Estudio de Los Microorganismos

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ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS Microorganismo Salmonela (Salmonella typhimurium), en rosa, en un cultivo de células humanas. Un microbio (del griego científico μικρόβιος [microbios]; de μικρός [micrós], ‘pequeño’, y βίος [bíos], ‘vida’; 1 ser vivo diminuto), también llamado microorganismo, es un ser vivo, o un sistema biológico, que solo puede visualizarse con el microscopio. La ciencia que estudia los microorganismos es la microbiología. Son organismos

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ESTUDIO DE MICROORGANISMOS

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ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS

Microorganismo

Salmonela (Salmonella typhimurium), en rosa, en un cultivo de células humanas.

Un microbio (del griego científico μικρόβιος [microbios]; de μικρός [micrós], ‘pequeño’, y βίος [bíos], ‘vida’;1 ser vivo diminuto), también llamado microorganismo, es un ser vivo, o un sistema biológico, que solo puede visualizarse con el microscopio. La ciencia que estudia los microorganismos es la microbiología. Son organismos dotados de individualidad que presentan, a diferencia de las plantas y los animales, una organización biológica elemental. En su mayoría son unicelulares, aunque en algunos casos se trate de organismos cenóticos compuestos por células multinucleadas, o incluso multicelulares.

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El concepto de microorganismo es operativo y carece de cualquier implicación taxonómica o filogenética dado que engloba organismos unicelulares y pluricelulares no relacionados evolutivamente entre sí, tantoprocariotas (como las bacterias), como eucariotas (como los protozoos), una parte de las algas y los hongos, e incluso entidades biológicas acelulares de tamaño ultramicroscópico, como los virus o los priones. Estos últimos generalmente no son considerados seres vivos y por lo tanto no son microorganismos en sentido estricto; no obstante, también están incluidos en el campo de estudio de la microbiología.

Los microbios tienen múltiples formas y tamaños. Si un virus de tamaño promedio tuviera el tamaño de una pelota de tenis, una bacteria sería del tamaño de media cancha de tenis y una célula eucariota sería como un estadio entero de fútbol.[cita requerida]

Algunos microorganismos son patógenos y causan enfermedades a personas, animales y plantas, algunas de las cuales han sido un azote para la humanidad desde tiempos inmemoriales. No obstante, la inmensa mayoría de los microbios no son en absoluto perjudiciales y bastantes juegan un papel clave en la biosfera al proporcionar oxígeno (algas y cianobacterias), y, otros, descomponer la materia orgánica, mineralizarla y hacerla de nuevo accesible a los productores, cerrando el ciclo de la materia.

Tipos de microbios

En los microbios están representados cuatro grupos de seres: bacterias,

protozoos, hongos y algas.

Virus[editar]

Artículo principal: Virus

Los virus son sistemas biológicos que presentan incluso tamaños ultramicroscópicos (los más pequeños y los de tamaños medianos solo se pueden observar mediante microscopio electrónico), los cuales pueden causar infecciones y solo se reproducen en células huésped. Los virus fuera de células huésped están en forma inactiva. Los virus constan de una cubierta protectora proteica o cápside que rodea el material genético. Su forma puede ser espiral, esférica o como células pequeñas, de tamaño entre 10 y 300 nm. Al tener un tamaño menor que las bacterias, pueden pasar filtros que permiten la retención de las mismas.

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Al contrario que las bacterias y los protozoos parásitos, los virus contienen un solo tipo de ácido nucleico (ARN o ADN). No se pueden reproducir por sí solos, sino que necesitan de la maquinaria metabólica de la célula huésped para asegurar que su información genética pasa a la siguiente generación.

Al contrario que las bacterias, los virus no están presentes en el ser humano de manera natural (excepto como un elemento viral endógeno). Cuando las personas quedan afectadas por un virus, estos generalmente se eliminan del cuerpo humano mediante secreciones.

En las últimas décadas se han empezado a utilizar virus en medicina, por ejemplo para la debilitación de bacterias, la creación de antitoxinas, la utilización para librerías genómicas, como vectores en terapia génica, para la destrucción de células tumorales2

Micrococcus luteus.Microorganismos procariotas

Artículos principales: Bacteria y Archaea.

Las bacterias y las arqueas son microorganismos procariontes de forma esférica (cocos), de bastón recto (bacilos) o curvado (vibrios), o espirales (espirilos). Pueden existir como organismos individuales, formando cadenas, pares, tétradas, masas irregulares, etc. Las bacterias son una de las formas de vida

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más abundantes en la tierra. Tienen una longitud entre 0,4 y 14 μm. Consecuentemente solo se pueden ver mediante microscopio. Las bacterias se reproducen mediante la multiplicación del ADN, y división en dos células independientes; en circunstancias normales este proceso dura entre 30 y 60 minutos.

Cuando las condiciones del medio son desfavorables, cuando cambia la temperatura o disminuye la cantidad de los nutrientes, determinadas bacterias forman endosporas como mecanismo de defensa, caracterizadas por presentar una capa protectora resistente al calor, a la desecación, a la radiación y a la trituración mecánica y que protege la bacteria de manera muy eficiente. De esta manera, pueden soportar temperaturas elevadas, periodos de sequía, heladas, etc. Cuando las condiciones del medio mejoran, se desarrolla una nueva bacteria que continúa el crecimiento y la multiplicación.

Las bacterias tienen un papel funcional ecológico específico. Por ejemplo, algunas realizan la degradación de la materia orgánica, otras integran su metabolismo con el de los seres humanos.

Si bien algunas bacterias son patógenas (causantes de diversas enfermedades), una gran parte de ellas son inocuas o incluso buenas para la salud.

Algas Cianoficeas

Artículo principal: Cyanobacteria

Las algas cianoficeas o Cyanobacterias son bacterias capaces de realizar fotosíntesis oxigénica, cuyas células miden solo unos micrómetros (µm) de diámetro, pero son más grandes que la mayoría de las otras bacterias. Contienen la enzima ribulosa-1,5-bisfosfatocarboxilasa RuBisCO, que realiza la fijación del CO2.

Microorganismos eucariotas

Se denomina eucariotas a todas las células que tienen su material hereditario (su información genética) encerrado dentro de una doble membrana, la envoltura nuclear, que delimita un núcleo celular.

Hay tres tipos de microorganismos eucariotas, los protozoos (heterótrofos y sin pared celular), las algas microscópicas (autótrofos y con pared celular de celulosa) y los hongos microscópicos (heterótrofos y con pared celular de quitina).

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Protistas

Artículo principal: Protozoo

Los protozoos son microorganismos unicelulares eucarióticos cuyo tamaño va de 10-50 μm hasta más de 1 milímetro, y pueden fácilmente ser vistos a través de un microscopio. Son heterótrofos, fagótrofos, depredadores o detritívoros, a veces mixótrofos(parcialmente autótrofos), que viven en ambientes húmedos o directamente en medios acuáticos, ya sean aguas saladas o aguas dulces. La reproducción puede ser asexual por bipartición y también sexual por isogametos o por conjugación intercambiando material genético. En este grupo encajan taxones muy diversos con una relación de parentesco remota, que se encuadran en muchos filos distintos del reino protista, definiendo un grupo polifilético, sin valor en la clasificación de acuerdo con los criterios actuales.

Hongos

Artículo principal: Fungi

El reino Fungi incluye muchas especies macroscópicas que en absoluto encajan en la definición de microorganismo, pero también forma microscópicas, como las levaduras, que son campo de estudio de la microbiología. Además, numerosos hongos producenenfermedades infecciosas en animales y plantas y tienen un gran interés sanitario y agropecuario.

Microorganismos patógenos

Artículo principal: Enfermedad infecciosa

Algunos microorganismos son capaces de penetrar y multiplicarse en otros seres vivos, a los que perjudican, originando una infección; son los denominados microorganismos patógenos. Los problemas que causa una infección dependen del tipo de patógeno, el modo en que se transfiere, dosis o concentración de patógenos, persistencia de los microorganismos y la resistencia del organismo infectado.

La dosis de infección significa el número de microorganismos. Esta dosis es muy baja para los virus y protozoos parásitos. La persistencia de los microorganismos depende del tiempo viable de los microorganismos cuando no se encuentran en el huésped humano. Por ejemplo, las bacterias son generalmente menos persistentes mientras los quistes de los protozoos son los más persistentes.

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Los jóvenes, personas mayores y enfermos de otras patologías son los menos resistentes a las enfermedades y por lo tanto son más frágiles. Cuando una persona es infectada, los patógenos se multiplican en el huésped, y esto supone un riesgo de infección o enfermedad. No todas las personas infectadas por patógenos enferman. Las personas que enferman pueden contagiar y extender la enfermedad mediante las secreciones y mediante contacto directo de alguna manera con la mucosa del infectado.

ESTEQUIOMETRÍA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

La conversión microbiológica de carbohidratos para obtener biomasa y

productos de interés industrial es tema de constante actualidad debido a la

creciente dependencia de los recursos renovables.

Los rendimientos alcanzados en biomasa y productos son de relevancia

significativa debido a que, generalmente, el valor de los sustitutos empleados

en la formulación de medios de cultivo tiene una importancia sustancial en el

costo de operación de las plantas industriales. El grado en que un

microorganismo puede transformar los componentes del medio de cultivo en

nueva biomasa y productos juega un papel fundamental, a punto tal que puede

llegar a ser factor determinante de la viabilidad de un proceso en gran escala.

Desde este punto de vista, resulta de sumo interés poder llegar a determinar,

estimar o predecir rendimientos que den cuenta de las transformaciones que

se están llevando a cabo en un biorreactor. Los balances de materia y energía

resultan a tal fin de suma utilidad y su empleo se ha extendido ampliamente en

ciencias básicas y aplicadas.

La aparición en el mercado de sensores que permiten medir importantes

variables de los cultivos microbianos y el uso de ordenadores acoplados a los

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biorreactores (biorreactor = recipiente en el cual se cultivan los

microorganismos) han ampliado el horizonte para la aplicación de balances de

materia y energía. la producción de biomasa (biomasa = concentración de

microorganismos expresada en gramos de células secas / litro de cultivo),

consumo de las fuentes de C y energía, de nitrógeno y Oxígeno y las producción

de CO2 y desprendimiento de calor son algunas de las variables que pueden ser

estimadas a partir de medidas experimentales y utilizadas en el planteo y

cálculo de balances de materia y energía.

Antes de proceder a considerar el sistema de análisis propuesto, es

conveniente introducir algunas definiciones y hacer ciertas consideraciones

sobre algunas “regularidades” observadas experimentalmente en el cultivo de

microorganismos.

En primer lugar se ha encontrado que la composición elemental de un

importante número de microorganismos, cultivados bajo diferentes

condiciones, se mantiene prácticamente constante; así podemos definir un

“microorganismo promedio” (composición standard) como aquel cuya

composición es (% p/p): C = 46,5; H = 6,94; 0 = 31,0 y N = 10,85, donde el

aproximadamente 5 % restante está representado por sales. Es importante

recalcar que si bien la composición elemental promedio de la biomasa se

mantiene prácticamente constante, la concentración intracelular de proteínas,

RNA y demás constituyentes celulares puede variar sensiblemente entre

diferentes especies e incluso entre diferentes estadíos del cultivo de un mismo

microorganismo.

Teniendo en cuenta esta composición media, podemos escribir lo que

sería la “fórmula mínima” de nuestro m.o. promedio como C H1,79O0,5N0,2 (en la

que está representada el 95% p/p de la biomasa) y con fines netamente

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prácticos definir “1 C-mol de biomasa” como la cantidad de biomasa que

contiene 1 átomo gramo de C. Así pues tenemos que:

Para conocer la cantidad de biomasa que corresponde a n C-moles de

biomasa debemos conocer su composición elemental y en base a dicha

composición, el peso de 1 cmol. En términos generales la masa resulta ser:

de biomasa.

De forma análoga a como lo hicimos con la biomasa, podemos definir 1

C-mol de sustrato (entiéndase por sustrato fuente de carbono y energía, FCE), 1

C-mol de fuente de N, etc. Como ejemplo, para la glucosa: C6H12O6, 1 C-mol de

glucosa estará representado por CH2O y pesará 30 g, y para el etanol, 1 C-mol

de etanol (CH3O0,5) pesará 23 g.

Otro concepto que debemos introducir es el de “grado de reducción” o

“grado de reductancia”, el cual será de gran utilidad en el momento de

plantear nuestros balances de materia y energía.

Tomemos como ejemplo las siguientes reacciones de oxidación:

C + O2. CO2 = 4

CH4 + 2O2 CO2 + 2H2O = 8

CO + 0,5 O2 CO2 = 2

CH2O + O2 CO2 + H2O = 4

CH3O0,5 + 1,5 O2 CO2 + 1,5 H2O ` = 6

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Podemos observar que los distintos valores de que figuran a la derecha

de cada ecuación coinciden con el número de “electrones disponibles” que

fueron transferidos desde el compuesto a oxidar al oxígeno. En general se

expresa en términos de n de e- disponibles / c-mol.

Para calcular el valor de de un determinado compuesto se toman los

grados de reducción 4 para el C; 1 para el H; -2 para el O y -3 para el N. En el

caso del CO2, H2O y NH3 no se tienen e- disponibles (estados de referencia),

luego CO2 = H2O = NH3 = 0. Se considera además que el estado de oxidación

predominante del N en la biomasa es -3. En términos generales para un

compuesto de fórmula CHaObNc, su grado de reducción vendrá dado por:

= 4 + a - 2b - 3c (1)

Si tenemos un compuesto cuya fórmula es Ch Hi Oj Nk, debemos llevarlo a la

forma

Si tomamos como ejemplo a nuestro m.o. promedio su x (donde el

subíndice x indica biomasa) será:

Este valor, junto a Pcmol = 25,8 son dos de las “regularidades” a las que

nos habíamos referido con anterioridad. Estos valores pueden ser empleados

en balances de materia y energía en aquellos casos en que se desconoce la

composición de la biomasa sin temor de incurrir en errores groseros de cálculo.

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Otras regularidades observadas en el cultivo de m.o. es que el calor de reacción

por mol de e- transferidos al O2 es relativamente constante para la oxidación de

una amplia variedad de moléculas orgánicas y corresponde a 27 Kcal/mol e -

disponibles transferidos al O2.

Estamos ahora en condiciones de plantear una serie de balances de

materia y energía, para lo cual trataremos al cultivo de un m.o. como si fuera

una reacción química simple.

Donde X significa “biomasa”, cualquiera sea su naturaleza.

Debemos hacer notar que los coeficientes estequiométricos están

referidos a 1 C-mol de fuente de C y energía. Así pues:

lo mismo para yp e yCO2.

El balance de carbono para esta reacción de formación de biomasa y producto

será:

(2)

De igual forma podemos establecer un balance del grado de reducción:

s + (-4)b = yx . x + yp . p (3)

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Reordenando y dividiendo por s obtenemos

(4)

o lo que es lo mismo

+ + = 1 (5)

donde = (fracción de e- disponibles de la FCE transferidos al O2)

= (fracción de e- disp. de la FCE transferidos a la biomasa)

= (fracción de e- disp. de la FCE transferidos al producto)

Estos dos balances obedecen directamente al principio de conservación

de la masa y la energía, en el primero de ellos, no puede haber entre los

productos más carbono del que un c-mol de sustrato puede aportar y el en el

caso del segundo, los electrones disponibles del sustrato deben ir

obligadamente a los distintos productos.

Si asumimos, como ya se mencionó, que el calor de reacción por mol de

e- disponibles transferidos al oxígeno es constante para un importante número

de moléculas orgánicas, el primer término de la ecuación (4) nos da la fracción

de energía del sustrato que evoluciona como calor. Si llamamos qo a esa

constante con qo = 27 Kcal/mol e- disponibles transferidos al O2, el calor

generado en la ecuación l’ vendrá dado por:

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q = 4 qo b kcal/C-mol de sustrato (6)

Si conocemos la velocidad de consumo de O2 de nuestro cultivo podemos

calcular la velocidad de producción de calor y por lo tanto los requerimientos

de H2O de enfriamiento para mantener constante la temperatura de nuestro

biorreactor.

El concepto de e- disponibles nos brinda un método simple de cálculo

para chequear los resultados obtenidos experimentalmente en lo que se da en

llamar “análisis de consistencia interna”. Empleando las ecuaciones (2) y (4) o

(5) con datos obtenidos en el laboratorio, podemos estimar parámetros no

medidos y tener idea de cuán confiables fueron nuestras determinaciones.

Medidas realizadas en el laboratorio deben encontrarse dentro de los

intervalos:

0,94 yx + yp + yCO2 1,06

0,93 + + 1,07

Valores inferiores o superiores a estos límites de aceptabilidad

determinados estadísticamente ponen en evidencia errores en las

determinaciones experimentales.

En el trabajo habitual de laboratorio la cuantificación de la biomasa

producida se efectúa gravimétricamente, es decir, se determina el incremento

en biomasa expresado en g/l (x) correspondiente a la utilización de una

determinada cantidad de sustrato (s) (igualmente expresada en g/l) con lo

cual definimos nuestro rendimiento en base a sustrato como al que

Page 13: Estudio de Los Microorganismos

tomamos como “rendimiento global” en el que sólo se tienen en cuenta los

valores finales e iniciales de biomasa y sustrato, más rigurosamente Y x debiera

ser expresado por el límite x / s con s 0, esto es: (observar que

el signo negativo es introducido porque x y s varían en sentido contrario).

Estamos ahora en condiciones de calcular los valores de yx, yp, y yCO2

conociendo los respectivos rendimientos globales y los valores de P cmol de X,

S, P y CO2 tal cual vemos a

continuación: (7)

Resulta de gran interés conocer los destinos que toma la fuente de C y energía

durante el crecimiento microbiano y la fracción de la misma empleada por el

m.o. para obtener la energía necesaria para llevar adelante sus funciones

metabólicas.

Por balance de sustrato:

s = sx + sp + sE (8)

donde S = Sustrato total consumido

Sx = Fracción de sustrato utilizado en la formación de biomasa

Sp = Fracción de sustrato utilizado en la formación de producto

SE = Fracción de sustrato utilizado para obtener energía

Page 14: Estudio de Los Microorganismos

por consiguiente:

SE = S - Sx - Sp

SE = S + X

fE = 1 - yx - yp = fE : fracc. de FCE destinada a la obtención de E.

(11)

Experimentalmente lo que se hace es determinar la producción global de

CO2 y conociendo la masa de CO2 y sustrato consumido y calcular SE por

estequiometría. Este método presenta dos inconvenientes: en primer lugar

existen reacciones enzimáticas que incorporan O2 a determinados

componentes celulares (O2 que no es empleado para obtener energía) no

obstante este consumo puede ser despreciado frente al global para oxidar la

fte. de C y E; y el más importante es que debemos suponer que x s, caso

contrario se introduce un grosero error en el cálculo.

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CINÉTICA

DEL CRECIMIENTO

Page 16: Estudio de Los Microorganismos

CINÉTICA DEL CRECIMIENTO

Hasta aquí hemos visto las relaciones estequiométricas que existen en

los cultivos microbianos, y cómo a través de ellas es posible obtener

información del destino que tiene la fuente de carbono y energía. Las

ecuaciones (2) y (4), resumen toda la información que es posible obtener

mediante los balances de materia y energía, pero nada dicen acerca de la

velocidad, r, con que transcurre el proceso; por lo que ahora centraremos la

atención en este aspecto.

Convendrá antes definir la forma en que expresaremos las distintas

velocidades. De este modo llamaremos a:

rx = velocidad de crecimiento microbiano (o, brevemente, velocidad de

crecimiento) y las unidades serán:

del mismo modo:

rs = = velocidad de consumo de sustrato

rp = = velocidad de formación de producto.

r = velocidad de consumo de O2

Page 17: Estudio de Los Microorganismos

r = velocidad de producción de CO2

Estas velocidades también pueden ser expresadas en ; y en este caso, para

diferenciarlo del anterior, las denotaremos con R. Por ej.:

Rx =

Análogamente tendremos: Rs, R , etc.

La conversión entre rx y Rx estará dada por:

Rx = 25,8 . rx

Análogamente:

Rs =

R , etc.

Velocidades específicas:

Corresponden alas anteriormente definidas pero referidas a la unidad de

biomasa, es decir:

= ; velocidad específica de crecimiento.

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= qs ; velocidad específica de consumo de sustrato (s puede ser la fuente de

carbono y energía o cualquier otro componente del medio)

; velocidad específica de consumo de O2.

; velocidad específica de formación de producto.

etc.

Las velocidades específicas suelen brindar información acerca de cuál es

la actividad metabólica del microorganismo (o de la biomasa) durante el

cultivo, ya que el estar referidos a la unidad de biomasa cualquier modificación

en el valor de , qs, etc. estará indicando que "algo" está ocurriendo en el

metabolismo del microorganismo en cuestión.

De hecho es frecuente que las velocidades específicas varíen durante el

cultivo, y es muy común que por ej. el valor de al principio del cultivo difiera

del que se encuentra en estadios posteriores. Lo mismo vale para qs, , etc.

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SISTEMAS DE CULTIVO

BATCH

CONTINUO

Y BATCH ALIMENTADO

Page 20: Estudio de Los Microorganismos

CULTIVO EN BATCH

La evolución del cultivo en el tiempo, sigue una curva típica la cual recibe

el nombre de “curva de crecimiento en batch”. Los sucesos que tienen lugar

durante la misma pueden separarse en cuatro fases perfectamente

diferenciables. En primer lugar existe una fase donde prácticamente no hay

división celular pero sí aumento de la masa individual de los microorganismos

(fase “lag” o fase de retardo). Le sigue una etapa donde el crecimiento ocurre a

velocidad específica () máxima y constante = m (fase exponencial). Al final de

esta fase se alcanza la máxima concentración microbiana. Posteriormente hay

un rápido período de desaceleración donde 0 y se entra en la fase

estacionaria la cual es causada por agotamiento de algún nutriente (el sustrato

limitante) o bien por acumulación de inhibidores. Durante esta fase la

concentración microbiana (o de biomasa) permanece constante. Finalmente se

llega a una última etapa donde la concentración de biomasa disminuye por

autolisis o como consecuencia del metabolismo endógeno (fase de

decaimiento).

La duración de cada una de estas fases es función del microorganismo

en estudio y de la composición del medio de cultivo. En particular la fase lag

depende además de la fase de crecimiento en que se encuentran las células en

el momento de ser sembradas y de la composición del medio de cultivo en que

fueron crecidas. Si éste es igual a la composición del medio en que se van a

sembrar y las células están en fase exponencial, la duración de la fase lag, en

general se acorta y puede llegar a desaparecer, lo cual es deseable ya que

constituye tiempo perdido.

Page 21: Estudio de Los Microorganismos

La descripción matemática (modelado) de las cuatro fases descriptas es

sumamente compleja y escapa a los fines de esta guía, por lo que sólo veremos

una más simple que sólo contempla la fase exponencial y la estacionaria.

De la definición de obtenemos

rx = . x (12)

donde x = concentración de biomasa. Hemos visto que varía durante el

cultivo, siendo un valor constante y máximo en la fase exponencial (m) y nulo

en la estacionaria. Monod ha propuesto una relación muy simple entre el valor

de y la concentración de sustrato limitante, S, entendiéndose por éste al

componente del medio de cultivo que esté en menor proporción respecto de

las necesidades del microorganismo. Por tanto S puede ser la fuente de N, de C,

algún aminoácido, etc. La ecuación es:

= m (13)

A KS se la conoce como Constante de Saturación, y da una idea de la

afinidad que tiene el microorganismo por el sustrato en cuestión. A menor KS

mayor afinidad. Normalmente KS tiene valores muy pequeños (10-2 - 10-3 g/l)

por lo que concentraciones relativamente pequeñas de S son suficientes para

hacer que:

= m (14)

Page 22: Estudio de Los Microorganismos

Reemplazando la ec. (13) en (12) queda:

rx = m . x (15)

Al principio del cultivo todos los nutrientes estarán en exceso, y en particular el

sustrato limitante también, por lo que la ex. (15) se reduce a (fase exponencial)

rx = m x ; o bien: = m . x (16)

La ec. (16) es fácilmente integrable y si hacemos a t = 0; x = xo (concentración

inicial de microorganismos) queda:

ln x = ln xo + m t (17)

o bien

x = xo em t (18)

Por tanto en esta fase la concentración de biomasa aumenta

exponencialmente, y también lo hace rx ya que reemplazando: rx = m xo e m t

A partir de la ec. (17) se puede calcular el tiempo de generación del

microorganismo (período de tiempo en que la biomasa se duplica) haciendo x =

2 xo y nos queda tg =

Page 23: Estudio de Los Microorganismos

A medida que transcurre el tiempo de cultivo, S va disminuyendo (y por

tanto rx) hasta que finalmente S = 0 (fase estacionaria), y

rx = 0 (19)

lo que implica:

x = cte = xf (20)

xf = concentración final de biomasa.

Si graficamos ln x vs. t se obtiene un gráfico como el de la fig.

Page 24: Estudio de Los Microorganismos

De la fase exponencial se calcula m mediante la ecuación (17). La

duración de la fase lag, tL, se puede calcular del gráfico, o bien haciendo una

corrección en la ec. (17).

ln x = ln xo + m (t - tL)

Si tomamos un valor cualquiera de x que corresponda a la fase

exponencial, xe, podemos calcular tL.

tL = te -

Consumo de Sustrato

Hemos visto que el rendimiento se definía como yx = -

por tanto

rs = (22)

reemplazando en la ec. (22) la ec. (15) queda:

rs = (23)

Page 25: Estudio de Los Microorganismos

A medida que S tiende a cero, rs también.

En fase exponencial será S ks y además x estará dado por la ec. (18), por

tanto:

(24)

Si a t = 0 es S = So implica:

S = So - (25)

La ec. (25) da la variación de S en función de t durante la fase

exponencial.

Si se conoce de antemano el rendimiento yx (o Yx) y las concentraciones

iniciales de sustrato y biomasa, es fácil estimar el valor de xf ya que:

x = -Yx . S (26)

x - xo = Yx (S - So) (27)

Si S es el sustrato limitante, se tendrá que para x = x f será Sf = 0, por

tanto:

xf = xo + Yx. So (28)

Page 26: Estudio de Los Microorganismos

La ec. (27) permite calcular S para un x dado (o viceversa) en cualquier

parte de la curva de crecimiento, siempre y cuando Yx (o yx) se mantenga

constante. Alternativamente la ec. (27) puede emplearse para verificar si tal

supuesto se cumple ya que la gráfica de (x - xo) en función de (So - S) deberá

ajustarse a una recta. De todos modos siempre es posible calcular un

rendimiento global, independientemente de las variaciones que pueda tener

durante el cultivo, empleando sólo valores iniciales y finales:

Yx = - (29)

Consumo de O2

Hemos visto que realizando un balance entre la composición de los gases

que ingresan y salen del biorreactor se puede calcular r . Con este valor y el

de la concentración de biomasa, x, se puede calcular a distintos tiempos el

valor de , con lo cual tendremos una idea de lo que ocurre con la

capacidad respiratoria de los microorganismos durante el cultivo. Al respecto

es útil estudiar cuáles son las posibles causas de variación de .

1) Sea yx/o = (30) yx/o = rendimiento de biomasa base a O2

consumido

Page 27: Estudio de Los Microorganismos

Al igual que en la ec. (21) podemos hacer:

yx/o = (31)

de donde reemplazando por la ec. (13)

(32)

En fase exponencial es S ks y

(33)

es decir que en esta fase se mantiene constante y con un valor máximo. A

medida que S disminuye, también hasta que virtualmente se hace nulo en

la fase estacionaria. Esto es particularmente válido cuando el sustrato limitante

es la fuente de carbono y energía, ya que al agotarse ésta, los microorganismos

se quedan sin “combustible” y por tanto el consumo de O2 cesa. No ocurre lo

mismo cuando el sustrato limitante es por ej. la fuente de nitrógeno, pues si

bien cuando ésta se agote se detendrá el crecimiento, nada impide que los

microorganismos sigan respirando ya que cuentan con “combustible” en

exceso.

Page 28: Estudio de Los Microorganismos

2) Otra causa que afecta el valor de es la concentración de O2 disuelto. Por

analogía con la ecuación de Monod, se ha propuesto la ecuación:

(34)

donde C = concentración de Os disuelto.

Al igual que ks, se encuentra que ko es pequeño, y en general valores de C

del orden de 0,8 mg/l (10% de saturación) son normalmente suficientes para

que = m. A la concentración de O2 disuelto por encima de la cual el

valor de se mantiene constante, se la conoce como concentración crítica

(Cc).

Page 29: Estudio de Los Microorganismos

PARTE EXPERIMENTAL

Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae.

Medio de cultivo:

Glucosa ..............................................................................10,00 g/l

Urea ................................................................................... 1,50 g/l

K2HPO4 ............................................................................. 1,00 g/l

MgSO4.7H2O ..................................................................... 0,60 g/l

CaCl2.2H2O ........................................................................ 0,10 g/l

ácido cítrico ........................................................................ 0,45 g/l

H3BO3 ................................................................................. 0,10 mg/l

CuSO4 ................................................................................. 0,10 mg/l

KI ........................................................................................ 0,10 mg/l

FeCl3 ................................................................................... 0,10 mg/l

Na2MoO4 ............................................................................. 0,10 mg/l

inositol ................................................................................. 6,00 g/l

biotina .................................................................................. 6,00 g/l

acido fólico .......................................................................... 6,00 g/l

pantotenato de calcio ............................................................ 0,80 mg/l

tiamina .................................................................................. 0,80 mg/l

ácido nicotínico ..................................................................... 0,80 mg/l

ácido p-amino benzoico ......................................................... 0,40 mg/l

riboflavina ............................................................................. 0,40 mg/l

Page 30: Estudio de Los Microorganismos

piridoxina .............................................................................. 1,60 mg/l

antiespumante ....................................................................... 3 gotas

pH 5,50 (ajustado con HCl o H2SO4 1N)

Volumen de cultivo: 4,0 l

Los fosfatos se esterilizan por calor húmedo (autoclave), fraccionados en

un erlenmeyer con salida lateral, disolviendo la cantidad necesaria para

preparar 3,7 l de medio de cultivo, en 500 ml de H2O y se ajusta el pH en 5,50.

El resto de los componentes (excepto la urea y la solución de vitaminas) se

disuelven en 3,2 l. de H2O, los microelementos se agregan en solución

concentrada 1000 veces a razón de 1 ml/l, se ajusta el pH en 5,50 y se

esterilizan, en autoclave, en el biorreactor.

El tiempo de esterilización será en ambos casos de 15 minutos. La urea se

esteriliza por filtración. Se prepara una solución madre con 500 g/l de urea y se

esteriliza con membrana absoluta. Esta solución se adiciona en proporción de

6,0- ml por litro de medio de cultivo.

Las vitaminas se preparan en solución concentrada 1000 veces, se

esterilizan por filtración y se adicionan a razon de 1 ml/l de medio.

Inóculo: Tres erlenmeyers de 1000 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo

diluido 2,5 veces se esterilizan por calor durante 10 min. En este caso para

mayor simplicidad se esterilizará el medio de cultivo completo (excepto la urea

y las vitaminas que se adicionarán en proporción de 0,5 ml y de 0,1 ml de las

soluciones madres). Los erlenmeyers serán sembrados el día anterior a la

Page 31: Estudio de Los Microorganismos

realización de trabajo práctico con células de levaduras provenientes de un

cultivo en agar inclinado. Las mismas se resuspenden fácilmente en agua. La

temperatura de incubación será en todos los casos de 30C.

Procedimiento:

1.- Termostatizar el biorreactor a 30C

2.- Conectar el sistema de aireación al filtro estéril del biorreactor.

3.- Conectar el sistema de agitación del biorreactor. Fijar la agitación en 600

rpm.

4.- Adicionar en forma estéril los fosfatos, la urea y las vitaminas al resto del

medio de cultivo contenido en el biorreactor.

5.- Calibrar el electrodo para medir O2 disuelto haciendo pasar por el

biorreactor, primero una corriente de nitrógeno y ajustando la lectura a 0%

de saturación (ajuste del cero) y luego aire a un caudal de 2 l/min., ajustando

con la perilla de calibración a 100% de saturación. En ambos casos, antes de

realizar los ajustes, se debe dejar transcurrir 10 a 15 minutos.

Los gases que ingresen al biorreactor deberán pasar por el filtro estéril.

6.- Calibrar los instrumentos de medida para efectuar el análisis de los gases a

la salida del biorreactor (analizador de O2 y de CO2).

7.- Trasvasar, en forma estéril, los tres erlenmeyers de inóculo a otro con salida

lateral.

8.- Sembrar el biorreactor y aguardar 2 a 3 minutos

9.- Tomar 15 mL de muestra (descartar antes 2 o 3 mL) y tomar el tiempo

CERO. Anotar en cada caso el volumen de muestra y el de descarte.

10.-Medir el porcentaje de O2 y CO2 en lo gases de salida del biorreactor

Page 32: Estudio de Los Microorganismos

Análisis de las muestras

11.- 10 mL se centrifugan 10 minutos. Guardar el sobrenadante para

determinar concentración de FCE y producto. Lavar (una vez) con agua

destilada el pellet de levaduras, centrifugar, resuspender las células con

más agua destilada y hacer peso seco a 105°C.

12.- Al resto de la muestra medirle:

12.1.- pH

12.2.- DO a 620. La muestra deberá diluirse de forma tal de obtener

lecturas entre 0,1 y 0,6.

12.3.- Control de contaminación por observación microscópica.

13.- Repetir los pasos 9 a 12 cada hora.

14.- Finalizado el cultivo, medir el volumen remanente. Con este dato y los de

volumen de muestra y lavado calcular el volumen de cultivo a la hora CERO,

1; 2, 3; etc. El volumen obtenido en cada caso será el utilizado para el

cálculo de y a los correspondientes tiempos.

Resultados

Los datos se volcarán en una tabla del siguiente formato y luego se harán las

graficas correspondientes en función del tiempo

Page 33: Estudio de Los Microorganismos

Hora T pH DO620 X S Vextr Vrem C.R.

I.- Graficar ln x vs. t. y DO vs. t. Calcular µmax .

II.-1 Verificar si YX se mantuvo constante durante el cultivo.

II-2 Calcular YX e yX globales.

II-3 Calcular el consumo global de O2 y el CO2 total producido. Con estos valores

calcular b e yCO2 respectivamente.

III- Verificar si se cumplen los balances de carbono y de grado de reducción.

+ + = 1

yx + yCO2 = 1

Page 34: Estudio de Los Microorganismos

CULTIVO CONTINUO

De los tres métodos usuales para el cultivo de microorganismos, batch, batch

alimentado y continuo, es este último el que ofrece mayores posibilidades de

control. Por sus características especiales permite controlar el proceso a un

valor de velocidad específica de crecimiento () prefijado de manera muy

simple. Este punto es de suma importancia ya que el comportamiento de la

mayoría de los microorganismos se ve afectado por el valor de al que están

creciendo.

Mediante el cultivo continuo es posible estudiar el efecto de variables

como PH, temperatura, concentración de nutrientes, etc., a valores constantes

el valor de , o bien, fijadas las anteriores, analizar el efecto de sobre la

estequiometría del crecimiento. De este modo es posible separar los distintos

efectos y obtener información valiosa para la mejora del proceso.

Para poner en marcha un cultivo continuo, se realiza previamente un

cultivo batch y en un momento dado, normalmente antes que se agote el

substrato limitante, se comienza a alimentar con medio de cultivo fresco a un

caudal F (Fig. 1).

F , S , X , P

X SP

F, SR

Page 35: Estudio de Los Microorganismos

Fig. 1

El volumen del cultivo se mantiene constante. El líquido que sale del

biorreactor, a un caudal F tendrá células, y la concentración de nutrientes será

menor que en el caudal de entrada debido a que en parte fueron consumidos

por los microorganismos. Eventualmente se encontrará también algún

producto(s) proveniente de la actividad metabólica de los microorganismos.

Una de las variables de operación fundamental en este tipo de cultivos es

la velocidad de dilución, D, la cuál se define como la relación entre el caudal de

alimentación, F, y el volumen de cultivo, V.

D= FV (1)

Teniendo en cuenta las unidades usuales de F (L. h-1) y de V (L), las de D serán

de h-1. El valor de D corresponde a las veces que se renueva el volumen del

biorreactor por unidad de tiempo, así un valor de D= 0.25 h -1 indica que en una

hora se renovó un 25 % del volumen de cultivo, o bien que al cabo de 16 h se

habrá renovado cuatro veces el volumen de cultivo. Podría pensarse que luego

de la renovación reiterada del volumen de cultivo ya no quedan

microorganismos dentro del biorreactor, pero no es así; debe tenerse en

cuenta que estos se están multiplicando activamente lo cual compensa las

“perdidas” debidas a los microorganismos que son arrastrados fuera del

biorreactor por el caudal de salida. Bajo ciertas condiciones ambos procesos se

Page 36: Estudio de Los Microorganismos

compensan de modo tal que la concentración de microorganismos se mantiene

constante en el tiempo, es decir que se habrá alcanzado un estado

estacionario. En estas condiciones también se mantendrán constantes en el

tiempo las concentraciones de nutrientes, en particular la del substrato

limitante del crecimiento, y la de producto(s).

Balances de materia:

De acuerdo al esquema de la Fig. 1 podemos plantear los siguientes

balances de materia para la concentración de microorganismos ( X ) , de

substrato ( S ) y de producto (P).

V .dXdt

=V . rx−F . X ( 2 )

V .dSdt

=F .SR−F .~S−V . r s ( 3 )

V .dPdt

=V . rP−F .P ( 4 )

Cuando se alcanza el estado estacionario, X, S y P ya no varían con el

tiempo, lo que equivale a igualar a cero las Ecs. (2), (3) y (4), de donde resulta:

r X=D .~X ( 5 )

Page 37: Estudio de Los Microorganismos

r S=D .(SR−~S ) ( 6 )

r P=D .~P ( 7 )

donde ~X ,~S ,~P representan las respectivas concentraciones en estado

estacionario. La Ec. (6) es válida para cualquier nutriente del medio de cultivo,

sea el substrato limitante o no, ya que la misma surge de un balance de materia

en el que no se ha hecho ninguna consideración con relación a la naturaleza del

substrato considerado.

Lo primero que debe destacarse en este tipo de cultivo es que permite

determinar experimentalmente y de modo muy simple las velocidades de

crecimiento, consumo de substrato y de formación de producto, tal como se

desprende de las Eqs. (5), (6) y (7). Del mismo modo permite calcular los

rendimientos. Por ej. Si suponemos que S representa a la fuente de carbono y

energía, el rendimiento celular se calcula fácilmente:

Y x/ s=

~X

( SR−~S ) ( 8 )

De modo similar puede calcularse YP/S , o bien las velocidades específicas. Por

ej. Para qs será:

qS=

rSx

=D . (SR−

~S )

~x ( 9 )

Page 38: Estudio de Los Microorganismos

mientras que para la velocidad específica de crecimiento será:

μ=rXX

=D .~X~X

=D ( 10 )

La Ec. (10) es de suma importancia pues significa que en estado estacionario es

= D, y como D puede ser variado a voluntad por el operador (variable de

operación) resulta que el cultivo continuo permite “ imponerle” externamente

a los microorganismos el valor de al que deben crecer.

El estado estacionario

En el estado estacionario = D. ¿Cuanto tiempo demora el sistema en

alcanzar este estado?. En rigor, la respuesta surge de la misma definición de

estado estacionario, es decir cuando todas las variables del cultivo (X, S, P,

concentración de O2 disuelto y composición de la biomasa) no varían en el

tiempo. El criterio práctico que se suele seguir es que, una vez fijado el valor de

D, debe esperarse al menos 4.tR, donde tR se conoce como tiempo de retención

medio y puede demostrarse que :

tR = 1 / D

Por tanto si se fija un valor de D= 0.15 h-1, habrá que esperar 26,7 hs. para

suponer que se ha alcanzado el estado estacionario, lo que deberá ser

corroborado experimentalmente midiendo las concentraciones de X, S, P hasta

observar que no varían con el tiempo. Usualmente con 4.tR es suficiente.

Page 39: Estudio de Los Microorganismos
Page 40: Estudio de Los Microorganismos

PARTE EXPERIMENTAL

Microorganismo y condiciones de cultivo

Los géneros Rhizobium, Shinorhizobium y Bradyrhizobium en relación

simbiótica con plantas leguminosas infectan las raíces de las mismas y

estimulan la producción de nódulos, dentro de los cuales las bacterias fijan

Nitrógeno (bacterias diazótrofas) y la planta responde entregando a la bacteria

nutrientes orgánicos que produce durante la fotosíntesis. La cepa 2011 de

Sinorhizobium meliloti, que es capáz de colonizar y nodular plantas de alfalfa es

la que utilizaremos para realizar el experimento de cultivo continuo bajo dos

condiciones de limitación: - limitado en Carbono, donde esperamos obtener los

mayores rendimientos en biomasa y – limitado en Nitrógeno, donde esperamos

obtener rendimientos menores ya que estamos frente a un exceso de fuente

de Carbono y hay formación de producto extracelular, el exopolisacárido.

Las condiciones bajo las cuales se realizarán los cultivos serán:

T=30CpH (controlado automáticamente)=6.8D (velocidad de dilución)= 0.10 h-1

La velocidad de agitación se mantendrá a un valor tal que asegure alrededor

de 25% de oxígeno disuelto en el cultivo (esta condición es sólo para

asegurarnos que el cultivo no se limite en Oxígeno). La concentración de O2

Page 41: Estudio de Los Microorganismos

disuelto se medirá continuamente empleando un electrodo polarográfico

Ingold (Wilmington, MA, USA).

Los pasos a seguir son:

Preparar los reactores. Chequear todo el sistema de mangueras para

agregado de medio de cultivo, de álcali, de antiespumante, entrada y salida de

gases, toma de muestra, inoculación, etc..

Preparar el medio de cultivo y esterilizarlo dentro del biorreactor (30

minutos, 121 oC) junto con los electrodos de pH y oxígeno disuelto.

Conjuntamente esterilizar los reservorios con medio fresco que se emplearán

para alimentar el reactor.

Realizar todas las conexiones necesarias (eléctricas y de tubería), llevar los

reactores a temperatura y calibrar el electrodo de oxígeno disuelto.

Inocular el reactor con aproximadamente 50 ml de un cultivo de

Sinorhizobium meliloti crecido durante 12-18 h en frascos agitados en agitador

rotatorio.

Calibrar el caudal de las bombas peristálticas a un valor tal que satisfaga el

valor de D preestablecido. Nota: los cultivos deben conducirse al mismo valor

de D para su posterior comparación.

Los cultivos serán chequeados periódicamente (una o dos veces por día). Se

determinará: el contenido de O2 y CO2 en los gases de salida del reactor, que el

Page 42: Estudio de Los Microorganismos

valor de pH y de O2 disuelto sean los requeridos, los caudales de aire y medio

fresco que están ingresando al reactor y el consumo de álcali. Se tomarán

muestras (alrededor de 30 ml) a las que se les determinará: densidad óptica

(650 nm), peso seco por duplicado y se conservarán congeladas muestras de

los sobrenadantes de los cultivos para luego determinar en los mismos la

concentración residual de fuente de carbono y de nitrógeno. También se

deberán tomar muestras de los reservorios para determinar la concentración

real de glucosa utilizada en la alimentación de los reactores.

Estas determinaciones se realizarán hasta obtener condiciones de estado

estacionario en los parámetros medidos y calculados.

Durante las dos semanas de curso se llevarán a cabo cultivos bajo 2

condiciones de limitación diferentes:

1er. semana: Cultivo limitado en C (glucosa)

2da. semana: Cultivo limitado en N (amonio)

Medios de cultivo

El medio mínimo definido que se utilizará para realizar el C. C. será el medio

de Evans, que limitado en C tiene la siguiente composición:

glucosa 5.0 gKCl 0.3725 gNaH2PO4.2H2O 0.78 g

Page 43: Estudio de Los Microorganismos

(NH4)Cl 2.675 gNa2SO4 0.142 gácido cítrico 0.21 gMgCl2.2H2O 0.127 gOligoelementos 5 mlH2O csp 1000 ml

El medio que se empleará para la condición de limitación por Nitrógeno

tiene los mimos nutrientes pero la concentración de glucosa se triplicó (15 g.l -1)

y la de (NH4)Cl se bajó a 0.8 g.l-1 .

Page 44: Estudio de Los Microorganismos

CULTIVO DISCONTINUO ALIMENTADO (BATCH ALIMENTADO)

Otro modo de operar un biorreactor es empleando la técnica de batch

alimentado (BA) o fed batch. Esta técnica se define como un cultivo en batch

donde se alimenta continuamente medio nutritivo fresco o alguno de sus

componentes. Si el nutriente que se alimenta es el limitante del crecimiento,

esta técnica permite controlar la velocidad de crecimiento () del

microorganismo.

El BA es particularmente útil en procesos en los que el crecimiento

celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del

sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la poductividad de

la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. Así, este método se

emplea cuando se quieren evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se

requiere alcanzar una alta concentración de biomasa.

ESQUEMA

Page 45: Estudio de Los Microorganismos

Donde F(t): caudal de alimentación

Sr(t):concentración de sustrato de la alimentación

Vf: volumen final de trabajo

Vo: volumen al inicio de la alimentación

Xo: concentración de biomasa al inicio de la alimentación

So: concentración de sustrato limitante al inicio de la alimentación

El cultivo BA se inicia a partir de un cultivo en batch, por lo que Vo, Xo y So

son las condiciones finales de dicho batch.

Es posible elegir distintas condiciones de alimentación, ya sea mediante

el empleo de caudales variables (F = F(t)), o bien mediante la variación de la

concentración de sustrato limitante (Sr=Sr(t)). En el caso del Trabajo Práctico se

utilizará el sistema más simple, es decir F=cte y Sr=cte.

PRODUCCION DE BIOMASA: ECUACIONES Y DISEÑO

Page 46: Estudio de Los Microorganismos

El cultivo puede describirse matemáticamente. La resolución de las

ecuaciones así obtenidas permitirá calcular la evolución de la biomasa durante

el cultivo, la velocidad específica de crecimiento, y la productividad. Asimismo

se podrán determinar parámetros de diseño, tales como F y Sr.

Para estudiar la evolución de X durante el cultivo se deben plantear las

ecuaciones de balance de materia.

Sustrato

acumulación = suministro - consumo

(1)

En este caso el volumen no es constante, como ocurre en cultivos en

batch o en continuo. Por lo tanto la expresión (1) quedará:

(2)

La condición final del batch es S = 0, pues, como se intenta controlar µ, S

no puede ser saturante (recordar a Monod).

Si S~ 0, dS/dt = 0, con lo que (2) se transforma en

(3) F . SR -

Page 47: Estudio de Los Microorganismos

de aquí, y recordando que rx = µ . X

(4) F . SR =

esta ecuación indica que la velocidad de producción de biomasa se acomoda a

la velocidad de suministro de sustrato, es decir que rx puede controlarse

“externamente”, modificando F y/o Sr.

La ecuación (3) es en realidad un límite superior ya que dados µ, X y V,

cualquier par de valores F, Sr que satisfagan la condición

(4) F . SR

harán que la velocidad de crecimiento esté limitada por la velocidad de

alimentación. Esta ecuación (3) será muy útil en el momento de diseñar la

alimentación.

Biomasa

La velocidad de acumulación de biomasa será:

(5)

o, reordenando,

(6) rx =

Page 48: Estudio de Los Microorganismos

Si se reemplaza en (4) se obtiene

(7) F . SR =

que indica que la velocidad de acumulación de biomasa depende de la

velocidad de alimentación de sustrato.

Integrando (7), se llega a

(8) X V = xo Vo + Yx/s F SR t

Uno de los objetivos planteados es conocer cómo varía la concentración

de biomasa con el tiempo. En cultivo en batch, al ser V = cte, X.V es

proporcional a X. En BA V no es constante, sino que varía con el tiempo (F =

dV/dt). Integrando se tiene

(9) V = Vo + F t

reemplazando en (8) y despejando X, se tendrá

(10) X =

expresión que describe la variación de X con t a lo largo del cultivo alimentado.

Puede darse el caso en que el aumento de V sea tal que haya un efecto de

dilución que provoque la disminución de la concentración de biomasa. Así,

Page 49: Estudio de Los Microorganismos

puede ocurrir que la concentración final alcanzada sea menor que la inicial,

pero no así la cantidad total X.V.

DISEÑO

Se desea obtener una concentración final de biomasa Xf, con un volumen

final Vf. El volumen total adicionado durante el BA será:

(11) Vf - Vo = F.t

donde tf es el tiempo total de alimentación. Cuando t = t f, la ecuación (8) se

transforma en

(12) XfVf = XoVo + SR F.tf

Reemplazando (11) en (12), y despejando Sr queda

(13) SR =

La ecuación (13) permite calcular la concentración de sustrato limitante

en el reservorio. Resta calcular F, cuyo valor debe ser tal que satisfaga la

ecuación (4). En particular, para t = 0 (inicio de la alimentación )será:

(14) F SR

Page 50: Estudio de Los Microorganismos

El valor de tf se calcula a partir de la ecuación (11).

NOTA: o puede ser igual a max si la alimentación se inicia el final de la fase

exponencial del batch.

Debe destacarse que si F.Sr fuera mayor que la velocidad de consumo de

sustrato, habría una acumulación de sustrato en el medio, y el crecimiento no

sería limitado.

Es interesante conocer la variación de durante el batch alimentado.

Recordando el balance de materia para la biomasa

xV =

Por lo tanto se obtiene

(15) =

Si se reemplaza (8) en (15), será

Page 51: Estudio de Los Microorganismos

(16) =

expresión que indica que disminuye con t a lo largo del batch alimentado.

Puede representarse un cultivo en batch alimentado operando en las

condiciones halladas.

Al obtener valores de Sr y F, se ha DISEÑADO una alimentación para el

cultivo en batch alimentado. El caso descrito hasta aquí tiene en cuenta que

tanto F como Sr sean constantes. Es claro que en caso de ser F = F(t) y/o S r =

Sr(t), dicha funcionalidad habrá de ser tenida en cuenta para resolver las

ecuaciones planteadas.