UNIVERSIDAD MIGUEL HERNÁNDEZ DE ELCHE

Facultad de Ciencias Experimentales

Unidad de Fisiología celular y nutrición

Trabajo de Fin de Grado

2015/2016

ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE LA TOLBUTAMIDA Y EL

DIAZÓXIDO SOBRE LA SEÑAL DE CALCIO CITOSÓLICA

EN LA CÉLULA β PANCREÁTICA

Autor:

ISAAC BENITO GONZÁLEZ

Titulación:

GRADO EN BIOTECNOLOGÍA

Tutor:

IVÁN QUESADA MOLL

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ÍNDICE

ABREVIATURAS ...................................................................................................................................4

RESUMEN ..........................................................................................................................................5

1. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................6

1.1. El páncreas. El islote de Langerhans ........................................................................................6

1.2. Homeostasis de la glucosa sanguínea. Diabetes Mellitus. .......................................................7

1.3. La célula beta: acoplamiento estímulo-secreción..................................................................10

1.4. Los canales KATP en célula β-pancreática. ...............................................................................13

1.5. Tolbutamida y diazóxido .......................................................................................................14

2. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS ......................................................................................................15

3. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................................16

3.1. Animales ................................................................................................................................16

3.2. Aislamiento de los islotes de Langerhans ..............................................................................16

3.3. Registros de señalización de calcio intracelular con sondas fluorescentes. Registro

ratiométrico de calcio intracelular en célula ß en islote completo ...........................................17

3.4. Estadística .............................................................................................................................21

4. RESULTADOS ................................................................................................................................21

4.1. La Tolbutamida aumenta la señalización de Ca2+ intracelular en célula β pancreática..........21

4.2. El Diazóxido disminuye la señalización de Ca2+ intracelular en célula β pancreática .............27

5. DISCUSIÓN ...................................................................................................................................28

6. CONCLUSIONES Y PROYECCIÓN FUTURA ....................................................................................31

7. BIBLIOGRAFÍA ..............................................................................................................................33

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Representación esquemática de los tipos celulares y de sus principales interacciones

hormonales en el islote de Langerhans.. ............................................................................................6

Figura 2. Representación de los islotes de Langerhans en humano (A) y en ratones (B). ..................7

Figura 3. Esquema del control de los niveles de glucemia por parte de la insulina y el glucagón. .....8

Figura 4. Registro de la actividad eléctrica oscilatoria de las células β en islotes intactos.. .............11

Figura 5. Acoplamiento estímulo-secreción en la célula β.. .............................................................12

Figura 6. Organización estructural del KATP. .....................................................................................13

Figura 7. Estructuras de la tolbutamida (izquierda) y diazóxido (derecha). .....................................14

Figura 8. Ratón en posición decúbito supino para la extracción del páncreas. ................................17

Figura 9. A, Esquema del equipo de imagen de fluorescencia. B, Espectro de excitación del Fura-2

a diferentes concentraciones de Ca2+ libre. ......................................................................................18

Figura 10. Registro control representativo. .....................................................................................22

Figura 11. Registro representativo del tipo 2 ...................................................................................23

Figura 12. Análisis comparativo del AUC de los últimos 5 minutos de la perfusión de 11 mM

Glucosa en los registros control o tipo 1 (1) y de los últimos 5 minutos del tipo 2. .........................23

Figura 13. Registro representativo del tipo 3. ..................................................................................24

Figura 14. Análisis del AUC de los registros del tipo 3. .....................................................................25

Figura 15. Análisis comparativo del AUC de los registros del tipo 2 y 3.. .........................................25

Figura 16. Análisis de la amplitud de los picos en los diferentes medios de perfusión indicados ....26

Figura 17. Registro representativo del tipo 4.. .................................................................................27

Figura 18. Análisis del AUC de los registros del tipo 4.. ....................................................................27

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ABREVIATURAS

ADP: Adenosine DiPhosphate (Adenosina Difosfato)

ATP: Adenosine TriPhosphate (Adenosina Trifosfato)

CaV: canales de calcio dependientes de voltaje

DIAZ: Diazóxido

DM: Diabetes Mellitus

FADH2 : dinucleótido de flavina-adenina

FID: Federación Internacional de Diabetes

GLUT-1: Glucose Transporter 1

GLUT-2: Glucose Transporter 2

K ATP : canales de potasio dependientes de ATP

KV : canales de potasio dependientes de voltaje

NADH: dinucleótido de nicotinamida y adenina

PP: polipéptido pancreático

T2DM: Type 2 Diabetes Mellitus (Diabetes Mellitus tipo 2)

TMD: dominio transmembrana

TOL: Tolbutamida

Vmb : potencial de membrana o potencial transmembrana

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Resumen

Ante la cada vez mayor prevalencia mundial de la diabetes mellitus (DM) y su relevancia

en la sociedad occidental, numerosos estudios se han centrado en buscar diferentes estrategias

terapéuticas con la finalidad de estabilizar los niveles de glucosa en sangre. La tolbutamida (TOL) y

el diazóxido (DIAZ) son dos compuestos utilizados en diabetes así como en otras alteraciones

como la hiperinsulinemia. Actúan a nivel del KATP provocando el cierre o apertura del mismo

respectivamente. Por tanto, el presente trabajo aborda el estudio del efecto de la TOL y el DIAZ en

las células β pancreáticas y cómo su unión a este canal modifica la concentración de Ca2+

intracelular. Mediante experimentos de microscopía de fluorescencia en islote intacto se observó

que la TOL aumenta la señalización de Ca2+ intracelular mientras que el DIAZ la disminuye (ambas

en célula β). Estos resultados definen la actuación de la TOL y el DIAZ a través de los KATP y

confirma estos canales como una diana terapéutica para el tratamiento de la diabetes,

hiperinsulinemias o hipoglucemias.

Palabras Clave: Tolbutamida, Diazóxido, Diabetes, KATP, islotes de Langerhans.

Summary

Due to the increasing prevalence of Diabetes Mellitus (DM) specially in western societies,

scientific efforts in discovering how to maintain glucose levels have increased too. Tolbutamide

(TOL) and Diazoxide (DIAZ) are two pharmacological compounds largely used in the treatment of

many diseases such as diabetes or hyperinsulinemia. They both bind to the ATP-modulated

potassium channels modifying its status, respectively increasing or decreasing cytosolic calcium

concentration. Experiments using fluorescence microscopy in intact islets reveal that TOL

increases the non glucose-induced intracellular Ca2+ signaling in β pancreatic cells. On the other

hand, DIAZ has been shown to decrease intracellular Ca2+ signaling in the same type of cells. These

results define TOL and DIAZ mechanism of action, confirming its linkage to KATP channels as a

promising region where new therapeutic compounds can be researched in order to treat different

diseases as the ones already mentioned.

Keywords: Tolbutamide, Diazoxide, Diabetes, KATP, Islets of Langerhans.

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1. INTRODUCCIÓN

1.1. El páncreas. El islote de Langerhans

El páncreas es un órgano situado en la zona interior del abdomen formado tanto por tejido

exocrino como endocrino. El primero constituye el 99% de la masa total del órgano mientras que

el segundo apenas constituye un 1% del total, y se agrupa en poblaciones de 1000-3000 células

que son las que forman los islotes de Langerhans. En ellos se producen y segregan las hormonas

que serán las encargadas de mantener los niveles óptimos de glucosa en sangre (normoglucemia).

Cada tipo de célula produce un tipo de hormona donde existen regulaciones tanto negativas como

positivas (Fig. 1). El tipo celular predominante es la célula β, encargada de producir la insulina. A

continuación la célula α, donde se produce el glucagón y cuyo estudio está cobrando especial

relevancia en la actualidad (Quesada et al., 2008). Finalmente y en menor proporción, las células

δ, PP y ԑ encargadas de producir somatostatina (SST), polipéptido pancreático y ghrelina

respectivamente. Esta última parece que adquiere especial relevancia en los periodos gestacional

y fetal de humanos y ratones, aunque su número decrece drásticamente tras el nacimiento

(Wierup et al., 2002).

Figura 1. Representación esquemática de los tipos celulares y de sus principales interacciones

hormonales en el islote de Langerhans.

Las interacciones entre hormonas han sido ampliamente descritas, demostrando que

existe una regulación autocrina y paracrina dentro del islote (Fig.1). Cabe destacar el efecto

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inhibitorio de la insulina sobre la secreción de glucagón en la célula α (Maruyama et al., 1984), y la

regulación negativa que la propia insulina realiza sobre la célula β (Khan et al., 2001).

Figura 2. Representación de los islotes de Langerhans en humano (A) y en ratones (B). Secciones

tomadas con microscopía confocal de una preparación inmunohistoquímica con un triple marcaje anti-

insulina (rojo), anti-glucagón (verde) y anti-somatostatina (azul). Modificado de Cabrera et al., 2006.

Es importante mencionar que la abundancia relativa de cada tipo celular en el islote varía

con la especie. En humanos se encuentran bastante entremezclados a lo largo del núcleo del

islote, siendo la célula β la mayoritaria (54%) seguido de la célula α (36%) y célula δ (10%). Sin

embargo, los islotes de ratón se distribuyen de forma diferente; un núcleo muy extenso de células

β (75%) colindado en superficie por células no-β (α-19% ; δ-6%). (Cabrera et al., 2006) (Fig. 2).

1.2. Homeostasis de la glucosa sanguínea. Diabetes Mellitus.

La glucosa es, para la gran mayoría de los organismos, la fuente principal de energía con la

que realizan los procesos metabólicos y un intermediario fundamental en ellos. Por ello es vital

que sus niveles se encuentren perfectamente regulados. Un circuito de retroalimentación negativa

entre la insulina (células β) y el glucagón (células α) es la principal vía de control cuando nos

encontramos en condiciones fisiológicas normales.

Cuando la glucemia se encuentra a niveles más altos de los habituales (hiperglucemia, p.ej.

momentos posteriores a la ingestión de alimentos) se libera la insulina. Esta hormona es capaz de

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disminuir los niveles de glucosa hasta la normoglucemia mediante su movilización y

transformación a grasas (lipogénesis) y carbohidratos (glucogénesis) en el tejido adiposo, muscular

e hígado principalmente. Se obtiene además una gran cantidad de energía ya que la insulina

aumenta la captación y posterior oxidación de la glucosa en la glucólisis. Sin embargo, en

condiciones de glucosa sanguínea baja (hipoglucemia, p.ej. en condiciones de ayuno) son las

células alfa del páncreas las que actúan liberando glucagón. Esto provoca que aumenten los

niveles de glucosa plasmática mediante la producción hepática de glucosa, fundamentalmente a

través de la gluconeogénesis y la glucogenolisis (Quesada et al., 2008). Por tanto, un cambio

significativo en la concentración de glucosa plasmática no solo induce a la liberación de la

hormona correspondiente sino también a la inhibición de su opuesta (Fig. 3).

Parece evidente, por tanto, que la función principal del islote de Langerhans es la

regulación de la homeostasis de la glucosa en sangre. Por ello, los islotes están altamente

vascularizados recibiendo así unas 20 veces más flujo sanguíneo que la parte exocrina, facilitando

el intercambio de hormonas entre la sangre y los tejidos circundantes (Lifson et al., 1985; Cao e

Wang, 2014). Los sistemas simpático, parasimpático y sensorial también inervan altamente a los

islotes. Por ellos se ve afectada su función y su fisiología (Ahren, 2000).

Figura 3. Esquema del control de los niveles de glucemia por parte de la insulina y el glucagón.

Imagen tomada de http://163.178.103.176/CasosBerne/7gRenal/Caso38-1/HTML/CasosB2/Poli/Poli1.htm

Las variaciones y alteraciones de esta homeostasis puede conducir al desarrollo de

diferentes enfermedades, siendo la más común la diabetes mellitus (DM) (Dunning et al., 2005).

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Esta se define como un síndrome metabólico crónico de origen multifactorial caracterizado por

unos niveles de glucemia elevados (hiperglucemia) con alteraciones en el metabolismo de los

carbohidratos, grasas y proteínas por déficit de insulina o una acción ineficaz de esta en sus tejidos

diana, o incluso ambos. Esto induce una mala utilización de la glucosa cuyas consecuencias son

principalmente la tríada clásica de poliuria, polidipsia y polifagia además de pérdida de peso y

visión borrosa.

La DM se clasifica principalmente en dos categorías: tipo I y tipo II. En la primera se

produce una destrucción de las células β que conlleva a un déficit casi absoluto de insulina, siendo

esta destrucción mayoritariamente autoinmune aunque también puede ser idiopático. El tipo II se

caracteriza por una secreción deficiente de la hormona, habitualmente asociada a una resistencia

a la insulina por parte de los tejidos diana. Existen además otros tipos de DM como la diabetes

gestacional, provocada por una resistencia a la insulina producida durante el embarazo y otras

específicas causadas por defectos genéticos o inducidas por fármacos o productos químicos.

La incidencia de la DM aumenta cada año, y el número de afectados ronda actualmente el

9% de la población adulta, y se prevé que alcance el 10% de aquí al año 2040 (datos de la

federación internacional de la diabetes, 2016). Esto ha repercutido sobre todo en los países con

ingresos bajos o medios, favorecido por la mayor prevalencia de la obesidad así como de la

inactividad física, que son factores asociados a un mayor riesgo de padecer ciertas patologías

graves como es en este caso la DM del tipo II (Haslam e James, 2005).

1.3. La célula beta: acoplamiento estímulo-secreción.

Aunque aún existen ciertas controversias puntuales, hay suficiente información como para

poder construir un modelo preciso de cómo se genera y modula la actividad eléctrica en la célula β

del islote de Langerhans en respuesta a los diferentes estímulos, principalmente la glucosa

plasmática. Existe un acoplamiento eléctrico entre las células β que componen el islote, lo que

hace que las variaciones de [Ca2+]i provocadas por los disparos en los potenciales de acción se

sincronicen a nivel de islote completo y por tanto la secreción de insulina se vea aumentada y

favorecida (Bergsten, 1995), primando así una respuesta global sobre las individuales (Santos et

al., 1991). Aunque existen algunas pequeñas diferencias entre el modelo humano y los ratones, los

puntos básicos del modelo para el acoplamiento estímulo-secreción establecen el comienzo de la

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fase activa a través del disparo de los potenciales de acción. Esto es consecuencia del cierre del

KATP tras la metabolización de glucosa (Rorsman e Braun, 2013) y un incremento asociado de la

[Ca2+]i debido a la apertura de los canales de Ca2+ dependientes de voltaje (Quesada et al., 2006);

que desencadenaría el proceso de exocitosis hormonal. Esto recogería los principales y más

importantes pasos del proceso que son comunes además a ambos modelos.

El proceso en sí sigue una serie de pasos que siempre ocurren en el mismo orden: en

primer lugar la glucosa sanguínea llega a los islotes a través de los capilares sanguíneos que los

irrigan, y entra en el citoplasma de estas a través de los transportadores específicos de glucosa,

GLUT2. Ya en su interior, esta es fosforilada por la hexoquinasa IV y posteriormente metabolizada

a piruvato a través de la glucólisis. Posteriormente se produce la entrada a la mitocondria del

piruvato activando el Ciclo de Krebs. Esto genera los nucleótidos NADH y FADH2, que actúan como

fuente de transferencia de electrones en la fosforilación oxidativa y en la síntesis de ATP (Quesada

et al., 2006). Cuando la razón ATP/ADP se incrementa, los canales de K+ dependientes de ATP

(KATP), que son los responsables de mantener el potencial de reposo de la célula, se cierran,

acumulando así el potasio intracelular (Huypens et al., 2012). Una vez generada la actividad

eléctrica esta siempre sigue un patrón bifásico: una fase activa correspondiente a la

despolarización y una fase silente de unos pocos segundos producida por la repolarización de la

membrana (Fig. 4).

En la fase activa, la despolarización de la membrana llega a un potencial umbral en el que

se disparan los potenciales de acción por apertura de canales de Ca2+. Como resultado de la

despolarización durante el potencial de acción se produce una entrada de Ca2+ a la célula

aumentando la [Ca2+]i al abrirse los canales de Ca2+ dependientes de voltaje (Cav 1.2/L-Type).

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Figura 4. Registro de la actividad eléctrica oscilatoria de las células β en islotes intactos. En él se

puede apreciar tanto la respuesta oscilatoria como las duraciones de las diferentes fases a una [glucosa] ext

de 8, 16 y 20 mM. El registro inferior es una muestra ampliada del fragmento sombreado del superior donde

se señalan las fases que caracterizan la respuesta oscilatoria. Figura obtenida de la Tesis doctoral Alejandro

González Álvarez, 2013.

Esto provoca la liberación rápida de la insulina almacenada, principalmente en aquellos

gránulos de secreción maduros unidos o cercanos a la membrana plasmática correspondiente a lo

que sería la primera fase de liberación de hormona y que tiene lugar durante los primeros 3-5

minutos. Si el metabolismo de la glucosa se mantiene, se moviliza la insulina sintetizada de nuevo

desde el interior de la célula debido al calcio que entra a través de otro grupo de canales de Ca2+

conocidos como Cav2.3 (R-Type) (Fig. 5) (Nitert et al., 2008).

Así se produce la segunda fase de secreción de insulina. De esta manera, un estímulo >8

mM glucosa genera una señal de Ca2+ oscilatoria acompañada de la liberación pulsátil de insulina.

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Figura 5. Acoplamiento estímulo-secreción en la célula β. En condiciones basales, los KATP

permanecen abiertos y mantienen el potencial de membrana de la célula β en reposo. Al aumentar la

glucosa, el ATP que produce su metabolización cierra los KATP permitiendo la despolarización de la

membrana. La despolarización de la membrana abre canales dependientes de voltaje que introducen calcio

en la célula. El incremento de calcio provoca la liberación de insulina en dos fases, una primaria mediada por

los canales CV1.2 y una secundaria por CV2.3.

Cabe destacar también que la respuesta oscilatoria no es privativa de la glucosa y se puede

apreciar también en presencia de otros compuestos como pueden ser concentraciones bajas de

tolbutamida, algo que se verá a lo largo de este trabajo.

1.4. Los canales KATP en célula β-pancreática.

Los KATP tienen un papel fundamental actuando como unión entre el metabolismo y la

excitabilidad de la célula. El desarrollo de nuevas técnicas como la cristalización o las estructuras

3D han permitido proponer un modelo estructural que concuerda altamente con los resultados

obtenidos experimentalmente mediante mutagénesis dirigida (Antcliff et al., 2005). Respecto a su

estructura molecular, el KATP es un complejo hetero-octamérico (4:4) (Shyng e Nichols, 1997),

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cuyos 2 tipos de proteínas son la Kir6.x y SUR, con 2 genes descritos de cada una (Kir6.1 y Kir6.2, y

SUR1 y SUR2). Concretamente Kir6.2 y SUR1 son los correspondientes en célula β (Fig 6).

Figura 6. Organización estructural del KATP.Topología de las subunidades fisiológicas que conforman

el KATP: Aparecen las uniones a los principales agentes fisiológicos así como las regiones de unión a los

fármacos de interés (tolbutamida y diazóxido) en las subunidades SUR1 y Kir6.2. Diaz = Diazóxido, Tol =

Tolbutamida. Modificado de la tesis doctoral de Alejandro González Álvarez (2013).

De entre las dos subunidades proteicas destaca sobre todo SUR1. Es básicamente

considerada la diana de unión de fármacos secretagogos que inhiben la actividad del canal

(tolbutamida) u otros fármacos activadores (diazóxido), y se caracteriza por poseer múltiples

dominios transmembrana y 2 dominios intracelulares de unión a nucleótidos (Higgins, 1995). Sin

embargo Kir6.2 es un miembro de la subfamilia de los rectificadores internos de la familia de los

canales de potasio (Inagaki et al., 1995; Sakura et al., 1995). Esta característica hace referencia a la

capacidad de introducir mayor cantidad de corriente de entrada que de salida a valores similares

de voltaje incluso cuando la concentración de potasio intracelular es igual a la extracelular.

Cuando el ratio ATP/ADP aumenta, este ATP interacciona con él y como consecuencia se produce

el cierre del canal (Tanabe et al., 1999)

1.5. Tolbutamida y diazóxido

Los efectos tanto de la tolbutamida como del diazóxido están ampliamente definidos en

las células β. La tolbutamida pertenece a la familia de fármacos de las sulfonilureas. Las

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sulfonilureas (SU) son fármacos insulinosecretores que, administrados por vía oral, actúan en

receptores específicos de la célula β-pancreática. La relación de estas SU con la diabetes radica en

el descubrimiento de que se produce un descenso en la permeabilidad a potasio por parte de la

membrana (uniéndose a los KATP y se despolarizando la célula β, produciendo secreción de

insulina) (Sturgess et al., 1985). Al parecer, la tolbutamida posee dos sitios de unión al KATP (Fig. 7).

Uno de alta afinidad correspondiente al receptor de la sulfonilurea (SUR1) (Aguilar-Bryan et al.,

1995) y otro de baja afinidad en Kir6.2. La unión de la tolbutamida a SUR1 bloquea los KATP

produciendo una despolarización de la membrana (Trube et al., 1986). Esto conlleva un

incremento en la duración de las oscilaciones de [Ca2+]i y un aumento en la secreción de insulina

(Mariot et al., 1998). Se ha visto además que la especificidad de la tolbutamida por su sitio de

unión de alta afinidad (SUR1) es muy elevada ya que se une a él y cierra el canal en células β-

pancreáticas pero no en cardíacas (SUR2A) aunque sí que mantiene su unión de baja afinidad. Esto

pone de manifiesto la importancia y dificultad a la hora de seleccionar los fármacos para combatir

la diabetes, que han de ser específicos de las subunidades del KATP de célula β (Ashcroft e Gribble,

1999).

Figura 7. Estructuras de la tolbutamida (izquierda) y diazóxido (derecha). Imágenes tomadas de

www.sigmaaldrich.com

El diazóxido, por el contrario, se utiliza para el tratamiento clínico de hiperinsulinemias

(Fatehi et al., 2015), insulinomas e hipoglucemias causadas por sobretratamiento con sulfonilureas

(SU) (Ferner e Neil, 1988). El diazóxido revierte la inhibición del KATP que se produce mediante la

ocupación de nucleótidos citosólicos en el sitio de unión del canal. Para conseguir este efecto el

diazóxido requiere la hidrólisis del ATP citosólico, incluso parece que si no hay suficiente cantidad

de este, los efectos del diazóxido sobre el KATP se ven muy reducidos. (Schwanstecher et al., 1992;

Harding et al., 1993). Por tanto, este compuesto abre los KATP e hiperpolariza las células β

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pancreáticas. Esto provoca un descenso en la [Ca2+]i y una fuerte inhibición en la secreción de

insulina (Samols e Marks, 1966; Dunne et al., 1987; Kozlowski et al., 1989). (Fig. 7).

2. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS

Aunque la etiología de la DM de tipo II está aún por clarificar totalmente, es conocido que

las deficiencias en la secreción de insulina por parte de las células β son un factor clave. Una

posible razón para la pérdida de la sensibilidad a la glucosa por parte de estas células podría estar

asociado a los canales KATP, bien por un defecto en el propio canal o en su regulación. Durante los

últimos años se ha producido un progreso muy rápido acerca de la relación entre la estructura y la

función de los canales KATP. Pese a que el mecanismo de modulación de estos sigue siendo incierto,

se sabe que ciertas deficiencias en los KATP pueden conducir a desórdenes metabólicos (Ashcroft e

Gribble, 1999). Por tanto, es esencial conocer en profundidad todas sus vías de regulación. El

cierre de estos provoca la despolarización de la membrana plasmática (Huypens et al., 2012) que

genera la apertura de los canales dependientes de voltaje, llevando a la entrada de Ca2+, lo que

produce una liberación de la insulina. Es interesante por tanto conocer vías que, en última

estancia, conduzcan a la liberación de la insulina sobre todo para posibles tratamientos de la DM

tipo II. Existen ciertos agentes farmacológicos como la tolbutamida, que bloquean el canal de KATP

mientras que otros como el diazóxido favorecen su apertura.

El objetivo general del presente estudio es determinar el efecto de la tolbutamida y el

diazóxido sobre la señal de calcio citosólica en las células β, debido a su estrecha conexión con la

apertura-cierre de los KATP. Para ello se fijaron los siguientes objetivos específicos:

1. Analizar la señal de calcio intracelular de las células β en presencia de tolbutamida, en

concentraciones tanto estimulatorias como no estimulatorias de glucosa.

2. Analizar la señal de calcio intracelular de las células β en presencia de diazóxido en

concentraciones estimulatorias de glucosa.

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3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Animales

En el presente trabajo se han utilizado ratones macho adultos C57BL/6J de 12- 14 semanas

de edad procedentes del Servicio de Experimentación Animal (SEA) de la UMH. Los ratones

C57BL/6J son consanguíneos y su cepa está ampliamente caracterizada. Ha sido utilizada en una

gran variedad de áreas de investigación, desde la biología cardiovascular a la investigación

neurosensorial, pasando por la biología del desarrollo, la diabetes y obesidad, genética,

inmunología y neurobiología. Todos los procedimientos llevados a cabo con animales de

experimentación fueron aprobados por el Comité Ético de la UMH de acuerdo a las normativas

nacionales e institucionales.

3.2. Aislamiento de los islotes de Langerhans

Para la obtención y aislamiento de islotes, se sacrifica al ratón por dislocación cervical y se

coloca en posición decúbito supino (Fig. 8). Se realiza una incisión ventral con línea media vertical

que permite la inspección de los órganos abdominales. Se separa el hígado hacia la zona superior

manteniéndolo apartado para poder localizar el conducto biliar o colédoco más fácilmente. Una

vez localizado, es necesario suturarlo a la altura de su unión con el intestino delgado, de forma

que impida el paso de flujo hacia él, pues posteriormente se perfundirá una solución de 0.5 mg/ml

de colagenasa (Sigma, España) en medio de aislamiento (composición en mM: 115 NaCl, 10

NaHCO3 , 5 KCl, 1.2 NaH2CO4 , 1.1 MgCl2 ·6 H2O, 25 HEPES, 2.5 CaCl2, 0.25% BSA y 5 Glucosa)

ajustado a pH 7.4 hasta alcanzar el volumen de páncreas máximo adecuado. Esto se puede

conseguir mediante la inserción de una cánula que será fijada mediante una nueva sutura a nivel

proximal, o mediante introducción directa y manual de la jeringa a través de una pequeña incisión

realizada previamente a la misma altura. Una vez el páncreas ha alcanzado el nivel máximo (tras 3-

4 mL de perfusión) se extrae y se transfiere a un tubo falcon con medio de aislamiento con

colagenasa, que se incuba en un baño a 37ºC durante 10 minutos, para la disgregación del tejido

exocrino por digestión enzimática. Una vez transcurrido este tiempo, se agita tras una pequeña

comprobación visual. Para inhibir la enzima, se añade medio frío (sin colagenasa) que permite

parar la reacción. Finalmente se separan los islotes utilizando una micropipeta y bajo inspección

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por lupa y se incuban en placa Petri con medio de aislamiento limpio a 37º C y 5% de CO2, durante

2 horas para su recuperación y posterior utilización. Este procedimiento es un protocolo

estandarizado ya descrito por otros autores (Nadal et al., 1999; Quesada et al., 2003).

Figura 8. Ratón en posición decúbito supino para la extracción del páncreas en el momento de la

inyección de la colagenasa a través de la cánula para que el órgano alcance el volumen idóneo.

3.3. Registros de señalización de calcio intracelular con sondas fluorescentes. Registro

ratiométrico de calcio intracelular en célula ß en islote completo

La [Ca2+]i (concentración intracelular de calcio) se midió utilizando Fura-2, un fluoróforo

derivado de EGTA sensible a este catión que contiene un sitio selectivo de unión a Ca2+, pero

especialmente mucho más selectivo para este que con respecto al Mg2+, algo crucial ya que la

concentración intracelular del Mg es mucho mayor que la del Ca2+. En el espectro de excitación del

fluoróforo se pueden observar dos máximos; uno a 340 nm que es el correspondiente al de la

sonda unida al catión, y otro a 380 nm perteneciente a la sonda exclusivamente (en su forma libre)

(Fig. 9B). De esta forma se pueden emplear registros ratiométricos donde se reduzcan

sensiblemente o directamente se anulen las interferencias, confirmando así que los datos de

fluorescencia obtenidos se deben exclusivamente a las variaciones en las [Ca+2]i . Por lo tanto, lo

más habitual en la representación de los datos obtenidos con fura-2 es hacerlo como la razón de

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fluorescencia de 510 nm recogida tras excitar la muestra a 340 y 380 nm (F340/F380) para lo que

se lanza ráfagas de excitación alternativamente de cada una de ellas. Como además esta sonda

presenta un punto isosbéstico a 360 nm, también se usa el ratio (F360/380), que ha sido además el

utilizado en estos experimentos tal y como se observa en los registros.

Figura 9. A, Esquema del equipo de imagen de fluorescencia. 1. Lámpara, 2. Rueda de filtros

monocromados de excitación, 3. Espejo dicroico, 4. Objetivo, 5.Cámara portadora de células, 6. Filtro de

emisión, 7. Cámara. B, Espectro de excitación del Fura-2 a diferentes concentraciones de Ca2+ libre. Las

líneas naranjas corresponden a los dos máximos, el de la sonda unida al catión y el de la sonda libre

respectivamente. (Villalobos et al., 2009)

Para realizar la medida de [Ca2+]i , los islotes se cargaron con 4 µM (2 µL por cada mL de

medio de incubación de los islotes) de fura-2-AM (Invitrogen, Madrid). Para que la sonda

penetrara correctamente, es necesario mantener la incubación durante al menos 1 hora, a

temperatura ambiente, en atmósfera húmeda y gaseados con carbógeno (mezcla de 95% O2 y 5%

19

CO2 ). Una vez cargados, estos son transferidos de uno en uno a una cámara de registro, donde

quedarán fijados gracias al pretratamiento del cubre donde se colocan con poli-L-lisina. Por ello es

conveniente una perfusión de los estímulos a baja velocidad y constante, ya que hay un alto riesgo

de que el islote no quede correctamente fijado y desaparezca del plano focal, impidiendo elaborar

los registros. Es importante mantener una temperatura constante de 37ºC durante todo el

proceso. La cámara y el sistema de perfusión se encuentran acoplados a un microscopio invertido

de epifluorescencia cuyo modelo es Axiovert 200 (Carl Zeiss, Alemania). El islote (o más bien la

cámara que lo contiene) es iluminada mediante una lámpara halógena a 360 y 380nm, excitando

alternativamente al fluorocromo. Tras ser excitado, este emite otra luz que ha de atravesar

inicialmente el espejo dicroico para que, a continuación, tras atravesar un segundo filtro de 510

nm (Omega Optics, Madrid), la cámara de alta resolución modelo ORCA C4742-95 (Hamamatsu

Photonics, Barcelona) recoja esta señal y la amplifique (Fig. 9A). Se tomaba 1 imagen cada 3

segundos. Tanto los parámetros asociados a los diferentes componentes del sistema y la

monitorización de la señal de calcio se controlaron mediante la interfaz del software Aquacosmos

2.0 (Hamamatsu Photonics, Barcelona).

Durante los experimentos, la perfusión contenía (en mM): 115 NaCl, 5 KCl, 10 NaHCO3, 1.1

MgCl2 ·6 H2O, 1.2 Na2HPO4, 2.5 CaCl2, 25 HEPES, suplementada con diferentes estímulos (3 mM

Glucosa, 11 mM Glucosa, 3 mM Glucosa + 40 µM Tolbutamida, 11 mM Glucosa + 40 µM

Tolbutamida y 11 mM Glucosa + 100 µM Diazóxido). La velocidad de la perfusión se ajusta a 1.67

ml/min (óptima para los registros en islotes completos). La duración de cada registro ratiométrico

de calcio intracelular es variable en función de los registros. El tiempo de perfusión de cada

tratamiento se establece para obtener un cambio estable en la respuesta así como para permitir

un análisis más exhaustivo de los resultados:

Registro 1 o control: Este primer registro se realiza para identificar la respuesta

característica de la célula β. Este tipo celular en un ratón se encuentra

ampliamente distribuido (77% de la masa del islote). Para ello se perfunde durante

los primeros 10 minutos una solución con concentración de glucosa no

estimulatoria (3 mM) y así obtener la señal basal de calcio intracelular. Durante los

siguientes 20 minutos se perfunde una solución con concentración de glucosa

20

estimulatoria (11 mM) que genera un aumento en la señal de calcio debido a su

entrada al interior celular.

Registro 2: En este segundo registro, de nuevo se perfunde inicialmente con una

concentración de glucosa no estimulatoria (3 mM) para obtener la señal basal de

calcio intracelular, aunque esta vez únicamente 5 minutos. Durante los siguientes

8 minutos se perfunde la misma concentración de glucosa (3 mM) a la que se le

añade tolbutamida a una concentración de 40 µM.

Registro 3: Durante los primero 3 minutos de este registro se perfunde de nuevo

glucosa a una concentración no estimulatoria (3 mM). Posteriormente se perfunde

una concentración de glucosa estimulatoria (11 mM) durante los 10 minutos

posteriores, y finalmente se perfunde esta misma concentración de glucosa

estimulatoria (11 mM) suplementada con tolbutamida a una concentración de 40

µM durante los últimos 7 minutos.

Registro 4: En este último registro, se perfunde inicialmente 5 minutos de una

concentración no estimulatoria de glucosa (3 mM), los siguientes 10 minutos a una

concentración estimulatoria de glucosa (11 mM), y los últimos 10 minutos se

mantiene la concentración de glucosa pero suplementada con diazóxido 100 µM.

Para el análisis de los registros se calcula el área bajo la curva (AUC) en los últimos 5

minutos de cada estímulo con el software Origin v7.0552 ya que es una forma de poder medir la

cantidad de Ca2+ intracelular (Rafacho et al., 2010; Gonzalez et al., 2013). Asumimos que la señal

detectada corresponde a la proveniente de las células β puesto que el microscopio de

epifluorescencia permite recoger la señal de varios planos focales a diferentes distancias del plano

ecuatorial del islote y que, dada la arquitectura característica de los islotes de ratón, el núcleo

central de este está formado mayoritariamente por este tipo de células, asumimos que la señal

obtenida en los registros de islote completo pertenece a las células β. (Cabrera et al., 2006). En

algunos casos se midió también la amplitud de la señal de calcio sustrayendo el valor basal de

F360/380 en ausencia de estímulo (3 mM glucosa) al valor de F360/380 correspondiente al punto

21

máximo de la señal tras el estímulo (glucosa 11 mM o glucosa suplementada con tolbutamida

40µM).

3.4. Estadística

Todos los datos se representan como la media ± el error estándar del número de

experimentos (n). Se consideran diferencias estadísticamente significativas cuando al realizar la

prueba t de Student el valor de p ≤ 0.05 (*:p≤0.05; **:p≤0.01; ***:p≤0.001). Se empleó

indistintamente el “paired t test” o “unpaired t test” en función de cada caso (datos

correspondientes al mismo islote o a distintos, respectivamente). En caso de comparar más de 2

datos, se analizó mediante ANOVA one way, seguido de un post-test de Tukey.

4. RESULTADOS

4.1. La Tolbutamida aumenta la señalización de Ca2+ intracelular en célula β pancreática

A nivel citosólico, el Ca2+ está implicado en gran cantidad de procesos celulares. En las

células β pancreáticas (estudiadas en este trabajo a nivel de islote completo), un aumento de la

[Ca2+]i, generalmente producido por una [glucosa]ext elevada (11 mM) activa la secreción de

insulina en última estancia, lo que explica la gran relevancia del ión. Las variaciones de [Ca2+]i al

aplicar los diferentes tratamientos (TOL y DIAZ suplementados con glucosa) en células β

pancreáticas se midieron utilizando la sonda Fura-2 (excitable al Ca2+). Para llevar a cabo la

identificación de las células β pancreáticas de estudio dentro de los islotes completos, se

perfundió una concentración inicial de glucosa no estimulatoria (3 mM) seguida de otra

estimulatoria (11 mM). Cuando los islotes fueron estimulados por concentraciones de glucosa

bajas, no había respuesta apreciable y la línea de fluorescencia se mantuvo a un nivel tomado

como basal. Sin embargo, al aumentarse la concentración de glucosa exterior hasta 11 mM los

registros presentaron un patrón de incremento de [Ca2+]i bifásico típico de la respuesta del islote

intacto. Este se caracteriza por presentar un incremento inicial elevado y puntual, seguido de un

descenso pronunciado pero nunca inferior a los niveles basales, para finalmente aumentar la

frecuencia oscilatoria de forma sostenida. Por otro lado se midió también el área bajo la curva

(AUC, del inglés area under the curve) de los registros ratiométricos de variación de [Ca2+]i de

22

célula β confirmándose que a una concentración de glucosa exterior elevada (11 mM) el AUC era

significativamente mayor que a glucosas bajas, pero sobre todo para que sirviera como punto de

partida en las comparaciones del AUC obtenidas al utilizar el resto de compuestos. Además se

producían las oscilaciones anteriormente mencionadas tras el pico transitorio inicial (unas 5

oscilaciones/minuto en los registros control) (Fig. 10). Se midió también la amplitud de los picos

de fluorescencia alcanzados al perfundir glucosa a una concentración estimulatoria, obteniéndose

una amplitud media de 0,31 ± 0,05 unidades arbitrarias (u.a.) (n=6).

1.0

1.2

1.4

1.6

11 mM G

5 min

3 mM G

F360/F

380

Figura 10. Registro control representativo. En una primera fase (Glucosa no estimulatoria) se

aprecia la fluorescencia asociada a la [Ca2+]i basal (A). Al perfundir glucosa a una concentración estimulatoria

(11 mM) se produce un pico (B) correspondiente al incremento de [Ca2+]i para finalmente descender de

nuevo aunque por encima de nivel basal inicial y oscilar (C). G = Glucosa.

Sin embargo, al perfundir una concentración de glucosa no estimulatoria (3 mM) con

tolbutamida 40 µM se produjo también un incremento significativo en la [Ca2+]i similar al

producido anteriormente por una concentración estimulatoria de glucosa (11 mM) (Fig. 11).

Posteriormente se analizaron los resultados calculando el AUC de los últimos 5 minutos del

registro para cuantificar así el aumento de la [Ca2+]i producido por la tolbutamida y comparándolo

con otro registro estimulatorio (últimos 5 minutos de los registros control, con glucosa a 11 mM)

En este caso la amplitud media de los picos máximos alcanzados fue de 0,42 ± 0,03 u.a. (n=6) (Fig.

12).

A

B

C

23

1.0

1.2

1.4

1.6

5 min

Tolbutamida 40 M

3 mM G

F3

60/F

38

0

Figura 11. Registro representativo del tipo 2. En él se aprecia de nuevo una línea basal

correspondiente a una concentración no estimulatoria de glucosa (A) seguido de un pico similar al producido

por una concentración estimulatoria de glucosa, aunque causado en este caso por la tolbutamida (B). G =

Glucosa.

11 mM G (1) 3 mM G + TOL (2)0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

**

AU

C (

u.a

.)

Figura 12. Análisis comparativo del AUC de los últimos 5 minutos de la perfusión de 11 mM Glucosa

en los registros control o tipo 1 (1) y de los últimos 5 minutos del tipo 2 concretamente de la región

perfundida con glucosa 3 mM + tolbutamida (2). En ambos casos el número total de registros de cada tipo es

6 (n=6) **:p≤0.01.

De forma paralela a este experimento, se realizó otro similar donde se añadía la

tolbutamida a la misma concentración (40 µM) pero después de estimular el islote con una

concentración de glucosa de 11 mM, y manteniendo esta al añadir la tolbutamida (Fig. 13). El

A

B

24

incremento producido en la [Ca2+]i por esta es altamente similar al producido por la misma

concentración de tolbutamida pero en un medio de glucosa no estimulatorio (3 mM) como ocurría

en los registros del tipo 2. Esto se pudo comprobar midiendo el AUC de los últimos 5 minutos del

registro, siendo significativamente mayor que la de los últimos 5 minutos con perfusión de

únicamente glucosa 11 mM pero prácticamente igual a la región de 3 mM Glucosa + tolbutamida

40 µM medida anteriormente (Fig. 14). La amplitud máxima media fue de 0,35 ± 0,04 u.a. a 11

mM G + TOL (n=6).

0.9

1.1

1.3

5 min

11 mM G

Tolbutamida 40 M3 mM G

F3

60/F

38

0

Figura 13. Registro representativo del tipo 3. Tras una concentración de [Ca2+

]i basal (A),

la glucosa a 11 mM produce un pico de fluorescencia (B) muy similar al producido por la misma

concentración suplementada con tolbutamida 40 µM (C). G = Glucosa.

A

B C

25

Figura 14. Análisis del AUC de los registros del tipo 3.El área de 11 mM G corresponde a los últimos

5 minutos de la perfusión de 11 mM G de los registros de este tipo, mientras que la de 11 mM G + TOL

corresponde a los últimos 5 minutos de esta condición (n=6) **:p≤0.01.

Se comparó además el AUC obtenida en los últimos 5 minutos del registro de 3 mM G +

TOL con los últimos 5 minutos del registro de 11 mM G + TOL para comprobar si había diferencias

significativas entre ellos (Fig. 15).

Figura 15. Análisis comparativo del AUC de los registros del tipo 2 y 3.El área de 3 mM G + TOL

corresponde a los últimos 5 minutos de la perfusión de los registros tipo 2, mientras que la de 11 mM G +

TOL corresponde a los últimos 5 minutos de esta condición de los registros tipo 3 (n=6). No se observan

diferencias estadísticamente significativas entre ambas.

26

De forma adicional se comparó la amplitud de los picos de fluorescencia alcanzada en cada

registro, sin obtenerse diferencias significativas entre ellos, aunque siendo ligeramente mayores

aquellos en los que la glucosa estaba suplementada con tolbutamida, independientemente de si la

concentración era de 3 o de 11 mM (Fig. 16).

11 mM G 11 mM + TOL 3 mM + TOL0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Am

plitu

d p

ico

(u

.a.)

Figura 16. Análisis de la amplitud de los picos en los diferentes medios de perfusión indicados, sin

obtenerse diferencias significativas entre ellos (n=6).

4.2. El Diazóxido disminuye la señalización de Ca2+ intracelular en célula β pancreática

De igual modo que lo anterior, se realizaron unos registros en los que se incluía el

diazóxido para observar su efecto. En este caso, la parte A y B del registro era similar a la de los

registros del tipo 3 con una perfusión de glucosa inicial no estimulatoria (3 mM) y una posterior de

glucosa estimulatoria (11 mM) a la que finalmente se le suplementaba Diazóxido 100 µM. Como

en los anteriores registros, la perfusión de glucosa estimulatoria (11 mM) generó un transiente de

calcio seguido de oscilaciones. Sin embargo, al perfundir posteriormente este mismo medio

suplementado con diazóxido, la concentración de Ca2+ disminuyó drásticamente hasta casi

alcanzar la línea basal inicial obtenida a 3 mM (Fig. 17). Finalmente, para un análisis más

exhaustivo de los datos, se calculó el AUC de los últimos 5 minutos de las últimas dos condiciones

(tanto a 11 mM glucosa como a 11 mM G + Diazóxido 100 µM) obteniéndose una disminución

27

significativa de esta en el medio con diazóxido (Fig. 18). La amplitud máxima media de los picos en

este tipo de registros fue de 0,34 ± 0,03 (n=6).

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5 Diazóxido 100 M

11 mM G

3 mM G

5 min

F360/F

380

Figura 17. Registro representativo del tipo 4.En él se puede observar la línea de fluorescencia basal

con glucosa 3 mM (A), seguido del transitorio y posteriores oscilaciones producidas por la perfusión de una

concentración estimulatoria de glucosa (11 mM) (B) y finalmente descenso de la fluorescencia hasta niveles

casi basales al perfundir glucosa 11 mM suplementada con diazóxido 100 µM (C). G = Glucosa.

11 mM G 11 mM G + DIAZ0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

**

AU

C (

u.a

.)

Figura 18. Análisis del AUC de los registros del tipo 4.El área de 11 mM G corresponde a los últimos

5 minutos de la perfusión de 11 mM G de los registros de este tipo, mientras que la de 11 mM G + DIAZ

corresponde a los últimos 5 minutos de esta condición. El número total de registros realizados fue de 6 (n=6)

**:p≤0.01.

A

B

C

28

5. DISCUSIÓN

Como ya se ha comentado a lo largo de este trabajo, una regulación eficaz de los

nutrientes y la energía es vital, y es aquí donde la secreción de hormonas juega un papel

fundamental. Una deficiente actuación o secreción de estas puede conllevar a desórdenes

metabólicos graves tales como la obesidad o la diabetes tipo II. Es especialmente interesante la

investigación sobre los KATP y su relación con el metabolismo celular. En el caso de la célula β

pancreática, el cierre de estos conduce a una despolarización celular y entrada de Ca2+, generando

este aumento de la [Ca2+] su correspondiente secreción de insulina. De esta forma se podrían

tratar casos de DM tipo II y normalizar situaciones tanto de secreción deficitaria de insulina por

una insensibilidad a la glucosa por parte de los KATP como una hiperestimulación de estos causada

por irregularidades en el metabolismo celular.

En el presente trabajo se ha indagado en el efecto que tienen dos fármacos conocidos, la

tolbutamida y el diazóxido sobre las células β pancreáticas. Respecto a la TOL, basándonos en los

resultados, se ve aumentada la señalización de calcio intracelular de los islotes de Langerhans

pertenecientes a ratones C57BL/6J. Esta afirmación se basa en el aumento del AUC de los registros

de calcio intracelular pertenecientes a la célula β a una concentración de 40µM de TOL, perfundida

tanto con glucosa estimulatoria (11 mM) como no estimulatoria (3 mM). Es importante destacar

este hecho ya que en cualquier célula β, tal y como hemos podido comprobar en los controles (Fig.

10) una concentración de 3 mM G nunca podrá generar un potencial de acción, algo que sí se

consigue con 11 mM G. Sin embargo, vemos que no hay diferencias significativas ni entre la

amplitud de picos (Fig. 16) ni entre el AUC (Fig. 15) como cabría esperar por el empleo de las

diferentes concentraciones de glucosa, pero sí respecto al control 11 mM G (Figs. 12 y 14). Este

aumento similar en la señal podría explicarse en base al siguiente acontecimiento:

En condiciones normales de hiperglucemia, la glucosa entra a la célula por el

transportador específico GLUT2. Su metabolización aumenta el ratio ATP/ADP y este ATP

se une al Kir6.2del KATP cerrando parcialmente los canales. Sin embargo, una concentración

de TOL de 40µM es suficiente para que el número de canales KATP cerrados sea superior al

que ocurriría con la vía de la glucosa, al unirse la TOL a la subunidad SUR1. Por tanto, la

TOL, al bloquear una mayor población de canales KATP, llevaría a una despolarización

29

mayor de la membrana. De esta manera se reclutarían más canales de calcio dependientes

de voltaje, lo cual llevaría a una mayor señal de Ca2+.

Esta explicación estaría apoyada por estudios anteriores (Gribble et al., 1998), que afirman que la

TOL se une principalmente al receptor SUR1 cerrando los canales muy específicamente.

La confirmación de la actividad estimulatoria de la TOL sobre la señalización de calcio

intracelular en las células β sugiere una acción estimulatoria del fármaco sobre la secreción de

insulina, puesto que el Ca2+ es el segundo mensajero responsable de la liberación de estas

hormonas (Nadal et al., 1999; Quesada et al., 1999). En base a los resultados de la modulación

que ejerce la TOL sobre la señal de calcio intracelular y, por ende, sobre la secreción de insulina

(como se podría ver reflejado en los resultados obtenidos en otros experimentos (Fatehi et al.,

2015), comprobamos que los sitios de unión de la TOL son importantes dianas sobre las que se

podría investigar acerca del desarrollo de drogas más específicas para el tratamiento de la

hiperglucemia, característica de enfermedades como la Diabetes Mellitus tipo 2 (T2DM). Por ello,

el conocimiento de los receptores por los cuales la tolbutamida media su acción en las células

pancreáticas puede ser de gran utilidad, especialmente en este caso donde existen pequeñas

diferencias con respecto a las subunidades que componen el KATP en otro tipo de células (como las

cardíacas) pero suficientemente grandes como para modificar la especificidad del fármaco

(Ashcroft e Gribble, 1999).

Por otra parte, si observamos los resultados del DIAZ, se ve disminuida la señalización de

calcio intracelular de los islotes de Langerhans pertenecientes a ratones del mismo tipo. Esta

afirmación se basa en la disminución del AUC de los registros de calcio intracelular pertenecientes

a la célula β a una concentración de 100µM de DIAZ, junto con glucosa estimulatoria (11 mM),

respecto a la respuesta obtenida en los mismos islotes con una perfusión de 11 mM G sin DIAZ

(Fig. 18). Este caso se explica también de forma similar al de la TOL, ya que pese a existir un

estímulo (glucosa 11mM) el AUC es similar a la que se obtendría con una concentración no

estimulatoria de glucosa (3mM) lo que se explicaría así:

En condiciones de hiperglucemia, la relación ATP/ADP se incrementa uniéndose el ATP a

los KATP cerrándolos y despolarizando la célula β, provocando la apertura de los canales de

Ca2+ dependientes de voltaje y aumentando la [Ca2+]i liberándose así insulina. En presencia

30

de diazóxido, (DIAZ 100 µM) éste se une al dominio SUR1 del KATP, abriendo el canal y

permitiendo la salida de iones K+ que repolarizarán la célula β y disminuirán tanto la [Ca2+]i

como la secreción de insulina. En este caso es por tanto mayor el efecto activador del

canal por parte del fármaco que el efecto bloqueante de la glucosa.

Estos resultados se ven apoyados por otros experimentos anteriores (Sturgess et al., 1985;

Schwanstecher et al., 1992), que afirman que el DIAZ hiperpolariza la célula β vía canal KATP. El

hecho de que esta hiperpolarización persista incluso cuando se encuentra suplementado con

concentraciones de glucosa estimulatorias (11 mM) indica que el DIAZ se une al KATP a través de

uniones muy específicas (dominio SUR1). La confirmación de la actividad inhibitoria del DIAZ sobre

la señalización de calcio intracelular en las células β sugiere una acción inhibitoria del fármaco

sobre la secreción de insulina (segundo mensajero responsable de la liberación de estas

hormonas) (Fatehi et al., 2015). Como consecuencia de la modulación que ejerce el DIAZ sobre la

señal de calcio intracelular y, por ende, suponemos que sobre la secreción de insulina, los sitios de

unión del DIAZ podrían estudiarse como dianas más específicas en las que se podría centrar la

industria farmacéutica para el diseño específico de drogas para el tratamiento de

hiperinsulinemias, insulinomas e hipoglucemias.

6. CONCLUSIONES Y PROYECCIÓN FUTURA

Las conclusiones de este Trabajo de Fin de Grado son las siguientes:

1. A nivel de islote completo, con concentraciones estimulatorias de glucosa se produce la

señal de calcio intracelular característica de la célula β, compuesta por un incremento

transitorio de Ca2+ seguido de un descenso de este aunque sin llegar al nivel basal, y

seguido de oscilaciones.

2. La TOL, agente bloqueante del KATP, aumenta el AUC de los registros de Ca2+ en célula β.

Por tanto, este fármaco aumenta la señalización de este segundo mensajero.

3. El DIAZ, agente que favorece la apertura del KATP, disminuye el AUC de los registros de Ca2+

en célula β. Este fármaco por el contrario disminuye la señalización de este segundo

mensajero.

31

4. Tanto la TOL como el DIAZ, que actúan a nivel del KATP, uniéndose a la subunidad SUR1,

son capaces de modular la señal de Ca2+ en la célula beta, lo cual implica que también

afectarían a la secreción de insulina.

Por tanto, los resultados aportados en el presente trabajo demuestran que la TOL y el DIAZ

tienen efectos opuestos en las células β pancreáticas a nivel de señalización de Ca2+ intracelular.

En base a estos resultados, sería interesante de cara al futuro desarrollar los siguientes

experimentos:

1. Investigar la posible reversibilidad de la unión de los fármacos TOL y DIAZ a la región de

alta especificidad del KATP. Para ello se podría perfundir una solución de únicamente

glucosa (no estimulatoria en caso de los experimentos con TOL y estimulatoria para los de

DIAZ) a continuación de las perfusiones con estos compuestos. Con ello podríamos

comprobar si la célula β pancreática es repolarizable o si conserva la capacidad de disparar

un potencial de acción respectivamente.

2. Comprobar que la secreción de insulina está efectivamente correlacionada a las

variaciones en la [Ca2+]i de la célula β pancreática producidas por la TOL y el DIAZ. Esto

completaría las afirmaciones propuestas en las conclusiones 1 y 2.

3. Medir cómo afectaría a la [Ca2+]i la unión por parte de la TOL al receptor menos específico

del KATP (Kir6.2) mediante anulación del sitio de unión SUR1 por mutagénesis dirigida,

valorando así el resultado sobre el cierre del canal. Esto se llevaría a cabo suplementando

tanto a concentraciones estimulatorias de glucosa como no estimulatorias, pudiéndose

analizar así si la TOL entraría en competencia directa por el sitio de unión junto con el ATP

o no.

Estos resultados son de gran interés, puesto que el KATP en general y sus subunidades (Kir6.2 y

SUR1) en particular (en célula β pancreática) son una posible diana terapéutica para enfermedades

como la DM, presentando así una gran oportunidad para el desarrollo de medicamentos más

específicos por parte de las industrias farmacológicas.

32

7. BIBLIOGRAFÍA

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