Beta galactosidasaLa-galactosidasa, tambien llamadabeta-galyb-gal, es una enzima que cataliza la hidrlisis de galactsidos a monosacridos. Un galactsido est compuesto por un glicsido que contiene galactosa. Es decir, el hidrogeno del grupo hidroxilo del carbono 1 de la galactosa es sustituido por un resto orgnico. Dependiendo del enlace glicosdico entre la galactosa y el resto orgnico, los galactsidos se clasifican en -galactsidos o -galactsidos. El -galactsido ms comn es la lactosa, un disacrido entre galactosa y glucosa ( 1,4 Galactosa-Glucosa). [1]

-galactosidasa dePenicillumsp.ndice[ocultar] 1Estructura 2Reaccin 3Funciones 4Referencias

Estructura[editar]La enzima -galactosidasa de 1,023 aminocidos fue secuenciada por primera vez en 1970 y su estructura fue finalmente definida en 1994. Su estructura consta de un homotetrmero con una simetra 2,2,2. La molcula tiene un peso de 464 kDa. La cadena polipeptdica se dobla sobre sus 5 dominios secuenciales y un segmento extendido en el amino terminal. [2] El primer dominio tiene una conformacin de barril beta tipo rollo de gelatina, el segundo y el cuarto de fibronectina tipo III, el tercero un barril TIM y el quinto un barril beta tipo sndwich. [3] El tercer dominio contiene el sitio activo que consiste de dos subunidades del tetrmero.Reaccin[editar]El sitio activo de la -galactosidasa hidroliza a un disacarido en presencia de iones de potasio monovalentes (K+) e iones de magnesio bivalentes (Mg2+). El enlace glicosdico del sustrato es clivado por un grupo carboxilo terminal de un cido glutmico presente en la enzima. Este clivaje se da por adicin de molculas de agua. En los humanos el nuclefilo de la reaccin de hidrolisis es Glu-268 a diferencia de Glu-537 que es el nuclefilo en E-Coli.Funciones[editar]La -galactosidasa es de gran importancia en la industria porque se usa para fermentar los azcares de la lactosa. La produccin de yogur y queso, por ejemplo, necesita de bacterias que expresen esta enzima. Adems, es usada para adicionarla a los productos lcteos con el fin de eliminar los residuos de lactosa y hacer productos deslactosados. Otra funcin crucial consta de identificar si las bacterias presentes en el agua potable son coliformes. La presencia de estas bacterias se puede identificar porque la galactosidasa esta presente en bacterias como Escherichia coli, comn en la materia fecal. [4] ..wikipediaDESNATURALIZACIN DE LAS PROTENAS Cuando la protena no ha sufrido ningn cambio en su interaccin con el disolvente, se dice que presenta una estructura nativa (Figura inferior). Se llama desnaturalizacin de las protenas a la prdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptdica reducida a un polmero estadstico sin ninguna estructura tridimensional fija.Estado nativoEstado desnaturalizado

Cualquier factor que modifique la interaccin de la protena con el disolvente disminuir su estabilidad en disolucin y provocar la precipitacin. As, la desaparicin total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralizacin de las cargas elctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrgeno facilitar la agregacin intermolecular y provocar la precipitacin. La precipitacin suele ser consecuencia del fenmeno llamado desnaturalizacin y se dice entonces que la protena se encuentra desnaturalizada (Figura superior).

En una protena cualquiera, la estructura nativa y la desnaturalizada tan slo tienen en comn la estructura primaria, es decir, la secuencia de AA que la componen. Los dems niveles de organizacin estructural desaparecen en la estructura desnaturalizada.La desnaturalizacin provoca diversos efectos en la protena: 1. cambios en las propiedades hidrodinmicas de la protena: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusin2. una drstica disminucin de su solubilidad, ya que los residuos hidrofbicos del interior aparecen en la superficie3. prdida de las propiedades biolgicas

Una protena desnaturalizada cuenta nicamente con su estructura primaria. Por este motivo, en muchos casos, la desnaturalizacin es reversible ya que es la estructura primaria la que contiene la informacin necesaria y suficiente para adoptar niveles superiores de estructuracin. El proceso mediante el cual la protena desnaturalizada recupera su estructura nativa se llama renaturalizacin. Esta propiedad es de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y purificacin de protenas, ya que no todas la protenas reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta. En algunos casos, la desnaturalizacin conduce a la prdida total de la solubilidad, con lo que la protena precipita. La formacin de agregados fuertemente hidrofbicos impide su renaturalizacin, y hacen que el proceso sea irreversible.

Los agentes que provocan la desnaturalizacin de una protena se llaman agentes desnaturalizantes. Se distinguen agentes fsicos (calor) y qumicos (detergentes, disolventes orgnicos, pH, fuerza inica). Como en algunos casos el fenmeno de la desnaturalizacin es reversible, es posible precipitar protenas de manera selectiva mediante cambios en:

La polaridad del disolvente disminuye cuando se le aaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona. Con ello disminuye el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la molcula proteica, provocando la agregacin y precipitacin. Los disolventes orgnicos interaccionan con el interior hidrofbico de las protenas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su desnaturalizacin y precipitacin. La accin de los detergentes es similar a la de los disolventes orgnicos.

Un aumento de la fuerza inica del medio (por adicin de sulfato amnico, urea o hidrocloruro de guanidinio, por ejemplo) tambin provoca una disminucin en el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la protena, ya que estos solutos (1) compiten por el agua y (2) rompen los puentes de hidrgeno o las interacciones electrostticas, de forma que las molculas proteicas se agregan y precipitan. En muchos casos, la precipitacin provocada por el aumento de la fuerza inica es reversible. Mediante una simple dilisis se puede eliminar el exceso de soluto y recuperar tanto la estructura como la funcin original. A veces es una disminucin en la fuerza inica la que provoca la precipitacin. As, las protenas que se disuelven en medios salinos pueden desnaturalizarse al dializarlas frente a agua destilada, y se renaturalizan cuando se restaura la fuerza inica original.

Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos, pero adems de afectar a la envoltura acuosa de las protenas tambin afectan a la carga elctrica de los grupos cidos y bsicos de las cadenas laterales de los aminocidos. Esta alteracin de la carga superficial de las protenas elimina las interacciones electrostticas que estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitacin. La solubilidad de una protena es mnima en su punto isoelctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsin electrosttica que pudiera dificultar la formacin de agregados.Cuando la temperatura es elevada aumenta la energa cintica de las molculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las protenas, y se desnaturalizan. Asmismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones dbiles y desorganiza la estructura de la protena, de forma que el interior hidrofbico interacciona con el medio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de la protena desnaturalizada.http://www.ehu.es/biomoleculas/proteinas/desnaturalizacion.htm

2. PROPIEDADES GENERALES DE LAS ENZIMASYa hemos mencionado que las enzimas, por ser protenas, tienen pesos moleculares altos. Esto hace difcil su caracterizacin por mtodos fsicos o qumicos.2.1. Efecto de la temperatura sobre las enzimas (3,6).Puesto que la estructura proteica es la que determina la actividad enzimtica, cualquier causa que perturbe esta estructura puede llevar a una prdida de actividad. Aunque el rango general de temperaturas adecuadas para las reacciones enzimticas es muy estrecho, los cambios ligeros suelen tener una considerable influencia. La temperatura ptima para la mayora de las reacciones enzimticas est, con pocas excepciones, entre 30C y 40C, en que la actividad es mxima. Al aumentar la temperatura, la velocidad de reaccin aumenta y, para casi todas las enzimas, un incremento de 10C duplica e incluso triplica la velocidad de reaccin. Por otro lado, sin embargo, ese mismo aumento de temperatura acelera tambin la inactivacin de la enzima por desnaturalizacin trmica. Para muchas enzimas la regin de inactivacin trmica extensiva est muy prxima de la temperatura ptima.Las enzimas muestran, a menudo, una marcada fragilidad trmica. Cuando se calientan a temperaturas superiores a los 50C la mayora de las enzimas, pero no todas, se denaturan, y unas pocas muestran desnaturalizacin cuando se enfran aproximadamente a 5C. A temperaturas bajas, aunque la actividad enzimtica procede muy lentamente, ella no se detiene del todo, hecho que debe tenerse en cuenta en la industria congeladora de alimentos. A menos que se inactiven previamente las enzimas objetables, la mayora de los alimentos congelados experimentan un considerable deterioro despus de un almacenamiento prolongado, porque a temperaturas tan bajas como -18C algunas reacciones enzimticas siguen teniendo lugar. Habitualmente la desnaturalizacin a alta temperatura es irreversible, debido a que se rompen las fuerzas dbiles de enlace al aumentar la vibracin trmica de los tomos componentes, fenmeno que daa la estructura tridimensional.Es importante sealar que una misma enzima, aislada de tejidos diferentes, puede tener diferente capacidad de resistencia a la desnaturalizacin suave por el calor, hecho que es til con fines de identificacin o de diagnstico.Otras aplicaciones de la desnaturalizacin por el calor son la esterilizacin de alimentos e instrumentos y la pasteurizacin de la leche; ambos procesos dependen de la destruccin rpida por calor de las enzimas esenciales de los microorganismos contaminantes.La mayora de las enzimas son, pues, muy termolbiles y habitualmente es suficiente aplicar una temperatura de 40 a 80C por 2 a 5 minutos, a fin de destruir su actividad.Es este hecho de inactivacin completa de las enzimas el que se utiliza ampliamente en la industria alimentara. En la mayor parte de los casos de preservacin de alimentos, es deseable que no haya continuacin alguna de actividad enzimtica.Si ello ocurriera se podra producir, por ejemplo, un cambio en el color de la clorifila o de los carotenoides, o producirse el pardeamiento de varios alimentos; podra alterarse el sabor de los hidratos de carbono, o producirse la rancidez de las grasas. Tambin la persistencia de actividad enzimtica podra provocar cambios en el aroma o en el valor nutritivo de las protenas (o de las vitaminas) y, finalmente, la presencia de enzimas pectinolticas puede producir un cambio total en la textura de los alimentos.El tratamiento con calor es, sin duda, un mtodo adecuado para la destruccin de microorganismos que alteran los alimentos (esterilizacin por calor y pasteurizacin). De esta manera un procesamiento trmico adecuado puede lograr simultneamente la preservacin microbiolgica y la estabilizacin de los alimentos. A veces la actividad residual de una enzima (no necesariamente objetable) se usa como prueba de la suficiencia de un proceso de tratamiento con calor.As, la ausencia de actividad fosfatsica de la leche es un buen indicador de si la leche ha sido pasteurizada adecuadamente, ya que esta enzima se inactiva completamente por la dosis de tratamiento trmico necesaria para destruir agentes patgenos.Las enzimas difieren ampliamente en su resistencia a la inactivacin trmica. Las peroxidasas vegetales son particularmente estables (120C por unos minutos no son suficientes para destruirlas del todo). La velocidad de inactivacin trmica depende tambin del pH, fuerza inica y del estado fsico de la enzima en el material alimentario: si la enzima est igualmente bien distribuida por todo el producto o adsorbida sobre partculas slidas (como ocurre con las enzimas pectinolticas y las fenolasas, las cuales estn adsorbidas en la pulpa de varios jugos de frutas).Existen situaciones en la tecnologa de alimentos en las que algunas enzimas, a pesar de haber sido inactivadas, se "regeneran" y su actividad se renueva despus de cierto tiempo. Este tipo de regeneracin enzimtica ha sido observada en los casos de peroxidasas (leche, verduras); catalasa (verduras); lipasa (productos de la leche) y enzimas pectinolticas (jugos ctricos). La regeneracin seria el resultado de una reorganizacin, al menos parcial, de la molcula proteica, restablecindose las estructuras de los sitios activos que haban sido alterados por la desnaturalizacin.La reversin de la desnaturalizacin es un proceso lento, pero durante el almacenamiento prolongado de los alimentos procesados habra tiempo suficiente para la regeneracin, detectable, de algunas enzimas. De esta manera, la estabilidad de los alimentos con respecto al dao de stos por las enzimas es una funcin tanto de la "profundidad" de la inactivacin trmica como del tiempo y condiciones de almacenamiento.2.2. Efecto de las radiaciones (3).Las enzimas se afectan tambin por irradiacin con ondas electromagnticas. La inactivacin por luz ultravioleta se debera a la fotolisis de grupos disulfuro y aromticos de los aminocidos que constituyen las protenas. La inactivacin de la pepsina se atribuye a la oxidacin del grupo fenlico de la tirosina. Estos efectos sobre las enzimas son de escaso rendimiento, por lo que la luz ultravioleta no es de aplicacin prctica, desde este punto de vista, en la tecnologa alimentara.En cambio, la irradiacin de los alimentos con radiaciones ionizantes (radiaciones beta, gamma, etc.) es de considerable importancia en el procesamiento de alimentos y ya est en uso en escala comercial. Uno de los mayores problemas en este campo es el hecho de que la destruccin de las enzimas requiere de dosis de radiacin mucho ms elevadas que para la destruccin de los microorganismos. En algunos casos es ms prctico utilizar en forma combinada calor e irradiacin para inactivar enzimas.La actividad lipoxidsica puede reducirse al 67% de su valor inicial por irradiacin a pH7 con 9x rad. Existe una prdida adicional postradiacin. Si la enzima se irradia y luego se calienta, el efecto de ambos tratamientos es sinergstico. Si la enzima se calienta primero y luego se irradia, el efecto es meramente aditivo.2.3. Efecto de la humedad (3,4).En los alimentos, al igual que en cualquier sistema biolgico, el agua es uno de los componentes ms importantes.Por ser un solvente, el agua sirve para poner en contacto a las diversas molculas que interactan. Adems, la reactividad de muchas sustancias depende de la disociacin inica y de la configuracin molecular y, por lo tanto, de la hidratacin. El agua es a menudo uno de los reactantes o uno de los productos de la reaccin.Hoy se sabe que la influencia del agua sobre la reactivacin del sistema no est relacionada slo con el contenido real de agua, sino tambin con el estado de las molculas de agua.La disponibilidad de agua es una funcin tanto del contenido como del estado y se expresa adecuadamente por el concepto denominado "actividad del agua" () que equivale a la relacin entre la presin de vapor de agua sobre el sistema (p) y la presin de vapor del agua pura (Po) a la misma temperatura:

Si los alimentos fueran simples mezclas de agua con sustancias inertes que no interactan de ninguna manera con las molculas de agua, la actividad del agua seria siempre 1, cualquiera sea el contenido de agua.Los alimentos son sistemas en los cuales parte del agua est fuertemente absorbida sobre la superficie de sustancias polimricas (protenas, carbohidratos macromoleculares). Esto queda claramente establecido por el hecho que la presin de vapor del agua sobre un alimento con un contenido de humedad bajo o intermedio es considerablemente menor que el que predice la Ley de Raoult. Esto se conoce como "agua ligada". En estos casos; la actividad del agua es inferior al valor que le correspondera por su concentracin. Una de las razones para este efecto es el hecho que el "agua libre" est parcialmente atrapada en la estructura porosa del alimento y, por lo tanto, est sujeta a la accin depresora de los capilares sobre la presin de vapor. A niveles ms altos del contenido de humedad el sistema se comporta en realidad como una solucin acuosa. De hecho la concentracin molar de los solutos es habitualmente tan baja que la actividad del agua pronto alcanza valores cercanos a la unidad.La disponibilidad de agua, medida como actividad del agua, tiene una fuerte influencia sobre la velocidad de las reacciones por enzimas, es decir, la actividad enzimtica aumenta al aumentar el contenido de "agua libre" y ello ocurre no slo en las reacciones hidrolticas, en las que el agua es uno de los reactantes obvios, sino tambin en las reacciones no-hidrolticas.La velocidad de las reacciones enzimticas se ve fuertemente influida por la naturaleza y concentracin de los solventes.En la prctica es de gran importancia el efecto de la cantidad de humedad de los alimentos sobre la velocidad de la reaccin enzimtica. Incluso en los alimentos denominados desecados la accin enzimtica procede a una velocidad medible.A niveles muy bajos de humedad, la actividad enzimtica puede ser afectada cualitativamente. Es el caso de la -amilasa que a una humedad del 20 %o (o 4% de "agua libre") produce principalmente glucosa y maltosa a partir de almidn. A niveles ms elevados de humedad se forman tambin otros oligosacridos. Quizs lo que ocurre es que a niveles muy bajos de "agua libre", la rigidez del medio impide la difusin de la enzima o del substrato, limitndose as la hidrlisis a aquellas porciones del substrato que estn en contacto inmediato con la enzima.En los cereales y harinas almacenados es posible detectar, fcilmente, actividad lipoltica y proteoltica. A niveles de humedad superiores a 15% esta actividad es debida, generalmente, a las enzimas de los hongos que crecen en el cereal y que pueden participar tambin en las reacciones hidrolticas, desarrollndose amargor o rancidez por la accin enzimtica sobre la fraccin proteoltica o lipdica durante el almacenamiento.Los mtodos modernos de liofilizacin de carnes y verduras han introducido problemas similares a estas industrias. La actividad enzimtica se determina generalmente en estos casos por mtodos autolticos, ya que la velocidad de la reaccin enzimtica es baja. Por ejemplo, en el msculo de cerdo liofilizado se usa la desaparicin del glicgeno muscular como un ndice de actividad enzimtica a diferentes niveles de humedad.2.4. Efecto del pH y del estado inico (3,6).La actividad enzimtica guarda tambin relacin con el estado inico de la molcula y, especialmente, de la parte proteica, puesto que las cadenas polipeptdicas contienen grupos que pueden ionizarse (principalmente grupos carboxilos y aminos de los aminocidos constituyentes) en un grado que depende del pH existente. Como ocurre con las protenas, las enzimas poseen un punto isoelctrico al cual su carga libre neta es cero. El pH del punto isoelctrico, como regla, no es igual al pH al cual se observa actividad mxima. El pH ptimo de las enzimas varia ampliamente; la pepsina, que existe en el medio cido del estmago, tiene un pH ptimo de alrededor de 1,5, mientras que la arginasa tiene un pH ptimo de 9,7. Sin embargo, la gran mayora de las enzimas tienen un ptimo entre pH 4 y 8. Algunas enzimas muestran una amplia tolerancia a los cambios del pH, pero otras trabajan bien slo en un rango estrecho. Cualquier enzima que se someta a valores extremos de pH, se desnaturaliza. Esta sensibilidad de las enzimas a la alteracin del pH es una de las razones por la que la regulacin del pH del organismo es controlada celosamente y explica por qu las desviaciones de la normalidad pueden implicar graves consecuencias.Muchas enzimas existen en el organismo a un pH ms bien alejado de su valor ptimo. Esto se debe, en parte, a la diferencia del medio ambiente "in vivo" con respecto al "in vitro". Esto recalca tambin que el control, del pH puede representar un importante medio para regular la actividad enzimtica.Las protenas sufren cambios en su solubilidad, presin osmtica y viscosidad a diferentes valores de pH. Es probable que el cambio en la actividad enzimtica, al variar los valores de pH, se deba a los cambios en la ionizacin ya sea de la enzima, del substrato o del complejo enzima-substrato.A1 determinar la velocidad de reaccin de una enzima y para cierta concentracin de substrato, a diferentes valores de pH, se observa que la curva resultante tiene forma de campana. Se le denomina curva de pH: actividad. Esta curva no caracteriza, necesariamente, a una enzima, puesto que el pH ptimo puede variar para diferentes substratos, ni tampoco son similares las curvas de pH: actividad para dos enzimas que hidrolizan el mismo enlace en un substrato. Por ejemplo, las pectinometilesterasas hidrolizan especficamente los enlaces ster de polimetilgalacturonatos. La pectinometilesterasa obtenida de un hongo tiene un pH ptimo de 5,0; la de frjoles tiene su ptima actividad a pH cercano a 8,5.Estas diferencias sobre los pH ptimos de enzimas que actan sobre substratos similares es de la mayor importancia en el procesamiento de alimentos. Una enzima tiene que tener buena actividad proteoltica a un pH de 4,5 a fin de ser una enzima a prueba de congelacin, o a niveles de pH superiores a 5,5 para ser un buen ablandador de carne. Para la mayora de las aplicaciones prcticas, el pH del alimento no puede ser ajustado como para adecuarlo al pH ptimo de una enzima determinada. La enzima debe escogerse en base a su actividad al pH natural del alimento. Existen algunas excepciones notables en que es factible y prctico el ajuste del pH. Para la produccin de glucosa, la pasta de almidn se ajusta a un pH entre 5 y 7 para la hidrlisis ptima por la alfa-amilasa bacteriana. En cambio, el pH se ajusta entre 4 y 6 para la ptima sacarificacin por la amilasa de hongos o de cereales.La velocidad de inactivacin de las enzimas vara para los diferentes valores de pH y, por lo tanto, un alza en la temperatura puede cambiar el pH ptimo. As, en la industria de cereales el aumento de temperatura hace variar el pH ptimo de la beta-amilasa hacia valores ms altos de pH. Puede aplicarse una variacin intencional del pH para destruir especficamente una enzima como, por ejemplo, la inactivacin diferencial de alfa-amilasa y proteasas en preparaciones enzimticas de hongos.Es necesario recalcar, sin embargo, que el trmino "pH ptimo" no tiene una significacin fsico-qumica bien definida. Es mejor, en general, referirse a un rango de pH favorable para una reaccin dada. Este rango depende no slo de la naturaleza de la enzima particular, sino tambin del substrato y de la concentracin de ste, de la estabilidad de la enzima, de la temperatura y de la extensin del periodo de reaccin.2.5. Sitio activo y especificidad enzimtica (5,8).Algunas enzimas tienen una especificidad prcticamente absoluta para un determinado substrato y no atacarn ni siquiera a molculas muy relacionadas. Por ejemplo, la enzima aspartasa cataliza la adicin reversible de amoniaco. Al doble enlace del cido fumrico, pero a ningn otro cido no saturado.. La aspartasa tambin presenta una rgida estereoespecificidad y especificidad geomtrica; por eso no desamina D-aspartato ni adiciona amonaco al maleato, que es el ismero geomtrico-cis del fumarato. Otro ejemplo de especificidad absoluta es el de la maltasa verdadera, que slo desdobla al azcar maltosa. En el otro extremo estn las enzimas que tienen una especificidad relativamente amplia y actan sobre muchos compuestos que presentan una caracterstica comn. Por ejemplo, la fosfatasa de rin cataliza la hidrlisis de muchos steres diferentes del cido fosfrico, pero a velocidades variables. Otro ejemplo lo constituyen las lipasas, que pueden romper la unin entre el cido y el alcohol en el lpido, en tanto sta sea una unin ster (desdoblan igual etilbutirato que un triglicrido).Del estudio de la especificidad de las enzimas por el substrato surgi la idea de que existe una relacin complementaria tipo llave-cerradura entre la molcula de substrato y un rea especfica sobre la superficie de la molcula de la enzima, denominada el sitio activo o sitio cataltico, al cual se une la molcula del substrato, mientras experimenta la reaccin cataltica.Dos caractersticas estructurales determinan la especificidad de una enzima por su substrato: a) el substrato debe poseer el enlace qumico especfico o unin, que puede ser atacado por la enzima, y b) el substrato debe tener habitualmente algn otro grupo funcional, un grupo de unin, que se une a la enzima y ubica en posicin a la molcula de substrato de modo que el enlace susceptible se disponga apropiadamente en relacin al sitio activo de la enzima.2.6. Isoenzimas (6,9).Los isoenzimas constituyen formas moleculares mltiples de una misma enzima que catalizan fundamentalmente la misma reaccin, pero difieren en sus propiedades qumicas, fsicas, estructurales o inmunoqumicas; Se originan estas diferencias en su biosntesis, debido a causas genticas. Su diferencia radica en la estructura primaria de su protena, ocurriendo como dmeros o tetrmeros, compuestos ya por subunidades idnticas o no.Muchas enzimas existen en la misma especie o tejido y aun dentro de la misma clula. A menudo limitadas a un rgano, pueden pertenecer, sin embargo, tambin a organismos diferentes (enzimas isodinmicas).Uno de los ejemplos ms conocidos de isoenzimas es el de la dehidrogenasa lctica que est presente en los tejidos animales en 5 formas, separables por electroforesis. Estas 5 isoenzimas estn constituidas por la combinacin de dos clases diferentes de cadenas polipeptdicas, de un peso molecular de 33.500 cada una: Las cadenas "M" (de msculo) y "H" (de heart, corazn).Para identificar y diferenciar isoenzimas se usan mtodos cromatogrficos (en columna); electroforticos (en papel o gel); inhibidores qumicos (ditio-treitol) o los respectivos antisueros contra isoenzimas. Estos ltimos representan anticuerpos inhibidores obtenidos por va inmunolgica (de sueros ovinos o caprinos) que actan generalmente por precipitacin en la solucin reactiva, al ser insoluble el complejo enzima - antisuero.La identificacin y diferenciacin de isoenzimas tiene aplicacin en el diagnstico de ciertas enfermedades para poder localizarlas en un determinado rgano como, por ejemplo, en el infarto cardiaco, mediante las isoenzimas de la creatin-fosfokinasa (CPK).3. MECANISMO DE LA CATALISIS ENZIMTICA (5,8).3.1. La energa de activacin y los efectos de los catalizadores.Una reaccin qumica tal como A P tiene lugar debido a que un cierto nmero de las molculas A, en un momento determinado, poseen ms energa que el resto de la poblacin, suficiente para alcanzar un estado "activado", en el cual puede formarse o romperse un enlace qumico, para formar el producto P. Se denomina energa libre de activacin a la cantidad de energa en caloras que se requiere para llevar todas las molculas de un mol de una sustancia, a una temperatura dada, al estado reactivo. Por estado de transicin se entiende el estado, rico en energa, de las molculas reaccionantes en el tope o cumbre de la barrera de activacin, sobrepasada la cual, se produce la reaccin.La velocidad de una reaccin qumica es proporcional a la concentracin de las molculas en estado de transicin. La velocidad de una reaccin qumica puede acelerarse, subiendo la temperatura (la cual aumenta el movimiento trmico y la energa, aumentando as el nmero de molculas en est estado de transicin) o mediante un catalizador, el cual acta haciendo bajar la energa de activacin. Los catalizadores, como las enzimas, se combinan con los reactantes y producen un estado de transicin que tiene menos energa libre que el estado de transicin de la reaccin no catalizada: Ellos no alteran los equilibrios de reaccin. Una vez formados los productos de la reaccin, el catalizador libre es nuevamente regenerado.3.2. El mecanismo de la accin enzimtica.No se conoce bien an el mecanismo preciso de la catlisis para ninguna enzima. Sin embargo, se sabe que los cidos y bases (es decir, dadores y aceptores de protones, respectivamente) son catalizadores muy verstiles, que pueden aumentar las velocidades de muchos tipos de reacciones orgnicas, tales como la hidrlisis de steres y de compuestos fosforilados, la adicin de agua a grupos carbonilos, as como la eliminacin de agua de los alcoholes para producir compuestos no saturados. Se puede extrapolar esto a las enzimas, las que contienen grupos dadores de protones (, carboxilos, sulfhidrilos) as como grupos aceptores de protones ( y carboxilatos -COO). Tambin los grupos nucleoflicos son catalizadores eficaces. Se trata de grupos funcionales ricos en electrones que pueden donar un par de electrones al ncleo de algn otro tomo. Grupos nucleoflicos tpicos son los grupos hidroxilo, sulfhidrilo e imidazol, que se sabe estn tambin presentes en las protenas. Es as que en diferentes enzimas son ciertos grupos funcionales de los aminocidos integrantes de su molcula proteica los que participan como centro activo en el proceso cataltico, como sucede con el grupo epsilon-amino de la lisina (base de la determinacin de la llamada "lisina aprovechable") (11), el grupo sulfhidrlico de la cistena, el de la cerina y el resto imidazlico de la histidina.http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/parte02/02.html

Plegamiento y desnaturalizacin

Existen muchos indicios que sealan que la informacin necesaria para un correcto pleglamiento de una protena globular est contenida en la estructura primaria, es decir en su secuencia de aminocidos de dicha protena. Una protena debe ser capaz de plegarse correctamente sin ms informacin que la contenida en su secuencia de aminocidos y las interacciones que se establecen entre ellos.

La estructura tridimensional de una protena en condiciones fisiolgicas se conoce comoestructura nativa, y se considera la estructura ms estable de todas las estructuras posibles. Adems la estructura nativa es la funcionalmente activa. Si cambiamos las condiciones ambientales, la estructura nativa se pierde, este proceso se denominadesnaturalizacin. Podemos conseguir la desnaturalizacin de una protena mediante anumento de la temperatura, cambios drsticos de pH, aadiendo agentes caotrpicos como la urea o el clorhidrato de guanidinio) o mediante disolventes orgnicos como el etanol.

Generalmente las protenas se desnaturalizan con calor. Bajo condiciones adecuadas un incremento mederado de la temperatura conduce a la perdida de la estrutura secundaria y terciaria de la protena. Se puede determinar el porcentaje de molculas desnaturalizadas a una detarminada temperatura por diferente tcnicas (espectroscopa UV, viscosidad de la disolucin o actividad ptica). Por lo general, la desnaturalizacin se produce en un intervalo relativamente estrecho de temperatura. Esto indica que es un proceso cooperativo donde la perdida de unas pocas intercciones no covalentes son suficientes para la perdita total de la conformacin nativa. La mayora de la protenas poseen una temperatura de fusin (Tm, temparatura a la cual el 50% de la protena se encuentra desnaturalizada) caracteristica a un determinado pH y fuerza inica.

Desnaturalizacin de la Ribonucleasa A

Los trabajos de Christian Anfisen con la ribonucleasa A (RNAsa A) apoyan est idea. La RNAsa A es una enzima digestiva que cataliza la hidrlisis de cidos ribonuclicos. Es relativamente pequea formada por 124 residuos de aminocidos y tiene 8 cistenas que forman 4 puentes disulfuro. Cuando la RNAsa A se desnaturaliza perdiendo su estructura nativa, y por tanto su actividad, es capaz de recuperar su estructura nativa y su actividad en determinadas condiciones. La desnaturalizacin de la RNAsa A con urea 8 M y B-mercaptoetanol. Reduce los puentes disulfuros de la enzima. Eliminando la urea y el BME, por ejemplo mediante dialisis, la enzima recuperasu plegamiento y se forman lo spuentes disulfuros correctos; la RNAsa A recupera su actividad. Si en cambio solo retiramos el agente reductor. Los puentes disulfuros que se forman no los los correctos y aproximadamente solo el 1% de la enzima es activa (si 8 residuos de cistena forman puentes disulfuros aleatoriamente, hay 105 posibles combinaciones, 7 para el primer par, 5 para el segundo, tres para el tercero y solo uno para el iltimo, 7x5x3x1 = 105). Si a esta ltima preparacin se le aaden trazas de BME y se calienta suavemente, los puentes disulfuros incorrectos se rompen formmandose los adecuados.

Consideraciones termodinmicas

La conformacin nativa de una protena es la conformacin de ms baja energa libre de Gibbs. El proceso de plegamiento, como cualquier otro proceso biolgico, se encuentra bajo control termodinmico y cintico, y es un proceso que est claramente favorecido en condiciones fisiolgicas. En otras palablas, el proceso de plegamiento hasta alcanzar la estructura nativa presenta un G negativo.Desde el punto de vista entrpico, el proceso de plegamiento supone una disminucin neta de entropa desde la estructura denominada ovillo aleatorio a la nica estructura nativa. Este descenso de entropa, denominada entropa conformacional, supone un incremento positivo de energa libre en el proceso de plegamiento (G = H TS). Para poder tener un descenso global en el proceso es necesario que el incremento de entalpa sea negativo o que existan otros aumentos de entropa. La principal contribucin entalpica al proceso de plegamiento la constituyen la formacin de interacciones no covalentes que estabilizan la estructura nativa y las interacciones hidrofbicas entre las cadenas laterales apolares que generalmente quedan localizados en el interior de la estructura nativa.

En resumen, la estabilidad de la estructura plegada de una protena globular depende de la interaccin de tres factores:1. El cambio de entropa conformacional desfavorable, que favorece en su lugar a las cadenas aleatorias.2. La entalpa favorable de las cadenas laterales intramoleculares.3. El cambio de entropa favorable del enterramiento de los grupos hidrfbicos en el interior de la molcula.La aportacin de estos factores vara entre diferentes protenas (ver tabla), pero la consecuencia es la misma: alguna estructura plagada corresponde con un mnimo de energa libre del polipptido en condiciones fisiolgicas, ste es el motivo por el que las cadenas polipeptdicas se pliegan espontaneamente.

Parametros termodinamicos de algunas protenas globulares a 25C en disoluciones acuosas

ProtenaG (kJ/mol)H (kJ/mol)S (J/Kmol)

Ribonucleasa-46-280-790

Quimiotripsina-55-270-720

Lisozima-62-220-530

Citocromoc-44-52-27

Mioglobina-500+170

Cada dato se ha tomado al pH en el que la protena presenta mxima estabilidad (todos cerca del pH fisiolgico). Los datos son para el equilibrio de plegado: desnaturalizada ->nativa.

La paradoja de Levinthal

El plegado de protenas globulares a partir de sus conformaciones desnaturalizadas es un proceso notablemente rpido, que se completa en menos de un segundo. Esto puede resultar paradjico tal y como puso de manifiesto Cyrus Levinthal en 1968. Una protena pequea como la RNAsa A, que tiene 124 aminocidos tiene 1050conformaciones posibles. Si la molcula pudiese probar una configuracin cada 10-13segundos, seran necesarios 1030aos para probarlas todas. Sin embargo, se ha comprobadoin vitroque la RNAsa de pliega en aproximadamente 1 minuto.La salida al dilema de Levilthal podra estar en laseleccin acumulativa, segn la cual los intermediarios parcialmente correctos se retienen. Los sitios de iniciacin favorecen la estabilizacin de estructuras ms complejas.

Determinados residuos aparecen preferentemente en determinadas estructura secundarias

Actualmente no se conoce el proceso exacto mediante el cual se produce el plegamiento de novo de una protena. Se admite que este proceso se inicia con interaciones de corto alcance que forman estructuras secundarias en regiones locales del polipptido. Estas interacciones son interacciones no covalentes que se establecen entre las cadenas laterales prximas. Determinados residuos tienen tendencia a formar estructuras en hlice-alfa, hoja-beta o giros reversos (ver tabla). Estos residuos que se estructuran espontaneamente se conocen como sitios de iniciacin.El siguiente paso es la formacin de estructuras parcialmente plegadas que se conocen con el nombre deestado globular fundido. Este estado se produce tras un colapso hidrofbico, y contiene la mayor parte de las estructuras secundarias presentes en la estructura nativa, pero posee muchas interacciones incorrectas. Este estado se encuentra en rpido equilibrio con el estado de ovillo aleatorio totalmente desnaturalizado. Las interacciones de medio y largo alcance se forman mediante reordenaciones del estado globular fundido. Las ltimas interacciones en formarse son los puentes disulfuros.

Frecuencias relativas de los residuos de aminocido en estructuras secundarias

AminocidoHlice alfaHoja betaGiroPreferencia por

Alanina1,290,900,78hlices alfa

Cistena1,110,740,80

Leucina1,301,020,59

Metionina1,470,970,39

Glutamato1,440,751,00

Glutamina1,270,800,97

Histidina1,221,080,69

Lisina1,230,770,96

Valalina0,911,490,47hojas betas

Isoleucina0,971,450,51

Fenilalanina1,071,320,58

Tirosina0,721,251,05

Tripofano0,991,140,75

Treonina0,821,211,03

Glicina0,560,921,64giros

Serina0,820,951,33

Aspartato1,040,721,41

Asparragina0,900,761,28

Prolina0,520,641,91

Arginina0,960,990,88

Prediccin de la estructura de las protenas

Dado que determinados residuos presentan una mayor frecuencia relativa de aparicin en las estruturas secundarias y que la informacin necesaria para el correcto plegado de una protena parece estar contenida en su estructura primaria, uno de los grandes retos de la Bioinformtica es la prediccin de la estructura terciaria de las protenas.La prediccin de la estructura a partir de la secuencia de amnocidos ha resultado difcil, fundamentalmente debido a las interacciones de largo alcance que estabilizan las estructuras secundarias y terciaria. Para intentar de resolver este problema se han tomado dos aproximaciones experimentales diferentes: laprediccinab initio, que intenta resolver el problema sin tener en cuenta ninguna de las estructura conocidas; y elmodelado por comparacin(diseo de protenas por homologa), que realiza la prediccin en funcin de un modelo conocido. Este ltimo mtodo asume que la estructura est ms conservada que la secuencia, de modo que si la protena que se quiere modelar presenta ms de un 30% de identidad con una protena de estructura conocida, ambas protenas sern estructuralmente semejantes. La mayora de los mtodos para la prediccin de la estructura secundaria de las protenas comienza con el alineamiento de la secuencia que se pretende modelizar.Disponer de la estructura tridimensional de una protena para el anlisis de su funcin es indudablemente un valor aadido. A pesar del avance en las tcnicas experimentales para proporcionar modelos aproximados de la estructura y la dinmica de las protenas (cristalografa de rayos X o resonancia magntica nuclear), cada da aumenta la diferencia entre el nmero de secuencias y el de estrucuras conocidas. Actualmente se emplea la Bioinformtica para la prediccin de la estructura de las protenas. Los mtodos de prediccin de estructuras tiene por objetivo disminuir esta diferencia entre el nmero de secuencias conocidas y el de estructuras.

Plegamiento asistido de protenas

A pesar de que la estructura primaria de la protenas contiene la informacin necesaria para el correcto plegamiento de la misma, muchas protenas necesitan el concurso de otras protenas para logar su conformacin nativa, y por tanto su conformacin funcionalmente activa. estas protenas que facilitan el correcto plegamiento de otras son laprotena disulfuro isomerasa, peptido prolil cis-trans isomerasa y las chaperonas moleculares.

Laprotena disulfuro isomerasacataliza el intercambio o la mezcla de puentes disulfuros hasta que se forman los enlaces de la estructura nativa. la pptidoprolil cis-trans isomerasacataliza la interconversin de los ismeros cis-trans en los enlaces peptdicos de prolina.

Laschaperonas molecularesson protenas que inetraccionan con polipptidos parcial o incorrectamente plegados, facilitando rutas de plegamiento o aportando microentornos en los que pueda tener lugar el plegamiento. Las chaperonas se descubrieron como protenas de choque trmico, o hsp. Estas protenas se inducen rpidamente cuando se somete a las clulas a un estrs trmico. Las chaperonas no alteran el resultado final del plegamiento proteco, simplemente lo aceleran, evitando la formacin de agregados proteicos antes de que finalice el plegamiento correcto de las protenas. Tambin evitan la formacin de intermediarios metaestables, "sin salida", durante el proceso. Las chaperonas aumentan la velocidad de plegamiento limitando el nmero de rutas no productivas que puede presentar el plegamiento de un polipptido.

http://www.biorom.uma.es/contenido/av_biomo/Mat4.html

Kaplan

http://books.google.cl/books?id=KHec9weY8Y0C&pg=PA98&dq=denaturacion+de+proteinas+por+calor&hl=es&sa=X&ei=OxHKUdysAYa0iwKJkYDIAw&ved=0CC0Q6AEwAA#v=onepage&q&f=false