ESPECTROFOTOMETRIA DEFINITIVA 2013

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(ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VIS) PROF. MARLENE MORA 2013 MM 2013

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(ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VIS)

PROF. MARLENE MORA

2013

MM 2013

La distancia entre dos picos (o dos valles) de una onda se llama longitud de onda (λ = lambda).

λ

LONGITUD DE ONDA

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UV Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo IR

4000 A Espectro Visible 7500 A

Ultravioleta Luz visible Infrarrojo

102 -104 ~ 104 104-107

Las longitudes de onda mas largas que las del rojo se les conoce como infrarrojas y las mas cortas que el violeta, ultravioletas.

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Cuanto más larga la longitud de onda de la luz visibletanto más rojo el color.

Asimismo las longitudes de onda corta están en la zona violeta del espectro.

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La luz blanca está compuesta de ondas de diversas frecuencias. Cuando un rayo de luz blanca pasa por un prisma se separa en sus componentes de acuerdo a la longitud de onda

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¿Cómo se puede medir la radiación que emiten o absorben los cuerpos?.

• Un aparato capaz de obtener el espectro de una radiación, es decir, de separar la radiación en sus componentes, se llama un espectroscopio.

•Si el aparato es capaz de fotografiarla se llama un espectrógrafo, y

•Si es capaz de medirla diremos que se trata de un espectrómetro.

•Cuando es capaz de medir también la intensidad de la radiación, se llama espectrofotómetro.

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COMPONENTES DE LOS INSTRUMENTOS ESPECTROSCÓPICOS

Los instrumentos usados para estudiar la absorción o la emisión de la radiación

electromagnética en función de la λ son conocidos como ESPECTROFOTÓMETROS y

constan de 5 elementos básicos :

1. Fuente estable de energía radiante.

2. Dispositivo que aísle una determinada región del espectro.

3. Recipiente transparente a la radiación para contener la muestra.

4. Detector de radiación que convierte a la energía radiante en una señal de medida.

5. Indicador de señal : sistema de procesamiento y lectura de la señal

ESPECTROFOTOMETRO

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1º Fuente de luz

La misma ilumina la muestra. Debe

cumplir con las condiciones de

estabilidad, direccionabilidad,

distribución de energía espectral

continua y larga vida. Las fuentes

empleadas son lámpara de tungsteno y

lámpara de arco de xenón.

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FUENTES DE

RADIACIÓN Y

DETECTORES

En la Figura se

resumen los

diferentes

sistemas de

detección de la

señal así como las

fuentes usadas en

función de la λ

(región espectral).

CO

NT

INU

AS

UV Visible/IRL

ámp

ara de D

euterio

Arco de Xenón

Lám

para d

e Wo

lframio

1.- FUENTES DE RADIACIÓN

1.- FUENTES DE RADIACIÓN Su misión es la generación de un haz de radiación con suficiente potencia de salida y

estabilidad para que se detecte y se mida con facilidad.

Pueden ser CONTINUAS , que emiten radiación que varia su intensidad en un amplio Δλ y

DISCONTINUAS O DE LÍNEAS, que emiten un número limitado de líneas o bandas de

radiación, cada una de las cuales abarca un limitado Δλ.

FUENTES USADAS EN ESPECTROSCOPÍA

FUENTE Δλ (nm) TIPO DE ESPECTROSCOPIA

CONTINUAS

Lámpara de Xenón 250-600 Fluorescencia molecular y Raman

Lámpara de

Hidrogeno/Deuterio160-380 Absorción molecular (UV)

Lámpara de Wolframio 350-2200 Absorción molecular (Visible/IR cercano)

Lámpara de

Wolframio/Halógeno240-2500

Absorción molecular (UV/Visible/IR

cercano)

Lámpara de Nicrom 750-20000 Absorción molecular (IR)

Lámpara de Nernst 400-20000 Absorción molecular (IR)

Fuente Globar 1200-40000 Absorción molecular (IR)

DE LINEAS

Lámpara de Cátodo hueco UV-Visible Absorción y fluorescencia atómica

Lámpara de descarga sin

electrodosUV-Visible Absorción y fluorescencia atómica

Lámpara de vapor

metálicoUV-Visible

Absorción atómica, Fluorescencia molecular

y Raman

Lámpara LASER UV-Visible-IRAbsorción molecular , Fluorescencia

molecular y Raman

2.- Monocromador

Para obtener luz monocromática, constituído por las rendijas

de entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersión.

El monocromador aísla las radiaciones de longitud de onda

deseada que inciden o se reflejan desde el conjunto.

3.- Fotodetectores

En los instrumentos modernos se encuentra una serie de 16

fotodetectores para percibir la señal en forma simultánea en

16 longitudes de onda, cubriendo el espectro visible. Esto

reduce el tiempo de medida, y minimiza las partes móvils del

equipo.

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MONOCROMADORESDispersan la radiación separando espacialmente las distintas λ de la luz policromáticaproporcionando bandas de anchura pequeña. Varían de forma continua y en un amplio Δλ y almismo tiempo aíslan una pequeña banda de la luz policromática.COMPONENTES:

1. Rendija de entrada

2. Lente colimadora o espejo cóncavo que produce un haz paralelo de radiación

3. Elemento que dispersa la radiación en sus longitudes de onda individuales: prisma o red

4. Elemento de enfoque de salida

5. Rendija de salida

CO

MP

ON

EN

TE

S

Y T

IPO

S D

E

MO

NO

CR

OM

AD

OR

ES

TEMA 3.- COMPONENTES DE LOS INSTRUMENTOS ESPECTROSCÓPICOS

TEMA 3.- COMPONENTES DE LOS INSTRUMENTOS ESPECTROSCÓPICOS

MATERIALES

DE LOS

COMPONENTES

OPTICOS

En la Figura se

muestran que tipo

de material se

emplea en función

de la λ (región

espectral) para

cubetas , ventanas,

lentes, prismas y

selectores de λ.

celda de 5uL

La muestra se coloca en una cubeta* de

forma prismáticaMM 2012

RECIPIENTES PARA LAS MUESTRAS Todos los métodos espectroscópicos , excepto los atómicos emplean un recipiente que

contenga a la muestra.

Reciben el nombre de celda o cubeta y se fabrican de :

plástico o vidrio (para la región Visible)

sílice fundido (cuarzo) (para la región Visible y UV por debajo de 350 nm e IR hasta

3000 nm )

vidrio de silicato para medidas entre 375 y 2000 nm (V e IR)

NaCl para la región del IR

La longitud mas común en la trayectoria de las cubetas para Visible y UV, suele ser de 1 cm,

aunque las puede haber menores o mayores.

Hay cubetas acopladas a los sistemas de medidas continuas (FIA o HPLC), a través de las

cuales pasa el flujo de muestra.

TEMA 3.- COMPONENTES DE LOS INSTRUMENTOS ESPECTROSCÓPICOS

RECIPIENTES PARA LAS MUESTRAS

TEMA 3.- COMPONENTES DE LOS INSTRUMENTOS ESPECTROSCÓPICOS

Cubeta: disolución de medida

Refrigerante: baño termostático ,

Peltier cooler

Portacubetas

Se asume que el tubo, celda o “cubeta” en la cual

se vierte la solución a leer no debe desviar la

trayectoria de la luz como requisito para el

cumplimiento de la ley de Beer

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Como el cuarzo aparte de ser muy transparente presenta uncomportamiento constante ante la variación de la longitud deonda es común que las celdas del espectrofotómetro ocolorímetro sean de este material .

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RELACIÓN ENTRE ABSORBANCIA Y CONCENTRACIÓN: LEY DE BEER

Ley de Lambert-Beer: muestra cómo la absorbancia es

directamente proporcional a la longitud b de la trayectoria a través de

la solución y a la concentración c del analito o especie absorbente.

cbaA ·· cbA ··

a: cte de proporcionalidad llamada absortividad. (unidades L·cm-1·g-1, si c=g/L)

b: longitud del camino que recorre la radiación a través del medio absorbente.

c: concentración expresada en g/L (mg/L, ...) Cuando en la ecuación laconcentración viene expresada en mol/L, la cte de proporcionalidad se denominaabsortividad molar y se representa por (unidades L·cm-1·mol-1. )

-Disoluciones que contienen más de una clase de especiesabsorbentes:

A = A1 + A2 + .... + An

Como A = · b · c

A = 1 · b · c1 + 2 · b · c2 + …. +n · b · cn

Siendo 1, 2, …, n los componentes absorbentes. MM 2012

Luz incidente (I0) Luz absorbida Luz emergente (I)

Longitud del medio

absorbente o ancho de la

celda

I0

c = concentración.(número de partículas por

cm3)

I

a = absortividad

Cuando un rayo de luz monocromática con una intensidad I0

pasa a través de una solución, parte de la luz es absorbida resultando que la luz emergente I es menor que I0

b

a

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TRANSMITANCIA

Transmitancia: fracción deradiación incidente transmitidapor la disolución.

O

T

P

PT

ABSORBANCIA

La absorbancia de una disolución aumenta a medida queaumenta la atenuación del haz.

T

O

P

PTA loglog

PT potencia del haz de radiación transmitida.MM 2012

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Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro deabsorción característico

Las longitudes de onda con mayor absorción (picos) corresponderánde forma general a aquellas con las que se leerá la muestra paradeterminar su concentración

La relación entre la absorbancia por una sustancia a una l

determinada y su concentración es directamente proporcional es decir:a mayor concentración mayor proporción de luz absorbida.

Absorbancia

Conc.

l

Absorbancia

l

Absorbancia

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Así, el espectro de absorción de la clorofila es:

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8.4.- LIMITACIONES DE APLICABILIDAD DE LA LEY DE BEER

A) Limitaciones reales de la ley

B) Limitaciones Químicas

C) Limitaciones Instrumentales

La proporcionalidad directa entre absorbancia yconcentración cuando b es cte presenta desviaciones:

La atenuación de una radiación es cuantitativamenteproporcional a ala concentración de la especie absorbente

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8.4.- LIMITACIONES DE APLICABILIDAD DE LA LEY DE BEER

A) Limitaciones reales de la ley

-Disoluciones de concentración elevada (c > 0.01 M) dan malos resultados.

-La absortividad a y la absortividad molar dependen del índice derefracción de la muestra.

B) Limitaciones Químicas

Se produce cuando el analito se disocia, asocia o reacciona con eldisolvente para dar productos que presentan propiedades deabsorción diferentes de las del analito.

HIn H+ + In-

Color 1 Color 2

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8.4.- LIMITACIONES DE APLICABILIDAD DE LA LEY DE BEER

C) Limitaciones Instrumentales

El cumplimiento estricto de la Ley de Beer sólo se observa pararadiaciones monocromáticas (radiación formada por una solalongitud de onda) y éstas en la práctica no se consiguen, ya quecon los dispositivos disponibles (filtros, monocromadores) seobtienen una banda de longitudes de onda más o menossimétrica entorno a la deseada.

Otra desviación: Presencia de radiación parásita o dispersa.

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8.6.- ESPECIES ABSORBENTES

A) Absorción por compuestos orgánicos

Dos tipos de e- son responsables de que las moléculas absorban radiaciónUV-Vis:

- e- compartidos que participan directamente en la formación de enlaces yque están asociados a más de un átomo.

- e- externos no compartidos, localizados preferentemente entorno aátomos como O, S, N y halógenos.(e situados en orbitales no enlazantesn)

l a la que absorbe una molécula depende de la fuerza con queretiene a sus distintos e-.

Enlaces sencillos C-C o C-H: l de la región del UV de vacío (l<180 nm)

Enlaces dobles o triples: l de la región del UV

Compuestos orgánicos que contienen S, Br y I: absorben en la región UV

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ESPECIES ABSORBENTES

A) Absorción por compuestos orgánicos con grupos cromóforos

n orbitales no enlazantes presentes en compuestos con heteroatomos de O, S y

halógenos. MM 2012

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8.7.- APLICACIONES

CARACTERÍSTICAS DE LOS MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS

- Amplia aplicabilidad.

- Elevada sensibilidad: los límites detección 10-4 a 10-5 M.

- Selectividad de moderada a alta.

- Buena exactitud: errores de concentración 1-5% o incluso menores.

- Facilidad y comodidad en las medidas espectrofotométricas.

- Se prestan a una fácil automatización.

CAMPO DE APLICACIÓN

- Especies absorbentes: compuestos orgánicos que contengan gruposcromóforos y especies inorgánicas como son los metales de transición.

- Especies no absorbentes: los analitos reaccionan con un reactivopara producir un compuesto absorbente.

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8.7.- APLICACIONES

APLICACIONES MEDIOAMBIENTALES

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Existen en la actualidad

diversos tipos de aparatos con

los mismos principios los hay

mecánicos y digitales; unos

miden solo la luz visible, otros

son más precisos y miden

también luz U.V. , Infrarroja, de

absorción atómica (AA),

flurescencia de rayos-X de

emisión de plasma (ICP),,

multipropósitos (para medir

directamente la solución con

suspensión, muestras sólidas y

biológicas), acoplado a

masas,etc..

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Diferentes tipos de espectrofotómetros

MCI MCI

MCI

Para medir Luz Visible Para medir Luz Visible y U.V.

Para medir Luz Visible y U.V.

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Spectronic 20 D Spectrónic 20

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Aplicaciones Estándar con Espectrofotómetro UV Mini

Modo fotométrico para longitud de onda fija

Con el modo fotométrico, Ud. puede medir la absorbancia o la transmitancia en lalongitud de onda fija. Análisis cuantitativo fijo usando el método Factor-K puedetambién ser usado. Resultados son automáticamente impresos o son mandados a lapuerta RS-232C. Con varios posicionadores de celda opcionales o con configuraciónsipper/auto-muestra, medidas continuas de muestras también es posible.

Modo espectro para barrido de longitud de onda

Con ese modo estándar, Ud. puede lograr espectro UV-Visible completo demuestras de 190nm a 1100nm. Barrido repetido le permite a Ud. medirautomáticamente cualquier cambio espectral en todo el rango. También disponibleen la configuración estándar, la función de procesamiento de datos espectral comoplotar gráfico y detección de picos / valles.

Modo cuantificación para análisis de longitud simple

Este modo le permite a Ud. preparar curva de calibración para determinacionesfáciles de concentraciones de muestras desconocidas. Están disponibles modos deuno, dos o tres longitudes de onda. Métodos cuantitativos posibles de seleccionarincluyendo factor-K, curva de calibración de un punto o multi-puntos . Ajuste deprimero, segundo o tercero orden también son posibles de seleccionar.

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El TU1800/1800S es el más popular espectofotómetro de P-General. Su óptica adopta el sistema de medición SPLIT-BEAN con un detector formado por dos fotodiodos de estado sólido de alta sensibilidad.

Las operaciones del instrumento estan controladas a través de un microchip interno en conjunto con una pantalla de cristal líquido (LCD) y un teclado Soft-Touch con salida para impresora. Su compartimiento es para 8 celdas y además posee una fuente de luz accesible.

El TU1800/1800S efectúa mediciones fotométricas, mediciones espectrales y cuantitativas, es fácilmente operable con característiCAS sobresalientes, Escaneo de longitudes de onda automático entre 1100-200 nm., chequea automáticamente la linea de base.

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Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse turbias o con precipitados.

El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser excesivo para evitar que se desborde, en caso de que sucediera, se debe limpiar con un paño limpio o papel absorbente suave, para evitar rayarla.

La cubeta se sujeta por los lados opacos. La cantidad a adicionar es, máximo, hasta ¾ partes

de la cubeta No se deben derramar líquidos, sobre todo

solventes, ácidos o álcalis; dentro del contenedor de la cubeta, se puede dañar parte del mecanismo

Se debe mantener, el espectrofotómetro, limpio y libre de humedad

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