Espectro de absorcion de la clorofila

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Espectro de Absorci´on de la Clorofila (Presentado el 11 de abril del 2015) Resumen En este experimento el espectro de la clorofila α y la clorofila β de espinaca se estudiaron utilizando un espectrofot´ ometro (spectronic 21D). La clorofila α y la clorofila β se extrajeron de la espinaca utilizando ´ eter de petr´ oleo, alcohol met´ ılico y ´ eter et´ ılico. La clorofila α se obtuvo de una soluci´ on de ´ eter de petroleo y la clorofila β se obtuvo en una soluci´ on de ´ eter et´ ılico. Los picos del espectro de absorci´ on que se obtuvo para la clorofila α fueron de 430nm y 620nm(±1nm)y los picos del espectro de absorci´ on para la clorofila β fueron de 450nm y 610nm(+/ - 1nm). 1. INTRODUCCI ´ ON La clorofila es un pigmento de las plantas, que les propor- ciona su color verde y que absorbe la luz necesaria para la fotos´ ıntesis. La clorofila absorbe principalmente luz violeta roja y azul y refleja luz verde. La abundancia de clorofila en hojas y su ocasional presen- cia en otros tejidos vegetales es la causa de que esas partes de las plantas aparezcan verdes, pero en algunas hojas la clorofila es enmascarada por otros pigmentos. La extrac- ci´ on y reconocimiento de estos pigmentos es interesante para el estudio y conocimiento de sus propiedades. Los Pigmentos vegetales, que se encuentran en los cloro- plastos, son mol´ eculas qu´ ımicas que reflejan o transmiten la luz visible, o hacen ambas cosas a la vez. El color de un pigmento depende de la absorci´ on selectiva de ciertas longitudes de onda de la luz y de la reflexi´ on de otras. Constituyen el sustrato fisicoqu´ ımico donde se asienta el proceso fotosint´ etico. Hay diversas clases de pigmentos [1]: 1- Clorofilas: · Clorofila-α: Es el pigmento principal para la fotos´ ıntesis en las plantas. Tiene la composici´ on C 55 H 72 O 5 N 4 Mg. Exhibe un color visual verde-hierba, y los picos de absorci´ on est´ an a 430nm y 662nm. Se da en todos los organismos fotosint´ eticos, excepto las bacterias fotosint´ eticas. · Clorofila-β: Tiene la composici´ on C 55 H 72 O 6 N 4 Mg, que se diferencia de la clorofila-α, en la sustituci´ on de un grupo metilo, por un CHO. Presenta un color vi- sual verde-azulado, y los picos de absorci´ on est´ an a 453nm y 642nm. Se da en todas las plantas, las algas verdes y algunas procariotas. En las plantas por lo general, hay aproximadamente la mitad de clorofila-β que de clorofila-α. 2- Carotenoides: Los colores de los carotenoides son familiares por los colores en la ca´ ıda de las hojas. Cuando las hojas pierden su clorofila, los carotenoides m´ as persistentes dan los agradables rojos, amarillos y naranjas del follaje en oto˜ no. El beta-caroteno es el m´ as impor- tante de los carotenoides. El licopeno, el color de los tomates, tambi´ en es un carotenoide. · Beta-caroteno: El beta caroteno es el m´ as importante de los ca- rotenoides que sirven como pigmentos accesorios en la fotos´ ıntesis. La medici´ on de la absorci´ on de estos pigmentos como funci´ on de la producci´ on fotosint´ etica, deja claro que las clorofilas son las as importantes, pero el beta caroteno contribu- ye de manera significativa. El beta caroteno da el color a las zanahorias,y tambi´ en a las calabazas, los pl´ atanos y aguacates. Tambi´ en aparece en los colores de las hojas en oto˜ no. · Licopeno: El licopeno es conocido por proporcionar el color rojo al tomate. La clorofila-α es el pigmento principal de la fotos´ ıntesis en las plantas, pero el rango de absorci´ on de la luz es ampliado por la clorofila-β, el beta-caroteno y otros pigmentos accesorios. La clorofila, es el pigmento que da el color verde a los vegetales y que se encarga de absorber la luz necesaria para realizar la fotos´ ıntesis, proceso que posibilita la s´ ıntesis de sustancias org´ anicas a partir de las inorg´ anicas (CO2, H2O y sales minerales), mediante la transformaci´ on de la energ´ ıa luminosa en energ´ ıa qu´ ımica. 2. PIGMENTOS VEGETALES Los colores que presentan los vegetales son debidos a unos compuestos qu´ ımicos llamados pigmentos. El color que presenta un determinado ´ organo vegetal depende generalmente del predominio de uno u otro pigmento o la combinaci´ on de ellos. Adem´ as, algunos de los pigmentos que condicionan el color est´ an estrechamente ligados a las actividades fisiol´ ogicas del propio vegetal[2].

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espectro de absorcion de la clorofila

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  • Espectro de Absorcion de la Clorofila(Presentado el 11 de abril del 2015)

    Resumen

    En este experimento el espectro de la clorofila y la clorofila de espinaca se estudiaronutilizando un espectrofotometro (spectronic 21D). La clorofila y la clorofila se extrajeron dela espinaca utilizando eter de petroleo, alcohol metlico y eter etlico. La clorofila se obtuvo deuna solucion de eter de petroleo y la clorofila se obtuvo en una solucion de eter etlico. Los picosdel espectro de absorcion que se obtuvo para la clorofila fueron de 430nm y 620nm(1nm) ylos picos del espectro de absorcion para la clorofila fueron de 450nm y 610nm(+/ 1nm).

    1. INTRODUCCION

    La clorofila es un pigmento de las plantas, que les propor-ciona su color verde y que absorbe la luz necesaria para lafotosntesis. La clorofila absorbe principalmente luz violetaroja y azul y refleja luz verde.

    La abundancia de clorofila en hojas y su ocasional presen-cia en otros tejidos vegetales es la causa de que esas partesde las plantas aparezcan verdes, pero en algunas hojas laclorofila es enmascarada por otros pigmentos. La extrac-cion y reconocimiento de estos pigmentos es interesantepara el estudio y conocimiento de sus propiedades.

    Los Pigmentos vegetales, que se encuentran en los cloro-plastos, son moleculas qumicas que reflejan o transmitenla luz visible, o hacen ambas cosas a la vez. El color deun pigmento depende de la absorcion selectiva de ciertaslongitudes de onda de la luz y de la reflexion de otras.Constituyen el sustrato fisicoqumico donde se asienta elproceso fotosintetico.

    Hay diversas clases de pigmentos [1]:

    1- Clorofilas:

    Clorofila-:Es el pigmento principal para la fotosntesis en

    las plantas. Tiene la composicion C55H72O5N4Mg.Exhibe un color visual verde-hierba, y los picosde absorcion estan a 430nm y 662nm. Se da entodos los organismos fotosinteticos, excepto lasbacterias fotosinteticas.

    Clorofila-:Tiene la composicion C55H72O6N4Mg, que se

    diferencia de la clorofila-, en la sustitucion de ungrupo metilo, por un CHO. Presenta un color vi-sual verde-azulado, y los picos de absorcion estana 453nm y 642nm. Se da en todas las plantas, lasalgas verdes y algunas procariotas. En las plantaspor lo general, hay aproximadamente la mitad declorofila- que de clorofila-.

    2- Carotenoides:

    Los colores de los carotenoides son familiares porlos colores en la cada de las hojas. Cuando las hojaspierden su clorofila, los carotenoides mas persistentesdan los agradables rojos, amarillos y naranjas delfollaje en otono. El beta-caroteno es el mas impor-tante de los carotenoides. El licopeno, el color de lostomates, tambien es un carotenoide.

    Beta-caroteno:El beta caroteno es el mas importante de los ca-

    rotenoides que sirven como pigmentos accesoriosen la fotosntesis. La medicion de la absorcion deestos pigmentos como funcion de la produccionfotosintetica, deja claro que las clorofilas son lasmas importantes, pero el beta caroteno contribu-ye de manera significativa.

    El beta caroteno da el color a las zanahorias,ytambien a las calabazas, los platanos y aguacates.Tambien aparece en los colores de las hojas enotono.

    Licopeno:El licopeno es conocido por proporcionar el

    color rojo al tomate.

    La clorofila- es el pigmento principal de la fotosntesisen las plantas, pero el rango de absorcion de la luzes ampliado por la clorofila-, el beta-caroteno y otrospigmentos accesorios.

    La clorofila, es el pigmento que da el color verde a losvegetales y que se encarga de absorber la luz necesaria pararealizar la fotosntesis, proceso que posibilita la sntesisde sustancias organicas a partir de las inorganicas (CO2,H2O y sales minerales), mediante la transformacion de laenerga luminosa en energa qumica.

    2. PIGMENTOS VEGETALES

    Los colores que presentan los vegetales son debidos aunos compuestos qumicos llamados pigmentos. El colorque presenta un determinado organo vegetal dependegeneralmente del predominio de uno u otro pigmento o lacombinacion de ellos. Ademas, algunos de los pigmentosque condicionan el color estan estrechamente ligados a lasactividades fisiologicas del propio vegetal[2].

  • 2.2 Espectroscopia UV-Visible 3 FOTOSINTESIS

    Figura 1. Estructura qumica de la clorofila- y clorofila-.

    El color verde en los vegetales es debido a la presenciade dos pigmentos estrechamente emparentados llamadosclorofila- y clorofila- . Se encuentran practicamente entodas las plantas con semilla, helechos, musgos y algas.Tambien aunque aparentemente falten en algunas hojasde color rojo o amarillo, cuando se extraen las otrassustancias colorantes de estas, puede comprobarse inclusoall la presencia de las clorofilas, que estaban enmascaradaspor los demas pigmentos. Asociados con las clorofilas,existen tambien en los cloroplastos dos clases de pigmentosamarillos y amarillo-anaranjados que son los xantofilas ycarotenos.

    2.1 Pigmentos fotosinteticos

    Entre todos los caracteres mas externos de los vegetales, elmas notable y caracterstico es probablemente el color. Elcolor no es unicamente un caracter llamativo de la vege-tacion, sino que, ademas, algunos de los pigmentos que locondicionan estan estrechamente ligados a las actividadesfisiologicas del propio vegetal. Por consiguiente, el estudiode como las plantas viven y se desarrollan requieren elprevio conocimiento de los pigmentos vegetales[2].

    Figura 2. Espectro de absorcion de los pigmentos foto-sinteticos.

    Es posible encontrar en el reino vegetal todos los matices ycombinaciones de colores del espectro, existe un predomi-

    nio general de los colores primarios: verde, amarillo, rojo,azul. Estos colores son conferidos a los vegetales por de-terminados compuestos qumicos definidos, llamados pig-mentos. El color particular que presenta un determinadoorgano vegetal depende generalmente del predominio deuno u otro o la combinacion de ellos.

    Se debe tener claro que cuando un vegetal presenta uncolor blanco, es debido a la falta de tales pigmentos. La luzsolar que incide sobre las partes en blanco no es absorbidaselectivamente como ocurre en las partes coloreadas, sinoque es transmitida o reflejada practicamente sin sufrirmodificacion.

    Las clorofilas. El color verde tan uniformemente presen-te en los vegetales es debido a la presencia de dos pig-mentos estrechamente emparentados llamados clorofila-y clorofila- . Se encuentran practicamente en todas lasplantas con semilla, helechos, musgos y algas. Puedenformarse en las races, tallos, hojas y frutos a condicionde que estos organos esten situados por encima del suelo yqueden expuestos a la luz. Tambien aunque aparentementefalten en algunas hojas de color rojo o amarillo, cuandose extraen las otras sustancias colorantes de estas, puedecomprobarse incluso all la presencia de las clorofilas, queestaban enmascaradas por los demas pigmentos.

    2.2 Espectroscopia UV-Visible

    La espectroscopia UV-Visible explora la absorbancia deuna materia con la region espectral electromagnetica delultravioleta y visible. Este tipo de espectroscopia es utilpara identificar algunos grupos funcionales de moleculas,y ademas, para determinar el contenido y fuerza de unasustancia.

    El principio fsico que utiliza un espectrometro UV-Visiblees simplemente la atenuacion de luz que esta dada por latransmitancia:

    T =I

    I0. (2.1)

    donde I es la intensidad del haz que pasa por el materialy I0 es la intensidad del haz original.

    La absorbancia de un material simplemente esta dada por:

    A = log(T ) = log(I

    I0

    )(2.2)

    El instrumento que se utiliza en la espectroscopia UV-Visible es el espectrofotometro. El escama comun de unespectrofotometro se puede observar en la Fig 3. Como seobserva en el diagrama, una fuente de tungsteno emite unhaz de luz que pasa por un monocromador y una rendija.Despues el haz pasa por la muestra y finalmente por unfotodetector, donde es analizada. Muchos de los espectro-fotometros pueden medir la absorbancia y la transmitanciade la muestra.

    3. FOTOSINTESIS

    La fotosntesis es un proceso en virtud del cual los orga-nismos con clorofila, como las plantas verdes, las algas y

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  • 4 DESARROLLO EXPERIMENTAL

    Figura 3. Esquema basico de un espectrofotometro.

    algunas bacterias, capturan energa en forma de luz y latransforman en energa qumica.

    Practicamente toda la energa que consume la vida de labiosfera terrestre -la zona del planeta en la cual hay vida-procede de la fotosntesis.

    La fotosntesis se realiza en dos etapas: una serie de reac-ciones que dependen de la luz y son independientes de latemperatura, y otra serie que dependen de la temperaturay son independientes de la luz.

    La velocidad de la primera etapa, llamada reaccion lumni-ca, aumenta con la intensidad luminosa (dentro de ciertoslmites), pero no con la temperatura. En la segunda etapa,llamada reaccion en la oscuridad, la velocidad aumenta conla temperatura (dentro de ciertos lmites), pero no con laintensidad luminosa.

    1- Fase primaria o lumnica

    La fase lumnica de la fotosntesis[4] es una etapa enla que se producen reacciones qumicas con la ayudade la luz solar y la clorofila.

    La clorofila es un compuesto organico, formadopor moleculas que contienen atomos de carbono,de hidrogeno, oxgeno, nitrogeno y magnesio. Estoselementos se organizan en una estructura especial: elatomo de magnesio se situa en el centro rodeado detodos los demas atomos.

    La clorofila capta la luz solar, y provoca el rom-pimiento de la molecula de agua (H2O), separandoel hidrogeno (H) del oxgeno (O); es decir, el enla-ce qumico que mantiene unidos al hidrogeno y aloxgeno de la molecula de agua, se rompe por efectode la luz. El proceso genera oxgeno gaseoso quese libera al ambiente, y la energa no utilizada esalmacenada en moleculas especiales llamadas ATP .En consecuencia, cada vez que la luz este presente, sedesencadenara en la planta el proceso descrito.

    2- Fase secundaria u oscura

    La fase oscura de la fotosntesis[4] es una etapa enla que no se necesita la luz, aunque tambien se realizaen su presencia. Ocurre en los cloroplastos y dependedirectamente de los productos obtenidos en la faselumnica.

    En esta fase, el hidrogeno formado en la fase ante-rior se suma al dioxido de carbono gaseoso (CO2) pre-sente en el aire, dando como resultado la produccionde compuestos organicos, principalmente carbohidra-tos; es decir, compuestos cuyas moleculas contienencarbono, hidrogeno y oxgeno.

    Dicho proceso se desencadena gracias a una energaalmacenada en moleculas de ATP que da como resul-tado el carbohidrato llamado glucosa (C6H12O6), untipo de compuesto similar al azucar, y moleculas deagua como desecho.

    Despues de la formacion de glucosa, ocurre unasecuencia de otras reacciones qumicas que dan lugara la formacion de almidon y varios carbohidratos mas.

    A partir de estos productos, la planta elaboralpidos y protenas necesarios para la formacion deltejido vegetal, lo que produce el crecimiento.

    Cada uno de estos procesos no requiere de la participacionde luz ni de la clorofila, y por ende se realiza durante el day la noche. Por ejemplo, el almidon producido se mezclacon el agua presente en las hojas y es absorbido por unostubitos minusculos que existen en el tallo de la planta y,a traves de estos, es transportado hasta la raz donde sealmacena. Este almidon es utilizado para fabricar celulosa,el principal constituyente de la madera.

    Figura 4. Esquema basico de la fotosntesis en un cloro-plasto.

    El resultado final, y el mas trascendental, es que la plantaguarda en su interior la energa que proviene del Sol. Estacondicion es la razon de la existencia del mundo vegetalporque constituye la base energetica de los demas seresvivientes.

    Por una parte, las plantas son para los animales fuente dealimentacion, y, por otra, mantienen constante la cantidadnecesaria de oxgeno en la atmosfera permitiendo que losseres vivos puedan obtener as la energa necesaria parasus actividades.

    Si los qumicos lograran reproducir la fotosntesis pormedios artificiales, se abrira la posibilidad de capturarenerga solar a gran escala. En la actualidad se trabajamucho en este tipo de investigacion. Todava no se halogrado sintetizar una molecula artificial que se mantengapolarizada durante un tiempo suficiente para reaccionarde forma util con otras moleculas, pero las perspectivasson prometedoras.

    4. DESARROLLO EXPERIMENTAL

    Para la preparacion del extracto de clorofila se necesitaronunas cuantas hojas de espinaca, el manual de laboratoriopara esta practica[3] indicaba el uso de solo 2.5 gr. deespinaca, pero para tener una mayor cantidad de clorofila

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  • 4 DESARROLLO EXPERIMENTAL

    se decidio seguir las instrucciones del manual usando unaproporcion de 1.5 de todas las cantidades necesarias parala extraccion de las clorofilas y [3].

    Para la extraccion de las clorofilas y se mezclaron 3.75gr. de espinaca molida con 60 ml. de acetona diluida al80 %.

    Una vez que la acetona adquiere un color verde oscurointenso, se filtra en un embudo de separacion, el extractode acetona contiene los pigmentos de los cloroplastos.

    Figura 5. Mezcla de acetona al 80 % con espinaca molida.

    Se agrega al embudo de separacion que contiene los pig-mentos 75 ml. de eter de petroleo y se rota el embudosuavemente.

    Posteriormente se agregan 105 gr. de agua destilada en elembudo, de tal manera que el agua resbale por las paredesdel recipiente hasta que llegue al fondo del embudo. Serota el embudo hasta que la parte superior adopte un colorverde intenso.

    Se lava la solucion de eter de petroleo anadiendo 75 ml. deagua destilada. Se rota suavemente el embudo, esperandoa que se separen la soluciones y se drena el agua con ayudadel embudo de separacion. Se repite el procedimientoanterior de dos a mas veces.

    Figura 6. Agregado de agua destilada (primera vez) a lamezcla previa dentro del embudo de separacion.

    Despues se mezclan 69 ml. de alcohol metlico con 6 ml. deagua destilada. Se limpia la solucion de eter de petroleoanadiendo 75 ml. de la solucion de alcohol metlico, semezcla rotando el embudo de separacion y se espera a que

    Figura 7. Agregado de agua destilada (tercera vez) a lamezcla previa dentro del embudo de separacion.

    se separen las mezclas de eter de petroleo y de alcoholmetlico.

    Con ayuda del embudo de separacion se coloca la parteinferior (de alcohol metlico) en un vaso de precipitado yla solucion de la parte superior (de eter de petroleo) enotro.

    Figura 8. Solucion de eter de petroleo.

    La solucion de alcohol metlico contiene la clorofila yxantofila, mientras que la solucion de eter de petroleocontiene la clorofila y carotenos.

    Una vez separadas las soluciones, se colocan 75 ml. de lasolucion de alcohol metlico en el embudo de separacion(previamente se lavo con acetona y agua destilada) y seanadieron 75 ml. de eter etlico, se mezcla por rotaciondentro del embudo, una vez mezclado se anade 7.5 mlde agua destilada haciendola resbalar por las paredes delrecipiente, se agrego agua destilada cada cierto tiempo(intervalos entre 2 y 5 mn.) respetando el agregar 7.5 ml.cada vez, este proceso se repitio hasta que se observarondos faces, se desecha la parte inferior (de alcohol metlico).

    En dos tubos de ensayo grandes, se colocan 45 ml. de cadauna de las soluciones por separado, esto es, la solucion deeter etlico en uno y de eter de petroleo en otro.

    Se prepara una solucion de 13.5 ml. de alcohol metlicocon 31.5 mg. de hidroxido de potasio, cuidadosamente sevierte por las paredes de cada tubo de ensayo 22.5 ml. dela solucion de alcohol metlico y se procede a agitar.

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  • 4 DESARROLLO EXPERIMENTAL

    Figura 9. Solucion de alcohol metlico, eter de etlico yagua destilada.

    Figura 10. Solucion de alcohol metlico y eter de petroleo.

    Se espera un tiempo a que se formen dos faces en cadatubo y con ayuda del embudo de separacion se desecha laparte inferior de cada uno.

    Figura 11. Solucion de alcohol metlico y eter de petroleo(5 mn. despues de su preparacion).

    La parte restante de cada tubo contiene los pigmentos,clorofila (solucion de eter de petroleo) y clorofila (solucion de eter etlico).

    Una vez separados los pigmentos se procedio a obtenersu absorbancia contra longitud de onda con ayuda de unespectrofotometro (spectronic 21).

    Figura 12. Solucion de alcohol metlico y eter etlico (5 mn.despues de su preparacion).

    Figura 13. Espectrofotometro utilizado en el experimento.

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  • REFERENCIAS

    5. RESULTADOS

    Graficas obtenidas durante el experimento.

    Figura 14. Espectro de absorcion de alcohol metlico y eterde petroleo.

    Figura 15. Espectro de absorcion de alcohol metlico y eterde etlico.

    Figura 16. Espectro de absorcion de la solucion de eter depetroleo (clorofila ) menos el espectro de absorciondel eter de petroleo y de la solucion de eter etlico(clorofila ) menos el espectro de del eter etlico(ambos menos el espectro de absorcion del alcoholmetlico).

    6. ANALISIS

    Como se observa en la grafica 3, el espectro de absor-bancia de los dos tipos de clorofila que se obtuvieronexperimentalmente si son similares a los espectros teori-cos. Las dos clorofilas tenan maxima absorbancia entre400 500nm y 620 700nm y mnima absorbancia entre500610nm(1nm). Los picos obtenidos para la clorofila ocurrieron en 430nm y 620(1nm) y para la clorofila ,los picos ocurrieron en 450nm y 610nm.

    Aunque estos picos si son consistentes con los valoresteoricos del espectro, el espectro en general no es exacta-mente como se esperaba. El segundo pico de la clorofila es mas grande que el de la clorofila , cuando enteora el segundo pico de tiene que ser mas grandeque el de . Otra observacion es el primer pico de esmuy ancho (un poco mas de 100nm). Esto no es con-sistente con el espectro teorico ya que lo mas ancho esde aproximadamente 50nm. Estas inconsistencias puedenser dadas por el metodo experimental. Aunque los pasosde la extraccion de las clorofilas son claros, se tiene quetener mucho cuidado de no contaminar las muestras y deasegurarse de que desechos no se queden solucion analiza-da. Contaminantes y desechos dentro de la muestra puedeafectar el espectro de absorcion un poco. Otro problemafue que el espectrofotometro tenda a saturarse con valoresgrandes de la absorbancia. Esto fue un gran problema yaque la absorbancia del primer pico de la clorofila beta esgrande. Se obtuvo la transmitancia sin saturacion pero losvalores de los picos era pequenos con poca variacion queel espectroscopio no tenia la resolucion necesaria para darvalores precisos (daba un intervalo constante cuando no loeran y afectaba los valores obtenidos de la absorcion).

    7. CONCLUSIONES

    Los resultados fueron suficientemente consistentes paradiferenciar entre clorofila y clorofila pero no fueron losmejores. Esto esta dado a que la muestra no era totalmentepura y contena desechos que afectaron el espectro deabsorcion. Tambien el espectrofotometro se saturaba alllegar una cierta medicion. Estos problemas pueden sereliminados asegurando que los instrumentos en uso estalimpio entre cada uso y asegurarse que los desechos nocontaminen las soluciones.

    REFERENCIAS

    [1]-http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbasees/biology/pigpho.html,

    fecha de consulta: 16/05/15.[2]-http://www.bdigital.unal.edu.co/8545/18/08

    Cap06.pdf,fecha de consulta: 16/05/15.

    [3]-Manual de laboratorio Espectro de absorcion de laclorofila.

    [4]-http://ocw.upm.es/produccion-vegetal/viticultura/contenidos/Fotosintesisvid.pdf,

    fecha de consulta: 18/05/15.

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