1

1

~ 6. ENZIMI I KOENZIMI ~• gr. ενζυμον = u kvascu

• enzimi: globularni proteini koji katalizuju biohemijske reakcije

• iz reakcije izlaze nepromenjeni

• razlike u odnosu na druge katalizatore:

• blagi reakcioni uslovi (t, p, pH)

• velike brzine r-je (103−1020 puta brže od neorg. kat.)

• visoka specifičnost

• mogućnost regulacije

• prema lokaciji: celularni i ekstracelularni

• prema složenosti: monomerni, oligomerni, multienzimski sistemi

• prema sastavu: proteinski, proteid enzimi (sa koenzimom), metaloenzimi

Biohemijske reakcije u organizmu predstavljaju veoma spore organske reakcije, koje bi se u odsustvu katalizatora odvijale previše sporo da bi život mogao da opstane. Zbog toga se skoro sve biohemijske reakcije odigravaju se posredstvom enzima. Enzimi su globularni proteini koji katalizuju hemijske reakcije, pri čemu sami iz reakcija izlaze nepromenjeni (iako se u toku reakcije mogu promeniti, dolazi do njihovog recikliranja). Sama reč “enzim” potiče od grčkog izraza “enzimon”, u kvascu, jer je jedan od prvih ispitivanih enzimskih procesa bila alkoholna fermentacija pod dejstvom kvasca.

Za razliku od neorganskih katalizatora (kiseline, platina itd.), koji tipično zahtevaju ekstremne uslove (visoke temperature i pritiske, ekstremne vrednosti pH i sl.), enzimi dejstvo ispoljavaju pri blagim, fiziološkim uslovima – pH ≈ 7, t ≈ 37 °C, atmosferski pritisak... Dalje, mnogo su efikasniji – postižu brzine reakcija 103–1020 puta veće od neorganskih katalizatora. Takođe, visoko su specifični – dok npr. H+ može katalizovati veoma veliki broj različitih reakcija, enzimi katalizuju samo određenu transformaciju određene funkcionalne grupe (ili, čak, samo određenog jedinjenja). Dodatno, praktično ne dolazi do sporednih reakcija – čistoća proizvoda je 100 %. Na kraju, aktivnost enzima moguće je regulisati različitim mehanizmima – nekovalentnim vezivanjem aktivatora ili inhibitora, kovalentnom modifikacijom (fosforilacijom) i regulacijom brzine sinteze ili degradacije enzima.

Postoje različite klasifikacije enzima. Prema lokaciji, mogu se podeliti na celularne (ovde spada većina; nalaze se u unutrašnjosti ćelije – u citosolu, organelama, ili membranama) i ekstracelularne (digestivni enzimi, neki toksini, enzimi vezani za imunitet i koagulaciju...). Prema složenosti proteinske komponente, obuhvataju monomerne (samo jedan peptidni lanac) i oligomerne enzime (više lanaca) i multienzimske sisteme ili multienzimske komplekse (sadrže više različitih enzima, koji zajedno katalizuju seriju uzastopnih reakcija). Prema sastavu, dele se na proteinske (sadrže samo peptidnu komponentu), proteid enzime (sadrže prostetske grupe – koenzime) i metaloenzime (sadrže metalne jone kao kofaktore). Najznačajnija podela enzima je prema tipu reakcija koje katalizuju, i o njoj će više biti reči dalje u tekstu.

2

2

6.1. Nomenklatura enzima• Nomenklatura

• Trivijalni naziv: pepsin, tripsin• Prema supstratu: ureaza, saharaza• Prema reakciji (uobičajeno ime): alkohol dehidrogenaza, ATP sintaza• Klasifikacioni broj: EC 1.1.12.3

• Podela prema tipu reakcija (Enzimska komisija 1961.)• EC 1 – oksidoreduktaze Ared + Box ⇔ Aox + Bred

• EC 2 – transferaze A-X + B ⇔ A + B-X• EC 3 – hidrolaze A-B + H2O ⇔ A-H + B-OH• EC 4 – lijaze A=B + C-D ⇔ CA-BD• EC 5 – izomeraze A ⇔ izoA• EC 6 – ligaze (sintetaze) A + B + NTP ⇔ A-B + NDP + Pi

EC 3.4.11.4

hidrolazaraskida peptidne vezeotkida aminokiselinu sa N-terminusasupstrat: tripeptid

tripeptid aminopeptidaza

Enzimi se mogu imenovati na više načina. Prvi otkriveni enzimi (pepsin, tripsin, himotripsin...) dobijali su trivijalna imena koja su neinformativna. Kasnije su uvedena sistematičnija imena, prema supstratu na koga deluju (npr. ureaza koja katalizuje hidrolizu uree, saharaza koja hidrolizuje saharozu...). Uobičajena imena enzima nose informacije i o supstratu i o reakciji koju katalizuju (npr. alkohol dehidrogenaza oksiduje alkohole, ATP sintaza katalizuje sintezu ATP...), i često predstavljaju kondenzovanu verziju sistematskih.

Konačno, svakom enzimu* dodeljuje se i klasifikacioni broj prema pravilima Enzimske komisije (EC) Međunarodne unije za biohemiju i molekularnu biologiju (IUBMB), kao i sistematsko ime** koje nosi detaljnije informacije o reakciji i supstratu. Prvi broj definiše klasu enzima. Prema pravilima enzimske komisije, razlikujemo 6 klasa: oksidoreduktaze (grupa EC1, katalizuju reakcije oksidacije i redukcije), transferaze (EC2, katalizuju prenos grupa), hidrolaze (EC3, katalizuju hidrolizu), lijaze (EC4, katalizuju reakcije adicije ili eliminacije), izomeraze (EC5, katalizuju interkonverziju izomera) i ligaze (EC6, katalizuju građenje veze uz utrošak energije). Drugi i treći broj definišu podklasu i pod-podklasu, a četvrti broj predstavlja serijski broj enzima u datoj pod-podklasi.

Sem nekoliko zadržanih starih naziva (tripsin, himotripsin, papain...), trivijalna, uobičajena i sistematska imena svih enzima završavaju se sufiksom “-aza”.

* Treba napomenuti da se jedan EC broj ne odnosi na jedan konkretni protein sa enzimskom aktivnošću, nego na grupu proteina sa istom katalitičkom aktivnošću (zbog čega enzimi iz različitih organizama, kao i izozimi, tipično imaju isti EC broj)** IUPAC preporučuje korišćenje uobičajenih imena, budući da su jednostavnija i praktičnija. Samo je prvi put u tekstu potrebno navesti i sistematsko ime i EC broj.

3

3

• EC 1. Oksidoreduktaze• katalizuju redoks reakcije: Ared + Box ⇔ Aox + Bred

• sistematsko ime: donor : akceptor oksidoreduktaza

NAD(P)HEC 1.6...

-CH-NH-EC 1.5-CH2-NH2EC 1.4-CH=CH-EC 1.3

>C=OEC 1.2>CH-OHEC 1.1

Donor elektronaKlasa Akceptori (3. broj):• NAD(P)+

• citohromi• O2

• lipoična kiselina• Fe-S proteini• hinoni...

glutamat dehidrogenaza (EC 1.4.1.3)L-glutamat:NAD(P)+ oksidoreduktazaGlu + H2O + NAD(P)+ ⇔ α-ketoglutarat + NH4

+ + NAD(P)H + H+

alkohol dehidrogenaza (EC 1.1.1.1)alkohol:NAD+ oksidoreduktazaRCH2OH + NAD+ ⇔ RCHO + NADH + H+ R

OH

R

O

NAD+

NADH

Oksidoreduktaze su enzimi koji katalizuju reakcije oksidoredukcije. Sistematski se imenuju kao donor:akceptor oksidoreduktaze, pri čemu se za donora smatra supstrat koji se oksiduje (donira elektrone odn. H). Preporučeno uobičajeno ime enzima ove grupe je supstrat dehidrogenaza ili, eventualno, supstratreduktaza (mada se mogu javiti i termini oksidaza, oksigenaza, monooksigenaza, peroksidaza). Na primer, u slučaju enzima EC 1.1.1.1 koji katalizuje oksidaciju alkoholâ u aldehide/ketone uz prenos elektrona na NAD+, sistematsko ime je alkohol:NAD+ oksidoreduktaza, a uobičajeno alkohol dehidrogenaza.

Kod većine podklasa oksidoreduktaza, drugi broj u oznaci enzima definiše grupu koja se oksiduje. Tako EC 1.1 oksiduju alkohole, EC 1.2. aldehide, oksokiseline i CO, itd. Treći broj kod većine podklasa definiše elektron-akceptora – 1. za NAD(P)+, 2. za citohrom, 3. za O2, 4. za disulfid itd.

Pored ostalog, oksidoreduktaze su značajne za energetski metabolizam, pošto se energija u ćeliji proizvodi procesima biološke oksidacije energetskih goriva – prvenstveno ugljenih hidrata i masnih kiselina. Tako, u glikolizi – procesu oksidacije glukoze do piruvata – učestvuje gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (EC 1.2.1.12), a u procesu β-oksidacije masnih kiselina učestvuju acil-CoA dehidrogenaza (EC 1.3.99.3) i L-β-hidroksiacil-CoA dehidrogenaza (EC 1.1.1.35).

4

4

• EC 2. Transferaze• katalizuju prenos grupa/molekula: A-X + B ⇔ A + B-X• sistematsko ime: donor : akceptor grupa transferaza

N-grupeEC 2.6...

alkil, aril-EC 2.5glikozil-EC 2.4acil-EC 2.3aldehidna/keto-EC 2.2C1EC 2.1GrupaKlasa

3. broj – preciznije definisana grupa ili akceptor

holin acil-transferaza (EC 2.3.1.6)acetil-CoA:holin; O-acetil transferazaacetil-CoA + holin ⇔ CoA + acetilholin

heksokinaza (EC 2.7.1)ATP:D-heksoza; 6-fosfotransferazaATP + D-heksoza ⇔ D-heksoza-6-fosfat + ADP O

OH

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH

O(P)

ADP-(P) ADP

Transferaze su enzimi koji katalizuju prenos funkcionalnih grupa (npr. metil-, glikozil-, amino-) sa jednog jedinjenja (donora) na drugo (akceptora). Sistematska imena formiraju se kao donor:akceptor grupatransferaza, npr. ATP:D-heksoza 6-fosfotranferaza. Uobičajena imena grade se često kao donor grupatransferaza ili akceptor grupatransferaza.

Zbog izuzetnog značaja fosforilacije u metabolizmu, za enzime koji prenose fosfatni ostatak sa nekog energijom bogatog molekula (tipično ATP) na supstrat koristi se poseban uobičajeni naziv kinaze; na primer, heksokinaza katalizuje fosforilaciju heksoza uz utrošak ATP. Reakcija transfera funkcionalne grupe može se posmatrati na više načina – kao transfer grupe X sa molekula A na molekul B, ili kao raskidanje A-X veze molekulom B. Ukoliko je B fosfatni jon, proces se naziva fosforolizom, a odgovarajući enzim – fosforilazom; npr. glikogen fosforilaza (EC 2.4.1.1) otkida glukozne jedinice iz glikogena.

Dodatni brojevi u oznaci enzima definišu grupu koja se prenosi. Tako, EC 2.1 prenose C1-grupe (EC 2.1.1 metil, EC 2.1.2. hidroksimetil, formil i sl., EC 2.1.3. karboksi i karbamoil...), EC 2.2 aldehidne i keto, EC 2.3 acil, EC 2.4. glikozil, EC 2.5. alkil (sem metil) i aril, EC 2.6. grupe sa azotom...

5

5

• EC 3. Hidrolaze• katalizuju hidrolizu: A-B + H2O ⇔ A-H + B-OH• sistematsko ime: supstrat hidrolaza / supstrataza

anhidridi kiselinaEC 3.6...

nepeptidna C-NEC 3.5peptidnaEC 3.4etarskaEC 3.3

glikozidnaEC 3.2estarskaEC 3.1

VezaKlasa

3. broj – preciznije definisana veza ili supstrat

invertaza (EC 3.2.1.26)β-fruktofuranozidazasaharoza + H2O ⇔ glukoza + fruktoza

ureaza (EC 3.5.1.5)urea amidohidrolazaurea + H2O ⇔ CO2 + 2 NH3

Hidrolaze su enzimi koji katalizuju hidrolitičko raskidanje veza, uklj. C-O, C-N, C-C, P-O itd. U principu, sve hidrolaze bi se po mehanizmu mogle svrstati u transferaze. Sistematsko ime gradi se dodatkom reči hidrolaza nazivu supstrata. U mnogim slučajevima, uobičajeni naziv izveden je prostim dodatkom sufiksa “-aza” nazivu supstrata, npr. ureaza (EC 3.5.1.5) hidrolizuje ureu, laktaza (EC 3.2.1.108) – laktozu, nukleaze – nukleinske kiseline...

Drugi broj u EC oznaci definiše tip veze koja se hidrolizuje – EC 3.1 raskidaju estarsku vezu, EC 3.2 –glikozidnu, EC 3.3 etarsku, EC 3.4. peptidnu itd. Treći broj najčešće preciznije specificira klasu jedinjenja – EC 3.1.1 hidrolizuju estre karboksilnih kiselina, EC 3.1.2 tioestre, EC 3.1.3 fosfatne monoestre... Treba napomenuti da neke hidrolaze pokazuju mešovitu aktivnost – većina proteaze katalizuje i hidrolizu estarskih veza, čak u većoj meri nego hidrolizu peptidnih; u tom slučaju, klasifikuju se prvenstveno prema fiziološkoj funkciji.

Hidrolaze su najbrojniji enzimi, i mnogi predstavnici veoma su značajni za metabolizam. Treba pomenuti serinske proteaze – tripsin (EC 3.4.21.4), himotripsin (EC 3.4.21.1)... – koji učestvuju u varenju proteina, acetilholin esterazu (EC 3.1.1.7) koja je bitna za proces neurotransmisije, nukleaze (EC 3.1.11-16 i 3.1.21-31) koje su bitne za digestiju nukleinskih kiselina, reparaciju... Primarni aktivni membranski transporteri takođe spadaju u hidrolaze – ATPaze (EC 3.6.3).

6

6

• EC 4. Lijaze (sintaze)• katalizuju raskidanje veza (C-C, C-O, C-N, C-S) putem eliminacije:

sistematsko ime: supstrat grupa-lijaza

P-OEC 4.6C-ClEC 4.5C-SEC 4.4C-NEC 4.3C-OEC 4.2C-CEC 4.1VezaKlasa

3. broj – preciznije definisana funkcionalna grupa

A=B + C-D ⇔ A-B| |

C D

fruktoza-bisfosfat aldolaza (EC 4.1.2.13)D-fruktoza-1,6-bisfosfat D-gliceraldehid-3-fosfat-lijazafruktoza-1,6-bisfosfat ⇔ gliceraldehid-3-fosfat + dihidroksiaceton-fosfat

fumaraza (EC 4.2.1.2)L-malat hidro-lijazaL-malat ⇔ fumarat + H2O

COOH

COOH

COOH

COOH

OHOH2

Lijaze ili sintaze su enzimi koji raskidaju C-C, C-O, C-N, C-S i druge veze putem eliminacije, uz formiranje višestrukih veza ili prstenova. Alternativno, ako se reakcija posmatra u suprotnom smeru, katalizuju adiciju na višestruke veze. Sistematsko ime ovih enzima formira se kao supstrat grupa-lijaza. Mnogi tipovi lijaza imaju uobičajena imena – karboksilaze/dekarboksilaze (karboksi-lijaze, uvode/uklanjaju karboksilnu grupu iz molekula), dehidrataze (uklanjaju OH grupu i H atom u vidu vode), aldolaze (katalizuju aldolnu kondenzaciju/cepanje) itd. Ukoliko je reakcija adicije mnogo značajnija, ponekad se koristi i termin sintaze (pažnja: ne mešati sa sintetazama, drugim nazivom za ligaze!).

Označavaju se prema tipu veze koja se raskida/formira. Drugi broj definiše povezane atome: EC 4.1 kidaju C-C veze, EC 4.2 C-O itd. Treći broj precizira klasu jedinjenja: EC 4.1.1 karboksilne kiseline, EC 4.1.2 aldehidi, EC 4.1.3 okso-kiseline...

Značajni predstavnici ove grupe su fruktoza-bisfosfat aldolaza (EC 4.1.2.13), koja u glikolizi razlaže heksozu – fruktozu – na dve trioze – gliceraldehid i dihidroksiaceton (svi u obliku odgovarajućih fosfata), i ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaza oksigenaza (RuBisCO, EC 4.1.1.49), najzastupljeniji protein u prirodi, odgovoran za fiksaciju (vezivanje) atmosferskog CO2 prilikom fotosinteze.

7

7

• EC 5. Izomeraze• katalizuju izomerizaciju – prevođenje jednog izomera u drugi: A ⇔ izoA• sistematsko ime: supstrat izomeraza

intramolekulske lijazeEC 5.5intramolekulske transferazeEC 5.4intramolekulske oksidoreduktazeEC 5.3cis-trans-izomerazeEC 5.2epimeraze, racemazeEC 5.1Tip reakcijeKlasa

3. broj – preciznije definisana veza / funkc. grupa / supstrat

racemaza aminokiselina (EC 5.1.1.10)L-aminokiselina ⇔ D-aminokiselina

COOH

R

NH2 H

COOH

R

NH2H

trioza-fosfat izomeraza (EC 5.3.1.1)D-gliceraldehid-3-fosfat ⇔ dihidroksiaceton-fosfat O

OH

O(P)

OH

O

O(P)

Izomeraze su enzimi koji katalizuju strukturne ili geometrijske promene unutar jednog molekula, odn. katalizuju interkonverziju skeletnih ili stereoizomera. Prema tipu izomerizacije, razlikuju se:

• racemaze i epimeraze (EC 5.1), koje katalizuju izomerizaciju na hiralnim centrima, npr. racemaza aminokiselina (EC 5.1.1.10): L-aminokiselina ⇔ D-aminokiselina

• cis-trans-izomeraze (EC 5.2), koje katalizuju interkonverziju geometrijskih izomera, npr. retinal izomeraza (EC 5.2.1.3): all-trans-retinal ⇔ 11-cis-retinal

• intramolekulske oksidoreduktaze (EC 5.3.), kod kojih su elektron-donor i elektron-akceptor delovi istog molekula, npr. trioza-fosfat izomeraza (EC 5.3.1.1) koja u metabolizmu glukoze konvertuje dihidroksiaceton-fosfat (ketotrioza) u gliceraldehid-3-fosfat (aldotrioza)

• mutaze (EC 5.4), koje predstavljaju intramolekulske transferaze, odn. katalizuju premeštanje funkcionalne grupe na drugu poziciju unutar istog molekula; primer: fosfoglicerat mutaza (EC 5.4.2.1), koja učestvuje u metabolizmu glukoze, a koja izomerizuje 3-fosfoglicerat u 2-fosfoglicerat

...

8

8

• EC 6. Ligaze (sintetaze)• katalizuju građenje veze uz hidrolizu ATP:A + B + ATP ⇔ A-B + ADP + Pi• sistematsko ime: supstrat1-supstrat2 ligaza

N-metalEC 6.6fosfoestarskaEC 6.5

C-CEC 6.4C-NEC 6.3C-SEC 6.2C-OEC 6.1VezaKlasa

glutamin sintetaza (EC 6.3.1.2) – formira C-N vezuL-glutamat:amonijum ligazaGlu + ATP + NH4

+ ⇔ Gln + ADP + Pi

acetil-CoA karboksilaza (EC 6.4.1.2) – formira C-C vezuacetil-CoA + ATP + CO2 ⇔ malonil-CoA + ADP + Pi

COOH

NH2

COOH

COOH

NH2

CONH2

ATP ADP

PiNH3

Poslednja klasa enzima su ligaze, koje katalizuju povezivanje dva molekula kuplovano sa hidrolizom fosfoanhidridne veze (npr. u ATP). Ranije je za enzime ove grupe korišćen naziv sintetaze, koji je napušten zbog mešanja sa sintazama (lijazama). Ligaze se označavaju prema vezama koje formiraju – EC 6.1 uspostavljaju C-O veze, EC 6.2 C-S veze itd. Kod ove klase, pod-podklase se uglavnom ne koriste (sem kod C-N ligaza), te je 3. broj uglavnom “1”.

Neki od značajnijih primera su aminoacil tRNK sintaze (koje vezuju aminokiselinu za odgovarajuću tRNK), glutamin sintetaza (EC 6.3.1.2) i asparagin sintetaza (EC 6.3.5.4) koje konvertuju kisele aminokiseline u odgovarajuće amide, DNK ligaza (EC 6.5.1.1) koja spaja raskinute DNK dvostruke helikse...

9

9

6.2. Enzimska kataliza6.2.1. Vezivanje supstrata

• supstrat se vezuje za enzim gradeći enzim-supstrat kompleks• vezivanje za aktivni centar – obično nekovalentnim interakcijama• u aktivnom centru – bočne grupe AK i kofaktori, odgovorni za:

• specifično vezivanje supstrata•katalizu

E + S ⇔ ES

aktivni centarglukokinaze(sa vezanim supstratom)

aktivni centararginin kinaze

Enzimi su po strukturi globularni proteini, koji za sebe vezuju supstrat(e) i katalizuju određenu reakciju. Poseduju poseban region – aktivni centar – koji je odgovoran za enzimsku aktivnost. Aktivni centar tipično je smešten u udubljenju ili pukotini na površini proteina.

U aktivnom centru nalaze se aminokiselinski ostaci odgovorni za specifično vezivanje supstrata (zahvaljujući odgovarajućem prostornom rasporedu naelektrisanih, hidrofobnih i drugih grupa, sternim smetnjama itd.) i ostaci odgovorni za katalizu. Pored toga, mogu biti prisutne i neproteinske komponente –kofaktori. Supstrat se za aktivni centar najčešće veže nekovalentnim interakcijama (mada pri samoj katalizi dolazi i do formiranja kovalentnih veza).

10

10

• bočni ostaci AK u aktivnom centru: ne moraju biti blizu u sekvenci• 3D struktura proteina ključna za pravilan raspored AK u akt. centru ⇒narušavanje strukture (denaturacija) → smanjenje/gubitak aktivnosti

himotripsinaktivni centar: His57, Asp102, Ser195

karboksipeptidaza Aaktivni centar: His69, Glu72, His196, Zn

Aminokiseline koje čine aktivni centar prostorno se nalaze blizu jedna drugoj, ali su tipično u sekvenci udaljene – npr. kod himotripsina za katalizu su odgovorni ostatak histidina u položaju 57, ostatak asparaginske kiseline u položaju 102, i serin u poziciji 195. Međutim, specifično uvijanje proteina dovodi ove grupe u blizak kontakt.

Da bi AK ostaci bili pravilno raspoređeni u aktivnom centru, trodimenzionalna struktura (tercijerna struktura) celog molekula enzima mora biti odgovarajuća. Narušavanje 3D-strukture rezultuje smanjenjem ili potpunim gubitkom aktivnosti (denaturacijom). Visoke temperature (iznad oko 40–50 °C) dovode do deaktivacije brojnih enzima organizma i smrti.

11

11

6.2.2. Specifičnost enzimskih reakcija• enzimske reakcije – visokospecifične:

R1

O

O

R2

R1

NH

O

R2

R1

OH

O

OH R2

• reakciona – određena reakcija, određeni tip veze

• supstratna – određeni supstrat

O

OHOOH

OH

OH

R

O

OHOOH

OH OH

R

O

OHOHOH

OH

OH

OHR

• grupna – širok spektar supstrata • apsolutna – samo jedan supstrat

R

OH

R

O O

NH2 NH2C

O

ONH3 NH3

O

R NH2

Enzimske reakcije karakteriše visoka specifičnost, koja uključuje reakcionu i supstratnu specifičnost. Reakciona specifičnost znači da enzim katalizuje samo određeni tip reakcije određenog tipa veze (npr. hidrolizu etarske veze), dok supstratna znači da enzim prihvata samo supstrate određene strukture (npr. samo glikozide β-D-glukopiranoze). Manje (grupno) specifični enzimi prihvataju širok spektar supstrata –alkohol dehidrogenaza, na primer, konvertuje različite primarne i sekundarne alkohole do aldehida i ketona. S druge strane, apsolutno specifični enzimi napadaju samo određenu vezu u određenom supstratu –ureaza hidrolizuje samo molekul uree na NH3 i CO2.

Po specifičnosti enzimi se veoma razlikuju od neenzimskih katalizatora. Zahvaljujući visokoj hemoselektivnosti (prihvataju kao supstrat i daju kao proizvod samo određene funkcionalne grupe), regioselektivnosti (samo jedan položajni izomer) i stereoselektivnosti (samo jedan stereoizomer), sporedne reakcije su zanemarljive. Ovim se sprečava trošenje materije i energije, kao i nagomilavanje potencijalno štetnih nusproizvoda.

12

12

• model ključ-brava • visoka sličnost između 3D geometrije supstrata i vezivnog centra

loš supstrat

dobar supstrat

O

NH

OHNH2

+

O

NH

NH2

NHO

NH

tripsinhimotripsin

elastaza

Specifičnost enzima određena je trodimenzionalnom strukturom aktivnog centra. Prema ranijem modelu “ključ-brava”, da bi supstrat mogao da uđe u aktivni centar i podlegne reakciji, on mora imati oblik (3D geometriju) komplementaran šupljini u aktivnom centru, analogno odnosu ključa i brave.

Odličan primer veze strukture aktivnog centra i selektivnosti su tri enzima iz grupe serinskih proteaza –tripsin, himotripsin i elastaza. Sva tri enzima za katalizu koriste tri aminokiselinska ostatka – Ser, His i Asp – ali pokazuju različitu selektivnost. Himotripsin u aktivnom centru poseduje hidrofobni džep koji vezuje bočne nizove aromatičnih ili voluminoznih alifatičnih aminokiselina iz supstrata. Zahvaljujući tome, himotripsin raskida polipeptidne lance na mestu peptidne veze koju formira Tyr, Trp, Phe, Leu ili Met. Tripsin na dnu džepa sadrži negativno naelektrisan ostatak Asp, te selektivno vezuje pozitivno naelektrisane nizove Lys i Arg. Na kraju, elastaza poseduje plitak džep sa Val i Thr, u koga se vezuju samo aminokiselinski ostaci sa malim bočnim nizom, naročito Ala i Gly.

13

13

• primer indukovanog prilagođavanja: heksokinaza

• model indukovanog prilagođavanja• vezivni centar fleksibilan• vezivanje → konformacione promene

• supstrat nije vezan• bočni nizovi koji grade aktivni centar udaljeni• neaktivan

• vezan supstrat

Po novijem modelu indukovanog prilagođavanja, nije neophodna apsolutna podudarnost struktura. Skelet proteina nije rigidan nego fleksibilan, i položaj grupa u aktivnom centru može se u izvesnoj meri prilagoditi supstratu. Prilikom vezivanja supstrata dolazi do konformacionih promena u proteinu (a u nekim slučajevima, i molekul supstrata može u izvesnoj meri promeniti oblik), tako da se vezivne i katalitičke grupe nađu u pogodnom položaju za ispoljavanje aktivnosti.

Dobar primer za indukovano prilagođavanje je heksokinaza (EC 2.7.1.1), koja katalizuje fosforilaciju terminalne –CH2OH grupe heksoza uz utrošak ATP. Molekul heksokinaze sadrži dva domena povezana fleksibilnom “šarkom”. Prilikom vezivanja heksoze (npr. glukoze) između domenâ, dolazi do promene konformacije, njihovog pomeranja, i postavljanja supstratâ i katalitičkih grupa aktivnog centra u optimalan položaj.

14

14

nekatalizovana r-jaS ⇔ X‡ ⇔ P

6.2.3. Mehanizam enzimske katalize

• enzimi vode r-ju alternativnim putem sa nižom energijom aktivacije ΔG‡

• enzimi snižavaju ΔG‡, ali ne menjaju ΔG reakcije• ΔG = – R T ln K ⇒ K se ne menja ⇒ enzimi ne pomeraju ravnotežu!

enzimska r-jaE + S ⇔ ES ⇔ EX‡ ⇔ E + P

ΔG‡uncat > ΔG‡

cat

X‡

SP

ES

EX‡ΔG‡

uncat

reakciona koordinata

slob

odna

ene

rgija

ΔG‡cat

Na koji način enzimi ubrzavaju biohemijske reakcije? Enzimi vezuju supstrat(e) u enzim-supstrat kompleks i vode tok reakcije alternativnim putem, preko prelaznog stanja sa nižom energijom aktivacije (ΔG‡). U toku svake reakcije formira se prelazno stanje – čestica sa najvišom energijom duž reakcione koordinate, koja ima strukturu između reaktanata i proizvoda (neke veze su parcijalno raskinute, neke parcijalno formirane). Razlika slobodne energije prelaznog stanja i slobodne energije reaktanatapredstavlja slobodnu energiju aktivacije ΔG‡. ΔG‡ predstavlja energetsku barijeru – samo reaktanti sa energijom većom od ΔG‡ mogu da nagrade prelazno stanje, odn. da reaguju.

Kod enzimski katalizovane reakcije, umesto da molekuli supstratâ direktno međusobno reaguju, oni prvo reaguju sa grupama iz aktivnog centra enzima, gradeći intermedijere koji su reaktivniji odn. imaju nižu energiju aktivacije (ΔG‡cat). Ovi intermedijeri dalje reaguju gradeći finalni proizvod, koji se odvaja sa molekula enzima, pri čemu se grupe u aktivnom centru regenerišu. Zahvaljujući činjenici da prelazno stanje kod enzimske reakcije ima nižu energiju aktivacije, odn. lakše se formira nego prelazno stanje u nekatalizovanoj reakciji, enzimske reakcije su brže od neenzimskih.

Treba napomenuti da, dok enzimi menjaju (snižavaju) ΔG‡ reakcije, ΔG ostaje nepromenjena. Pošto je ravnotežna konstanta reakcije povezana sa promenom slobodne energije (ΔG =–RT lnK), sledi da se ni Kne menja, odn. enzimi ne pomeraju položaj ravnoteže, već samo ubrzavaju njeno postizanje.

15

15

• na koji način se snižava energija aktivacije? X‡

SP

ES

EX‡

reakciona koordinata

slob

odna

ene

rgija

1. snižavanjem energije prelaznog stanja

• privlačne interakcije između AK ostataka u aktivnom centru i X‡ → stabilizovan X‡ → niža ΔG‡

H

HO C O

H

HO C Oδ+ δ–

H

HO C O

••B

++

+

+

H

HO C Oδ+ δ–

••B

++

+

+*

Enzimi snižavaju energiju aktivacije odn. ubrzavaju reakciju na više načina.Prvo, između bočnih ostataka aminokiselina u aktivnom centru i funkcionalnih grupa u prelaznom stanju (X‡) uspostavljaju se privlačne interakcije. Ove interakcije značajno stabilizuju prelazno stanje (tj. snižavaju mu slobodnu energiju), te se razlika u slobodnoj energiji supstrata i prelaznog stanja (tj. energija aktivacije) snižava.

16

16

2. destabilizacijom (povećanjem energije) ES kompleksa

• previše čvrsto E-S vezivanje nepogodno (niska G → visoka ΔG‡)

• kompenzacija: smanjenjem ΔS i povećanjem ΔHS

PES

EX‡

reakciona koordinata

slob

odna

ene

rgija

slobodansupstrat

vezanisupstrat

entropija slobodna energija

solvatisansupstrat

desolvatisansupstrat

entalpija slobodna energija

entalpija slobodna energija

Da bi moglo doći do enzimske reakcije, supstrat se mora vezati za aktivni centar enzima različitim privlačnim nekovalentnim interakcijama (elektrostatičkim, H-vezama, hidrofobnim, Van der Waals-ovim). Dok čvrsto povezivanje povećava afinitet enzima prema supstratu, ono istovremeno povećava energetsku barijeru i ograničava efikasnost enzima. Naime, uspostavljanje privlačnih interakcija je egzoterman proces (ΔH<0), te energija ES kompleksa opada, a razlika u energijama ES i X‡ raste. Enzimi zbog toga koriste različite mehanizme da u izvesnoj meri povećaju energiju ES (tj. destabilizuju ga).

Prvo, dok je vezivanje molekula supstrata entalpijski povoljno (ΔH<0), zbog ograničenja slobodnog kretanja molekula odn. smanjenja broja stepeni slobode proces je entropijski nepovoljan (ΔS<0). Pošto je ΔG = ΔH – t ΔS, ovo dovodi do povećanja ΔG.

Dalje, slobodan supstrat je u većoj ili manjoj meri solvatisan (hidratisan). Prilikom vezivanja za aktivni centar, dolazi do uklanjanja solvatacione sfere, što je endoterman proces (ΔH>0), što takođe povećava ΔG.

Destabilizaciji mogu doprineti i odbojne elektrostatičke interakcije između naelektrisanih grupa supstrata i enzima, sterni napon itd.

17

17

3. Kataliza aproksimacijom – reaktanti (i katalitičke grupe) dovode se u neposrednu blizinu (→ povećana efektivna C) i optimalno orijentišu (tako da podsećaju na prelazno stanje)

H

HO: C O

HH

O:

CO

4. Kovalentna kataliza – nukleofilne (bočni ostaci AK) i elektrofilne grupe (neki koenzimi) enzima reaguju sa S → reaktivni E-S intermedijeri

E

S1–X

S1

E–X

S2

S2–X

E

5. Kataliza metalnim jonima – elektrofili, stabilizuju nastalu povećanu elektronsku gustinu / negativnu šaržu

I brojni drugi faktori doprinose ubrzanju enzimski katalizovane reakcije. Prvo, enzimi vezuju supstrate iz rastvora, dovode ih u neposrednu blizinu i ograničavaju im kretanje (smanjuju im entropiju). Ovo, s jedne strane, povećava efektivnu koncentraciju reaktanata u odnosu na rastvor. Pošto je koncentracija veća, zbog veće verovatnoće sudara veća je i brzina reakcije. Dodatno, prlikom uspostavljanja interakcija sa grupama u aktivnom centru, molekuli supstratâ orijentišu se jedan prema drugome na način optimalan za odigravanje reakcije. Ove pojave predstavljaju katalizu aproksimacijom (uticaj blizine).

Bočni ostaci nekih aminokiselina u aktivnom centru (-OH serina, -SH cisteina, -HIm histidina, -NH2 lizina, -COOH asparaginske i glutaminske kiseline) deluju kao nukleofili, a neki koenzimi kao elektrofili. Oni mogu da reaguju sa funkcionalnim grupama supstrata, formirajući estre, tioestre, imine, anhidride i druge intermedijere koji su reaktivniji od samog supstrata. Ovaj mehanizam tzv. kovalentne katalize naročito je zastupljen kod transferaza i hidrolaza.

U aktivnom centru nekih enzima nalaze se metalni joni. Zahvaljujući elektrofilnosti, oni stabilizuju povećanu elektronsku gustinu ili negativnu šaržu u supstratu, a koordinacijom sa različitim grupama supstrata mogu obezbediti i njegovu pravilnu orijentaciju.

18

18

9. Elektrostatička kataliza

8. Kataliza stvaranjem napona / konformacionim promenama

7. Mikrookruženje – hidrofobni džep štiti supstrat(e) od vode

6. Kataliza opštom kiselinom/bazom – bočni ostaci AK deluju kao kiseline/baze

NH N OH

H O

S

Najzastupljniji tip katalize u enzimskim reakcijama je opšta kiselobazna kataliza, odn. kataliza protondonorskim/protonakceptorskim grupama (slobodni H+ i OH– ne učestvuju u enzimskim reakcijama). Jedna od najčešćih aminokiselina koja učestvuje u ovom tipu katalize je histidin, zahvaljujući činjenici da je pKa protonovanog imidazola blisko fiziološkim uslovima te se on može ponašati i kao proton-donor i kao proton-akceptor. His se, pored ostalog, nalazi u aktivnom centru svih serinskih proteaza (tripsin, himotripsin, elastaza...) i esteraza (acetilholin esteraza).

Neke reakcije ometa prisustvo vode. Na primer, kod heksokinaze (koja otkida fosfatnu grupu sa ATP i prenosi je na glukozu), voda u aktivnom centru dovela bi do neželjene hidrolize ATP. Dalje, zbog visoke dielektrične konstante, voda slabi sve elektrostatičke interakcije koje bi inače mogle učestvovati u katalizi. Ukoliko je potrebno postići anhidrovane uslove, aktivni centar enzima smešta se u hidrofobni džep –udubljenje obloženo hidrofobnim bočnim ostacima aminokiselina.

Energija (i, samim tim, nestabilnost i reaktivnost) supstrata može se povećati i indukovanjem napona u molekulu, a putem formiranja napetih prstenova, promene konformacije u manje povoljnu, distorzije uglova veza itd., kao i putem elektrostatičkog odbijanja između naelektrisanih grupa supstrata i enzima.

19

19

• primer: mehanizam dejstva himotripsina*

Na slajdu je prikazan mehanizam dejstva himotripsina, enzima iz grupe serinskih proteaza. Sve serinske proteaze sadrže u aktivnom centru ostatke asparaginske kiseline, histidina i serina. Supstrat (peptid) vezuje se u hidrofobnom džepu formiranom između histidina i serina. Vodonična veza između imidazola i vodonikovog atoma OH-grupe serina povećava nukleofilnost OH, te ona napada (1) karbonilni ugljenik peptidne veze uz formiranje tetraedarskog intermedijera (uobičajeni adiciono-eliminacioni mehanizam, karakterističan za karboksilne kiseline i derivate). Ponovno uspostavljanje C=O veze (2) raskida tetraedarski intermedijer odn. dolazi do kidanja peptidne veze. Pritom, H+ prelazi sa imidazolijuma na N, formirajući NH2-grupu (3). Deprotonaciju imidazola olakšava građenje H-veze sa ostatkom asparaginske kiseline, koje dovodi do pomeranja elektronske gustine i slabljenja im-H veze.

U sledećoj fazi, prvi peptidni fragment se odvaja sa enzima, a u aktivni centar ulazi voda. Dolazi do napada vode (4) na estarsku vezu između preostalog fragmenta peptida vezanog za Ser. Reakciju olakšava formiranje H-veze između vode i imidazola (koje povećava nukleofilnost kiseonika) i hidrofobni džep koji okružuje aktivni centar. Formira se novi tetraedarski intermedijer, koji se raspada (5) na slobodni peptidni fragment i slobodni enzim (6).

20

20

6.3. Kinetika enzimskih reakcija

• Vmax – maksimalna brzina reakcije• [S] – koncentracija supstrata• Km – Mihaelisova konstanta

• enzimi ubrzavaju i direktnu i povratnu r-ju → ne menja se položaj ravnoteže

• kinetika r-je opisuje se Mihaelis-Menten jednačinom:

0 maxm

[ ][ ]

Sv vK S

=+

[S] (mol L–1)

v 0 (m

ol L

–1 s

–1)

Km

½ vmax

vmax

½ vmax

[S]

v0

Km(1) Km(2)

S2

S1

Pošto enzimi predstavljaju katalizatore – supstance koje ubrzavaju hemijske reakcije – neophodno je poznavanje kinetike enzimskih reakcija. Kod uobičajenih (neenzimskih) hemijskih reakcija, brzina reakcije v direktno je proporcionalna koncentraciji reaktanta – supstrata [S]. Pošto se tokom reakcije reaktant troši, brzina reakcije postepeno opada; za potrebe kinetičkih ispitivanja, brzina se meri na početku reakcije (v0), kada je samo mala količina reaktanta potrošena i mala količina proizvoda formirana.

U slučaju enzimski katalizovanih reakcija, kriva zavisnosti početne brzine reakcije v0 od koncentracije supstrata [S] približno je linearna (odn. kinetika je prvog reda) samo pri niskim koncentracijama supstrata. Umesto uobičajene linearne zavisnosti v0 = k [S], kriva ima oblik hiperbole, pri čemu se brzina reakcije pri visokim koncentracijama supstrata asimptotski približava maksimalnoj vrednosti (vmax). Hiperbolična kriva opisuje se jednačinom y=a·x/(b +x); u konkretnom slučaju, kriva je definisana kao v0=vmax[S] / (Km+[S]). Ova jednačina naziva se Mihaelis-Menten jednačinom*, a konstanta Km – Mihaelisovom konstantom.

Kao što se može izvesti iz jednačine, Km predstavlja koncentraciju supstrata pri kojoj se postiže polovina od maksimalne brzine reakcije. Km ukazuje na afinitet enzima prema određenom supstratu – što je vrednost veća, afinitet je niži, odn. potrebna je viša koncentracija supstrata da bi se postigla određena brzina reakcije (npr. ½ vmax).

*napomena: uobičajeni naziv, Mihaelis-Mentenova jednačina, nije pravilan budući da je Maude Menten ženskog roda; korektniji naziv bio bi Mihaelis-Menten jednačina, Mihaelis-Mentenina ili jednačina Mihaelisa i Mentenove

21

21

[S] < [E]v ∝ [S]

[S] >> [E]svi molekuli E vezani u ES

Hiperbolična zavisnost brzine reakcije od koncentracije supstrata može se obrazložiti činjenicom da je za odvijanje enzimske reakcije neophodno vezivanje supstrata za enzim u enzim-supstrat kompleks (E-S). Pri [S]<<[E], svaki molekul supstrata ima veliki broj raspoloživih molekula enzima za koje se može vezati. Kako [S] raste, broj slobodnih molekula enzima opada, te ih molekuli supstrata sve teže “pronalaze”. Pri visokim [S], praktično su svi molekuli enzima vezani (sva aktivna mesta su zasićena), i molekuli supstrata moraju da “čekaju” da se okolni molekuli enzima oslobode iz E-S ili E-P kompleksa; dalje povećanje [S] ne doprinosi porastu brzine reakcije, jer se samo povećava broj molekula supstrata “na čekanju”.

22

22

• problem kod M-M jednačine: nije moguće pouzdano ekstrapolirati vmax →nepouzdana procena Km

0 maxm

[ ][ ]

Sv vK S

=+

m

0 max

[ ]1[ ]

K Sv v S

+=

m

0 max max

1 [ ][ ] [ ]

K Sv v S v S

= +

m

0 max max

1 1 1[ ]

Kv v S v

= ⋅ +

• linearna forma – Lineweaver-Burk jednačina

Određivanje kinetičkih parametara (vmax, Km) bitno je za ispitivanje specifičnosti i mehanizma enzimske katalize. Međutim, određivanje vmax (a samim tim i Km, za koju je potrebno znati vrednost ½ vmax) je problematično – pri koncentracijama supstrata koje se koriste u eksperimentima, nije moguće pouzdano proceniti položaj horizontalne asimptote. Problem je moguće prevazići očitavanjem parametara iz jednačine fita, umesto grafičkim putem, ali ovo zahteva odgovarajuće softvere koji mogu da fituju podatke hiperboličnom krivom.

Drugi pristup (koji se može i manuelno izvesti) podrazumeva prevođenje Mihaelis-Menten jednačine u linearnu formu. Ovo se može postići uzimanjem recipročne vrednosti obe strane jednačine, i izvlačenjem 1/[S] kao nezavisne promenljive. Iz dobijene jednačine 1/v0=ƒ(1/[S]), tzv. Lineweaver-Burk-ove jednačine, kinetički parametri se lako određuju – vmax se određuje iz odsečka na y-osi (koji predstavlja 1/vmax), a Km se računa iz nagiba (koji iznosi Km/vmax) ili iz odsečka na x-osi (-1/Km).

23

23

6.3.1. Izražavanje aktivnosti enzima• promena koncentracije supstrata/proizvoda u jedinici vremena

• internacionalna jedinica (international unit) (U) = količina enzima koja transformiše 1 μmol supstrata (odn. generiše 1 μmol produkta) u 1 min pri datim uslovima (pH, t, jonska jačina...)

• katal (kat) = količina enzima koja transformiše 1 mol supstrata u 1 s1 U = 16,7 nkat

• broj izmene (turnover number) kcat [s–1] = broj molekula supstrata koje 1 molekul enzima konvertuje u proizvod u jedinici vremena

• specifična aktivnost (specific activity) [U/mg] = kod sirovih preparata –enzimska aktivnost (u internacionalnim jedinicama) po 1 mg proteina

24

24

• enzimi = proteini → enzimske reakcije osetljive su na promene pH i t

• za svaki enzim postoje optimalna t i optimalna pH, pri kojima se postiže vmax

6.3.2. Uticaj pH i temperature

• uticaj temperature:

1.brzina svake reakcije raste sa porastom t (~2× za svakih 10 °C)

2.visoke vrednosti t (> 50-60 °C) → denaturacija

Napomena: enzimi termofilnih bakterija aktivni i iznad 85 °C

Pored koncentracije supstrata, na brzinu enzimskih reakcija značajno utiču pH vrednost i temperatura. Za svaki enzim moguće je definisati optimalnu vrednost (ili opseg) pH i t koji rezultuju maksimalnom brzinom reakcije.

Sa porastom temperature brzina svih hemijskih reakcija (pa i enzimskih) raste, približno 2× za svakih 10 °C. Međutim, u slučaju enzimskih reakcija, na povišenim temperaturama dolazi do naglog gubitka aktivnosti. Ovo se može objasniti denaturacijom – visoke temperature dovode do narušavanja trodimenzionalne strukture enzima, uključujući i aktivni centar (dolazi do pomeranja i udaljavanja ključnih grupa).

Budući da živi organizmi zavise od pravilnog i kontrolisanog funkcionisanja enzima i drugih proteina, povišena telesna temperatura (hipotermija) može dovesti do smrti usled brzog iscrpljenja metaboličkih zaliha (usled povećane aktivnosti enzima) ili usled denaturacije (pri višim temperaturama). Isto tako, pri previše niskim temperaturama (hipotermija) aktivnost enzima postaje preniska za održanje fizioloških funkcija, uključujući energetski metabolizam i rad nervnog sistema, i takođe može doći do smrti. Treba napomenuti da neki primitivniji organizmi (ekstremofili) mogu preživeti na znatno nižim temperaturama (bliskim tački mržnjenja) ili visokim (i preko 80 °C) zahvaljujući specijalizovanim, adaptiranim enzimima i drugim proteinima. Dodatno, svi organizmi poseduju specijalizovane heat shock proteine (iz grupe šaperona) zadužene za reparaciju denaturisanih proteina.

25

25

• uticaj pH:1. uticaj na konformaciju proteina i strukturu AC2. uticaj na naelektrisanje jonizabilnih grupa u AC→ većina enzima aktivna samo u ograničenom opsegu pH

nema kiselih ni baznih grupa u AC

His u AC, mora biti deprotonovan

His u AC, amfoteran

O-

O N NH H O

Većina enzima aktivna je samo u ograničenom opsegu pH. Uticaj pH na aktivnost enzima je dvojak. Sa jedne strane, pH vrednost može uticati na naelektrisanje i elektron- i proton-donorska/akceptorska svojstva jonizabilnih grupa u aktivnom centru. Enzim će pokazivati značajnu aktivnost samo kada su ove grupe u odgovarajućem obliku. Na primer, kod tripsina (EC 3.4.21.4), –COOH grupa asparaginske kiseline mora biti deprotonovana tj. pH mora biti veći od pKa bočnog niza (~3,7), a imidazol histidina mora biti sposoban i da prima i da predaje H+, dakle pH mora biti blisko pKa imidazola (~6,0). Kod nekih enzima, aktivnost je značajna samo u uskom opsegu pH, kod drugih – u širem opsegu (pri dovoljno niskom ili visokom pH), dok je kod onih enzima koji u aktivnom centru nemaju jonizabilne grupe aktivnost praktično nezavisna od pH (sem, naravno, pri ekstremnim pH vrednostima koje dovode do denaturacije).

Dodatno, pored direktnog uticaja na naelektrisanje grupa u aktivnom centru, pH može uticati i na konformaciju celog molekula proteina, a samim tim i aktivnog centra.

Poremećaji pH u organizmu (acidoza, alkaloza) imaju štetne posledice po zdravlje. Na primer, kod nekontrolisanog dijabetesa, opadanje pH za 0,35 jedinica dovodi do kome i, ukoliko se ne tretira, smrti.

26

26

6.4. Inhibicija enzimskih reakcija• inhibitori – jedinjenja koja se vežu za enzime i snižavaju im aktivnost

1. ireverzibilni 2. reverzibilni

a) kompetitivnib) akompetitivnic) mešoviti

• značaj:1. regulacija metaboličkih puteva

E + I ⇔ EI

E + I → EI

COOH

COOH

O

O

acetilsalicilna k.(aspirin)

ibuprofen(brufen)

2. lekovi i otrovi

COX

Glc

pyr

ATP

PFK

Na aktivnost enzima dodatno mogu uticati i različita jedinjenja. Supstance koje se vežu (kovalentno ili nekovalentno) za enzim i smanjuju mu aktivnost nazivaju se inhibitorima. Inhibicija može biti reverzibilna i ireverzibilna. Ireverzibilni inhibitori se za enzim vezuju čvrsto, kovalentnim vezama. Primeri su nervni bojni otrovi i organofosforni pesticidi, koji se vezuju za enzim acetilholin esterazu. Reverzibilni inhibitori vežu se za enzim slabim, nekovalentnim interakcijama, i po njihovom uklanjanju enzim obnavlja svoju aktivnost. Prema mestu vezivanja, dele se na kompetitivne, akompetitivne i mešovite.

Pojava inhibicije veoma je važna za regulaciju metaboličkih puteva. Aktivnost ključnih enzima u različitim putevima često se modifikuje upravo vezivanjem alosternih inhibitora. Na primer, fosfofruktokinaza (ključni enzim glikolize, metaboličkog puta koji je deo energetskog metabolizma) je inhibirana ATP-om (krajnji proizvod energetskog metabolizma, čija visoka koncentracija signalizira da organizam ima dovoljno energije i nema više potrebe za intenzivnom glikolizom). Takođe, većina toksina (prirodnih i sintetičkih) deluje upravo preko inhibicije određenih enzima. Na kraju, i dejstvo lekova tipično se zasniva na enzimskoj inhibiciji (npr. aspirin i ibuprofen inhibiraju ciklooksigenazu, enzim koji učestvuje u sintezi prostaglandinâ).

27

27

• sa enzimom grade stabilne kovalentne veze

6.4.1. Ireverzibilna inhibicija

• aspirin (acetilsalicilna kiselina)

• analgetik, antiinflamatorni agens, antipiretik

• deluje na ciklooksigenaze

O O

COOH

OH

OH

COOH

O O

COX

aspirin P

O

F

P

O

O

OHO

N+

O

OHN

+

• organofosfati (nervni bojni otrovi, pesticidi)

• deluje na acetilholin esterazu

acetilholin

holin

acetilholinesteraza

sarin

Ireverzibilni inhibitori se čvrsto vezuju za aktivni centar enzima, najčešće putem građenja kovalentnih veza. Pošto je nastali proizvod inaktivan, efektivno je smanjena koncentracija aktivnog enzima u rastvoru i, samim tim, brzina reakcije. Dok organizam ne koristi ovaj tip inhibicije za regulaciju metabolizma, različiti prirodni i sintetski ireverzibilni inhibitori našli su primenu kao lekovi ili otrovi.

Primer ireverzibilnog inhibitora koji se koristi u medicini je aspirin (acetilsalicilna kiselina), koji se koristi kao analgetik (ublažava bol), antipiretik (ublažava groznicu odn. snižava temperaturu) i antiinflamatorni agens (ublažava zapaljenja). Aspirin deluje kao acetilujući agens – dovodi do acetilovanja serinskog ostatka u aktivnom centru enzima ciklooksigenaze (COX, EC 1.14.99.1). COX je ključni enzim u biosintezi prostaglandina, koji deluju kao medijatori inflamacije.

Drugi primer su nervni bojni otrovi (sarin, tabun, soman, VX, F...) i organofosforni pesticidi (paration, malation...), koji fosforiluju serinski ostatak u aktivnom centru enzima acetilholin esteraze. Ovaj enzim neophodan je za normalno odvijanje procesa neurotransmisije (uklanja neurotransmiter iz sinapse nakon prenosa signala); ukoliko je inhibiran, dolazi do trajne aktivacije postsinaptičkih neurona, što vodi trajnom grču mišića (uključujući i respiratorne) i smrti usled gušenja.

Ireverzibilna inhibicija korisna je za proučavanje strukture aktivnog centra enzima. Korišćenjem reagenasa koji selektivno reaguju sa bočnim ostacima određene aminokiseline, i praćenjem da li dolazi do gubitka aktivnosti nakon reakcije, može se utvrditi prisustvo/odsustvo neke aminokiseline u aktivnom centru.

28

28

• nekovalentne interakcije E-I• konstanta inhibicije:

• primenjiva Mihaelis-Menten kinetika

6.4.2. Reverzibilna inhibicija

[E] [I][EI]iK ⋅=

smanjujusmanjujune menjajuvmax

L-B dijagram

smanjujune menjajupovećavajuKm

ESE, ESEvežu se za

alosternoalosternoaktivni centarvezivanje

AkompetitivniNekompetitivniKompetitivni

1/[S]

1/v0

1/[S]

1/v0

1/[S]

1/v0

Reverzibilni inhibitori vezuju se za enzim slabim, nekovalentnim interakcijama. Vezivanje je povratan proces, koji se može opisati odgovarajućom ravnotežnom konstantom – konstantom inhibicije, Ki=[E] [I]/[EI]. Većina prirodnih inhibitora, koji učestvuju u regulaciji metabolizma, spada u ovu grupu. Prema tome s kime interaguju (enzim ili enzim-supstrat kompleks), gde se vezuju (za aktivni centar ili alosterno) i kako utiču na kinetičke parametre, reverzibilni inhibitori dele se na kompetitivne, nekompetitivne i akompetitivne.

29

29

Kompetitivni inhibitori• strukturno slični supstratu, takmiče se za AC

O-OC

COO-

O-OC

COO-

COO-

COO-

sukcinat fumarat

malonat

• primer: malonat inhibira sukcinat dehidrogenazu

[I]1

max

'm m

i

v const

K KK

=

⎛ ⎞= ⋅ +⎜ ⎟

⎝ ⎠[S]

v0

[I]

ES

ES E + P

EI

I

Kompetitivni inhibitori su najuobičajeniji tip. Strukturno su slični supstratu, te se mogu vezati za aktivni centar slobodnog enzima (ali ne i za ES kompleks). Kada se inhibitor veže za enzim, aktivni centar je blokiran i supstrat ne može da se veže, i obrnuto – vezivanje supstrata sprečava vezivanje inhibitora. Dolazi do kompeticije između molekula supstrata i inhibitora za molekule enzima, čime se smanjuje broj slobodnih molekula enzima.

Bitna karakteristika ovog tipa inhibicije je da se povećanjem koncentracije supstrata ravnoteža EI ⇔ E ⇔ES pomera ka ES, odn. kompenzuje se prisustvo inhibitora. Dovoljno visokom koncentracijom supstrata moguće je dostići identičnu vmax kao i u odsustvu inhibitora. S druge strane, što je više inhibitora prisutno, više je supstrata neophodno za postizanje poluzasićenja – sledi da se Km povećava, srazmerno [I].

Primer je malonat, koji je kompetitivni inhibitor sukcinat dehidrogenaze – enzima energetskog metabolizma (Krebsovog ciklusa i elektron-transportnog niza) koji oksiduje sukcinat do fumarata. Malonat je strukturno sličan sukcinatu i vezuje se za aktivni centar.

30

30

Akompetitivni inhibitori• I se vezuje samo za ES• alosterna inhibicija

[I]1

[I]1

' maxmax

i

' mm

i

vv

KKK

K

=⎛ ⎞

+⎜ ⎟⎝ ⎠

=⎛ ⎞

+⎜ ⎟⎝ ⎠

[S]

v0

[I]

ES

ES E + P

ESI

I

• primer: Li+ inhibira IMPazu i IPPazu

IMP

inozitol PIP2 DAG

IP3

IMPaza

IPPazaLi+

Li+

signalsignal

*

Kod akompetitivne inhibicije (uncompetitive inhibition), inhibitor se vezuje samo za ES kompleks, ali ne i za slobodan enzim. Nagrađeni ESI kompleks je neaktivan (ne dovodi do konverzije supstrata u produkt). Inhibitor se ne vezuje za aktivni centar, te on spada u alosterne efektore. Zbog toga, on ne mora da bude strukturno sličan supstratu.

Maksimalna brzina reakcije vmax kod ovog tipa inhibicije je smanjena – pošto se inhibitor vezuje za ES kompleks, dodatna količina S neće potisnuti vezivanje inhibitora (naprotiv, pomeraće ravnotežu ka ES i ESI). S druge strane, afinitet prema supstratu prividno raste, tj. Km opada, jer vezivanje ES u ESI kompleks pomera (po Le Chatelier-ovom principu) ravnotežu E + S ⇔ ES. Na Lineweaver-Burk-ovom dijagramu, krive dobijene za različite koncentracije akompetitivnog inhibitora međusobno su paralelne, jer se i vmax i Km proporcionalno smanjuju.

Ovaj tip inhibicije je u prirodi redak. Primer akompetitivnog inhibitora je Li+, koji inhibira inozitol-monofosfatazu (IMPazu) i inozitol-polifosfatazu (IPPazu). Ovi enzimi odgovorni su za reciklažu inozitola, koji je ključan za neke signalne puteve u ćeliji. Kod ljudi sa bipolarnim (manično-depresivnim) poremećajem, ovaj signalni put je hiperaktivan; unošenje Li+ (u vidu Li2CO3) ublažava simptome obolenja.

31

31

Nekompetitivni inhibitoriE

SES E + P

ESI

IS

EI

I

[S]

v0

[I] [I]1

' maxmax

i

'm

vv

K

K const

=⎛ ⎞

+⎜ ⎟⎝ ⎠

=

• čista nekompetitivna inhibicija (retka):

• vezivanje I ne utiče na vezivanje S

• Km=const, sistem se ponaša kao da je [E] smanjena

• reaguju i sa E i sa ES• alosterna inhibicija

Na kraju, kod nekompetitivne inhibicije (noncompetitive inhibition), inhibitor može da se veže i za enzim i za enzim-supstrat kompleks, pri čemu su i EI i ESI kompleksi inaktivni. Ovo su takođe alosterni inhibitori – ne vezuju se (najčešće) za aktivni centar (zbog čega povećanje [S] ne istiskuje inhibitora, pa je vmaxsmanjena) ali ipak smanjuju aktivnost. Na Lineweaver-Burk-ovom dijagramu, krive dobijene za različite koncentracije akompetitivnog inhibitora ukrštaju se u tački na x-osi koja odgovara -1/Km, budući da Km ne zavisi od [I].

Ovakvi idealni slučajevi (tzv. čista nekompetitivna inhibicija), gde je afinitet E i ES prema inhibitoru jednak (ravnotežne konstante za E+I⇔EI i ES+I⇔ESI su jednake), a vezivanje inhibitora ne utiče na vezivanje supstrata (ravnotežne konstante za E+S⇔ES i EI+S⇔ESI su jednak), zbog čega je Km=const, retki su.

32

32

• mešovita nekompetitivna inhibicija:• vezivanje I utiče na građenje ES (vezivna mesta blizu, ili I dovodi do konformacionih promena)• menjaju se i vmax i Km

*• primer: Ala inhibira piruvat kinazu

PEP

pyr

pyr kinaza

Ala

Mnogo češće afinitet inhibitora prema E i ES je različit, kao i afinitet E i EI prema supstratu, te je i Km u izvesnoj meri promenjena. Ovo može biti posledica blizine vezivnog centra za inhibitor aktivnom centru, ili promena konformacije usled vezivanja inhibitora. Ovakav tip inhibicije naziva se mešovitom nekompetitivnom inhibicijom, i na Lineweaver-Burk dijagramu karakteriše ga ukrštanje krivih koje se ne nalazi na x-osi.

Primer nekompetitivne inhibicije je feed-back inhibicija piruvat kinaze alaninom. Piruvat kinaza je enzim glikolize, koji konvertuje fosfoenolpiruvat u piruvat. Piruvat dalje služi kao izvor energije ili prekursor velikog broja biomolekula, uključujući i alanin. Visoke koncentracije alanina i drugih proizvoda smanjuju aktivnost piruvat kinaze, i time zaustavljaju dalju produkciju energije i metabolita.

33

33

6.5. Regulacija enzimske aktivnosti

1) inhibicija proizvodom – proizvod r-je inhibira E / pomera ravnotežu ES ⇔ P

E-OH E-OP

proteinkinaza

proteinfosfataza

ATP ADP

Pi H2O

3) kovalentna modifikacija – fosforilacija Ser, Thr, Tyr protein kinazom / defosforilacija fosfoprotein fosfatazom

2) alosterna regulacija – vezivanjem malih molekula-efektora (ne u aktivnom centru) E

S ⇔ P1 ⇔ P2 ⇔ P3 ⇔ P4

4) kontrola sinteze enzima – indukcijom/represijom gena koji kodiraju enzim

5) kontrola degradacije enzima – opštim mehanizmima reciklaže, specifičnim proteazama

6) kontrola dostupnosti supstrata / kofaktora – podešavanje [S] menja brzinu r-je

7) konverzija zimogena u enzim – inaktivni zimogen aktivira se otkidanjem dela lanca

Jedna od najvažnijih prednosti enzima nad neenzimskim katalizatorima je mogućnost regulacije njihove aktivnosti. Regulacija je neophodna, jer ćelija mora da procese koje enzimi katalizuju – sintezu/razgradnju biomolekula i generisanje/trošenje energije – prilagodi svojim trenutnim potrebama i potrebama organizma.

Enzimska aktivnost može se modulirati na više načina. Prvo, direktni proizvod enzimske reakcije može se vezati za aktivni centar i smanjivati broj slobodnih molekula enzima (efektivno, ponaša se identično kompetitivnim inhibitorima). Dalje, vezivanje različitih malih molekula (efektora) van aktivnog centra može dovesti do smanjenja/povećanja aktivnosti, odn. do alosterne aktivacije/inhibicije. Veoma često je alosterni inhibitor nekog enzima upravo jedan od proizvoda metaboličkog puta u kome taj enzim učestvuje; na ovaj način, sprečava se nepotrebna akumulacija proizvoda.

Aktivnost nekih enzima može se modulirati i reverzibilnom kovalentnom modifikacijom. Najčešće je u pitanju fosforilacija Ser, Thr ili Tyr ostataka pod dejstvom odgovarajuće protein kinaze uz utrošak ATP (ili defosforilacija fosfoserina, fosfotreonina i fosfotirozina pod dejstvom protein fosfataze, a uz oslobađanje Pi). Pritom se enzim aktivira ili inaktivira (stabilizacijom R ili T konformacije). Ovaj je uobičajeni mehanizam odgovora na dejstvo hemijskih signalnih molekula (hormona).

Brzina enzimske reakcije zavisi i od koncentracije enzima; kontrolom brzine sinteze i degradacije enzima može se dakle regulisati i ukupna aktivnost u ćeliji. Biosinteza se kontroliše indukcijom ili represijom gena koji ga kodiraju. Ovaj tip regulacije je spor, na nivou minuta ili sati. Degradacija enzima može se postići pomoću opštih mehanizama za recikliranje proteina, ili specifičnim proteazama koje ciljano razgrađuju dati enzim.

Koncentracija supstrata u ćeliji tipično je bliska Km, odn. enzimi su pod normalnim uslovima poluzasićeni. Podešavanjem koncentracije supstrata ćelija takođe može ubrzati ili usporiti reakciju.

Na kraju, neki enzimi se u ćeliji sintetišu u inaktivnoj formi (tzv. zimogen). Proteolitičkim otkidanjem dela lanca enzim se aktivira. Ovaj mehanizam aktivacije zastupljen je kod digestivnih proteaza (pepsin, tripsin, himotripsin...).

34

34

• regulatorni ≠ aktivni centar• moduliraju aktivnost ključnih enzima u metaboličkim putevima

Glc

Glc6P

Fru6P

Fru1,6BP

DHAP GAld3P

1,3BPG

3PG

2PG

heksokinaza

fosfofruktokinaza

PEP

Pyr

piruvat kinaza

–

+ATP–

acetil-CoA

–

ATP–

AMP+

Fru2,6BP

––

citrat

Ala

–

* 6.5.1. Alosterni enzimi

EnzA ⇔ B ⇔ C ⇔ D ⇔ E ⇔ D ⇔ E

–+–

• tipično su oligomerni → kooperativnost, sigmoidna v0 vs. [S] kriva

(Michaelis-Menten kinetika)

Važnu grupu regulatornih enzima predstavljaju alosterni enzimi. To su enzimi kod kojih su aktivni centar i regulatorni centar (mesto vezivanja aktivatora/inibitora) fizički razdvojeni. Alosterni efektori za enzim se vežu nekovalentno, pri čemu najčešće menjaju Km* prema supstratu (v. krivu), mada neki menjaju vmax.

Ovi enzimi nalaze se na ključnim mestima u metaboličkim putevima, i omogućavaju kontrolu brzine i toka celog puta. Česta je situacija da metaboliti koji se u datom putu nalaze pre enzima deluju kao njegovi alosterni aktivatori, a oni nakon njega – kao alosterni inhibitori (na primer, u putu prikazanom na slajdu –glikolizi – fosfoenolpiruvat je aktivator, a alanin i acetil-CoA su inhibitori piruvat kinaze). Na ovaj način, sprečava se nagomilavanje i prekursorâ i produkata.

Većina alosternih enzima su oligomerni proteini, sa identičnim ili različitim podjedinicama. Aktivni i alosterni centar mogu se nalaziti na istoj ili različitim podjedinicama. Oligomerni alosterni enzimi najčešće pokazuju kooperativnost prema bar jednom supstratu, što se može uočiti iz krive brzine reakcije u funkciji koncentracije supstrata, koja je sigmoidna a ne hiperbolična, odn. ne zadovoljava Mihaelis-Menten kinetiku.

*napomena: strogo gledano, pri vezivanju alosternih efektora menja se oblik krive odn. dolazi do odstupanja od Michaelis-Menten kinetike, te Km gubi smisao

35

35

• 2 konformacije: R (relaxed) i T (taut/tense)

• u odsustvu supstrata favorizovano T stanje → manje aktivno, slabiji afinitet)

• vezivanje supstrata stabilizuje aktivnije R stanje → vezivanje još molekulasupstrata → pozitivna kooperativnost

• alosterni aktivatori vezuju se za R i stabilizuju ga

• alosterni inhibitori vezuju se za T i stabilizuju ga

• Monod-Wyman-Changeux (MWC) model: TT → RR • sekvencijalni model: TT → TR → RR

Postoji više objašnjenja za pojavu kooperativnosti, aktivacije i inhibicije kod oligomernih alosternih enzima (i proteina uopšte – podsetiti se hemoglobina!). Svi modeli podrazumevaju da se svaka podjedinica može javljati u dve konformacije – opuštenoj (relaxed, R) i napetoj (taut, tense, T). Protein bez vezanog supstrata nalazi se u konformaciji T, koja ima niži afinitet. Prilikom vezivanja supstrata dolazi do indukovanog prilagođavanja – konformacija se menja u R, koja ima viši afinitet i katalitičku aktivnost.

Po Monod-Wyman-Changeux* (MWC) koncertovanom modelu, zbog bliskog kontakta i interakcija sve podjedinice oligomernog proteina teže da imaju istu konformaciju. Kada se konformacija jedne podjedinice promeni iz T u R usled vezivanja supstrata, sve ostale podjedinice istovremeno (koncertovano) prelaze u R oblik, pri čemu afinitet raste. Alosterni inhibitori preferencijalno se vezuju za T-formu i stabilizuju je, čime smanjuju afinitet i aktivnost, dok se alosterni aktivatori vezuju za R-oblik.

Po opštijem, sekvencijalnom modelu, istovremeno u molekulu mogu postojati podjedinice u obe konformacije. Vezivanje supstrata za jednu podjedinicu dovodi do manjih ili većih konformacionih promena kod susednih jedinica.

*Mono-Vajman-Šanžu

36

36

6.5.2. Izoenzimi

• izoenzimi (izozimi) = enzimi koji imaju različitu sekvencu ali katalizuju istu reakciju

• tipično imaju različite kinetičke parametre (Km) → fino podešavanje metabolizma u datom tkivu

• primer: laktat dehidrogenaza (LDH, EC 1.1.1.27) – tetramer, 2 različite podjedinice (M i H) → 5 izoformi:

• LDH-1 (H4) – u srcu, značajno raste nakon infarkta miokarda• LDH-2 (H3M)• LDH-3 (H2M2) – u plućima• LDH-4 (HM3) – u bubrezima, pankreasu• LDH-5 (M4) – u jetri, mišićima

37

37

6.6. Kofaktori

• u aktivnom centru često pored AK-ostataka prisutne i neproteinske komponente – kofaktori – neophodne za aktivnost

• aktivni enzim (holoenzim) = protein (apoenzim) + kofaktor

• podela:1. neorganski

a) metalni joni (Fe, Mn, Co, Cu, Zn, Se, Mo) b) Fe-S klasteri

2. organskia) labilno vezani – koenzimi (kosupstrati)b) čvrsto vezani – prostetske grupe

enzim ksantin oksidaza koristi nekoliko kofaktora

FAD

Fe2S2

Fe2S2

MoO2SH

Enzimi su, po definiciji, proteini. Međutim, kod mnogih enzima (naročito oksidoreduktaza i transferaza) proteinska komponenta nije dovoljna za ispoljavanje katalitičke aktivnosti, nego se u aktivnom centru nalazi i neka neproteinska vrsta – kofaktor – koja aktivnom centru obezbeđuje dodatne funkcionalne grupe. Kovalentnim ili nekovalentnim vezivanjem kofaktora za neaktivni proteinski deo (apoenzim) nastaje aktivna forma – holoenzim. Neki kompleksni enzimi čak zahtevaju nekoliko kofaktora (npr. piruvat dehidrogenaza ima TPP kao koenzim, lipoamid i FAD kao prostetske grupe, NAD i CoA kao kosupstrate i metalni jon – Mg2+).

Kofaktori se mogu podeliti na dve velike grupe – organske i neorganske. U neorganske kofaktore spadaju različiti metalni joni (Fe, Mn, Co, Zn, Mo, Se), koji mogu biti vezani čvrsto (kod metaloenzima) ili labilno (ako samo služe kao aktivatori), kao i gvožđe-sumpor klasteri. Mnogi od minerala neophodni su organizmu upravo zbog izgradnje određenih enzima. Primeri enzima koji u aktivnom centru sadrže metalne jone su citohrom oksidaza (Cu), katalaza, citohromi, kompleksi I-III (Fe), DNK polimeraza, glukoza 6-fosfataza, heksokinaza (Mg), ureaza (Ni), glutation peroksidaza (Se), DNK polimeraza, karboanhidraza, alkohol dehidrogenaza (Zn) itd.

Organski kofaktori se grubo mogu podeliti prema načinu vezivanja za apoenzim na labilno vezane –koenzime – i čvrsto vezane prostetske grupe, mada u literaturi ponekad postoje odstupanja od ovih definicija (u okviru ovog kursa, pod koenzimima će se podrazumevati sva neproteinska organska jedinjenja neophodna za enzimsku aktivnost). Prvu grupu čine organski molekuli koji su vezani za enzim samo u toku reakcije. Pri reakciji oni se hemijski menjaju (ponašaju se kao kosupstrati u reakciji), te se nakon reakcije moraju odvojiti sa enzima i regenerisati (upravo se po stalnom recikliranju razlikuju od običnih supstrata, koji tipično podležu daljim reakcijama). Prostetske grupe su za aktivni centar vezane kovalentno (ili velikim brojem nekovalentnih interakcija), ostaju vezane za apoenzim, i u okviru svakog katalitičkog ciklusa se regenerišu.

Koenzimi su često vitamini ili se sintetišu iz vitamina, tačnije hidrosolubilnih (B) vitamina. Dok većina organizama može da ih sintetiše de novo*, životinje ih najčešće moraju uneti hranom; deficijencija dovodi do razvoja niza obolenja (uključujući skorbut, beriberi, pelagru, neke vidove dermatitisa i anemije).

*biosinteza de novo = iz jednostavnih prekursora

38

38prenos elektronaprostetskahem

prenos elektronakosupstratubihinon

karboksilacija Gluprostetskavitamin K

fotoreceptorprostetskaretinal

oksidacija hidroksialkila i transfer acil-grupeprostetskalipoična k.

prenos CH3-grupeprostetskakobalamin

prenos C1-grupakosupstratTHF

prenos -COOHprostetskabiotin

prenos NH2-grupeprostetskaPALP

prenos ostataka sa >C=O grupomprostetskaTPP

prenos acil-grupakosupstratCoA

jedno- i dvoelektronske redoks reakcijeprostetskaFAD, FMN

dvoelektronske redoks reakcijekosupstratNAD(P)+

prenos glukozil-grupekosupstratUDP-glukoza

prenos CH3-grupekosupstratSAM

prenos fosforil-/adenilil-grupekosupstratATP

FunkcijaVezivanjeKoenzim

U tabeli su navedeni neki od najvažnijih koenzima, sa najbitnijim metaboličkim funkcijama.

39

39

6.6.1.1. NAD(P)+

• vitaminska komponenta – vitamin B3: nikotinska kiselina (niacin) i nikotinamid

N

O

OH

N

O

NH2

• koenzim: nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD+), nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat (NADP+)

• nukleotidna komponenta (AMP) i pseudonukleotidna (sa nikotinamidom)

• deficit → pelagra (fotosenzitivni dermatitis), demencija, dijareja, smrt• hipervitaminoza → oštećenje jetre• izvor: meso

6.6.1. Koenzimi oksidoreduktaza

N+

OO

OH OH

O

NH2

OO-

O

P

OO-

O

P

NO

OH

N

NN

NH2

O O-

O-

O

P

aktivni deo

Samo mali broj aminokiselina (Cys, Tyr) ima mogućnost da učestvuje u reakcijama oksidoredukcije, tako da sve oksidoreduktaze (EC 1) koriste koenzime kao donore/akceptore elektrona. U koenzime oksidoreduktaza spadaju NAD+, NADP+, FMN, FAD, Fe-S klasteri, lipoična kiselina, hem, ubihinon itd.

Nikotinamidni koenzimi – nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD+)* i nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat (NADP+) – spadaju u najvažnije redoks koenzime. Sintetišu se iz vitamina B3 (nikotinske kiseline i nikotinamida), čiji je glavni izvor meso. U nedostatku ovog vitamina, javlja se obolenje pelagra –fotosenzitivni dermatitis, a u ozbiljnijim slučajevima – demencija, dijareja, i čak smrt.

NAD+ sastoji se od dva 5’-nukleotida povezana fosfoanhidridnom vezom: nikotinamid-mononukleotida i adenozin-monofosfata. U slučaju NADP+, 2’-OH grupa adenilata je fosforilovana.

*Napomena: znak “+” kod NAD+ i NADP+ odnosi se samo na naelektrisanje na piridinskom prstenu; zahvaljujući fosfatnim ostacima, molekul je zapravo negativno naelektrisan.

40

40

• f-ja: koenzimi dehidrogenaza (oksiduju alkohole, aldehide, hidroksikiseline, AK)

• primeri NAD-zavisnih enzima:• alkohol dehidrogenaza (ADH)• izocitrat dehidrogenaza• laktat dehidrogenaza (LDH)

N+

O

NH2

R

oksidovani oblikNAD(P)+

CH+

N

O

NH2

R

N

O

NH2

R

H H

redukovani oblikNAD(P)H

H–

NADH+ H+

NAD+SupH2

Sup

H2O

½ O2

dehidrogenaze elektron-transportni sistem

NAD+ i NADP+ omogućavaju transfer elektrona sa supstratâ. Koenzimi su dehidrogenaza – grupe oksidoreduktaza koje oksiduju alkohole, aldehide, hidroksikiseline, aminokiseline i sl. uz uklanjanje 2 atoma H iz supstrata. Primeri NAD-zavisnih enzima su neki od enzima glikolize: alkohol dehidrogenaza (R-CH2OH + NAD+ R-CHO + NADH + H+), laktat dehidrogenaza (laktat + NAD+ piruvat + NADH+ + H+), gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (G3P + NAD+ + Pi 1,3BPG + NADH + H+).

Aktivni deo molekula je piridinski prsten (u sklopu nikotinamida), koji od supstrata može da primi dva elektrona u vidu hidridnog anjona (H–) koji se veže u poziciji C-4 prstena. Pritom NAD+ prelazi u NADH, a NADP+ u NADPH. Elektron-akceptorska svojstva potiču od elektronskog deficita u C-4 poziciji prstena (a koji potiče od delokalizacije šarže). Nastali NADH i NADPH dovoljno su stabilni da se mogu prenositi kroz ćeliju (za razliku od flavinskih koenzima), i služiti kao izvor elektrona u različitim biohemijskim reakcijama (pretežno u biosintezama).

NAD(P)+ se ponaša kao kosupstrat – troši se tokom reakcije i mora se regenerisati posebnim enzimatskim reakcijama. Reoksidacija NAD(P)H ima ključnu ulogu u energetskom metabolizmu. Naime, energija koja se oslobađa prilikom oksidacije metaboličkih goriva iz hrane prvenstveno se skladišti u formi NADH. NADH dalje uskladištenu energiju (elektrone) predaje elektron-transportnom nizu u mitohondrijama, koji je koristi za sintezu ATP.

41

41

6.6.1.2. Flavinski nukleotidi

• vitaminska komponenta: vitamin B2(riboflavin)

• riboflavin sintetišu zelene biljke, bakterije i gljivice, a životinje ne

• deficit → tamnocrveni jezik, dermatitis (seboreja)

N

N

NH

N O

O

CH2

OH

OH

OH

OH

izoaloksazin

ribitol

N

N

NH

N O

O

CH2

OH

OH

OH

O OH

O-

O

P

N

N

NH

N O

O

CH2

OH

OH

OH

O NO

O

OH

O

O-

O

P N

NN

NH2

OH

O-

O

P

• koenzim:

flavin-mononukleotid (FMN) flavin-adenin-dinukleotid (FAD)

Flavinski nukleotidi sintetišu se iz vitamina B2 (riboflavina) kao prekursora. Riboflavin sintetišu zelene biljke, bakterije (uključujući i intestinalne) i gljive, a životinje ne. Deficit riboflavina se manifestuje tamnocrvenim jezikom, dermatitisom (seborejom), oštećenjima sluzokože, usporenim rastom. U (retkim) ozbiljnijim slučajevima dolazi do prestanka rasta, slabosti, ataksije, kome i smrti. Do hipervitaminoze ne dolazi zbog niske rastvorljivosti.

Riboflavin sadrži šećerni alkohol ribitol (koji se izvodi od riboze) koji je preko N-10 vezan za heterociklično jedinjenje izoaloksazin, i može se smatrati nukleozidom. Aktivna forma koenzima su flavin-mononukleotid (FMN) i flavin-adenin-dinukleotid (FAD). FMN nastaje 5’-fosforilacijom ribitola u riboflavinu, a FAD – formiranjem fosfoanhidridne veze između FMN i AMP.

42

42

• mogu razmenjivati 1 ili 2 e– → povezuju jedno- i dvoelektronske reakcije

N

N

NH

N O

O

R

FAD / FMN

NH

N

NH

NH

O

O

R

FADH2 / FMNH2

H+, eNH

C

N

NH

N O

O

R

FADH• / FMNH•(semihinon)

H+, e

H+, H–

• FAD i FMN – u flavoproteinskim enzimima: nekim dehidrogenazama, oksidazama, hidroksilazama

• sukcinat dehidrogenaza • α-ketoglutarat dehidrogenaza

FAD i FMN ulaze u sastav flavoproteinskih oksidoreduktaza – nekih dehidrogenaza, oksidaza i hidroksilaza. Predstavljaju prostetske grupe; za apoprotein su najčešće vezani nekovalentno. Primeri flavin-zavisnih enzima su sukcinat dehidrogenaza (EC 1.3.5.1, enzim Krebsovog ciklusa i elektron-transportnog niza), α-ketoglutarat dehidrogenaza (EC 1.2.4.2, enzim Krebsovog ciklusa) itd.

Za razliku od nikotinamidnih koenzima, koji mogu da prime samo 2 e– odn. da učestvuju isključivo u dvoelektronskim reakcijama, flavinski koenzimi mogu da razmenjuju 1 ili 2 e–, što im omogućava da premošćavaju jedno- i dvoelektronske reakcije, odn. da prenose elektrone sa dvoelektronskih koenzima (npr. NAD(P)H) na jednoelektronske (npr. citohrom, Fe-S klasteri).

43

43

6.6.1.3. Fe-S proteini• metaloproteini, sadrže klastere 2Fe-2S, 4Fe-4S, 3Fe-4S i sl.• terminalni S potiču od Cys• ne primaju H– nego razmenjuju elektrone!• primeri:

• NADH dehidrogenaza• CoQ-CytC reduktaza• sukcinat-CoQ reduktaza• enzimi fotosintetičkog aparata

U sklopu aktivnog centra nekih metaloproteinskih oksidoreduktaza prisutni su gvožđe-sumpor klasteri, vezani preko cisteinskih ostataka za protein. Klasteri mogu da sadrže različit broj atoma, ali su najčešći 2Fe-2S, 4Fe-4S i 3Fe-4S. Za razliku od nikotinamidnih i flavinskih koenzima, Fe-S proteini na primaju H–

nego direktno razmenjuju elektrone, putem promene oksidacionog stanja Fe jona. Dalje, za razliku od većine drugih koenzima, Fe-S klasteri se direktno sintetišu u organizmu, a ne iz vitamina kao prekursora.

Fe-S proteini nalaze se u nekim enzimima elektron-transportnog sistema (NADH dehidrogenaza, CoQ-CytC reduktaza, sukcinat-CoQ reduktaza), fotosintetičkog aparata itd.

44

44

6.6.1.4. Askorbinska kiselina

• L-askorbinska kiselina = vitamin C• nije koenzim, ali učestvuje u redoks reakcijama (hidroksilacijama – pri sintezi adrenalina i noradrenalina iz Tyr, Hyp iz Pro – bitan za strukturu kolagena)• deficit → skorbut• preporučuje se dodatno unošenje – 100 mg/d• antioksidans

O

OH OH

O

OH

OH

askorbat dehidroaskorbat

H

semidehidroaskorbat

H

2H

O

O OH

O

OH

OHO

O O

O

OH

OH

Vitamin C ili askorbinska kiselina predstavlja lakton ugljenohidratnog porekla. Velika većina biljaka i životinja sposobni su da je sintetišu; u izuzetke spadaju neki primati (uključujući čoveka) i zamorci. Iako pripada grupi hidrosolubilnih vitamina, nije koenzim nego deluje kao supstrat u nekim enzimatskim reakcijama oksidoredukcije. U najznačajnije uloge spadaju reakcije hidroksilacije Lys i Pro (pri sintezi kolagena) i Tyr (pri sintezi noradrenalina i adrenalina). Predstavlja i antioksidans (učestvuje u recikliranju vitamina E) te se preporučuje unos dodatnih količina. U naročito bogate izvore spadaju crvena paprika, brokoli, citrusi... Deficit dovodi do skorbuta, koji se manifestuje lezijama na koži, fragilnim krvnim sudovima, krvarenjem desni, ispadanjem zuba, a može dovesti i do smrti. Do hipervitaminoze ne dolazi, jer se višak lako izbacuje urinom.

45

45

6.6.1.5. Hem

• kofaktor hemoproteina, uključujući hemoglobin, mioglobin, citohrome• citohromi učestvuju u jednoelektronskim redoks-reakcijama (uklj. transport elektrona u respiratornom lancu)• podvrste: cyt a, cyt b, cyt c

N

Fe

N

NN

S Cys

OHO

Cys

O OH

Hem (kompleks Fe2+ jona sa heterocikličnim organskim molekulima – porfirinima) je prostetska grupa niza hemoproteina, koji imaju funkciju prenosa kiseonika (hemoglobin mioglobin...), transfera elektrona (citohrom c), enzimske katalize (katalaza, peroksidaze, citohrom c oksidaze) itd.

Sa stanovišta enzimskih procesa, najznačajniji hemoproteini su citohromi, koji se javljaju samostalno ili (kao proteinski koenzimi) u sklopu većih enzimskih kompleksa. Zahvaljujući prisustvu gvožđa koje lako menja oksidaciono stanje: Fe2+ Fe3+ + e–, značajni su za prenos elektrona između komponenti enzimskih kompleksa elektron-transportnog niza, kao i za prenos elektrona na supstrate kod citohrom-zavisnih oksidoreduktaza. Od citohrom-zavisnih enzima treba pomenuti citohrom c oksidazu (EC 1.9.3.1, kompleks IV elektron-transportnog niza). Citohrom P450 oksidaze (CYP) učestvuju u biosintezi lipidnih hormona, kao i u detoksifikaciji ksenobiotika. Jedinjenja koja inhibiraju CYP (npr. kumarin bergamotin iz grejpfruta) usporavaju metabolizam nekih lekova, te mogu dovesti do predoziranja.

46

46

6.6.1.6. Koenzim Q

• koenzim Q = ubihinon• značajan antioksidans• mobilni, liposolubilni prenosioci elektrona i H+ u respiratornom lancu mitohondrija

O

O

O

O

H

n

n=10: CoQ10

O

O

O

O

R

O

O

O

OH

R

H HO

OH

O

OH

R

hinon, Q hidrohinon, QH2semihinon, QH•

Na kraju, treba pomenuti i koenzim Q (CoQ, ubihinon), liposolubilno jedinjenje slično vitaminima, koje se nalazi u većini ćelija, prvenstveno u mitohondrijama. Zahvaljujući benzohinonskoj strukturi, lako razmenjuje elektrone (redukuje se do ubisemihinona i, dalje, do ubihinola), te predstavlja prenosioca elektrona u elektron-transportnom nizu mitohondrija (sa kompleksa I i II na kompleks III). Pritom, dugi ugljovodonični rep izoprenoidnog porekla (sastavljen od 6–10 izoprenskih jedinica, 10 u slučaju CoQ10) omogućava ovom jedinjenju da se veže za membranu i slobodno kreće njenom površinom.

Dodatno, CoQ ima i antioksidantnu funkciju – regeneriše vitamin E, sprečava proces lipidne peroksidacije i kardiovaskularne bolesti – zbog čega se često dodaje u dijetetske suplemente i kozmetičke preparate.

47

47

6.6.2. Koenzimi transferaza• vrše prenos funkcionalnih grupa

• koenzimi C1 metabolizma (prenosioci C1 jedinice)1. -CH3

2. -CH2OH3. -CHO4. -COOH

• koenzimi C2 metabolizma1. CH3CO-

• koenzimi metabolizma azota1. NH3/RNH2

Sup1–R Sup1

Co Co–R

Sup2–R Sup2

48

48

6.6.2.1. SAM• S-adenozilmetionin• aktivna CH3-grupa (najvažniji donor Me-grupe u raznim reakcijama)

O

NH2

S+

OH

Rib

Adenin

O

NH2

SOH

Rib

Adenin

Sup Sup CH3

S-adenozilmetionin(SAM)

S-adenozilhomocistein(SAH)

SAM

SAH

NH2 NH

NH2+

COO-

NH2 N

NH2+

COO-

guanidinosirćetna kiselina kreatin

• primer: sinteza kreatina

S-adenozilmetionin (SAM) je uobičajeni kosupstrat u reakcijama prenosa metil-grupe (-CH3). Normalna metiltio-grupa metionina nije naročito reaktivna; formiranje sulfonijum-jona značajno povećava potencijal za transfer metil-grupa. SAM-zavisne metilaze prenose CH3- sa SAM na ciljni supstrat (nukleofilni akceptor), uz nastajanje S-adenozilhomocisteina. SAM se naknadno regeneriše iz SAH nizom reakcija (preko homocisteina i metionina), pri čemu se nova CH3-grupa prenosi sa 5-metiltetrahidrofolata.

SAM se sintetiše prvenstveno u jetri, iz ATP i metionina kao prekursora. Neophodan je za rast i popravke ćelija, i sintezu mnogih biomolekula (fosfolipida, proteina, DNK, RNK...). Uzimanje u vidu dijetetskih suplemenata može pomoći kod depresije, obolenja jetre, Alchajmerove bolesti...

49

49

6.6.2.2. THF• vitaminska komponenta: vitamin B9 (folna kiselina)• nalaženje: povrće (spanać, pasulj, grašak...), pivo, kvasac, jetra• smanjuje rizik od ateroskleroze, tromboze, hipertenzije; bitan u trudnoći;

ublažava anemije nastale usled deficita B12

• deficit → megaloblastična anemija

N

N

N

N

NH

OH

OO

NH2

NHO

OH

OH

2-amino-4-hidroksi-6-metilpteridin

p-aminobenzoevakiselina

Glu

folna kiselina

Tetrahidrofolna kiselina je redukovani oblik folne kiseline (vitamina B9), koja se može naći u lisnatom povrću i mahunarkama (spanać, pasulj, grašak...), pivu, kvascu, jetri itd. Deficit je na Zapadu neuobičajen; simptomi uključuju dijareju, megaloblastičnu anemiju, slabost, oštećenja nerava, utrnutost, slabljenje kognitivnih funkcija, komplikacije u toku trudnoće, povećan rizika od kancera itd. Zbog značaja prilikom trudnoće (smanjuje rizik od nekih deformacija ploda), trudnicama se preporučuje dodatni unos folne kiseline.

Folna kiselina sadrži tri osnovne strukturne komponente: 2-amino-4-hidroksi-6-metilpteridin (6-metilpterin), p-aminobenzoevu kiselinu (PABA) i ostatak glutaminske kiseline.

50

50

• koenzim: tetrahidrofolna kiselina (THF, FH4)• aktivacija:

L-folat reduktaza

dihidrofolat reduktaza

N

NH

N

N

NH

O

OO

NH2

NHO

OH

OH

N

NH

N

NH

O

NH2

NH

N

NH

NH

NH

O

NH2

NH

folna kiselina

dihidrofolna kiselina

tetrahidrofolna kiselinaFH4

Aktivna, koenzimska forma je tetrahidrofolna kiselina (THF). Aktivacija obuhvata dve uzastopne reakcije redukcije folne kiseline, pod dejstvom L-folat reduktaze i dihidrofolat reduktaze, u pozicijama N-5, C-6, C-7 i N-8. Takođe, za Glu ostatak vezuje se još 4–5 ostataka Glu, formirajući anjonski “rep” koji omogućava vezivanje za enzim.

51

51

• vrši prenos hidroksimetil- (-CH2OH), formil- (-CH=O), metil- (-CH3) i formimino-grupe (-CH=NH)

N

NH

NH

NH

O

NH2

NH

• neophodna za sintezu DNK (dUMP → dTMP)

5-formil-THFTHF 5,10-metilen-THF

5-metil-THF

5,10-metenil-THF

formijatα-C glicinaβ-C serina3-C imidazolane: CO2

10-formil-THF

5-formimino-THF

Tetrahidrofolna kiselina ima funkciju prenosa C1 grupa različitog oksidacionog stanja, koje se kovalentnovezuju preko N5 i/ili N10: metil- (-CH3), hidroksimetil- (-CH2OH), formil- (-CH=O), formimino- (-CH=NH). Izvor C1-fragmenta mogu biti formijat, glicin, serin, imidazol, ali ne i CO2 (ne može da vrši fiksaciju neorganskog C).

Pored ostalog, THF je neophodna za sintezu DNK (učestvuje u sintezi dTMP iz dUMP) i njenu reparaciju, naročito tokom rapidne ćelijske deobe (razvoj zametka, detinjstvo, obnavljanje eritrocita). Jedinjenja koja ometaju metabolizam folata (npr. metotreksat) koriste se u hemoterapiji kancera i kao antibakterijski agensi.

52

52

• vitamin B12: cijanokobalamin, hidroksikobalamin...• nalaženje: sintetišu ga samo mikroorganizmi → životinje• veoma nestabilan• faktor u prevenciji i lečenju perniciozne anemije (deficit B12 → blokiran

metabolizam folne kiseline)

• koenzim izomeraza, metiltransferaza, dehalogenaza

• učestvuje u raskidanju C-C, C-N veza i aktivaciji CH3-

• regeneriše THF

6.6.2.3. Kobalamin

*

Vitamin B12 (kobalamin) je najkompleksniji vodorastvorni vitamin, koji se javlja u nekoliko formi –hidroksokobalamin, cijanokobalamin (sintetički), metilkobalamin, adenozilkobalamin. Karakteriše ga prisustvo biohemijski neuobičajenog metala – kobalta. Četiri koordinaciona mesta Co3+ jona kompleksirana su korinskom prstenom (složeni heterociklični sistem sličan porfirinu), peto mesto –benzimidazolnim nukleotidom iz bočnog lanca, a šesto metil- ili deoksiadenozil-grupom.

Ni biljke ni životinje nisu u stanju da sintetišu vitamin B12 – jedino bakterije i kvasci poseduju potrebne enzime. Kod biljojeda preživara, izvor ovog vitamina su simbiotske bakterije u digestivnom traktu. Čovek unosi kobalamin preko hrane životinjskog porekla (mesa, jaja, mleka), kao i žitarica sa dodatkom kobalamina. Za normalnu apsorpciju u crevima neophodan je protein intrinsic factor (IF); kod obolelih od autoimunog obolenja perniciozne anemije, antitela napadaju ovaj protein, što dovodi do potencijalno fatalne deficijencije (simptomi uključuju megaloblastičnu anemiju).

Reakcioni centar kobalamina je Co3+ jon, koji uspostavlja Co-C vezu sa supstratom. Kobalamin je koenzim izomerazâ, metiltransferazâ i dehalogenazâ. Uključen je u metabolizam svih ćelija, naročito u sintezu DNK, sintezu masnih kiselina, i produkciju energije. Prvenstveno je uključen u regeneraciju folne kiseline; većina simptoma deficijencije B12 vitamina (perniciozne anemije, megaloblastoze) potiču u stvari od problema u sintezi timina (i, samim tim, DNK) usled nedostatka THF, i mogu se suzbiti dovoljnim unosom folata.

53

53

6.6.2.4. Biotin

• vitamin H (B7)• nalaženje: široko rasprostranjen (naročito u

žumancetu, jetri, nekom povrću); proizvode ga i intestinalne bakterije

• faktor rasta nekih bakterija• deficit: retko

Enzim-biotin Enzim-biotin-COO-

SupSup-COO-

ADP + PiATP + H2CO3

• f-ja: učestvuje u transferu -COOH grupe (karboksilaciji)• kovalentno se vezuje za enzim

NH NH

S

O

OH

O

tetrahidroimidazolon

tetrahidrotiofen

Biotin, vitamin H ili vitamin B7 učestvuje u reakcijama koje katalizuju karboksilaze – ligaze koje uvode CO2 u molekul, uz formiranje karboksilne (-COOH) grupe. COOH se vezuje za N-atom tetrahidroimidazolonskog prstena, gradeći karboksibiotin. Važan je koenzim u metabolizmu masnih kiselina (aktivira acetil-CoA konverzijom u malonil-CoA), izoleucina i valina (tj. aminokiselina sa račvastim bočnim nizom), glukoneogenezi (sintezi glukoze iz nešećernih prekursora) i Krebsovom ciklusu.

Predstavlja prostetsku grupu – kovalentno se vezuje za odgovarajuće enzime preko –COOH, gradeći amid sa sa ε-NH2 lizina – ε-N-biotinillizin.

Deficijencija je retka, pošto crevna mikroflora proizvodi biotin u količinama koje su više nego dovoljne. Naročito je zastupljen u nekim vrstama hrane – žumancetu jajeta, jetri, kikirikiju, nekim vrstama povrća. Deficit (koji može biti izazvan konzumiranjem sirovih jaja, koja sadrže protein avidin koji čvrsto vezuje biotin) ili poremećaj metabolizma biotina uzrokuje ćelavost, konjunktivitis, dermatitis, neurološke simptome...

54

54

6.6.2.5. Koenzim A• vitaminska komponenta: vitamin B5 (pantotenska kiselina)• nalaženje: u mesu, integralnim žitaricama, brokoliju• deficijencija: retka

OHNH

OH

OO

OH

NO

O

O

O

O-

O

P N

NN

NH2

OH

O

O-

O

P

O-

O-

O

P

NHNH

OH

OO

SH

ADP-3’-fosfatpantoatβ-Ala2-merkaptoetilamin

pantotenat

CoA-SHCoA-SAc

Sup Sup-Ac

• koenzim: koenzim A (CoA, CoASH)• funkcija: prenos i aktivacija acil-grupa (naročito acetil)• učestvuje u ciklusu limunske kiseline, sintezi i oksidaciji

masnih kiselina, oksidaciji piruvata...

Prekursor koenzima A (CoA, CoASH) je vodorastvorni vitamin B5 (pantotenska kiselina*). Nalazi se u skoro svim vrstama hrane, ali naročito u mesu, integralnim žitaricama, brokoliju. Moguće je da ga proizvode i intestinalne bakterije. U dijetetskim suplementima koristi se stabilniji redukovani derivat –pantotenol. Deficijencija je veoma retka; simptomi uključuju zamor, apatiju, iritabilnost.

Aktivna forma koenzima predstavlja estar pantotenske kiseline sa ADP-3’-fosfatom i amid sa 2-merkaptoetilaminom. Aktivna grupa je terminalna merkapto- (-SH) grupa, koja može reagovati sa različitim karboksilnim kiselinama gradeći tioestar – acil-koenzim A (R-CO-SCoA), npr. acetil-CoA (CH3CO-S-CoA). Tioestarska veza bogata je energijom, te je ovako vezana acil-grupa aktivirana, i lako podleže različitim hemijskim reakcijama (acilovanje, Claisen-ova kondenzacija). Zbog toga, koenzim A učestvuje u reakcijama transfera acil-grupa.

Acetil-CoA (aktivna C2-grupa) nastaje oksidacijom masnih kiselina i oksidacijom piruvata (poreklom iz glikolize), a učestvuje u Krebsovom ciklusu, sintezi masnih kiselina i mnogih drugih primarnih i sekundarnih biomolekula.

*Pantotenska kiselina često se dodaje u proizvode za negu kose jer deficit dovodi do iritacije kože i gubljenja boje kose. Međutim, ispitivanja su pokazala da eksterna primena nema efekta.

55

55

• prisutna u svim vrstama hrane, naročito jetri i kvascu• faktor rasta nekih bakterija• čovek može da je sintetiše u dovoljnim količinama, ali je poželjno dodatno unošenje (dijetetski suplement)• može da primi 2 e–

S S

OH

O

6.6.2.6. Lipoična kiselina

• snažan antioksidans (hvata slobodne radikale)

• primeri:• kompleks piruvat dehidrogenaze• α-ketoglutarat dehidrogenaza

SH SH

OH

OS SH

OH

O

O

R2 H

Lipoična (liponska) kiselina je sumporni derivat oktanske kiseline. Ovo jedinjenje se u dovoljnim količinama sintetiše u organizmu, ali je poželjno dodatno unošenje. Prisutna je u malim količinama u svim vrstama hrane, naročito u jetri, kvascu, spanaću, brokoliju, a javlja se i u vidu dijetetskih suplemenata (budući da ima niz pozitivnih efekata po organizam).

Za proteine (enzime) vezuje se kovalentno, formirajući amidnu vezu sa bočnim nizom lizina. Zahvaljujući prisustvu disulfidnog mosta, sposobna je da primi 2 e– (2 H-atoma), pri čemu se -SS- redukuje do dve tiolne grupe. Lipoična kiselina je esencijalni kofaktor četiri mitohondrijalna enzimska kompleksa (uključujući kompleks piruvat dehidrogenaze), ključna za aerobni metabolizam i ćelijsku energetiku. Funkcija joj je prenos acil-grupa uz istovremeni prenos elektronâ. Zahvaljujući činjenici da je reaktivni centar (-SS-) vezan za dugi lanac (alifatični niz lipoične kiseline + bočni niz lizina), lipoična kiselina može funkcionisati kao “ruka” koja prenosi acil-grupu iz aktivnog centra jednog enzima u drugi.

Pored toga, predstavlja (u formi dihidrolipoične kiseline) i snažan antioksidans, mada se čini da protektivni i terapeutski efekti nisu posledica direktnog antioksidantnog dejstva.

56

56

• vitaminska komponenta: vitamin B6 (piridoksal, piridoksin, piridoksamin)

• nalaženje: široko rasprostranjen, naročito u mesu, integralnim žitaricama, povrću...

N

OH

O

OH

N

OH

OH

OH

N

OH

NH2

OH

• deficit (usled gladovanja) → poremećaj u metabolizmu Trp i Met →dermatitis, neuropatija, konvulzije

6.6.2.7. PALP

Vitamin B6 javlja se u prirodi u više formi koje se razlikuju po grupi vezanoj na C-4 piridinskog prstena: piridoksal (sadrži formil-grupu), piridoksin (hidroksimetil-) i piridoksamin (aminometil-). Široko je rasprostranjen, i naročito zastupljen u mesu, integralnim žitaricama, povrću... Deficit, koji se najčešće javlja usled gladovanja, dovodi do dermatitisa, konjunktivitisa, senzorne neuropatije, konvulzija sličnih epileptičnim napadima...

57

57

N

O

NH+

OHP

O

O-

O-

O

NH

• koenzim: piridoksal-fosfat (PALP) – prostetska grupa (kovalentno vezan za Lys)

N

O

O

OHP

O

O-

O-

• koenzim kod:1. transferaza - transaminaza 2. lijaza - dekarboksilaza3. izomeraza - racemaza

• značajan u metabolizmu AK

PALP-CH=NH+-Enzim

NH2-Enzim

A-CH2NH2

PALP-CH2NH2

A-CH=O B-CH=O

B-CH2NH2

Aktivna forma je piridoksal-5’-fosfat (PALP, PLP), koji se kovalentno vezuje za odgovarajuće enzime gradeći jedinjenja tipa imina, odn. predstavlja prostetsku grupu. Učestvuje u svim reakcijama transaminacije (prenosa NH2 grupe sa jednog molekula na drugi, a putem privremenog vezivanja za aldehidnu grupu PALP-a), zbog čega je značajan za biosintezi i degradaciju aminokiselina i metabolizam azota uopšte. Javlja se i u aktivnom centru nekih dekarboksilaza i racemaza.

58

58

• vitaminska komponenta: vitamin B1 (tiamin)• prvi otkriveni vitamin• nalaženje: široko rasprostranjen, ali u niskim

koncentracijama; najvažniji izvori: svinjetina, kvasac, integralne žitarice

• deficit → hronični periferni neuritis, beriberi (→edem pluća, smanjenje srčanih funkcija)

• koenzim: tiamin-pirofosfat (TPP)• prostetska grupa kod:

1. lijaza – dekarboksilaza (oksidativna dekarboksilacija keto-kiselina)2. transferaza – transketolaza (značajno u metabolizmu ugljenih hidrata)

N

N

NH2

N+

S OH

pirimidin tiazol

N

N

NH2

N+

S O O

O-

O

P O-

O-

O

PH

lako odlazeći proton → ilid (jak nukleofil)

6.6.2.8. TPP

Tiamin je vodorastvorni vitamin B-kompleksa (B1), koji je u niskim koncentracijama široko zastupljen u hrani (naročito u svinjetini, kvascu i žitaricama). Pošto je značajan za sva tkiva, deficit dovodi do niza simptoma, uključujući ozbiljan zamor očiju, neurodegeneraciju, slabljenje, pa čak i smrt. Poznato obolenje kao posledica deficita B1 je beriberi, koji se manifestuje neurološkim poremećajima (poremećaji čula, motorike, refleksa, konfuzija...) i kardiovaskularnim problemima (tahikardija, nedovoljno snabdevanje tkiva krvlju).

U strukturi sadrži pirimidinski i naelektrisani tiazolni prsten. Fosforilacijom tiamina nastaje tiamin-pirofosfat (TPP, novije: tiamin-difosfat, TDP), koji je prostetska grupa dekarboksilazâ (lijaza koje uklanjaju –COOH grupu iz supstrata, uklj. piruvat dekarboksilazu i α-ketoglutarat dehidrogenazu) i transketolaza (transferaze koje prenose fragmente monosaharida, i značajne su u metabolizmu ugljenih hidrata). Aktivni deo molekula je tiazolijumski prsten, tačnije C-2 atom. Zahvaljujući elektron-deficitarnom N-atomu u susedstvu, C-H veza je oslabljena i molekul se lako deprotonuje. Nastali ilid(struktura tipa X+-C–) je jak nukleofil, i može napasti karbonilni C supstrata formirajući tetraedarski intermedijer.