~ LAVORO DI DIPLOMA ~

Elettroforesi: frazioni β 1 e β 2, utilità in diagnostica

Laboratorio Cantonale Immunologia Clinica Ospedale S.Giovanni

6500 Bellinzona

Responsabile: Dr. Franco Keller

Moro Sammy

III FLM Scuola Superiore Medico Tecnica

Anno 2004 / 2005

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1 Indice 1 Indice............................................................................................................................................2 2 Riassunto......................................................................................................................................3 3 Nomenclatura ...............................................................................................................................4

3.1 Misure di grandezza .............................................................................................................4 3.2 Abbreviazioni e sigle ...........................................................................................................4

4 Introduzione .................................................................................................................................5

4.1 Le proteine ...........................................................................................................................5 4.2 L’elettroforesi.......................................................................................................................5 4.3 Le frazioni elettroforetiche...................................................................................................6 4.4 Interpretazione dei tracciati elettroforetici ...........................................................................6 4.5 Criteri di ricerca ...................................................................................................................7 4.6 Difficoltà di ricerca ..............................................................................................................7

5 Materiali e metodi ........................................................................................................................8

5.1 Conservazione dei campioni ................................................................................................8 5.2 Materiale d’analisi................................................................................................................8 5.3 Materiale di lavoro ...............................................................................................................8 5.4 Apparecchi utilizzati ............................................................................................................9 5.5 Principio del metodo ..........................................................................................................10

6 Risultati ......................................................................................................................................11 7 Discussione ................................................................................................................................13 8 Conclusioni ................................................................................................................................14 9 Ringraziamenti ...........................................................................................................................14 10 Bibliografia ............................................................................................................................14 11 Allegati...................................................................................................................................14

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2 Riassunto Nei più svariati campi dell’immunologia si presenta anche un interesse per quanto riguarda le proteine presenti nel siero. Grazie all’elettroforesi abbiamo la possibilità di rendere visibile già ad occhio nudo su di un supporto le classi proteiche separate mediante un campo elettrico. Queste classi proteiche si dividono attualmente in cinque frazioni principali, conosciute come: albumina, α 1 , α 2 , β e γ. Lo scopo di questo lavoro di diploma è documentare se separare ulteriori frazioni possa essere utile o meno alla clinica identificando le singole sieroproteine presenti in una determinata frazione. Nel caso di questo lavoro viene separata la banda β in β 1 e β 2 grazie ad un nuovo tipo di gel della ditta SEBIA (rue Maximilien Robespierre 23, 92130 Issy-les-Moulineaux), per avere un’identificazione più specifica delle proteine che fanno parte di questa frazione, che sono principalmente transferrina, LDL (Low Density Lipoprotein) e complemento (C3c).

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3 Nomenclatura

3.1 Misure di grandezza g/l grammi su litro % valore in percentuale

3.2 Abbreviazioni e sigle LC-CIC laboratorio centrale di chimica e immunologia clinica OSG ospedale S.Giovanni alb albumina α alfa β beta γ gamma ELFO elettroforesi MW Molecular Weight, peso molecolare pI punto isoelettrico TRF transferrina C3c complemento LDL low density lipoprotein TP proteine totali

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4 Introduzione

4.1 Le proteine Le proteine sono un ampio gruppo di composti organici, formati da una sequenza di molecole chiamate amminoacidi, legate l'una all'altra da legami peptidici. Presenti in tutti gli organismi viventi, le proteine sono gli elementi costitutivi predominanti delle cellule e sono indispensabili per il loro funzionamento. Da questa definizione possiamo dedurre che le proteine possiedono quindi grandezze diverse, dovute principalmente alla loro struttura differente. Grazie all’interpretazione della loro concentrazione serica possiamo dirigerci con facilità verso alcune diagnosi possibili. Al giorno d’oggi possediamo molti mezzi per determinare la quantità serica di proteine, ma tramite elettroforesi si può avere un quadro completo della loro concentrazione.

4.2 L’elettroforesi Per definizione da un qualsiasi dizionario, l’elettroforesi è un movimento di particelle elettricamente cariche attraverso un gel, per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi. Le particelle si spostano verso il catodo se hanno carica positiva e verso l'anodo se hanno carica negativa; nel primo caso il processo è detto cataforesi, nel secondo anaforesi. Nel nostro caso, con il gel utilizzato per questo lavoro (HYDRAGEL β1 β2, SEBIA), avremo una separazione seguente:

Figura 1: Suddivisione proteica dopo migrazione elettroforetica

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L’ELFO è una tecnica che ha subito nel tempo una forte evoluzione, riducendo di molto le difficoltà nell’esecuzione, contatti diretti con i sieri e pipettaggi che portano a errori. Il metodo della ditta SEBIA è ormai diventato un metodo standard molto pratico da usare anche per chi si trova alle prime armi.

4.3 Le frazioni elettroforetiche Come già detto, le frazioni d’importanza clinica sono attualmente quattro. Ogni frazione, racchiude una determinata “famiglia” di proteine, come riportato nella figura 2:

Figura 2: picchi con le varie sieroproteine di un tipico tracciato elettroforetico

4.4 Interpretazione dei tracciati elettroforetici Dalla figura 1 si può dedurre che aumenti, diminuzioni o variazioni di una banda elettroforetica piuttosto che di un’altra, aiutano il medico a dirigersi verso determinate diagnosi. Per esempio: l’aumento della frazione gamma può orientare verso patologie quali tumori o reazioni immuni. Aumento della frazione beta potrebbe invece dirigere il medico verso patologie croniche o malattie autoimmuni. Un aumento della frazione beta cosa significa esattamente? Principalmente nella frazione beta sono presenti, come già specificato in precedenza, la transferrina, il complemento e le lipoproteine LDL. Da questo si può dedurre che separare ulteriormente la banda β permette di poter visualizzare queste tre sieroproteine singolarmente. Questo nuovo tipo di gel ci permette proprio di separare con più specificità la banda β.

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4.5 Criteri di ricerca Al fine di effettuare le analisi sono stati scelti pazienti con dei valori di β globulina esterni ai limiti dei valori normali. Per aver un ulteriore aiuto nell’interpretazione finale, di ogni campione è stato effettuato anche il valore di complemento e transferrina al Nefelometro (Dade Behring Holding GmbH, Höchster Strasse 70, 65835 Liederbach, Germany) e il valore di LDL all’Hitachi (Roche Diagnostic, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Diagnostics Division, Grenzacherstrasse 124, CH-4070 Basel). Sono stati scelti ventiquattro campioni, di questi ne sono stati esclusi alcuni una volta effettuate le analisi, per motivi che spiegheremo successivamente.

4.6 Difficoltà di ricerca Nella ricerca di pazienti potenzialmente interessanti per ottenere dei risultati sono state riscontrate difficoltà non indifferenti, questo dovuto a delle scelte: è stato deciso, dopo discussione, di escludere dalla scelta pazienti oncologici, a parte due eccezioni, in quanto la patologia è già conosciuta, quindi non c’è nessun interesse clinico a proseguire con ulteriori indagini. Una volta effettuate tutte le analisi dei ventiquattro pazienti, sono ancora stati esclusi dei campioni, non ritenuti significativi per il lavoro e questo ha ridotto ulteriormente il numero di pazienti utili alla ricerca.

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5 Materiali e metodi

5.1 Conservazione dei campioni Tutti i campioni raccolti sono stati aliquotati e quindi conservati a -20°C fino all’esecuzione delle analisi. Ogni campione è stato trattato allo stesso modo.

5.2 Materiale d’analisi Per le analisi è stato usato unicamente siero, prelevato ogni settimana dai pazienti della routine del laboratorio LC-CIC.

5.3 Materiale di lavoro Per il materiale rimandiamo alle indicazioni della ditta SEBIA, metodo HYDRAGEL β1-β2, presente negli allegati. Come componenti, intesi come reagenti e materiali, si disponeva di:

• gels di agarosio, pronti all’uso • strisce tamponate, pronte all’uso • diluente per la soluzione colorante, soluzione concentrata • colorante Amidoschwarz, soluzione concentrata • applicatori, pronti all’uso • cartine da filtro sottili

tutti questi componenti vengono forniti nel kit HYDRAGEL 30 β1-β2 della ditta SEBIA. Particolarità: il gel contiene agarosio in concentrazione 8 g/l, tampone Tris-barbital a pH 8.5 ± 0.1 ed additivi necessari per ottimizzare l’analisi. 1 Il gel nuovo rispetto a quello tradizionale è meno concentrato e le maglie meno fitte, in questo modo riesce a dividere con più specificità le bande β. Non si sono dovute preparare diluizioni delle soluzioni in quanto sono utilizzate normalmente in routine dal laboratorio LC-CIC, quindi sono già state trovate pronte all’uso.

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5.4 Apparecchi utilizzati

• Per la migrazione elettroforetica:

Figura 3: HYDRASYS LC, apparecchio per migrazione e colorazione elettroforetica, laboratorio LC-CIC

L’apparecchio HYDRASYS LC è fornito dalla ditta SEBIA, permette di effettuare elettroforesi e colorazione del gel.

• Per la lettura dei gels di elettroforesi:

Figura 4: HYRYS HIT, densitometro per lettura gel elettroforetici, laboratorio LC-CIC

L’apparecchio HYRYS HIT della ditta SEBIA permette di leggere i gel elettroforetici e crea un grafico dove mostra le bande presenti. Inoltre grazie al suo software dà risultati quantitativi delle varie frazioni e permette di creare ulteriori bande nel grafico.

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• Per la determinazione di LDL:

Figura 5: HITACHI Roche, laboratorio centrale OSG

Apparecchio usato per la routine di chimica clinica dal laboratorio centrale Ospedale OSG, Bellinzona.

• Per la determinazione di TRF e C3c

Figura 6 Nefelometro DADE Behring, laboratorio LC-CIC

Apparecchio usato per la routine di nefelometria dal laboratorio LC-CIC Ospedale OSG, Bellinzona.

5.5 Principio del metodo Tale tecnica è basata sul principio della elettroforesi zonale effettuata su un adatto mezzo di supporto. L’agarosio è un versatile ed efficace mezzo di supporto. L’elettroforesi si basa sul principio che ogni proteina in un miscuglio possiede, se poste in campo elettrico, una propria velocità di migrazione diversa dalle altre. In questo modo è possibile separare varie frazioni proteiche. La velocità di migrazione dipende dalla grandezza (MW), dalla forma (struttura terziaria) e dalla carica di superficie. A pH 8.6 tutte le proteine seriche hanno una carica negativa, il loro pI è inferiore e 8.6, e quindi migrano verso l’anodo (polo positivo). 2

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6 Risultati Una volta effettuate tutte le analisi sono stati riportati nella seguente tabella tutti i valori:

8 - 15 5.8 - 11 6 - 10 2 - 5 4 - 7 2 - 4 <2.60 2.00 - 3.60 0.9 - 1.8 62 - 82

n° reparto β % β g/l β 1 % β 2 % β 1 g/l β 2 g/l LDL TRF C3c TP

1 PS 11.2 9.14 7.8 4.7 4.70 3.84 2.96 2.22 1.412 81.6

2 MED 13.9 8.70 9.8 6.0 6.13 3.76 2.46 2.64 1.360 62.6

3 CH 18.1 13.61 8.3 11.9 6.24 8.95 1.28 1.42 1.264 75.2

4 ONC 15.5 8.31 12.7 3.6 6.81 1.93 1.66 1.60 1.490 53.6

5 PS 12.6 10.08 7.4 6.8 5.92 5.44 0.92 2.12 1.302 80.0

6 PS 32.5 25.61 30.5 2.6 24.03 2.05 2.80 2.56 1.356 78.8 X

7 PS 18.1 15.49 9.6 8.9 8.22 7.62 2.84 1.84 1.588 85.6

8 NEFR 14.9 7.24 9.2 6.1 4.47 2.96 2.50 1.08 1.396 48.6

9 MED 18.5 12.43 9.5 10.4 6.38 6.99 1.32 0.92 1.516 67.2

10 MED 15.7 10.08 6.9 7.5 4.43 4.82 0.24 1.36 1.974 64.2

11 MED 15.2 11.04 10.0 7.0 7.26 5.08 3.42 2.98 1.600 72.6

12 MED 16.2 7.97 9.6 9.1 4.72 4.48 0.12 1.66 2.06 49.2

13 MED 16.0 10.53 9.1 8.3 5.99 5.46 0.84 1.28 1.468 65.8

14 PS 41.1 35.92 37.9 2.4 33.12 2.10 2.64 2.58 1.354 87.4 X

15 MED 15.5 10.6 10.4 7.00 7.11 4.79 2.48 2.20 1.230 68.4

16 PS 7.1 5.35 5.9 9.4 4.45 7.09 1.30 1.04 0.540 75.4 X

17 ONC 6.8 6.45 5.6 2.9 5.31 2.75 1.38 1.96 0.682 94.8

18 PS 7.5 7.29 6.7 2.4 6.51 2.33 0.64 1.58 1.058 97.2

19 PS 7.4 4.96 5.4 2.7 3.62 1.81 1.82 1.90 0.472 67.0

20 MED 15.6 10.92 9.00 7.4 6.30 5.18 3.22 1.58 1.842 70.0

21 PS 6.9 5.99 4.4 2.9 3.82 2.52 1.62 1.64 1.076 86.8 X

22 PS 17.7 14.90 11.4 7.5 9.60 6.31 4.46 2.50 1.538 84.2

23 MED 18 7.34 13.4 7.1 5.47 2.90 7.08 1.70 0.976 40.8

24 PS 18.4 12.29 10.8 7.8 7.21 5.21 2.20 1.56 1.748 66.8

Legenda:

Eccezione reparto Valore alto Valore basso

X Picco monoclonale Figura 7: risultati ottenuti per effettuare la ricerca

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I risultati ottenuti al densitometro HYRYS HIT (figura 4) appaiono nel seguente modo, per il gel tradizionale che separa le cinque frazioni:

Albumina α 1 α 2 β γ Figura 8: Elettroforesi delle proteine, cinque frazioni. Gel tradizionale.

Per il gel nuovo in grado di separare sei frazioni:

Si può notare nella figura 9 che appare un picco in più rispetto alla figura 8, indicata dalla freccia rossa, questo perché il grafico della figura 9 è stato effettuato con il nuovo gel HYDRAGEL β1-β2. I grafici di ogni campione sono presenti negli allegati.

Albumina α 1 α 2 β 1 β 2 γ Figura 9: Elettroforesi delle proteine, sei frazioni. Gel nuovo.

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7 Discussione Principalmente l'elettroforesi viene utilizzata nella routine d'ospedale per la ricerca di bande monoclinali. Circa l'80% delle elettroforesi di routine vengono considerate negative, però anche se negativo un tracciato può dare informazioni supplementari al medico, mostrando per esempio picchi elevati. Per questo motivo può essere utile avere ulteriori informazioni con aumenti o diminuzioni di picchi. Nella banda β 1 è presente transferrina e LDL, mentre nella β 2 è presente complemento C3c. Come già accennato, abbiamo riscontrato una notevole difficoltà nella raccolta dei campioni. I campioni 6, 14, 16 e 21 sono stati esclusi immediatamente, in quanto esprimono un picco monoclonale, quindi nessuna utilità per il lavoro. Per poter confermare e quindi provare i risultati del nuovo gel HYDRAGEL β1-β2 sono state effettuate, come già spiegato, le proteine che dovrebbero esser presenti in questa determinata banda, quindi per β 1 transferrina e LDL e per β 2 il complemento C3c. Non in tutti i campioni ciò che era visibile su gel rispecchiava esattamente le analisi effettuate, questo si presume per determinati fattori quali degradazione delle proteine, precisione e sensibilità nella lettura al densitometro con conseguente spostamento verso sinistra o destra dei limiti delle curve date dalle frazioni. Nei risultati finali si sono presentati campioni correlanti, campioni che non correlano con le analisi effettuate e campioni correlanti solo in parte, qui di seguito sono riportati in sintesi questi risultati:

4 - 7 2 - 4 <2.60 2.00 - 3.60 0.9 - 1.8 Correlazione fra n° β 1 g/l β 2 g/l LDL TRF C3c risultati e analisi 1 4.70 3.84 2.96 2.22 1.412 NO 2 6.13 3.76 2.46 2.64 1.360 SI 3 6.24 8.95 1.28 1.42 1.264 NO 4 6.81 1.93 1.66 1.60 1.490 IN PARTE 5 5.92 5.44 0.92 2.12 1.302 NO 7 8.22 7.62 2.84 1.84 1.588 IN PARTE 8 4.47 2.96 2.50 1.08 1.396 NO 9 6.38 6.99 1.32 0.92 1.516 NO 10 4.43 4.82 0.24 1.36 1.974 SI 11 7.26 5.08 3.42 2.98 1.600 IN PARTE 12 4.72 4.48 0.12 1.66 2.06 SI 13 5.99 5.46 0.84 1.28 1.468 NO 15 7.11 4.79 2.48 2.20 1.230 NO 17 5.31 2.75 1.38 1.96 0.682 NO 18 6.51 2.33 0.64 1.58 1.058 NO 19 3.62 1.81 1.82 1.90 0.472 SI 20 6.30 5.18 3.22 1.58 1.842 IN PARTE 22 9.60 6.31 4.46 2.50 1.538 IN PARTE 23 5.47 2.90 7.08 1.70 0.976 NO 24 7.21 5.21 2.20 1.56 1.748 NO

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Il campione 2 è risultato negativo per β 1 e β 2 e negativo per le proteine ricercate, quindi c’è buona correlazione nel senso che il gel non dimostra falsi positivi. Per i campioni 10, 12 e 19 si può notare un ottima eguaglianza tra il valore delle beta riscontrato nel gel e la conferma con la ricerca delle singole sieroproteine. Nei dettagli: - il campione 10 ha dimostrato dal grafico dell’elettroforesi un aumento della frazione β 2 , il valore di C3c è effettivamente aumentato. - il campione 12, come per il 10, dove il gel ha mostrato un picco in β 2 il complemento è risultato aumentato. - per il campione 19 invece il caso opposto, dove β 1 e β 2 sono risultate diminuite al grafico di elettroforesi, pure alla ricerca delle singole proteine si è visto un valore diminuito. Nei campioni 4, 7, 11, 20 e 22 c’è una correlazione parziale nel senso che solo una banda delle beta risulta corretta. Per esempio avere una β 1 aumentata con rispettive proteine e delle β 2 anche aumentate ma senza le corrispondenti proteine (campione 7). Il campione 4 presenta una particolarità. Testimonia come parte della frazione β 2 vada a nascondersi sotto la frazione β 1 . In effetti avendo valori ai limiti come in questo caso, la precisione con cui vengono delimitati i picchi risulta molto importante. Il campione 7 ha le bande β 1 e β 2 aumentate, ma solo le lipoproteine, quindi di classe β 1 , risultano aumentate. Anche i campioni 11 e 22 dimostrano un caso simile al 7. Il campione 20 invece correla per le β 2 ma non per le β 1 , difatti l’aumento delle lipoproteine non è evidenziato con l’aumento della banda rispettiva. Per contro gli altri campioni non rispecchiano le bande con le proteine misurate, nel senso che dove è presente un aumento della banda beta non c’è il corrispondente valore alto delle proteine e viceversa.

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Si è visto che il nuovo gel dimostra una migliore separazione delle proteine seriche rispetto al gel tradizionale, nella figura 10 questo è molto ben visibile indicato dalle frecce rosse:

Figura 10: il gel tradizionale e il gel nuovo messi a confronto

Nel primo gel HYDRAGEL PROTEIN 15/30 la banda β indicata dalla freccia è singola e ben definita, nel secondo gel HYDRAGEL β1-β2 15/30 si può notare che la stessa banda è suddivisa in due, appunto in β 1 e β 2 .

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8 Conclusioni I risultati correlanti e quindi a favore del nuovo gel hanno dimostrato la capacità di quest’ultimo di separare con più sensibilità le proteine. Per quanto riguarda i risultati non correlanti consideriamo alcuni punti: - probabilmente ci sono più proteine che andrebbero prese in considerazione come per esempio fibrinogeno, complemento C4 o immunoglobuline; - a causa della scarsità di siero dei campioni all’inizio del lavoro è stato necessario diluire ogni campione 1:2 con NaCl soluzione fisiologica. Come già detto in precedenza ogni campione è stato trattato allo stesso modo; - come valori di riferimento per tutta la ricerca sono stati utilizzati quelli del sistema informatico LAB400 del laboratorio LC-CIC, OSG Bellinzona e non quelli forniti dalla ditta SEBIA. Questo gia per il sistema tradizionale di elettroforesi, in quanto dopo una ricerca erano stati creati dei limiti interni perché quelli forniti dalla ditta SEBIA non si adattavano alla routine. Per questo motivo ho contattato la ditta SEBIA per avere ulteriori indicazioni ed eventuali consigli in merito, purtroppo al momento della stesura definitiva non si disponeva ancora della loro risposta. Sarebbe interessante in un futuro poter ampliare questa ricerca tramite accertamenti, in quanto il gel testato si è dimostrato interessante e promettente e di utilità sicuramente per il medico, dato che darebbe la possibilità di fornire informazioni in più su queste determinate proteine, ma per poterlo inserire nella routine di laboratorio bisogna innanzitutto chiarire le situazioni di contrasto per poter fare affidamento ai risultati.

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9 Ringraziamenti • Per la pazienza, il tempo concesso, i preziosi consigli, la disponibilità e la conoscenza messa a disposizione: Relatore e responsabile personale Dr. Franco Keller; Bellinzona Capo laboratori LIC e centrale OSG Roberto Francesconi; Bellinzona • Per la disponibilità durante la routine e nei giorni feriali: Personale del laboratorio LIC; Bellinzona Personale del laboratorio centrale OSG; Bellinzona • Per la metodologia, l’aiuto nella redazione e i consigli didattici: Vice direttore SSMT Andrea Boffini, Locarno Docente chimica clinica SSMT Togni, Locarno Responsabili SSMT Sonja Marci, Daniela Marcacci, Micaela Zenger; Locarno • Per la redazione del riassunto inglese e l’aiuto con la lingua: Docente inglese SSMT Gilbert Susan • Per i consigli e l’aiuto nelle correzioni: Rickenbach Joëlle, Witschi Michael • Ogni singola persona che mi ha aiutato e sopportato nella stesura di questo lavoro.

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10 Bibliografia Testi e citazioni: 1 HYDRAGEL 30 β1-β2, manuale per l’operatore fornito nel kit dalla ditta SEBIA 2 Immunologia, dispense corso scolastico per laboratoristi medici; Ver. Corso 2003/2004, Dr.Keller Tabelle e grafici: Immagine di copertina Gel HYDRAGEL 30 β1-β2 dopo colorazione Figura 1 HYDRAGEL 30 β1-β2, manuale per l’operatore fornito nel kit dalla ditta SEBIA Figura 2 Immunologia, dispense corso scolastico per laboratoristi medici; Ver. Corso 2003/2004, Dr.Keller Figure 3, 4, 6 Fotografie effettuate nei laboratori dell’ospedale OSG, 6500 Bellinzona Figura 5 http://www.rochediagnostics.pl

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11 Allegati

1. Copia dei gel dopo colorazione 2. Grafici delle letture al densitometro del gel tradizionale

3. Grafici delle letture al densitometro del gel testato 4. Metodica HYDRAGEL 30 β1-β2, manuale per l’operatore fornito nel kit dalla ditta

SEBIA