EKSTRAK PROPOLIS LEBAH (Trigona sp) SEBAGAI PREVENTIF ...repository.ub.ac.id/8272/1/DIAH VITA...
Transcript of EKSTRAK PROPOLIS LEBAH (Trigona sp) SEBAGAI PREVENTIF ...repository.ub.ac.id/8272/1/DIAH VITA...
EKSTRAK PROPOLIS LEBAH (Trigona sp) SEBAGAI
PREVENTIF TERHADAP EKSPRESI TNF- α DAN
GAMBARAN HISTOPATOLOGI JANTUNG
PADA TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus)
DENGAN PAPARAN ASAP ROKOK
SKRIPSI
Oleh
DIAH VITA WIJAYANTI
125130101111025
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER HEWAN
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2017
i
EKSTRAK PROPOLIS LEBAH (Trigona sp) SEBAGAI
PREVENTIF TERHADAP EKSPRESI TNF- α DAN
GAMBARAN HISTOPATOLOGI JANTUNG
PADA TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus)
DENGAN PAPARAN ASAP ROKOK
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
Oleh
DIAH VITA WIJAYANTI
125130101111025
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER HEWAN
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2017
ii
LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI
Ekstrak Propolis Lebah (Trigona sp) sebagai Preventif Terhadap Ekspresi
TNF-α dan Gambaran Histopatologi Jantung pada Tikus Putih (Rattus
norvegicus) dengan Paparan Asap Rokok
Oleh:
DIAH VITA WIJAYANTI
125130101111025
Setelah dipertahankan di depan Majelis Penguji
pada Tanggal 8 Desember 2017
dan dinyatakan memenuhi syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
Pembimbing I Pembimbing II
Dr.drh. Djoko Winarso, MS drh. Herlina Pratiwi, M. Si
NIP. 19530605 198403 1 001 NIP. 19870518 201012 2 010
Mengetahui,
Dekan Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Brawijaya
Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES
NIP. 19600903 198802 2 001
iii
LEMBAR PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan di bawah ini:
Nama : Diah Vita Wijayanti
NIM : 125130101111025
Program Studi : Pendidikan Dokter Hewan
Penulis Skripsi berjudul:
“Ekstrak Propolis Lebah (Trigona sp) sebagai Preventif Terhadap Ekspresi TNF-α
dan Gambaran Histopatologi Jantung pada Tikus Putih (Rattus norvegicus)
dengan Paparan Asap Rokok”
Dengan ini menyatakan bahwa:
1. Isi dari skripsi yang saya buat adalah benar-benar karya saya sendiri dan tidak
menjiplak karya orang lain, selain nama-nama yang termaktub diisi dan tertulis
di daftar pustaka dalam skripsi ini.
2. Apabila dikemudian hari ternyata skripsi yang saya tulis terbukti hasil jiplakan,
maka saya akan bersedia menanggung segala resiko yang akan saya terima.
Demikian pernyataan ini dibuat dengan segala kesadaran.
Malang, 8 Desember 2017
Yang menyatakan,
(Diah Vita Wijayanti)
NIM. 125130101111025
iv
Ekstrak Propolis Lebah (Trigona sp) sebagai Preventif Terhadap
Ekspresi Tnf- α dan Gambaran Histopatologi Jantung
pada Tikus Putih (Rattus norvegicus)
dengan Paparan Asap Rokok
ABSTRAK
Asap rokok dapat menurunkan level antioksidan, meningkatkan pelepasan
radikal superoksida, dan menyebabkan nekrosis akibat stimulasi dari TNF-α.
Jantung merupakan organ penting dalam tubuh karena fungsinya sebagai sistem
kardiovaskuler. Ekstrak etanol propolis lebah Trigona sp diketahui mengandung
Caffeic Acid Phenethyl Ester (CAPE) yang bekerja sebagai antioksidan. Penelitian
ini bertujuan untuk mengetahui histopatologi jantung dan ekspresi TNF-α pada
tikus (Rattus norvegicus) hasil paparan asap rokok yang diberi ekstrak propolis
lebah Trigona sp sebagai preventif. Hewan coba yang digunakan adalah tikus
putih strain Wistar. Tikus dibagi menjadi lima kelompok yaitu kelompok kontrol
negatif (K-), kelompok kontrol positif (K+), kelompok tikus P1, P2, P3 yang
masing-masing diberi ekstrak etanol propolis lebah Trigona sp 10mg/200g/hari,
20mg/200g/hari, 30mg/200g/hari kemudian diberi paparan asap rokok 2
batang/hari selama 14 hari. Pengukuran ekspresi TNF-α menggunakan uji
Imunohistokimia, analisa data dilakukan secara kuantitatif menggunakan uji One
Way ANOVA dan dilanjutkan dengan uji Tukey (P<0,05). Histopatologi jantung
menggunakan pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE). Hasil gambaran histopatologi
organ jantung dianalisa secara deskriptif. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak
propolis lebah Trigona sp secara signifikan (P<0,05) mencegah peningkatan
ekspresi TNF-α pada tikus yang terpapar asap rokok, dengan dosis terbaik untuk
mencegah peningkatan ekspresi TNF-α adalah 30mg/200g/hari. Terapi ekstrak
etanol propolis lebah Trigona sp mencegah kerusakan kondisi histopatologi sel
otot jantung. Kesimpulan dari penelitian, ekstrak etanol propolis lebah Trigona sp
mampu mencegah peningkatan ekspresi TNF-α dan dapat mencegah kerusakan
otot jantung pada tikus yang dipapar asap rokok.
Kata Kunci: Asap Rokok, Histopatologi Jantung, Propolis, TNF-α
v
Propolis Extract Bee (Trigona sp) as Preventation of TNF-α
Expression and The Description of Heart Histopathology
on The White Rat (Rattus norvegicus) Exposured
with Cigarette Smoke
ABSTRAC
Cigarette smoke could reduce antioxidant levels, increase the release of
superoxide radical, and emerge the necrosis because of the stimulation of TNF- α.
Heart is premier organ in the body, it is included into the cardiovascular
system.The ethanol extract of propolis bee Trigona sp is known to contain Caffeic
Acid Phenethyl Ester (CAPE) which acts as an antioxidant. This research was
aims to determine the histopathology of heart and expression of TNF-α in rat
(Rattus norvegicus) exposure to cigarette smoke extracted with Trigona sp extract
as preventive. The experimental animal used was Wistar strain white rat. The
study consisted to five groups in which contained of negative control (K-),
positive control (K+), groups of rats P1, P2, P3 were given ethanol extract of
propolis bee Trigona sp 10mg/200g/day, 20mg/200g/day, 30mg/200g/day and
those were exposed to cigarettes smoke as much 2 cigarettes/day within 14 days.
The measurement of expression TNF-α used Immunohistochemistry tests,
quantitative data analysis performed was used One Way ANOVA followed by
Tukey's test (P <0.05). Histopathology of heart used Hematoxylin Eosin staining
(HE). The results of overview heart organ histopathology were analysed
descriptively. The results showed that Trigona sp extract significantly (P<0.05)
prevented the increase of TNF-α expression in rat exposed to cigarette smoke, the
best dose to prevent the increase of TNF-α expression was 30mg/200g/day. The
therapy using ethanol extract of propolis bee Trigona sp prevents the damage
histopathological condition of heart muscle cells. The conclusions from the
research, ethanol extract of propolis bee Trigona sp is able to prevent the increase
of TNF-α expression and can prevent the damage of heart muscle in rat exposed
to cigarette smoke.
Keywords: Cigarette Smoke, Heart Histopathology, Propolis, TNF-α
vi
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas
berkat dan anugerah-Nya sehingga Skripsi yang berjudul “Ekstrak Propolis Lebah
(Trigona sp) sebagai Preventif Terhadap Ekspresi TNF-α dan Gambaran
Histopatologi Jantung pada Tikus Putih (Rattus norvegicus) dengan Paparan Asap
Rokok” ini dapat terselesaikan.
Dengan penuh rasa hormat penulis mengucapkan terimakasih kepada
pihak yang secara langsung maupun tidak langsung telah membantu dalam
penyususnan Skripsi ini. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada:
1. Dr.drh. Djoko Winarso, MS selaku dosen pembimbing I atas segala bantuan,
kesempatan, bimbingan, arahan serta dukungan yang diberikan kepada
penulis.
2. drh. Herlina Pratiwi, M. Si selaku dosen pembimbing II atas segala bantuan,
kesempatan, bimbingan, arahan serta dukungan yang diberikan kepada
penulis.
3. drh. M. Arfan Lesmana, M. Sc selaku dosen penguji I atas saran, masukan,
koreksi serta perbaikan yang diberikan kepada penulis.
4. drh. Yudit Oktanella, M.Si selaku dosen penguji II atas saran, masukan,
koreksi serta perbaikan yang diberikan kepada penulis.
5. Prof. Dr. Aulanni’am, drh. DES selaku Dekan Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Brawijaya.
6. Drh. Dyah Ayu Oktavianie, M.Biotech selaku Wakil Dekan 1 bidang
akademik Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya.
7. Para dosen yang telah membimbing dan memberikan ilmu selama
menjalankan studi di Program Studi Kedokteran Hewan Universitas
Brawijaya.
8. Bapak Suparno, Ibu Siti Fatehah serta saudara saya tercinta Andi Winata
Budi, Yeni Wulandari dan Rizky Ibnan Maulana untuk doa, kasih sayang,
dukungan serta pengorbanan baik moril maupun materi selama ini.
vii
9. Terima kasih sahabat satu penelitian Trigona Sweet yaitu Eli, Retno, Fitri dan
Wijaya atas kerjasama dan waktunya selama penelitian ini berlangsung.
10. Teman-teman seperjuangan keluarga besar angkatan 2012 FKH UB
khususnya kelas B atas cinta, persahabatan, semangat, inspirasi, keceriaan dan
mimpi- mimpi yang luar biasa.
11. Sahabat Baik Upakarti, Retno, Ayu, Diah yang telah memberikan semangat
kepada penulis.
12. Semua pihak lain yang telah membantu penulis dalam penyelesaian penulisan
Skripsi ini yang tidak mengkin penulis sebutkan satu persatu.
Penulis sadar bahwa Skripsi ini jauh dari sempurna oleh sebab itu kritik
dan saran yang konstruktif dari semua pihak sangat diharapkan demi
penyempurnaan selanjutnya.
Malang, 8 Desember 2017
Penulis
viii
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ................................................................................. i
HALAMAN PENGESAHAN .................................................................. ii
HALAMAN PERNYATAAN ................................................................. iii
ABSTRAK ............................................................................................... iv
KATA PENGANTAR ............................................................................. vi
DAFTAR ISI ......................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR .............................................................................. xi
DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................... xii
DAFTAR ISTILAH DAN LAMBANG ................................................ xiii
BAB 1. PENDAHULUAN ....................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ........................................................................ 1
1.2 Rumusan Masalah ................................................................... 3
1.3 Batasan Masalah ..................................................................... 3
1.4 Tujuan Penelitian ................................................................... 5
1.5 Manfaat Penelitian .................................................................. 5
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA .............................................................. 6
2.1 Asap Rokok.... ....................................................................... 6
2.2 Propolis Lebah Trigona sp...................................................... 8
2.2.1 Kandungan Kimia Propolis ........................................... 9
2.2.2 Manfaat Propolis ........................................................ 12
2.3 Hewan Coba Tikus (Rattus norvegicus).................................. 12
2.4 Jantung ................................................................................ 14
2.4.1 Anatomi Jantung ......................................................... 14
2.4.2 Histologi Jantung ........................................................ 16
2.5 Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) .................................. 19
BAB 3. KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN .... 21
3.1 Kerangka Konsep .................................................................. 21
3.2 Hipotesis Penelitian ............................................................... 23
BAB 4. METODE PENELITIAN ......................................................... 25
4.1 Waktu dan Tempat Penelitian ................................................ 25
4.2 Materi Penelitian ................................................................... 25
4.2.1 Bahan Penelitian ......................................................... 25
4.2.2 Alat Penelitian ............................................................ 25
4.3 Sampel Penelitian .................................................................. 26
4.4 Rancangan Penelitian ............................................................ 27
4.5 Variabel Penelitian ................................................................ 28
4.6 Tahapan Penelitian ................................................................ 28
ix
4.6.1 Persiapan Hewan Coba ............................................ 28
4.6.2 Pembuatan Ekstrak Etanol Propolis. ......................... 29
4.6.3 Uji Fitokimia Etanol Propolis Lebah Trigona sp ....... 30
4.6.4 Dosis Ekstrak Propolis Trigona sp ............................ 30
4.6.5 Pemberian Ekstrak Etanol Propolis ........................... 30
4.6.6 Paparan Asap Rokok ................................................. 31
4.6.7 Pengambilan Organ Jantung..................................... .32
4.6.8 Pembuatan Preparat Histopatologi Jantung................. 32
4.6.9 Pengukuran Ekspresi TNF-α....................................... 34
4.6.10 Analisis Data ...............................................................34
BAB 5. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 36
5.1 Efek Pemberian Ekstrak Etanol Propolis Lebah Trigona sp
terhadap EkspresiTNF-α Jantung ............................................ 36
5.2 Histopatologi Jantung Tikus Putih (Rattus novergicus) Setelah
Pemberian Ekstrak Propolis dan Dipapar Asap Rokok ............ 43
BAB 6. PENUTUP ................................................................................. 49
6.1 Kesimpulan ........................................................................... 49
6.1 Saran ..................................................................................... 49
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................. 50
LAMPIRAN ........................................................................................... 56
x
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
2.1 Komposisi Kimia Propolis ...................................................................... ….11
4.1 Rancangan Kelompok Penelitian .................................................................. 28
5.1 Ekspresi TNF-α jantung tikus perlakuan...................................................... 39
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
2.1 Propolis Trigona sp ........................................................................................ 9
2.2 Tikus (Rattus norvegicus). ........................................................................... 13
2.3 Anatomi jantung ............................................................................................. .15
2.4 Histologi jantung......................................................................................... 18
2.5 Histopatologi jantung.......................................................................................19
5.1 Ekspresi Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) pada jantung tikus (Rattus
norvegicus)......................................................................................................37
5.2 Histopatologi jantung) pada jantung tikus (Rattusnorvegicus) dengan
pewarnaan HE..................................................................................................44
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Sertifikat Laik Etik…… .................................................................................. 57
2. Hasil Analisa LCMS Ekstrak Etanol Propolis Trigona sp.............................. ... 58
3. Dosis Perhitungan Pemberian Ekstrak Etanol Propolis Trigona sp……….. ..... 59
4. Pembuatan Sedian Propolis Konsentrasi 30% dengan Volume 150 mL….. ..... 60
5. Kerangka Operasional…………………………………………………….. ...... 61
6. Pembuatan Gambaran Histopatologi Jaringan ................................................. 62
7. Pewarnaan Hematoxylen-Eosin (HE)... ........................................................... 63
8. Metode Immunohistokimia Ekspresi TNF-α ................................................... 64
9. Perhitungan Ekspresi TNF-α ........................................................................... 65
10. Data Dan Uji Statistik Ekspresi TNF-α ........................................................... 67
11. Dokumentasi Penelitian .................................................................................. 76
xiii
DAFTAR ISTILAH DAN LAMBANG
Simbol/Singkatan Keterangan
oC Derajat Celcius
% Persen
AOAC Association of Analytical Communities
ANOVA Analysis of Varience
BB Berat Badan
CAPE Caffeic Acid Phenethyl Ester
DNA Deoxyribose Nucleic Acid
CO Karbon monoksida
Cm sentimeter
EEP Ekstrak Etanol Propolis
g gram
GATS Global Adult Tobacco Survey
GSH Glutathione
HE Hematoxyline Eosin
IL Interleukin
IHK Imunohistokimia
Kg Kilogram
LD Letal Dosis
mg miligram
mL mililiter
NO Nitrogen monoksida
-OH Hidroksil
PAH Poliaromatik Hidrokarbon
PBS Phosphate Buffer Saline
PO Peroral
PUFA Poly Unsaturated Fatty Acid
RAL Rancangan Acak Lengkap
RSB Reducting Sample Buffer ROS Reaktif Oksigen Spesies
TNF-α Tumor Nekrosis Faktor Alfa
1
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Kebiasaan merokok merupakan masalah penting dewasa ini. Rokok
merupakan hasil olahan tembakau terbungkus termasuk cerutu atau bahan lainya
yang dihasilkan tanamam Nicotiana tabacum, Nicotiana rustica dan spesies
lainnya atau sintesisnya yang mengandung nikotin dan tar dengan atau tanpa
bahan tambahan (Tendra, 2003). Rokok adalah salah satu zat adiktif yang bila
digunakan mengakibatkan bahaya bagi kesehatan individu dan masyarakat. Rokok
mengandung lebih dari 4.000 zat berbahaya, di antaranya tar, arsen, formaldehid,
dan benzo (a) piren yang bersifat karsinogenik. Tar bersifat direk karsinogen
sehingga tidak memerlukan promotor untuk dapat menimbulkan kanker. Di dalam
asap rokok juga mengandung karbon monoksida (CO), hidrogen sianida, nitrogen
oksida, dan amonia (Cancer research uk, 2006). Radikal bebas rokok berasal dari
asap rokok yang menyebabkan iritasi dan efek inflamasi (Winarsi, 2007).
Rokok oleh sebagian orang sudah menjadi kebutuhan hidup yang tidak
bisa ditinggalkan dalam kehidupan sehari-hari. Lingkungan asap rokok adalah
penyebab berbagai penyakit dan juga dapat mengenai orang sehat dan hewan
peliharaan yang berada disekitar perokok. Paparan asap rokok yang dialami terus-
menerus dapat menambah resiko terkena penyakit paru-paru dan penyakit
jantung. Berdasarkan Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) 2013, sebesar 85%
sumber paparan asap rokok disumbang oleh lingkungan rumah tangga,
estimasinya adalah delapan perokok meninggal karena perokok aktif, satu
perokok pasif meninggal karena terpapar asap rokok orang lain. Berdasarkan
2
perhitungan rasio ini maka sedikitnya 25.000 kematian di Indonesia terjadi
dikarenakan asap rokok orang lain.
Radikal bebas dari asap rokok menyebabkan terganggunya kestabilan
metabolisme di dalam tubuh. Terganggunya kestabilan tubuh akan merangsang
terjadinya aktivasi sistem pertahanan termasuk TNF-α sebagai sistem pertahanan
umum. Tumor Nekrosis Faktor Alfa (TNF-α) dalam jumlah sedikit akan
menginduksi leukosit dan endotel untuk menginisiasi terjadinya inflamasi akut.
Radikal bebas akan mengganggu kestabilan sel pada otot jantung dengan merusak
membran lipid bilayer, protein maupun susunan basa DNA. Kerusakan –
kerusakan pada otot jantung akan merubah bentuk sitoplasma akibat rupturnya
membran lipid bilayer, dan terjadinya nekrosis akibat stimulasi dari TNF-α
(Palyoga, 2014).
Secara alami tubuh memproduksi enzim yang dapat menangkal radikal
bebas, namun bila jumlah radikal bebas berlebihan, seperti pada perokok, tubuh
memerlukan antioksidan dari luar untuk menangkal radikal bebas. Propolis atau
lem lebah merupakan produk alami dari lebah madu yang mempunyai potensi
antioksidan yang tinggi (Gheldof et al., 2002). Propolis mempunyai aktivitas
antioksidan yang paling kuat dalam melawan oksidan dan radikal bebas
dibandingkan dengan hasil produk lebah lainnya (Nakajima et al., 2009).
Kandungan flavonoid di dalamnya dapat meredam efek buruk radikal bebas (Mot
et al., 2009). Manfaat propolis selain sebagai antioksidan adalah antibakteri,
antiinflamasi, antiviral, hepatoprotektif, antitumor, mencegah terjadinya ulkus dan
vasodilator (Viuda et al., 2008; Nakajima et al., 2009).
3
Berdasarkan latar belakang di atas, penelitian ini dilakukan untuk
mempelajari pengaruh preventif pemberian ekstrak propolis terhadap ekspresi
TNF-α dan histopatologi jantung pada hewan model tikus putih (Rattus
norvegicus) yang diberi paparan asap rokok.
1.2 Rumusan Masalah
Dari latar belakang yang telah diuraikan, maka dapat dirumuskan beberapa
permasalahan berikut :
1. Apakah pemberian ekstrak etanol propolis lebah Trigona sp sebagai preventif
dapat mencegah peningkatan ekspresi TNF-α jantung tikus putih (Rattus
norvegicus) yang diberi paparan asap rokok ?
2. Apakah pemberian ekstrak etanol propolis lebah Trigona sp sebagai preventif
dapat mencegah kerusakan histopatologi jantung tikus putih (Rattus
norvegicus) yang diberi paparan asap rokok ?
1.3 Batasan Masalah
Dari latar belakang yang telah diuraikan, maka penelitian ini dibatasi
pada :
1. Tikus putih yang digunakan adalah tikus putih strain wistar jantan dengan
umur 8-12 minggu dengan berat badan 150-200 gram yang diperoleh dari
Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah
Malang. Penggunaan hewan coba dalam penelitian telah mendapatkan
sertifikat laik etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya
(Lampiran 1).
4
2. Rokok yang digunakan adalah rokok non filter atau rokok kretek. Pemaparan
asap rokok dilakukan 2 batang/hari/kandang selama 14 hari dimulai pada hari
ke-15 hingga hari ke-28. Pemaparan asap rokok dilakukan dengan cara asap
rokok dimasukkan dalam kotak kaca menggunakan smoking pump hingga
memenuhi kotak (Radiati, 2008).
3. Propolis Trigona sp. didapatkan dari peternakan lebah di daerah Lawang
Kabupaten Malang.
4. Propolis diberikan secara per oral dengan sonde selama 21 hari. Dosis preventif
ekstrak etanol propolis Trigona sp yang diberikan pada tikus yang dipapar asap
rokok perhari yaitu sebesar 10mg/200gBB/hari, 20mg/200gBB/hari dan
30mg/200gBB/hari. Masing-masing dosis diberikan 1 kali sehari secara peroral
selama 2 minggu dimulai pada hari ke-8 sampai pada hari ke-28 (Lampiran
3).
5. Kandungan flavonoid ekstrak Propolis lebah Trigona sp yang akan digunakan
telah dianalisis di Laboratorium Kimia Analitik Politeknik Negeri Malang
(Lampiran 2).
6. Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah pengamatan histopatologi
jantung untuk melihat kerusakan sel otot jantung dengan menggunakan
pewarnaan HE dan ekspresi TNF-α jantung dengan menggunakan
Imunohistokimia (IHK) pada tikus putih (Rattus novergicus) yang dipapar asap
rokok.
5
1.4 Tujuan Penelitian
Dari latar belakang yang telah diuraikan, maka tujuan dari penelitian ini
adalah :
1. Mengetahui pengaruh pengaruh pemberian ekstrak etanol propolis lebah
Trigona sp sebagai preventif terhadap ekspresi TNF-α jantung tikus putih
(Rattus novergicus) yang diberi paparan asap rokok.
2. Mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol propolis lebah Trigona sp
sebagai preventif terhadap histopatologi jantung tikus putih (Rattus novergicus)
yang diberi paparan asap rokok.
1.5 Manfaat Penelitian
Penelitian ini bermanfaat sebagai salah satu sumber kajian untuk
mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol propolis Trigona sp terhadap
perbaikan histopatologi jantung tikus putih dan ekspresi TNF-α tikus (Rattus
novergicus) yang diberi paparan asap rokok.
6
6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Asap Rokok
Rokok adalah salah satu zat adiktif yang bila digunakan mengakibatkan
bahaya bagi kesehatan individu dan masyarakat. Kemudian ada juga yang
menyebutkan bahwa rokok adalah hasil olahan tembakau terbungkus termasuk
cerutu atau bahan lainya yang dihasilkan dari tanamam Nicotiana tabacum,
Nicotiana rustica dan spesies lainnya atau sintesisnya yang mengandung nikotin
dan tar dengan atau tanpa bahan tambahan (Tendra, 2003).
Menurut Global Adults Tobacco Survey (GATS) 2011, Indonesia memiliki
jumlah perokok aktif terbanyak dengan prevalensi 67 % laki-laki dan 2,7% pada
wanita atau 34,8 % penduduk (sekitar 59,9 juta orang) dan 85,4 % masyarakat
terpapar asap rokok di tempat umum yaitu restoran 78,4 % terpapar asap rokok di
rumah dan 51,3 % terpapar asap rokok di tempat kerja. Hampir 80% dari perokok
Indonesia merokok di rumah masing-masing. Indonesia merupakan negara
dengan jumlah perokok laki-laki terbesar di dunia yaitu 14% sejak 17 tahun
(Depkes, RI, 2012).
Asap rokok memiliki kandungan oksidan eksogen yang tinggi untuk tubuh.
Mekanisme peningkatan senyawa oksidan pada tubuh yang disebabkan oleh asap
rokok diantaranya : 1) melalui paparan oksidan secara langsung yang terdapat
pada asap rokok fase tar dan gas, 2) Secara tidak langsung asap rokok ini
mengikat ivasi makrofag dan neutrofil yang akan mengeluarkan senyawa oksidan
endogen, dan 3) Senyawa radikal oksigen endogen yang terbentuk secara
fisiologis melalui reaksi rantai pernafasan dalam mitokondria (Sitepoe, 2000).
7
Cigarette smoke (asap rokok) dihasilkan dari pembakaran produk
tembakau yang disebut rokok. Asap rokok berdasarkan keluarnya asap dari bagian
rokok dapat dibagi menjadi 2 yaitu side stream smoke adalah asap yang berasal
dari ujung rokok yang terbakar dan main stream smoke adalah asap yang berasal
dari ujung rokok yang kemudian dihisap melewati filter (Tjandra, 2001). Asap
rokok yang berbahaya adalah asap rokok sampingan (side stream smoke) yang
dihirup oleh perokok pasif. Perokok pasif merupakan orang-orang yang tidak
merokok namun secara tidak sengaja ikut menghirup asap rokok disekitar
perokok.
Efek asap rokok menurut Ziech et al (2011) dapat menyebabkan
menurunkan level antioksidan dalam darah, meningkatkan pelepasan radikal
superoksida dan oksidasi dari glutation (GSH). GSH merupakan antioksidan yang
melindungi DNA dari kerusakan oleh Reactive Oxygen Species (ROS). Satu kali
hisapan asap rokok diperkirakan mengandung 1.016 molekul radikal bebas yang
masuk ke dalam tubuh. Asap rokok mengandung gas kimia sebanyak 92% seperti
karbon monoksida, karbondioksida, hydrogen sianida, amoniak, oksida dari
nitrogen dan senyawa hidrokarbon dan partikel aerosol sebanyak 8% seperti tar,
nikotin, benzopiren, fenol, dan cadmium (Yani, 2006). Paparan asap rokok yang
menerus dapat mambah resiko kerusakan berbagai organ vital termasuk paru-paru
dan jantung (Fauzan, 2003). Adedayo et al (2011) menambahkan radikal bebas
yang terkandung didalam asap rokok juga dapat menyebabkan kerusakan pada
ginjal, jantung, testis dan sel.
8
2.2 Propolis Lebah Trigona sp
Propolis atau lem lebah adalah suatu zat yang dihasilkan oleh lebah madu,
mengandung resin dan lilin lebah, bersifat lengket yang dikumpulkan dari sumber
tanaman, terutama dari bunga dan pucuk daun, untuk kemudian dicampur dengan
air liur lebah (Nakajima et al., 2009) (Gambar 2.1). Lebah menghasilkan
propolis dari resin yang dikumpulkan dari berbagai tumbuhan kemudian resin
tersebut dicampur bersama saliva dan berbagai enzim pada lebah (Lofty, 2006).
Salah satu jenis lebah yang mampu menghasilkan propolis dalam jumlah banyak
yaitu jenis Trigona sp (Sabir, 2009). Lebah jenis Trigona merupakan salah satu
lebah tidak menyengat, jumlah madu yang dihasilkan lebih sedikit namun jumlah
propolis yang dihasilkan lebih banyak dibandingkan jenis lebah lainnya. Lebah
Trigona sp diklasifikasikan sebagai berikut (Indra, 2009) :
Divisi : Animalia
Filum : Arhtropoda
Kelas : Insecta
Order : Hymenoptera
Subordo : Apocrita
Superfamili : Apoidea
Famili : Apidae
Subfamili : Apinae
Suku : Meliponini
Genus : Trigona
9
Lebah menggunakan propolis sebagai: 1) memperkuat sarang lebah; 2)
bahan pelapis untuk melindungi sarangnya dari faktor pengganggu dari luar,
misalnya serangga, kumbang, atau tikus; 3) meratakan dinding sarang lebah; 4)
bahan pengisi lubang atau celah dan perekat keretakan yang terdapat pada sarang
lebah; 5) melindungi sel sarang tempat ratu lebah menetaskan telurnya sehingga
larva lebah terlindungi dari penyakit (Lofty, 2006).
Gambar 2.1 Propolis Trigona sp (Sabir, 2009)
Keterangan : : bentuk propolis
2.2.1 Kandungan Kimia Propolis
Propolis mengandung resin (50%), wax (30%), essential oils (10%),
pollen (5%), dan komponen organik (5%) (Gomez et al., 2006). Resin
mengandung flavonoid, fenol, dan berbagai bentuk asam (Borelli et al., 2002).
Fenol merupakan salah satu ikatan yang ada dalam propolis yaitu Caffeic Acid
Phenethyl Ester (CAPE). Sisi aktif flavonoid adalah CAPE yang bekerja untuk
10
memaksimalkan aktivitas penangkapan terhadap radikal bebas dengan cara
menurunkan aktivitas radikal hidroksil (OH-) sehingga tidak terlalu reaktif lagi
(Cadenas and Packer, 2002).
Propolis mengandung 16 asam amino essensial yang dibutuhkan untuk
regenerasi sel. Dari semua asam amino yang terdapat dalam propolis,
arginin dan prolin tergolong yang terbanyak, sekitar 45,8%. Propolis
mengandung semua mineral, kecuali sulfur. Zat besi (Fe) dan seng (Zn) adalah
kandungan yang terbanyak. Propolis juga mengandung vitamin di antaranya
vitamin A, vitamin B (B1, B2, B6), vitamin C, vitamin E dan vitamin D (Radiati,
2008).
Pemberian Ekstrak Etanol Propolis (EEP) dengan dosis 200 mg/kgBB/hari
mampu menurunkan derajat infamasi intestinal secara bermakna. Hasil ini sesuai
dengan teori yang diungkapkan Takaisi-Kikuni dan Schilcher dalam Sabir (2005)
yang menyatakan bahwa EEP mampu menyebabkan disorganisasi sitoplasma,
membran sitoplasmik, serta dinding sel bakteri yang semuanya mengakibatkan
bakteriolisis parsial serta penghambatan sintesis protein sehingga bersifat
antibakteri. Selain itu, kandungan CAPE di dalam propolis dapat menghambat
aktivitas dalam pengikatan Deoxyribonucleic Acid (DNA), transkripsi NF-kB,
dan aktivator protein-1 (AP-1), tanpa memengaruhi degradasi protein
penghambat NF-kB yang terletak dalam sitoplasma, maka propolis memiliki
aktivitas sebagai imunomodulator dan antiinfamasi (Sabir, 2005).
Propolis dan hasil produk lebah lainnya seperti madu, pollen dan
royal jeli, bermanfaat untuk kesehatan, diantaranya bermanfaat sebagai
11
antioksidan, antibakteri, antiinflamasi, hepatoprotektif, antitumor, dan vasodilator
(Nakajima et al., 2009). Komposisi kimia propolis menurut Krell (1996) dapat
dilihat pada Tabel 2.1.
Tabel 2.1 Komposisi kimia propolis
Kelas komponen Jumlah Grup komponen
Resin 45-55% Flavonoid, asam fenolat dan
berbagai bentuk asam
Lilin dan asam
lemak
25-53%
sebagian besar berasal dari lilin
lebah dan tanaman
Minyak essensial 10% Senyawa volatile
Protein 5% Protein berasal dari pollen dan 16
asam amino seperti arginin dan
prolin sebanyak 45,8 %
Senyawa organik
lain dan mineral
5%
Semua mineral (Fe, Zn, Au, Ag, Cs,
Hg, La, dan Sb) kecuali Su dan
senyawa organik (keton, laktan,
kuinolon, gula, vitamin A, vitamin B
(B1,B2,B6, dan B8), vitamin C,
vitamin E, Vitamin D, asam
benzoate dan esternya)
(Krell, 1996)
12
2.2.2 Manfaat Propolis
Propolis dapat menghambat inflamasi melalui sintesis eikosanoid. Sintesis
eikosanoid akan terhambat akibatnya kandungan asam arakidonat di membran
fosfolipid sel akan menurun. Pelepasan prostaglandin, leukotrin dan tromboksan
sebagai mediator inflamasi akan terhambat karena penurunan asam arakidonat.
Manfaat propolis sebagai antiinflamasi didukung oleh adanya flavonoid, asam
aminodan derivate asam sinamat (Sabir, 2005).
Antioksidan merupakan zat yang dapat berperan sebagai donor hydrogen
ataupun akskseptor elektron (Ardhie, 2011). Antioksidan berpenting untuk
melindungi komponen lipid, protein dan asam nukleat seluler dari kerusakan
stress oksidatif yang diinduksi oleh radikal bebas (Stanojevic et al., 2009). Selain
itu, antioksidan juga berfungsi sebagai scavenger atau perangkap radikal bebas
(Winarsi, 2007). Caffeid Acid Phenethyl Ester (CAPE) yang merupakan sisi aktif
dari flavonoid membantu menurunkan aktivitas radikal hidroksil menjadi tidak
reaktif melalui peningkatan aktivitas scavenger dalam melawan radikal bebas
(Cadenas and Packer, 2002).
2.3 Tikus Putih (Rattus norvegicus)
Menurut Adiyati (2011), hewan coba merupakan hewan yang dikembang
biakkan untuk digunakan sebagai hewan uji coba. Tikus sering digunakan pada
berbagai macam penelitian medis selama bertahun-tahun. Hal ini dikarenakan
tikus memiliki karakteristik genetik yang unik, mudah berkembang biak, murah
13
serta mudah untuk mendapatkannya. Tikus merupakan hewan yang melakukan
aktivitasnya pada malam hari (nocturnal) (Gambar 2.2).
Tikus Wistar saat ini menjadi salah satu yang strain tikus paling populer
yang digunakan untuk penelitian laboratorium. Hal ini ditandai oleh kepala lebar,
telinga panjang, dan memiliki panjang ekor yang selalu kurang dari panjang
tubuhnya. Tikus Wistar lebih aktif (agresif) daripada jenis lain seperti tikus
Sprague dawley (Sirois, 2005). Klasifikasi Tikus putih (Rattus norvegicus)
menurut Krinke (2000) adalah sebagai berikut:
Kingdom : Animalia
Phylum : Chordata
Subphylum : Vertebrata
Class : Mammalia
Order : Rodentia
Family : Muridae
Genus : Rattus
Species : norvegicus
Gambar 2.2 Hewan Coba Tikus Rattus norvegicus (Pollock, 2010)
14
Tikus putih memiliki beberapa sifat yang menguntungkan sebagai hewan
uji penelitian di antaranya perkembangbiakan cepat, mempunyai ukuran yang
lebih besar dari mencit, mudah dipelihara dalam jumlah yang banyak. Tikus putih
juga memiliki ciri-ciri morfologis seperti albino, kepala kecil, dan ekor yang lebih
panjang dibandingkan badannya, pertumbuhannyacepat, temperamennya baik,
kemampuan laktasi tinggi, dan tahan terhadap arsenik tiroksid.
Tikus (Rattus norvegicus) merupakan hewan yang umum digunakan dalam
penelitian, karena mudah dipelihara, secara garis besar fungsi dan bentuk organ
serta proses biokimianya antara tikus dan manusia memiliki banyak kesamaan
(Suckow et al., 2006). Tikus (Rattus norvegicus) galur Wistar lebih besar dari
famili tikus umumnya dimana tikus ini dapat mencapai 40 cm diukur dari hidung
sampai ujung ekor dan berat 140-500 gram. Tikus betina biasanya memiliki
ukuran lebih kecil dari tikus jantan dan memiliki kematangan seksual pada umur 4
bulan dan dapat hidup selama 4 tahun (Kusumawati, 2004).
2.4 Struktur Histologi Jantung
2.4.1 Anatomi Jantung
Jantung terletak dalam ruang mediastinum rongga dada, yaitu di antara
paru. Secara fungsional, jantung terdiri atas dua pompa yang terpisah, yakni
jantung kanan yang memompakan darah ke paru dan jantung kiri yang
memompakan darah ke organ-organ perifer. Selanjutnya, setiap bagian jantung
yang terpisah ini merupakan dua ruang pompa yang dapat berdenyut, yang terdiri
atas satu atrium dan satu ventrikel (Gambar 2.3) (Susilaningsih, 2006).
15
Efisiensi jantung sebagai pompa bergantung pada nutrisi dan oksigenasi
otot jantung melalui sirkulasi koroner. Sirkulasi ini meliputi seluruh permukaan
epikardium jantung, membawa nutrisi dan oksigen ke miokardium melalui
cabang-cabang intramiokardial yang kecil-kecil (Eroschenko, 2003). Berkaitan
dengan oksigenasi dan nutrisi, maka berhubungan erat dengan otot jantung.
Jantung terdiri atas tiga tipe otot jantung yang utama yakni: otot atrium, otot
ventrikel, dan serat otot khusus penghantar rangsangan dan pencetus rangsangan.
Tipe atrium dan ventrikel berkontraksi dengan cara yang sama seperti otot rangka,
hanya saja lamanya kontraksi otot-otot tersebut lebih lama. Sebaliknya, serat-serat
khusus penghantar dan pencetus rangsangan berkontraksi dengan lemah sekali
sebab serat-serat ini hanya mengandung sedikit serat kontraktif (Susilaningsih,
2006).
Gambar 2.3 Anatomi Jantung Tikus (Jacob, 2000)
16
2.4.2 Histologi Jantung
Jantung terdiri dari tiga lapisan. Lapisan terluar (epikardium), lapisan
tengah yang merupakan lapisan otot (miokardium), dan lapisan yang terdalam
adalah lapisan endotel (endokardium) (Susilaningsih, 2006).
a. Epikardium
Lapisan ini merupakan bagian visceral dari kantong perikardium yang
membungkus jantung sebagai suatu membran serosa yang tipis. Membran ini
terdiri atas selapis sel-sel mesotel dan lapisan jaringan ikat. Epikardium terikat
pada miokardium dengan suatu lapisan jaringan ikat longgar vaskuler yaitu
lapisan subepikardium (Janqueira, 1997).
b. Miokardium
Lapisan miokardium mirip lapisan tunika media pembuluh darah. Lapisan
ini tersusun oleh berkas-berkas otot jantung yang saling melilit. Otot-otot jantung
tersusun dalam lembaran-lembaran yang membungkus ventrikel dan atrium
dengan membentuk spiral. Miokardium ventrikel hanya memiliki sedikit serat
elastis, sedangkan di atrium terdapat banyak jala-jala serat elastis di antara serat
otot. Jaringan ikat interstitial miokardium berisi serat retikulum (Janqueira, 1997).
c. Endokardium
Endokardium membatasi permukaan dalam atrium dan ventrikel. Lapisan
ini paling tebal di atrium sehingga permukaan dalam atrium lebih pucat dari pada
ventrikel. Endokardium akan melanjutkan ke tunika intima pembuluh darah yang
keluar dan masuk ke jantung. Lapisan ini terdiri atas lapisan sel-sel endotel yang
gepeng berbentuk poligonal, terletak di atas lamina basalis yang tipis. Selanjutnya
17
lapisan jaringan ikat subendotel yang relatif tebal tersusun oleh sejumlah serat
kolagen dan serabut elastis dan berkas sel otot polos. Pada subendokardium, di
bawah lapisan subendotel, terdiri dari jaringan ikat longgar yang mengikat
endokardium pada miokardium yang terletak di bawahnya. Lapisan ini juga
mengandung pembuluh darah, saraf, dan cabang-cabang sistem penghantar ke
jantung, bercampur dengan jaringan lemak (Janqueira, 1997).
Serat otot jantung memiliki beberapa ciri yang juga terlihat pada otot
rangka. Perbedaannya adalah otot jantung terdiri atas sel-sel yang panjang,
terdapat garis-garis melintang di dalamnya,bercabang tunggal, terletak paralel satu
sama lain, dan memiliki satu atau dua inti yang terletak di tengah sel (Gambar
2.4). Di sekitar inti terdapat daerah terang tanpa fibril yang disebut sarkoplasma
perinuklear. Pada potongan melintang, sarkoplasma perinuklear jantung tampak
sebagai ruang terang jika irisan tidak melalui inti. Juga terlihat myofibril jantung
pada potongan melintang. Satu ciri khas untuk membedakan otot jantung adalah
diskus interkalatus. Diskus iniadalah struktur berupa garis-garis gelap melintang
yang melintasi rantai-rantai otot jantung, yang terpulas gelap, ditemukan pada
interval tak teratur pada otot jantung, dan merupakan kompleks tautan khusus
antar serat-serat otot yang berdekatan (Eroschenko, 2003).
18
Gambar 2.4 Gambaran Histologi Normal Otot Jantung Tikus(Kuenhel, 2003)
Sel otot jantungn memiliki satu inti yang terletak di tengah dengan dua
atau lebih anak inti, dan sarkoplasma yang mempunyai struktur kontraktil, yang
dibentuk oleh miofibril. Sel-sel otot jantung ini dipisahkan dan dihubungkan satu
sama lain oleh sebuah membran sel yang disebut diskus interkalatus. Sel otot
jantung dibungkus oleh sarkolema yang memiliki membrana basement atau
ektraseluler membran yang berhubungan dengan pembuluh darah dan ruang
interstitium melewati matrik kolagen atau jaringan kolagen fibrillar. Permukaan
dari miosit ini terdiri atas tiga lapis unit membran yang khas, yang dibentuk oleh
selapis biomolekular hydrophobic lipid pada bagian tengah dan dua lapis
eksterna protein plus hydrophobic lipid (Guyton, 1995).
19
Gambar 2.5 a : Histologi normal otot jantung tikus, b: Histopatologi otot jantung
tikus hasil paparan asap rokok (Palyoga, 2014)
Pemaparan asap rokok akan menyebabkan kestabilan metabolisme jaringan
rusak dan memicu aktivasi makrofag. Jaringan otot jantung yang tidak stabil
disebabkan oleh radikal bebas. Radikal bebas berikatan dengan lipid, protein dan
DNA. Ikatan radikal bebas dengan lipid menyebabkan sel dehidrasi, sel kaku dan
ruptur (Palyoga, 2014) (Gambar 2.5).
2.5 Tumor Nekrosis Faktor Alfa (TNF- α)
Tumor Nekrosis Faktor Alfa atau sering dikenal TNF-α adalah molekul
pleitropik yang disekresikan terutama oleh makrofag yang teraktivasi dan sel T,
molekul ini juga dapat dihasilkan oleh sel-sel lain seperti sel mast, sel NK,
neutrofil, sel endotel, sel otot jantung, sel otot polos, fibroblast, dan osteoklas
(Fiers, 1991). Pembentukan terjadi sebagai respon terhadap rangsangan bakteri,
virus dan sitokin granulocyte (Palladino, 2003).
Efek biologis TNF-α sebagai protein immunomodulator (memodulasi
pertumbuhan dan difrensiasi sel B dalam produksi antibodi), mengaktifkan
makrofag dan monosit, merangsang hemapoitis, sitotoksik dan sitostatik langsung
20
terhadap berbagai tahap pertumbuhan sel tumor. Sitokin-sitokin proinflammantory
TNF-α dapat digunakan sebagai indikator bahwa sel mengalami stres oksidatif,
apoptosis, atau nekrosis (Park, et al., 1994). Umumnya, rokok akan lebih
difokuskan pada peran nikotin dan karbon monoksida. Kedua-dua bahan ini,
selain meningkatkan kebutuhan oksigen, juga mengganggu suplai oksigen ke otot
jantung sehingga akhirnya merugikan kerja otot jantung.
Nikotin mengganggu sistem saraf simpatis dengan akibat meningkatnya
kebutuhan oksigen otot jantung. Selain menyebabkan ketagihan merokok, nikotin
juga merangsang pelepasan adrenalin, meningkatkan frekuensi denyut jantung,
serta menyebabkan gangguan irama jantung. Nikotin turut mengaktifkan
trombosit dengan akibat timbulnya adhesi trombosit (penggumpalan) ke dinding
pembuluh darah. Karbon monoksida menimbulkan desaturasi hemoglobin,
menurunkan langsung persediaan oksigen untuk jaringan seluruh tubuh termasuk
ke otot jantung. Karbon monoksida menggantikan tempat oksigen di hemoglobin,
mengganggu pelepasan oksigen dan mempercepat arterosklerosis. Dengan
demikian, karbon monoksida menurunkan kapasitas latihan fisik, meningkatkan
viskositas darah, sehingga mempermudah penggumpalan darah (Jaya, 2009).
21
21
21
BAB 3 KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESA PENELITIAN
3.1 Kerangka konseptual
Gambar 3.1 Kerangka Konseptual
Keterangan :
Sirkulasi darah
Kerusakan Permeabilitas
Membran Sel
Peroksidasi Lipid
Stres oksidatif
Asap
rokok
Ekstrak Etanol
Propolis Lebah
Trigona sp
Perubahan Histologi
jantung
Tikus (Rattus
norvegicus)
Jantung
Sitokin pro-inflamasi
(TNF-α)
)
Sistem respirasi
: Pengaruh Ekstrak Etanol Propolis
: Pengaruh Paparan Asap rokok
: Parameter yang diamati
: Menghambat
Radikal Bebas
ROS
22
Propolis mengandung flavonoid dengan sisi aktif CAPE (Caffeid Acid
Phenethyl Ester). Flavonoid mempunyai potensi sebagai antioksidan serta anti
inflamasi. Antioksidan dapat melindungi komponen lipid, protein dan asam
nukleat seluler dari kerusakan stress oksidatif yang diinduksi oleh radikal bebas.
Sisi aktif flavonoid adalah CAPE yang bekerja untuk memaksimalkan aktivitas
penangkapan terhadap radikal bebas dengan cara menurunkan aktivitas radikal
hidroksil (OH-) sehingga tidak terlalu reaktif lagi.
Paparan asap rokok diberikan 2 batang perhari per kandang selama 14
hari. Paparan asap rokok akan terhirup oleh tikus dan masuk ke dalam saluran
pernafasan. Asap rokok dibedakan menjadi dua yaitu fase gas seperti nitrogen
monoksida (NO) yang akan menjadi radikal bebas apabila teroksidasi, dan fase
partikulat seperti nikotin, tar, benzipren, dibensokarbol dan logam. Fase partikulat
akan masuk ke peredaran darah melalui alveoli paru. Radikal bebas tersebut akan
diedarkan ke seluruh tubuh oleh jantung melalui aliran darah. Molekul utama di
dalam tubuh yang dirusak oleh radikal bebas adalah DNA, lemak dan protein.
Radikal bebas masuk ke organ jantung melalui pembuluh darah yaitu arteri
koroner. Arteri koroner berfungsi memberikan darah ke jantung, memberikan
kelangsungan penyediaan oksigen dan nutrisi yang dibutuhkan oleh jantung.
Akumulasi radikal bebas mengakibatkan stres oksidatif (ROS). Pada kondisi stres
oksidatif radikal bebas akan menyebabkan terjadinya peroksidasi lipid membran
sel dan merusak organisasi membran sel. Membran sel ini sangat penting bagi
fungsi enzim sehingga terjadinya peroksidasi lipid membran sel oleh radikal bebas
dapat menyebabkan hilangnya fungsi seluler pada organ jantung.
23
Ketidakseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan dapat menyebabkan
kerusakal sel jantung, dimana jumlah radikal bebas lebih banyak dibandingkan
antioksidan seluler.
Akumulasi radikal bebas di organ jantung menstimulasi aktivasi dari sel
monosit, sel netrofil dan sel T. Sel-sel tersebut akan infiltrasi ke jaringan jantung
menjadi makrofag. Makrofag akan merangsang sekresi sitokin pro-inflamasi salah
satunya adalah TNF-α. Produksi TNF-α yang berlebih pada sel akan
menyebabkan adanya agregasi dan aktivitas neutrofil serta pelepasan enzim
protease yang menyebabkan kerusakan jaringan jantung.
Pada penelitian ini hewan model paparan asap rokok diberi Ekstrak
Etanol propolis lebah Trigona sp yang mengandung flavonoid Caffeic Acid
Phenethyl Ester (CAPE) sebagai antioksidan dengan cara menangkap radikal
hidroksil dan superoksida kemudian menetralkan radikal bebas sehingga
melindungi sel, mempertahankan keutuhan stuktur sel dan jaringan. Pemberian
ekstrak propolis dapat menurunkan ekspresi TNF-α dan menghambat kerusakan
sel jantung yang dapat terlihat secara histopatologis.
3.2 Hipotesis Penelitian
Dari rumusan permasalahan, maka hipotesi dari penelitian ini adalah
sebagai berikut :
1. Pemberian terapi preventif ekstrak etanol propolis lebah Trigona sp mampu
menghambat peningkatan ekspresi TNF- α pada jantung tikus putih jantan
(Ratus novergicus) yang diberi paparan asap rokok.
24
2. Pemberian terapi preventif ekstrak etanol propolis lebah Trigona sp mampu
mencegah kerusakan histopatologi jantung pada tikus putih jantan (Rattus
novergicus) yang diberi paparan asap rokok.
25
25
25
25
BAB 4 METODE PENELITIAN
4.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan April-Juni 2016 di Laboratorium Sentral
Ilmu Hayati, Laboratorium Biokimia Universitas Brawiaya Malang dan
Laboratorium Farmakologi Kedokteran UMM. Pengujian fitokimia propolis lebah
Trigona sp dilakukan di Laboratorium Kimia Analitik Politeknik Negeri Malang.
4.2 Materi Penelitian
4.2.1 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu propolis lebah Trigona sp
yang berasal dari peternakan lebah di Lawang, Kabupaten Malang, tikus putih
jantan (Rattus norvegicus) galur Wistar dengan bobot badan 150-200 gram dan
berumur 8-12 minggu sebanyak 24 ekor, pakan tikus, aquadest, etanol 70%, NaCl
fisiologis 0,9%, formalin 10%, alkohol 70%, Larutan PBS (Phospat Buffer
Saline), 15µl RSB (Reducting Sample Buffer), staining, E-PURE, Tween 80,
antibodi primer (antiRat TNF- α), antibodi nsekunder berlabel biotin (Goat Anti
Rat biotin labeled), PFA 10%, Hidrogen peroksida (H2O2) 3%, BSA 5%, Sterp
Avidin Horse Radish Peroxidase (SA-HRP), diamino benzidine (DAB),
Hematoxylin, Eosin dan xylol.
4.2.2 Alat Penelitian
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu kandang pemeliharaan
hewan coba, kandang kaca dengan smoke pump, beker glass, gelas obyek, gelas
ukur, tabung reaksi, erlenmeyer, spuit oral atau sonde 1 mL, alat bedah,
26
mikroskop cahaya, mikropipet, pipet tetes, pengaduk, penangas air, scanner,
timer, lemari pendingin, tabung polipropilen, autoclave.
4.3 Sampel Penelitian
Hewan model yang digunakan dalam penelitian ini yaitu tikus jantan (Rattus
norvegicus) strain wistar dengan bobot tikus antara 150-200 gram dan berumur 8-
12 minggu. Hewan coba diaklimatisasi terlebih dahulu selama tujuh hari dengan
pemberian ransum basal standar Association of Analytical Communities (AOAC)
(2005). Aklimatisasi bertujuan untuk penyesuaian hewan coba terhadap kondisi
laboraturium. Penelitian ini bersifat eksperimental menggunakan Rancangan Acak
Lengkap (RAL) dengan estimasi sampel dihitung berdasarkan rumus
(Kusriningrum, 2008):
p (n-1) ≥ 15
p (n-1) ≥ 15
5 (n-1) ≥ 15
5n-5 ≥ 15
5n ≥ 20
n ≥ 20/5
n ≥ 4
Keterangan dari rumus di atas yaitu jumlah kelompok perlakuan
disimbolkan dengan huruf p, sedangkan jumlah ulangan yang diperlukan
disimbolkan dengan huruf n. Berdasarkan perhitungan diatas, maka lima jenis
kelompok perlakuan akan memerlukan jumlah ulangan minimal dalam setiap
kelompok yaitu empat kali.
27
4.4 Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan metode Rancang Acak Lengkap (RAL) dan
bersifat eksperimental. Perhitungan dosis terapi yang diberikan merujuk pada
penelitian sebelumnya yang telah dilakukan oleh Radiati (2008) untuk
mengetahui pengaruh ekstrak propolis terhadap sistem kekebalan seluler. Hewan
coba dibagi menjadi lima kelompok perlakuan yaitu :
K (-) : Tikus tidak diberikan Propolis dan paparan asap rokok
K (+) : Tikus diberikan paparan asap rokok 2 batang/hari/kandang pada
hari ke-15 sampai hari ke-28
P1 : Tikus diberikan propolis 10mg/200gBB/hari pada hari ke-8
sampai hari ke-28 dan paparan asap rokok 2 batang/hari/kandang
pada hari ke-15 sampai hari ke-28
P2 : Tikus diberikan propolis 20mg/200gBB/hari pada hari ke-8
sampai hari ke-28 dan paparan asap rokok 2 batang/hari/kandang
pada hari ke-15 sampai hari ke-28
P3 : Tikus diberikan propolis 30mg/200gBB/hari pada hari ke-8
sampai hari ke-28 dan paparan asap rokok 2 batang/hari/kandang
pada hari ke-15 sampai hari ke-28
28
Tabel 4.1 Rancangan Kelompok Penelitian
Variabel yang diamati
Profil protein dan Histopatologi sel-sel
jantung
Ulangan
1 2 3 4
Kelompok kontrol negatif (K-)
Kelompok kontrol positif (K+)
Kelompok preventif 10mg/200gBB/hari (P1)
Kelompok preventif 20mg/200gBB/hari (P2)
Kelompok preventif 30mg/200gBB/hari (P3)
4.5 Variabel Penelitian
Variable yang dapat diamatai pada penelitian ini yaitu :
Variabel bebas : Ekstrak propolis Trigona sp dan paparan asap rokok
Variabel tergantung : Gambaran histopatologi jantung dan ekspresi TNF- α
jantung
Variabel kendali : Jenis kelamin tikus, berat badan tikus, dan umur tikus,
pakan, suhu dan kandang
4.6 Tahapan Penelitian
4.6.1 Persiapan Hewan Percobaan
Tikus diaklimatisasi selama tujuh hari agar dapat beradaptasi dengan
lingkungan baru. Pakan yang diberikan adalah ransum basal dengan komposisi
serat (5%), protein (20%), dan lemak (5-10%). Pakan diberikan satu kali setiap
hari dan diberikan minum secara adlibitum. Tikus dibagi menjadi 5 kelompok
29
perlakuan yang terdiri dari 5 ekor tikus pada setiap kelompok. Tikus dipelihara
pada kandang berukuran 17.5 x 23.75 x 17.5 dengan suhu optimum ruangan tikus
22-24o C dan kelembaban 50-60%.
4.6.2 Pembuatan Ekstrak Etanol Propolis
Ekstraksi adalah metode untuk mengambil zat-zat yang terkandung dalam
suatu campuran menggunakan pelarut yang sesuai (Khopkar, 2002). Pelarut yang
diperbolehkan yaitu air, etanol, atau campuran keduanya. Etanol adalah pelarut
yang paling sering digunakan karena mampu melarutkan zat yang bersifat polar,
semipolar, non polar, mampu mengendapkan protein dan menghambat kerja
enzim sehingga menghambat proses hidolisi dan oksidasi serta sifatnya yang tidak
beracun (Harborne, 1987). Pelarut etanol juga memberikan efekaktifitas
antioksidan propolis yang tertinggi dengan flavonoid yang terekstrak diantaranya
yaitu kemferida (flavonol), akaseton (flavon) dan isoramnetin (Mahasaru dan
Kun, 1998).
Pengambilan sampel diawali dengan pembuatan rendemen propolis yang
berasal dari propolis kasar (Radiati, 2008). Menurut Krell (1996) pembuatan
ekstrak etanol propolis memerlukan perbandingan propolis dengan etanol yaitu
1:10. Alat yang digunakan yaitu Thermostirer berkecepatan 150 rpm selama 4 jam
dibantu dengan Magnetic Stirrer 5 cm. Hasil yang diperoleh disaring
menggunakan kertas saring hingga diperoleh filtrat propolis. Filtrat tersebut
diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu ± 70o C berkecepatan 2-3 rpm
untuk memisahkan filtrat dari pelarut. Rendemen propolis dihitung untuk
membuat dosis kemudian ditambahkan dengan tween 80 sebagai pengemulsi dan
30
diencerkan dengan E-pure dari hasil pemurnian akuades. Hal ini dilakukan karena
rendemen propolis bersifat lengket. Hewan coba kemudian diberi rendemen
secara peroral (Radiati, 2008).
4.6.3 Uji Flavonoid Propolis Trigona sp
Sampel propolis sebanyak 0,3 mL diencerkan menggunakan dengan
perbandingan 1 :2 kemudian dicampur dengan methanol sebanyak 1,5 mL dan
dipanaskan pada suhu 50o C selama 5 menit. Larutan tersebut diambil sebanyak 5
tetes dan ditambahkan dengan 5 tetes asam sulfat pekat. Sampel yang
mengandung flavonoid ditunjukkan dnegan terbentuknya warna merah (Harborne,
1987).
4.6.4 Dosis Ekstrak Propolis Trigona sp
Lethal dosage (LD50) merupakan dosis yang dapat mematikan separuh
hewan percobaan. Pada tikus LD50 propolis yang diberikan secara peroral
mencapai 8000-40.000 mg/kg (Burdock, 1997). Hardianty (2011) menyatakan
10.000 mg propolis setara dengan 7 ons propolis sekali konsumsi pada manusia
dengan berat badan 70 kg. Penelitian ini menggunakan dosis ekstrak propolis
Trigona Sp yaitu 100 mg/Kg BB (Radiati, 2008). Propolis sangat aman
dikonsumsi karena kenyataannya dimasyarakat konsumsi propolis hanya 1 – 2
tetes dalam segelas air. Kelompok P1, P2, dan P3 pada penelitian ini diberikan
propolis dengan dosis sesuai perhitungan pada lampiran 5 yaitu 10 mg/200g/hari
20 mg/200g/hari dan 30 mg/200g/hari.
4.6.5 Pemberian Ekstrak Etanol Propolis
Cara pemberian ekstrak propolis menurut Ngatidjan (2006) pada tikus
31
putih jantan (Rattus norvegicus) galur Wistar yaitu dipegang leher bagian
belakang dengan tangan kiri sehingga kulit itu terjepit ibu jari dan jari telunjuk.
Pegangan diperkuat dengan jepitan pangkal ibu jari dengan ibu jari lainnya
pada kulit punggung dan ekor dikaitkan dengan kelingking tangan kiri tersebut.
Tangan kanan memegang sonde yang berisi bahan uji yaitu ekstrak propolis
lebah Trigona sp. Sonde dimasukan sampai ke lambung secara hati-hati dan
dipastikan tepat masuk ke lambung .
4.6.6 Paparan Asap Rokok
Pelakuan pertama pada tikus adalah pemberian paparan asap rokok.
Langkah pemaparan yaitu asap rokok dimasukkan dalam kotak kaca
menggunakan smoking pump hingga memenuhi kotak (Sulanda, 2014).
Pemaparan asap rokok dilakukan pada kelompok kontrol positif dan kelompok
perlakuan terapi dengan 2 batang rokok per kelompok setiap hari selama 14 hari
(Hardi, 2014).
Tikus dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan secara acak. Kelompok
pertama adalah kelompok kontrol negatif (K-) yang masing-masing tikus tidak
diberi perlakuan apapun mulai hari ke-1 sampai hari ke-29. Kelompok kedua
adalah kelompok kontrol positif (K+) yang masing-masing tikus diberi paparan
asap rokok 2 batang sehari selama 14 hari tanpa diberi terapi propolis. Kelompok
ketiga adalah perlakuan 1 (P1) yang masing-masing tikus diberi paparan asap
rokok 2 batang sehari selama 14 hari dan diberi terapi propolis sebanyak
10mg/200g/hari yang dilarutkan dalam aquadest hingga volumenya 1 mL dan
diberikan secara peroral (PO) pada hari ke-8 sampai hari ke-29.
32
Kelompok keempat adalah perlakuan 2 (P2) yang masing-masing tikus
diberi paparan asap rokok 2 batang sehari selama 14 hari dan diberi terapi
propolis sebanyak 20mg/200g/hari dilarutkan dalam aquadest hingga volumenya 1
mL dan diberikan secara peroral (PO) pada hari ke-8 sampai hari ke-
29.Kelompok kelima adalah perlakuan 3(P3) yang masing-masing tikus diberi
paparan asap rokok 2 batang sehari selama 14 hari dan diberi terapi propolis
sebanyak 30mg/200g/hari dilarutkan dalam aquadest hingga volumenya 1 mL dan
diberikan secara peroral (PO) pada hari ke-8 sampai hari ke-29.
4.6.7 Pengambilan Organ Jantung
Pengambilan organ jantung dilakukan dengan nekropsi. Tikus didislokasi
selanjutnya tikus dilakukan pembedahan. Tikus diposisikan diatas papan bedah
dengan posisi terlentang, rambut dibagian perut dicukur dan dibersihkan dengan
kapas yang dibasahi air. Pembedahan dilakukan pada bagian abdomen
menggunakan gunting bengkok. Jantung terletak dalam ruang mediastinum
rongga dada yaitu di antara paru. Organ jantung diambil dan dibagi menjadi dua
bagian. Bagian kanan jantung dimasukkan ke dalam PBS untuk pengukuran kadar
MDA dan bagian kiri jantung dimasukkan ke dalam formaldehid 10% untuk
pembuatan preparat histopatologi (Wati dkk., 2013).
4.6.8 Pembuatan Preparat Histopatologi Jantung
Langkah-langkah pembuatan preparat histopatologi menurut Jusuf (2009)
yaitu fiksasi, dehidrasi, clearing, embedding, sectioning, pewarnaan HE dan
pengamatan preparat histopatologi. Fiksasi dilakukan untuk mengawetkan dan
mengeraskan jaringan setelah organ jantung diambil. Fiksasi dilakukan dengan
33
memasukkan sampel jantung dalam paraformaldehid 10%. Dehidrasi merupakan
tahapan untuk mengeluarkan air dari dalam jaringan tujuannya agar ruang-ruang
anter sel dalam jaringan dapat diisi dengan parafin. Dehidrasi menggunakan
alkohol secara bertingkat yaitu 90%, 95% dan absolute selama 20 menit dalam
suhu 4oC. Clearing merupakan tahap pengeluaran alkohol dari jaringan dan
menggantinya dengan xylol yang dapat berikatan dengan parafin.
Embedding merupakan proses pengeluaran cairan clearing agent dari
jaringan kemudian diganti dengan parafin. Jaringan jantung dicelupkan parafin
cair kemudian parafin akan memadat. Pembuatan preparat jantung hasil dari
tahap embedding dimasukkan pada penjepit (block holder) kemudian berlanjut
pada tahap sectioning yang diawali dengan mengatur ukuran ketebalan irisan yaitu
± 4µm. Hasil irisan kemudian dipindahkan menggunakan kuas ke air hangat 38-
40oC. Irisan tersebut diambil dengan gelas objek. Potongan dikeringkan dan
diletakan diatas hot plate 38-40 oC sampai kering kemudian dilakukan pewarnaan
hematoklin dan eosin atau dikenal dengan pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE).
Pewarnaan diawali dengan memasukkan preparat dalam xilol 1 dan 2
selama 5 menit yang disebut sebagai proses deparafinasi. Selanjutnya preparat
dimasukkan dalam etanol bertingkat dari etanol absolut, 95 %, 90%, 80 %, dan
70% selama 5 menit yang disebut sebagai proses rehidrasi. Setelah proses
rehidrasi, preparat direndam dalam aquades selama 5 menit kemudian dilakukan
pewarnaan hematoxylin selama 10 menit. Hasil pewarnaan dicuci selam 30 menit
dengan air mengalir dan dibilas dengan akuades selama 5 menit. Selanjutnya
dilakukan pewarnaan dengan eosin selama 5 menit dan dicuci kembali selama
34
10 menit dengan air mengalir serta dibilas dengan aquades selama 5 menit.
Setelah pewarnaan, dilakukan dehidrasi dengan memasukkan preparat pada
alkohol dari 80 %, 90 %, dan 95 % hingga alkohol absolut. Selanjutnya
dilakukan clearing dengan memasukkan xilol 1-3 selama 3 menit dan dikering
anginkan. Tahapan terakhir yaitu mounting (perekatan) menggunakan
entellan serta ditutup menggunakan cover glass. Hasil pembuatan preparat
histopatologi jantung dilakukan pembesaran mikroskop cahaya Olympus BX51
perbesaran lemah (100x) dilanjutkan perbesaran kuat (400x) untuk melihat adanya
perubahan histopatologi jantung berupa nekrosis secara kualitatif.
4.6.9 Pengukuran Ekspresi TNF-α Organ Jantung
Pengamatan Tumor Nekrosis Faktor Alfa (TNF-α) dalam jaringan otot
jantung akan tampak dengan warna coklat. Warna coklat menunjukkan adanya
reaksi inflamasi di sel otot jantung. Keberadaan TNF-α pada otot jantung diamati
menggunakan metode Imunohistokimia (IHK), dianalisis secara kualitatif dengan
cara membandingkan distribusi TNF-α pada sediaan histologi jantung kontrol
dengan perlakuan pada perbesaran 400x dengan mikroskop cahaya BX51, untuk
ekspresi TNF-α dilakukan pengamatan 5 bidang pandang menggunakan
mikroskop kemudian dilakukan penilaian rata-rata presentase area dengan
menggunakan program Immunoratio.
4.6.10 Analisis Data
Analisa data yang digunakan dalam penelitian yaitu histopatologi jantung
dengan analisa dekriptif dan ekspresi TNF-α jantung dengan analisa secara
kuantitatif. Data kuantitatif yang digunakan yaitu pemeriksaan ekspresi TNF-α
35
menggunakan uji ANOVA dengan taraf kepercayaan α = 0,05. Apabila terdapat
perbedaan nyata dilanjutkan uji Tukey α = 5%.
36
BAB 5 HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1 Efek Pemberian Ekstrak Etanol Propolis Lebah Trigona sp Terhadap
Ekspresi Tumor Nekrosis Faktor Alfa (TNF-α) Jantung Tikus Putih
(Rattus norvegicus) dengan Paparan Asap Rokok
Hasil ekspresi TNF-α (Gambar 5.1) menunjukan adanya spot warna coklat
pada jaringan organ jantung (Rattus norvegicus). Analisis kuantitatif ekspresi
TNF-α dilakukan menggunakan immunoratio dengan menghitung persen area
ekspresi TNF-α pada lima lapang pandang kemudian dilakukan analisis statistika
(One Way ANOVA) menggunakan program SPSS (p<0,05) dilanjutkan dengan uji
Tukey untuk menetukan perbedaan antara perlakuan (Lampiran 10).
Hasil pewarnaan imunohistokimia pada tikus kontrol negatif menunjukkan
ekspresi TNF-α (Gambar 5.1A). Adanya ekspresi TNF-α pada jaringan jantung
kelompok kontrol negatif adalah normal karena sitokin TNF-α secara alami
terdapat di dalam tubuh dalam jumlah relatif sedikit sebagai komponen imunitas.
Tumor Nekrosis Faktor Alfa (TNF-α) merupakan suatu sitokin yang dihasilkan
oleh leukosit yang berfungsi untuk merangsang dan mengaktifkan sistem imun
terhadap respon inflamasi, dimana dalam keadaan normal, antigen yang masuk
memicu reaktivitas imun pada imunitas nonspesifik maupun spesifik
(Baratawidjaja, 2004).
37
Gambar 5.1 Ekspresi Tumor Nekrosis Faktor Alfa (TNF-α) ( )pada jantung
tikus (Rattus norvegicus) perbesaran 400x.
Keterangan : (A) Tikus kontrol negatif (K-); (B) Tikus kontrol positif (K+); (C) Tikus
perlakuan 1 dosis 10mg/200g/hari (P1); (D) Tikus perlakuan 2 dosis 20mg/200g/hari (P2); (E) Tikus perlakuan 3 dosis 30mg/200g/hari (P3).
Ekspresi TNF-α pada hasil pewarnaan imunohistokimia jaringan jantung
kontrol positif menunjukkan ekspresi TNF-α yang lebih banyak dibandingkan
tikus kontrol negatif (Gambar 5.1B). Meningkatnya ekspresi TNF-α
B
A
C
E
D
38
mengindikasikan terjadinya inflamasi pada jantung tikus. Makrofag yang
teraktivasi akibat tingginya radikal bebas hasil paparan asap rokok menginduksi
sekresi protein yang dikenal dengan nama kemokin. Kemokin mempunyai
kemampuan merekrut sel-sel lain yang memiliki reseptor kemokin, seperti
neutrofil dan monosit dari sirkulasi darah menuju ke jaringan. Sitokin (TNF-α)
dan kemokin yang dihasilkan makrofag sebagai respon terhadap adanya radikal
bebas mengawali proses inflamasi. Terjadinya inflamasi akan direspon oleh
tubuh melalui sekresi sel-sel radang seperti neutrofil, basofil, eosinofil dan
limfosit. Sel radang yang lebih dahulu muncul ketika terjadi inflamasi adalah
neutrofil yang berfungsi untuk memfagosit sel, namun apabila infiltrasi neutrofil
terlalu banyak pada jaringan justru dapat menyebabkan kerusakan karena neutrofil
mampu memproduksi enzim protease (Butterfield et al., 2006).
Akumulasi radikal bebas yang berlebihan menyebabkan ketidakseimbangan
jumlah radikal bebas dengan antioksidan sehingga menimbulkan stress oksidatif.
Stress oksidatif menyebabkan sel-sel tidak stabil. Sel-sel tidak stabil diakibatkan
ikatan antara radikal bebas dengan bagian-bagian sel yang memiliki ikatan lemah
seperti lipid termasuk pada sel otot jantung. Ikatan antara radikal bebas dan lipid
pada membran sel menyebabkan peroksidasi lipid (lemak). Peroksidasi lipid
adalah kerusakan oksidatif pada lipid yang mengandung ikatan karbon rangkap
sehingga sel otot jantung menjadi rusak. Sel otot jantung yang rusak akan
melepaskan faktor kemotatik sitokin (kemokin) sehingga sel fagosit bisa
melakukan fagositosis (Baratawidjaja, 2004). Radikal bebas akan menyebabkan
terjadinya peroksidasi lipid membran sel. Peroksida-peroksida lipid akan
39
terbentuk dalam rantai yang semakin panjang dan dapat merusak organisasi
membran sel (Sikka et al., 1995). Peroksidasi ini akan mempengaruhi fluiditas
membran, cross-linking membran, serta struktur dan fungsi membran (Power and
Jackson, 2008).
Tabel 5.1 Rataan Ekspresi TNF-α Jantung Tikus
Kelompok Rata-Rata
Ekspresi TNF-α
(%)
Ekspresi TNF-α
Peningkatan
(%)
Penurunan
(%)
Kelompok A
(kontrol negatif)
32,75±1,62a
-
-
Kelompok B
(kontrol positif)
59,07±2,67d
44,5
-
Kelompok C
(Perlakuan 1)
52,70±2,17c
-
10,7
Kelompok D
(Perlakuan 2)
40,77±1,03b - 30,9
Kelompok E
(Perlakuan 3)
36,02±0,59a - 39,0
Analisis uji one way ANOVA menunjukkan bahwa pemberian ekstrak etanol
propolis (EEP) lebah Trigona sp dapat mencegah peningkatan ekspresi TNF-α
secara signifikan (p<0,05), hal ini ditunjukkan dengan notasi yang berbeda antar
perlakuan dengan uji lanjutan Tukey (Tabel 5.1). Pada kelompok kontrol positif
berbeda signifikan (p<0,05) dengan kelompok kontrol negatif. Hal ini
menunjukkan bahwa pemberian paparan asap rokok mampu meningkatkan
ekspresi TNF-α sebagai salah satu sitokin proinflamasi yang mampu
Keterangan: Notasi a,b,c,d dan e menunjukkan perbedaan nyata antar perlakuan
(P<0,05).
40
menyebabkan inflamasi jaringan. Kelompok kontrol positif mengalami
peningkatan ekspresi TNF-α sebesar 44,5% karena asap rokok mengandung
bahan-bahan yang bersifat toksik yaitu zat-zat radikal bebas, diantaranya adalah
peroksinitrit, hidrogen peroksida, dan superoksida. Ketidakseimbangan antara
produksi radikal bebas dan zat antioksidan dalam tubuh dapat meningkatkan
produksi TNF-α sebagai akibat reaksi sistem imun dalam tubuh.
Hasil analisa secara statistika menggunakan One-Way ANOVA menunjukkan
bahwa pemberian ekstrak etanol propolis (EEP) lebah Trigona sp (p<0,05)
memberi pengaruh yang berbeda nyata antar perlakuan sebagaimana ditunjukkan
pada Tabel 5.1, perhitungan statistika secara lengkap dapat dilihat pada
Lampiran 10. Perbedaan yang signifikan (p<0,05) untuk kelompok perlakuan 1,
2, dan 3 dengan kelompok kontrol positif menunjukkan bahwa terapi tersebut
mampu mencegah peningkatan ekspresi TNF-α. Rendahnya ekspresi TNF-α pada
kelompok C/perlakuan 1 sebesar 10,7% dibanding kontrol positif, ekspresi TNF-
α pada kelompok D/perlakuan 2 sebesar 30,9% dibanding kontrol positif,
sedangkan pada kelompok E/perlakuan 3 menunjukkan ekspresi paling rendah
yaitu sebesar 39,0% dibanding kontrol positif (Tabel 5.1).
Ekspresi TNF-α yang lebih rendah dari kontrol positif menunjukkan adanya
pencegahan inflamasi paska pemberian ekstrak etanol propolis (EEP) lebah
Trigona sp yang mengandung flavonoid yang berfungsi sebagai antioksidan.
Antioksidan merupakan senyawa aktif yang berperan untuk menghambat reaksi
oksidasi dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif sehingga
kerusakan sel dapat dihambat (Andayani et al.,2008). Tubuh secara alami
41
memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal bebas secara
berkelanjutan, namun jika jumlah radikal bebas dalam tubuh berlebih maka
dibutuhkan antioksidan tambahan yang dapat diperoleh dari vitamin C, vitamin E,
flavonoid, dan karotin (Erguder et al., 2007).
Radikal bebas merupakan molekul yang mengandung elektron tidak
berpasangan pada orbit terluarnya. Elektron tidak berpasangan ini membuatnya
sangat reaktif. Oleh karena radikal bebas dapat menyerang molekul penting
seperti DNA, protein dan lipid dapat menyebabkan kerusakan yang signifikan.
Radikal bebas dapat dibentuk dalam berbagai macam reaksi seperti misalnya
fragmentasi, substitusi, oksidasi, addisi, dan reduksi.
Ekspresi TNF-α dengan dosis EEP perlakuan 1 (P1) 10mg/200g/hari,
perlakuan 2 (P2) dengan dosis EEP 20mg/200g/hari dan perlakuan 3 (P3) dengan
dosis EEP 30mg/200g/hari memiliki perbedaan yang signifikan (p<0,05) dengan
kelompok kontrol positif (K+) yaitu terjadi penurunan berturut-turut sebesar
10,7%, 30,9% dan 39,0% (Tabel 5.1).
Perbedaan yang signifikan (p<0,05) pada setiap perlakuan yaitu P1, P2 dan
P3 terhadap kontrol positif (K+) menunjukkan bahwa terdapat perbedaan
kandungan flavonoid yang memiliki sisi aktif CAPE (Caffeic Acid Phenethyl
Ester) di dalam masing-masing dosis pemberian EEP lebah Trigona sp. Pada
perlakuan 3 (P3) tidak berbeda signifikan dengan kontrol negatif (K-). Hal ini
menunjukkan bahwa pemberian EEP lebah Trigona sp dengan dosis 30mg/
tikus/hari merupakan dosis efektif untuk memberikan pengaruh terbaik terhadap
pencegahan kenaikan ekspresi TNF-α.
42
Propolis adalah produk lebah yang mengandung flavonoid tinggi yang
mempunyai efek antioksidan dan anti inflamasi yang kuat. Propolis mampu
menurunkan reaksi inflamasi melalui hambatan terhadap aktifitas TNF otak
setelah iskemia-reperfusi (Hartati, 2013). Ostrowska dan Skrzydlewska
menyebutkan bahwa propolis dapat menurunkan prostaglandin, leukotrin, sitokin
proinflamasi (TNF-α, interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8)), dan
meningkatkan interleukin-10 (IL-10) (30). Selain itu, studi menunjukkan bahwa
propolis menurunkan aktivitas Nitric oxyde synthase (NOS), caspase-3, nitric
oxide (NO), konsentrasi TNF-α dan kinase A (KA) yang diperantarai oleh jalur
eksitotoksisitas dan pelindung terhadap gangguan eksitotoksisitas (Prasetyyo,
2013).
Caffeic Acid Phenethyl Ester (CAPE) merupakan salah satu komponen yang
terkandung dalam propolis dan memiliki efek sebagai anti inflamasi, anti viral,
anti kanker, imunomodulator dan antioksidan dengan mekanisme menghambat
tiap produksi Reactive Oxygen Species (ROS). Caffeic Acid Phenethyl Ester
(CAPE) yang memiliki rantai OH akan mendonorkan satu atom hidrogen (H+)
kepada radikal bebas. Oleh karena itu radikal bebas di dalam tubuh akan menjadi
stabil. Radikal bebas di dalam tubuh yang stabil, akan mengurangi aktivitas
peroksidasi lipid pada membran sel, sehingga dapat mengurangi terjadinya
kerusakan sel (Slamet dkk., 2007). Menurut Hardianty (2011), bahwa CAPE
(Caffeic Acid Phenethyl Ester) sebagai salah satu bahan aktif dalam propolis juga
telah terbukti menghentikan pertumbuhan sel kanker, CAPE akan disimpan di
dalam plasma cukup lama. Kandungan CAPE yang tersimpan di dalam plasma
43
dapat meningkatkan antioksidan di dalam tubuh sehingga akan mampu mengatasi
tingginya radikal bebas akibat paparan asap rokok.
5.2 Histopatologi Jantung Tikus Putih (Rattus novergicus) Setelah Pemberian
Ekstrak Propolis dan Dipapar Asap Rokok
Pengamatan preparat histopatologi jantung dilakukan dengan
menggunakan mikroskop cahaya Olympus BX 51 melalui pembesaran 400x.
Pengambilan gambar histopatologi menggunakan kamera dilakukan setelah
mendapat gambar preparat yang diinginkan. Pembuatan preparat histopatologi
jantung dengan menggunakan perwarnaan Hematoksilin Eosin (HE). Pengamatan
yang diamati meliputi perubahan sel otot jantung. Hasil penelitian tentang
histopatologi jantung tikus putih (Rattus novergicus) yang diberi paparan asap
rokok menunjukkan perubahan pada bentukan sel otot jantung. Gambaran
histopatologi jantung pada masing-masing kelompok perlakuan dapat diamati
pada Gambar 5.2.
Histopatologi jantung dalam keadaan normal (Gambar 5.2A)
menunjukkan inti sel berwarna ungu gelap dan sitoplasma berwarna merah muda.
Histologi dari kelompok A dapat dijadikan sebagai acuan adanya perubahan dan
kerusakan yang terjadi pada kelompok lainya. Histologi otot jantung normal pada
tikus putih, sel otot jantung tampak normal, serabut otot jantung bercabang,
jaringan ikat terlihat jelas, nukleus sel otot jantung tampak normal berada di
tengah dan dikelilingi sitoplasma berwarna pucat (Bondan, 2014).
44
Gambar 5.2 Histopatologi preparat otot jantung tikus dengan pewarnaan HE
(perbesaran 400x)
Keterangan : (A) Tikus kontrol negatif (K-); (B) Tikus kontrol positif (K+); (C) Tikus Perlakuan 1 dosis 10mg/200g/hari (P1); (D) Tikus perlakuan 2 dosis
20mg/200g/hari (P2); (E) Tikus perlakuan 3 dosis 30mg/200g/hari
(P3).
A B
C D
E
45
Gambaran histopatologi dari kelompok kontrol positif (Gambar 5.2B)
menunjukkan adanya kerusakan sel otot jantung. Kerusakan pada sel yang
ditandai dengan bentuk susunan sitoplasma otot jantung yang rusak. Radikal
bebas yang berikatan dengan dengan membran sel akan membuat dinding sel
rusak sehingga terlihat sitoplasma rusak. Asap rokok mengandung nitrogen
dioksida dapat merusak membran memulai proses peroksidasi lipid, dapat
menyebabkan vasokontriksi. Nitrogen dioksida bereaksi dengan hidrogen
peroksida (H2O2) yang menghasilkan OH dan menyebabkan tidak dapat
berkombinasinya oksigen dengan molekul hemoglobin (Karen and Thomas,
2006). Karbon monoksida merupakan gas beracun yang dapat mengakibatkan
berkurangnya kemampuan darah membawa oksigen serta bahan-bahan lainnya
yang terkandung dalam rokok yang berbahaya dan merugikan bagi tubuh,
sehingga berakibat pada kematian sel karena kekurangan oksigen (Sukendro,
2007).
Gambaran histopatologi tikus perlakuan 1 (P1) atau pemberian ekstrak
etanol propolis lebah Trigona sp dosis 10mg/200g/hari menunjukkan bahwa sel
otot jantung terjadi kerusakan pada sel yang ditandai dengan bentuk susunan
sitoplasma otot jantung yang rusak (Gambar 5.2C). Pada tikus perlakuan 2 (P2)
atau pemberian ekstrak etanol propolis lebah Trigona sp dosis 20mg/200g/hari
terjadi penurunan kerusakan sel otot jantung yaitu bentuk susunan sitoplasma otot
jantung (Gambar 5.2D). Kerusakan sel jantung pada tikus perlakuan 2 (P2) lebih
ringan dibandingkan dengan tikus perlakuan 1 (P1). Hal ini menunjukkan bahwa
ekstrak etanol propolis lebah Trigona sp sudah mampu mencegah kerusakan yang
46
terjadi pada sel otot jantung namun belum efektif. Pada tikus perlakuan 3 (P3)
atau pemberian ekstrak etanol propolis lebah Trigona sp dosis 30mg/200g/hari
menunjukkan sedikit kerusakan pada sel otot jantung dan bentuk susunan
sitoplasma otot jantung lebih baik ( 5.2E). Hal ini tidak berbeda jauh dengan
histopatologi pada tikus kontrol negatif (K-) atau tikus yang tidak diberikan
perlakuan.
Kerusakan jaringan otot jantung akibat senyawa toksik ditandai dengan
banyaknya inti menyusut (piknotik) pada jantung sehingga mengakibatkan
perubahan fungsi dan struktur pada jantung (Bhara, 2001). Perubahan struktur sel
otot jantung akibat senyawa toksik yang dapat tampak pada pemeriksaan
mikroskopis antara lain radang, fibrosis, nekrosis dan degenerasi. Kerusakan sel
otot jantung pada perlakuan 1 (P1) (Gambar 5.2C), perlakuan 2 (P2) (Gambar
5.2D) dan perlakuan 3 (P3) (Gambar 5.2E) ditandai dengan adanya inti yang
terlihat ke tepi, inti keluar, rongga sel terlihat kosong diakibatkan karena sel
membengkak (Mufidah, 2011). Radikal bebas (OH) akan merusak tiga komponen
molekul utama dari sel-sel tubuh yaitu lipid, protein dan DNA. Kerusakan pada
lipid ditiap oksidasi dan pada proses dasar oksidasi DNA sel akan mengganggu
integritas sel, sehingga akan menimbulkan kematian pada sel (Halliwell and
Gutteridge, 1999).
Kerusakan sel jantung yang masih terdapat pada gambaran histopatologi
tikus perlakuan 1 (P1) (Gambar 5.2C), perlakuan 2 (P2) (Gambar 5.2D) dan
perlakuan 3 (P3) (Gambar 5.2E) kemungkinan dikarenakan CAPE (Caffeic acid
Phenethyl Ester) sebagai antioksidan belum mampu bekerja maksimal dalam
47
menstabilkan radikal bebas. Peningkatan Reactive Oxygen Species (ROS) di
dalam tubuh akibat tingginya radikal bebas dari asap rokok yaitu radikal hidroksil
(OH) menyebabkan peroksidasi lipid. Antioksidan yang belum mampu mengatasi
reaksi antara OH dengan rantai asam lemak tak jenuh (PUFA) akan menyebabkan
peroksidasi lipid terjadi secara terus-menerus sehingga masih terdapat kerusakan
pada membran sel. Kerusakan membran sel karena kehilangan atom H+ yang
diambil oleh radikal hidroksil berpengaruh terhadap struktur sel sehingga masih
terjadi kerusakan pada sel otot jantung.
Pada tikus perlakuan 3 (P3) menunjukkan bahwa kandungan CAPE di
dalam ekstrak etanol propolis lebah Trigona sp memberikan efek lebih baik
sebagai antioksidan sehingga dapat mencegah terjadinya kerusakan pada sel otot
jantung, karena CAPE mampu menstabilkan radikal bebas dengan mendonorkan
atom hidrogen (H+) yang dapat menurunkan proses peroksidasi lipid sehingga
mengurangi kerusakan sel (Slamet, 2007). Kandungan CAPE sebagai antioksidan
juga dapat menghambat produksi Reactive Oxygen Species (ROS) (Putri, 2014).
Produksi ROS yang dihambat akan menurunkan terjadinya stres oksidatif
sehingga peroksidasi lipid juga menurun dan akan mengurangi terjadinya
kerusakan pada membran sel sehingga sel otot jantung memiliki struktur yang
tidak berbeda jauh seperti pada kontrol negatif (K-).
Radikal bebas yang stabil menyebabkan radikal bebas tidak akan berikatan
dengan lipid, protein dan DNA pada sel otot jantung. Peroksidasi lipid sebagai
salah satu dampak akumulasi radikal bebas pada sel otot jantung tidak akan
terjadi. Sel otot jantung menjadi stabil dan kerusakan sel akibat radikal bebas
48
menurun. Penurunan jumlah sel yang rusak menurunkan aktivitas kerja makrofag
sehingga sekresi TNF-α menurun. Penurunan TNF-α menunjukkan bahwa
inflamasi pada jaringan jantung juga menurun (Palyoga, 2014).
Pemberian propolis sebagai antioksidan terbukti dapat mencegah
terjadinya peningkatan ROS. Kemampuan propolis sebagai antioksidan dapat
menangkap radikal hidroksi dan superoksida kemudian menetralkan radikal bebas
sehingga melindungi sel dan mempertahankan keutuhan struktur sel dan jaringan
serta dapat melindungi membran lipid. Propolis mengandung fenol yang
mempunyai daya antioksidan lebih poten dari vitamin C dan vitamin E, sehingga
dapat meredam reaksi rantai yang ditimbulkan ROS dengan baik (Prasetyo dkk,
2013).
49
49
BAB 6 PENUTUP
1.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat
disimpulkan bahwa:
1. Pemberian ekstrak etanol propolis lebah Trigona sp dapat mencegah
peningkatan ekspresi TNF-α jantung dan dosis efektif adalah
30mg/200g/hari.
2. Pemberian ekstrak etanol propolis lebah Trigona sp dapat mencegah
kerusakan sel otot jantung pada pengamatan histopatologi jantung.
1.2 Saran
1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai dosis efektif pemberian
ekstrak etanol propolis lebah Trigona sp dalam mencegah kerusakan sel
otot jantung dan organ lainnya yang diakibatkan paparan asap rokok.
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut agar ekstrak etanol propolis lebah
Trigona sp dalam mencegah peningkatan ekspresi TNF-α jantung dapat
diaplikasikan pada jenis hewan lainnya.
50
DAFTAR PUSTAKA
Adiyati PN. 2011. Ragam jenis ektoparasit pada hewan coba tikus putih (Rattus
norvegicus) galur Sprague dawley. Skripsi. Bogor: Fakultas Kedokteran
Hewan Institut Pertanian Bogor.
Adedayo, A.D., Tijani, A.A., Musa, A.A and Adeniyi, T.D. 2011. Histological
Study of Smoke Extract of Tobacco nicotiana on the Heart, Liver, Lungs,
Kidney, and Testes of Male Sprague-Dawley
Rats.<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3329088/> [6 Maret
2016]
Andayani, R., L. Yovita, dan Maimunah. 2008. Penentuan aktivitas antioksidan,
kadar fenolat total dan likopen pada buah Tomat (Solanum
lycopersicum l). J. Sains dan Teknologi Farmasi,13(1): 31-37.
AOAC.International. 2005. Officilals Methods Of Analysis Of AOAC
International. 2 vols. 16 editions. Arlington VA. USA. Association of
Analytical Community
Ardhie, Ari Muhandari. (2011). Radikal Bebas dan Peran Antioksidan dalam
Mencegah Penuaan.Medicinus 24 (1) pp. 4-9.
Baratawidjaja, K.G. 2004. Imunologi Dasar: Sitokin. Balai Penerbit Fakultas
Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta.128-131.
Bondan, Ade.2014. Pengaruh Tamoxifen Pada Jantung Tikus DuaBulan Pasca
Ovariektomi. Skripsi. Universitas Gadjah Mada:Yogyakarta.
Borrelli, F., Maffia, P., Pinto, L., Ianaro, A., Russo, A., Capasso, F., et al, 2002.
Phytochemical compounds involved in the anti-inflammatory effect of
propolis extract. Fitoerapia, 73: 53-63.
Burdock, G.A. 1998. Review of the Biological Properties and Toxicity of Bee
Propolis (Propolis). Food and Chemical Toxicology 36 : 347-363.
Butterfield,T.A. T.M. Best and M.A. Merrick. 2006. The Dual Roles of
Neutrophils and Macrophages in Inflammation : A Critical Balance
Between Tissue Damage and Repair. Journal of Athletic Training 41(4):
457-465.
Cadenas, E., and Packer, L. 2002. Expanded Caffeic Acid and Related Antioxidant
Compound: Biochemical and Cellular Effects. Handbook of Antioxidants.
Second edition. California : Marcel Dekker, Inc. p. 279-303
Cancerresearchuk. 2006. Cancer-causing Chemicals.
<http://www.cancerresearchuk.org/ healthyliving/smokeispoison/poisonous
moke/cancercausingchemicals/?a=5441> [15 November 2016]
51
Depkes RI, 2012. Kemampuan Advokasi, Mobilisasi Sosial, dan Komunikasi
Risiko Diperlukan Dalam Upaya Penanggulangan Rokok di Indonesia.
<http://depkes.go.id/index.php/component/content/article/43newsslider/181
-kemampuan-advokasi-mobilisasi-sosial-dankomunikasi-risiko diperlukan-
dalam-upaya-penanggulangan-rokok-di-indonesia.html> [Diakses tanggal
20 September 2016]
Erguder, B., A. Avci, E. Devrim, and I. Durak. 2007. Effects of Cooking
Techniques on Antioxidant Enzyme Activities of Some Fruits And
Vegetables. Turk. J. Med. Sci., 37(3): 151-156.
Eroschenko, V.P.2003. Atlas histologi di fiore dengan korelasi fungsional. Ed 9.
Jakarta : EGC, p.80-83.
Fauzan. 2003. Penentuan Kadar Nikotin dalam Asap Rokok. Jurnal Ekologi
Kesehatan 3 (2) : 273-274
GATS. 2011. Global Adults Tobacco Survey Indonesia Report 2011.New Delhi :
WHO Regional Office For South-East Asia
Gheldof N, Engeseth NJ. 2002. Antioxidant capacity of honeys from various
floral sources based on the determination of oxygen radical absorbance
capacity and inhibition of in vitro lipoprotein oxidation in humanserum
samples. J Agric Food Chem., 50: 3050-3055.
Gómez, C.A.M., Gómez, R.M., Arráez, R.D., Segura, C.A., Fernández, G.A.
2006.Advances in the analysis of phenolic compounds in products derived
from bees. J Pharmac Bio Anal 41:1220–34.
Guyton, A.C.1996. Fisiologi Manusia dan Mekanisme Penyakit. Andriano
P,penerjemah. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Human Physiology and
Mechanisms of Disease.
Harborne, J.B. 1987. MetodeFitokimia : Penenuntun Cara Modern Menganalisa
Tumbuhan. Penerjemah : K. Padmawinata. Terjemahan dari :
Phytochemical Methods. ITB Press : Bandung
Halliwell B and Gutteridge JMC. 1999. Free Radicals, other rective spesies and
disease. In free Radicals in Biology Medicine. New York: Oxford
University.
Hardi, R.M.,Agung, P.M.W., dan Aulanni’am. 2014. Pengaruh Terapi Rebusan
Akar Gantung Pohon Beringin (Ficus benjamina L.) terhadap Kadar
Malondialdehida (MDA) dan Profil Pita Protein Serum Tikus (Rattus
norvegicus) Hasil Papara Asap Rokok [Skripsi]. Program Kedokteran
Hewan. Universitas Brawijaya
52
Hardianty, D. 2011. Pemberian Ekstrak Propolis Peroral Menurunkan Kadar F2-
Isoprostan dalam Urin Tikus Putih (Rattus novergicus) Jantan Yang
Mengalami Aktivitas Fisik Maksimal [Thesis]. Program Studi Ilmu
Biomedik. Program Pascasarjana.Universitas Udayana. Denpasar
Hartati S.H, Sarsono, Aisyah S, dan Diding H.P. Ekstrak Etanol Propolis
Menurunkan Kadar IL-Serum pada Mencit Balb/C Model Asma Kronik.
Majalah Surgical Management of Acute Epidural Hematomas. Kedokteran
Bandung. 2013; 45(4): 213-217.
Indra, S. 2009. Aktivitas Antibakteri Mikrokapsulasi Propolis Trigona spp
Pandeglang Setelah Terpapar Cairan Rumen Sapi [Skripsi]. Institut
Pertanian Bogor
Janqueira, LC., Carneirro, J., Kelly, RO. 1997.Histologi Dasar. Ed 8. Jakarta:
EGC, P.198-204.
Jacob, S. 2000.Animal Anatomy: A Clinically-Orientated Approach. New York:
Churchill Livingstone, Inc.
Jaya, M., 2009. Pembunuh Berbahaya Itu Bernama Rokok. 1sted. Yogyakarta:
Riz’ma.
Jusuf, A.A. 2009. Histoteknik Dasar. Bagian Histologi.Fakultas Kedokteran
Universitas Indonesia. Jakarta.
Karen ES and Thomas M. 2006. Principles of Toxicology. 2nd edition. New York
Khopkar, S.M., 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI Press.
Krell, R. 1996. Value-Added Products From Beekeeping; FAO Agricultural
Services Bulltein No.124. Food and Agriculture Organization of the United
Nations Rome 1996. <www.fao.org/docrep.htm.> [11 September 2016]
Krinke, G. J. 2000. The Handbook of Experimental Animals The Laboratory Rat.
Academy Press, New York. Pp. 45-50, 295-296.
Kuenhel, Wolfgang.2003. Color Atls of Cytology, Hystology and Microscopic
Anatomy. Thieme Flexibook.
Kusumawati, D. 2004. Bersahabat dengan Hewan Coba. Gadjah Mada University
Press : Yogyakarta
Lofty,M. 2006. Biological Activity of Bee Propolis In Health And Diesease.
Asian Pac J. Cancer Prev. 7 (1) : 22-31
Mahasaru, I. and Kun Y.P. 1998. Preparation of water and ethanolic extract of
propolis and evaluation of the preparation.2Nd International electonic
Conference on Syntetic Organic Chemistry (ESOC-2).Unicamp.Brazil.
53
Mardjun, Y. 2012.Perbandingan Keadaan Tulang Alveolar Antara Perokok dan
Bukan Perokok.(Skripsi).Universitas Hasannudin. Makasar.
Mot, A.C., Damian, G., Sarbu, C., Silaghi, D.R., 2009. Redox Reactivity in
Propolis: Direct Detection of Free Radicals in Basic Medium and
Interaction with Hemoglobin. Department of Chemistry and Chemical
Engineering, 'Babes-Bolyai' University, Cluj-Napoca, Romania. Journal
Medicine Food. 14(6):267-74
Mufidah, Nurul. 2011. Pengaruh Pemberian Tepung Lumbricus rubellas
Terhadap Gambaran Histologi Hepar Dan Antioksidan Pada Serum Darah
Rattus novergicus Yang Terinfeksi Salmonella typhi. Skripsi. Malang:
Fakultas Sains Dan Teknologi Universitas Islam Negri Malang.
Muhibah,F.A.B. 2011.Tingkat Pengetahuan Pelajar Sekolah Menengah SainsHulu
Selangor Mengenaik Efek Rokok Terhadap Kesehatan.(KTI).Universitas
Sumatera Utara. Medan.
Nakajima, Y., Tsuruma, K., Shimazawa, M., Mishima.S., Hara, H. 2009.
Comparison of Bee Products Based on Assays of Antioxidant
Capacities.Nagaragawa Research Center. Department of Biofunctional
Evaluation, Molecular Pharmacology, Gifu Pharmaceutical University,
Japan. Journal BioMed Central Medicine 9 (4): 1472-6882
Ngatidjan, 2006. Metode Laboratorium dalam Toksikologi Cetakan Ke-1. Bagian
Farmakologi dan Toksikologi Fakultas Kedokteran UGM : Yogyakarta.
Orsatti C.L., 2010. Propolis Immunomodulatory Action in Vivo on Toll Like
Receptors 2 and 4 Expression and On Pro-inflammatory Cytokines
Production in Mice. Phytotherapy Res 24 (8) : 1141-6
Ostrowska J dan Skrzydlewska E. The Biological Activity of Flavonoids. Postępy
Fitoterapii. 2005; 3–4: 71–79
Palladino, A. 2003. Carotid Atherosclerosis is Associated With Inflammation and
Endhothelial Cell Adhesion Molecules in Chronic Haemodialysis Patients.
Neprol. Dial Transplant. 18: 113-119.
Palyoga, Habyb. 2014. Pengaruh Pemberian Ekstrak Biji Anggur (Vitis vinifera)
Terhadap Ekspresi Tumor Nekrosis Faktor Alfa (TNF-α) Dan Gambaran
Histopatologi Jantung Pada Hewan Model Tikus Putih (Rattus norvegicus)
Yang Diberi Paparan Asap Rokok. [Skripsi].Program Studi Kedokteran
Hewan. Fakultas Kedokteran Hewan. Universitas Brawijaya.
Powers SK and Jackson MJ (2008) Exercise-induced oxidative stress: Cellular
mechanisms and impact on muscle force production. Physiol Rev 88:1243
–1276.
Prasetyo D.H, Suparyanti EL, dan Guntur AH. Ekstrak Etanol Propolis Isolat
54
Menurunkan Derajat Inflamasi dan Kadar Malondialdehid pada Serum
Tikus Model Sepsis. Majalah Kedokteran Bandung. 2013:45(3):161-166.
Price SA, Wilson LM. 2006. Patofisiologi Edisi VI Volume 1. Jakarta : EGC.
Putri, M. D. 2014. Caffeic Acid Phenethyl Ester (CAPE) Propolis dan Matrix Metalloproteinase 8 (MMP-8) dalam Proses Inflamasi [Skripsi]. Makassar : Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Hasanuddin.
Radiati, L. E., Awwaly, Kh.U., Kalsum, U. dan Jaya, F. 2008. Pengaruh
Pemberian Ekstrak Propolis Terhadap Sistem Kekebalan Seluler pada
Tikus Putih (Rattussnorvegicus) Strain Wistar. Jurnal Teknologi Pertanian
9(1) : 1- 9
Sabir, A. 2005. Respons Inflamasi Pada Pulpa Gigi Tikus Setelah Aplikasi
Ekstrak Etanol Propolis (EEP). J. Dent 38 (2) : 77-83
Sabir, A. 2009. Aktivitas Antibakteri Flavonoid Propolis Trigona sp terhadap
Bakteri Streptococcus Mutans(In vitro). Bagian Konservasi Gigi. Makasar.
Fakultas Kedokteran universitas Hasanudin. Available
from: <http://www.journal.unair.ac.id. Vol: 38,no:3, 2005> [Diakses
Oktober 2016.]
Sikka, S., Rajasekaran, M., Hellstrom, W.J.G. (1995) Role of Oxidative Stress
and Antioxidants in Male Infertility.Journal of Andrology, 16,8-464.
Sirois M. 2005. Laboratory animal medicine: Principles and procedures. United
States of America: Mosby, Inc.
Sitepoe, M. 2000. Kekhususan Rokok Indonesia.Jakarta: PT. Gramedia
Widiasarana.
Slamet, N., L, Caroline., M, Srinivas., Susarla., and S.R, Naama. 2007. The Effect of Bee Propolis on Recurrent Aphtohous Stomatitis. Original Article Clin
Oral Invest.
Stanojevic, L., Stankovic, M., Nicolic, V., L. Ristic., D. Canadanovic., Brunet, J.,
and Tumbas, V. 2009. Antioxidant Activity And Total Phenolic and
Flavonoid Contens of Hieracium pilosella L. Extract. Sensors 9(7) :5702-
5714
Suckow, M.A., H, Steven., and C.L, Frangklin. 2006. The Laboratory Rat Second
Edtion. A volume in American Coolege of Laboratory Animal Medicine.
Academic Press.
Sukendro, S. 2007. Filosofi Rokok. Sehat Tanpa Berhenti Merokok. Pinus Book
Publisher .
55
Susilaningsih, Neni.2006. CD Praktikum Histologi 1 Bagian Histologi. Fakultas
Kedokteran Universitas Diponegoro. Diponegoro: Fakultas Kedokteran.
Tawbarial, L., Apriliana, E., Wintoko R., dan Sukohar A. 2014. Hubungan
Konsumsi Rokok dengan Perubahan Tekanan Darah Pada Masyarakat di
Pulau Pasaran Kelurahan Kota Karang Kecamatan Teluk Betung Timur
Bandar Lampung. J of Fakultas Kedokteran Universitas Lampung.
Tendra, H. Penentuan Kadar nikotin Dalam Asap Rokok. Yogyakarta:Makara
Kesehatan. 2003; No 7(2):23.
Tjandra, A.Y., 2002, Smoking Problem in Indonesia, Med J Indonesia, 11, 56-65.
Viuda-Martos, M., Ruiz-Navajas,Fernandez-Lopez, dan Perez-Alvarez, 2008.
Functional Properties of Honey,Propolis, and Royal Jelly. Journal of Food
Sciences, 73 (9), 117-124.
Wati, I. P., Aulanni’am dan C. Mahdi. 2013. Aktivitas Protease dan Gambaran
Histologi Ginjal Tikus Putih (Rattus norvegicus) Pasca Induksi
Cyclosporine-A. Kimia.Studentjournal 1(2): 257-263.
Winarsi H. 2007. Antioksidan Alami & Radikal Bebas. Yogyakarta: Kanisius. pp:
138-281.
Yani, Widyastuti. 2008. Kesehatan Reproduksi. Yogyakarta: Fitramaya.
Ziech, D., R. Franco. 2011. Reactive Oxygen Species (ROS) – Induced Genetic
and Epigenetic Alterations In Human Carcinogenesis. Mutation Research
711 : 167-173