Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and...

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Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf zellbiologische Aktivitäten in mesenchymalen Zellen Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Gudrun Volkert aus Hünfeld

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Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und

auf zellbiologische Aktivitäten in mesenchymalen Zellen

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.

vorgelegt von

Gudrun Volkert

aus Hünfeld

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Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 23.11.2011 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink Erstberichterstatter: Prof. Dr. Robert Slany Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Karl Hilgers

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Meinen Eltern

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Was wir wissen, ist ein Tropfen,

was wir nicht wissen, ein Ozean

ISAAK NEWTON (1643-1727)

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Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis.............................................................................................I 

Zusammenfassung.........................................................................................VI 

Summary ...................................................................................................... VII 

1 Einleitung ...................................................................................................... 1 

1.1 Aufbau und Funktion der Niere................................................................................. 1 

1.2 Pathologische Veränderungen im Glomerulus .......................................................... 2 

1.3 Aufbau und Funktion arterieller Gefäße.................................................................... 3 

1.4 Pathologische Veränderungen der Gefäßwand.......................................................... 4 

1.5 Mesenchymale Zellen in Niere und Gefäßen ............................................................ 5 

1.5.1 Mesangiumzellen (MZ) .......................................................................................... 5 

1.5.2 Vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMZ).................................................................. 6 

1.6 Integrine und ihre Funktionen ................................................................................... 6 

1.6.1 Struktur und Aufbau der Integrine......................................................................... 7 

1.6.2 Ligandenbindung und Aktivierung der Integrine................................................... 8 

1.6.3 Integrine und fokale Kontakte.............................................................................. 10 

1.6.4 Integrine und das Zytoskelett ............................................................................... 11 

1.6.5 Integrine und Matrix-Metalloproteinasen (MMP) .............................................. 13 

1.6.6 Integrine und Connective tissue growth factor (CTGF)...................................... 13 

1.7 Integrine der mesenchymalen Zellen....................................................................... 14 

1.8 α8β1-Integrin ........................................................................................................... 15 

1.9 Zielsetzung............................................................................................................... 18 

2 Ergebnisse ................................................................................................... 19 

2.1 Isolation und Charakterisierung von Maus-Mesangiumzellen (MMZ)................... 19 

2.1.1 Generierung der Primärkulturen......................................................................... 19 

2.1.2 Charakterisierung der Zellen............................................................................... 20 

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Inhaltsverzeichnis

II

2.2 Etablierung eines siRNA-vermittelten transienten „knockdown“ von α8-Integrin in Ratten-Mesangiumzellen (RMZ)......................................................................... 22 

2.3 Charakterisierung der isolierten vaskulären glatten Muskelzellen (VSMZ) aus Aorten von WT- und α8-/--Mäusen.......................................................................... 23 

2.4 Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett........................................................... 25 

2.4.1 Vergleichende Darstellung der F-Aktine............................................................. 25 

2.4.2 Vergleichende immunzytochemische Darstellung der Stressfasern .................... 27 

2.4.3 Nachweis der α-SMA Expression in mesenchymalen Zellen ............................... 29 

2.5 Einfluss von α8-Integrin auf die Bildung fokaler Kontakte .................................... 30 

2.6 Vergleich mesenchymaler und epithelialer Marker................................................. 33 

2.6.1 Expression mesenchymaler und epithelialer Marker .......................................... 33 

2.6.2 Immunzytochemische Desmin-Färbung von siRNA transfizierten RMZ ............. 34 

2.7 Zellbiologische Untersuchungen zur Funktion von α8-Integrin.............................. 35 

2.7.1 Einfluss von α8-Integrin auf Adhäsion und Ausbreitung..................................... 35 

2.7.2 Einfluss von α8-Integrin auf Migration ............................................................... 36 

2.7.2.1 Migration im Wundheilungstest (Scratch Assay) ......................................... 37 

2.7.2.2 Migration im Barriere-Assay........................................................................ 38 

2.7.2.3 Migration in der Boydenkammer (Boyden Chamber Assay)........................ 39 

2.7.3 Einfluss von α8-Integrin auf das Zellüberleben................................................... 40 

2.7.3.1 Apoptose im Caspase-3 Assay ...................................................................... 41 

2.7.3.2 Hoechst-Apoptoseassay ................................................................................ 42 

2.7.4 Einfluss von α8-Integrin auf das Wachstumsverhalten von Zellen...................... 44 

2.8 Untersuchungen zur Interaktion von α8-Integrin mit seinem potentiellen Liganden Fibrillin .................................................................................................... 46 

2.8.1 Adhäsions- und Ausbreitungsassays.................................................................... 46 

2.8.2 Adhäsionsassay mit cRGD-Peptiden ................................................................... 48 

2.9 Expression potentiell kompensatorischer Integrine................................................. 50 

2.9.1 Bestimmung der RNA-Expression potentiell kompensatorischer Integrine ........ 50 

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Inhaltsverzeichnis

III

2.9.2 Untersuchung zur Funktion von α2- und α6-Integrin beim Zellüberleben.......... 51 

2.10 Einfluss von α8-Integrin auf die Matrix-Metalloproteinasen (MMP) ..................... 53 

2.11 CTGF Expression in mesenchymalen Zellen .......................................................... 54 

2.12 Untersuchungen des RhoA/Rho-Kinase (ROCK)-Signalwegs ............................... 55 

3 Diskussion ................................................................................................... 58 

3.1 Einfluss von α8-Integrin auf Zellmorphologie, Zytoskelett und fokale Kontakte .... 58 

3.2 Die Bedeutung von α8-Integrin für zellbiologische Aktivitäten ............................. 60 

3.2.1 Einfluss von α8-Integrin auf Adhäsion und Ausbreitung..................................... 60 

3.2.2 Einfluss von α8-Integrin auf Zellüberleben, Proliferation und Migration .......... 61 

3.3 Mögliche Kompensatorische Mechanismen............................................................ 63 

3.3.1 α2- und α6-Integrin.............................................................................................. 63 

3.3.2 Funktion von α2- und α6-Integrin beim Zellüberleben in α8-/--MMZ ................. 65 

3.4 α8β1-Integrin und mesenchymale Marker............................................................... 66 

3.4.1 Vermehrte Bildung von Vimentin in α8-/--MMZ .................................................. 67 

3.5 Einfluss von α8-Integrin auf Matrix-Metalloproteinasen (MMP) ........................... 68 

3.6 Welche Rolle spielt der Rho/ROCK–Signalweg? ................................................... 69 

3.7 Die Interaktion von Fibrillin-1 und α8β1-Integrin .................................................. 71 

4 Material und Methoden............................................................................. 72 

4.1 Material.................................................................................................................... 72 

4.1.1 Chemikalien ......................................................................................................... 72 

4.1.2 Kits ....................................................................................................................... 74 

4.1.3 Verbrauchsmaterialien ........................................................................................ 75 

4.1.4 Geräte und Zubehör............................................................................................. 75 

4.1.5 Puffer und Lösungen............................................................................................ 77 

4.1.5.1 Zellkultivierung............................................................................................. 77 

4.1.5.2 Kultivierung von MZ aus den Glomeruli .......................................................... 78 

4.1.5.3 VSMZ-Isolation aus der Mausaorta ................................................................. 78 

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Inhaltsverzeichnis

IV

4.1.5.4 Proteinisolierung und –auftrennung................................................................. 79 

4.1.5.5 Immunzytochemische Fluoreszenzfärbung ....................................................... 81 

4.1.5.6 Adhäsions- und Ausbreitungsassay .................................................................. 82 

4.1.5.7 Migration in der Boydenkammer...................................................................... 82 

4.1.5.8 Proliferationsassay ........................................................................................... 82 

4.1.5.9 Caspase-3-Aktivität-Assay ................................................................................ 82 

4.2 Methoden ................................................................................................................. 84 

4.2.1 Zellkultur.............................................................................................................. 84 

4.2.1.1 Einfrieren von Zellen .................................................................................... 84 

4.2.1.2 Auftauen der Zellen ...................................................................................... 84 

4.2.1.3 Zellisolation von Ratten-Mesangiumzellen (RMZ)....................................... 85 

4.2.1.4 Zellisolation von Maus-Mesangiumzellen (MMZ) ....................................... 85 

4.2.1.5 Zellisolation von Maus-vaskulären glatten Muskelzellen (VSMZ)............... 86 

4.2.2 Elektronenmikroskopie ........................................................................................ 86 

4.2.3 Proteinanalyse ..................................................................................................... 86 

4.2.3.1 Proteinisolation ............................................................................................ 86 

4.2.3.2 Protein-Konzentrationsbestimmung ............................................................. 87 

4.2.3.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE ) ................................ 87 

4.2.3.4 Immunoblot-Verfahren ................................................................................. 88 

4.2.4 Immunzytochemische Färbungen ........................................................................ 90 

4.2.4.1 Charakterisierung der Mesangiumzellen ..................................................... 90 

4.2.4.2 Hämatoxylinfärbung..................................................................................... 91 

4.2.4.3 Fluoreszenzfärbungen .................................................................................. 92 

4.2.5 Zellbiologische Untersuchungen ......................................................................... 93 

4.2.5.1 Adhäsions- und Ausbreitungsassay .............................................................. 94 

4.2.5.2 Migration ...................................................................................................... 94 

4.2.5.3 Apoptosemessungen...................................................................................... 96 

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Inhaltsverzeichnis

V

4.2.5.4 Proliferationsassay....................................................................................... 99 

4.2.5 RNA-Methoden................................................................................................... 100 

4.2.5.1 Grundlagen des Real-Time-RT-PCR-Verfahrens....................................... 100 

4.2.5.2 RNA-Extraktion .......................................................................................... 100 

4.2.5.3 Reverse Transkription................................................................................. 101 

4.2.5.4 Taqman Real-Time-RT-PCR....................................................................... 102 

4.2.6 siRNA Silencing ................................................................................................. 103 

4.2.7.6 Transiente Transfektion von RMZ .............................................................. 104 

4.2.7 Statistische Auswertung ..................................................................................... 105 

5 Literaturverzeichnis................................................................................. 106 

6 Abbildungsverzeichniss ........................................................................... 121 

7 Tabellenverzeichnis.................................................................................. 123 

8 Abkürzungsverzeichnis............................................................................ 124 

9 Anhang ...................................................................................................... 129 

Publikationen..............................................................................................VIII 

Danksagung..................................................................................................... X 

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Zusammenfassung

VI

Zusammenfassung

Die α8-Integrinkette ist Bestandteil des heterodimeren Matrixrezeptors α8β1-Integrin und

wird überwiegend in Zellen mesenchymaler Herkunft wie vaskulären glatten Muskelzellen

(VSMZ) und renalen Mesangiumzellen (MZ) exprimiert. Integrine beeinflussen zahlreiche

grundlegende zellbiologische Funktionen wie Adhäsion, Proliferation, Migration und

Zellüberleben, die bei pathologischen Veränderungen sowohl in der Niere als auch im

Gefäßsystem eine große Rolle spielen. In vivo ist α8-Integrin bei proliferativen

Erkrankungen der Niere (z.B. Glomerulonephritis) und der Gefäße (z.B. Arteriosklerose)

verändert exprimiert vorzufinden. Es gibt Hinweise dafür, dass α8-Integrin bei diesen

Erkrankungen eine funktionelle Rolle spielt, wobei die Mechanismen noch unklar sind.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Hypothese untersucht, dass die α8-Integrinkette

grundlegende Funktionen mesenchymaler Zellen mitreguliert.

Hierzu wurden im Rahmen dieser Arbeit MZ und VSMZ aus Wildtyp (WT)- und α8-

Integrin knockout (α8-/-)-Mäusen kultiviert und miteinander verglichen. Zusätzlich wurde

die siRNA-Technik zur transienten Herunterregulation von α8-Integrin in MZ etabliert.

Sowohl transienter als auch dauerhafter Mangel an α8-Integrin führte in MZ zur

Umstrukturierung des Zytoskeletts und zum Verlust des mesenchymalen Phänotyps. Des

Weiteren konnte mittels zellbiologischer Untersuchungen eine abgeschwächte Adhäsion

und ein erhöhtes Zellüberleben dokumentiert werden. Allerdings wiesen MZ mit

transienter und dauerhafter α8-Integrin Defizienz Unterschiede im Proliferationsverhalten

auf. Im Gegensatz zu MZ führte der Verlust von α8-Integrin in VSMZ weder zu

morphologischen noch strukturellen Veränderungen. Zudem zeigten α8-/--VSMZ im

Vergleich zu WT-VSMZ, außer in der Migrationsrate, keine Unterschiede in den

zellbiologischen Prozessen wie Adhäsion, Proliferation und Überlebensfähigkeit.

Aus diesen Befunden schließen wir, dass α8-Integrin die strukturellen Veränderungen und

zellbiologischen Funktionen von MZ und VSMZ bei der Glomerulonephritis und der

Arteriosklerose zelltypspezifisch beeinflussen kann. Die zelltypabhängigen Befunde sind

nicht durch unterschiedliche Aktivierbarkeit des Rho/ROCK-Weges, ein potentieller

Signalweg von α8-Integrin, erklärbar. Hingegen kann die zelltypspezifische Funktion von

α8-Integrin zum Teil auf zelltypabhängige kompensatorische Mechanismen zurückgeführt

werden.

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Summary

VII

Summary

The α8-integrin chain is a component of the heterodimeric matrix receptor α8β1 and is

predominantly expressed in cells of mesenchymal origin such as vascular smooth muscle

cells (VSMC) and renal mesangial cells (MC). Integrins influence many fundamental cell

biological functions such as adhesion, proliferation, migration and cell survival, which play

a major role in pathological alterations in both the kidney and the vasculature. In vivo α8-

integrin expression is altered in proliferative diseases of the kidney, like in

glomerulonephritis, and of the vessels, like in atherosclerosis. Some evidence exists that

α8-integrin plays a functional role in these diseases, but the mechanisms are still unclear.

In the present work the hypothesis that the α8-integrin chain modulates basic functions of

mesenchymal cells is tested.

For this purpose MC and VSMC were cultivated from wild type (WT) and α8-integrin

knockout (α8-/-) mice and compared with each other. Additionally, siRNA technology was

established in MC for a transient down regulation of α8-integrin.

Transient absence or constant lack of α8-integrin in MC led to reorganisation of the

cytoskeleton and loss of the mesenchymal phenotype. Furthermore, attenuated adhesion

and spreading as well as increased cell survival were documented in cell biological studies.

However, MC with transient and permanent α8-Integrin deficiency differed in their

proliferative behaviour. In contrast, the transient loss of α8-integrin in VSMC led to neither

morphological nor to structural changes. In α8-/--VSMC no changes in cell biological

processes such as adhesion, proliferation and survival could be detected, only alterations in

cell migration were observed. Based on these findings, we conclude that α8-integrin can

influence cell type-specifically the structural alterations and cell biological functions of

MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results

cannot be explained by different activation of the Rho/ROCK pathway, a potential

pathway of α8-integrin. In contrast, the cell type-specific function of α8-integrin can be

partially attributed to cell type-dependent compensatory mechanisms.

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Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Aufbau und Funktion der Niere

Die dreizonig aufgebaute Niere ist ein bohnenförmiges, paariges Organ und befindet sich

im Retroperitonealraum. Im Innern der Niere liegt das Nierenbecken, mittig das fein

gestreifte Nierenmark und ganz außen die Nierenrinde [1]. Die kleinste funktionelle

Einheit der Niere ist das Nephron, das sich aus dem Glomerulus (Nierenkörperchen) und

dem Tubulusapparat zusammensetzt. Proximaler und distaler Tubulus sind durch die

Henle`sche Schleife miteinander verbunden [2]. Im Glomerulus wird durch Ultrafiltration

der Primärharn aus dem Blut gebildet [3]. Die Tubuli sind für die Rückresorption von

gelösten Stoffen und Wasser aus dem Primärharn zuständig. Dieser fließt durch den Ureter

(Harnleiter) in die Harnblase und wird schließlich durch die Harnröhre als Urin

ausgeschieden [2]. Das Vas afferens ist die blutzuführende Arteriole und verzweigt sich im

Nephron zum Kapillarknäuel, dem eigentlichen Glomerulus. Abschließend vereinigt sich

das Kapillarkonvolut wieder im abführenden Vas efferens [2]. Der Glomerulus besteht aus

einer Anhäufung von ca. 30 Kapillarschlingen, die durch Mesangiumzellen (MZ) und die

von ihnen gebildete mesangiale Matrix gestützt werden (Abb. 1 (B)). Diese Struktur wird

von der Bowman’schen Kapsel umgeben (Abb. 1 (A)). Die Kapillarschlingen sind von

außen mit Podozyten überzogen. Deren Fortsätze greifen ineinander und bilden zusammen

mit der Basalmembran und dem gefensterten Endothel der Kapillaren eine

Filtrationsbarriere (Abb. 1 (B)) [3]. Das Blut wird im Kapillarkonvolut durch den

glomerulären Filter als Primärharn in den Kapselraum filtriert. Zelluläre Bestandteile und

größere Proteine werden dabei zurückgehalten [2].

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Einleitung

2

Abb. 1: Glomerulus und Kapillarschlinge.

(A) Elektronenmikroskopische Aufnahme eines glomerulären Kapillarkonvolutes nach [4]. (B) Schema einer

glomerulären Kapillarschlinge. EN: Endothelzelle, GBM: glomeruläre Basalmembran, M: Makrophage,

MES: Mesangiumzelle, MM: mesangiale Matrix, pEP: parietale Epithelzelle, POD: Podozyten, THR:

Thrombozyten nach [5].

Eine der wichtigsten Funktionen der Niere ist die Ausscheidung von Giftstoffen und

Stoffwechselprodukten. Sie dient aber auch als Regulator des Flüssigkeits-, Säure-, Basen-

und Elektrolythaushaltes. Als Renin-produzierendes Organ wirkt die Niere auf das Renin-

Angiotensin-System ein und besitzt damit eine wichtige Blutdruck-regulierende Funktion.

Zudem fördert die Niere durch Erythropoetinsynthese die Bildung der Blutkörperchen und

ist im Knochenstoffwechsel an der Vitamin D-Synthese beteiligt [1, 2, 6].

1.2 Pathologische Veränderungen im Glomerulus

Der Verlust von gesundem und funktionsfähigem Gewebe stellt ein pathologisches

Ereignis sowohl einer akuten als auch einer chronischen Niereninsuffizienz dar. Aufgrund

des Verlustes entwickelt sich ein fibrotisches, vernarbtes und funktionsloses Gewebe und

in Folge daraus die Niereninsuffizienz. Unabhängig von der Ätiologie und der Art der

Glomerulopathien ist der Prozess der renalen Fibrose durch überschießende

Zellvermehrung sowie durch eine gesteigerte Ablagerung von Matrixproteinen

gekennzeichnet [7-9]. Im gesunden Glomerulus dagegen proliferieren die Zellen nur in

geringem Maße und es besteht ein Gleichgewicht zwischen Matrixaufbau und -abbau. Die

Regulation des Gleichgewichtes zwischen Matrixauf- und -abbau erfolgt durch

Proteinasen, den zinkabhängigen Matrix-Metalloproteinasen (MMP) und Serin-Proteinasen

(Plasminogen Aktivatoren), sowie deren Inhibitoren [10]. Veränderte Expressionen und

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Einleitung

3

Aktivitäten von MMP wurden in zahlreichen renalen Erkrankungen beschrieben, so dass

für MMP eine bedeutende Rolle in der Entstehung von unterschiedlichen

Glomerulopathien diskutiert wird [10, 11]. Inflammatorische Zellen wie Makrophagen und

Lymphozyten infiltrieren bei vielen glomerulären Erkrankungen in den Glomerulus und

gehen mit fibrotischen Veränderungen einher. Im Glomerulus sezernieren die

inflammatorischen Zellen proinflammatorische Faktoren wie platelet-derived growth factor

(PDGF), transforming growth factor-beta (TGF-β) und Interleukin-1 (IL-1), die MZ-

Proliferation und vermehrte Matrixablagerung induzieren [12-15]. Sowohl glomeruläre

Zellanhäufung, an der auch MZ beteiligt sind, als auch die Vernarbung durch

fortschreitende Matrixexpansion führen zur Zerstörung des Glomerulus und final zum

Verlust der Nierenfunktion [8].

1.3 Aufbau und Funktion arterieller Gefäße

Das kardiovaskuläre System, ein Netz aus Blutgefäßen, dient dem Blutkreislauf als ein

weitverzweigtes Transportsystem. Der Stoffaustausch zwischen dem Blut und dem

Gewebe findet nur in den Kapillaren statt. Die Aufgaben des Blutkreislaufes sind zahlreich

und beinhalten die Regulation des Gasaustausches, Transport der Nährstoffe und

Abtransport der Stoffwechsel– und Abfallprodukte. Zudem werden durch das

kardiovaskuläre System Botenstoffe wie z.B. Hormone, Zellen des Immunsystems und

Blutgerinnungsfaktoren an ihren Zielort befördert [16].

Prinzipiell bestehen die Wände aller Arterien aus drei Schichten: Der Intima, der Media

und der Adventitia. Die Intima stellt die innere, dem Blutstrom zugewandte Schicht dar.

Sie wird aus flachen Endothelzellen gebildet, die für einen möglichst reibungslosen

Blutfluss sorgen. Zudem erfüllt die Intima die Funktion einer Barriere und ist auch am

transzellulären Stofftransport beteiligt. Die mittlere Schicht setzt sich aus glatten

Muskelzellen (VSMZ), der Membrana elastica externa sowie der Membrana elastica

interna zusammen. VSMZ und elastisch vernetzte Fasern beeinflussen die Hämodynamik

durch Kontraktion bzw. Dilatation des Arteriendurchmessers. Die nach außen abgrenzende

Adventitia wird hauptsächlich aus Bindegewebe gebildet. Sie dient der Versorgung der

Arterienwand, indem sie Gefäßnerven und kleinste Blutgefäße führt, die bis in die Media

eindringen [17].

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Einleitung

4

1.4 Pathologische Veränderungen der Gefäßwand

Eine typische pathologische Veränderung der Gefäßwand ist die Arteriosklerose. Die

Pathogenese der Arteriosklerose ist ein komplexer, lang andauernder und noch nicht

vollständig aufgeklärter Vorgang. Zahlreiche Faktoren, zu denen auch genetische

Dispositionen und umweltbedingte Einflüsse zählen, lösen die Bildung des

morphologischen Symptomkomplexes aus. Sie beeinflussen zudem den zeitlichen Verlauf

und das Ausmaß der Schädigung [18, 19]. Während der Entwicklung einer Arteriosklerose

manifestieren sich in der Intima arteriosklerotische Plaques, die aus Fetten,

Blutbestandteilen, aktivierten Endothelzellen, Makrophagen und eingewanderten VSMZ

gebildet werden (Abb. 2 (B) und (D)). Das Gefäßlumen wird durch die arteriosklerotischen

Plaques verengt, sodass der Blutstrom lokal vermindert wird [17, 20]. Arteriosklerotische

Veränderungen können zu irreversiblen Gefäßschädigungen führen, die den vollständigen

Gefäßverschluss mit tödlichem Verlauf nach sich ziehen können [19].

Abb. 2: Querschnitt durch ein gesundes Gefäß und ein arteriosklerotisches Gefäß mit Plaque.

(A) Skizzenhafter und (C) mikroskopischer Querschnitt durch ein gesundes Gefäß. (B) Skizze und (D)

mikroskopische Darstellung einer Gefäßlumeneinengung durch arteriosklerotische Plaques (Skizzen

modifiziert aus [20]. Fotos wurden mit freundlicher Genehmigung von Frau Dr. Nada Cordasic; Department

für Nephrologie und Hypertensiologie, Universitätsklinikum Erlangen, zur Verfügung gestellt).

Die „Response-to-injury“-Hypothese [21] und die „Lipoprotein-induced-atherosclerosis“-

Hypothese [22] werden als die wahrscheinlichsten Mechanismen bei der Entstehung einer

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Einleitung

5

Arteriosklerose angesehen. Obwohl sie sich in ihren Ursachen unterscheiden, die eine

Arteriosklerose auslösen können, sind sie im weiteren Verlauf identisch. In der Gefäßwand

kommt es zu einer erhöhten Lipidaufnahme und Adhäsion von Monozyten und

Thrombozyten. Die Monozyten dringen in die Intima ein und werden in Makrophagen

umwandelt. Die Makrophagen phagozytieren LDL (low-density lipoprotein) und wandeln

sich wiederum zu Schaumzellen um. Durch chemotaktische Faktoren der Mono- und

Thrombozyten migrieren die VSMZ aus der Media in die Intima, wo sie durch

Wachstumsfaktoren zur Proliferation angeregt werden. Zusätzlich wird vermehrt

extrazelluläre Matrix (ECM) gebildet und abgelagert. In Folge dieser Ablagerungen wird

das Lumen der Arterie immer enger. Das Endstadium dieses Prozesses wird

umgangssprachlich als „Arterienverkalkung“ bezeichnet [17, 23].

Zelladhäsion, -migration, -proliferation, -überleben sowie Matrixvermehrung sind

grundlegende Prozesse, die bei pathologischen Veränderungen, sowohl in der Niere als

auch im Gefäßsystem, eine große Rolle spielen.

1.5 Mesenchymale Zellen in Niere und Gefäßen

1.5.1 Mesangiumzellen (MZ)

MZ gehören wie VSMZ und Fibroblasten zu den mesenchymalen Zellen [24]. Im

physiologisch gesunden Zustand der Niere bilden die verzweigten MZ ein lockeres Netz

[25]. Einerseits vermitteln sie dem Glomerulus mechanische Stabilität, andererseits

regulieren sie mittels ihrer kontraktilen Eigenschaft den Blutfluss der Kapillarschlingen

[6]. Zudem produzieren MZ die sie umgebende ECM selbst [7]. Sie sezernieren

hauptsächlich Kollagen IV, Fibronektin, Laminin, Proteoglykane [25] und zu geringen

Teilen Vitronektin sowie Tenascin-C [26]. Bei vielen glomerulären Erkrankungen, wie

einer Glomerulonephritis, werden die Proteine der ECM verstärkt sezerniert [7] oder wie

die interstitiellen Kollagene, Kollagen I und III de novo produziert [27]. Da MZ zudem in

der Lage sind, entzündliche Mediatoren und Wachstumsfaktoren zu sezernieren, die

sowohl parakrin als auch autokrin wirken können, tragen sie somit zur Aufrechterhaltung

lokaler Entzündungsreaktionen bei [28].

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Einleitung

6

1.5.2 Vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMZ)

VSMZ sind unter physiologischen Bedingungen für die Elastizität sowie für die

Kontraktion der Gefäße verantwortlich. Sie sorgen damit für die Aufrechterhaltung des

Gefäßtonus. Entsprechend ihrer Funktion sind VSMZ mit einem kontraktilen Apparat

ausgestattet. Dazu gehören zahlreiche Proteine des Zytoskeletts wie das α-Glattmuskel-

Aktin (α-SMA), Subtypen der schweren Ketten des Myosins (myosin heavy chains),

Desmin, Vimentin, Calponin, Caldesmon, SM 22α und Smoothelin [29, 30].

Normalerweise vermehren sich die VSMZ nur gering. In diesem nicht-mobilen Zustand

sind die VSMZ in der Media lokalisiert und befinden sich in einem ausdifferenzierten und

kontraktilen Phänotyp [29, 31]. VSMZ können eine reversible Modifikation zwischen

ausdifferenziertem und dedifferenziertem Zustand durchlaufen [32]. Während der

Reparatur nach einem vaskulären Schaden sowie bei krankhaften Veränderungen der

Gefäßwand kommt es zur Dedifferenzierung der ruhenden, kontraktilen VSMZ in einen

proliferativen, migratorischen Typ, der große Mengen an ECM-Proteinen synthetisieren

kann (sekretorischer Phänotyp). Die Proliferation der VSMZ spielt eine wichtige Rolle bei

der Entstehung von okklusiven Gefäßerkrankungen, wie z.B. bei der Bildung von

arteriosklerotischen Plaques oder bei einer Restenose nach Angioplastie [29, 31-33].

Aktivierte VSMZ zeigen veränderte Expressionen der Adhäsionsrezeptoren, zu denen auch

die Integrine zählen. Weiterhin weisen sie eine Umorganisation des Aktinzytoskeletts auf

[31, 34].

1.6 Integrine und ihre Funktionen

Der Kontakt zwischen ECM und MZ wird durch Zelloberflächen-Rezeptoren vermittelt.

Zu den wichtigsten Adhäsionsrezeptoren zählt neben den Cadherinen, den Selektinen und

der IgCAMs (immunoglobulin cell adhesion molecules), die Familie der Integrine [35].

Integrine sorgen nicht nur für eine Verankerung der Zellen, sondern sind darüber hinaus

auch an zahlreichen Signal-Transduktionswegen beteiligt [5, 35]. Integrine sind eine große

Familie von membranständigen Zelladhäsionsmolekülen, die in Zell-Zell- und Zell-Matrix-

Interaktionen involviert sind. Sie verbinden Matrixproteine wie z.B. Kollagene,

Fibronektin und Laminine mit dem Zytoskelett [36-38]. Integrine tragen somit zur

Regulation von Adhäsion, Migration, Proliferation, Differenzierung und Apoptose der

Zellen bei [39]. Neben der Zell-ECM-Interaktion sind Integrine auch bidirektional an der

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Einleitung

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Weiterleitung von Signalen beteiligt. So vermitteln sie sowohl Informationen aus der ECM

in die Zelle (outside-in signaling) als auch intrazelluläre Signale in die Zellumgebung

(inside-out signaling) [38].

1.6.1 Struktur und Aufbau der Integrine

Das Integrin ist ein heterodimeres Glykoprotein, das sich aus einer α-Integrinkette und

einer nichtkovalent gebundenen β-Untereinheit zusammensetzt. Jede Kette besteht aus

einer langen extrazellulären (700 bis 1100 AS), einer membrandurchspannenden und einer

relativ kurzen zytoplasmatischen Domäne (30 bis 50 AS). Eine Ausnahme stellt die β4-

Kette dar, die mit der α6-Integrinkette ein Hetereodimer bildet. α6β4-Integrin ist ein

Bestandteil der Hemidesmosomen und trägt durch die sehr große zytoplasmatische

Domäne der β4-Kette (ca. 1000 AS) zu der Verankerung von Intermediärfilamenten bei

[38, 40]. Die zellinnere Domäne der Integrinketten enthält in der Nähe des

transmembranösen Bereiches eine konservierte Sequenz. Bei den α-Untereinheiten ist es

das KXGFFKR-Motiv und bei fast allen β-Untereinheiten das KLLX4D-Motiv. Diese

Regionen sind wichtig für die Aktivierung und Deaktivierung der Integrinkette, indem sie

über die Ausbildung und Dissoziation einer Salzbrücke die Interaktion zwischen der α- und

der β-Kette regulieren [41]. Die meisten α-Ketten bestehen aus einer leichten und schweren

Kette, die durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind. Die extrazelluläre

Domäne der α-Kette zeigt N-terminal sieben homologe Wiederholungen auf, die sich zu

einer sogenannten ß-Propeller-Struktur falten. Einige α-Integrinketten besitzen zwischen

der 2. und 3. Wiederholung des ß-Propellers eine unabhängige gefaltete Region aus ca. 200

AS, die inserted (I) Domäne oder auch A-Domäne genannt wird. Die I/A-Domäne ist

häufig in die Ligandenerkennung involviert. In α-Integrinketten ohne I/A-Domäne wird die

Ligandenbindung über den ß-Propeller, der mit einer I-ähnlichen Domäne (I-like Domäne)

der ß-Integrinkette kooperiert, vermittelt Zusätzlich trägt N-terminal die β-Integrin-

Untereinheit eine als PSI-Domäne (Plexin, Semaphorin und Integrin) bezeichnete Region,

die Sequenz-Homologie mit Membranproteinen wie Plexin und Semaphorin besitzt. Das

erste der sieben Cysteine dieser Region bildet eine Disulfidbrücke mit der C-terminalen

Cystein-reichen Region der β-Untereinheit aus (Abb. 3) [38, 40, 41].

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Abb. 3: Schematische Darstellung des Aufbaus der Integrine.

Die N-terminale Kopfgruppe der α-Untereinheit besteht aus einem siebenblättrigen β-Propeller. Viele α-

Untereinheiten besitzen zwischen dem zweiten und dritten Propellerblatt eine zusätzliche, eingeschobene,

sogenannte inserted (I) Domäne bzw. I/A-Domäne. Die β-Untereinheit kann eine I-ähnliche Domäne

aufweisen, die über die PSI-Domäne an die C-terminale cysteinreiche Region verbunden ist (modifiziert nach

M. J. Humphries, 2000 [40]).

1.6.2 Ligandenbindung und Aktivierung der Integrine

In Vertebraten wurden bisher 24 verschiedene Integrin-Heterodimere nachgewiesen, die

aus 18 α- und 8 β-Untereinheiten gebildet werden [38, 42]. Integrine werden nach ihrer

Ligandenspezifität und Zelltyp-spezifischen Expression in vier Gruppen eingeteilt:

Kollagen-, Laminin-, RGD- und Leukozyten-spezifische Rezeptoren (Abb. 4) [38]. Das

RGD- (Arg-Gly-Asp) Motiv befindet sich in zahlreichen ECM-Proteinen wie Fibronektin,

Vitronektin, Tenascin-C und vielen weiteren Proteinen [42, 43] und stellt eine

Bindesequenz dar, die von vielen Integrinen erkannt wird [44]. Zusätzlich ist die

Ligandenbindung von divalenten Kationen wie Ca2+, Mg2+ und Mn2+ abhängig. Putative

divalente Kationen-Bindestellen, die MIDAS (metal ion dependent adhesion site), befinden

sich im N-terminalen Bereich der α- und ß-Kette [40, 45]. Für die korrekte

Integrinfunktion sind demnach beide Ketten notwendig [46]. Die α-Kette ist für die

Spezifität des Rezeptors und die β-Kette für die Verbindung mit dem Zytoskelett

zuständig. Eine gut untersuchte ECM-Integrin Interaktion ist die Bindung von Fibronektin

an αvβ3-Integrin, die Migration und Adhäsion beeinflussen kann [47].

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Abb. 4: Die Familie der Integrine.

18 α- und 8 β-Untereinheiten bilden 24 verschiedene Heterodimere, die aufgrund ihrer Spezifität für

bestimmte Liganden und Zelltyp-Expression in vier Hauptgruppen eingeteilt werden (modifiziert nach R.O.

Hynes, 2002 [38]).

Viele Integrine interagieren mit mehr als einem Liganden und einige Matrixproteine

können von mehreren Integrinen gebunden werden. Dadurch wird einer Zelle ermöglicht,

eine große Vielzahl von Integrin-Matrix-Interaktionen auszubilden [38]. Die Aktivierung

der Integrine ist bis heute nicht eindeutig geklärt. Ligandenbindung, Kationen und

Proteine, die an den intrazellulären Bereich binden, beeinflussen die Aktivierung bzw.

Deaktivierung der Integrine. Integrine können verschiedene Konformationszustände

annehmen. In ruhenden Zellen liegen die Integrine in einer nicht-adhäsiven Form vor und

zeigen eine niedrige Liganden-Affinität. Eine Ligandenbindung an das N–terminale Ende

beider Integrinketten führt zu einer Konformationsänderung des Integrins. Das Integrin

befindet sich nun in einem aktivierten Status mit hochaffiner Bindung an den Liganden

[38, 48]. Während die Ausbildung einer Salzbrücke zu einem inaktiven, geschlossenen

Zustand führt, wird durch eine Konformationsänderung die Dissoziation beider Ketten

herbeigeführt. Es erfolgt die Streckung und damit die Aktivierung des Integrins mit der

Fähigkeit zur Ligandenbindung [41].

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1.6.3 Integrine und fokale Kontakte

Aktivierte Integrine liegen in der Zelle meist in Clustern vor und bilden Zell-Matrix

Adhäsionen aus [39, 49]. In migrierenden Zellen unterliegen Adhäsionen dynamischen und

hierarchischen Prozessen, an denen zahlreiche Zelloberflächen- und Matrix-assoziierte

Moleküle beteiligt sind. Diese sind sowohl räumlich als auch zeitlich reguliert und aktiv.

Integrin-vermittelte Adhäsionen können in drei Formen unterteilt werden, die sich in ihrer

molekularen und morphologischen Zusammensetzung unterscheiden: die fokalen

Kontakte, fibrillären Adhäsionen und Fokalkomplexe [50]. Die Fokalkomplexe treten

kurzzeitig in den protusiven Lamellipodien und Filopodien auf. Hierbei handelt es sich um

Zellfortsätze, die sich während der Fortbewegung (Protrusion) an der vorderen Zellfront

migrierender Zellen bilden [51]. Die Mehrheit dieser Fokalkomplexe löst sich während des

Zurückziehens der Zellfortsätze (Retraktion) wieder auf [50]. Somit unterliegen

migrierende Zellen einem ständigen Wechsel aus Neubildung und Auflösung von

Adhäsionen (turnover) [49, 52]. Durch die Rekrutierung weiterer Ankerproteine wie

Zyxin, aber auch Vinculin, können Fokalkomplexe zu fokalen Kontakten ausreifen. Fokale

Kontakte sind für die stabile Bindung an die ECM verantwortlich und deshalb vor allem in

festsitzenden (sessilen) Zellen vorzufinden [50, 53].

Abb. 5: Schematische Darstellung von fokalen Kontakten.

Neben strukturgebenden Proteinen befinden sich in den fokalen Kontakten viele signalübertragende Proteine

wie die c-Src (Tyrosinkinase Src) oder FAK (focal adhesion kinase). Nach der Bindung des Integrinrezeptors

an die RGD-Bindungsstelle in der Matrix kommt es zur Rekrutierung der FAK–Moleküle und in Folge zur

Ausbildung einer Signalkaskade [39].

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In vitro konnte gezeigt werden, dass die Ligandenbindung auf extrazellulärer Seite der

Integrine zu einer Ausbildung von fokalen Kontakten führt (Abb. 5). Auf der

intrazellulären Seite der transmembranösen Integrine ist die β-Untereinheit über

Adapterproteine wie z.B. Talin, α-Aktinin und Vinculin mit den Aktinfilamenten sowie mit

Kinasen verbunden [39, 49]. Das 116kDa große Vinculin wurde zuerst in Zellen des

Hühnermagens identifiziert und ist seitdem in vielen anderen Zellarten von Säugetieren

nachgewiesen worden [54-56].

1.6.4 Integrine und das Zytoskelett

Das Zytoskelett einer Zelle besteht aus drei strukturellen Einheiten: den Mikrotubuli, den

Intermediärfilamenten und den Aktin-haltigen Mikrofilamenten. Zusammen mit ihren

assoziierten Proteinen bilden sie ein komplexes intrazelluläres System [57]. Das

Zytoskelett spielt eine entscheidende Rolle in der Ausbildung der Zellform, Organisation

des Zytoplasmas, Zellteilung, Zellbewegung und -differenzierung [58-60]. Insbesondere

die Organisation des Aktin-Zytoskeletts wirkt sich auf Adhäsion, Ausbreitung, Migration,

Proliferation, Morphologie und das Zellüberleben aus. An der Regulation von Aktin-

Vernetzung, Aktin-Treadmilling und der Neubildung von Aktinfilamenten sind unter

anderem auch die kleinen GTPasen, wie z.B. Rho, beteiligt [61].

Sechs verschiedene Isoformen des globulären, sogenannten G-Aktins sind im Menschen

vorzufinden. Neben α-Skelettmuskel-, α-Herzmuskel-, γ-Glattmuskel-, sowie β- und γ-

Nichtmuskel-Aktin, existiert das α-Glattmuskel-Aktin (α-SMA) [62]. α-SMA ist

typischerweise in mesenchymalen Zellen vorzufinden. Aus dem ca. 42kDA monomeren

Molekül entsteht eine filamentöse Form des Aktins (F-Aktin). F-Aktine können sich

zusammenlagern und Stressfasern bilden [63, 64]. Stressfasern sind durch ihre beiden

Enden mit fokalen Kontakten verbunden und stabilisieren dabei die Integrin-Cluster und

damit die Integrität der fokalen Kontakte [49, 52]. Die Formierung von Stressfasern wird

durch Rho Aktivierung initiiert [53, 65]. Wie Rho gehören Rac und Cdc42 zur Familie der

kleinen GTP-bindenden Proteine und beeinflussen sich in migrierenden Zellen gegenseitig

in einem Signalnetzwerk [35] (Abb. 6). Rac ist wichtig beim Aufbau und bei der

Ausbildung der peripheren Lamellipodien [51]. Cdc42 beeinflusst die Entstehung

aktinreicher Fortsätze, den sogenannten Filopodien [66]. Zudem spielen beide eine Rolle in

der Bildung von kurzzeitigen Fokalkomplexen. Der Übergang von Fokalkomplexen

(assoziiert mit Lamellipodien) zu fokalen Kontakten (assoziiert mit Stressfasern) wird

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durch die Verlagerung des Integrin-vermittelten Signalweges von Rac zu Rho gesteuert

[65, 67]. Damit nimmt die Familie der kleinen GTPasen eine Schlüsselposition bei der

Verknüpfung von Signalwegen und der Organisation des Aktin-Zytoskeletts ein. Aber

auch die Rho-assoziierte Kinase (ROCK), ein wichtiger Effektor von Rho, beeinflusst

gemeinsam mit mDia1-Protein, einem weiteren Effektor der RhoA, die

Zusammenlagerung von F-Aktinbündeln [35]. Neben dem MAPK-, PI-3K-PKB/Akt- und

NF-κB-Signalweg, ist der Rho/GTPase-Weg einer der Hauptsignalwege, die durch die

Integrin-Liganden Interaktion (outside-in-signaling) direkt aktiviert werden kann [68].

Abb. 6: Der Integrin-vermittelte Rho/GTPase-Weg.

Integrine können durch die Ligandenbindung direkt auf die Aktivität von Rho, Rac und cdc42 einwirken.

Rho ist zum einem über die Rho Kinase (ROCK) und zum anderen über mDia1 an der Formation von

Stressfasern beteiligt. Rac kann über zwei Signalkaskaden (IRSp53, WAVE, Arp2/3-Komplex und PAK,

LIMK, Cofilin) die Bildung von Lamellipodien modulieren. cdc42 wirkt über den WASP-Arp2/3-Komplex

und den PAK-LIMK-Cofilin-Weg auf die Filopodien Formation ein. IRSp53 = insulin receptor tyrosine

kinase substrate p53, WAVE = WASP family Verprolin-homologous protein, WASP= Wiskott-Aldrich

syndrome protein, Arp = actin-related proteins, LIMK = LIM domain kinase, LIM = localized leukocyte

mobilization, PAK = p21-activated protein kinase, MLC = myosin light chain, mDia1 = mammalian

Diaphanous-related formin 1 [35].

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1.6.5 Integrine und Matrix-Metalloproteinasen (MMP)

Integrine können über outside-in-signaling nicht nur die Organisation des Zytoskeletts

beeinflussen, sondern können ebenso regulierend auf die Synthese der MMP (Matrix-

Metalloproteinasen) einwirken [69]. Es sind über 20 verschiedene MMP-Spezies bekannt,

die sich je nach Zielmatrix und nach Sequenzhomologie in sechs verschiedene Gruppen

einteilen lassen: Die Kollagenasen (z.B. MMP-1), die Gelatinasen (z.B. MMP-2 und

MMP-9), die Stromelysine (z.B. MMP-3), die Matrilysine (MMP-7 und MMP-26), die

Membrane-Type (MT) MMP (z.B. MMP-14) und die MMP-Gruppe, die die restlichen

MMP beinhaltet, die sich weder durch ihre Sequenz noch durch ihre Substratspezifität in

eine der fünf vorangegangen Gruppen klassifizieren lassen (z.B. MMP-11) [70]. MMP sind

Zn2+-abhängige Endopeptidasen und können regulierend auf zahlreiche biologische

Prozesse der Zelle einwirken, indem sie neben dem Abbau der ECM Moleküle weitere

Nicht-Matrixmoleküle wie z.B. andere Proteinasen, Proteinase-Inhibitoren,

Wachstumsfaktoren sowie Zelloberflächenmoleküle wie z.B. Integrine und andere

Rezeptoren degradieren [71]. Der begleitende lokale Abbau der ECM durch MMP ist

essentiell für eine gerichtete Zellmigration. MMP können dadurch eine entscheidende

Funktion in embryonalen, physiologischen und pathologischen Prozessen wie

Angiogenese, Wundheilung sowie Inflammation einnehmen [72, 73]. Alle MMP (außer

den MT-MMP und MMP-11) werden in einer inaktiven Proform sezerniert. Bei der

Enzymaktivierung wird das ca. 80AS große N-terminale Propeptid abgespalten und erst

dann kann Zn2+ gebunden werden, welches die proteolytische Aktivität von MMP

reguliert. Aber auch die Familie der TIMP (tissue inhibitors of metalloproteinases),

natürlich vorkommende Inhibitoren der MMP, spielen eine entscheidende Rolle in der

Regulation der MMP-Aktivitäten [74, 75]. Die vier Mitglieder (TIMP-1, -2, -3 und -4) der

TIMP-Familie besitzen in der Regel eine hohe Affinität für bestimmte MMP. So bindet

TIMP-1 bevorzugt MMP-9 [76] und TIMP-2 inhibiert hauptsächlich MMP-2 [77].

1.6.6 Integrine und Connective tissue growth factor (CTGF)

Ebenso wie die MMP und TIMP beeinflussen zahlreiche Zytokine wie z.B. TGF-β [78, 79]

und CTGF (Connective tissue growth factor) Bildung und Deposition der ECM [80-82].

CTGF kann zudem durch seine Bindung an Oberflächenrezeptoren wie Integrine

zahlreiche Signalwege initiieren und somit einen regulatorischen Einfluss auf

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zellbiologische Prozesse wie Adhäsion, Migration, Proliferation und Zellüberleben

einnehmen [79][83]. CTGF ist ein 38kDa großes sezerniertes, matrizelluläres Protein,

welches 1991 erstmals für HUVEC (human vascular endothelial cells) beschrieben wurde

[84] und bildet mit CCN1/CYR61 (Cysteine-rich 61), CCN2/NOV (Nephroblastoma

overexpressed), CCN4/WISP-1 (Wnt-induced secreted proteins-1), CCN5/WISP-2 und

CCN6/WISP-3 die CCN-Familie. CCN steht für Cyr61, CTGF und NOV, welche die

ersten drei bekannten Proteine dieser Familie darstellen [85, 86]. Außer in zahlreichen

Organen, wie Leber, Herz, Lunge sowie Niere ist CTGF/CCN2 auch in Blutgefäßen

nachgewiesen worden und ist an physiologischen und pathologischen Prozessen wie

Embryogenese, Wundheilung, Angiogenese, Arteriosklerose und Fibrosevorgängen

beteiligt [85, 87, 88].

1.7 Integrine der mesenchymalen Zellen

Im Mesangium der gesunden Niere exprimieren MZ eine Vielzahl von Integrinketten, wie

α1, α2, α3, α5, α6, α8, αv sowie β1, β3 und β5 [7]. In zahlreichen glomerulären

Erkrankungen ist eine veränderte mesangiale Expression dieser Integrine zu beobachten

(Beispiele s. Tab. 1).

Integrinketten Glomeruläre Erkrankungen

α1, α2, α3, αv, β1, β3 und β5 (erhöht)

Diabetische Nephropathie [89]

αv, β3 (erhöht) Membranoproliferative Glomerulonephritis Typ I [90]

α1, α5, αv, β1 (erhöht) IgA-Nephropathie [78, 91]

α1, α5, α8, β1 (erhöht) α3 (reduziert)

Mesangioproliferative Anti-Thy1.1 Nephritis im Rattenmodell [92, 93]

Tab. 1: Integrine und glomeruläre Erkrankungen.

Beispielhafte Übersicht der Integrine, deren Expression während glomerulärer Erkrankungen der Niere

induziert wird. Eine Ausnahme stellt das α3-Integrin dar, das während der Mesangioproliferativen Anti-

Thy1.1 Nephritis reprimiert wird.

Normalerweise liegen in der Media der Gefäße die VSMZ im differenzierten, kontraktilen

Phänotyp vor und exprimieren überwiegend α1-, α3-, α5-, α7-, α8-, α9-, αv- sowie β1- und

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β3-Integrinketten [31]. Die Dedifferenzierung zu invasiven VSMZ korreliert in vitro mit

erhöhter α5-, αv-, β1- und β3-Integrin Expression [94] und de novo Expression von α4β1-

Integrin [95]. Gefäßschäden lösen unterschiedliche Expressionsänderungen zahlreicher

Integrine aus (Beispiele s. Tab. 2).

Integrinketten Vaskuläre Schäden

αv, β3 und β5 (erhöht) Neointima Formation im Kaninchenmodell [96] Aorten Ballon-Verletzung im Rattenmodell [97]

α5, β1 (erhöht) sowie α8 (reduziert)

Ballon-Verletzung einer Karotisarterie im Rattenmodell [98, 99]

aktiviertes β1 (reduziert) Ballon-Verletzung der Vena saphena magna im Pavianmodell [100]

α4β1-Integrin (de novo) arteriosklerotische Intimaverdickung [95]

Tab. 2: Integrine und vaskuläre Schäden.

Beispielhafte Übersicht der Integrine, deren Expression durch vaskuläre Schäden verändert ist.

Indem Integrine Migration, Proliferation und Apoptose von MZ und VSMZ, sowie die

Synthese von ECM und deren Zusammensetzung regulieren, sind sie für die Entwicklung

vaskulärer und glomerulärer Erkrankungen von großer Bedeutung [7, 101].

1.8 α8β1-Integrin

α8β1-Integrin ist im Nervensystem von Hühnerembryonen erstmals identifiziert und

beschrieben worden [45]. Es ist ein Rezeptor für Tenascin-C, Fibronektin und Vitronektin

sowie für Osteopontin und Nephronektin, wobei die Bindung der Liganden Tenascin-C,

Fibronektin und Vitronektin an α8β1-Integrin durch die RGD Bindesequenz erfolgt [26,

102-105]. Das cysteinreiche 350kDA Glykoprotein Fibrillin-1 wird auch als ein

potentieller Ligand von α8β1-Integrin diskutiert [106, 107]. Fibrillin-1 stellt die

Hauptkomponente von elastischen Mikrofibrillen dar [108] und ist sowohl in elastischen

als auch in unelastischen Geweben wie Haut, Auge, Gefäße und Niere vorzufinden [109].

In der Media der Gefäße sowie in der mesangialen Matrix des Glomerulus kann Fibrillin-1

nachgewiesen werden [110]. Degradation, Überexpression, aber auch Mutationen von

Fibrillin-1 führen zu zahlreichen Erkrankungen wie z.B. dem Marfan-Syndrom (MFS)

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[111]. In vitro fördert Fibrillin-1 Adhäsion, Ausbreitung, Migration und Proliferation von

MZ [112]. Fibrillin-1 ist bereits als ein Ligand von α5β1-und αvβ3-Integrin bekannt [107].

α8β1-Integrin wird von neuronalen und mesenchymalen Zellen exprimiert und konnte in

der Niere von Maus, Ratte und Mensch spezifisch in MZ und im Gefäßsystem in VSMZ

nachgewiesen werden [93, 113]. Es ist bekannt, dass α8β1-Integrin mit fokalen Kontakten

assoziiert ist. Adaptive Zytoskelettmoleküle wie Vinculin stellen die Verbindung zwischen

α8β1-Integrin und dem Aktinzytoskelett her [93, 114-116]. α8β1-Integrin wird auch in den

sensorischen Haarzellen des Innenohrs exprimiert. Fehlt α8β1-Integrin, ist die

Differenzierung dieser Zellen gestört. Der Mangel an α8β1-Integrin führt in α8-Integrin

defizienten Mäusen (α8-/--Mäuse) zu Gleichgewichtsstörungen [117]. In Neuronen wird

die Adhäsion, das Ausbreiten der Zellen sowie die Ausbildung von Neuriten durch α8β1-

Integrin verstärkt [118].

α8-/--Mäuse zeigen einen renalen Phänotyp. α8-Integrin wird früh während der

Nephrogenese exprimiert und besitzt eine wichtige Funktion in der Nierenentwicklung.

Mangelt es an α8-Integrin, so liegt eine eingeschränkte Wechselwirkung zwischen Epithel

und Mesenchym vor. Die Interaktion zwischen Ureterknospe und umgebendem

Mesenchym ist daher gestört. Ein großer Teil der α8-/--Mäuse entwickelt keine Nieren und

stirbt. Überlebende neugeborene α8-/--Mäuse werden mit einer annähernd normal großen

oder zwei kleineren Nieren geboren [119, 120]. Diese Tiere weisen im Vergleich zu WT-

Mäusen eine signifikante Reduktion der Nierenmasse auf. Sie haben einen leicht erhöhten

Blutdruck sowie eine reduzierte Urinkonzentrationsfähigkeit [120]. In der adulten Niere

wird die α8-Integrinkette speziell in glomerulären MZ und in VSMZ exprimiert. Die

Glomeruli der α8-/--Mäusenieren zeigen im Vergleich zu WT-Mäusen histologisch zwar

kaum auffällige Veränderungen, aber morphometrische Untersuchungen belegen, dass

mehr glomeruläre MZ und eine etwas verbreiterte mesangiale Matrix vorliegen. So ist eine

erhöhte Ablagerung von Kollagen IV sowie Fibronektin und eine de novo Expression von

Kollagen I und III festzustellen. Während in α8-/--Mäusen die Gefäßwände der kortikalen

Arterien unverändert sind, sind die Kapillaren des peritubulären Netzwerkes etwas

geweitet. Obwohl α8-Integrin üblicherweise im Mesangium und in Gefäßen stark

exprimiert wird und α8-/--Mäuse enorme Nierenfehlbildungen aufzeigen, sind die

histologischen und morphometrischen Veränderungen im Verhältnis gering [27]. Jedoch

führen Induktionen experimenteller Glomerulopathien, wie z.B. der HABU-Nephritis oder

der Desoxycorticosteron(DOCA)-Salz Hypertonie-vermittelten Glomerulosklerose, in α8-/-

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-Mäusen zu einer verzögerten Ausheilung bzw. zu einem schwereren Krankheitsverlauf

[120-122]. Sowohl in α8-/-- als auch in WT-Mäusen kann durch eine DOCA-Salz

Behandlung Bluthochdruck induziert werden. In Folge entwickeln die Tiere eine

hypertensive Nephrosklerose. Obwohl α8-Integrin in DOCA-behandelten Mäusen

vermehrt im Glomerulus exprimiert wird, kann für α8-Integrin kein profibrotischer

Einfluss beobachtet werden, da α8-/-- und WT-Mäuse einen vergleichbaren Grad an

Nephrosklerose aufweisen [122]. Dagegen wird α8β1-Integrin in vielen anderen Organen

als ein profibrotischer Faktor beschrieben. So wird α8-Integrin im Verlauf einer

experimentellen Lungenfibrose in interstitiellen Fibroblasten vermehrt exprimiert.

Desweiteren kann eine de novo Expression von α8β1-Integrin während einer induzierten

Lebererkrankung in aktivierten sternförmigen Leberzellen, die mit Myofibroblasten

vergleichbar sind, nachgewesen werden [123]. In kardialen Fibroblasten kann eine α8-

Integrin Expression detektiert werden, die im fibrotischen und vernarbten Myokard

hochreguliert ist [114, 124].

In vitro Untersuchungen zeigen, dass α8-Integrin eine Rolle in der Regulation des

mesangialen Phänotyps spielt und die Adhäsion von MZ fördert, aber Migration und

Proliferation zu hemmen scheint [125]. Zudem ist die α8-Integrin Expression für das

Überleben von MZ essentiell [121]. In VSMZ wird α8β1-Integrin als ein

Differenzierungsmarker angesehen. Die Modulation zu einer dedifferenzierten Zelle geht

mit Veränderungen in der Morphologie von einem spindelförmigen zu einem mehr

ausgebreiteten Phänotyp einher. Dabei erfolgt eine Umorganisation der Aktinfilamente zu

einer parallelen Anordnung und einem veränderten Expressionsmuster von Vinculin [126].

Diese Prozesse sind reversibel, denn eine Überexpression von α8-Integrin führt vom

dedifferenzierten zum differenzierten Phänotyp mit reduzierter Migration [127], während

eine erhöhte Migrationsrate durch die akute Herunterregulation von α8-Integrin erzielt

werden kann [124]. Somit stellt α8β1-Integrin in VSMZ nicht nur einen Marker für den

Differenzierungszustand dar, sondern ist auch am Prozess der Umdifferenzierung beteiligt

[127].

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Einleitung

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1.9 Zielsetzung

Aufgrund dieser Vorbefunde war von Interesse, die Bedeutung von α8-Integrin für den

Phänotyp von renalen MZ und VSMZ zu klären. Für die Untersuchungen wurden zum

einen MMZ und VSMZ genutzt, die aus WT- und α8-/--Mäusen isoliert wurden, zum

anderen wurde die α8-Integrin Expression in WT-Zellen (RMZ) mittels siRNA blockiert.

Durch siRNA-vermittelte Herunterregulation von α8-Integrin war es möglich, Effekte

einer akuten α8-Integrin Defizienz zu untersuchen.

1. Welchen Einfluss hat α8-Integrin auf die Organisation des Aktinzytoskeletts und

fokaler Kontakte und somit auf die Zellmorphologie? Welche Rolle spielt der

Rho/ROCK–Signalweg?

2. Inwieweit werden Adhäsion, Migration, Zellüberleben und Proliferation durch

akuten bzw. dauerhaften Mangel an α8-Integrin beeinflusst?

3. Existieren kompensatorische Mechanismen für das Fehlen von α8-Integrin?

4. Verändert sich durch den Mangel an α8-Integrin das Expressionsmuster

mesenchymaler Marker?

Page 30: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

19

2 Ergebnisse

2.1 Isolation und Charakterisierung von Maus-Mesangiumzellen (MMZ)

2.1.1 Generierung der Primärkulturen

Aus den Glomeruli von α8-Integrin defizienten (α8-/-)- und Wildtyp (WT)-Mäusen

(erhalten von Dr. Ulrich Müller, Scripps Institute, La Jolla, CA, USA) wurden wie von

Hartner A. et al., 2002 [120] beschrieben, mesangiale Zellen isoliert und in eine

Primärkultur überführt. Aus isolierten Glomeruli wuchs zunächst eine Mischung

unterschiedlicher Zelltypen aus. Die Kultivierung in einem Selektivmedium für MMZ

führte zum Absterben der anderen Zelltypen. Das Vorliegen einer reinen MMZ-Kultur

wurde mit Hilfe von Antikörpern für unterschiedliche zelltypspezifische Marker wie

Faktor VIII, MECA-32, Zytokeratin 18, WT-1 und F4/80 überprüft. Die

immunzytochemische Färbung der isolierten Zellen gegen zellspezifische Epitope (Tab. 3)

zeigte, dass weder Endothel-, Epithelzellen, Podozyten noch Makrophagen in den Isolaten

vorzufinden waren.

Zellen Zellspezifische Marker Detektion in Primärkultur

Endothelzellen Faktor VIII, MECA-32 (-)

Epithelzellen Zytokeratin 18 (-)

Podozyten Wilms Tumor 1 (WT-1) (-)

Makrophagen F4/80 (-)

Mesangiumzellen (WT) α-Glattmuskel-Aktin (α-SMA), α8-Integrin (+), (+)

Tab. 3: Übersicht der verwendeten Oberflächenmarker zur Charakterisierung der Zelltypen.

(+) = positive und (-) = negative immunzytochemische Färbung.

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Ergebnisse

20

2.1.2 Charakterisierung der Zellen

Antikörperfärbungen zur Identifizierung von mesangialen Markern wie α-Glattmuskel-

Aktin (α-SMA) und α8-Integrin führten in WT-Zellen zu positiven Ergebnissen und

verifizierten sie somit als mesangiale Zellen. Dagegen erfolgte mit denselben Antikörpern

in isolierten Zellen aus α8-/--Mäusen keine positive Färbung (Daten werden nicht gezeigt).

Zudem zeigten lichtmikroskopische Aufnahmen morphologische Unterschiede zwischen

den aus den Glomeruli von WT- und α8-/--Mäusen isolierten Zellen (Abb. 7 (A) und (B)).

WT-MMZ wiesen ein typisch mesenchymales Wachstum auf. Sie lagen überwiegend

vereinzelt vor und stellten Zellkontakte über ihre zahlreichen, stark ausgebreiteten

Zellausläufer her. α8-/--Zellen waren dagegen kompakter und mit wenigen und kurzen

Fortsätzen ausgestattet. Sie bildeten sogenannte Cluster, in denen die Zellen angehäuft in

Gruppen vorlagen. Sie ähnelten damit eher den für Epithelzellen typischen

pflastersteinartigen Zellverbänden. Aufgrund der untypischen Morphologie und der nicht

eindeutigen immunzytochemischen Identifizierung der α8-/--Zellen als mesangiale Zellen,

erfolgte mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie eine weitere Analyse. Im

Vergleich zu den bereits als mesangial identifizierten WT-Zellen wurden die α8-/--Zellen

auf MZ-spezifische Merkmale wie Einschlusskörperchen (phagozytotische Vesikel) und

ovaler Zellkern mit Heterochromatin hin untersucht. In beiden Aufnahmen (Abb. 7 (C) und

(D)) sind die für mesenchymale Zellen typischen ovalen Zellkerne mit Heterochromatin

(schwarze Pfeile), sogenannten Kernflecken, zu erkennen. Des Weiteren konnten sowohl

in WT- als auch in α8-/--Zellen phagozytotische Vesikel (weiße Pfeile) identifiziert

werden. Somit konnte für die aus den Glomeruli der α8-/--Maus isolierten Zellen, wie

schon für die WT-Zellen, der mesenchymale Ursprung nachgewiesen werden.

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Ergebnisse

21

Abb. 7: Morphologischer Vergleich zwischen WT- und α8-/--MMZ.

WT- und α8-/--MMZ wiesen unterschiedliche Morphologie auf. (A) und (B) Hämatoxylinfärbung (HE): Die

WT- und α8-/--Zellen wurden dazu auf unbeschichtete Chamberslides ausgesät und nach der Färbung

erfolgten lichtmikroskopische Aufnahmen in 200-facher Vergrößerung. (C) und (D)

Elektronenmikroskopische Aufnahmen von isolierten und kultivierten Zellen aus den Glomeruli von WT-

und α8-/--Mäusen in 2156-facher Vergrößerung. Die für mesenchymale Zellen charakteristischen ovalen

Zellkerne (schwarze Pfeile) und phagozytotischen Vesikel (weiße) Pfeile konnten sowohl in den WT-Zellen

(C) als auch in den α8-/--Zellen (D) identifiziert werden und bewies für beide Zellen ihre mesenchymale

Herkunft. (Mit freundlicher Unterstützung von Frau Prof. Schlötzer-Schrehardt, Augenklinik,

Universitätsklinikum Erlangen).

Die Expression von α8-Integrin wurde in WT- und α8-/--MMZ mittels Real-Time-RT-PCR

und Western Blot bestimmt. Dazu wurden Protein- und RNA-Lysate gewonnen und

jeweils die Konzentration bestimmt. In α8-/--MMZ konnte auf RNA-Ebene nur eine

geringe und auf Proteinebene keine Expression von α8-Integrin nachgewiesen werden. In

WT- MMZ dagegen zeigte sich sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene eine starke

Expression von α8-Integrin (Abb. 8).

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Ergebnisse

22

(A) Real-Time-RT-PCR

00,20,40,60,8

11,21,4

WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

*

(B) Western Blot

- α8-Integrin(160kDa)

Abl

WT α8-/-

(A) Real-Time-RT-PCR

00,20,40,60,8

11,21,4

WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

*

(A) Real-Time-RT-PCR

00,20,40,60,8

11,21,4

WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

*0

0,20,40,60,8

11,21,4

WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

*

(B) Western Blot

- α8-Integrin(160kDa)

Abl

WT α8-/-

(B) Western Blot

- α8-Integrin(160kDa)

Abl

WT α8-/-

- α8-Integrin(160kDa)

Abl

WT α8-/-

Abb. 8: Messung der α8-Integrin Expression in MMZ.

α8-/--MMZ (α8-/-) exprimierten im Vergleich zu WT-MMZ (WT) signifikant weniger α8-Integrin mRNA und

kein α8-Integrin Protein. (A) Real-Time-RT-PCR: Die Darstellung der relativen Induktion erfolgte in Bezug

auf 18S. (n=6, * p< 0,05 vs. WT). (B) Western Blot: Die Beladungskontrolle erfolgte über

Amidoschwarzfärbung (Abl).

2.2 Etablierung eines siRNA-vermittelten transienten „knockdown“ von

α8-Integrin in Ratten-Mesangiumzellen (RMZ)

RMZ wurden nach der Siebmethode [93] isoliert und ähnlich den WT-MMZ

charakterisiert. Parallel zu den dauerhaft α8-Integrin defizienten MMZ (α8-/--MMZ),

wurden RMZ mit einer transienten Reduktion der α8-Integrin Expression durch siRNA

Silencing („knockdown“) untersucht. Diese Methode erlaubt die Effekte einer akuten und

transienten Verminderung von α8-Integrin in RMZ zu untersuchen. Ein Vergleich dieser

Zellen mit MZ aus α8-/--Mäusen sollte Aufschluss darüber geben, inwieweit mögliche

kompensatorische Mechanismen bei einer dauerhaften Defizienz von α8-Integrin zum

Tragen kommen. Vor allem die kompensatorische Induktion anderer Integrine könnte

Effekte haben, die direkte Effekte der α8-Integrin Defizienz verdecken könnten. Zunächst

wurde überprüft, ob die spezifische siRNA (si itga8) die Expression des Zielgens α8-

Integrin in RMZ herunterregulieren kann. α8-Integrin mRNA-Expression wurde in einem

Zeitverlauf von 24h bis 96h nach der Transfektion bestimmt. Zur Kontrolle wurden

parallel die Zellen mit einer siRNA (si Ko) behandelt, deren Zielsequenz nicht in

eukaryontischen Zellen vorzufinden ist. Mit der si Ko sollte es somit zu keinen messbaren

spezifischen Effekten in den transfizierten RMZ kommen. Bereits 24 h nach der

Transfektion wurde α8-Integrin in siRNA transfizierten Zellen tendenziell und ab 48h

signifikant herunterreguliert (Abb. 9 (A)). Der Western Blot mit Lysaten 96h nach der

Transfektion bestätigte den Verlust an α8-Integrin Proteinen in si itga8 RMZ im Vergleich

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Ergebnisse

23

zu si Ko RMZ (Abb. 9 (B)). Die Bandenintensität der si Ko RMZ entsprach der von

unbehandelten RMZ (Daten nicht gezeigt).

(B) Western Blot(A) Real-Time-RT-PCR

0,00,20,40,60,81,01,2

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

24 h 48 h 72 h 96 h

rela

tive

Indu

ktio

n

* **

si Ko si itga8

- α8-Integrin(160kDa)

- α-Tubulin(55kDa)

(B) Western Blot(A) Real-Time-RT-PCR

0,00,20,40,60,81,01,2

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

24 h 48 h 72 h 96 h

rela

tive

Indu

ktio

n

* **

0,00,20,40,60,81,01,2

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

24 h 48 h 72 h 96 h

rela

tive

Indu

ktio

n

* **

si Ko si itga8

- α8-Integrin(160kDa)

- α-Tubulin(55kDa)

si Ko si itga8

- α8-Integrin(160kDa)

- α-Tubulin(55kDa)

si Ko si itga8si Ko si itga8

- α8-Integrin(160kDa)

- α-Tubulin(55kDa)

- α8-Integrin(160kDa)

- α-Tubulin(55kDa)

Abb. 9: Messung der α8-Integrin Expression in si RNA transfizierten RMZ.

α8-Integrin wurde durch siRNA Transfektion in RMZ sowohl auf Transkriptions- als auch auf

Translationsebene transient herunterreguliert. (A) Real-Time-RT-PCR diente zur quantitativen Bestimmung

der zeitabhängigen (24h, 48h, 72h und 96h nach der Transfektion) α8-Integrin mRNA Herunterregulation

durch siRNA Behandlung von RMZ. Zur Normierung wurde 18S verwendet. Die gemessene RNA

Expression in α8-Integrin siRNA transfizierten RMZ (si itga8) wurde in Bezug auf die RNA aus Zellen

gesetzt, die mit unspezifischer Kontroll-siRNA behandelt wurden (si Ko). Die relative Induktion wurde auf

der Y-Achse dargestellt. (n=6, * p< 0,05 vs. si Ko). (B) Western Blot Analyse der si Ko und si itga8 RMZ

Proteinlysate mit einem Antikörper gegen α8-Integrin. α-Tubulin diente als Beladungskontrolle. (n=3).

In den folgenden Untersuchungen wurden Lysate aus Zellen mit 96h Transfektionszeit

verwendet. Alle folgenden siRNA-Untersuchungen wurden durch eine weitere spezifische

siRNA für α8-Integrin (s. Methodenteil) überprüft und bestätigt (Daten werden nicht

gezeigt).

2.3 Charakterisierung der isolierten vaskulären glatten Muskelzellen

(VSMZ) aus Aorten von WT- und α8-/--Mäusen

Ähnlich wie bei Strehlow K. et al., 2003 [128] beschrieben, wurden die Aorten aus WT-

und α8-/--Mäusen präpariert, VSMZ isoliert und in eine Primärkultur überführt.

Lichtmikroskopisch waren keine auffälligen morphologischen Unterschiede zwischen WT-

und α8-/--VSMZ zu sehen (Abb. 10). Der mesenchymale Charakter blieb, mit Bildung

eines netzartigen Zellverbandes und zahlreichen lang gestreckten Ausläufern, auch beim

Fehlen von α8-Integrin in den Zellen erhalten.

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Ergebnisse

24

Abb. 10: Morphologischer Vergleich zwischen WT- und α8-/--VSMZ.

WT- und α8-/--VSMZ zeigten keine Unterschiede in ihrer Morphologie. Die Zellen wurden auf

unbeschichtete Zellkulturschalen ausgesät, mit 100% Methanol fixiert und mit Hämatoxylin (HE) gefärbt.

Die lichtmikroskopischen Aufnahmen erfolgten in 200-facher Vergrößerung.

Die Expressionsstärke von α8-Integrin wurde in VSMZ überprüft. Aus den frisch isolierten

Zellkulturen wurden Protein- und RNA-Lysate gewonnen und Protein und RNA

Konzentration gemessen. Der Nachweis des α8-Integrin Proteins erfolgte mittels Western

Blot. Parallel wurden RNA Messungen durchgeführt. In frisch isolierten α8-Integrin

defizienten VSMZ konnte im Western Blot kein α8-Integrin Protein detektiert werden

(Abb. 11 (B)). Im Vergleich zu WT-Zellen war die α8-Integrin RNA Expression in α8-/--

VSMZ bis auf eine geringe basale Expression signifikant herunterreguliert (Abb. 11 (A)).

In Zellen aus der Aorta der WT-Maus konnte dagegen die α8-Integrin Expression sowohl

auf RNA- als auch auf Protein-Ebene nachgewiesen werden.

(A) Real-Time-RT-PCR (B) Western Blot

0,00,20,40,60,81,01,21,4

WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

*

- α8-Integrin(160kDa)

Abl

WT α8-/-

(A) Real-Time-RT-PCR (B) Western Blot(A) Real-Time-RT-PCR (B) Western Blot

0,00,20,40,60,81,01,21,4

WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

*

- α8-Integrin(160kDa)

Abl

WT α8-/-

- α8-Integrin(160kDa)

Abl

WT α8-/-WT α8-/-

Abb. 11: Messung der α8-Integrin Expression in VSMZ.

α8-/--VSMZ (α8-/-) exprimierten im Vergleich zu WT-VSMZ (WT) signifikant weniger α8-Integrin mRNA

und kein α8-Integrin Protein. (A) Mittels Real-Time-RT-PCR wurde die mRNA Expression in WT-und α8-/--

Zellen gegen den 18S normiert. (n=3; * p< 0,05 vs. WT). (B) Der Protein Nachweis erfolgte mittels Western

Blot Analyse. Die Färbung mit Amidoschwarz (Abl) diente als Beladungskontrolle. (n=3).

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Ergebnisse

25

2.4 Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett

2.4.1 Vergleichende Darstellung der F-Aktine

Inwieweit die Struktur und Organisation des Zytoskeletts durch α8-Integrin beeinflusst

wurde, wurde mittels Fluoreszenzfärbungen analysiert. F-Aktin wurde durch Rhodamin-

Phalloidin, ein interkalierendes Phallotoxin, an das ein fluoreszierender Farbstoff

gebunden ist, visualisiert. Die angefärbten Aktinfilamente ließen in WT-MMZ (Abb. 12

(A)) eine dichte netzartige Struktur erkennen, die sich durch die gesamte Zelle zog. Das

„Netz“ aus Aktinfilamenten zeigte zum Teil parallel angeordnete, aber auch quer

verlaufende Fasern. An der Peripherie der Zellen konnte eine Verdichtung der F-Aktine

(intensivere Fluoreszenz) detektiert werden. In α8-/--MMZ (Abb. 12(B)) dagegen waren

die Aktinfilamente überwiegend nur noch randständig und parallel angeordnet lokalisiert.

Die charakteristische netzartige Organisation der F-Aktine hatte sich vollständig aufgelöst

(Abb. 12 (B)). Die zuvor nach HE-Färbung lichtmikroskopisch sichtbare Veränderung der

α8-/--MMZ Morphologie (Abb. 7 (B)) spiegelte sich in der zytochemischen Analyse wider.

Der Mangel an α8-Integrin in VSMZ (Abb. 12 (D)) zeigte im Vergleich zum Wildtyp der

Zellen (Abb. 12 (C)) keinen Einfluss auf die Aktinfilamente. Passend zur Morphologie

(Abb. 10) ließen sich in WT- und α8-/--VSMZ keine Unterschiede in der Organisation des

Zytoskeletts nachweisen. Die transiente Herunterregulation von α8-Integrin in RMZ (si

itga8 RMZ) führte zu einer veränderten Verteilung der Aktinfilamente ähnlich der

Veränderung, wie sie in α8-/--MMZ zu beobachten war. In si itga8 RMZ waren die

Aktinfilamente überwiegend parallel und randständig angeordnet (Abb. 12 (F)). Zeitgleich

wurden RMZ mit nicht funktionaler siRNA (si Ko) transfiziert und ließen einen

unveränderten, den WT-MMZ (Abb. 12 (A)) vergleichbaren Phänotyp erkennen (Abb. 12

(E)).

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Ergebnisse

26

Abb. 12: Vergleichende Fluoreszenzfärbungen der Aktinfilamente.

(B) α8-/--MMZ und (F) si itga8 RMZ wiesen im Vergleich zu (A) WT-MMZ bzw. (E) si Ko RMZ eine

veränderte Organisation der F-Aktinfilamente auf. (C) WT- und (D) α8-/--VSMZ zeigten keine Veränderung

in der netzartigen Struktur der F-Aktine. 2000 Zellen/Well wurden auf einen unbeschichteten 8-Kammer

Objektträger in 500µl D10+ ausgesät, mit 100% Methanol fixiert und F-Aktin mit interkalierendem

Rhodamin-Phalloidin sichtbar gemacht. (A) WT- und (B) α8-/--MMZ in 400-facher Vergrößerung. (C) WT-

und (D) α8-/--VSMZ in 200-facher Vergrößerung. (E) si Ko- und (F) si itga8 RMZ in 400-facher

Vergrößerung.

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Ergebnisse

27

2.4.2 Vergleichende immunzytochemische Darstellung der Stressfasern

Während Rhodamin-Phalloidin durch seine interkalierende Eigenschaft generell alle Arten

von F-Aktinfilamenten visualisieren kann, dient die Untersuchung der α-SMA Expression

der spezifischen Analyse der Stressfasern. In WT-MMZ war α-SMA in charakteristischen

Stressfasern angeordnet, die sich über die gesamte Zelle verteilten (Abb. 13 (A)). In α8-/--

MMZ waren dagegen nur wenige einzelne Zellen gefärbt (mit einem langen weißen Pfeil

markiert). In diesen Zellen konnten die Stressfasern überwiegend nur kortikal

nachgewiesen werden. Die Mehrheit der Zellen konnte durch den α-SMA-Antikörper nicht

angefärbt werden (kleine weiße Pfeile) (Abb. 13 (B)). WT- und α8-/--VSMZ zeigten keine

Unterschiede in der Organisation der mit α-SMA-Antikörper detektierten Stressfasern.

Diese durchzogen gleichmäßig die gesamte Zelle (Abb. 13 (C) und (D)). In

Übereinstimmung mit den oben gezeigten F-Aktin Färbungen (Abb. 13 (F)), waren die

Stressfasern in si itga8 RMZ vermehrt parallel und in der Nähe des Zellrandes lokalisiert

(langer weißer Pfeil) und dokumentierten damit den Verlust der netzförmigen Struktur

(Abb. 13 (F)). Ähnlich der α8-/--MMZ (Abb. 13 (B)) konnten durch den Mangel an α8-

Integrin nur noch in wenigen vereinzelten si itga8 RMZ Stressfasern angefärbt werden

(kleine weiße Pfeile) (Abb. 13 (F)). Die Stressfasern in si Ko RMZ waren dagegen keiner

erkennbaren Veränderung unterworfen (Abb. 13 (E)).

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Ergebnisse

28

Abb. 13: Vergleichende Immunzytochemie der Stressfasern (α-SMA).

Nicht in allen (B) α8-/--MMZ und (F) si itga8 RMZ konnten im Vergleich zu (A) WT-MMZ bzw. (E) si Ko

RMZ noch Stressfasern nachgewiesen werden (ungefärbte Zellen werden mit kurzen, weißen Pfeile

markiert). In den wenigen, vereinzelten (B) α8-/--MMZ und (F) si itga8 RMZ, in denen Stressfasern

ausgebildet wurden, lagen diese in einer veränderten Organisation und Lokalisation vor (lange weiße Pfeile).

(C) WT- und (D) α8-/--VSMZ waren in der Organisation ihrer Stressfasern unverändert. (A) und (B)

Immunzytochemie von Stressfasern in WT- vs. α8-/--MMZ in 200-facher Vergrößerung. (C) und (D) WT–

und α8-/--VSMZ in 400-facher Vergrößerung. (E) si Ko und (F) si itga8 transfizierte RMZ in 200-facher

Vergrößerung.

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Ergebnisse

29

2.4.3 Nachweis der α-SMA Expression in mesenchymalen Zellen

Ergänzend dazu wurde die RNA- und Proteinexpression von α-SMA in den untersuchten

Zelltypen bestimmt. Die Durchführung der Nachweise für α-SMA-RNA und -Protein

erfolgte aus identisch behandelten Zellen. Auf mRNA-Ebene konnte im Vergleich zu WT-

MMZ in α8-/--MMZ eine signifikant geringere α-SMA Expression detektiert werden. Im

Gegensatz zu WT-MMZ konnte in α8-/--MMZ kein α-SMA Protein nachgewiesen werden

(Abb. 14 (A)). Dagegen war kein Unterschied in der α-SMA mRNA und Protein

Expressionsstärke zwischen WT- und α8-/--VSMZ zu detektieren (Abb. 14 (B)). Im

Vergleich zu si Ko RMZ wurde in einer Zeitkinetik von 24h bis 96h nach der Transfektion

in si itga8 RMZ ab 48h eine signifikante Verringerung der α-SMA RNA Expression

ermittelt (Abb. 14 (C)). Die Befunde des Western Blots wiesen auf eine verminderte α-

SMA Protein in den si itga8 RMZ hin und unterstützten die in der Real-Time PCR

erhobenen Daten (Abb. 14 (C)). Diese Beobachtungen deuteten darauf hin, dass das Fehlen

von α8-Integrin in den Mesangiumzellen den Aufbau und die Verteilung der

Aktinfilamente beeinflusst und eine morphologische Veränderung der Zelle zur Folge

haben kann. Dagegen konnte in den VSMZ durch das Fehlen von α8-Integrin keine

Beeinflussung des Zytoskeletts und der Zellform gezeigt werden.

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Ergebnisse

30

Real-Time-RT-PCR Western Blot

(A) MMZ

0,00,20,40,60,81,01,21,4

WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

* Abl

- α-SMA(42kDa)

WT α8-/-

0,00,20,40,60,81,01,21,4

WT α8-/-

real

tive

Indu

ktio

n

(B) VSMZWT α8-/-

Abl

- α-SMA(42kDa)

00,20,40,60,8

11,21,4

si K

osi itg

a8si

Ko

si itga8

si K

osi itga8

si K

osi itg

a8

24h 48h 72h 96h

rela

tive

Indu

ktio

n

** *

(C) si RMZ

- α-Tubulin(55kDa)

- α-SMA(42kDa)

si itga8si Ko

Real-Time-RT-PCR Western Blot

(A) MMZ

0,00,20,40,60,81,01,21,4

WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

* Abl

- α-SMA(42kDa)

WT α8-/-

Real-Time-RT-PCR Western Blot

(A) MMZ

0,00,20,40,60,81,01,21,4

WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

*0,00,20,40,60,81,01,21,4

WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

* Abl

- α-SMA(42kDa)

WT α8-/-

Abl

- α-SMA(42kDa)

WT α8-/-

Abl

- α-SMA(42kDa)

Abl

- α-SMA(42kDa)

WT α8-/-WT α8-/-

0,00,20,40,60,81,01,21,4

WT α8-/-

real

tive

Indu

ktio

n

(B) VSMZWT α8-/-

Abl

- α-SMA(42kDa)

0,00,20,40,60,81,01,21,4

WT α8-/-

real

tive

Indu

ktio

n

(B) VSMZWT α8-/-

Abl

- α-SMA(42kDa)

WT α8-/-WT α8-/-

Abl

- α-SMA(42kDa)

Abl

- α-SMA(42kDa)

00,20,40,60,8

11,21,4

si K

osi itg

a8si

Ko

si itga8

si K

osi itga8

si K

osi itg

a8

24h 48h 72h 96h

rela

tive

Indu

ktio

n

** *

(C) si RMZ

- α-Tubulin(55kDa)

- α-SMA(42kDa)

si itga8si Ko

00,20,40,60,8

11,21,4

si K

osi itg

a8si

Ko

si itga8

si K

osi itga8

si K

osi itg

a8

24h 48h 72h 96h

rela

tive

Indu

ktio

n

** *

00,20,40,60,8

11,21,4

si K

osi itg

a8si

Ko

si itga8

si K

osi itga8

si K

osi itg

a8

24h 48h 72h 96h

rela

tive

Indu

ktio

n

00,20,40,60,8

11,21,4

si K

osi itg

a8si

Ko

si itga8

si K

osi itga8

si K

osi itg

a8

24h 48h 72h 96h

rela

tive

Indu

ktio

n

** *

(C) si RMZ

- α-Tubulin(55kDa)

- α-SMA(42kDa)

si itga8si Ko

- α-Tubulin(55kDa)

- α-SMA(42kDa)

si itga8si Ko si itga8si Ko

Abb. 14: α-SMA Expression in mesenchymalen Zellen.

Der Nachweis der α-SMA Expression erfolgte vergleichend zwischen (A) WT- und α8-/--MMZ, (B) WT- und

α8-/--VSMZ, sowie (C) si Ko und si itga8 RMZ. Im Vergleich zu (A) WT-MMZ bzw. (C) si Ko RMZ wurde

α-SMA mRNA sowohl in α8-/--MMZ als auch in si itga8 RMZ 48h, 72h und 96h nach der Transfektion

signifikant geringer exprimiert. Der Mangel an α8-Integrin führte in α8-/--MMZ zum Verlust des Proteins (A)

und in si itga8 RMZ im Vergleich zu si Ko RMZ zu einer geringeren Expression des Proteins (C). Dagegen

führte der Mangel an α8-Integrin in VSMZ weder auf mRNA noch auf Proteinebene zu einer veränderten α-

SMA Expression (B). Real-Time-RT-PCR: Die mRNA Messdaten des Zielgens wurden gegen 18S normiert.

Die relative Induktion wird auf der Y-Achse dargestellt. (n=3, * p< 0,05 vs. WT bzw. si Ko). Die Western-

Blot-Analyse wurde zur Detektion vom α-SMA Protein angewendet. Amidoschwarz (Abl) und α-Tubulin

dienten als Beladungskontrolle (n=3).

2.5 Einfluss von α8-Integrin auf die Bildung fokaler Kontakte

Page 42: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

31

Die beobachtete Umorganisation des Zytoskeletts führte zu der Frage, inwieweit die

Bildung fokaler Kontakte durch das Fehlen von α8-Integrin beeinflusst wurde. Es ist

bekannt, dass in vitro Stressfasern mit fokalen Kontakten verbunden sind [52, 129].

Vinculin ist ein wichtiges Adaptermolekül zwischen fokalen Kontakten und F-

Aktinfilamenten [55]. Deshalb können fokale Kontakte mit Hilfe eines Vinculin-

Antikörpers visualisiert werden. Dafür wurden Zellen auf 8-Kammer Objektträger ausgesät

und zum einen mit dem Vinculin-Antikörper allein sowie zusammen mit einem

Fluoreszenzfarbstoff-konjugiertem Phalloidin (Doppelfärbungen) immunzytochemisch

untersucht. Die immunzytochemischen Doppelfärbungen verdeutlichten, dass die

Aktinfilamente mit Vinculin verbunden in fokalen Kontakten enden (Abb. 15 (A), (B), (G)

und (H)). Während die Menge an Vinculin zwischen WT- und α8-/--MMZ nicht

unterschiedlich war (Abb. 15 (I)), konnte für Vinculin ein veränderte Lokalisation gezeigt

werden. So waren nach der Vinculin-Antikörperfärbung in WT-MMZ (Abb. 15 (A))

vereinzelte Strukturen zu sehen, die sich gleichmäßig über die Gesamtzelle verteilten,

während in α8-/--MMZ (Abb. 15 (B)) geclusterte Bündel detektiert wurden. Diese Befunde

korrelierten mit dem Verlust der ursprünglichen netzartigen Struktur und der Neuordnung

der Aktinfilamente zu mehr parallel und randständig lokalisierten Strukturen (s. Kapitel

2.4.1). In WT- und α8-/--VSMZ erfolgte die Analyse von Vinculin ebenfalls mit einem

spezifischen Antikörper und dokumentierte eine gleich aussehende Verteilung der fokalen

Kontakte (Abb. 15 (C) und (D)). VSMZ aus WT- und α8-/--Mäusen waren demzufolge in

ihrem morphologischen Erscheinungsbild, in der Organisation des Zytoskeletts und in der

Lokalisation von Vinculin unverändert. Der transiente Mangel an α8-Integrin in MZ (Abb.

15 (E) und (F)) führte zu vergleichbaren Ergebnissen wie in α8-/--MMZ (Abb. 15 (A) und

(B)). So waren die Vinculin-positive fokalen Kontakte in si Ko-RMZ als längliche Struktur

zu erkennen, die gleichmäßig über die Zellen verteilt waren (Abb. 15 (E)). Hingegen

konnte häufig eine Bündelung der nun gedrungenen Strukturen beobachtet werden, wenn

in RMZ α8-Integrin durch siRNA-Transfektion transient herunterreguliert war (Abb. 15

(F)). Durch die Doppelfärbungen von Vinculin und F-Aktin wurde vor allem die

morphologische Veränderung, hinsichtlich der strukturellen Umorganisation der

Aktinfilamente und dem Verteilungsmuster von Vinculin, deutlich (Abb. 15 (G) und (H)).

Die Herunterregulation von α8-Integrin in RMZ führte zu abgerundeten Zellen mit kurzen

und wenigen Zellausläufern (Abb. 15 (H)) wie sie auch in α8-/--MMZ (Abb. 15 (B))

vorlagen.

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Ergebnisse

32

Abb. 15: Vergleichende Immunzytochemie für Vinculin.

Die Lokalisation von Vinculin war in den (B) α8-/--MMZ und (F) und (H) si itga8 RMZ deutlich gegenüber

den (A) WT-MMZ bzw. (E) und (G) si Ko RMZ verändert. Dagegen führte der Mangel an α8-Integrin in den

VSMZ (D) zu keiner veränderten Lokalisation von Vinculin im Vergleich zu (E) WT-VSMZ. (A) und (B)

Immunzytochemie-Doppelfärbung von MMZ in 400-facher Vergrößerung. Vinculin (rot) wurde mittels eines

Primärantikörpers detektiert. Die F-Aktinfilamente (grün) wurden mit Hilfe von Phalloidin sichtbar gemacht.

(C) und (D) Vergleichende Lokalisation von Vinculin (rot) in VSMZ in 800-facher Vergrößerung. In (E) si

Ko- und (F) si itga8 RMZ wird die Lokalisation von Vinculin (grün) in 400-facher Vergrößerung

gegenübergestellt. (G) und (H) Doppelfärbung (Vinculin (grün) und F-Aktin (rot)) in den siRNA

transfizierten RMZs. (I) Proteinlysate aus WT- und α8-/--MMZ wurden mit einem Primärantikörper gegen

Vinculin inkubiert. Amidoschwarzfärbung (Abl) diente als Beladungskontrolle.

Page 44: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

33

2.6 Vergleich mesenchymaler und epithelialer Marker

2.6.1 Expression mesenchymaler und epithelialer Marker

Um die Veränderungen in der MZ-Morphologie durch den Verlust von α8-Integrin genauer

zu beleuchten, wurden zunächst auf RNA-Ebene neben α-SMA die Expression weiterer

typischer mesenchymaler Marker wie Vimentin, Desmin und Fibronektin (FN) analysiert.

Mit E-Cadherin wurde zudem ein epithelialer Marker hinsichtlich seiner Expression in MZ

untersucht. In α8-/--MMZ konnten Desmin und FN im Vergleich zu WT-MMZ signifikant

geringer exprimiert nachgewiesen werden. E-Cadherin dagegen zeigte eine ca. dreifach

und Vimentin eine ca. sechsfach erhöhte mRNA Expression (Abb. 16 (A)). Im Vergleich

zu si Ko RMZ lagen die mesenchymalen Marker FN, Vimentin und Desmin in si itga8

RMZ signifikant geringer exprimiert vor. Ebenso konnte für den epithelialen Marker E-

Cadherin eine signifikant verminderte Expression nachgewiesen werden (Abb. 16 (B)).

0,00,20,40,60,81,01,21,4

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

Vimentin Desmin FN E-Cadherin

rela

tive

Indu

ktio

n

* *

**

(B) si RMZ

0,01,02,03,04,05,06,07,08,0

WT α8-/- WT α8-/- WT a8-/- WT α8-/-

Vimentin Desmin FN E-Cadherin

rela

tive

Indu

ktio

n

*

*

* *

(A) MMZ

0,00,20,40,60,81,01,21,4

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

Vimentin Desmin FN E-Cadherin

rela

tive

Indu

ktio

n

* *

**

(B) si RMZ

0,00,20,40,60,81,01,21,4

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

Vimentin Desmin FN E-Cadherin

rela

tive

Indu

ktio

n

* *

**

(B) si RMZ

0,01,02,03,04,05,06,07,08,0

WT α8-/- WT α8-/- WT a8-/- WT α8-/-

Vimentin Desmin FN E-Cadherin

rela

tive

Indu

ktio

n

*

*

* *

(A) MMZ

0,01,02,03,04,05,06,07,08,0

WT α8-/- WT α8-/- WT a8-/- WT α8-/-

Vimentin Desmin FN E-Cadherin

rela

tive

Indu

ktio

n

*

*

* *0,01,02,03,04,05,06,07,08,0

WT α8-/- WT α8-/- WT a8-/- WT α8-/-

Vimentin Desmin FN E-Cadherin

rela

tive

Indu

ktio

n

*

*

* *

(A) MMZ

Abb. 16: Messung mesenchymaler und epithelialer Marker.

Page 45: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

34

(A) Im Vergleich zu WT-MMZ (WT) führte der Verlust von α8-Integrin in α8-/--MMZ (α8-/-) zu einer

signifikanten Hochregulation von Vimentin (6-fach) und E-Cadherin (3-fach), während Desmin und FN

signifikant geringer exprimiert wurden. (B) In si itga8 RMZ (si itga8) waren alle untersuchten Marker im

Bezug auf si Ko RMZ (si Ko) signifikant reprimiert vorzufinden. RNA wurde aus (A) WT- und α8-/--MMZ

und aus (B) mit siRNA behandelten RMZ isoliert und mit Real-Time-RT-PCR quantifiziert. Die mRNA

Messdaten der Zielgene wurden gegen 18S normiert. (n=3; *p> 0,05 vs. (A) WT und (B) si Ko).

2.6.2 Immunzytochemische Desmin-Färbung von siRNA transfizierten RMZ

Inwieweit Proteinsynthese und intrazelluläre Verteilung von Desmin durch die reduzierte

α8-Integrin Expression beeinflusst wurden, wurde mittels immunzytochemischer Analyse

96h nach siRNA Transfektion in RMZ untersucht. In si Ko-Zellen war eine starke Färbung

von Desmin detektierbar (Abb. 17). In si itga8 RMZ konnte Desmin nicht mehr in allen

Zellen nachgewiesen werden (Abb. 17). Vergleichbare Veränderungen wurden auch in α8-

/--MMZ beobachtet (nicht gezeigt). Somit konnte neben α-SMA (Abb. 13 und Abb. 14)

auch für den mesenchymalen Marker Desmin eine Reduktion der Expression auf

Proteinebene gezeigt werden (Abb. 17).

Abb. 17: Beispielhafte Desmin/F-Aktin Doppelfärbung von siRNA transfizierten RMZ.

Die transiente Herunterregulation von α8-Integrin in RMZ mittels der siRNA-Silencing-Methode (si itga8)

führte auch auf Proteinebene zu einer geringeren Expression von Desmin im Vergleich zu si Ko behandelten

RMZ (si Ko). Die Färbung der F-Aktinfilamente erfolgte mit interkalierendem Rhodamin-Phalloidin (rot)

und wurde in einer 200-fachen Vergrößerung aufgenommen.

Page 46: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

35

2.7 Zellbiologische Untersuchungen zur Funktion von α8-Integrin

2.7.1 Einfluss von α8-Integrin auf Adhäsion und Ausbreitung

Bekanntermaßen sind Integrine an ECM-Zell-Interaktionen beteiligt. Inwieweit der

Mangel an α8-Integrin zu einem veränderten adhäsiven Verhalten führt, wurde im

Folgenden untersucht. Eine Voraussetzung für die Ausbreitung ist die Adhäsion. Somit

dient die Bestimmung der Ausbreitung der Zellen zusätzlich als Hinweis für eine feste

Anhaftung der Zellen an ihre Umgebung. Während Fibronektin (FN) einer der

Hauptliganden von α8-Integrin darstellt, ist Kollagen I (Col I) kein Bindungspartner. 2%

BSA wurde als Negativkontrolle verwendet. Im Vergleich zu WT-MMZ adhärierten α8-/--

MMZ auf Col I unverändert. Bei dem Liganden FN lag eine verminderte Anhaftung der

α8-/--MMZ vor (Abb. 18 (A)). WT-MMZ breiteten sich auf FN und auf Col I geringer aus

als α8-/--MMZ (Abb. 18 (B)). In unbeschichteten Kontroll-Wells (PL) konnte weder ein

Unterschied im Adhäsionsverhalten noch in der Ausbreitung beobachtet werden (Abb. 18

(A) und (B)). VSMZ adhärierten auf FN am stärksten, während die Adhäsion auf PL und

auf Col I ähnlich gering war. Mit demselben Versuchsansatz wurde auch die Ausbreitung

der VSMZ analysiert. So breiteten sich diese Zellen unabhängig von der α8-Integrin

Expression am stärksten auf FN aus. Der Mangel an α8-Integrin führte in VSMZ sowohl

hinsichtlich der Adhäsion als auch der Ausbreitung zu keiner signifikanten Veränderung

(Abb. 18 (C) und (D)). Verglichen mit si Ko RMZ adhärierten si itga8 RMZ auf FN

geringer. Auf Col I und auf PL war kein Unterschied im Adhärenz-Verhalten zu

beobachten (Abb. 18 (E)). Wurden si itga8 RMZ mit si Ko RMZ hinsichtlich der

Ausbreitungsrate gegenübergestellt, so zeigte sich auf FN ein geringerer Anteil an

ausgebreiteten Zellen. Auf PL und auf Col I ausgesäte Zellen zeigten insgesamt weniger

Ausbreitung und es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen si itga8 RMZ und si

Ko RMZ ermittelt werden (Abb. 18 (F)).

Page 47: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

36

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Adh

äsio

n (%

)

*

(A) MMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Aus

brei

tung

(%)

*

*

(B) MMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PLA

usbr

eitu

ng (%

)

(D) VSMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Adh

äsio

n (%

)

(C) VSMZ

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

Aus

brei

tung

(%)

*

(F) si RMZ

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

Adh

äsio

n (%

)

*

(E) si RMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Adh

äsio

n (%

)

*

(A) MMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Adh

äsio

n (%

)

*

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Adh

äsio

n (%

)

*

(A) MMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Aus

brei

tung

(%)

*

*

(B) MMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Aus

brei

tung

(%)

*

*

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Aus

brei

tung

(%)

*

*

(B) MMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PLA

usbr

eitu

ng (%

)

(D) VSMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PLA

usbr

eitu

ng (%

)

(D) VSMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Adh

äsio

n (%

)

(C) VSMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Adh

äsio

n (%

)

(C) VSMZ

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

Aus

brei

tung

(%)

*

(F) si RMZ

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

Aus

brei

tung

(%)

*

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

Aus

brei

tung

(%)

*

(F) si RMZ

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

Adh

äsio

n (%

)

*

(E) si RMZ

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

Adh

äsio

n (%

)

*

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

Adh

äsio

n (%

)

*

(E) si RMZ

Abb. 18: Adhäsions- und Ausbreitungsassays.

α8-/--MMZ (α8-/-) (A) adhärierten und (B) breiteten sich auf FN geringer aus als WT-MMZ (WT). WT- und

α8-/--VSMZ zeigten keine signifikanten Unterschiede in der (C) Adhäsion und in der (D) Ausbreitung. Die

transiente Herunterregulation von α8-Integrin in RMZ (si itga8) führte auf FN zu verminderter (E) Adhäsion

und (F) Ausbreitung im Vergleich zu si Ko RMZ (si Ko). Adhärente Zellen wurden mit HE angefärbt,

gezählt und prozentual gegen die Gesamtzahl ausgesäter Zellen ausgewertet. Die prozentuale Auswertung

ausgebreiteter Zellen erfolgte im gleichen Versuchsansatz. (n=4, * p< 0,05 vs. WT-MMZ bzw. si Ko).

2.7.2 Einfluss von α8-Integrin auf Migration

In vitro wurde der Einfluss von mangelnder α8-Integrin Expression auf die Migration der

zu untersuchenden Zellen mittels dreier Methoden, des Wundheilungstests, des Barriere-

Assays [130] und des Boydenkammer Assays untersucht.

Page 48: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

37

2.7.2.1 Migration im Wundheilungstest (Scratch Assay)

Um das Wanderungsverhalten von MMZ zu beobachten, wurden die Zellen auf

unbeschichtete 6cm Petrischalen konfluent ausgesät. Mittels einer gelben Pipettenspitze

wurde ein Kratzer durch den Zellrasen gezogen (“Scratchen“). Zum Zeitpunkt 0h sowie

nach 4h, 19h, 27h und 48h wurde der Spalt an zuvor markierten Stellen fotografiert.

Nach dem Verletzen des Monolayers war zu Beginn des Versuches (0h) ein klar definierter

Spaltrand zu erkennen. Nach 4h waren bereits mehr WT-MMZ als α8-/--MMZ in den Spalt

eingewandert. Nach 19h Versuchszeit kehrte sich diese Beobachtung um. Nach 48h waren

α8-/--MMZ konfluent gewachsen, während bei WT-MMZ noch ein restlicher Spalt zu

erkennen war (Abb. 19).

Abb. 19: Migration im Wundheilungstest.

Beispielhafte Fotos des zur Einwanderung der Zellen in den durch „Scratchen“ hergestellten Spalts im

konfluenten Zellrasen. Nach dem Versuchsende (48h) war der Zellrasen mit (B) α8-/--MMZ wieder konfluent

geschlossen, während im Ansatz mit (A) WT-MMZ noch ein restlicher Spalt zu erkennen war. In der oberen

Reihe sind die Spaltränder der WT-MMZ und in der unteren Reihe die der α8-/--MMZ abgebildet. Die Fotos

wurden bei 10-facher Vergrößerung lichtmikroskopisch aufgenommen.

Wir konnten nicht eindeutig feststellen, ob die zu einem späteren Zeitpunkt vermehrte

Migration der α8-/--MMZ wirklich allein auf den Mangel von α8-Integrin zurückzuführen

war. Zum einen konnte der Anteil an proliferierenden Zellen nicht bestimmt werden und

zum anderen war die Spaltgröße zu Versuchsbeginn nicht immer gleich. Zudem kann beim

Scratch Assay die Matrix-Beschichtung durch das Ritzen des Zellrasens mit einer

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Ergebnisse

38

Pipettenspitze zerstört und somit die matrixabhängige Wanderung der Zellen verfälscht

werden. Die Unversehrtheit der Matrix-Beschichtung sowie eine genormte Spaltbreite

konnte durch die Verwendung des Barriere-Assays gewährleistet werden [130].

2.7.2.2 Migration im Barriere-Assay

Auf FN und auf Col I beschichteten 6cm Petrischalen und auf PL wurde durch eine

Barriere in konfluent ausgesäten MMZ bzw. mit siRNA transfizierten RMZ ein Spalt

freigehalten, der eine lichtmikroskopische und fotografische Auswertung (0h, 24h und

48h) von eingewanderten Zellen zuließ. Anschließend wurde ein BrdU-Assay

durchgeführt, um proliferierende Zellen prozentual zu bestimmen. Somit sollte abgeschätzt

werden, wie groß der Anteil der proliferierenden Zellen an der Gesamtzahl der sich im

Spalt befindenden Zellen war. Ein Ziel dieser Methode war, die Migrations- und

Proliferationseffekte zu trennen. Unabhängig von der Beschichtung der Kulturschalen

waren im Spalt nach 48h Migrationszeit tendenziell mehr α8-/--MMZ zu erkennen als im

vergleichenden Ansatz des WT-Phänotyps. Hierfür lag aber kein signifikanter Unterschied

vor (Abb. 20 (A)). Auf Col I und auf PL waren bezüglich si Ko-RMZ 48h nach der

Transfektion signifikant vermehrt si itga8 RMZ in den Spalt eingewandert. Auf FN konnte

kein Unterschied bestimmt werden (Abb. 20 (B)). Die Proliferation der Zellen wurde

mittels BrdU-Assay nach 48h Migration bestimmt. Hierzu wurde in den letzten 2 Stunden

des Migrationsversuches BrdU (1:1000) in das Medium dazugegeben. α8-/--MMZ

proliferierten auf Col I und FN mehr als WT-MMZ (Abb. 20 (C)). Auf PL konnte dagegen

ein tendenziell vermindertes Wachstumsverhalten beobachtet werden. Si itga8 RMZ

proliferierten in der Barriere auf FN und auf PL schneller als RMZ mit si Ko RNA

behandelt. Auf Col I konnte keine signifikante Veränderung im Proliferationsverhalten

bestimmt werden (Abb. 20 (D)).

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Ergebnisse

39

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

Mig

ratio

n (%

)0

20406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

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ifera

tion

(%)

**

(D) si RMZ Barriere Proliferation

* *

(B) si RMZ Barriere Migration

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

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(%)

*

(C) MMZ Barriere Proliferation

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Mig

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n (%

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020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

Mig

ratio

n (%

)

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

Mig

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n (%

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20406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

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(%)

**

(D) si RMZ Barriere Proliferation

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

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(%)

**

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

Prol

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(%)

**

(D) si RMZ Barriere Proliferation

* *

(B) si RMZ Barriere Migration

* *

(B) si RMZ Barriere Migration

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Prol

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(%)

*

(C) MMZ Barriere Proliferation

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Prol

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(%)

*

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Prol

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tion

(%)

*

(C) MMZ Barriere Proliferation

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Mig

ratio

n (%

)(A) MMZ Barriere Migration

Abb. 20: Migration im Barriere-Assay.

Grafische Darstellung der migrierenden (A) WT- und α8-/--MMZ und (B) si Ko- und si itga8 transfizierten

RMZ. Der prozentuale Anteil an proliferierenden Zellen, die sich nach dem Versuchsende (48h) im Spalt

befanden, wurden grafisch für (C) MMZ und (D) si RMZ dargestellt. Mittels MetaVue wurde die Spaltfläche

vermessen und die Spaltbreite nach einer 48-stündigen Versuchszeit berechnet. Die Differenz zwischen der

Spaltbreite nach Versuchsende (48h) und der Spaltbreite zu Versuchsbeginn (0h) wurde bestimmt. Je größer

die Differenz der Spaltbreite, umso mehr Zellen befanden sich im Spalt. Der prozentuale Differenzwert

wurde berechnet und auf der Y-Achse dargestellt. (n=3, * p< 0,05 vs. WT bzw. si Ko). WT = WT-MMZ; α8-/-

= α8-/--MMZ; si Ko = si Ko RMZ; si itga8 = si itga8 RMZ.

Wie anhand der Grafiken (Abb. 20) deutlich wird, nahmen die proliferierenden Zellen nach

der 48-stündigen Versuchszeit einen großen Anteil an den im „Spalt“ befindlichen Zellen

ein. Somit eignete sich diese Methode nur eingeschränkt, um das migratorische Verhalten

der MMZ und RMZ zu bestimmen. Um eine sichere Aussage über das

Wanderungsvermögen der Zellen zu erhalten, musste eine Methode mit einer deutlich

kürzeren Versuchszeit gewählt werden, um Proliferationseffekte ausschließen zu können.

2.7.2.3 Migration in der Boydenkammer (Boyden Chamber Assay)

In der Boydenkammer wandern die Zellen chemotaktisch durch eine Membran in Richtung

des Attraktans. Für den Versuchsansatz wurden Col I (30µg/ml) und FN (40µg/ml) als

Page 51: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

40

Attraktantien verwendet und in die Vertiefungen der unteren Kammer vorgelegt.

Chemotaxismedium (Ko) wurde als Negativkontrolle mitgeführt. Bei Verwendung von FN

als Attraktans, migrierten α8-/--MMZ mehr als WT-MMZ. Für Col I und die Ko konnte

keine erhöhte Migrationsrate der α8-/--MMZ gegenüber den WT-MMZ bestimmt werden,

wobei MMZ insgesamt auf Col I wesentlich geringer migrierten als auf FN (Abb. 21 (A)).

FN stimulierte α8-/--VSMZ zu einer signifikant höheren Migrationsrate als WT-VSMZ.

Col I übte auf VSMZ im Vergleich zum α8-Integrin Liganden FN eine deutlich geringere

chemotaxische Wirkung aus. Für α8-/-- und WT-VSMZ konnte auf Col I kein signifikanter

Unterschied protokolliert werden. (Abb. 21 (B)).

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN Ko

Mig

ratio

n (%

)

*

(A) MMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN Ko

Mig

ratio

n (%

)*

(B) VSMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN Ko

Mig

ratio

n (%

)

*

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN Ko

Mig

ratio

n (%

)

*

(A) MMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN Ko

Mig

ratio

n (%

)*

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN Ko

Mig

ratio

n (%

)*

(B) VSMZ

Abb. 21: Migration in der Boydenkammer.

Auf FN wanderten sowohl die (A) α8-/--MMZ (α8-/-) als auch die (B) α8-/--VSMZ (α8-/-) signifikant mehr als

die jeweiligen WT-Zellen (WT). Auf Col I konnte weder für (A) MMZ noch für (B) VSMZ ein signifikanter

Unterschied im Wanderungsverhalten beobachtet werden. Vergleichende Analyse der migrierenden (A) WT-

und α8-/--MMZ und (B) WT- und α8-/--VSMZ. FN und Col I wurden als Attraktans verwendet. Ko steht für

die Verwendung des Chemotaxismediums ohne Zugabe von Attraktantien und wurde als Negativkontrolle

verwendet. Pro Ansatz wurden Tripletts angelegt, je drei Gesichtsfelder ausgezählt und prozentual auf der Y-

Achse dargestellt. (n=3, * p< 0,05 vs. WT).

2.7.3 Einfluss von α8-Integrin auf das Zellüberleben

Da Integrine auf die Apoptose von Zellen modulierend einwirken können [39], wurde in

den folgenden Versuchen in MMZ und VSMZ Apoptose mittels Serumentzug (D0) oder

cis-Platin Gabe ausgelöst, um herauszufinden, ob und inwieweit das Zellüberleben von α8-

Integrin abhängig ist.

Page 52: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

41

2.7.3.1 Apoptose im Caspase-3 Assay

Die Aktivierung der Effektorcaspase-3 gilt als ein früher Marker des programmierten

Zelltodes. Der Caspase-3-Assay stellt eine Methode dar, mit deren Hilfe die Aktivität der

Caspase-3 gemessen werden kann. In Bezug zu unstimulierten Kontrollen (Ko) wiesen

sowohl WT- als auch α8-/--MMZ nach Apoptosestimulation mit 50µM cis-Platin (50µM)

auf allen Matrices eine signifikant höhere Apoptoserate auf (mit * markiert). Dabei zeigten

stimulierte WT-MMZ auf FN einen ca. 10-fachen und auf PL einen über 6-fachen

signifikanten Anstieg der Caspase-3-Aktivität im Vergleich zur Ko (Abb. 22 (A)).

Bezüglich stimulierter WT-MMZ konnte auf FN und auf PL mittels cis-Platin in α8-/--

MMZ eine signifikant geringere Apoptoserate induziert werden (mit # markiert). Dagegen

war auf Col I kein Unterschied zwischen stimulierten WT- und α8-/--MMZ festzustellen

(Abb. 22 (A)). Diese Ergebnisse konnten mit serumfreiem Medium (D0) als

Apoptosestimulans reproduziert werden. Auch erste Untersuchungen mit si RMZ zeigten

aufgrund der Herunterregulation der α8-Integrin Expression auf FN eine geringere

Apoptoserate. Caspase-3-Aktivitäts-Messungen in VSMZ erfolgten mit cis-Platin in zwei

Konzentrationen (50µM und 100µM). Wie auch in MMZ führte die Stimulation sowohl

der WT- als auch der α8-/--VSMZ im Vergleich zur unstimulierten Ko zu einer signifikant

vermehrten Apoptose (mit * markiert). Aber im Gegensatz zu MMZ konnte in der

Apoptoserate zwischen stimulierten WT- und α8-/--VSMZ kein Unterschied detektiert

werden (Abb. 22 (B)). Die Ergebnisse der Stimulation mit 50µM und 100µM cis-Platin

waren vergleichbar (Daten mit 100µM cis-Platin werden nicht gezeigt).

Page 53: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

42

(B) VSMZ

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Cas

pase

-3-A

ktiv

ität

Col I PLFN

**

* ** *

(A) MMZ

Col I PLFN

0

5000

10000

15000

20000

25000

Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Casp

ase-

3- A

ktiv

ität

*

*

* * * *

# #

(B) VSMZ

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Cas

pase

-3-A

ktiv

ität

Col I PLFN

**

* ** *

(B) VSMZ

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Cas

pase

-3-A

ktiv

ität

Col I PLFN

**

* ** *

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Cas

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ität

Col I PLFN

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Cas

pase

-3-A

ktiv

ität

Col I PLFNCol I PLFN

**

* ** *

(A) MMZ

Col I PLFN

0

5000

10000

15000

20000

25000

Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Casp

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3- A

ktiv

ität

*

*

* * * *

# #

(A) MMZ

Col I PLFN

0

5000

10000

15000

20000

25000

Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Casp

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3- A

ktiv

ität

*

*

* * * *

# #

Col I PLFN

0

5000

10000

15000

20000

25000

Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Casp

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ität

Col I PLFNCol I PLFN

0

5000

10000

15000

20000

25000

Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Casp

ase-

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ktiv

ität

*

*

* * * *

# #

Abb. 22: Apoptose im Caspase-3 Assay.

Sowohl in (A) MMZ als auch in (B) VSMZ führte die Stimulation mit 50µm cis-Platin zu einem

signifikanten Anstieg der Apoptoserate (mit * markiert). (A) Im Vergleich zu stimulierten WT-MMZ (WT)

führte der Mangel an α8-Integrin in stimulierten MMZ (α8-/-) sowohl auf FN als auch auf PL zu einem

signifikant besseren Zellüberleben (mit # markiert). (B) Stimulierte WT-VSMZ zeigten im Vergleich zu

stimulierten α8-/--VSMZ keinen Unterschied im Zellüberleben. (A) WT- und α8-/--MMZ sowie (B) WT- und

α8-/--VSMZ wurden auf FN (40µg/ml), Col I (30µg/ml) und auf PL mittels 50µM cis-Platin (50µM) zur

Apoptose stimuliert. Zellen, die nicht mit einem Apoptosestimulans behandelt wurden, dienten als Kontrolle

(Ko). (n=3, * p< 0,05 vs. unstimulierte Ko; # p< 0,05 vs. stimulierte WT-MMZ).

2.7.3.2 Hoechst-Apoptoseassay

Durch das Anfärben von Chromatin mittels Hoechstfarbstoff konnten die MMZ ermittelt

werden, die sich im Spätstadium des programmierten Zelltodes befanden.

Page 54: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

43

Abb. 23: Hoechstfärbung nach cis-Platin Behandlung.

Die Fotos zeigen beispielhaft WT- und α8-/--MMZ auf FN ausgesät und durch 50µM cis-Platin in die

Apoptose überführt. In den mit einem weißen Pfeil (beispielhaft) gekennzeichneten Zellkernen liegt das

Chromatin kondensiert vor und stellt damit ein spätes Stadium des programmierten Zelltodes dar. Die Bilder

wurden in 100-facher Vergrößerung aufgenommen.

Hierbei konnten die erhobenen Befunde aus dem Caspase-Assay für MMZ wie in Kapitel

2.7.3.1 beschrieben (Abb. 22) mit dem Hoechst-Assay bestätigt werden. So zeigten alle

untersuchten Zellen nach der Stimulation mit 50µM cis-Platin eine erhöhte Apoptose im

Vergleich zur unstimulierten Kontrollansatz (mit * markiert). Sowohl auf FN als auch auf

PL zeigten stimulierte α8-/--MMZ bezüglich stimulierter WT-MMZ ein geringeres

Zellsterben (mit # markiert). Auf Col I konnte kein signifikanter Unterschied in der

Apoptoserate zwischen stimulierten WT- und stimulierten α8-/--MMZ bestimmt werden

(Abb. 24).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

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)

Col I PLFN

* *

*

*

*

#

*

#

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Apo

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)

Col I PLFN

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Apo

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e (%

)

Col I PLFNCol I PLFN

* *

*

*

*

#

*

#

*

#

*

#

Page 55: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

44

Abb. 24: Hoechst-Apoptoseassay.

α8-/--MMZ (α8-/-) auf FN und auf PL wiesen im Vergleich zu WT-MMZ (WT) ein erhöhtes Zellüberleben

auf. Grafische Darstellung des prozentualen Anteils an apoptotischen Zellen im Bezug auf die Gesamtzahl

der Zellen (Y-Achse). Die Zellen wurden mit cis-Platin (50µM) zur Apoptose stimuliert. Pro Ansatz wurden

3 Gesichtsfelder und jeweils 500 Zellen gezählt. Die Untersuchung erfolgte mit den Matrixmolekülen FN

und Col I, sowie auf unbeschichteten Kulturschalen (PL). (n=4, * p< 0,05 vs. unstimulierte Ko; # p< 0,05 vs.

stimulierte WT-MMZ).

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass in WT-MMZ die Apoptose stärker induziert

werden konnte als in MMZ, denen α8-Integrin dauerhaft fehlte (α8-/--MMZ). Hierbei

spielte es keine Rolle, ob die Zellen auf PL oder auf FN gewachsen waren. Col I bildete

eine Ausnahme, denn in beiden Methoden war die Induzierbarkeit der WT- und α8-/--

Zellen etwa gleich groß. Für VSMZ konnte keine veränderte Induzierbarkeit der Apoptose

in Abhängigkeit der Matrices oder α8-Integrin nachgewiesen werden.

2.7.4 Einfluss von α8-Integrin auf das Wachstumsverhalten von Zellen

Integrine sind als Oberflächenrezeptoren u.a. an der Proliferation und Migration von

VSMZ beteiligt [31]. Im Verlauf von entzündlichen glomerulären Erkrankungen spielt die

Proliferation neben der Adhäsion von MZ eine wesentliche Rolle [12]. Inwieweit dabei das

α8-Integrin eine regulatorische Funktion einnimmt, sollte durch den Vergleich der

Proliferation von WT- und α8-/--Zellen auf verschiedenen Matrixproteinen im BrdU-Assay

durch Stimulation mit 10% FCS untersucht werden. Unabhängig von der Existenz von α8-

Integrin, zeigten Zellen auf PL keinen Unterschied im Wachstumsverhalten (Abb. 25).

Dagegen wuchsen α8-/--MMZ auf Col I tendenziell etwas geringer als WT-MMZ. α8-/--

MMZ auf FN wiesen dagegen gegenüber WT-MMZ eine signifikante Steigerung der

Proliferationsrate um 20% auf (Abb. 25 (A)). Im Vergleich zu WT-VSMZ konnte für α8-/--

VSMZ auf Col I ebenfalls ein geringeres Wachstum protokolliert werden. Auf FN und auf

PL zeigte die Proliferationsrate von α8-/--VSMZ und WT-VSMZ keinen nennenswerten

Unterschied (Abb. 25 (B)). Auf FN zeigten si itga8 RMZ (si itga8) gegenüber si Ko RNA

(si Ko) eine verminderte Proliferation. Auf PL und auf Col I dagegen ergab sich kein

signifikanter Unterschied (Abb. 25 (C)).

Page 56: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

45

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

Prol

ifera

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(%)

*

(C) si RMZ

(A) MMZ

0204060

80100120

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Col I FN PL

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(%)

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0

20

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80

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120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Prol

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tion

(%)

(B) VSMZ

*

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8

Col I FN PL

Prol

ifera

tion

(%)

*

(C) si RMZ

(A) MMZ

0204060

80100120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Prol

ifera

tion

(%)

*

0

20

40

60

80

100

120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Prol

ifera

tion

(%)

(B) VSMZ

0

20

40

60

80

100

120

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

Col I FN PL

Prol

ifera

tion

(%)

(B) VSMZ

*

Abb. 25: Proliferationsassay.

(A) WT- und α8-/--MMZ, (B) WT- und α8-/--VSMZ und (C) RMZ mit Ko (si Ko) und α8-Integrin siRNA (si

itga8) behandelt, wurden hinsichtlich ihres Wachstumsverhaltens auf verschiedenen Matrixproteinen

untersucht. Im Vergleich zu WT-Zellen führte der Mangel an α8-Integrin auf FN zu einer erhöhten

Proliferation der (A) MMZ, zu einer geringeren Proliferation der (C) si itga8 RMZ und bis auf Col I zu

keinem veränderten Wachstumsverhalten der (B) VSMZ. Mit Hilfe des Einbaus von BrdU in die DNA

wurden proliferierende Zellen von nicht proliferierenden Zellen unterschieden. Der prozentuale Anteil wurde

berechnet und auf der Y–Achse dargestellt. Die Stimulation erfolgte mit 10% FCS. (n=4, * p< 0,05 vs. WT

bzw. si Ko). WT = (A) WT-MMZ bzw. (B) WT-VSMZ; α8-/- = (A) α8-/--MMZ bzw. (B) α8-/--VSMZ; si Ko = si

Ko RMZ; si itga8 = si itga8 RMZ.

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Ergebnisse

46

2.8 Untersuchungen zur Interaktion von α8-Integrin mit seinem

potentiellen Liganden Fibrillin

Integrine, die zu der Gruppe der RGD-spezifischen Rezeptoren gehören, interagieren mit

ihren Matrixmolekülen ausschließlich über eine bestimmte Bindesequenz, dem RGD (Arg-

Gly-Asp)-Motiv [38]. Eine RGD-Bindestelle ist auch im Fibrillinmolekül vorzufinden. Es

ist bekannt, dass die Zelladhäsion an Fibrillin-1 mit αvβ3-Integrin über das RGD-Motiv

vermittelt werden kann [107]. Inwieweit α8β1-Integrin mit Fibrillin überhaupt interagiert,

und ob diese Interaktion über die RGD-Sequenz verläuft, war bisher noch ungeklärt und

war Gegenstand der folgenden Untersuchungen.Zwei Fibrillinfragmente, rF6H mit der

RGD-Bindesequenz und rF16 ohne Bindesequenz (Abb. 26), wurden für die folgenden

Untersuchungen in der Konzentration 15µg/ml eingesetzt.

Abb. 26: Schematische Darstellung des Fibrillin-1 Proteins und seiner Fragmente.

rF6H beinhaltet die einzige RGD-Bindestelle (*), die Fibrillin-1 besitzt. Die Fragmente rF16 und rF6H

decken die Aminosäuresequenz des Gesamtmoleküls Fibrillin-1 ab. (aus Porst M., et al., 2006 [112],

modifiziert nach Reinhardt D. P. et al., 1996 [131] und Jensen S. A., 2001 [132]).

2.8.1 Adhäsions- und Ausbreitungsassays

MMZ und VSMZ wurden auf Fibrillinfragmenten-beschichteten Platten ausgesät und

Adhäsion und Ausbreitung in Abhängigkeit von RGD-Bindesequenz und α8-Integrin

Expression studiert. Als Negativkontrolle wurde 2%iges BSA eingesetzt und im

Versuchsansatz mitgeführt. Sowohl MMZ, VSMZ als auch si RMZ zeigten unabhängig

von der Anwesenheit des α8-Integrins auf dem rF16-Fragment eine signifikant geringere

Adhäsion und Ausbreitung als auf dem Fibrillinfragment mit der RGD-Bindesequenz

(rF6H) mit # markiert). Wurden α8-/--MMZ mit WT-MMZ verglichen, so adhärierten und

breiteten sie sich sowohl auf rF6H als auch auf rF16 signifikant geringer aus (mit *

markiert) (Abb. 27 (A) und (B)). Im Vergleich zu WT-VSMZ führte der Mangel an α8-

Page 58: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

47

Integrin in VSMZ zu keiner signifikanten Veränderung der Adhäsion (Abb. 27 (C)). Auf

rF16 zeigten α8-/--VSMZ gegenüber WT-VSMZ eine signifikant geringere Ausbreitung

(mit * markiert), während auf rF6H keine signifikanten Unterschiede beobachtet werden

konnten (Abb. 27 (D)). In Bezug zu si Ko RMZ wiesen si itga8 RMZ auf dem rF16-

Fragment eine signifikant geringere Adhäsion und Ausbreitung auf als auf rF6H (mit *

markiert) (Abb. 27 (E) und (F)).

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

Adh

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*

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#

020406080

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020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8

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020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8

rF6H rF16

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# #

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(D) VSMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

Adh

äsio

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# #

(C) VSMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

Aus

brei

tung

(%)

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#

*

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

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*

(A) MMZ

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020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

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(A) MMZ

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#

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

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n(%

)

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*

(A) MMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

Adh

äsio

n(%

)

*

*0

20406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

Adh

äsio

n(%

)

*

*

(A) MMZ

#

#

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16A

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)

**

(B) MMZ

#

#

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

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usbr

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ng (%

)

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(B) MMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16A

usbr

eitu

ng (%

)

**

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16A

usbr

eitu

ng (%

)

**

(B) MMZ

#

#

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8

rF6H rF16

Adhä

sion

(%)

##

*

(E) si RMZ

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8

rF6H rF16

Aus

brei

tung

(%)

*

# #

(F) si RMZ

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8

rF6H rF16

Adhä

sion

(%)

##

*

(E) si RMZ

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8

rF6H rF16

Adhä

sion

(%)

##

*

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8

rF6H rF16

Adhä

sion

(%)

##

*

(E) si RMZ

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8

rF6H rF16

Aus

brei

tung

(%)

*

# #

(F) si RMZ

020406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8

rF6H rF16

Aus

brei

tung

(%)

*

# #0

20406080

100120

si Ko si itga8 si Ko si itga8

rF6H rF16

Aus

brei

tung

(%)

*

# #

(F) si RMZ

(D) VSMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

Adh

äsio

n (%

)

# #

(C) VSMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

Aus

brei

tung

(%)

#

#

*

(D) VSMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

Adh

äsio

n (%

)

# #

(C) VSMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

Aus

brei

tung

(%)

#

#

*0

20406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

Adh

äsio

n (%

)

# #

(C) VSMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

Adh

äsio

n (%

)

# #

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

Adh

äsio

n (%

)

# #

(C) VSMZ

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

Aus

brei

tung

(%)

#

#

*0

20406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

Aus

brei

tung

(%)

#

#

020406080

100120

WT α8-/- WT α8-/-

rF6H rF16

Aus

brei

tung

(%)

#

#

*

Abb. 27: Adhäsions- und Ausbreitungsassay auf Fibrillinfragmenten.

Auf dem Fibrillinfragment ohne RGD-Bindesequenz (rF16) adhärieren und breiten sich MMZ, VSMZ und

siRNA behandelte RMZ geringer aus als auf dem Fragment mit RGD-Motiv (rF6H) (mit # markiert). Die

Zellen wurden in rF6H- und rF16-beschichteten 8-Kammer Objektträgern 1h adhärieren gelassen. Mit einer

parallel laufenden Real-Time-RT-PCR wurde verifiziert, dass die Herunterregulation von α8-Integrin durch

siRNA erfolgreich durchgeführt wurde. (n=3; * p< 0,05 vs. WT-Zellen bzw. si Ko RMZ; # p< 0,05 vs. auf

rF6H ausgesäten Zellen). WT = (A) und (B) WT-MMZ bzw. (C) und (D) WT-VSMZ; α8-/- = (A) und (B) α8-/--

MMZ bzw. (C) und (D) α8-/--VSMZ; si Ko = si Ko RMZ; si itga8 = si itga8 RMZ.

Page 59: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

48

Zusammengefasst konnte damit gezeigt werden, dass das Vorhandensein sowohl des α8-

Integrins als auch des RGD–Bindemotivs die Adhäsion und Ausbreitung von MZ auf dem

Matrixprotein Fibrillin beeinflussen kann. Für VSMZ scheint dagegen weniger α8-Integrin

als die RGD-Bindesequenz eine essentielle Rolle in der Adhäsion und Ausbreitung

einzunehmen.

2.8.2 Adhäsionsassay mit cRGD-Peptiden

Anhand des vorherigen Versuchsaufbaues konnte nicht eindeutig nachgewiesen werden, ob

α8-Integrin direkt bei der RGD-vermittelten Interaktion in den MZ eine essentielle Rolle

spielt (Abb. 27). Um diesen Aspekt noch näher zu untersuchen, wurden WT- und α8-/--

MMZ mit cyclischen RGD-Peptiden (cRGD) inkubiert und auf Vitronektin (VN) und

Fibrillinfragmenten ausgesät. Cyclische RGD-Peptide blockieren spezifisch den αvβ3-

Integrinrezeptor (RGDdFV-Peptid, kurz cRGD) [133, 134] und erlauben somit die

Erforschung der Zelladhäsion unter Ausschluss des αvβ3-Integrins vermittelten Beitrags

zur Zelladhäsion. αvβ3-Integrin ist ein Adhäsionsrezeptor von VN, FN und Fibrillin-1,

dessen Bindung über die RGD-Sequenz dieser Matrixmoleküle vermittelt wird. Deshalb

wurden zur Kontrolle zunächst die zuvor mit cRGD behandelten Zellen auf VN

beschichtete Platten ausgesät. Die Adhäsion von WT- und α8-/--MMZ war auf VN nach

der Behandlung mit dem Kontrollpeptid, einem durch einen Aminosäureaustausch des

cRGD nicht blockierenden cyclischen Peptid (cRADdFV-Peptid, kurz cRAD), unverändert

gleich hoch. Mit zunehmender cRGD Konzentration (5µM bis 250µM) sank, sowohl in

WT- als auch in α8-/--MMZ, die Anhaftungsrate bis auf einen basalen Wert. WT- und α8-/--

MMZ wurden vergleichbar stark durch das blockierende cRGD-Peptid in ihrer Adhäsion

an VN gehemmt (Abb. 28).

Page 60: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

49

0

20

40

60

80

100

120

5µM 50µM 250µM 5µM 50µM 250µM

cRGD cRAD

Adh

äsio

n (%

)

(B) α8-/--MMZ auf Vitronektin mit cRGD

0

20

40

60

80

100

120

5µM 50µM 250µM 5µM 50µM 250µM

cRGD cRAD

Adh

äsio

n (%

)

(A) WT-MMZ auf Vitronektin mit cRGD

0

20

40

60

80

100

120

5µM 50µM 250µM 5µM 50µM 250µM

cRGD cRAD

Adh

äsio

n (%

)

(B) α8-/--MMZ auf Vitronektin mit cRGD

0

20

40

60

80

100

120

5µM 50µM 250µM 5µM 50µM 250µM

cRGD cRAD

Adh

äsio

n (%

)

(A) WT-MMZ auf Vitronektin mit cRGD

Abb. 28: Adhäsionsassay auf Vitronektin mit cRGD-Peptiden.

WT- und α8-/--MMZ wurden auf Vitronektin (VN) ausgesät und der prozentuale Anteil an adhärenten Zellen

im Vergleich nach cRAD- und cRGD-Behandlung bestimmt. In direkter Abhängigkeit der cRGD-Dosis

adhärierten sowohl (A) WT- als auch (B) α8-/--MMZ geringer. Die Zellen wurden zuvor mit cyclischen

Peptiden in steigender Konzentration (5µM-250µM) inkubiert. cRGD ist ein αvβ3-Integrin blockierendes

cyclisches RGDdFV-Peptid. cRADdFV (cRAD) wurde als Kontrollpeptid verwendet. (n=3).

Es folgten Untersuchungen mit cRGD-Peptid behandelten WT- und α8-/--MMZ, die auf

dem Fibrillinfragment rF6H ausgesät wurden. Es zeigte sich, dass ähnlich dem Verhalten

der mit cRGD-Peptid behandelten Zellen auf VN, mit steigender Peptidkonzentration

(3,125µM bis 50µM) eine kontinuierliche Abnahme sowohl der adhärenten WT- als auch

α8-/--MMZ zu beobachten war. Der Prozentsatz der adhärenten Zellen war nach

Behandlung mit cRGD geringer als nach Behandlung mit dem Kontrollpeptid (cRAD). Es

konnte kein signifikanter Unterschied zwischen der Adhäsion von WT-MMZ und von α8-/-

-MMZ nachgewiesen werden (Abb. 29).

Page 61: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

50

020406080

100120140

3,12

5µM

6,25

µM

12,5

µM

50µM

3,12

5µM

6,25

µM

12,5

µM

50µM

cRGD cRAD

Adh

äsio

n (%

)

(A) WT-MMZ auf Fibrillinfragmente mit cRGD

020406080

100120140

3,12

5µM

6,25

µM

12,5

µM

50µM

3,12

5µM

6,25

µM

12,5

µM

50µM

cRGD cRAD

Adh

äsio

n (%

)

(B) α8-/--MMZ auf Fibrillinfragmente mit cRGD

020406080

100120140

3,12

5µM

6,25

µM

12,5

µM

50µM

3,12

5µM

6,25

µM

12,5

µM

50µM

cRGD cRAD

Adh

äsio

n (%

)

(A) WT-MMZ auf Fibrillinfragmente mit cRGD

020406080

100120140

3,12

5µM

6,25

µM

12,5

µM

50µM

3,12

5µM

6,25

µM

12,5

µM

50µM

cRGD cRAD

Adh

äsio

n (%

)

(B) α8-/--MMZ auf Fibrillinfragmente mit cRGD

Abb. 29: Adhäsionsassay auf Fibrillin mit cRGD-Peptiden.

WT- und α8-/--MMZ wurden auf RGD-haltigen Fibrillinfragmenten (rF6H) ausgesät und der prozentuale

Anteil an adhärenten Zellen im Vergleich zu cRAD- und cRGD-Behandlung bestimmt. In direkter

Abhängigkeit der cRGD-Dosis adhärierten sowohl (A) WT- als auch (B) α8-/--MMZ geringer. Die Zellen

wurden zuvor mit cyclischen Peptiden in steigender Konzentration (3,125µM-50µM) inkubiert. cRGD ist ein

αvβ3-Integrin blockierendes cyclisches RGDdFV-Peptid. cRADdFV (cRAD) wurde als Kontrollpeptid

verwendet. (n=3).

2.9 Expression potentiell kompensatorischer Integrine

2.9.1 Bestimmung der RNA-Expression potentiell kompensatorischer Integrine

Obwohl α8-Integrin sowohl in MZ als auch in VSMZ exprimiert wird, konnten in α8-/--

Mäusen hauptsächlich im glomerulären Mesangium histologische und morphometrische

Veränderungen beobachtet werden, während die renalen Blutgefäße kaum betroffen waren

Page 62: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

51

[27]. Dies führte zur Hypothese, dass MZ und VSMZ durch den Mangel an α8-Integrin

unterschiedlichen kompensatorischen Mechanismen unterworfen sind. In kultivierten α8-/--

MMZ konnte bereits eine Hochregulation von α2- und α6-Integrinketten gezeigt werden

[125, 135]. Deshalb sollte mit den folgenden Untersuchungen die Frage geklärt werden, ob

die Hochregulation von α2- und α6-Integrinketten in α8-/--MMZ direkt auf den Mangel

von α8-Integrin zurückzuführen ist. Hierzu wurden mittels Real-Time-RT-PCR die

Expression von α2- und α6-Integrinketten in α8-/--MMZ der Expression in si itga8 RMZ

gegenübergestellt. Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit konnten diese

Beobachtungen in MMZ bezüglich der Veränderungen der Expression von α2- und α6-

Integrin-Untereinheit verifizieren. So wurde in α8-/--MMZ eine ca. 40-fach erhöhte

Expression von α2- und ein 18-facher Anstieg der Expression der α6-Integrin Untereinheit

auf mRNA Ebene ermittelt (Abb. 30 (A)). Im Gegensatz zu den Befunden in α8-/--MMZ

wurde durch den transienten Knockdown von α8-Integrin in RMZ sowohl für die α2- als

auch für die α6-Integrinkette eine um fünffach verringerte RNA-Expression detektiert

(Abb. 30 (B)).

(A) MMZ

01020

304050

WT α8-/- WT α8-/-

α2 α6

rela

tive

Indu

ktio

n

*

*

0,00,20,40,60,81,01,21,4

si Ko si itga8 si Ko si itga8

α2 α6

rela

tive

Indu

ktio

n

* *

(B) si RMZ(A) MMZ

01020

304050

WT α8-/- WT α8-/-

α2 α6

rela

tive

Indu

ktio

n

*

*

01020

304050

WT α8-/- WT α8-/-

α2 α6

rela

tive

Indu

ktio

n

*

*

0,00,20,40,60,81,01,21,4

si Ko si itga8 si Ko si itga8

α2 α6

rela

tive

Indu

ktio

n

* *

0,00,20,40,60,81,01,21,4

si Ko si itga8 si Ko si itga8

α2 α6

rela

tive

Indu

ktio

n

* *

(B) si RMZ

Abb. 30: α2- und α6-Integrin Expression in MZ.

α2- und α6-Integrin Expression in (A) WT- und α8-/--MMZ und in (B) RMZ mit Ko- und α8-Integrin siRNA

behandelt. Während in (A) α8-/--MMZ (α8-/-) die Expression von α2- und α6-Integrin bezüglich WT-MMZ

(WT) um ein signifikant Vielfaches erhöht vorzufinden war, wurden (B) α2- und α6-Integrin durch den

transienten Mangel an α8-Integrin in RMZ (si itga8) im Vergleich zu si Ko RMZ (si Ko) signifikant

schwächer exprimiert. Anhand von Real-Time-RT-PCR Untersuchungen wurde die RNA Expression

ermittelt und gegen 18S normiert. (n= 4, * p< 0,05 vs. WT bzw. si Ko).

2.9.2 Untersuchung zur Funktion von α2- und α6-Integrin beim Zellüberleben

Da α2- und α6-Integrin an der Regulation des Zellüberlebens beteiligt sein können und in

Vorbefunden mit MMZ und HEK [(human embryonic kidney–Zellen] in vitro divergente

Page 63: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

52

Ergebnisse hinsichtlich des Einflusses von α8-Integrin auf das Zellüberleben erhoben

worden waren, stellte sich die Frage, inwieweit sich die vermehrte Expression von α2- und

α6-Integrin in α8-/--MMZ auf die Apoptoseinduktion in diesen Zellen auswirken kann.

Hierzu wurden α8-/--MMZ vor der Durchführung des Caspase-3-Assays mit α2- und α6-

Integrin blockierenden Antikörpern vorbehandelt. Mit blockierenden Antikörpern

behandelte, unstimulierte Zellen (Ko) zeigten ein gleich niedriges Niveau an Caspase-3-

Aktivität. Im Versuchsansatz mit blockierenden Antikörpern gegen α2- (+ 2) bzw. α2- mit

α6-Integrin (+ 2, + 6) kombiniert konnte gegenüber der unstimulierten Ko in stimulierten

Zellen nur eine leicht erhöhte Caspase-3-Aktivität detektiert werden. Zellen, die nur mit

dem Antikörper gegen die α6-Integrin Kette vorinkubiert waren, zeigten eine bis zu 3-

fache signifikante Aktivitätszunahme des Caspase-3-Enzyms (Abb. 31). Die Ergebnisse

konnten mit serumfreiem Medium (D0) als Apoptosestimulans reproduziert werden (Abb.

31).

010002000300040005000600070008000

+ a2 + a6 +a2+a6

+ a2 + a6 +a2+a6

+ a2 + a6 +a2+a6

Ko D0 50µM

Cas

pase

-3-A

ktiv

ität

**

α8-/--MMZ mit blockierenden Antikörpern

010002000300040005000600070008000

+ a2 + a6 +a2+a6

+ a2 + a6 +a2+a6

+ a2 + a6 +a2+a6

Ko D0 50µM

Cas

pase

-3-A

ktiv

ität

**

010002000300040005000600070008000

+ a2 + a6 +a2+a6

+ a2 + a6 +a2+a6

+ a2 + a6 +a2+a6

Ko D0 50µM

Cas

pase

-3-A

ktiv

ität

**

α8-/--MMZ mit blockierenden Antikörpern

Abb. 31: Caspase-3-Assay mit blockierenden Antiköpern.

Caspase-3-Assay mit α8-/--MMZ nach Behandlung mit α2- und α6-Integrin blockierenden Antiköpern. Nur

die stimulierten α8-/--MMZ, die mit dem Antikörper gegen α6-Integrin (+ a6) blockiert wurden, wiesen eine

signifikant erhöhte Apoptoserate zu den unstimulierten Ko auf. Der jeweilige Einsatz von blockierenden

Antikörpern wird mit + α2 bzw. + α6 markiert. Ko = ohne Apoptosestimulans, D0 = Serumentzug, 50µM =

Behandlung mit 50µM cis-Platin. Die Messung und Auswertung der Caspase-3-Aktivität erfolgte nach dem

Standardprotokoll. (n=3, * p <0,05 vs. Ko).

Page 64: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

53

2.10 Einfluss von α8-Integrin auf die Matrix-Metalloproteinasen (MMP)

MMP übernehmen in zahlreichen biologischen Prozessen wie Adhäsion, Migration,

Proliferation und Zellüberleben eine wichtige regulatorische Funktion [71]. Da MMP-2

und MMP-9 am häufigsten im Glomerulus vorzufinden sind [136] und eine

Expressionshemmung von MMP-2 und MMP-9 durch blockierte α4-, α5- und αv-Integrine

erfolgen kann [137], wollten wir untersuchen, ob die Expression von MMP-2 und MMP-9,

und ihre speziellen Inhibitoren TIMP-1 und TIMP-2 auch von α8-Integrin abhängig ist.

Dazu wurde die Expression von MMP-2, MMP-9, TIMP-1 und TIMP-2 mittels Real-

Time- RT-PCR sowohl in α8-/--MMZ als auch in si itga8 RMZ im Vergleich zu WT-

MMZ bzw. si Ko bestimmt. Im Vergleich zu WT-MMZ war in α8-/--MMZ die MMP-2,

MMP-9 und TIMP-1 mRNA Expression reduziert. TIMP-2 wurde dagegen unverändert

transkribiert (Abb. 32 (A)). Ebenso konnte in si itga8 RMZ bezüglich si Ko RMZ neben

einer verminderten TIMP-2 auch eine verminderte MMP-2 und MMP-9 mRNA Expression

bestimmt werden. Für TIMP-1 konnte kein Unterschied gemessen werden (Abb. 32 (B)).

0,00,20,40,60,81,01,21,41,6

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2

rela

tive

Indu

ktio

n

**

*

(A) MMZ

0,00,20,40,60,81,01,21,41,6

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2

rela

tive

Indu

ktio

n

* **

(B) si RMZ

0,00,20,40,60,81,01,21,41,6

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2

rela

tive

Indu

ktio

n

**

*

0,00,20,40,60,81,01,21,41,6

WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-

MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2

rela

tive

Indu

ktio

n

**

*

(A) MMZ

0,00,20,40,60,81,01,21,41,6

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2

rela

tive

Indu

ktio

n

* **

0,00,20,40,60,81,01,21,41,6

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

si Ko siitga8

MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2

rela

tive

Indu

ktio

n

* **

(B) si RMZ

Page 65: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

54

Abb. 32: Expression von MMP und TIMP.

MMP-2, MMP-9, TIMP-1 und TIMP-2 RNA Expression in (A) WT- und α8-/--MMZ und in (B) RMZ mit si

Ko- und si itga8 behandelt. Im Vergleich zu (A) WT-MMZ (WT) bzw. (B) si Ko RMZ (si Ko) wurden bei

Mangel an α8-Integrin MMP-2, MMP-9 und TIMP-1 in (A) α8-/--MMZ (α8-/-) bzw. (B) si itga8 RMZ (si

itga8) geringer exprimiert. TIMP-2 wurde nur in (B) si itga8 RMZ (si itga8) signifikant geringer exprimiert.

Real-Time-RT-PCR wurde zur Bestimmung der quantitativen mRNA Expression durchgeführt. Die

Ermittlung der Kopienzahl erfolgte in Bezug auf 18S als Referenz. (n=3, * p< 0,05 vs. WT bzw. si Ko).

2.11 CTGF Expression in mesenchymalen Zellen

Für VSMZ [138] und für MZ [139] wird ein Zusammenhang zwischen CTGF-Expression

und Migration beschrieben. Daher wurde die CTGF-Protein Expression der WT- und α8-/--

Zellen miteinander verglichen, indem Western Blot- bzw. mittels RT-PCR-Messungen

durchgeführt wurden. Sowohl auf Protein- als auch auf RNA-Ebene konnte in WT-MMZ

CTGF nachgewiesen werden. Dagegen war CTGF in α8-/--MMZ auf einen geringen

basalen mRNA Level reduziert und im Western Blot konnte kein CTGF mehr detektiert

werden (Abb. 33 (A)). In α8-/--VSMZ konnte im Vergleich zu WT-VSMZ eine vermehrte

CTGF mRNA-Expression detektiert werden. CTGF Protein war in WT- und α8-/--VSMZ

nachweisbar (Abb. 33 (B)).

(A) CTGF in MMZ

Real-Time-RT-PCR

0,00,40,81,21,62,0

WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

Western Blot

- CTGF(36kDa)

- β-Aktin(42kDa)

WT α8-/-

(B) CTGF in VSMZ

0,00,51,01,52,02,53,0

WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

- CTGF(36kDa)

- β-Aktin(42kDa)

WT α8-/-

*

*

(A) CTGF in MMZ

Real-Time-RT-PCR

0,00,40,81,21,62,0

WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

Western Blot

- CTGF(36kDa)

- β-Aktin(42kDa)

WT α8-/-

(B) CTGF in VSMZ

0,00,51,01,52,02,53,0

WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

- CTGF(36kDa)

- β-Aktin(42kDa)

WT α8-/-

(A) CTGF in MMZ

Real-Time-RT-PCR

0,00,40,81,21,62,0

WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

Western Blot

- CTGF(36kDa)

- β-Aktin(42kDa)

WT α8-/-

- CTGF(36kDa)

- β-Aktin(42kDa)

- CTGF(36kDa)

- β-Aktin(42kDa)

WT α8-/-WT α8-/-

(B) CTGF in VSMZ

0,00,51,01,52,02,53,0

WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

- CTGF(36kDa)

- β-Aktin(42kDa)

WT α8-/-

- CTGF(36kDa)

- β-Aktin(42kDa)

WT α8-/-WT α8-/-

*

*

Page 66: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Ergebnisse

55

Abb. 33: CTGF Expression.

Während der Mangel an α8-Integrin in (A) MMZ zu einer reduzierten CTGF Expression führte, war die

CTGF Expression in (B) VSMZ signifikant erhöht. Quantitative CTGF mRNA Analyse mittels Real-Time-

RT-PCR in (A) WT- und α8-/--MMZ und in (B) WT- und α8-/--VSMZ. Western Blot Analyse von CTGF

Expression in (A) MMZ und in (B) VSMZ. β-Aktin wurde als Beladungskontrolle verwendet. (n=3, * p<

0,05 vs. WT).

2.12 Untersuchungen des RhoA/Rho-Kinase (ROCK)-Signalwegs

Wie bereits in der Einleitung beschrieben, sind die kleinen GTPasen wie RhoA an der

Bildung der Stressfasern beteiligt und beeinflussen somit die Organisation des

Aktinzytoskeletts [35]. Bekanntermaßen kann das Aktin-Zytoskelett Adhäsion,

Ausbreitung, Migration, Proliferation, Morphologie und das Zellüberleben beeinflussen. Es

war deshalb von Interesse zu untersuchen, ob und inwieweit α8-Integrin über den

RhoA/ROCK-Signalweg direkt oder indirekt auf die Formierung der Stressfasern bzw.

Expression von α-SMA einwirkt. Desweiteren wurde in humanen Nierenfibroblasten

gezeigt, dass auch die Induktion von CTGF (connective tissue growth factor) über RhoA

und ROCK verläuft [140]. Da bereits für MZ ein direkter Zusammenhang zwischen CTGF

Expression und Aktin-Abbau und somit auf den Umbau des Zytoskeletts beschrieben

wurde [139], wurden WT- und α8-/--MMZ sowie WT- und α8-/--VSMZ 24h nach der

Behandlung mit 10µM Y-27632 (Endkonzentration) hinsichtlich der CTGF- und α-SMA-

Expression mit unbehandelten Zellen (Ko) verglichen. Y-27632 ist ein synthetisch

hergestelltes Pyridinderivat, das an ROCK, einen direkten Effektor der GTPase RhoA,

bindet und diesen inaktiviert. Folglich werden Signalwege gehemmt, die durch RhoA

induziert werden [141]. Es bietet somit eine Möglichkeit in den uns vorliegenden Zellen zu

untersuchen, ob der RhoA/ROCK-Signalweg eine Rolle in der α8-Integrin vermittelten

Signalweiterleitung spielt. Mit dem ROCK-Inhibitor behandelte WT-MMZ wiesen im

Vergleich zu den unbehandelten WT-MMZ (Ko) eine signifikante Herunterregulation von

α-SMA- und CTGF-mRNA auf (Abb. 34 (A)). Hingegen zeigten VSMZ im Vergleich zu

MMZ hinsichtlich der Expression von α-SMA und CTGF nach der Behandlung mit Y-

27632 eine unterschiedliche Reaktion. So war nach der Inhibition von ROCK die α-SMA-

Expression bezüglich der unbehandelten Ko sowohl in WT- als auch in α8-/--VSMZ

geringer. Im Gegensatz dazu führte die ROCK-Inhibition mit Y-27632 in α8-/--VSMZ

zwar zu einer Reduktion der CTGF-Expression im Vergleich zur Kontrolle (Ko), in WT-

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Ergebnisse

56

VSMZ konnte dagegen keine Veränderung in der CTGF-mRNA Expression beobachtet

werden (Abb. 34 (B)).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y

WT α8-/- WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

α-SMA CTGF

*

*

*

(B) VSMZ

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y

WT α8-/- WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

**

α-SMA CTGF

(A) MMZ

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y

WT α8-/- WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

α-SMA CTGF

*

*

*

(B) VSMZ

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y

WT α8-/- WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

α-SMA CTGF

*

*

*

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y

WT α8-/- WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

α-SMA CTGF

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y

WT α8-/- WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

α-SMA CTGFα-SMA CTGF

*

*

*

(B) VSMZ

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y

WT α8-/- WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

**

α-SMA CTGF

(A) MMZ

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y

WT α8-/- WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

**

α-SMA CTGF

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y

WT α8-/- WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

**

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y

WT α8-/- WT α8-/-

rela

tive

Indu

ktio

n

**

α-SMA CTGF

(A) MMZ

Abb. 34: Expression von α-SMA und CTGF nach Inhibition von ROCK.

α-SMA- und CTGF-Expression nach ROCK Inhibition mit Y-27632 (+ Y) in (A) WT- und α8-/--MMZ im

Vergleich mit (B) WT- und α8-/--VSMZ. (A) Während α-SMA- und CTGF mRNA in α8-/--MMZ (α8-/-) nur

gering basal exprimiert wurden und somit eine Inhibition der Rho-Kinase (ROCK) zu keiner signifikanten

messbaren Veränderung in der Expression führte, konnte durch die Behandlung von WT-MMZ (WT) mit

dem ROCK-Inhibitor Y-27632 eine signifikant geringere Expression sowohl von α-SMA als auch CTGF

bezüglich der unbehandelten Kontrollen (Ko) beobachtet werden. (B) Im Vergleich zu den Ko führte die

ROCK Inhibition sowohl in WT- als auch α8-/--VSMZ zu einer signifikant reduzierten Expression von α-

SMA. Desweiteren konnte die CTGF Expression in α8-/--VSMZ (α8-/-) signifikant reprimiert vorgefunden

werden. Dagegen konnte für WT-VSMZ (WT) im Vergleich mit den Ko durch die Behandlung mit Y-27632

keine Veränderung in der CTGF mRNA Expression gezeigt werden. Die 18S wurde als Bezugsgröße zur

Bestimmung der relativen mRNA Induktion verwendet (Y-Achse). (n=6, * p< 0,05 vs. Ko).

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Ergebnisse

57

Wie bereits beschrieben, führte im Vergleich zu WT-MMZ der Verlust von α8-Integrin in

MMZ sowohl für α-SMA (Abb. 14 (A)) als auch für CTGF (Abb. 33 (A)) zu einer

Reduktion der mRNA Expression auf einen basalen geringen Level. Dagegen wiesen α8-/--

VSMZ im Vergleich zu WT-VSMZ keine veränderte α-SMA- (Abb. 14 (B)) und CTGF-

Expressionen auf (Abb. 33 (B)). Die basal schon geringe α-SMA- und CTGF mRNA

Produktion in α8-/--MMZ, wurde nach der Behandlung mit dem ROCK Inhibitor Y-27632

nicht nachweisbar verändert. Zur besseren Veranschaulichung wurden die mRNA-Werte

der unbehandelten α8-/--MMZ auf 1 normiert und verdeutlichen die unveränderte

Expression an α-SMA und CTGF (Abb. 35).

0,00,20,40,60,81,01,2

Ko + Y Ko + Y

α-SMA CTGF

rela

tive

Indu

ktio

n

ROCK Inhibition auf α8-/- -MMZ

0,00,20,40,60,81,01,2

Ko + Y Ko + Y

α-SMA CTGF

rela

tive

Indu

ktio

n

ROCK Inhibition auf α8-/- -MMZ

Abb. 35: Normierte Expression von α-SMA und CTGF nach Inhibition von ROCK.

Normierte α-SMA- und CTGF-Expression nach ROCK Inhibition mit Y-27632 (+ Y) in α8-/--MMZ. Sowohl

α-SMA als auch CTGF blieben in α8-/--MMZ im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen (Ko) nach der

Behandlung mit dem ROCK inhibierenden Y-27632 (+ Y) in ihrer Expression unverändert. Hierbei wurden

die ursprünglichen geringen basalen Werte der unbehandelten α8-/--MMZ auf 1 normiert. Die Befunde

stammen aus dem zuvor beschriebenen Versuch (siehe Abb. 34 (A)).

Page 69: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Diskussion

58

3 Diskussion

Vorbefunde aus unserer Arbeitsgruppe hatten bereits Hinweise auf einen Einfluss einer

dauerhaften α8-Integrin Defizienz auf Adhäsion, Migration, Proliferation [125] und das

Überleben von Maus-Mesangiumzellen (MMZ) ergeben [142]. Diese Befunde konnten von

mir im Zuge meiner vorliegenden Arbeit verifiziert und vervollständigt werden. Zusätzlich

wurden Untersuchungen in vaskulären glatten Muskelzellen aus der Mausaorta (VSMZ)

mit und ohne α8-Integrin Defizienz durchgeführt. Die Etablierung eines in vitro–Modells

für den transienten „knockdown“ von α8-Integrin (siRNA Transfektion) im Rahmen

meiner Doktorarbeit gab uns eine weitere Möglichkeit, die Funktion von α8-Integrin in den

MZ zu analysieren. Eine reproduzierbare Transfektion der MMZ mit siRNA gegen α8-

Integrin konnte, im Gegensatz zu Ratten-Mesangiumzellen (RMZ), bisher nicht in unserem

Labor etabliert werden. Daher wurden alle siRNA Transfektionen in RMZ durchgeführt.

Diese Tatsache muss bei dem Vergleich zwischen transienter und dauerhafter α8-Integrin

Defizienz in MZ berücksichtigt werden. Es ist durchaus vorstellbar, dass auch Spezies-

Unterschiede auftreten können, obwohl Maus und Ratte für α8-Integrin eine 92%ige

Homologie der Gensequenz und eine 96%ige Homologie für das Protein aufzeigen

(Sequenzvergleich s. Anhang).

3.1 Einfluss von α8-Integrin auf Zellmorphologie, Zytoskelett und fokale

Kontakte

Eine Studie beschreibt, dass nach transienter Herunterregulation von α8-Integrin in Ratten-

VSMZ (siRNA Silencing) neben der drastischen Modulation des Phänotyps von einer

differenzierten, kontraktilen Zelle zu einer dedifferenzierten, migrierenden Zelle, sowohl

eine Änderung der Morphologie als auch eine Umstrukturierung der Aktinfilamente und

der fokalen Kontakte stattfand [126]. Diese Befunde mit si RNA behandelten VSMZ [126]

konnten wir mit kultivierten VSMZ aus α8-/--Mäusen nicht bestätigen. Der dauerhafte

Mangel an α8-Integrin führte in VSMZ (α8-/--VSMZ) zu keiner morphologischen

Veränderung. α-Glattmuskel-Aktin (α-SMA), ein Marker für Stressfasern, wurde

unvermindert exprimiert und die Organisation des Aktinzytoskeletts entsprach dem der

WT-VSMZ. In MZ dagegen führte sowohl transiente (siRNA Silencing) als auch

dauerhafte α8-Integrin (α8-/--) Defizienz zum Verlust des mesenchymalen Charakters.

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Diskussion

59

Zudem war die Bildung der F-Aktinfilamente erheblich gestört. Obwohl α8-/--MMZ im

Vergleich zu WT-MMZ eine veränderte Lokalisation von Vinculin aufwiesen, war die

Expression des Vinculinproteins nicht reduziert. Es ist bekannt, dass α8β1-Integrin mit

fokalen Adhäsionen assoziiert ist und die Verbindung an das Aktinzytoskelett über

adaptive Zytoskelettmoleküle wie Vinculin hergestellt wird [99]. Die genauen

regulatorischen Zusammenhänge zwischen α8-Integrin und Vinculin sind aber bis dato

noch unklar. Da mangelndes α8-Integrin in den MZ zu keiner Reduzierung der Vinculin

Expression führte, scheint α8-Integrin weder einen direkten noch indirekten

regulatorischen Einfluss auf die Expression von Vinculin in MZ zu nehmen. Dagegen

konnte durch den Mangel an α8-Integrin neben der veränderten Lokalisation von Vinculin

auch eine strukturelle Veränderung der fokalen Kontakte in MZ initiiert werden. In

normalen MZ lagen die fokalen Kontakte als längliche Strukturen vor. Aufgrund der α8-

Integrin Defizienz konnten die fokalen Kontakte nur noch als gedrungene Strukturen, die

sich zu Bündel zusammengelagert hatten, sichtbar gemacht werden. Vinculin nimmt

hinsichtlich der Regulation der Bildung fokaler Kontakte eine zentrale Rolle ein [49, 56].

Fibroblasten, die kein Vinculin produzieren, wiesen kleinere fokale Kontakte auf als

normale Fibroblasten [143]. Bekanntermaßen erfolgt die Rekrutierung des

Adaptermoleküls Vinculin in fokale Kontakte erst nach der Ligandenbindung an einen

Oberflächenrezeptor wie z.B. Integrin [144]. Deshalb vermuteten wir, dass mangelndes α8-

Integrin in den MZ zu einer gestörten Liganden-Integrin Interaktion führt und infolge

dessen es zu einer veränderten Lokalisation von Vinculin kommt. Vinculin kann aber

sowohl in einer aktiven als auch in einer inaktiven Form vorliegen, wobei nur die aktive

Form in fokalen Kontakten und die inaktive Form im Zytosol vorzufinden ist [56]. Somit

könnte auch die Verfügbarkeit von Vinculin bzw. die der aktiven Form mitverantwortlich

für die Lokalisation und für die Struktur der fokalen Kontakte sein. Die inaktive Form

entsteht durch eine Interaktion des Kopf- und Schwanzbereiches der primären

Proteinsequenz und maskiert alle Bindesequenzen des Moleküls. Somit können nur an der

offenen, aktiven Struktur Interaktionen wie z.B. die Bindung von F-Aktin an Vinculin

stattfinden [56] Da Vinculin nicht nur eine zentrale Schlüsselfunktion in der Regulation

von fokalen Kontakten einnimmt [49, 56], sondern auch die Bildung der kontraktilen

Stressfasern reguliert [144] und Vinculin-/--Zellen auch morphologischen Veränderungen

unterworfen waren [143, 144], wäre damit ein direkter Zusammenhang zwischen den

massiven Veränderungen bei den fokalen Kontakten, der Umstrukturierung der F-

Page 71: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Diskussion

60

Aktinfilamente sowie der Modifizierung der Zellmorphologie, wie wir sie in MZ durch

mangelndes α8-Integrin vorliegen haben, erklärt.

Im Gegensatz dazu zeigten VSMZ aus α8-/--Mäusen keine derartigen Veränderungen. Es

ist zu vermuten, dass die mangelnde α8-Integrin-Liganden Interaktion von anderen

Adhäsionsrezeptoren kompensatorisch übernommen wird oder α8-Integrin per se keine

wesentliche Rolle in der Ligandenbindung in VSMZ einnimmt. Wir vermuten daher, dass

die regulatorische Funktion von α8-Integrin vom Zelltyp abhängig ist. Diese in vitro

Befunde könnten auch erklären, warum in α8-/--Mäusen mehr Auffälligkeiten in der Niere

als in den Gefäßen auftreten [27].

3.2 Die Bedeutung von α8-Integrin für zellbiologische Aktivitäten

3.2.1 Einfluss von α8-Integrin auf Adhäsion und Ausbreitung

Einer der wichtigsten Aspekte, wie sich Zellen in einem Organismus in ihrer Umgebung

orientieren, ist die adhäsive Interaktion mit dem Substrat. Für zahlreiche Zellaktivitäten,

wie Zellüberleben, Proliferation, Differenzierung und Migration ist die Bildung von

adhäsiven Kontakten der Zellen an die ECM erforderlich [145]. Bereits 1995 konnte

Müller U. et al. zeigen, dass α8-Integrin die Adhäsion und Ausbreitung von

Hühnerfibroblasten fördern kann [116]. Dieser Effekt des RGD-abhängigen Integrins

wurde in den folgenden Jahren in weiteren mesenchymalen Zellen beschrieben [118, 125,

127]. Befunde zur Matrix-abhängigen Regulation von Adhäsion, Migration, Proliferation

[125] und Zellüberleben von WT- im Vergleich zu α8-/--MZ [142] wurden bereits in

unserer Arbeitsgruppe erhoben und publiziert. Im Zuge meiner Arbeit konnte ich

verifizieren, dass die α8-Integrin die Adhäsion und das Ausbreiten der MZ auf Fibronektin

fördert. Die akute Herunterregulation von α8-Integrin in RMZ (si itga8) führte wie die

dauerhafte α8-Integrin Defizienz in MMZ zu einer geringeren Adhäsion und Ausbreitung

der Zellen. Dies lässt somit auf einen direkten Einfluss von α8-Integrin auf die Adhäsion

von MZ schließen. Im Gegensatz dazu konnte auf keiner der untersuchten Matrices ein

unterschiedliches adhäsives Verhalten zwischen WT- und α8-/--VSMZ beobachtet werden.

Adhäsion ist eine Voraussetzung für eine gute Ausbreitung der Zellen, um eine korrekte

Lokalisation von Vinculin für eine vollständig ausgereifte Bildung der fokalen Kontakte zu

erreichen. Denn nur dann kommt es zur notwendigen Integrin-Zytoskelett-Bindung, in

deren Folge sich die Zelle auf ihrem Untergrund ausbreiten kann [146]. Xu W. et al. zeigte

Page 72: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Diskussion

61

1998 bereits, dass Fibroblasten (MEF), die kein Vinculin produzierten, weniger adhärent

waren, weniger ausgebreitet und mehr migrierten [143]. Das würde auch erklären, warum

wir in α8-/--MMZ bzw. si itga8 RMZ trotz unveränderter Vinculin-Expression, veränderte

Ausbreitungs- und Adhäsionsaktivitäten der Zellen beobachten konnten: die Zellen

konnten durch das fehlende α8-Integrin vermutlich weniger Integrin-ECM Interaktionen

mit dem Zytoskelett und ihrer Umgebung eingehen. In Folge dessen kam es, wie bereits

diskutiert, zu weniger und unausgereifteren Formierungen der fokalen Kontakte. Dies

resultierte in einer verminderten Lokalisation von Vinculin in den fokalen Kontakten und

folglich zum vermehrten Abbau und Umorganisation der Stressfasern. Dadurch adhärierten

die Zellen schwächer und breiteten sich geringer aus. Dagegen war in α8-/--VSMZ im

Vergleich mit WT-VSMZ die Struktur des Aktin-Zytoskeletts, die Bildung der fokalen

Kontakte, die Adhäsion und Ausbreitung nicht betroffen. Das deutet darauf hin, dass α8-

Integrin in VSMZ bei der Adhäsion an ECM keine so essentielle Rolle wie in MZ spielt.

3.2.2 Einfluss von α8-Integrin auf Zellüberleben, Proliferation und Migration

Apoptose, der programmierte Zelltod, ist wie auch die Proliferation ein wichtiger eng

regulierter Vorgang im Organismus, um die Zellzahl und die Gewebegröße während der

Embryonalentwicklung sowie in physiologischen und pathologischen Prozessen zu

kontrollieren. Der gezielte Abbau überzähliger und anormaler Zellen trägt somit zur

Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase bei [147, 148]. So ist das Verhältnis zwischen

Zellproliferation und Apoptose im Glomerulus entscheidend über den Ausgang zahlreicher

Glomerulonephritiden [149]. Die Proliferation von MZ ist dabei ein Kennzeichen

zahlreicher glomerulärer Erkrankungen. Desweiteren kann das Überleben der MZ ein

wichtiger Faktor für die glomeruläre Funktion und Struktur in gesunden sowie in

erkrankten Nieren sein [150]. Auch während der Entwicklung einer Arteriosklerose spielen

bei der Bildung von arteriosklerotischen Plaques Proliferation und Zelltod von VSMZ eine

entscheidende Rolle [151, 152]. Wie bereits publiziert, wirkte α8-Integrin in MMZ anti-

proliferativ [125]. In si itga8 RMZ dagegen hatte α8-Integrin eine wachstumsfördernde

Funktion. Es gibt Studien, die einen regulatorischen Zusammenhang zwischen α2- und α6-

Integrin und Zellwachstum beschreiben [153, 154]. Somit könnte die konträre Funktion

von α8-Integrin im Vergleich von transient zu dauerhaft defizienten MZ auf die

unterschiedliche Expression von α2- und α6-Integrinen zurückgeführt werden. Dagegen

führte der Mangel an α8-Integrin in VSMZ zu keinem veränderten Proliferationsverhalten.

Page 73: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Diskussion

62

Vorbefunde wiesen darauf hin, dass α8-Integrin das Überleben der MMZ begrenzt [142].

Durch Analyse der Caspase-3-Aktivität und Zellkernkondensation (Hoechstfärbung)

konnte ich im Rahmen meiner Arbeit sowohl auf FN als auch auf PL ein besseres

Überleben der α8-/--MMZ gegenüber den WT-MMZ nachweisen. Erste Daten aus siRNA

behandelten RMZ deuten ebenfalls darauf hin, dass die α8-Integrinkette die

Apoptosesensibilität in RMZ erhöhen könnte. Für eine signifikante Aussage müssen noch

weitere Untersuchungen durchgeführt werden. Durch Überexpression von α8-Integrin in

verschiedenen Zelllinien [155] sowie in HEK (human embryonic kidney)-Zellen [142]

wurde dagegen eine pro-apoptotische Wirkung von α8-Integrin postuliert. In VSMZ

wiederum war weder eine pro- noch anti-apoptotische Wirkung der α8-Integrinkette

nachweisbar. Somit ist anscheinend der Einfluss von α8-Integrin auf das Zellüberleben

vom Zelltyp abhängig. Wie in der Einleitung schon erwähnt, konnte α8β1-Integrin als ein

Differenzierungsmarker von VSMZ identifiziert werden und ist zudem an der Regulation

der Umdifferenzierung der VSMZ beteiligt. Mittels siRNA-Silencing herunterreguliertes

α8-Integrin ließ VSMZ vermehrt migrieren, aber geringer proliferieren [99, 127]. Im

Gegensatz dazu konnte in der vorliegenden Arbeit kein α8-Integrin abhängiger

Unterschied im Proliferationsverhalten von VSMZ beobachtet werden, während die

Migration α8-Integrin abhängig erschien. Für einen direkten Einfluss von α8-Integrin

spräche, dass sowohl ein akuter [99, 127] als auch ein dauerhafter Mangel an α8-Integrin

in VSMZ eine erhöhte Migrationsrate induzieren kann. So würde in vivo der Mangel an

α8-Integrin durch eine erhöhte Migration direkt Einfluss auf die Bildung von

arteriosklerotischen Plaques einnehmen. Dieser in vivo Funktion von α8-Integrin

widersprechen aber die Befunde der geringeren bzw. unveränderten Proliferation von

VSMZ mit akuter und dauerhafter α8-Integrin Defizienz. Eine erhöhte Migration der

VSMZ aus der Media in die Intima der Gefäßwand geht immer mit einer erhöhten

Proliferation einher, sodass beide biologische Prozesse eine Voraussetzung für die Bildung

von Plaques sind [29, 31-33]. Die für α8-Integrin postulierte hemmende Wirkung auf die

Migration kultivierter MMZ [125] konnte zwar tendenziell durch den Scratchassay und

Migrations-Barrieresassay gezeigt werden, jedoch war bei diesen beiden Methoden die

Bestimmung der anteiligen proliferierenden an den migrierenden Zellen schwierig. Zudem

kann beim Scratch Assay die Matrix-Beschichtung durch das Ritzen des Zellrasens mit

einer Pipettenspitze zerstört und somit die matrixabhängige Wanderung der Zellen

verfälscht werden. Da „Scratchen“ eine invasive Methode ist und die Zellen zum Teil

Page 74: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Diskussion

63

verletzt werden, vermuteten wir, dass durch die Ausschüttung von Zytokinen und weiteren

Wachstumsfaktoren ein Reparaturprozess zur Ausheilung angeregt wurde. Es ist nicht

sicher, inwieweit Zytokine und Wachstumsfaktoren von WT- und α8-/--MMZ in

unterschiedlichem Maß sezerniert werden. Wir konnten deshalb nicht eindeutig feststellen,

ob die zu einem späteren Zeitpunkt vermehrte Migration der α8-/--MMZ wirklich allein auf

den Mangel von α8-Integrin zurückzuführen war oder vielleicht auf den Einfluss von

unterschiedlich viel sezernierten Zytokinen und Wachstumsfaktoren. Aufgrund kürzerer

Versuchszeiten waren Proliferationseffekte im Boydenkammer-Assay vernachlässigbar. In

diesen Untersuchungen bestätigten sich die Vorbefunde aus den vorherigen

Migrationsassays. Unterexpression von α8-Integrin führte auch hier zu einer erleichterten

Migration der Zellen. Im Gegensatz dazu werden in der Literatur Integrine wie z. B avß3-

[156], α1β1- und α2β1-Integrin [157] als pro-migratorische Effektoren beschrieben. Aber

gerade für α8-Integrin existieren viele widersprüchliche Publikationen, die sowohl pro-

[158] als auch anti-migratorische Effekte [127, 159] postulieren. Daher wurde der Begriff

des “Tensegrins” eingeführt [158]. Das Konzept schreibt α8-Integrin eine duale Rolle in

der Migration zu. Es scheint zudem so, dass Zellen eine optimale Kontraktilität und

entsprechende Zugkraft für die Migration benötigen. α8β1-Integrin fördert die Migration

bei Zellen, die sich zunächst in einem weniger optimalen kontraktilen Zustand befinden

wie z. B. in Neuralleistenzellen [158] und reduziert die Migration von kontraktilen Zellen

[129]. Somit wäre die regulatorische Funktion von α8β1-Integrin nicht allein vom Zelltyp

abhängig, sondern auch vom Kontraktionsvermögen der Zelle.

3.3 Mögliche Kompensatorische Mechanismen

3.3.1 α2- und α6-Integrin

Zahlreiche Studien mit Knockout-Mäusen für verschiedene Integrine belegen die

essentielle Rolle von Integrinen für die Entwicklung und Differenzierung von Organen [94,

160]. Weiterhin wurde durch Knockout-Untersuchungen gezeigt, dass einige Integrine

kompensatorische Fähigkeiten besitzen und fehlende Integrine in ihrer Funktion ersetzen

können [161]. Hingegen können andere Integrine in ihrer Funktion nicht ersetzt werden

und ihre Abwesenheit führt zu embryonalem oder perinatalem Tod [161]. In einigen

Geweben stehen für einen Liganden mehr als ein Integrin zur Verfügung. Wird in diesem

Fall ein Integrin nicht exprimiert, so kann alternativ ein anderes Integrin den Liganden

Page 75: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Diskussion

64

binden und somit die Funktion des fehlenden Integrins übernehmen oder zumindest

teilweise kompensieren. Während bei mangelnder Kompensation das Fehlen eines

Integrins zu massiven Auswirkungen auf den Organismus führen kann, zeigen Gewebe, in

denen kompensatorische Mechanismen wirken, geringere Schäden [37]. So ist zwar die

Sterberate neonataler α8-/--Mäuse aufgrund embryonaler, zum Teil ausgeprägter

Nierenfehlbildungen groß und die überlebenden Nachkommen besitzen mit nur einer oder

zwei kleineren Nieren eine insgesamt geringere Nierenmasse als WT-Mäuse [119, 120],

dennoch sind die glomerulären Veränderungen, angesichts der starken Expression von α8-

Integrin im Mesangium von WT-Mäusen, verhältnismäßig gering [27]. Es ist aber noch

nicht geklärt, ob die de novo Expression der Kollagene und die vermehrte glomeruläre

Expression von α2-Integrin in den Glomeruli dieser Mäuse zur Aufrechterhaltung der

glomerulären Struktur beiträgt. α2β1-Integrin ist ein überwiegend Kollagen-bindendes

Protein mit sehr hoher Affinität für Kollagen I [162, 163]. Eine Hochregulation von α2-

Integrin konnte ebenso von Bieritz B et al., 2003 in kultivierten α8-/--MMZ gezeigt werden

[125]. Marek I wies 2006 erstmals eine Hochregulation von α6-Integrinketten in α8-/--

MMZ nach [142]. α6-Integrin ist ein Hauptrezeptor für Laminine. α6-Integrin kann sowohl

mit der β1- als auch mit der β4-Integrinkette Heterodimere bilden, die jeweils spezifisch

für bestimmte Laminine sind [162, 163]. Die mögliche kompensatorische Hochregulation

von α3-, α5-. αV-und β1-Integrin konnte zudem ausgeschlossen werden. In α8-/--VSMZ

lag dagegen keines der untersuchten Integrine induziert vor [125, 135]. α2- und α6-

Integrinketten werden normalerweise in MZ gering exprimiert [164], denn α2β1, α6β1 und

α6β4 sind Integrine, die meist in Zellen mit epithelialer Herkunft präsent sind [162, 163].

Sowohl die geringe Expression in WT-MMZ als auch die Hochregulation der beiden

Integrinketten in α8-/--MMZ konnte in unseren Untersuchungen bestätigt werden. Im

Gegensatz dazu waren weder α2- noch α6-Integrine in α8-/--VSMZ kompensatorisch

induziert [125, 135]. Diese Befunde führten zunächst zu der Hypothese, dass sich die

Unterschiede in der Morphologie und bei zellbiologischen Aktivitäten zwischen α8-/--

MMZ und α8-/--VSMZ auf die unterschiedlich exprimierten α2- und α6-Integrinketten

zurückzuführen sind. Da aber in den si itga8 RMZ die α2- und α6-Integrinketten reduziert

exprimiert vorlagen, aber trotzdem Unterschiede in der Morphologie und bei

zellbiologischen Aktivitäten gegenüber der si Ko RMZ gezeigt werden konnten, scheint

sich in MZ der direkte Zusammenhang von α8-Integrin und erhöhter Expression von α2-

noch α6-Integrin nicht zu bestätigen. Es ist aber noch zu klären, ob ein transienter

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Diskussion

65

Knockdown von α8-Integrin mit einem limitierten Zeitraum (in unserem Beispiel 96h) sich

in seinem kompensatorischen Potential generell von einem dauerhaften knockout

unterscheidet und andere Integrinketten als α2 noch α6 den Mangel an α8-Integrin

kompensatorisch ausgleichen. Dazu müssen die Expressionen weiterer Integrinketten wie

z.B. α3, α5, αV und β1 nach einem transienten Knockdown von α8-Integrin untersucht

werden. Um den direkten Einfluss von α8-Integrin auf die Expression von α2- und α6-

Integrinketten in MZ genauer zu untersuchen, könnten Überexpressionsversuche in WT-

MZ oder Rescue-Versuche mit einem α8-Integrin Konstrukt in α8-/-- bzw. si RNA

behandelten MZ durchgeführt werden.

3.3.2 Funktion von α2- und α6-Integrin beim Zellüberleben in α8-/--MMZ

Sowohl für α2-Integrin [165] als auch für α6-Integrin [166] wurde eine anti-apoptotische

Wirkung postuliert. Um zu überprüfen, ob und inwieweit die vermehrt exprimierten α2-

und α6-Integrine in α8-/--MMZ an der Regulation des Zellüberlebens beteiligt sind, wurde

das Zellüberleben der α8-/--MMZ nach Behandlung mit blockierenden Antikörpern für α2-

und α6-Integrin untersucht. Stimulierte α8-/--MMZ zeigten nach der Inhibition von α6-

Integrin eine erhöhte Apoptoserate, während die Blockierung von α2-Integrin zu keiner

Veränderung im Zellüberleben führte. Damit würde die anti-apoptotische Wirkung von α6-

Integrin in α8-/--MMZ bestätigt werden, während α2-Integrin in α8-/--MMZ keine anti-

apoptotische Eigenschaft besitzt. Allerdings führten erstaunlicherweise kombinierte α2-

und α6-Integrin Inhibitionen zu keiner erhöhten Apoptoserate. Es ist bekannt, dass

Integrine die Aktivität und Expression weiterer Integrine beeinflussen können [37]. Sun H.

et al., 1998 zeigte, dass eine Re-Expression von α2β1-Integrin in gering differenzierten

Brustkrebszelllinien (Mm5MT) zu einer Hochregulation von α6- und β4-Integrin-UE, aber

nicht von α1-, α3-, α5- oder β1-Integrin führte [167]. Angelehnt an die Publikation von

Sun H. et al., 1998 wäre somit für α2-Integrin eine regulatorische Funktion auf die

Expression der α6-Integrinkette denkbar. Die α2β1-Integrin Expression löste zudem die

Differenzierung der Brustkrebszellen zu einem ausdifferenzierten, epithelialen Phänotyp

aus [167].Wir stellen daher die Hypothese auf, dass die Hochregulation des α6-Integrins

das Zellüberleben sichert und α2-Integrin dagegen keinen direkten Einfluss auf das

Zellüberleben der α8-/--MMZ einnimmt. Die Tatsache, dass in α8-/--MMZ aufgrund der

erhöhten α2-Integrin Expression ein Kollagenrezeptor vermehrt vorliegt und Kollagen I de

novo sezerniert wird, ließ im Vergleich zur WT-MMZ eine erhöhte Adhäsion von α8-/--

Page 77: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Diskussion

66

MMZ auf Kollagen I erwarten. Allerdings zeigten α8-/--MMZ eine geringere Ausbreitung

und Adhäsion auf Kollagen I, ähnlich wie auf Fibronektin. Wie schon zuvor in diesem

Kapitel diskutiert, spricht auch dieser Befund für eine eher regulatorische als direkte

Funktion von α2-Integrin.

3.4 α8β1-Integrin und mesenchymale Marker

Passend zu der unveränderten mesenchymalen Morphologie der VSMZ (Abb. 10), wurden

sowohl die mesenchymalen Marker wie α-SMA, Desmin und Vimentin sowie der

epitheliale Marker E-Cadherin in den WT- und α8-/-VSMZ gleich stark exprimiert [125,

135]. Im Gegensatz dazu unterlaufen α8-/--MMZ eine starke Veränderung des WT-

Phänotyps zu einer mehr epithelial-ähnlichen Zellstruktur. Zudem ist die Expression von

mesenchymalen Markern wie α-SMA und Desmin herunterreguliert, während der

epitheliale Marker E-Cadherin leicht erhöht exprimiert wird. Eine mögliche Deutung wäre,

dass die MMZ durch den Verlust von α8-Integrin eine MET (mesenchymale-epitheliale

Transition), den reversiblen Prozess der EMT (epitheliale-mesenchymale Transition)

durchlaufen. Beide Prozesse spielen eine wesentliche Rolle in der Embryonalentwicklung

und in der Entstehung einer Fibrose. In vitro konnte gezeigt werden, dass die

Herunterregulation von E-Cadherin mit dem Verlust des epithelialen Phänotyps direkt

korrelierten und mesenchymale Marker wie Vimentin, Fibronektin und α-SMA die

Transition von epithelialen zu mesenchymalen Zellen (EMT) kennzeichnen [168]. Dieses

Phänomen ist in Modellen von renalen fibrotischen Erkrankungen häufig anzutreffen. Die

Reversion dieses Prinzips wird MET genannt und stellt die Transition von mesenchymalen

Zellen zu epithelialen Zellen dar [169, 170]. Bis heute ist dieser Vorgang mehrfach

beschrieben worden, wobei keine einheitlichen Marker zur Charakterisierung der EMT

bekannt sind. Yang und Liu unterteilen die EMT in vier Abschnitte, die für die Vollendung

der EMT auf zellulärem Level nötig sind [171]. Nicht in allen Punkten können unsere

Daten den reversen Prozess der EMT, die MET widerspiegeln. So ist z.B. Vimentin als ein

mesenchymaler Marker in den α8-/--MMZ nicht herunterreguliert, sondern liegt vermehrt

exprimiert vor. Eine mögliche Erklärung wäre eine Art Übergangsphase im Verlauf der

MET, wie sie von Strutz F. et al., 1996 für EMT beschrieben wurde. In diesem Stadium

der EMT exprimieren die Zellen eine Kombination aus epithelialen und mesenchymalen

Markern [172]. Ein weiterer Widerspruch ergibt sich aus der erhöhten Migrationsrate von

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Diskussion

67

α8-/--MMZ bezüglich der WT-MMZ. Denn die MET geht mit dem Verlust von

kontraktilen und migratorischen Fähigkeiten einher [173, 174]. Zahlreiche Studien der

letzten Jahre untersuchten den Einfluss der EMT auf renale fibrotische Läsionen [175,

176], aber der Zweifel wächst, ob dieser Prozess in vivo überhaupt existiert und eine Rolle

spielt [177]. Angelehnt an den regulatorischen Einfluss des α8-Integrins auf den

Differenzierungszustand von VSMZ [99, 126, 127] und Epithelzellen [115] wäre auch

denkbar, dass der Mangel an α8-Integrin zu einer Dedifferenzierung der MZ führt. Somit

würden die MZ keinen epithelialen, sondern vielmehr einen undifferenzierten, den

mesenchymalen Stammzellen ähnlichen Phänotyp annehmen. Es bleibt aber die Frage

ungeklärt, warum in den uns vorliegenden kultivierten VSMZ α8-Integrin weder als

Marker noch als Regulator des Differenzierungszustands fungiert, wie es in transient α8-

Integrin defizienten VSMZ (si itga8 VSMZ) beschreiben wurde [99, 127]. Möglicherweise

tragen noch unbekannte kompensatorische Mechanismen der α8-/--VSMZ zu den

unterschiedlichen Befunden mit si itga8 VSMZ bei (s. 3.3 Kompensatorische

Mechanismen).

3.4.1 Vermehrte Bildung von Vimentin in α8-/--MMZ

Vimentin ist ein ca. 57 kDa großes Zytoskelettprotein. Es gehört wie Desmin zu dem Typ-

3 Intermediärfilament und ist typischerweise in mesenchymalen Zellen, wie Fibroblasten,

Endothelzellen, MZ und VSMZ vorzufinden [179]. Studien zeigten, dass Vimentin u.a. am

Nukleus, am endoplasmatischem Retikulum (eR) und an Mitochondrien binden kann und

somit anscheinend eine wichtige Funktion in der Verankerung der Organellen im Zytosol

einnimmt. Zudem wurde publiziert, dass Intermediärfilamente zusammen mit den

Mikrotubuli das Aktinzytoskelett verstärken und dadurch die polygonalen Aktin-

Netzwerke organisieren, die für die Filopodien-Formierung während der Migration einer

Zelle notwendig sind [180]. In Ingber D. E. et al., 1994 wird das Modell der Tensegrity

beschrieben, d.h. die drei Zytoskelettstrukturen, Aktinfilamente, Mikrotubuli und

Intermediärfilamente, bilden ein Netzwerk, dass sich gegenseitig stabilisiert ohne

miteinander (zwingend) verbunden zu sein [180]. Integrine spielen eine regulatorische

Funktion in der Signalweiterleitung durch mechanischen Stress auf das Zytoskelett im

Tensegrity-Modell [181]. Im Vergleich zu den WT-MMZ unterliegen α8-/--MMZ einer

erhöhten Migrationsrate. Erhöhte Migration bedeutet erhöhte Zug- und Scherkräfte, die auf

die Zelle und ihre Organellen ausgeübt werden. Somit könnte in den betroffenen MMZ

Page 79: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Diskussion

68

mehr Vimentin exprimiert werden, um den Zug- und Scherkräften, durch ein stabileres

Zytoskelett, entgegenzuwirken. Passend dazu konnte in Fibroblasten aus Vimentin

knockout Mäusen im Vergleich zu Fibroblasten aus Vimentin WT-Mäusen gezeigt werden,

dass der Verlust des Vimentin-Netzwerkes im Zytoskelett zu einer geringeren

mechanischen Stabilität führt. Zudem ist eine geringere Migrationsrate in Vimentin

knockout- im Vergleich zu WT-Fibroblasten vorzufinden [178].

3.5 Einfluss von α8-Integrin auf Matrix-Metalloproteinasen (MMP)

Der Einfluss unterschiedlicher Matrixmoleküle auf Ausbreitung, Adhäsion, Migration,

Proliferation und Apoptose, wie er in der vorliegenden Arbeit auf Fibronektin, Kollagen I

und Fibrillin untersucht wurde, ist zudem beeinflusst von einem ständig stattfindenden

Umbau der ECM. Nur ein Gleichgewicht von ECM-Neusynthese und Abbau durch

Proteasen erhält die Gewebshomöostase [182]. MMP und TIMP (tissue inhibitors of

metalloproteinases) spielen eine entscheidende Rolle in der embryonalen Entwicklung

sowie in zahlreichen physiologischen Prozessen. Aber auch in pathologischen Vorgängen

wie Entzündungen und Krebserkrankungen nehmen sie eine essentielle Funktion ein [182].

MMP-2 (Gelantinase A) und MMP-9 (Gelatinase B) sind die häufigsten exprimierten

MMP im Glomerulus [136]. MMP-2 und MMP-9 sind Typ IV Kollagenasen, deren

Aktivierung und Aktivität jeweils durch einen speziellen Inhibitor reguliert wird. So wirkt

TIMP-2 hauptsächlich auf MMP-2 [77] und TIMP-1 mit hoher Affinität auf MMP-9

inhibierend [76]. So sind auch MMP-2 und MMP-9 sowie ihre Inhibitor an der

Nephrogenese sowie an Nierenerkrankungen beteiligt [183]. In vivo Untersuchungen in

Mäusen mit einer experimentell induzierten Fibrose dokumentierten, dass durch eine

verringerte MMP-2 und MMP-9 Aktivität eine Inhibition der ECM Degradierung ausgelöst

wird und dass eine zusätzliche Störung des MMP- und TIMP-Gleichgewichtes zu einer

Verschlechterung des Krankheitsbildes führte [184]. Die Befunde dieser Publikation und

meine Daten, die zeigen, dass α8-/-- und si itga8 MZ eine verminderte Expression von

MMP-2, -9 und TIMP-1 aufweisen, könnten erklären, dass es im Glomerulus der α8-/--

Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen zu Veränderungen bei der Matrixablagerung kommt

[27] und glomeruläre Schäden in α8-/--Mäusen schlechter ausheilen [122]. Dass der

Mangel an α8-Integrin in MZ direkt zu einer reduzierten Expression von MMP-2 und

Page 80: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Diskussion

69

MMP-9 führen kann, wird durch die Studie unterstützt, die zeigt, dass es infolge einer

Inhibition von Integrinen zu einer geringeren Expression dieser zwei MMP kommt [137].

MMP und ihre natürlichen Inhibitoren TIMP sind aber auch wichtige Regulatoren für

zelluläre Prozesse wie Adhäsion, Migration und Proliferation. Eine Voraussetzung für

Migration ist die zelluläre Bewegung durch das dichte Netz der ECM. Deshalb ist eine der

wichtigsten Aufgaben von MMP, den Zellen einen Durchtritt durch die ECM durch

lokalen Abbau der Matrix zu ermöglichen. Die Inhibition von MMP verhinderten

Zellmigration und Invasion [185]. Überproduktion von MMP führten dagegen zu einer

erhöhten Invasion von Zellen [186, 187]. Daher war es überraschend, dass α8-/--MMZ trotz

erniedrigter Expression von MMP leichter migrierten. Neben MMP kann auch CTGF

(connective tissue growth factor) auf die Migration sowohl von VSMZ [138] als auch von

MZ [139] einwirken. Zudem induziert CTGF in renalen Fibroblasten eine erhöhte MMP-2

Aktivität und Expression [188]. Da CTGF in α8-/--MMZ sowohl auf Transkriptions- als

auch auf Translationsebene bis auf ein geringes basales Niveau herunterreguliert war,

könnte es somit zu einer geringeren Expression von MMP-2 und MMP-9 geführt haben.

Die erhöhte Migrationsrate in α8-/--VSMZ könnte mit der vermehrten CTGF Expression

erklärt werden. Denn eine Überexpression von CTGF in VSMZ führt zu einer einer

gesteigerten Migration [189]. Ob und inwieweit die α8-Integrin abhängigen

regulatorischen Aktivitäten durch MMP oder TIMP in den VSMZ stattfinden, muss noch

untersucht werden.

3.6 Welche Rolle spielt der Rho/ROCK–Signalweg?

Da Integrine als bidirektionale Signaltransduktoren agieren, gelangen extrazelluläre

Informationen über die Integrin-vermittelte ECM-Verankerung an das Zytoskelett und

intrazelluläre Signale können die Integrin-ECM Bindung induzieren [35, 39, 190].

Integrine tragen über outside-in signaling zur Aufrechterhaltung des Phänotyps einer Zelle

bei. Dabei werden Signale aus der ECM von Transmembranrezeptoren wie Integrinen an

das Zytoskelett weitergeleitet. Kleine GTPasen aus der Rho-Familie spielen dabei eine

bedeutende Rolle [53, 191]. Sie übernehmen aber nicht nur die Weiterleitung des Integrin-

abhängigen Signals zur Kontrolle der Organisation des Zytoskeletts, sondern regulieren

auch die Expression von CTGF [192, 193]. In MZ wurde ein direkter Zusammenhang

zwischen CTGF und Aktin-Abbau und somit auf den Umbau des Zytoskeletts beschrieben.

Page 81: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Diskussion

70

Durch den Abbau der Stressfasern erfolgte eine Inhibition der CTGF Expression [139,

194]. In Fibroblasten wurde bereits nachgewiesen, dass die Induktion von CTGF

(connective tissue growth factor) über ROCK verläuft und durch die Inhibition von ROCK

CTGF geringer exprimiert wird [140, 195]. Eine Arbeit in epithelialen Darmzellen

(intestinal crypt cells) zeigte zudem eine α8-Integrin abhängige Aktivierung des

RhoA/ROCK Signalweges sowie den Einfluss dieser Aktivierung auf Stressfasern [115].

Deshalb wurde die Rolle der kleinen GTPase RhoA bei der Regulation der α-SMA- und

CTGF-Expression in Abhängigkeit von α8-Integrin evaluiert. Die Behandlung der Zellen

mit dem ROCK Inhibitor Y 27632 zeigte, dass die Inhibition des RhoA/ROCK-Weges in

WT-MMZ zu einer reprimierten Expression von CTGF und α-SMA führte. α-SMA und

CTGF wurden in α8-/--MMZ so gering exprimiert, dass die anscheinend unveränderte

Expression durch die ROCK-Inhibition nicht wirklich beurteilt werden kann. So konnten

wir zwar zeigen, dass der RhoA/ROCK-Signalweg bei der CTGF Expression sowie bei der

Bildung und Organisation der Stressfasern in WT-MMZ beteiligt ist, aber ein Einfluss von

α8-Integrin konnte in diesem Zusammenhang nicht nachgewiesen werden. Dagegen wurde

durch die Blockierung des RhoA/ROCK-Weges CTGF in WT-VSMZ unverändert

exprimiert und widerspricht einer ROCK-regulierten CTGF-Expression. Einerseits kann

der RhoA/ROCK Signalweg in VSMZ zwar die CTGF-Expression beeinflussen, ist aber

dafür nicht unbedingt zwingend notwendig. Die Regulation von CTGF über p38 MAP-

Kinase wird als eine mögliche Alternative diskutiert. Zudem wird die CTGF-Expression

bereits als zellspezifisch reguliert beschrieben [193]. Warum der Mangel an α8-Integrin

wieder zu einer Rho/ROCK beeinflussten CTGF-Expression führt, bleibt in diesem

Zusammenhang noch unklar. Ebenso konnte in VSMZ zwar eine RhoA/ROCK abhängige

Regulation von α-SMA nachgewiesen werden, wobei aber α8-Integrin keine Rolle zu

spielen scheint. Möglich ist, dass andere Integrine als α8-Integrin an der Aktivierung des

Rho/ROCK -Weges beteiligt sind. So kann auch α5β1-Integrin über den Rho/ROCK Weg

auf die Zellmigration Einfluss nehmen [196] und somit auch auf die α-SMA Expression.

Denn Stressfasern, die aus α-SMA gebildet werden, sind typischerweise in Zellen mit

migratorischen bzw. kontraktilen Fähigkeiten vorzufinden [63]. Desweiteren sind auch

Signaltransduktionswege ohne Integrin-Liganden Bindung aktivierbar. Ebenso können

Assoziationen mit weiteren Rezeptoren wie z.B. Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTK,

„receptor tyrosine kinase“) und Verknüpfungen mit weiteren Signalwegen wie z.B. dem

Ras/MAPK-Weg eine Rolle spielen (siehe Überblick [35]). In puncto Regulation der

Page 82: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Diskussion

71

Stressfaserformierung und der CTGF-Expression bleiben noch viele Fragen offen.

Hinsichtlich meiner Befunde erscheint aber zu diesem Zeitpunkt gesichert, dass sich die

Regulation in MZ von der in VSMZ unterscheidet.

3.7 Die Interaktion von Fibrillin-1 und α8β1-Integrin

Fibrillin-1 wird sowohl in der Media der Arterie als auch in der mesangialen Matrix des

Glomerulus exprimiert [108]. Dort wird Fibrillin-1 nicht nur von den glomerulären MZ

sezerniert [110], sondern ist auch in der Lage Adhäsion, Ausbreitung, Migration und

Proliferation von MZ zu fördern [112]. Zudem konnte Fibrillin-1 während einer

glomerulären Erkrankung in Glomeruli vermehrt detektiert werden [112]. Im Gegensatz

dazu führte eine verringerte Fibrillin-1 Expression nach Induktion eines glomerulären

Schadens zu milderen Nierenschäden [197] und zu einer reduzierten Proliferation [112].

Weiterhin wird Fibrillin-1 als ein möglicher Ligand von α8-Integrin angesehen [106]. Über

welche Bindesequenz diese zwei Moleküle miteinander verbunden sind, ist noch nicht

geklärt. Da bereits für die RGD-bindenden Integrine α5β1 und αvβ3 nachgewiesen wurde,

dass sie über das RGD-Motiv an Fibrillin-1 binden können [107], war zu erwarten, dass

sich α8-Integrin ebenfalls RGD-abhängig an Fibrillin-1 haftet. Es konnte zunächst gezeigt

werden, dass die Adhäsion und Ausbreitung der MMZ, VSMZ und siRNA behandelten

RMZ mit Fibrillin-1 von der Anwesenheit des RGD-Motivs beeinflusst war. Allerdings

schien die Anwesenheit von α8-Integrin für die Adhäsion und Ausbreitung nur in MZ eine

Rolle zu spielen. Jedoch zeigten weitere Untersuchungen mit blockierenden cRGD-

Peptiden im Vergleich zwischen WT- und α8-/--MMZ auf, dass die Adhäsion von MMZ

nicht von α8-Integrin abhängig war. Demnach erscheint es wahrscheinlich, dass Fibrillin-1

über seine RGD-Bindesequenz über seine bereits bekannten Integrinrezeptoren wie α5β1

und αvβ3 mit den Zellen interagiert und kein Ligand von α8-Integrin ist. Dennoch könnte

eine direkte oder indirekte Interaktion zwischen α8-Integrin und Fibrillin-1 existieren Wie

anhand von α5β1-vermittelter Interaktion von Zellen mit Fibrillin gezeigt werden konnte,

wird die Zelladhäsion durch EGF-like Domänen extrem verstärkt [107]. Da wir nur mit

Fibrillinfragmenten gearbeitet haben, könnten diese notwendigen synergen Regionen

fehlen. Durch Untersuchungen mit einem Gesamtmolekül von Fibrillin-1 könnte die

Beteiligung von synergen Regionen an der Adhäsion und Ausbreitung abgeklärt werden.

Page 83: Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results cannot be explained by different

Material und Methoden

72

4 Material und Methoden

4.1 Material

4.1.1 Chemikalien

Chemikalien und Medien Bezugsquelle

β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Acrylamid-Bis Lösung (Rotiphorese30) Roth, Karlsruhe

Amidoschwarz Merck, Darmstadt,

Ammoniumpersulfat (APS) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

BCA Protein Assay Pierce, Rockford, IL,USA

Hoechstfarbe Hoechst, Frankfurt

Bromphenolblau Serva, Heidelberg

BSA A7030 Sigma-Aldrich, Taufkirchen

3-[3-Cholamidopropyl)-Dimethyl-ammonio]-1-Propansulfonat (Chaps)

Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(SP-4-2)-Diammindichloroplatin(II) (cis-Platin)

Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Kollagen I (3,25 mg/ml) Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA

Kollagenase Type I Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Complete Protease Inhibitor Cocktail Tabletten

Roche, Mannheim

Coomassie Brilliant Blue G 250 Serva, Heidelberg

cyclisches RAD (Cyclo(-Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val)

Bachem, Weil a. Rhein

cyclisches RGD (Cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)

Bachem, Weil a. Rhein

DEVD-AMC Biomol, Plymouth Meeting, PA, USA

Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt

DMEM Medium High Glucose PAA, Cölbe

DMF (Dimethylformamid) Merck, Darmstadt

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Material und Methoden

73

Elastase aus Schweinepankreas (200 U/mg) Serva, Heidelberg

Essigsäure 100% Merck, Darmstadt

Ethanol Roth, Karlsruhe

Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) Merck, Darmstadt

Fibronektin (rein) aus menschlichem Plasma Roche, Mannheim

Fötales Rinderserum (FCS) PAA, Cölbe

Gelatine G1890 Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Glycin Merck, Darmstadt

Hämatoxylin-Lösung modifiziert nach Gill III für die Mikroskopie

Merck, Darmstadt

HiPerFect Transfection Reagent Qiagen, Hilden

Insulin aus Rinderpankreas Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Isopropanol Merck, Darmstadt

ITS-Supplement Roche, Mannheim

L-Glutamin 100x 200mM PAA, Cölbe

Magermilchpulver Lasana Humana Milchunion eG, Herford

Magnesiumchlorid (MgCl2) Merck, Darmstadt

Methanol Merck, Darmstadt

Mowiol Merck, Darmstadt

Natrium-Azid Merck, Darmstadt

Natriumchlorid (NaCl) Merck, Darmstadt

Natriumdodecylsulfat (SDS) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Natriumhydroxid (NaOH) Merck, Darmstadt

PageRuler Plus Prestained Protein Ladder Fermentas,St.Leon-Rot

PageRuler Prestained Protein Ladder Fermentas,St.Leon-Rot

PBS Dulbecco Pulver Biochrom AG, Berlin

Penicillin/Streptomycin 100x PAA, Cölbe

Paraformaldehyd (PFA) Merck, Darmstadt

Pferdeserum PAA, Cölbe

Oligonukleotide (Primer) MWG Biotech, Ebersberg

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Material und Methoden

74

Opti-MEM Invitrogen, Darmstadt

Protease Inhibitor Tabletten Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Quick Diff Lösungen 1 und 2 Dade Behring Marburg GmbH, Marburg

Roti-Block 10x Konzentrat Roth, Karlsruhe

Rotiphorese Gel 30 Roth, Karlsruhe

Salzsäure (HCl) Merck, Darmstadt

SYBR Green PCR Mastermix Applied Biosystems, Darmstadt

Taq DNA-Polymerase Qiagen, Hilden

Tetramethylethylendiamin (TEMED) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) Merck, Darmstadt

Triton-X 100 Serva, Heidelberg

Trypsin Inhibitor Type-II-S Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Trypsin/EDTA 10x PAA, Cölbe

Tween 20 (Polyoxyethylensorbit-Monolaurat)

Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Vitronektin-100 Nutacon, Leimuiden, NL

Y-27632 (ROCK-Inhibitor) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

4.1.2 Kits

Kits Bezugsquelle

5-Bromo-2`-deoxyuridine Labeling und Detektion Kit II

Roche, Mannheim

ECL Plus Western Blotting Detektion Reagenz, Amersham

GE Healthcare, Uppsala, Schweden

QIAshredder Qiagen, Hilden

RNase-freie DNase Set Qiagen, Hilden

RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden

Taq PCR Core Kit Qiagen, Hilden

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Material und Methoden

75

4.1.3 Verbrauchsmaterialien

Materialbezeichnung Bezugsquelle

Chamberslide VWR International, Darmstadt

Deckgläser VWR International, Darmstadt

Eppendorf-Reaktionsgefäße (Eppendorfcups)

Eppendorf, Hamburg

Fettstift (Liquid Blocker) Science Services, München

Hybond- ECL Nitrocellulose Membrane, Amersham

GE Healthcare, Uppsala, Schweden

Hybond-P PVDF Membrane Amersham GE Healthcare, Uppsala, Schweden

Kryoröhrchen Greiner Bio-One, Frickenhausen

8-Kammer Objektträger BD Falcon, Heidelberg

Petrischalen versch. Größen BD Falcon, Heidelberg

Röntgenfilm Fuji Medical Super RX Fuji Foto, Tokyo, Japan

Zellkulturplatten, 96-Well PAA, Cölbe

Tyler Siebe (versch. Porengröße) VWR International GmbH, Darmstadt

Whatman-Papier Hartenstein, Würzburg

Zellkulturflaschen Greiner Bio-One, Frickenhausen

Zellschaber 25cm steril Sarstedt, Nümbrecht

4.1.4 Geräte und Zubehör

Materialbezeichnung Bezugsquelle

ABI PRISM 7000 Sequence Detection System

Applied Biosystems, Weiterstadt

AIDA Image Analyzer 2.1 Auswertungs-Software

Raytest, Berlin

Anatomische Pinzetten für Aorta Fine Science Tools, Heidelberg

Biophotometer (DNA) Eppendorf, Hamburg

Boydenkammer Neuro Probe, Inc., Gaithersburg, USA

Brutschrank Hera Cell 240 Heraeus, Hanau

Kryo Einfrierbox, Nalgene Thermo Scientific, Bonn

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Material und Methoden

76

Elektrophoresekammer (DNA-Gele) Biorad, München

Elektrophorese Power Supply Consort, Turnhout, Belgien

Elisareader Dynatech MR700 Dynatech, Denkendorf

Fluoreszenzmikroskop Nikon, Düsseldorf Leica, München,

Gefrierschrank -80°C Forma Scientific, Frankfurt

Gel-Dokumentation Biometra, Göttingen

GraphPad Prism 5 Software GraphPad, San Diego, CA, USA

Heizblock Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg

Kühlschränke Bosch, Stuttgart Liebherr, Ochsenhausen

Kühl-Tischzentrifuge, Heraeus ThermoFisher, Bonn

Leica DC 200 Kamera Leica, Herbrugg, Schweiz

Leica DC Viewer Software Leica, Herbrugg, Schweiz

Leica Lichtmikroskop Leica, Bensheim

Lumi Imager Fujifilm, Düsseldorf

Magnetrührer RCT Basic IKA Labortechnik, Staufen

Membran für Boydenkammer: PVP frei, 25x80mm, 8µm Poren

Neuro Probe, Inc., Gaithersburg, USA

Mastercycler (PCR) Eppendorf, Hamburg

MetaVue imaging Software Molecular Devices, Ismaning

Mikrotest Platte 96-Well F Sarstedt, Nümbrecht

Mikrowelle Sharp Electronics, Hamburg

Neubauer Zählkammer Hartenstein, Würzburg

Olympus CK40 Mikroskop Olympus, Hamburg

pH-Meter CG 812 Schott Geräte, Ludwigshafen

Pipetten Greiner Bio-One, Frickenhausen

Pipettierhilfe Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt

Power Pac 300 Bio-Rad, München

Primer express version 2.0 Software Applied Biosystems, Darmstadt

Röntgenkassette (X-Omatic screen) Kodak, Stuttgart

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Material und Methoden

77

Scanner Scan Jet 6300C Hewlett-Packard GmbH, Nürnberg

Schere für Aorta Fine Science Tools, Heidelberg

Schütteltisch KS250 IKA Labortechnik, Staufen

Spektrometer Spectra Fluor Tecan, Salzburg, Österreich

SPSS Software SPSS Inc., Chicago, USA

Sterilbank BDK Luft- und Reinraumtechnik GmbH, Sonnenbühl-Genkingen

Thermocycler T1 Biometra, Göttingen

Transblot SD semidry transfer cell Bio-Rad, München

Ultraschallgerät Sonoplus HD 70 BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin

Vortexer MS1 Minishaker IKA Labortechnik, Staufen

Waage Sartorius universal Sartorius, Göttingen

Wasserbad Köttermann Labortechnik, Uetze

Zellzähler Cell Counter Countess Invitrogen, Darmstadt

Zentrifuge 5810R Eppendorf, Hamburg

Zentrifuge CR 322 ThermoFisher, Schwerte

4.1.5 Puffer und Lösungen

4.1.5.1 Zellkultivierung

Penicillin/Streptomycin-Stammlösung 10000U/ml Streptomycin

10000U/ml Penicillin

Insulin-Stammlösung: 5mg/ml 100mg in 20ml 2% Essigsäure lösen

D10+-Medium 500ml DMEM

50ml FCS

5ml Penicillin/Streptomycin

0,5ml Insulin

D20+-Medium 500ml DMEM

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Material und Methoden

78

100ml FCS

5ml Penicillin/Streptomycin

0,5ml Insulin

D0.1+-Medium (Hungermedium) 500ml DMEM

5ml FCS

5ml Penicillin/Streptomycin

0,5ml Insulin

Einfriermedium jeweiliges Wachstumsmedium mit 10% DMSO versetzen

1x Trypsin/EDTA 10x Trypsin/EDTA mit 1xPBS verdünnen

4.1.5.2 Kultivierung von MZ aus den Glomeruli

ITS-Supplement (Insulin-Transferrin-Selen)-Stammlösung

50mg in 1ml dH2O lösen

Kultivierungslösung 500 ml D20

100µl ITS-Stammlösung

(Endkonzentration: 5µg/ml Insulin, 5µg/ml Transferrin, 5ng/ml Selen)

4.1.5.3 VSMZ-Isolation aus der Mausaorta

Enzymlösung 24mg Kollagenase Typ I

8mg Elastase

8mg Trypsin Inhibitor

24ml D20+

Waschpuffer 1% Penicillin/Streptomycin in 1xPBS

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Material und Methoden

79

4.1.5.4 Proteinisolierung und –auftrennung

RIPA-Proteinlysepuffer 50mM HEPES pH 7,4

150mM NaCl

1% Triton X-100

1mM EDTA

+ Protease-Inhibitor Cocktail

10% SDS-Lösung 10g SDS

ad 100ml dH2O

Lower Tris 4x 1,5M Tris

0,4% SDS (aus 10% Stammlösung)

pH 8,8 mit 12N HCL

Upper Tris 4x 0,5M Tris

0,4% SDS (aus 10% Stammlösung)

pH 6,8

10% APS 100g/l Ammoniumperoxydisulfat

lösen in dH2O

Sammelgel Rotiphorese Gel30

0,5M Upper Trispuffer, pH 6,7

10% APS Lösung

ad dH2O

Trenngel Rotiphorese Gel 30

3M Lower Trispuffer, pH 8,9

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Material und Methoden

80

TEMED

10% APS Lösung

ad dH2O

Reservoirpuffer 10x (Gel-Laufpuffer) 1M Tris

0,77M Glycin pH 8,3

1% SDS

TBS 10x 0,5M Tris Base

1,5M NaCl, pH 7,6

TBS/T 10% 10x TBS

0,06% Tween 20

Proben-Puffer 10mM EDTA

(bei reduzierten Bedingungen vor dem Gebrauch frisch mit β-Mercaptoethanol versetzen)

300mM Tris, pH 6,9

10M Harnstoff

0,1% SDS

einige Tropfen gesättigte

Bromphenolblau - Lösung

Towbin-Puffer 4x 768mM Glycin

100mM Tris/HCl, pH 8,3

5,2mM SDS

Blotpuffer 25% Towbin Puffer

20% Methanol

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Material und Methoden

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Blockierungslösung 1x Rotiblock in TBS/T,

5 % Magermilch in TBS/T

oder 5% Pferdeserum in TBS/T

Amidoschwarz-Färbelösung 0,1% Amidoschwarzpulver

25% Isopropanol

10% Eisessig

Entfärberlösung für Amidoschwarz 25% Isopropanol

10% Eisessig

Coomassielösung 1,25g Coomassie Brilliant Blau (R250)

450ml Methanol/dH20 1/1

50ml Eisessig

Entfärberlösung für Coomassie 450ml Methanol/dH20 1/1

50ml Eisessig

Stripp-Puffer 5x, pH 2,5 37,5g Glycin

73,05g NaCl

ad 500ml dH2O

4.1.5.5 Immunzytochemische Fluoreszenzfärbung

Blockierungslösung 2% BSA in 1xPBS, sterilfiltriert

80°C, 30min hitzeinaktiviert

Verdünnungslösung für Antikörper 1% FCS in 1xPBS, sterilfiltriert

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Material und Methoden

82

4.1.5.6 Adhäsions- und Ausbreitungsassay

Blockierungslösung 2% BSA in 1xPBS, sterilfiltriert

80°C, 30min hitzeinaktiviert

Inhibitorische Peptide 10mM cRGD-Peptid in dH2O/1xPBS (2:3)

10mM cRAD-Peptid in dH2O/1xPBS (2:3)

4.1.5.7 Migration in der Boydenkammer

Gelatinelösung 0,1mg/ml Gelatine in 0,1% Essigsäure

Chemotaxismedium 500ml DMEM

5ml Penicillin/Streptomycin

0,5ml Insulin

0,1% BSA

4.1.5.8 Proliferationsassay

1x Trypsin/EDTA 10x Trypsin/EDTA mit 1xPBS verdünnen

Waschpuffer 1xPBS

Ethanol Fixans pH 2,0 70% Ethanol in 50mM Glycinpuffer

Substratpuffer pH 9,5 100mM Tris/HCL

100mM NaCl

50mM MgCl2

4.1.5.9 Caspase-3-Aktivität-Assay

cis-Platin-Stammlösung 25mg/ml in DMF

D0 (serumfreies DMEM) 500ml DMEM

5ml Penicillin/Streptomycin

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Material und Methoden

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0,5ml Insulin

DTT-Stammlösung 1M DTT

Lyse- und Messpuffer, pH 7,5 100mM HEPES

10% Sucrose

0,1% Chaps

1mM EDTA

Fluoreszenzsubstrat 7,2mM DEVD-AMC in DMSO

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Material und Methoden

84

4.2 Methoden

4.2.1 Zellkultur

Für die Durchführung der Experimente wurden die Zellen in 10cm Petrischalen kultiviert

und expandiert. Je nach Zelltyp wurden die Zellen ein– bis zweimal pro Woche unter

keimfreien Bedingungen in einer sterilen Arbeitsbank passagiert. Dafür wurden die Zellen,

nachdem das Zellkulturmedium entfernt worden war, einmal mit sterilem 1xPBS

gewaschen und mit 3ml Trypsin/EDTA behandelt, um die Zellen von der Kulturschale zu

lösen. Die enzymatische Reaktion wurde nach fünfminütiger Inkubationszeit bei 37°C mit

gleichvolumigem FCS-haltigem Medium gestoppt. Die Zellsuspension wurde in ein

Falcon-Tube überführt, mit 1000rpm bei Raumtemperatur abzentrifugiert und anschließend

im entsprechenden Zellmedium resuspendiert und zur Weiterzucht verdünnt ausgesät. In

der Regel wurden die Zellen 1 Tag vor den Versuchen dementsprechend behandelt und die

dafür benötigte Zellzahl mittels Neubauer-Zellkammer bzw. Cell Counter bestimmt.

4.2.1.1 Einfrieren von Zellen

Zum Einfrieren der Zellen wurden die Zellen wie oben beschrieben in eine Zellsuspension

überführt und abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in einer 1:1 Mischung aus FCS und

DMSO/FCS (20%) resuspendiert und in Kyroröhrchen überführt. Diese wurden in mit

Isopropanol gefüllte Einfrierboxen bei -80°C eingefroren, wobei die Einfrierbox garantiert,

dass die Temperatur kontrolliert 1°C/h heruntergekühlt wird, um Kristallisierung zu

vermeiden. Einfriermedium, Kyroröhrchen und Zentrifuge wurden zur Verwendung

heruntergekühlt. Nach wenigen Tagen können die Röhrchen zur längeren Aufbewahrung

in den flüssigen Stickstoff umgelagert werden.

4.2.1.2 Auftauen der Zellen

Zum Auftauen der Zellen wurden die in Stickstoff gelagerten Kyroröhrchen möglichst

rasch erwärmt; dies erfolgte am besten im 37°C warmen Wasserbad. Die aufgetaute

Zellsuspension wurde in das entsprechende Zellmedium überführt, kurz abzentrifugiert und

mit frischem Medium in eine Zellkulturschale überführt.

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Material und Methoden

85

4.2.1.3 Zellisolation von Ratten-Mesangiumzellen (RMZ)

Die männlichen Sprague-Dawley Ratten wurden von Charles River (Deutschland)

bezogen.

RMZ wurden nach der Siebmethode [93] aus der Niere von Sprague Dawley Ratten

isoliert. Nieren männlicher Sprague-Dawley Ratten von ca. 150g Körpergewicht wurden

unter sterilen Bedingungen entnommen und die Glomeruli mittels Siebtechnik isoliert.

Dazu wurden die Nieren entkapselt, das Nierenbecken und Mark entfernt und das

restliche Gewebe mit Hilfe einer Rasierklinge zerkleinert. Diese Nierenmasse wurde dann

durch Tyler Siebe unterschiedlicher Porengrößen von 106µm, 180µm und 75µm passiert.

Ca. 9000 der in dem 75µm Sieb angereicherten Glomeruli wurden in eine 75cm2

Zellkulturflasche mit D20+-Medium überführt. Zur Kultivierung wurde das D20+-Medium

mit 5µg/ml Transferrin und 5ng/ml Selen (ITS Supplement) versetzt und bei 5% CO2,

100% Luftfeuchtigkeit und 37°C gehalten. Aus den kultivierten Glomeruli wuchsen im

Verlauf einer Woche Zellen aus, die zunächst ein Gemisch aus Epithel-, wenig Endothel-

und RMZ darstellten. Nach der 3. Passage blieben nahezu ausschließlich MZ in der

Kultur erhalten. Für die Weiterkultur wurde dem Medium kein Selen und Transferrin

mehr zugefügt und die FCS Konzentration auf 10% gesenkt (D10+). Für die folgenden

Versuche wurden nur die Zellen aus dem Isolat 19 von Passage 5 bis 18 verwendet.

4.2.1.4 Zellisolation von Maus-Mesangiumzellen (MMZ)

Mäuse mit einer genetischen Deletion der α8-Integrinkette wurden uns von Prof. Uli

Müller (Scripps Institute, La Jolla, CA, USA) zur Verfügung gestellt und in unserem

Tierstall als heterozygote Zucht gehalten.

MMZ wurden wie von Hartner A. et al., 2002 [122] beschrieben, aus α8-Integrin

defizienten (α8-/-) und Wildtyp (WT)-Mäuseglomeruli nach der Siebmethode isoliert.

Nieren männlicher Wildtyp und α8-/--Mäuse von ca. 15g Körpergewicht wurden analog

der Rattennieren behandelt. Hier wurden jedoch Siebe der Porengrößen 63µm, 75µm und

38µm verwendet. Die Kulturbedingungen entsprachen den Bedingungen für die

Rattenzellen. Aus den Glomeruli wuchsen nach wenigen Tagen Zellen aus und nach

einigen Wochen der Kultivierung begannen dann die MMZ zu proliferieren, während

andere Zelltypen abstarben. Die verbliebenen Zellen wurden nach dem Auswachsen und

der Vermehrung mittels Immunzytochemie wie von Bieritz B. et al., 2003 beschrieben

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Material und Methoden

86

und Elektronenmikroskopie charakterisiert. Für die folgenden Versuche wurde das Isolat

1 der WT-MMZ und das Isolat 8 der α8-/--MMZ jeweils von Passage 4 bis 19 verwendet.

4.2.1.5 Zellisolation von Maus-vaskulären glatten Muskelzellen (VSMZ)

VSMZ wurden aus der Mausaorta ähnlich wie aus der Rattenaorta, wie bei Strehlow K. et

al., 2003 beschrieben, frisch aus WT- und α8-/--Mäuseaorten isoliert, kultiviert und nur von

Passage 1 bis 2 verwendet. Alle Schritte erfolgten soweit nicht anders angegeben auf Eis

und mit gekühlten sterilen Lösungen.

Die Aorten wurden präpariert und für weitere Bearbeitung in gekühltes 1xPBS mit 1%

Penicillin/Streptomycin überführt. Unter der Sterilbank wurden die Aorten mittels Pinzetten

von Fett- und Bindegewebe befreit. Anschließend wurden die Aorten in eine Enzymlösung

überführt und für 15min bis 20min bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die angedauten

Aorten wurden in 1xPBS mit Penicillin/Streptomycin gewaschen und die Adventitia mit 2

anatomischen Pinzetten gelöst. Die Aorten wurden mit einer Schere in möglichst kleine

Stücke geschnitten und erneut in die Enzymlösung überführt und unter ständigem Schütteln

bei 37°C verdaut, bis die Aorten kaum noch sichtbare Struktur zeigten (max. 1h). Die

Zellsuspension wurde für 2min bei 5000rpm abzentrifugiert, das Zellpellet in 1ml D20+

aufgenommen und in eine 3cm Zellkulturschale ausgesät. Die Charakterisierung der Zellen

erfolgte über Immunfärbung mit α-Glattmuskel-Aktin (α-SMA) Antikörper.

4.2.2 Elektronenmikroskopie

Für elektronenmikroskopische Analysen wurden Nierengewebe oder kultivierte Zellen in

3% Glutaraldehyd fixiert und in Epon-Araldit eingebettet. Davon wurden mit einem

Diamantmesser Ultradünnschnitte (0,08µm) angefertigt, die in einem Zeiss

Elektronenmikroskop EM107 (Zeiss, Oberkochen) ausgewertet wurden.

4.2.3 Proteinanalyse

4.2.3.1 Proteinisolation

Die zu erntenden Zellen wurden im Medium abgekratzt, in ein Falconröhrchen überführt

und bei 1000rpm abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde zweimal mit kaltem 1xPBS

gewaschen und in 100µl Lysepuffer aufgenommen und in ein Eppendorfcup transferiert.

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Material und Methoden

87

Für 15min bis 30min folgte die Lyse auf Eis, wobei zwischendurch gevortext wurde. Nach

zehnminütigem Zentrifugieren bei 13.0000rpm wurde der proteinhaltige Überstand

aliquotiert und bei -20°C gelagert.

4.2.3.2 Protein-Konzentrationsbestimmung

Die Konzentrationsbestimmung der Proteine erfolgte mit dem BCA-Assay von Pierce in

einer Doppelbestimmung. Diese Nachweismethode beruht auf einer Farbreaktion durch

Ausbildung eines Biuretkomplexes (blau-violett), dessen Absorptionsspektrum bei 550nm

ein Maximum besitzt. Durch das Mitführen einer Standardreihe konnte auf den

Proteingehalt der Proben geschlossen werden, wobei der jeweilige Verdünnungsfaktor

berücksichtigt werden musste. Nach einer Inkubationszeit von 30min bei 37°C erfolgte die

photometrische Messung in 96-Well-Platten.

4.2.3.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE )

Um die Proteine der Größe nach aufzutrennen, wurde die Methode der sogenannte SDS-

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) gewählt. Das Detergenz Sodium-Dodecyl-

Sulfat (SDS) führt zu einer vollständigen Denaturierung der Proteine, so dass die

Wanderungsgeschwindigkeiten der Proteine nur noch von ihrem Molekulargewicht

abhängig sind.

Die polymerisierten Gele mit 1,5mm Dicke wurden in eine Vertikallaufkammer

eingespannt. Vor dem Auftragen auf das Gel wurden die Proben in der gewünschten

Konzentration (30µg-100µg) auf 20-40µl Volumen mit dH2O aufgefüllt und anschließend

mit 5x Probenpuffer versetzt.

Die Proteinlösungen wurden 5min bei 95°C denaturiert und nach Abkühlung in die

entsprechenden Geltaschen pipettiert. Die gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine

erfolgte für ca. 90min bei 25mA pro Gel. Zur Größenzuordnung wurde ein

Molekularstandard mitgeführt.

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Material und Methoden

88

Substanzen Trenngel Sammelgel

Mengenangabe für je 4 Gele 6% 8% 10% alle

RotiphoreseGel30 9 ml 12 ml 15ml 2 ml

3M Upper Tris (pH 8,9) 5,6 ml

1M Lower Tris (pH 6,7) 2 ml

dH2O 30 ml 27 ml 24ml 11,7 ml

TEMED 67,5 µl 24 µl

10% APS 225 µl 200µl

Tab. 4: Zusammensetzung der SDS-PAGE-Gele.

4.2.3.4 Immunoblot-Verfahren

Mit Western Blotting wird der Transfer von Proteinen auf eine Nitrozellulose- oder PVDF-

Membran bezeichnet.

Hierzu wurde das sogenannte Semidry-Verfahren benutzt. Die Membranen und die 2x3

Lagen Whatman-Papier wurden in eine Mischung aus 1 Teil Methanol und 4 Teilen

Blotpuffer (4xTowbin) äquilibriert. Bei Verwendung von PVDF-Membranen wurden diese

zur Hydratisierung zuvor in Methanol eingelegt.

Das Gel wurde im Sandwich-Verfahren zwischen je 3 Lagen Whatman-Papier mit der

äquilibrierten Membran luftblasenfrei bedeckt. Der Aufbau erfolgte so, dass der

Proteintransfer in der SemiDry Transfer Zell-Kammer bei konstanter Stromstärke von

1,0mA/cm2 Gelfläche nur in Richtung der Anode erfolgen konnte. Nach dem Blotten

wurde die Membran für 1h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C in Blockierungs-

Lösung geschwenkt, um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen.

Danach wurde die Membran einmalig mit TBS/T gewaschen und über Nacht bei 4°C mit

dem Primärantikörper in der angegebenen Verdünnung (Tab. 6) unter leichtem Schwenken

inkubiert.

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Material und Methoden

89

Primärantikörper Bezugsquelle Verdünnung Blockierungs- und Verdünnungslösung

Maus Anti-Human α-Glattmuskel-Aktin

DAKO, Hamburg 1:1000 in 1xRotiblock

1xRotiblock

Kaninchen Anti-Maus Vinculin

Santa Cruz, Heidelberg

1:1000 in 1% FCS/1xPBS

5% Magermilchpulver

Kaninchen Anti-Maus β-Tubulin

Abcam, Cambridge, UK

1:5000 in 1% FCS/1xPBS

5% Magermilchpulver

Ziege Anti-Maus CTGF Santa Cruz, Heidelberg

1:500 in 1% FCS/1xPBS

1xRotiblock oder 5% Pferdeserum

Ziege Anti-Maus α8-Integrin

R&D Systems, Wiesbaden

1:1000 in 1xRotiblock

1xRotiblock

Kaninchen Anti-Maus α8-Integrin

Dr. Müller, Scripps Institute, La Jolla, CA, USA

1:500 in 1% FCS/1xPBS 5% Magermilchpulver

Tab. 5: Übersicht der Primärantikörper für Immunoblot.

Am folgenden Tag wurde die Membran dreimal 5min mit TBS/T gewaschen und für

45min bis 60min mit dem Horseradish-Peroxidase-(HRP-)konjugierten Sekundärantikörper

(Tab. 7) in TBS/T bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert.

Sekundärantikörper Bezugsquelle Verdünnungslösung

Huhn Anti-Kaninchen IgG-HRP Santa Cruz, Heidelberg

1:10.000 in TBS-T

Huhn Anti-Maus IgG-HRP Santa Cruz, Heidelberg

1:10.000 in TBS-T

Esel Anti-Ziege IgG-HRP Santa Cruz, Heidelberg

1:50.000 in TBS-T

Tab. 6: Übersicht der Sekundärantikörper für Immunoblot.

Nicht gebundener Antikörper wurde im nächsten Waschzyklus entfernt und die Membran

für 5min in ECL Plus (Amersham) im Dunkeln inkubiert. Bei dieser Reaktion wird ein

lumigenes Substrat durch die Meerrettich-Peroxidase (HRP) des Sekundärantikörpers

oxidiert, wodurch eine Chemolumineszenz entsteht. Die Detektion erfolgte in einer

Röntgenkassette durch Auflegen eines Röntgenfilms. Nach einer bestimmten

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Material und Methoden

90

Inkubationszeit (30sek bis 15min) erfolgte abhängig von der Signalintensität eine

abschließende Entwicklung (1min entwickeln, 1min wässern, 3min fixieren).

Sollte die Membran anschließend noch mit einem weiteren Primärantikörper inkubiert

werden, wurden die bereits gebundenen Antikörper durch Schwenken in Stripp -Puffer bei

50°C für 1h entfernt. Danach wurde die Membran zweimal mit je 100ml TBS-T

gewaschen und erneut blockiert. Die weitere Behandlung mit einem neuen Antikörper

entsprach dem oben genannten Vorgehen.

Um eine gleichmäßige Beladung der Proteine nachzuweisen, wurde das Gel nach dem

Blot-Verfahren über Nacht in Coomassielösung eingelegt. Zur Quantifizierung der

Proteinmenge wurden zusätzlich sogenannte „Housekeeper“-Proteine, wie z.B. β-Tubulin

oder α-Aktin, als Beladungskontrolle auf den Membranen detektiert. Alternativ dazu

wurde eine irreversible Amidoschwarzfärbung der Membran durchgeführt. Hierfür wurde

die PVDF-Membran für wenige Minuten in die Färbelösung eingelegt und anschließend

zwei- bis dreimal mit der Entfärberlösung solange geschwenkt, bis sich die angefärbten

Banden deutlich vom Hintergrund abhoben.

Der Film und die Amidoschwarz gefärbte Membran wurden nach dem Trocknen

eingescannt und die Banden mit AIDA 2.1. densitometrisch ausgewertet. Die Proteinwerte

wurden jeweils auf die Beladungskontrolle bezogen.

4.2.4 Immunzytochemische Färbungen

4.2.4.1 Charakterisierung der Mesangiumzellen

Zellen wurden einmal mit 1xPBS gewaschen, mit TE abgelöst und auf eine Zelldichte von

20.000 Zellen/ml eingestellt. Nach 1h Blockierung wurden die Kulturobjektträger zweimal

mit 1xPBS gewaschen. 500µl Zellsuspension wurde daraufhin in jede Kammer eines 8-

Kammer Objektträgers pipettiert und für 3h bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Danach

wurden die Zellen in Methanol bei -20°C für 10min fixiert und dreimal je 5min in 1xPBS

gewaschen. Zur Blockierung wurde 30µl 100% FKS auf die einzelnen Felder des

Objektträgers pipettiert und 30min bei 37°C in der feuchten Kammer inkubiert. Daraufhin

wurden die Primärantikörper in ausgetesteter Verdünnung (Tab. 8) auf die fixierten Zellen

gegeben und bei 4°C über Nacht im feuchten Milieu inkubiert. Am nächsten Tag wurde

der Objektträger dreimal je 5min in 1xPBS gewaschen. Die Sekundärantikörperlösung

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Material und Methoden

91

wurde in entsprechender Konzentration (Tab. 8) auf die einzelnen Kammern gegeben und

bei 37°C für 2h in der feuchten Kammer inkubiert. Die Kulturobjektträger wurden

wiederholt dreimal je 5min mit 1xPBS sowie zweimal mit dH20 gewaschen und

abschließend mit Mowiol eingedeckt. Die Färbungen wurden mit Hilfe eines

Fluoreszenzmikroskopes ausgewertet.

Tab. 7: Übersicht der Primär– und Sekundärantikörper für die Charakterisierung.

Die Antikörper wurden in 1% FCS/1xPBS verdünnt.

4.2.4.2 Hämatoxylinfärbung

Zur lichtmikroskopischen Beurteilung der Morphologie wurden die Zellen auf

unbeschichtete Chamberslides ausgesät. Nach 24h Adhäsionszeit wurde das Medium

entfernt und die Zellen vorsichtig mit 1xPBS gewaschen. Die Fixierung der Zellen erfolgte

für 10min bei -20°C mit 100%igem Methanol. Es schloss sich ein Waschzyklus aus

Primärantikörper Bezugsquelle Verdünnung

Maus Anti-Human α-Glattmuskel-Aktin

DAKO, Hamburg 1:50

Kaninchen Anti-Maus α8-Integrin

Dr. Müller, Scripps Institute, La Jolla, CA, USA

1:50

Ratte Anti-Maus F4/80 Linaris GmbH, Wertheim-Bettingen 1:200

Kaninchen Anti-Maus WT-1 Santa Cruz, Heidelberg 1:50

Kaninchen Anti-Maus Zytokeratin 18

Biomol GmbH, Hamburg 1:250

Ratte Anti-Maus MECA-32 BD, Heidelberg 1:50

Kaninchen Anti-Maus -Faktor III Serotec, Wiesbaden 1: 50

Sekundärantikörper: Bezugsquelle Verdünnung

cyTM 3-Anti-Maus IgG DIANOVA, Hamburg 1:400

cyTM 2-Anti-Maus IgG DIANOVA, Hamburg 1:200

cyTM 2-Anti-Kaninchen IgG DIANOVA, Hamburg 1:200

cyTM 2-Anti-Ratte IgG DIANOVA, Hamburg 1:500

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Material und Methoden

92

zweimal 5min in 1xPBS und einmal 10min in dH2O an. Für die Färbung der Zellen wurde

die Chamberslides kurz in die Hämatoxylinfärbung getaucht, unter fließendem Wasser

gespült und mit Mowiol eingedeckelt. Bei 4°C über Nacht festigt sich das Eindeck-

Medium Mowiol und erlaubt erst am folgenden Tag die mikroskopische Betrachtung.

4.2.4.3 Fluoreszenzfärbungen

Um Aussagen über die Morphologie der Zellen und die Verteilung zellulärer Proteine zu

ermöglichen, wurden immunzytochemische Färbungen durchgeführt. Dazu wurden die

Zellen auf Chamberslides bzw. auf 8-Kammer Objektträger ausgesät. Je nach

Versuchsansatz variierten die Parameter wie Zellzahl, Beschichtung, der Einsatz von

Inhibitoren und die Behandlung mit siRNA. Alle nachfolgenden Schritte erfolgten bei

Raumtemperatur.

Zuerst wurde das Medium entfernt, dreimal mit 1xPBS gewaschen und dann die Zellen mit

3,5%igem PFA 10min fixiert. Nach dem Waschen erfolgte die Permeabilisierung der

Zellen mit 0,2% Triton-X 100/1xPBS für 10min. Die Zellen wurden wiederholt wie oben

beschrieben gewaschen und anschließend in einer feuchten Kammer mit

Blockierungslösung (30min bei 37°C mit 100% FCS oder 60min bei Raumtemperatur mit

5% Pferdeserum/1xPBS) inkubiert. Nach dem Waschzyklus erfolgte die Inkubation mit

dem Primärantikörper, wahlweise 1h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C in der

feuchten Kammer. Der Sekundärantikörper inkubierte nach dem Waschschritt für 1h bei

Raumtemperatur in der dunklen, feuchten Kammer.

Erfolgte eine Doppelfärbung mit Phalloidin, so wurde die Phalloidinlösung nach der

Antikörperfärbung auf die Zellen aufgetragen und es folgte eine zwanzigminütige

Inkubation in der feuchten Kammer. Abschließend wurde dreimal 5min mit 1xPBS

gewaschen und der 8-Kammer Objektträger mit Mowiol eingedeckelt. Das Mowiol konnte

über Nacht bei 4°C aushärten, so dass die fluoreszenzmikroskopische Betrachtung am

Folgetag durchgeführt werden konnte.

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Material und Methoden

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Primärantikörper Bezugsquelle Verdünnung

Maus Anti-Human α-Glattmuskel-Aktin DAKO, Hamburg 1:50 in 1% FCS/1xPBS

Kaninchen Anti-Maus Vinculin Santa Cruz, Heidelberg

1:500 in 1% FCS/1xPBS

Maus Anti-Human Desmin IgG DAKO, Hamburg 1:50 in 1% FCS/1xPBS

Sekundärantikörper: Bezugsquelle Verdünnung

cyTM 2-Anti-Kaninchen IgG DIANOVA, Hamburg

1:400 in 1% FCS/1xPBS

cyTM 3-Anti-Maus IgG DIANOVA, Hamburg

1:200 in 1% FCS/1xPBS

cyTM 2-Anti-Maus IgG DIANOVA, Hamburg

1:200 in 1% FCS/1xPBS

Interkalierende Farbstoffe Bezugsquelle Verdünnung

Phalloidin Fluor 488 (grün) Molecular Probes, Leiden, NL

2,5µl Stammlösung (300U/1,5ml Methanol) auf 200µl 1xPBS

Rhodamin-Phalloidin R-415 (rot) MoBiTec, Göttingen

2,5µl Stammlösung (300U/1,5ml Methanol) auf 200µl 1xPBS

Tab. 8: Übersicht der Antikörper und Farbstoffe für Fluoreszenzfärbungen.

4.2.5 Zellbiologische Untersuchungen

Sofern erforderlich wurden Kulturschalen bzw. 8-Kammer Objektträger für den Versuch

mit Matrix-Proteinen beschichtet. Dazu wurde zunächst eine Stammlösung der folgenden

Matrixproteine entsprechend der Herstellerangaben bzw. Bezugsquelle hergestellt. Die

Fibrillinfragmente wurden uns von Prof. Dieter P. Reinhardt, McGill University, Montreal,

Kanada [131, 132] freundlicherweise zur Verfügung gestellt.

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Material und Methoden

94

Matrixprotein Stammlösung Endkonzentration

Fibronektin (FN) 1mg/ml 40µg/ml in 1xPBS

Vitronektin (VN) 50µg/ml 10µg/ml in 1xPBS

Kollagen Typ I (Col I) 3,25mg/ml 30µg/ml in 1xPBS

Fibrillin-1 Fragmente: rF16 rF6H

0,8mg/ml 1,47mg/ml

15µg/ml in 1xPBS 15µg/ml in 1xPBS

Tab. 9: Übersicht der verwendeten Matrixproteine.

Angegeben sind die Konzentrationen der Stammlösungen und deren Endkonzentrationen.

4.2.5.1 Adhäsions- und Ausbreitungsassay

Zellen wurden wie bereits beschrieben abtrypsiniert, gezählt und auf die zuvor

beschichteten 8-Kammer Objektträger ausgesät. Nach 10min bis 5h Adhäsionszeit wurden

die Zellen nach einmaligem Waschen mit 1xPBS für 10min bei -20°C in 100% Methanol

fixiert, wiederholt zweimal 5min mit 1xPBS gewaschen und kurz in Hämatoxylin getaucht.

Die Zellen wurden mit Mowiol eingedeckelt und konnten nach dem Trocken über Nacht

mit dem Durchlichtmikroskop ausgewertet werden. Dazu wurden alle adhärenten Zellen

gezählt und zu der Anzahl der ausgesäten Zellen in Prozent gesetzt.

Gleichzeitig wurde die Ausbreitung der adhärenten Zellen bewertet und prozentual

berechnet. Als ausgebreitete Zellen wurden die adhärenten Zellen gezählt, die eindeutig

um ihren Nukleus Zytoplasma gebildet haben.

4.2.5.2 Migration

Wundheilungstest (Migration nach Verletzen einer Monolayerkultur („Scratchen“)

Zur Analyse der ungerichteten Migration von Mesangiumzellen wurde ein

Wundheilungstest (Scratch-Assay) durchgeführt. Hierfür wurden je ca. 250.000 Zellen/4ml

D10+ in eine 6cm Zellkulturschale ausgesät, so dass sie konfluent bewachsen war. Es

wurde dann mit Hilfe einer sterilen 1000μl Pipettenspitze in den Zellrasen eine gerade

Furche gezogen und zwei Messpunkte auf der Unterseite der Platte mit einem Stift

markiert (Tag 0). An diesen Markierungen wurde unter einem Mikroskop zu jedem

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Material und Methoden

95

Messzeitpunkt (0h, 24h und 48h) fotografisch der Zustand der Furche festgehalten und

mittels MetaVue der Durchmesser der Furche bestimmt und ausgewertet.

Migration mit dem Barriere-Verfahren

Wie von Kroening S. und Goppelt-Struebe M., 2010 [130] beschrieben, kann mit Hilfe des

Barriere-Assays Matrix-abhängiges Migrationsverhalten der Zellen untersucht werden.

Dazu wurden sterile Deckgläschen mit Col I oder FN in 1xPBS beschichtet und für 2h bei

37°C inkubiert. Anschließend wurde das beschichtete Deckglas in eine 35mm Schale

überführt und eine mechanische Barriere an den Rändern der Schale fixiert (Barriere wurde

freundlicherweise von Dr. S. Kröning, Department für Nephrologie und Hypertensiologie,

Universitätsklinikum Erlangen, zur Verfügung gestellt). Diese Barriere diente dazu, an

einer definierten Stelle eine Besiedlung des Deckglasses mit Zellen zu verhindern, um

dann nach Entfernen der Barriere die Migration in den freien Spalt beobachten zu können.

Einen Tag vor dem Versuch wurden die Zellen derart ausgesät, dass sie am Versuchstag

100% konfluent vorlagen. Die Barriere wurde vorsichtig entfernt und der Spalt an

vormarkierten Stellen, flächendeckend an beiden Seiten, abfotografiert. Nach 6h, 24h und

48h wurden dieselben Stellen nochmals fotografiert und die Abnahme der freien

Spaltfläche durch migrierende Zellen mittels MetaVue ausgewertet. Nach Beenden des

Migrationsassays wurden die Zellen fixiert und die proliferierenden Zellen mit BrdU (s.

BrdU-Assay) angefärbt, um diese von den migrierenden Zellen unterscheiden zu können.

Migration in der Boydenkammer (Boyden Chamber Assay)

Eine Membran mit 8µm Poren wurde über Nacht bei 4°C in eine Gelatinelösung eingelegt

und am Versuchstag getrocknet. 28µl Chemotaxismedium wurde jeweils mit einem

Matrixprotein, 30µg/ml Col I bzw. 40µg/ml FN versetzt und in die Vertiefungen der

Abb. 36: Fotographische Darstellung der Barriere.

Die Barriere wird in eine 35mm Petrischale mit

vormarkiertem Plattenboden befestigt. (Foto wurde mit

freundlicher Genehmigung von Dr. S. Kröning, Department

für Nephrologie und Hypertensiologie, Universitätsklinikum

Erlangen, zur Verfügung gestellt).

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Material und Methoden

96

unteren Kammer pipettiert. Danach wurde die Membran zügig auf die gefüllten

Vertiefungen gelegt. Zum Äquilibrieren wurde die jetzt vollständig zusammengesetzte

Boydenkammer für 1h in einer feuchten Kammer bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden in

der Zwischenzeit abtrypsinisiert, zentrifugiert, einmal mit Chemotaxismedium gewaschen

und auf 0,5 Millionen Zellen/ml eingestellt. 56µl der Zellsuspension wurden langsam in

die Vertiefung des Deckels pipettiert und in der feuchten Kammer für 5h bei 37°C im

Brutschrank inkubiert. Die Membran wurde zum Fixieren 1min in die Fixierungslösung

und zum Färben jeweils 1min in Quick Diff Lösung 1 und 2 getaucht. Nicht migrierte

Zellen wurden durch Abwischen mit einem weichen Tuch von der Oberseite der Membran

entfernt. Die blau gefärbten migrierten Zellen konnten nun auf der Membranunterseite mit

Hilfe eines Durchlichtmikroskopes gezählt werden. In jedem Ansatz, der in Tripletts

angelegt worden war, wurden drei Gesichtsfelder ausgezählt.

4.2.5.3 Apoptosemessungen

Caspase-3-Assay

Die Aktivierung der Caspase-3 durch Phosphorylierung ist ein frühes Ereignis in der

Signalkaskade nach Apoptoseinduktion und gilt somit als früher Marker in der Apoptose.

Die Messung der Caspase-3 Aktivität erfolgte mit Hilfe des Caspase-3-Assays.

6cm Petrischalen wurden mit 2ml Matrixmolekülen beschichtet (40µg/ml FN bzw. 30µg/m

Col I) und über Nacht bei 4°C oder 2h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde zweimal

mit 1xPBS gewaschen und mit 2% BSA/1xPBS die unspezifischen Bindungsstellen für 1h

bei 37°C blockiert. In allen Versuchen wurden auch unbeschichtete Petrischalen

mitgeführt.

Eine definierte Zellzahl (350.000 WT-MMZ/Schale, 500.000 α8-/--MMZ/Schale) wurde in

4ml D10+ auf die Kulturschalen ausgesät und über Nacht adhärieren gelassen.

Am nächsten Tag wurde wie folgt stimuliert:

1. 4ml D0 (serumfreies DMEM)

2. 50µM cis-Platin im Normalmedium

3. 100µM cis-Platin im Normalmedium

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Material und Methoden

97

Als Negativkontrolle dienten Zellen, die mit DMF (Lösungsmittel von cis-Platin)

behandelt worden waren. Als weitere Kontrolle wurden unbehandelte Zellen nur im

Vollmedium mitgeführt. Nach 16-24h Inkubationszeit, bei 37°C und 5% CO2, wurden die

Zellen geerntet. Die Zellen der unbeschichteten Petrischalen wurden vor dem Ernten

zweimal mit 1xPBS gewaschen und dann mit 1ml 1xPBS mittels Zellschaber geerntet. Bei

beschichteten Petrischalen wurden die Zellen 5min mit 1,5M EDTA bei 37°C abgelöst und

mit dem zuvor gesammelten Überstand 5min bei 1000rpm abzentrifugiert. Das Zellpellet

wurde einmal mit 1xPBS gewaschen und anschließend in ca. 200µl Lysepuffer auf Eis

resuspendiert. Nach dem Sonifizieren (15sek bei 40%) ruhte die Lysesuspension nochmals

10min bis 30min auf Eis, wurde danach abzentrifugiert (10min, 14.000rpm bei 4°C) und

der Überstand in neue Eppendorfcups überführt. Mittels BCA Protein Assay wurde die

Proteinkonzentration gemessen.

Auf einer 96-Well-Platte erfolgte im Triplettansatz die Bestimmung der Caspase-3

Aktivität. Für die Messung wurde pro Probe 30µg Gesamtprotein eingesetzt, mit

Lysepuffer inklusive 10mM DTT auf 140µl Endvolumen aufgefüllt und mit je 12µM

Fluoreszenzsubstrat DEVD-AMC gemischt. Die Spaltung der DEVD-Sequenz wird durch

Caspase-3 während des programmierten Zelltodes katalysiert. Dabei wird der an DEVD

gebundene Fluoreszenzfarbstoff AMC durch die Aktivität der Caspase-3 freigesetzt. Im

Fluoreszenzplattenleser TECAN Spectrafluor, Programm Magellan3, wurde der

Substratumsatz in 5min-Intervallen bei 30°C für insgesamt 2h bestimmt (Exzitation:

360nm und Emission: 465nm). Bei Sättigung mit Substrat ist der Substratumsatz

proportional zur Anzahl der aktiven Enzyme, so dass mit Hilfe der Zeitkinetik die Caspase

3-Aktivität bestimmt werden kann. Das heißt, dass die Intensität des fluoreszierenden

Lichtes korreliert direkt mit der Aktivität der Caspase.

Caspase-3-Assay mit blockierenden Antikörpern

Da α2- und α6-Integrin an der Regulation des Zellüberlebens beteiligt sein können, wurden

α8-/--MMZ vor dem Aussäen mit α2- und α6-Integrin blockierenden Antikörpern für eine

halbe Stunde vorinkubiert. Anschließend wurde der Caspase-3-Assay wie oben

beschrieben durchgeführt.

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Material und Methoden

98

Blockierende Antikörper Bezugsquelle

α2-Integrin Hamster Anti-Ratte CD 49b BD, Heidelberg

α6-Integrin Anti-Ratte CD 49f VLA BD, Heidelberg

Tab. 10: Übersicht der verwendeten blockierenden Antikörper.

Hoechstfärbung

Die Hoechstfärbung ist ein Nachweis für ein spätes Apoptosestadium. Die

Chromatinkondensation erfolgt kurz vor der DNA-Fragmentierung und Bildung der

sogenannten Apoptosebläschen. Der Hoechstfarbstoff interkaliert mit dem Chromatin,

welches sich im kondensierten Zustand besonders stark anfärben lässt. Es ist damit von

unkondensiertem Chromatin nicht-apoptotischer Zellen unterscheidbar. Mittels

Fluoreszenzmikroskop lassen sich die Zellkerne mit kondensiertem Chromatin leicht

detektieren.

6cm-Petrischalen wurden mit 1ml Matrixproteinlösung inkubiert und mit 2% BSA/1xPBS

blockiert und zum Vergleich unbeschichtete Kulturschalen mitgeführt.

Die Zellen wurden abtrypsinisiert, abzentrifugiert und auf eine Zellzahl von 175.000

Zellen/ml eingestellt. In die Kulturschalen wurden jeweils 4ml Zellsuspension pipettiert

und je nach Versuchsansatz 4h-72h bei 37°C mit einem Apoptosestimulans, entweder

50µg/ml cis-Platin oder serumfreies Medium, inkubiert. Als Kontrolle wurden die Zellen

in Normalmedium ohne Apoptosestimulans ausgesät. Die Zellen wurden durch Abschaben

von den unbeschichteten oder durch Abtrypsinisieren von den beschichteten

Zellkulturschalen geerntet und abzentrifugiert. Das Pellet wurde einmal mit 1xPBS

gewaschen und mit 30µl 3,5% Paraformaldehydlösung (PFA) zur Permeabilisierung

versetzt. Jeweils zwei 15µl der fixierten Zellen wurden auf einem Objektträger verteilt und

über Nacht getrocknet. Am nächsten Versuchstag wurde der getrocknete Tropfen mit

einem Fettstift umrandet und je 100µl Hoechstfarbstoff aufgetragen. Die Inkubation fand

5min bei Dunkelheit und Raumtemperatur statt. Anschließend wurde der Objektträger

zweimal 10min mit 1xPBS und 5min mit dH20 gewaschen. Nach dem Trockenen über

Nacht wurde mit Mowiol eingedeckelt. Die Beurteilung der Kondensation erfolgte am

Fluoreszenzmikroskop mit dem UV-Filter in 40-facher Vergrößerung. Es wurden pro

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Material und Methoden

99

Versuchsansatz je 500 Kerne ausgezählt und der prozentuale Anteil an positiv gefärbten

d.h. kondensierten Kernen bestimmt.

4.2.5.4 Proliferationsassay

Zur Durchführung des immunzytochemischen Assays zum Nachweis von inkorporiertem

BrdU wurden die 8-Kammer Objektträger mit Matrixproteinlösung über Nacht beschichtet

und mit 2% BSA für 1h bei Raumtemperatur blockiert. Die Zellen wurden für 72h im

Hungermedium (D0.1+) gehalten. Am Versuchstag wurden die Zellen abtrypsinisiert,

zentrifugiert und abhängig von der Zellart auf eine Zellzahl von 5000 bis 10.000 Zellen/ml

eingestellt. 500µl der Zellsuspension wurden in jede Vertiefung ausgesät. Nach 12h

Adhäsion erfolgte die Stimulation durch Zugabe von 10% FCS. In den letzten 2h der

Inkubationszeit wurde BrdU 1:1000 (0,5µl/500µl Medium/Well) hinzugegeben.

Nach 48h Inkubation bei 37°C wurde das Medium entfernt und wie folgt fixiert:

Fixierlösung: 70% EtOH in 50mM Glycin pH 2,0

a. bei vorgekühlter Fixierlösung: 20min bei –20°C

b. bei ungekühlter Fixierlösung: 30min bis 45min bei -20°C

Nach dreimal 5min Waschen wurde in jedes Well 30µl anti-BrdU-Arbeitslösung pipettiert

und für 30min bei 37°C inkubiert. Der 8-Kammer Objektträger wurde dann dreimal

gewaschen und mit 30µl anti-Maus-Ig-AP-Arbeitslösung pro Well überschichtet und

wieder für 30min bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde der 8-Kammer

Objektträger dreimal mit 1xPBS gewaschen und in jede Vertiefung 30µl frisch hergestellte

Farbsubstratlösung gegeben und 15min bis 20min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach

einmaligem Waschen in 1xPBS wurde der 8-Kammer Objektträger kurz in Hämatoxylin

getaucht und mit klarem Wasser gespült. Danach wurde der 8-Kammer Objektträger mit

Aquatex eingedeckelt. Zur Auswertung wurden jeweils die Zellkerne von 500 Zellen am

Durchlichtmikroskop ausgezählt und daraus die positiven, dunkelblau-violetten Zellen,

prozentual ermittelt.

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Material und Methoden

100

4.2.5 RNA-Methoden

4.2.5.1 Grundlagen des Real-Time-RT-PCR-Verfahrens

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist ein molekularbiologisches Verfahren, um DNA-

Abschnitte zu vervielfältigen. Dazu muss zunächst die DNA bei 95°C denaturiert werden,

wobei ihre Wasserstoffbrückenbindungen aufgebrochen werden. Nach Abkühlung auf

60°C können sich nun für die Zielsequenz spezifische Primer an die zu amplifizierende

DNA anlagern und der Gegenstrang kann durch Polymerisation mit freien Nukleotiden

gebildet werden.

Wenn man mRNA quantifizieren will, muss diese zunächst mittels des Enzyms Reverse

Transkriptase (RT) in die komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben werden. Dies

geschieht mit Hilfe eines unspezifischen Primermix, den sogenannten Random Hexamere.

Die cDNA wird dann mittels des Real-Time-RT-PCR Verfahrens amplifiziert. Dabei kann

in Echtzeit der Verlauf des PCR-Prozesses verfolgt und der mRNA Gehalt (entspricht dem

DNA Gehalt der Probe) quantifiziert werden. Bei der Real-Time-RT-PCR wird zusätzlich

zur Amplifikation die Menge des Amplifikationsproduktes nach jedem Zyklus gemessen,

die proportional zur Emission des eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffes ist. Wird ein neuer

Doppelstrang synthetisiert, so kommt es durch die Einlagerung von interkalierenden

Fluoreszenzfarbstoffen, wie z.B. SYBR-Green, zur messbaren Emissionszunahme. Zur

Quantifizierung wird der Zeitpunkt bestimmt, ab dem die Fluoreszenzzunahme pro Zyklus

linear verläuft (ct-Wert). Als endogene Kontrolle wurde die ribosomale Untereinheit 18S

gewählt.

Die Auswertung erfolgt durch die delta-delta-ct-Methode. Dabei wird zunächst die

Differenz (delta) aus dem ct-Wert der Ziel-mRNA und dem ct-Wert der 18S-mRNA

gebildet. Anschließend wird vom delta-ct-Wert der Kontrollwert abgezogen (delta-delta).

Dieser Wert wird in eine negative Exponentialfunktion (Expression (GenX) proportional

zu 2-ct-Wert) eingesetzt, da bei jedem PCR-Zyklus eine Verdopplung der Zielsequenz

stattfindet.

4.2.5.2 RNA-Extraktion

Die RNA-Isolation erfolgte mit dem RNeasy Mini-Kit nach Angaben des Herstellers. Die

isolierte RNA wurde in 30µl RNase freies Wasser aufgenommen und bei -20°C gelagert.

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Material und Methoden

101

Die Konzentrationsbestimmung wurde bei einer Wellenlänge von 260nm photometrisch

durchgeführt. Der Reinheitsgrad wurde durch die Ratio E260/E280 bestimmt und sollte 1,8

nicht unterschreiten.

4.2.5.3 Reverse Transkription

Für die Reverse Transkription wurde zunächst ein Mastermix angesetzt. Die RNA wurde

mit RNase-freiem Wasser auf 100ng/µl verdünnt.

Reagenzien Endkonzentration Ansatz pro Probe (µl) Pipettieren

10xTaqMan RT Puffer 1x 1 zuerst

MgCl 25mM 5,5mM 2,2

dNTP-Mix je 500µM 2

Random Hexamere 2,5µM 0,5

RNase Inhibitor 0,4U/µl 0,2 dann

Multiscribe RT 50U/µl 1,2U/µl 0,25

RNase-freies H2O 2,85

RNA-probe 10pg-2µg 1

Volumen ohne RNA 9

Totalvolumen 10

Tab. 11: Mastermix für Reverse Transkriptase.

Die Umschreibung der mRNA in cDNA erfolgte durch eine PCR im Thermocycler nach

folgendem Protokoll: Annealing 25°C für 10min

Elongation 48°C für 45min

Enzyminaktivierung 95°C für 5min

Von allen mRNA wurden Reaktionen ohne Multiscribe Reverse Transkriptase (Multiscribe

RT) als negative Kontrolle mitgeführt, um Kontaminationen mit genomischer DNA

ausschließen zu können. Vor der Real-Time-PCR wurde das Reaktionsprodukt 1:1 mit

RNase-freiem Wasser verdünnt.

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Material und Methoden

102

4.2.5.4 Taqman Real-Time-RT-PCR

Für die Taqman Real-Time-RT-PCR wurde zunächst für jede Ziel-mRNA ein Mastermix

(Endvolumen 8µl) aus 2x SYBR-Puffer mit bereits enthaltener Taq-Polymerase (Applied

Biosystems), Forward primer, Reverse Primer und RNase-freiem Wasser hergestellt. Alle

Proben wurden als Triplett gemessen.

In eine 96-Well-Platte wurde pro Well 8µl des Mastermixs vorgelegt und 2µl der cDNA

dazu pipettiert. Die Platte wurde mit einer Folie verschlossen und kurz bei

Raumtemperatur zentrifugiert. Nach der zehnminütigen Initialisierung und Aktivierung des

Enzyms bei 95°C folgte ein Zyklus von 3sek Denaturierung bei 95°C und Annealing

inklusive Elongation für 30sek bei 60°C, der sich 40x wiederholte. Zur Erstellung einer

Schmelzkurve erfolgte anschließend ein Zyklus mit 95°C für 15sek, 60°C für 1min und

nochmals 95°C für 15sek. Verwendet wurde hierfür das Real-Time PCR System

StepOnePlus mit der Software v2.0 von Applied Biosystems.

Reagenzien Stammlösung (µM)

Endkonzentration (nM)

Ansatz pro Probe (µl)

2x SYBR MM Puffer 2x 1x 5

Forward Primer 20 200 0,1

Reverse Primer 20 200 0,1

dH20 2,8

cDNA 2

Tab. 12: Mastermix für Real-Time-RT-PCR.

Maus Forward Primer Reverse Primer

CTGF GCCCTAGCTGCCTACCGACT CATAGTTGGGTCTGGGCCAA

Desmin GTGAAGATGGCCTTGGATGT TTGAGAGCAGAGAAGGTCTGG

Fibronektin TGTGACCAGCAACACGGTG ACAACAGGAGAGTAGGGCGC

α8-Integrin AGAATGATTACCCAGATTTGCTTGT GCTACTTTCCCTTTTCCAAATGC

MMP-2 ATGCGGAAGCCAAGATGTG GTCCAGGTCAGGTGTGTAAC

MMP-9 CAAGGATTGCTCAGAGATTCTCCG ATCTCACCTGGAGGACACAGTCTG

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Material und Methoden

103

α-SMA CCCTGAAGAGCATCCGACAC GCCTTAGGGTTCAGTGGTGC

TIMP-1 GATATGTCCACAAGTCCCAGAACC CCACAGCCAGCACTATAGGTCTTT

TIMP-2 ATAAAGATGTTCAAAGGACCTGACAA GGCCGTGTAGATAAACTCGATGT

Vimentin ACGATCTCACCCTCAGGGCT GGGTCGCTGAGTCAGTGGAT

Ratten Forward Primer Reverse Primer

CTGF TGTGCACTGCCAAAGATGGT GGTACACGGACCCACCGA

Desmin GTGAAGATGGCCTTGGATGT TTGAGAGCAGAGAAGGTCTGG

EGF TGCCACTGGGTCCGAAAC ATGCACACGCCACCATTG

Fibrillin-1 TGCTCTGAAAGGACCCAATGT CGGGACAACAGTATGCGTTATAAC

Fibronektin TTGCAACCCACCGTGGAGTATGTG CTCGGTAGCCAGTGAGCTTAACAC

α8-Integrin TCCAAATCAGAAGCTCCAACAA CGCTCACGAAATTGCTGTCA

α-SMA TCCTGACCCTGAAGTATCCGATA GGTGCCAGATCTTTTCCATGTC

Vimentin GAGTCAAACGAATACCGGAGACA CCAGGGACTCATTAGTGCCTTT

Housekeeper Forward Primer Reverse Primer

18S TTGATTAAGTCCCTGCCCTTTGT CGATCCGAGGGCCTCACTA

Tab. 13: Übersicht der verwendeten Primer für Real-Time-RT-PCR.

4.2.6 siRNA Silencing

Die RNA-Interferenz, auch siRNA Silencing genannt, ist eine neue Methode für „gene

silencing“ und führt in vitro mit Hilfe der Transfektion spezifischer siRNA zur

funktionellen Inaktivierung einzelner Gene.

Bei der RNA-Interferenz macht man sich einen zelleigenen Abwehrmechanismus zu

Nutze, der darauf basiert, dass doppelsträngige RNA (dsRNA) nicht nativ in den Zellen

vorkommt, sondern nur von extern, z.B. durch einen Virenangriff, in die Zelle gelangen

kann. An diese dsRNA bindet Dicer. Dicer besteht aus ATP abhängige Ribonukleasen,

welche die RNA unter ATP-Verbrauch zerschneiden. Die RNA wird demzufolge

inaktiviert und der Virenangriff kann dadurch abgewendet werden. Handelt es sich aber bei

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Material und Methoden

104

der entstandenen „small interfering RNA“ (siRNA) um Sequenzstücke, die auch in der

Zelle als mRNA vorhanden sind, läuft die Kaskade weiter. Die kurzen ds siRNAs werden

von dem „RNA induced silencing complexes“, kurz RISC, gebunden. In diesem Komplex

öffnet sich der Doppelstrang der siRNA unter Einwirkung von Helikasen. An die

einzelsträngige-RNA (ssRNA) kann sich komplementäre mRNA binden. Das wiederum

aktiviert den „RNA induced silencing complex“ und die mRNA wird gespalten. Die

mRNA Stücke sind damit dem Abbauprozess in der Zelle ausgeliefert. Es kann kein

Protein mehr gebildet werden. Da durch eine Transfektion auch spezifische siRNA in die

Zelle geschleust werden kann, kann das Zielgen funktionell inaktiviert werden, d.h. die

Transkription des Gens erfolgt ungestört, aber eine Proteinbildung findet wegen des

beschleunigten Abbaus der mRNA nicht mehr oder nur noch in vermindertem Umfang

statt. Die funktionelle Inaktivierung des Zielgens wird auch transiente Herunterregulation

oder „knockdown“ genannt.

4.2.7.6 Transiente Transfektion von RMZ

Die Versuche mit RMZ wurden mit dem Transfektionsreagenz HiPerFect (Qiagen) nach

dem fast protocol, laut Herstellerangaben, durchgeführt. Das Transfektionsreagenz besteht

aus einer Mischung aus kationischen und neutralen Lipiden und führt so über die Bildung

von Liposomen zu einer Endozytose der siRNA und Freigabe in das Zytoplasma der Zelle.

Dazu ließ man die Zellen fast 100% konfluent wachsen, stellte nach dem Abtrypsinieren

die gewünschte Zellzahl ein (z.B. für die Verwendung der Zellen 72h nach der

Transfektion: 100.000 Zellen/Well in 2,3ml D10+). Die Transfektion mit siRNA

(Endkonzentration: 5nM) wurde in der Zellsuspension durchgeführt und erst danach

wurden die Zellen auf eine 6-Well-Platte ausgesät. 24h nach der Transfektion erfolgte ein

Mediumwechsel und nach 48h eine Nachtransfektion (wie oben beschrieben, allerdings auf

die adhärenten Zellen).

Transfektion-Mastermix pro Probe: Endvolumen 100µl

12µl HiPerFect

6µl siRNA (Stocklösung: 2µM)

82µl Opti-MEM (serumreduziertes DMEM)

Der Mix wurde kurz abzentrifugiert, bei 15min Raumtemperatur inkubiert und

abschließend unter leichtem Schwenken tropfenweise zur Zellsuspension dazugegeben.

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Material und Methoden

105

RNA Isolierung erfolgte mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) und Umschreibung in cDNA

mittels Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems).

Für die folgende Real-Time-RT-PCR wird der Power SYBR Green PCR Master Mix

(Applied Biosystems), Primer von MWG Biotech AG (Endkonzentration: 200nM) und

StepOnePlus Sequence Detection System (Applied System) verwendet.

Design und Herstellung der siRNAs erfolgte mit Hilfe der Software von Qiagen (Hilden)

bzw. Invitrogen (Darmstadt).

siRNA Duplex gegen α8-Integrin Bezugsquelle Sense Strand

Ratte α8-Integrin (itga8) (21mer) Qiagen, Hilden

GACCUCCUCAGGAUGAAAUTT

Ratte α8-Integrin (itga8) oligo1 (Sequenz nach R. Zargham und G. Thibault, 2005 [99])

Invitrogen, Darmstadt

AAGGUCAGAUCGAGAUUG(dT)(dT)

siRNA Kontrollen Bezugsquelle Sense Strand

Ratte „non-silencing control“ siRNA (Negativ-Kontrolle)

Qiagen, Hilden

UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT

Maus/Ratte Ctrl_All Stars_3 „Positive cell death phenotype control“ (Positiv-Kontrolle)

Qiagen, Hilden

Eine Mischung von verschiedenen siRNAs, die Gene silencen und die Zelle damit in die Apoptose führen.

Luciferase GL2 siRNA (Negativ-Kontrolle)

Qiagen, Hilden

AACGTACGCGGAATACTTCGA (Unspezifische Target-Sequenz die nicht in eukaryontischen Zellen vorkommt.)

Tab. 14: Auflistung der Kontroll- und siRNA gegen α8-Integrin

4.2.7 Statistische Auswertung

Durch den Student`s paired t-test wurden zwei normalverteilte Gruppen mit gleicher

Varianz miteinander verglichen. Für normierte Daten wurde „Column statistics“ (one-

sample t-test)“ angewandt. Der Mann-Whitney-U-Test wurde bei nicht normaler

Verteilung zweier Gruppen eingesetzt. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte ±

Standardabweichung. Ein p-Wert < 0,05 wurde als signifikant betrachtet. Die

Berechnungen wurden mit SPSS Software (SPSS Inc., Chicago, USA) und GraphPad

Prism 5 Software (GraphPad, San Diego, CA, USA) durchgeführt.

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Abbildungsverzeichnis

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6 Abbildungsverzeichniss

Abb. 1: Glomerulus und Kapillarschlinge.......................................................................................... 2 

Abb. 2: Querschnitt durch ein gesundes Gefäß und ein arteriosklerotisches Gefäß mit Plaque. ....... 4 

Abb. 3: Schematische Darstellung des Aufbaus der Integrine. .......................................................... 8 

Abb. 4: Die Familie der Integrine. ..................................................................................................... 9 

Abb. 5: Schematische Darstellung von fokalen Kontakten.............................................................. 10 

Abb. 6: Der Integrin-vermittelte Rho/GTPase-Weg. ....................................................................... 12 

Abb. 7: Morphologischer Vergleich zwischen WT- und α8-/--MMZ............................................... 21 

Abb. 8: Messung der α8-Integrin Expression in MMZ.................................................................... 22 

Abb. 9: Messung der α8-Integrin Expression in si RNA transfizierten RMZ.................................. 23 

Abb. 10: Morphologischer Vergleich zwischen WT- und α8-/--VSMZ. .......................................... 24 

Abb. 11: Messung der α8-Integrin Expression in VSMZ. ............................................................... 24 

Abb. 12: Vergleichende Fluoreszenzfärbungen der Aktinfilamente. ............................................... 26 

Abb. 13: Vergleichende Immunzytochemie der Stressfasern (α-SMA)........................................... 28 

Abb. 14: α-SMA Expression in mesenchymalen Zellen. ................................................................. 30 

Abb. 15: Vergleichende Immunzytochemie für Vinculin. ............................................................... 32 

Abb. 16: Messung mesenchymaler und epithelialer Marker............................................................ 33 

Abb. 17: Beispielhafte Desmin/F-Aktin Doppelfärbung von siRNA transfizierten RMZ............... 34 

Abb. 18: Adhäsions- und Ausbreitungsassays. ................................................................................ 36 

Abb. 19: Migration im Wundheilungstest........................................................................................ 37 

Abb. 20: Migration im Barriere-Assay. ........................................................................................... 39 

Abb. 21: Migration in der Boydenkammer. ..................................................................................... 40 

Abb. 22: Apoptose im Caspase-3 Assay. ......................................................................................... 42 

Abb. 23: Hoechstfärbung nach cis-Platin Behandlung. ................................................................... 43 

Abb. 24: Hoechst-Apoptoseassay. ................................................................................................... 44 

Abb. 25: Proliferationsassay. ........................................................................................................... 45 

Abb. 26: Schematische Darstellung des Fibrillin-1 Proteins und seiner Fragmente. ....................... 46 

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Abbildungsverzeichnis

122

Abb. 27: Adhäsions- und Ausbreitungsassay auf Fibrillinfragmenten. ........................................... 47 

Abb. 28: Adhäsionsassay auf Vitronektin mit cRGD-Peptiden. ...................................................... 49 

Abb. 29: Adhäsionsassay auf Fibrillin mit cRGD-Peptiden. ........................................................... 50 

Abb. 30: α2- und α6-Integrin Expression in MZ.............................................................................. 51 

Abb. 31: Caspase-3-Assay mit blockierenden Antiköpern. ............................................................. 52 

Abb. 32: Expression von MMP und TIMP. ..................................................................................... 54 

Abb. 33: CTGF Expression.............................................................................................................. 55 

Abb. 34: Expression von α-SMA und CTGF nach Inhibition von ROCK....................................... 56 

Abb. 35: Normierte Expression von α-SMA und CTGF nach Inhibition von ROCK. .................... 57 

Abb. 36: Fotographische Darstellung der Barriere. ........................................................................... 1 

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Tabellenverzeichnis

123

7 Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Integrine und glomeruläre Erkrankungen. ........................................................................... 14 

Tab. 2: Integrine und vaskuläre Schäden. ........................................................................................ 15 

Tab. 3: Übersicht der verwendeten Oberflächenmarker zur Charakterisierung der Zelltypen......... 19 

Tab. 4: Zusammensetzung der SDS-PAGE-Gele............................................................................. 88 

Tab. 5: Übersicht der Primärantikörper für Immunoblot. ................................................................ 89 

Tab. 6: Übersicht der Sekundärantikörper für Immunoblot. ............................................................ 89 

Tab. 7: Übersicht der Primär– und Sekundärantikörper für die Charakterisierung.......................... 91 

Tab. 8: Übersicht der Antikörper und Farbstoffe für Fluoreszenzfärbungen. .................................. 93 

Tab. 9: Übersicht der verwendeten Matrixproteine.......................................................................... 94 

Tab. 10: Übersicht der verwendeten blockierenden Antikörper. ..................................................... 98 

Tab. 11: Mastermix für Reverse Transkriptase. ............................................................................. 101 

Tab. 12: Mastermix für Real-Time-RT-PCR. ................................................................................ 102 

Tab. 13: Übersicht der verwendeten Primer für Real-Time-RT-PCR............................................ 103 

Tab. 14: Auflistung der Kontroll- und siRNA gegen α8-Integrin.................................................. 105 

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Abkürzungsverzeichnis

124

8 Abkürzungsverzeichnis

8.1 Allgemeine Abkürzungen

α8-/- α8-Integrinkette dauerhaft defizient

α-SMA α-smooth muscle actin (α-Glattmuskel-Aktin)

Abb. Abbildung

Abl amidoblack (Amidoschwarz)

AK Antikörper

Akt Synonym für PKB

APS Ammoniumpersulfat

AS Aminosäure

ATP Adenintriphosphat

BCA bicinchonicin acid (Bicinchoninsäure)

bp Basenpaare

BSA bovine (Rinder) Serum Albumin

Cdc42 homologous to yeast cell division cycle gene 42

cDNA complementary-DNA (komplementäre DNA)

cis-Platin cis-platinum (II) diamine dichloride

CO2 Kohlenstoffdioxid

Col I Kollagen I

CTGF connective tissue growth factor

DEVD-AMC N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-Amino-4-methyl-coumarin

dH2O Aqua bidestelliert

DMEM Dulbecco’s Modified Eagles Medium

DMF Dimethylformamid

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA desoxyribonucleinacid (Desoxyribonukleinsäure)

DNase Desoxynuklease

dNTP’s 2`-Desoxyribonucleosid-5`-triphosphat

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Abkürzungsverzeichnis

125

dsRNA double-stranded RNA (doppelsträngige RNA)

DTT Dithioreitol

ECL enhanced chemoluminescence

ECM Extrazelluläre Matrix

EDTA Etylendiamintetraazetat

EMT Epithelial-mesenchymale Transformation

EtOH Ethanol

FAK focal adhesion kinase

F-Aktin Filamentöses Aktin

FCS fetal calf serum (Fötales Kälberserum)

FN Fibronektin

g Gramm

GTP Guanosine triphosphate

h hour (Stunde)

HCL Salzsäure

HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure

HRP horse-radish peroxidase (Meerrettich-Peroxidase)

Ig-CAM immunoglobulin cell adhesion molecules (Immunglobulin Zelladhäsionsmoleküle)

IgG Immunglobulin G

IgM Immunglobulin M

kDA Kilodalton

l Liter

M Molar

m Meter

mA Milliampere

MAPK mitogen-activated protein kinase

mDia1 mammalian Diaphanous-related formin 1

MET Mesenchymale-epitheliale Transformation

mg Milligramm

MgCl2 Magnesiumchlorid

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Abkürzungsverzeichnis

126

min Minute(n)

mM millimolar (Konzentrationseinheit mMol/l)

mm Millimeter

MMP Matrixmetalloprotease

MMZ Maus-Mesangiumzellen

mRNA messenger ribonucleic acid (Boten-Ribonukleinsäure)

MZ Mesangiumzellen

NaCl Natriumchlorid

NF-κB nuclear factor-kappaB

ng Nanogramm

nm Nanometer

PI-3K phosphatidylinositde-3 kinase

PAA Polyacrylamid

PAGE Polyacrylamid Gelelektrophorese

PBS phosphate-buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung)

PCR polymerase-chain-reaction (Polymerase-Ketten-Reaktion)

PFA Paraformaldehyd

pg Pikogramm

PKB protein kinase B

PL Plastik

PVFD Polyvinylidenfluorid

Rac related to A and C kinases

RAD Arginin-Alanin-Aspartat Tripeptid

Ras rat sarcoma

RGD Arginin-Glycin-Aspartat Tripeptid

Rho Ras homologue

RMZ Ratten-Mesangiumzellen

RNA ribonucleinacid (Ribonukleinsäure)

Rnase Ribonuklease

ROCK Rho-associated protein kinase (Rho-assoziierte Kinase)

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Abkürzungsverzeichnis

127

rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)

RT Reverse Transkriptase

SDS Natriumdodecylsulfat

sek Sekunde

siRNA small interfering RNA (kleine interferierende RNA)

ssRNA single-stranded RNA (einzelsträngige RNA)

Tab. Tabelle

Taq Thermus aquaticus DNA-Polymerase

TBS Tris buffered saline (Tris-gepufferte Salzlösung)

TBS-T TBS-Tween 20 (Polyoxyethylensorbit-Monolaurat)

TEMED N, N, N`, N`-Tretramethyl-ethylendiamin

TGF-β transforming growth factor-beta

TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

U Unit (1U=1µmol/min) Einheit für Enzymaktivität

WT Wildtyp

µ Mikro

vs. versus

8.2 Aminosäuren

Aminosäuren Dreibuchstabencode Einbuchstabencode

Alanin Ala A

Arginin Arg R

Asparagin Asn N

Asparaginsäure Asp D

Cystein Cys C

Glutamin Gln Q

Glutaminsäure Glu E

Glycin Gly G

Histidin His H

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Abkürzungsverzeichnis

128

Isoleucin Ile I

Leucin Leu L

Lysin Lys K

Methionin Met M

Phenylalanin Phe F

Prolin Pro P

Serin Ser S

Threonin Thr T

Tryptophan Trp W

Tyrosin Tyr Y

Valin Val V

8.3 Nukleinsäuren

DNA- und RNA-Basen Einbuchstabencode

Adenin A

Cytosin C

Guanin G

Thymin T

Uracil U

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Anhang

129

9 Anhang

A. Homologie des α8-Integrin Gens von Maus (obere Reihe) und Ratte (untere Reihe)

Query 10 GAGAGGACTGTCACTGTGGACGCTCCTAGCTCACCGACCCGGGACACCGGCCTCTGGGGA 69 ||||||||||||||||||||| | || ||||||| ||||||||||||||||||||||||| Sbjct 18 GAGAGGACTGTCACTGTGGACTCACCGAGCTCACTGACCCGGGACACCGGCCTCTGGGGA 77 Query 70 GCGTCA-GG--CCTTCTCCTCTGGGCTCCACGGCTCCCGATCCCGGGTGAACAGCG-TTC 125 | ||| || ||| ||||||| |||||||||||||||||||| |||||| ||||| || Sbjct 78 ACATCAGGGCTCCTCCTCCTCT-GGCTCCACGGCTCCCGATCCTGGGTGAGCAGCGTTTG 136 Query 126 GGGAAGGAGGGCGATGTCTGCGGGAACCCACTGTGGTCCCCCGGGGAACCGGGCACCTCC 185 ||| | |||| ||||||||||| |||||||| | |||||||||| |||| |||||||||| Sbjct 137 GGGCA-GAGGACGATGTCTGCGAGAACCCACCGGGGTCCCCCGGAGAACTGGGCACCTCC 195 Query 186 GTTCGCGCGTCTCTGTTGCGTCTCGGCCGCGCTGGGGATGCTGTGGTCCCCTGCGTGTCT 245 |||||| ||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| | || ||| Sbjct 196 GTTCGCTTGTCTCTGTTGCGTCTCGGCCGTGCTGGGGATGCTGTGGTCCCCCGTGTCTCT 255 Query 246 GGCGTTCAACTTGGATGTGGACAAGCTCACTGTGTACAGTGGCCCCGAGGGCAGCTACTT 305 ||||||||||||||| || ||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 256 GGCGTTCAACTTGGACGTAGACAAGCTCACGGTGTACAGTGGCCCCGAGGGCAGCTACTT 315 Query 306 CGGCTACTCACTGGACTTCTACATACCTGATGCGCGCACAGCCAGTGTCTTAGTGGGGGC 365 ||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||| Sbjct 316 CGGCTACTCGCTGGACTTCTACATACCTGATGCGCGCACAGCCAGTGTCTTGGTGGGGGC 375 Query 366 ACCCAAAGCCAACACTAGCCAGCCGGATATCGTAGAAGGGGGAGCTGTCTACTACTGTCC 425 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 376 GCCCAAAGCCAACACTAGCCAGCCGGATATCGTAGAAGGGGGAGCTGTCTACTACTGTCC 435 Query 426 CTGGCCCT-CAGAGAGGTCTGCACAGTGCAAGCAGATACCGTTTGACACCACCAACAACA 484 |||| ||| ||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| Sbjct 436 CTGG-CCTGCAGAGAGGTCTGCACAGTGCAAGCAGATACCCTTTGACACCACCAACAACA 494 Query 485 GGAAAATCAGAGTTAATGGAACCAAAGAACCTATAGAATTTAAATCAAACCAGTGGTTTG 544 |||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| ||||||| Sbjct 495 GGAAAATCAGAGTTAATGGAACCAAAGAGCCTATAGAATTTAAATCAAACCAATGGTTTG 554 Query 545 GAGCCACAGTGAGAGCTCACAAAGGAAAAGTTGTGGCTTGTGCCCCTTTGTATCACTGGA 604 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||| Sbjct 555 GAGCCACAGTGAGAGCTCACAAAGGAAAAGTTGTGGCTTGTGCCCCTTTATATCACTGGA 614 Query 605 GAACTCTGAAACCTAATCCAGCGAAGGACCCAGTTGGCACATGCTATGTAGCAATTCAGA 664 |||||||||| ||||||||||| |||||||| |||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 615 GAACTCTGAAGCCTAATCCAGCAAAGGACCCGGTTGGCACATGCTATGTAGCAATTCAGA 674 Query 665 ATTTCAGTGCCTATGCTGAGCACTCACCTTGTCGAAACAGCAATGCTGATCCCGAAGGCC 724 | |||||||| || |||||||||||||| ||||| |||||||| | |||||| ||||||| Sbjct 675 ACTTCAGTGCTTACGCTGAGCACTCACCCTGTCGGAACAGCAACGTTGATCCTGAAGGCC 734 Query 725 AAGGTTACTGCCAGGCAGGGTTTAGCCTAGACTTCTATAAGAATGGAGACCTTATAGTGG 784 ||||||||||||| || || || || |||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 735 AAGGTTACTGCCAAGCCGGCTTCAGTCTAGACTTCTATAAGAATGGAGACCTTATAGTGG 794 Query 785 GAGGACCTGGAAGTTTTTACTGGCAAGGTCAGGTGATCACTGTCAGTATAGCAGACATCA 844 ||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| |||||| |||||||||||| Sbjct 795 GAGGACCTGGAAGCTTTTACTGGCAAGGTCAGGTGATCACGGTCAGTGTAGCAGACATCA 854 Query 845 TTGCAAATTACTCATTCAAGGATATTCTACGAAAATTGGCCGCAGAAAAGCAGACAGACG 904 ||||||||||||||||||| || ||||| |||||| |||| ||||||||||||||||| | Sbjct 855 TTGCAAATTACTCATTCAAAGACATTCTTCGAAAACTGGCAGCAGAAAAGCAGACAGATG 914 Query 905 TGGCTCCAGCTTCCTATGATGACAGCTACCTTGGATATTCGGTCGCTGCTGGAGAATTCA 964 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || |||||||||||||||| Sbjct 915 TGGCTCCAGCTTCCTATGATGACAGCTACCTTGGATATTCAGTTGCTGCTGGAGAATTCA 974 Query 965 CTGGGGACTCTCAGCAAGAATTGGTGGCTGGGATTCCAAGAGGAGCACAGAACTTTGGAT 1024 |||||||||||| |||||||||||| ||||| |||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 975 CTGGGGACTCTCTGCAAGAATTGGTTGCTGGAATTCCAAGAGGAGCACAGAACTTTGGAT 1034

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Anhang

130

Query 1025 ATGTCTCCATCATTAACTCCACAGACATGACCTTCATTCAGAATTTTACTGGTGAGCAGA 1084 ||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1035 ATGTCTCCATCATTAACTCCACAGATATGACCTTCATTCAGAATTTTACTGGTGAGCAGA 1094 Query 1085 TGGCATCTTATTTCGGATATACTGTTGTGGTATCAGATGTTAACAATGATGGCATGGATG 1144 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1095 TGGCATCTTATTTCGGATATACTGTTGTGGTATCAGATGTTAACAATGATGGCATGGATG 1154 Query 1145 ACATATTGGTCGGGGCACCTCTCTTTATGGAGCGAGAATTTGAAAGTAACCCTAGAGAAG 1204 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1155 ACATATTGGTCGGGGCACCTCTCTTTATGGAGCGAGAATTTGAAAGTAACCCTAGAGAAG 1214 Query 1205 TGGGACAGGTCTACTTGTACCTTCAAGCAAGCGCCCTCCTCTTCCAAGACCCACAGGTCC 1264 |||| ||||||||| ||||||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1215 TGGGTCAGGTCTACCTGTACCTACAAGTGAGCGCCCTCCTCTTCCAAGACCCACAGGTCC 1274 Query 1265 TCACCGGCACGGAGACATTTGGGAGATTTGGTAGCTCTGTGGCCCACTTGGGGGACCTGA 1324 | || ||||| ||||| ||||||||||| ||||| ||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1275 TTACGGGCACAGAGACTTTTGGGAGATTCGGTAGTTCTGTGGCCCACTTGGGGGACCTGA 1334 Query 1325 ACCAAGATGGATACAATGACATCGCCATCGGTGTGCCCTTTGCAGGCAAGGATCAACGAG 1384 ||||||||||||||||||| || ||||||||||||||||||||||||||||||||| ||| Sbjct 1335 ACCAAGATGGATACAATGATATTGCCATCGGTGTGCCCTTTGCAGGCAAGGATCAAAGAG 1394 Query 1385 GTAAAGTCCTCATTTACAATGGAAAC-CCAAGAGGTTTACACAGCAAGCCTTCCCAAGTT 1443 ||||||||||||||||||| |||||| ||| |||| || ||||||||||||||||||||| Sbjct 1395 GTAAAGTCCTCATTTACAACGGAAACGCCA-GAGGCTTGCACAGCAAGCCTTCCCAAGTT 1453 Query 1444 CTGCAAGGAATATGGGGGTCACAGACCATCCCTTCTGGATTTGGCTTTTCTCTAAGAGGA 1503 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| Sbjct 1454 CTGCAAGGAATATGGGGGTCACAGACCATCCCTTCTGGATTCGGCTTTTCTCTAAGAGGA 1513 Query 1504 GATGCAGACATAGACAAGAATGATTACCCAGATTTGCTTGTAGGGGCATTTGGAAAAGGG 1563 || |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| |||||||||||| ||||| Sbjct 1514 GACGCAGACATAGACAAGAATGATTACCCAGATTTACTTGTCGGGGCATTTGGAGAAGGG 1573 Query 1564 AAAGTAGCTGTTTACAGAGCAAGGCCAGTTGTAACCGTGGATGCCCAGCTTCTGCTGCAC 1623 ||||| || || ||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| Sbjct 1574 AAAGTGGCCGTGTACAGAGCAAGGCCAGTTGTAACAGTGGATGCCCAGCTTCTGCTGCAC 1633 Query 1624 CCGATGATTATCAACCTTGAAAATAAAACTTGCCAGATTCCAGAATTCCCTACTCCTGTG 1683 || ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| Sbjct 1634 CCAATGATTATCAACCTTGAAAATAAAACTTGCCAGATTCCAGAATTCCCGACTCCTGTG 1693 Query 1684 GCCTGCTTTTCTGTAAGAGTCTGTGCATCTATAGCAGGCCAGAGCATTTCAAATACAATA 1743 |||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || Sbjct 1694 GCCTGCTTTTCTTTAAGAGTCTGTGCATCTATAGCAGGCCAGAGCATTTCAAATACAGTA 1753 Query 1744 GCCCTGCTGGCCGAGGTGCAGTTAGATTTCCTGAAGCAAAAAGGAGCCATCAAACGGACG 1803 |||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1754 GCCCTGATGGCCGAGGTGCAGTTAGATTTCCTGAAGCAAAAAGGAGCCATCAAACGGACC 1813 Query 1804 CTCTTTCTCCACAACCACCAGTCCCATTTCACCTTCCCCTTTGTGATGAAGCAGCAGAAA 1863 ||||| |||||||||||||||||||| ||| ||||||||| ||||||| |||||| ||| Sbjct 1814 CTCTTCCTCCACAACCACCAGTCCCACCTCATCTTCCCCTTCGTGATGAGGCAGCAAAAA 1873 Query 1864 TCCCTCCACTGCCAGGATTTTATGGTTTACCTTCGGGATGAAACTGAATTCCGAGATAAA 1923 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| Sbjct 1874 TCCCTCCACTGCCAGGATTTTATGGTTTACCTTCGAGATGAAACTGAATTCCGAGATAAA 1933 Query 1924 TTGTCTCCAATCAACATCAGCCTGAACTACAGTTTGGATGATTCTACCTTTAAAGACAGC 1983 |||||||||||||| | |||||||||||||||||||||||||| |||||| |||| || Sbjct 1934 CTGTCTCCAATCAACGTTAGCCTGAACTACAGTTTGGATGATTCCACCTTTGAAGATGGC 1993 Query 1984 CTGGAAGTGAAGCCAATTTTGAACCACTACAGGGACAATGTAGTTACTGAGCAGGCTCAC 2043 |||||||||||||| |||||||||||||||||||| ||||| |||||||||||||||||| Sbjct 1994 CTGGAAGTGAAGCCGATTTTGAACCACTACAGGGAGAATGTCGTTACTGAGCAGGCTCAC 2053 Query 2044 ATCCTGGTGGACTGTGGAGAAGACAATCTATGCGTTCCTGACTTGAAGCTGTCAGCTAGA 2103 |||||||||||||||||||||||||| || || ||||||||||||| ||||||||||||| Sbjct 2054 ATCCTGGTGGACTGTGGAGAAGACAACCTCTGTGTTCCTGACTTGAGGCTGTCAGCTAGA 2113 Query 2104 CCAGATAAGCATCAGATAATTATTGGCGATGAAAATCACCTAATGCTCATAATAAATGCA 2163 ||||||||||| ||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| |||||| Sbjct 2114 CCAGATAAGCAGGAGATAATTATTGGGGATGAAAATCACCTAATGCTCATAATCAATGCA 2173

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Anhang

131

Query 2164 AGAAATGAGGGAGAAGGGGCCTACGAAGCCGAACTCTTTGTTATCATCCCCGAAGAAGCA 2223 || ||||| |||||||| || |||||||| |||||||| || || || |||||||||||| Sbjct 2174 AGGAATGAAGGAGAAGGAGCTTACGAAGCTGAACTCTTCGTCATGATTCCCGAAGAAGCA 2233 Query 2224 GATTATGTTGGGATTGAGCGCAACAACAAGGGACTGAGGCCCCTGAGTTGTGAGTACAAG 2283 ||||| |||||||| ||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| Sbjct 2234 GATTACGTTGGGATCGAGCGCAACAACAAGGGACTGAGGCTCCTGAGTTGTGAGTACAAG 2293 Query 2284 ATGGAAAACGTGACCAGGATGGTGGTGTGTGACCTTGGGAACCCGATGGTGACTGGAACA 2343 ||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2294 ATGGAAAACGTAACCAGGATGGTGGTGTGTGACCTTGGGAACCCGATGGTGACTGGAACG 2353 Query 2344 AATTTTTCTCTGGGCCTCCGATTTGCTGTTCCTCGCCTTGAGAAAACAAATATGAGCATT 2403 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||| ||||| ||| Sbjct 2354 AATTTTTCTCTGGGCCTCCGATTTGCTGTTCCTCGTCTTGAGAAAACAAACATGAGTATT 2413 Query 2404 AACTTCGATCTCCAAATCAGAAGCTCCAATAAGGACAATCCTGACAGCAACTTCG--AGC 2461 ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| |||| ||| Sbjct 2414 AACTTCGATCTCCAAATCAGAAGCTCCAACAAGGACAATCCTGACAGCAATTTCGTGAGC 2473 Query 2462 GTGTACAGATCAACATCACTGCCATTGCTCAGGTCGAAATCAGAGGAGTGTCCCACCCTC 2521 ||| | | |||||| |||||||| | |||||||| ||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2474 GTGCA-A-ATCAACGTCACTGCCGTGGCTCAGGTGGAAATCAGAGGAGTGTCCCACCCTC 2531 Query 2522 CGCAGATTGTTCTGCCCATCCACAACTGGGAACCAGAAAAGAAGCCACACAAAGAGGAGG 2581 | || |||||||||||||||||||||||||| |||| | || |||| ||||||||||||| Sbjct 2532 CCCAAATTGTTCTGCCCATCCACAACTGGGAGCCAGCAGAGGAGCCCCACAAAGAGGAGG 2591 Query 2582 AAGTCGGTCCTTTGGTTGAGCATATTTATGAGCTGCACAATATTGGACCCAGCACCATCA 2641 |||||||||| ||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2592 AAGTCGGTCCCCTGGTTGAACATATTTATGAGCTGCACAATATTGGACCCAGCACCATCA 2651 Query 2642 GTGACAGCATTCTTGACGTGGGCTGGCCGTTCTCTGCACGGGATGAGTTTCTCCTCTATA 2701 ||||||||||||| || ||||||||||| |||||||||||||| ||||| ||||||||| Sbjct 2652 GTGACAGCATTCTCGAAGTGGGCTGGCCATTCTCTGCACGGGAGGAGTTCCTCCTCTATG 2711 Query 2702 TTTTTCATCTTCAAACTCTGGGACCTCTACAATGTCAAACAAATCCTGAGATCAACCCAC 2761 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | Sbjct 2712 TCTTTCATCTTCAAACTCTGGGACCTCTACAATGTCAAACAAATCCTGAGATCAACCCGC 2771 Query 2762 AGGATATAAAGCCTGCTGCCTCCCCAGAGGATACCCCTGAGCTCAGTGCCTTCTTAAGAA 2821 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| Sbjct 2772 AGGATATAAAGCCTGCTGCCTCCCCAGAGGATACCCCTGAGCTCAGCGCCTTCTTAAGAA 2831 Query 2822 ATGCTACAATTCCCCATCTTGTCAGAAAGAGGGATGTGCCAGTGGTCCAGCTCCACAGAC 2881 ||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| |||||||| Sbjct 2832 ATGCTACAATTCCCCATCTTGTCAGGAAGAGGGATGTGCCAGTGGTCCAGCCCCACAGAC 2891 Query 2882 AGAGCCCTGCAAGAATACTGAACTGTACCAACATTGACTGCTTGCAAATCTCTTGTGCAG 2941 ||||||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||| Sbjct 2892 AGAGCCCGGCAAAAATACTGAACTGTACCAACATTGACTGCTTGCAAATCTCGTGTGCAG 2951 Query 2942 TGGGTCGCCTGGGAGGAGGCGAAAGTGCAGTCCTAAAGGTCAGATCGAGATTGTGGGCCC 3001 ||||||||||||||||||| ||||||||||| || ||||||||||||||||||||||| | Sbjct 2952 TGGGTCGCCTGGGAGGAGGAGAAAGTGCAGTTCTGAAGGTCAGATCGAGATTGTGGGCGC 3011 Query 3002 ACACGTTCCTCAAGAGAAAGAATGATCATTATGCTCTTGCATCCCTGGTGTCCTTTGAAG 3061 |||| |||||| |||||||||| || | |||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3012 ACACATTCCTCCAGAGAAAGAACGACCCTTATGCTCTTGCATCCCTGGTGTCCTTTGAAG 3071 Query 3062 TCAAGAAGATGCCGTATAAAGAACAGCCAGCAAAGCTGCCAGCGGGGAGCACAGCGGTTA 3121 |||||||||| || |||||||| ||||||||||| |||||||| |||||||||||| ||| Sbjct 3072 TCAAGAAGATACCTTATAAAGAGCAGCCAGCAAAACTGCCAGCCGGGAGCACAGCGATTA 3131 Query 3122 AGACGTCGGTTATTTGGGCCACTCCGAATGTCTCCTTCTCAATTCCATTGTGGGTCATAA 3181 |||| |||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| |||||||||||| Sbjct 3132 AGACATCGGTTATTTGGGCCACTCCAAATGTCTCCTTCTCAATTCCACTGTGGGTCATAA 3191 Query 3182 TACTAGCGATCCTTCTTGGTTTGCTGGTTCTGGCTATCTTAACTTTAGCTTTATGGAAGT 3241 ||||||||||||||||||| |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3192 TACTAGCGATCCTTCTTGGCTTGCTGGTTCTGGCCATCTTAACTTTAGCTTTATGGAAGT 3251 Query 3242 GTGGATTCTTTGATAGAGCAAGACCTCCTCAGGATGAAATGACAGACAGGGAACAACTGA 3301 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3252 GTGGATTCTTTGATAGAGCAAGACCTCCTCAGGATGAAATGACAGACAGGGAACAACTGA 3311

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Anhang

132

Query 3302 CCAGTGACAAGACCCCAGAGGCGTGACTTGGAAACATGAAGACCTAAAATTCAAGCACTG 3361 |||||||||||||||| ||||| |||||||||| |||||| ||||||||||||||||||| Sbjct 3312 CCAGTGACAAGACCCCGGAGGCTTGACTTGGAACCATGAACACCTAAAATTCAAGCACTG 3371 Query 3362 GTCCTATTCAAAGAAAGAAAGGGAGGAAGGACACAAGGGCTCAATGATCATAGCCTTCCA 3421 ||||| ||||||||||||||| | ||| ||||||||| | |||||||||||||||||| Sbjct 3372 GTCCTGTTCAAAGAAAGAAAG--A--AAGAACACAAGGGTTGAATGATCATAGCCTTCCA 3427 Query 3422 TACCTGCCAATGACCCAGGGAATG-AAGAGTCCCTAATGATCACCTCATCTAAGTCATGC 3480 ||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| | | | ||| | || Sbjct 3428 CACCTGCCAATGACCCAGGGAATGGAAGAGTCCCTAAT---C---TG-TGTAA--C--GC 3476 Query 3481 ATTGGT-GTGGAGTGCAGAGAACCCCAC-GTGAAAAGAAATGCAGCCACTAACACTACAG 3538 ||||| | ||| | ||||||||||||| | ||||||||| ||||||| |||||| || Sbjct 3477 ATTGGCAG-GGACTACAGAGAACCCCACCG-GAAAAGAAACACAGCCACCAACACTGTAG 3534 Query 3539 AAACAATCCACAGCCATGAAGATTTCCTTTGTTCTTACCGTTTCACATCTGGCTGACATT 3598 |||||||||||||||||||||||||||||| ||| ||| ||||||||||||| | ||| Sbjct 3535 GAACAATCCACAGCCATGAAGATTTCCTTTGCTCTCACCCTTTCACATCTGGCCAATATT 3594 Query 3599 CTGGAACAGCTGTAGGAGCTTAGGCAGCTGTCTAGGTCAGCCCAATATGACTTACAAAAA 3658 ||||||||||||||||| || | || ||||| || |||||||||| ||||| ||||||| Sbjct 3595 CTGGAACAGCTGTAGGAACTCAAACAACTGTCCAGATCAGCCCAATGTGACTCACAAAAA 3654 Query 3659 CA-A-TTCCTACAGAGATGAGATGAACTGAGATTGAACACTACTGTAATCCGATGGAATC 3716 || | |||||||||||| |||||| || |||| |||||||||||||||||||||| || Sbjct 3655 CACAGTTCCTACAGAGACGAGATGGACCAAGATCGAACACTACTGTAATCCGATGGCGTC 3714 Query 3717 TCAGACACCTCCCTATGGAATAGAACCCTTTCTAAGGATGCGAAGGCTCAGGGAGAAAAG 3776 || |||||| |||||||||| ||||||||||||||||||| || |||||||||||||||| Sbjct 3715 TCGGACACCCCCCTATGGAAGAGAACCCTTTCTAAGGATGTGATGGCTCAGGGAGAAAAG 3774 Query 3777 T-GATATGATGTTGGGACTATGAAAGTGCTTATGGAACTACAGAGATGATTTCA-TCATG 3834 |||| | ||||||||| ||||||||||| |||||||| ||||||||||| | | | Sbjct 3775 CAGATACAACGTTGGGACTGTGAAAGTGCTTGCAGAACTACAAAGATGATTTCACTAA-G 3833 Query 3835 GGAAG-ACCAAAAATATATTTATTTATGTTTCCTTTCTCTAGGTAGAGAATTGGGCCATT 3893 | ||| ||||||||| |||||||||||||||| |||||||||||||| ||||||||||| Sbjct 3834 G-AAGGACCAAAAATGTATTTATTTATGTTTCGTTTCTCTAGGTAGAAAATTGGGCCATC 3892 Query 3894 TAGAGGATGTGGAAATTAAGATTTGGTTAGCTAGATTTCATCA-CTACTCAGTTTACTTC 3952 |||||||| |||| | | |||||||||||||||||||||||| | ||||| ||||| | Sbjct 3893 TAGAGGATTTGGAGAGGACGATTTGGTTAGCTAGATTTCATCAGC-ACTCAACTTACTCC 3951 Query 3953 CTCTTAAGATAACTACTCTGTGCAGATAGCATATTTAATTGGGCTTCTTCAGGTGTTAGA 4012 |||||||||||||| |||||||||||||| | ||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3952 CTCTTAAGATAACTGTTCTGTGCAGATAGCGTGTTTAATTGGGCTTCTTCAGGTGTTAGA 4011 Query 4013 TGGTGTTACACATGGTTTGGCATTAGGGCTCTGTTGTGCTTAATTTTCTGCTGCCTCGAG 4072 || ||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| ||||||||| ||| Sbjct 4012 TGATGTTACACATGGTTTGGCATTAGGGCTCTTTTGTGCTTAATTTCCTGCTGCCTGGAG 4071 Query 4073 TGACTTTTCTTCATGTTCTCTGGAAACTCATGTCTGCATAATTCAACTTTACAAAATCTT 4132 |||| || |||||||||||| || |||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 4072 TGACATTCCTTCATGTTCTCCGGGAACTCATGTCTGCATAATTCAACTTTACAAAATCTT 4131 Query 4133 ATATTTATAGTTTC-TTTTATATGTGTAAAAAA-CTATTTCCAGTGACTTCTGTAAAGCA 4190 |||||||||||| | |||||||||||| ||||| ||||||||| |||||||| ||||||| Sbjct 4132 ATATTTATAGTT-CATTTTATATGTGTGAAAAATCTATTTCCACTGACTTCTTTAAAGCA 4190 Query 4191 TTCATTTCAAGGTACTCACTATGCTGATGATGTTGAAAAGTACTTGCACAATTTTGTAGA 4250 ||||||||||||||||||||| |||||| ||||||||| |||| ||||||||| ||||| Sbjct 4191 TTCATTTCAAGGTACTCACTACCCTGATGCTGTTGAAAACTACTAGCACAATTT-GTAGA 4249 Query 4251 GTCCATATAAAAAG-CAATTTAACTATATGGGTGAATATTATCTTAATAGCTATAGTAAG 4309 ||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||| |||||||| |||| Sbjct 4250 GTCCATATAAAAAAACAATTTAACTATATGGGTGAATATTATCTTGATAGCTATTGTAAA 4309 Query 4310 CACCAATATTTACCTTGAAATTTACACACTCATTTTCATTGTAATACCTCACATTTATAT 4369 |||||| ||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| || | Sbjct 4310 CACCAACATTTACCTTGAAATTTACACACTTGTTTTCATTGTAATACCTCACATTCATGT 4369 Query 4370 AAAAGAGAAAACTGTGTTGAACATAAATAAGAT-GAAGATATATAAAGTTATACAAGTGT 4428 ||||||||||| |||||||| |||||||||||| ||| ||||||||||| |||||||| | Sbjct 4370 AAAAGAGAAAAGTGTGTTGAGCATAAATAAGATAGAA-ATATATAAAGTCATACAAGTAT 4428

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Anhang

133

Query 4429 GAGCCAAACAGAAACTCACTCTTAAGGACATAGCAGTGCTTATTACAGCTTTATT-GTCC 4487 |||||| |||| || ||||||||||||| || || || |||||||||||||||| | || Sbjct 4429 GAGCCAGGCAGACACACACTCTTAAGGACCTAACAATGTTTATTACAGCTTTATTAG-CC 4487 Query 4488 ACTCTTTATGGTTAA-CTTTTCCTAGCAAGTAATCTTGGAGAATA-T-TTT-ATATTTAA 4543 ||||||||||||||| || | |||||||||||||||||||||||| | ||| |||||||| Sbjct 4488 ACTCTTTATGGTTAATCTGT-CCTAGCAAGTAATCTTGGAGAATAATCTTTTATATTTAA 4546 Query 4544 GCTATTTTACCATCATCTTTACCTAAACATTGCTTAGAGCTCTTGTAAATAATCCATAAT 4603 |||||||||||||||||||||| ||||| ||||||| ||| |||||||||||| |||| | Sbjct 4547 GCTATTTTACCATCATCTTTACTTAAACGTTGCTTAAAGCGCTTGTAAATAATTCATAGT 4606 Query 4604 AATTTGTAATGTTGTCATTTTGAAGTAATATTGACCAGCCAAATTAATAAGATTGTCTGC 4663 |||| |||||||| | ||||||||||| |||||| |||||||||| |||||||| |||| Sbjct 4607 AATTCGTAATGTTATGATTTTGAAGTACTATTGAACAGCCAAATTCATAAGATTACCTGC 4666 Query 4664 ACAATTTTATATCCTTTTTATAATAATGAAAAATTGCTATGGAGAAATGCTGAACAAAAT 4723 ||| |||||||||||||||||||||||||||||| |||| |||||||||||||||||||| Sbjct 4667 ACACTTTTATATCCTTTTTATAATAATGAAAAAT-GCTACGGAGAAATGCTGAACAAAAT 4725 Query 4724 GTTATGTGCAATATTTTATAGACCTATGTATCTGAGGCATGTTTACACTGGCATTAGTTT 4783 |||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 4726 GTTATGTGCAATATTTTATAGAACTATGTATCTGAGGCATGTTTACACTGGCATTAGTTT 4785 Query 4784 Ctttttttt-AATTAATATCCTGA-TCACTAAGTCTGATATAACAAGCTGACCAAAATCC 4841 ||||||||| |||||||||||||| | ||||||||||||||||||||||||||||| | Sbjct 4786 CTTTTTTTTTAATTAATATCCTGAAT-ACTAAGTCTGATATAACAAGCTGACCAAA--C- 4841 Query 4842 TAACGTTTACAAAACAG-----AAAA-CTCTGTCTCAGTTTCAACAATGACACT-TTATT 4894 ||||||||| ||| |||| || ||||||||||||| |||||||||| || || Sbjct 4842 ----GTTTACAAAGCAGTTGGGAAAATCTGTGTCTCAGTTTCACCAATGACACTCTT-TT 4896 Query 4895 TGAAAGATGACCCAAACTCACAGACAGTAAATTTTATGTGGTGCCTTAACCTGGAAAGGA 4954 ||||||| || |||||||||||||||||||| | ||||||||||||||||||||||||| Sbjct 4897 TGAAAGACGATCCAAACTCACAGACAGTAAACATGATGTGGTGCCTTAACCTGGAAAGGA 4956 Query 4955 GCCATTTGGCTTCAGTTGCTACAGTTCCTTGGAAAGCAAATGAAATGCACAGAGTCAAAC 5014 ||||||||||||||||||| | | ||||||||||||||||||| ||||| || Sbjct 4957 GCCATTTGGCTTCAGTTGC--C--T-----GGAAAGCAAATGAAATGCA--GAGTCGAAG 5005 Query 5015 AGCATTGCTGTTCATCTTGCCCTGCTTATTAGTTAAATCTGTCCTGGTAGCTGGCTT-AT 5073 | || ||||||||| |||||||||||| | |||||| |||||||| |||||| ||| || Sbjct 5006 ATCACTGCTGTTCACCTTGCCCTGCTTGTCAGTTAAC-CTGTCCTGATAGCTG-CTTTAT 5063 Query 5074 GTCTATAAGG 5083 |||||| ||| Sbjct 5064 GTCTATCAGG 5073

B. Homologie des α8-Integrin Proteins von Maus (obere Reihe) und Ratte (untere Reihe)

Aminosäuren (AS) sind in Einbuchstabencode dargestellt.

Query 1 MSAGTHCGPPGNRAPPFARLCCVSAALGMLWSPACLAFNLDVDKLTVYSGPEGSYFGYSL 60 MSA TH GPP N APPFA LCCVSA LGMLWSP LAFNLDVDKLTVYSGPEGSYFGYSL Sbjct 1 MSARTHRGPPENWAPPFACLCCVSAVLGMLWSPVSLAFNLDVDKLTVYSGPEGSYFGYSL 60 Query 61 DFYIPDARTASVLVGAPKANTSQPDIVEGGAVYYCPWPSERSAQCKQIPFDTTNNRKIRV 120 DFYIPDARTASVLVGAPKANTSQPDIVEGGAVYYCPWP+ERSAQCKQIPFDTTNNRKIRV Sbjct 61 DFYIPDARTASVLVGAPKANTSQPDIVEGGAVYYCPWPAERSAQCKQIPFDTTNNRKIRV 120 Query 121 NGTKEPIEFKSNQWFGATVRAHKGKVVACAPLYHWRTLKPNPAKDPVGTCYVAIQNFSAY 180 NGTKEPIEFKSNQWFGATVRAHKGKVVACAPLYHWRTLKPNPAKDPVGTCYVAIQNFSAY Sbjct 121 NGTKEPIEFKSNQWFGATVRAHKGKVVACAPLYHWRTLKPNPAKDPVGTCYVAIQNFSAY 180 Query 181 AEHSPCRNSNADPEGQGYCQAGFSLDFYKNGDLIVGGPGSFYWQGQVITVSIADIIANYS 240 AEHSPCRNSN DPEGQGYCQAGFSLDFYKNGDLIVGGPGSFYWQGQVITVS+ADIIANYS Sbjct 181 AEHSPCRNSNVDPEGQGYCQAGFSLDFYKNGDLIVGGPGSFYWQGQVITVSVADIIANYS 240

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Anhang

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Query 241 FKDILRKLAAEKQTDVAPASYDDSYLGYSVAAGEFTGDSQQELVAGIPRGAQNFGYVSII 300 FKDILRKLAAEKQTDVAPASYDDSYLGYSVAAGEFTGDS QELVAGIPRGAQNFGYVSII Sbjct 241 FKDILRKLAAEKQTDVAPASYDDSYLGYSVAAGEFTGDSLQELVAGIPRGAQNFGYVSII 300 Query 301 NSTDMTFIQNFTGEQMASYFGYTVVVSDVNNDGMDDILVGAPLFMEREFESNPREVGQVY 360 NSTDMTFIQNFTGEQMASYFGYTVVVSDVNNDGMDDILVGAPLFMEREFESNPREVGQVY Sbjct 301 NSTDMTFIQNFTGEQMASYFGYTVVVSDVNNDGMDDILVGAPLFMEREFESNPREVGQVY 360 Query 361 LYLQASALLFQDPQVLTGTETFGRFGSSVAHLGDLNQDGYNDIAIGVPFAGKDQRGKVLI 420 LYLQ SALLFQDPQVLTGTETFGRFGSSVAHLGDLNQDGYNDIAIGVPFAGKDQRGKVLI Sbjct 361 LYLQVSALLFQDPQVLTGTETFGRFGSSVAHLGDLNQDGYNDIAIGVPFAGKDQRGKVLI 420 Query 421 YNGNPRGLHSKPSQVLQGIWGSQTIPSGFGFSLRGDADIDKNDYPDLLVGAFGKGKVAVY 480 YNGN RGLHSKPSQVLQGIWGSQTIPSGFGFSLRGDADIDKNDYPDLLVGAFG+GKVAVY Sbjct 421 YNGNARGLHSKPSQVLQGIWGSQTIPSGFGFSLRGDADIDKNDYPDLLVGAFGEGKVAVY 480 Query 481 RARPVVTVDAQLLLHPMIINLENKTCQIPEFPTPVACFSVRVCASIAGQSISNTIALLAE 540 RARPVVTVDAQLLLHPMIINLENKTCQIPEFPTPVACFS+RVCASIAGQSISNT+AL+AE Sbjct 481 RARPVVTVDAQLLLHPMIINLENKTCQIPEFPTPVACFSLRVCASIAGQSISNTVALMAE 540 Query 541 VQLDFLKQKGAIKRTLFLHNHQSHFTFPFVMKQQKSLHCQDFMVYLRDETEFRDKLSPIN 600 VQLDFLKQKGAIKRTLFLHNHQSH FPFVM+QQKSLHCQDFMVYLRDETEFRDKLSPIN Sbjct 541 VQLDFLKQKGAIKRTLFLHNHQSHLIFPFVMRQQKSLHCQDFMVYLRDETEFRDKLSPIN 600 Query 601 ISLNYSLDDSTFKDSLEVKPILNHYRDNVVTEQAHILVDCGEDNLCVPDLKLSARPDKHQ 660 +SLNYSLDDSTF+D LEVKPILNHYR+NVVTEQAHILVDCGEDNLCVPDL+LSARPDK + Sbjct 601 VSLNYSLDDSTFEDGLEVKPILNHYRENVVTEQAHILVDCGEDNLCVPDLRLSARPDKQE 660 Query 661 IIIGDENHLMLIINARNEGEGAYEAELFVIIPEEADYVGIERNNKGLRPLSCEYKMENVT 720 IIIGDENHLMLIINARNEGEGAYEAELFV+IPEEADYVGIERNNKGLR LSCEYKMENVT Sbjct 661 IIIGDENHLMLIINARNEGEGAYEAELFVMIPEEADYVGIERNNKGLRLLSCEYKMENVT 720 Query 721 RMVVCDLGNPMVTGTNFSLGLRFAVPRLEKTNMSINFDLQIRSSNKDNPDSNFERVQINI 780 RMVVCDLGNPMVTGTNFSLGLRFAVPRLEKTNMSINFDLQIRSSNKDNPDSNF VQIN+ Sbjct 721 RMVVCDLGNPMVTGTNFSLGLRFAVPRLEKTNMSINFDLQIRSSNKDNPDSNFVSVQINV 780 Query 781 TAIAQVEIRGVSHPPQIVLPIHNWEPEKKPHKEEEVGPLVEHIYELHNIGPSTISDSILD 840 TA+AQVEIRGVSHPPQIVLPIHNWEP ++PHKEEEVGPLVEHIYELHNIGPSTISDSIL+ Sbjct 781 TAVAQVEIRGVSHPPQIVLPIHNWEPAEEPHKEEEVGPLVEHIYELHNIGPSTISDSILE 840 Query 841 VGWPFSARDEFLLYIFHLQTLGPLQCQTNPEINPQDIKPAASPEDTPELSAFLRNATIPH 900 VGWPFSAR+EFLLY+FHLQTLGPLQCQTNPEINPQDIKPAASPEDTPELSAFLRNATIPH Sbjct 841 VGWPFSAREEFLLYVFHLQTLGPLQCQTNPEINPQDIKPAASPEDTPELSAFLRNATIPH 900 Query 901 LVRKRDVPVVQLHRQSPARILNCTNIDCLQISCAVGRLGGGESAVLKVRSRLWAHTFLKR 960 LVRKRDVPVVQ HRQSPA+ILNCTNIDCLQISCAVGRLGGGESAVLKVRSRLWAHTFL+R Sbjct 901 LVRKRDVPVVQPHRQSPAKILNCTNIDCLQISCAVGRLGGGESAVLKVRSRLWAHTFLQR 960 Query 961 KNDHYALASLVSFEVKKMPYKEQPAKLPAGSTAVKTSVIWATPNVSFSIPLWVIILAILL 1020 KND YALASLVSFEVKK+PYKEQPAKLPAGSTA+KTSVIWATPNVSFSIPLWVIILAILL Sbjct 961 KNDPYALASLVSFEVKKIPYKEQPAKLPAGSTAIKTSVIWATPNVSFSIPLWVIILAILL 1020 Query 1021 GLLVLAILTLALWKCGFFDRARPPQDEMTDREQLTSDKTPEA 1062 GLLVLAILTLALWKCGFFDRARPPQDEMTDREQLTSDKTPEA Sbjct 1021 GLLVLAILTLALWKCGFFDRARPPQDEMTDREQLTSDKTPEA 1062

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VIII

Publikationen

Hartner, I. Marek, N. Cordasic, C. Haas, H. Schöcklmann, G. Hülsmann-Volkert, I. Plasa, W. Rascher, K.F. Hilgers, K. Amann (2008): Glomerular regeneration is delayed in nephritic α8 integrin-deficient mice: Contribution of α8 integrin to the regulation of mesangial cell apoptosis. American Journal of Nephrology 28, 168-178

A. Hartner, N. Cordasic, C. Menendez-Castro, G. Volkert, J.M. Yabu, M. Kupraszewicz-Hutzler, W. Rascher, K.F. Hilgers (2010): Lack of α8 integrin aggravates podocyte injury in experimental diabetic nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol 299, F1151-7

I. Marek*, G. Volkert*, A. Jahn, F. Fahlbusch, C. Zürn, Z. Özcan, M. Goppelt-Strübe, K.F. Hilgers, W. Rascher, A. Hartner (2010): Lack of alpha8 integrin leads to morphological changes in renal mesangial cells, but not in vascular smooth muscle cells. BMC Cell Biology 11, 102 (* gleichberechtigte Erstautoren)

Kongressbeiträge

Jahn, G. Hülsmann-Volkert, K.F. Hilgers, A. Hartner (2006): The alpha8 integrin chain protects renal cells against apoptosis. Poster at the XLIII Congress of the European Renal Association 2006, Glasgow and Nephrol Dial Transplant Suppl 21, V29

I. Marek, A. Jahn, G. Hülsmann-Volkert, A. Hartner (2006): The alpha8 integrin chain contributes to maintaining the mesenchymal phenotype of renal mesangial cells. Oral presentation at the 37th Meeting of the German Society of Nephrology, Essen and Zeitschrift für Nieren- und Hochdruckkrankheiten 35

A. Jahn, G. Hülsmann-Volkert, A. Hartner (2006): Contribution of the alpha8 integrin chain to renal cell survival. Poster at the 37th Meeting of the German Society of Nephrology, Essen and Zeitschrift für Nieren- und Hochdruckkrankheiten 35

A. Jahn, G. Hülsmann-Volkert, N. Cordasic, W. Rascher, K.F. Hilgers, A. Hartner (2007): Extracellular matrix molecule and integrin expression patterns are altered in vascular smooth muscle cells derived from alpha8 integrin-deficient mice. Poster at the 38th Meeting of the German Society of Nephrology, Munich and Nieren- und Hochdruckkrankheiten 36, 446

A. Hartner, N. Cordasic, A. Jahn, G. Hülsmann-Volkert, W. Rascher, K.F. Hilgers (2007): Fibrillin-1 and alpha8 integrin are coexpressed in the glomerulus and interact to confer fim adhesion of mesangial cells. Poster at the 38th Meeting of the German Society of Nephrology, Munich and Nieren- und Hochdruckkrankheiten 36, 442

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IX

G. Volkert, A. Jahn, I. Marek, M. Goppelt-Strübe, K.F. Hilgers, W. Rascher, A. Hartner (2009): Lack of alpha8 integrin leads to morphological and functional changes in renal mesangial cells, but not in vascular smooth muscle cells. Poster at the 1st Annual Meeting of the German Society of Nephrology, Göttingen and Zeitschrift für Nieren- und Hochdruckkrankheiten 38, 466

A. Hartner, C. Menendez-Castro, N. Cordasic, G. Volkert, J. Dötsch, W. Rascher, K.F. Hilgers (2010): Das Fehlen von alpha8 Integrin verschlimmert den Podozytenschaden bei experimenteller Typ 1 Diabetes-assoziierter Nephropathie. Poster at the 41st Annual Meeting of the German Society of Pediatric Nephrology, Hamburg and Der Nephrologe 5, S60

A. Hartner, C. Menendez-Castro, N. Cordasic, G. Volkert, W. Rascher, K.F. Hilgers (2010): Lack of α8 integrin aggravates podocyte injury in experimental diabetic nephropathy. Poster at the XLVII ERA-EDTA Congress, Munich and Nephrol Dial Transplant Plus 3, iii 107

G. Volkert, I. Marek, A. Jahn, A. Hartner (2010): siRNA-Silencing von α8-Integrin in Mesangiumzellen. Vortrag am Kongress der Jungen Niere, Hamburg

G. Volkert, I. Marek, K.F. Hilgers, W. Rascher, A. Hartner (2010): siRNA silencing of the α8 integrin chain in mesangial cells. Poster at the 3rd International Symposium SFB 423, Bamberg

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X

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei Frau Prof. Dr. Andrea Hartner für die Überlassung

des Themas, für die wissenschaftliche Betreuung der Dissertation sowie die Übernahme

des Zweitgutachtens bedanken. Ihre fachkompetente Unterstützung und wissenschaftliche

Diskussionsbereitschaft weiß ich sehr zu schätzen.

Herrn Prof. Dr. Robert Slany danke ich für die freundliche Übernahme der Betreuung und

die Vertretung meiner Doktorarbeit seitens der Naturwissenschaftlichen Fakultät der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg.

Danken möchte ich Herrn Prof. Dr. Karl Hilgers, der mit konstruktiven Diskussionen und

wertvollen Hilfestellungen einen westlichen Beitrag zum Gelingen dieser Arbeit beitrug.

Für seine außergewöhnliche Hilfsbereitschaft möchte ich PD Dr. Christoph Daniel meinen

Dank aussprechen. Seine Tipps, vor allem bei der Etablierung der siRNA-Technik in

Primärzellen, sowie seine stete Bereitschaft für produktive Diskussionen waren mir von

großem Nutzen.

Ich weiß sehr zu schätzen, dass ich bei den Mitarbeitern des Labors stets auf gute

Arbeitsatmosphäre und spontane Hilfsbereitschaft treffen durfte. Daher gilt allen Kollegen

und Mitarbeitern ein herzliches Dankeschön für ihre Hilfen, Anleitungen, Korrekturen und

sonstigen Unterstützungen. Besonders erwähnen möchte ich an dieser Stelle Nada für ihre

Hilfe bei der Präparation der Mäuseaorten, Rainer für seine Einarbeitung in die Taqman

RT-PCR und die Unterweisung in der Generierung von Primern, Sonja für ihre wertvolle

Hilfe (und das nicht nur) im Labor und Ines für ihren freundschaftlichen Beistand bei der

Durchführung und Anfertigung meiner Doktorarbeit.

Babs, Brigitte, Susi, Tine, Andy, Hans, Tina sowie Andrea danke ich für die schöne Zeit

und die vielen netten (Mittagstisch-) Runden. Ich werde euch immer in meinem Herzen

tragen und nie vergessen, dass ihr mit mir nicht nur die Freude, sondern auch den Frust

geteilt habt. In diesem Zusammenhang möchte ich insbesondere Andy und Hans meinen

Dank aussprechen, die in besonderem Maße zu Beginn meiner Tätigkeit in der Loschge

mir zur Seite standen und mich in den Großteil der Methoden einweihten. Andy ist mir

darüber hinaus eine wichtige Freundin geworden, der ich für ihre freundschaftliche

Unterstützung auf meinem Weg danken möchte.

Darüber hinaus verdanke ich meiner Mitstreiterin Tine mehr als ich ausdrücken kann.

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XI

Danke auch an Edith, Anke und im Speziellen an Cem und Andre für eure Hilfe und für

die Durchsicht des Manuskriptes. Gute Arbeit!

Nicht zuletzt möchte ich mich ganz besonders herzlich bei meiner Familie und bei meinen

Freunden für die fortwährende Unterstützung, Geduld und den stetem Glauben an mich

bedanken.

Ich danke mit Liebe und Respekt meiner Tochter Ann-Christin, die in dieser Zeit oft ohne

mich auskommen musste und dies mit viel Geduld und Verständnis gemeistert hat. Ich bin

stolz auf dich.