EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL...

23
EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR LEUKEMIA INHIBITORY FACTOR UTERUS MENCIT ABSTRAK Angka implantasi pada program Fertilisasi invitro masih rendah. Kadar Estrogen suprafisiologis yang dihasilkan oleh perkembangan multifolikel akibat stimulasi protokol antagonis diduga menyebabkan gangguan reseptivitas endometrium yang ditandai dengan rendahnya ekspresi integrin β3, e-cadherin, dan kadar LIF sehingga menyebabkan gangguan implantasi. Letrozol merupakan preparat inhibitor aromatase, yang dapat mencegah terjadinya kadar estrogen suprafisiologis. Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa penambahan letrozol pada protokol antagonis FIV akan meningkatkan ekspresi integrin β3, e- cadherin, dan kadar LIF endometrium mencit. Rancangan penelitian adalah the experimental post test only design menggunakan mencit Balb/c yang distimulasi menyerupai proses FIV. Ekspresi integrin β3, e-cadherin diperiksa dengan teknik imunohistokimia, dan kadar LIF diperiksa dengan tehnik ELISA.Uji normalitas data dilakukan dengan Shapiro- Wilk Test, uji homogenitas menggunakan Levene’s T. Uji komparasi ekspresi integrin β3, e-cadherin dengan Mann Whitney dan Fisher's exact, dan uji komparasi data LIF dengan uji Mann Whitney. Uji kemaknaan dengan menggunakan p <0,05. Juga dilakukan analisis jalur kontribusi masing masing variabel. Rerata H-score integrin β3 (2,71 + 0,61 vs 1,04 + 0,08 , p<0,05) dan e- cadherin (2,71 + 0,61 vs 1,04 + 0,08 , p<0,05) secara bermakna lebih tinggi pada kelompok perlakuan dibandingkan dengan kontrol. Ekspresi integrin β3 (2= 22,91 , p<0,05) dan e-cadherin (2=36,00, p<0,05) yang kuat dan sangat kuat secara bermakna lebih tinggi pada kelompok perlakuan dibandingkan dengan kelompok kontrol. Kadar LIF secara bermakna lebih tinggi pada kelompok perlakuan dibandingkan dengan kontrol (1.78 + 0,13 vs 1.66 + 0,17 ng/ml , p<0,05). Letrozol memberi kontribusi paling besar pada peningkatan e-cadherin. Integrin β3 bersama dengan e-cadherin dan letrozol memberi kontribusi bagi peningkatan LIF sebesar 31,4%. Penambahan letrozol pada protokol antagonis mengakibatkan ekspresi integrin β3, e-cadherin dan kadar LIF yang lebih tinggi dibandingkan protokol antagonis standar. Letrozol memberi kontribusi paling besar pada peningkatan e- cadherin. Integrin β3 bersama dengan e-cadherin dan letrozol juga memberi kontribusi bagi peningkatan LIF. Kata kunci: Letrozol, Protokol antagonis, Integrin β3, e-cadherin, LIF.

Transcript of EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL...

Page 1: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS

FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E-

CADHERIN, DAN KADAR LEUKEMIA INHIBITORY FACTOR

UTERUS MENCIT

ABSTRAK

Angka implantasi pada program Fertilisasi invitro masih rendah. Kadar

Estrogen suprafisiologis yang dihasilkan oleh perkembangan multifolikel akibat

stimulasi protokol antagonis diduga menyebabkan gangguan reseptivitas

endometrium yang ditandai dengan rendahnya ekspresi integrin β3, e-cadherin,

dan kadar LIF sehingga menyebabkan gangguan implantasi. Letrozol merupakan

preparat inhibitor aromatase, yang dapat mencegah terjadinya kadar estrogen

suprafisiologis. Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa penambahan

letrozol pada protokol antagonis FIV akan meningkatkan ekspresi integrin β3, e-

cadherin, dan kadar LIF endometrium mencit.

Rancangan penelitian adalah the experimental post test only design

menggunakan mencit Balb/c yang distimulasi menyerupai proses FIV. Ekspresi

integrin β3, e-cadherin diperiksa dengan teknik imunohistokimia, dan kadar LIF

diperiksa dengan tehnik ELISA.Uji normalitas data dilakukan dengan Shapiro-

Wilk Test, uji homogenitas menggunakan Levene’s T. Uji komparasi ekspresi

integrin β3, e-cadherin dengan Mann Whitney dan Fisher's exact, dan uji

komparasi data LIF dengan uji Mann Whitney. Uji kemaknaan dengan

menggunakan p <0,05. Juga dilakukan analisis jalur kontribusi masing masing

variabel.

Rerata H-score integrin β3 (2,71 + 0,61 vs 1,04 + 0,08 , p<0,05) dan e-

cadherin (2,71 + 0,61 vs 1,04 + 0,08 , p<0,05) secara bermakna lebih tinggi pada

kelompok perlakuan dibandingkan dengan kontrol. Ekspresi integrin β3 (2=

22,91 , p<0,05) dan e-cadherin (2=36,00, p<0,05) yang kuat dan sangat kuat

secara bermakna lebih tinggi pada kelompok perlakuan dibandingkan dengan

kelompok kontrol. Kadar LIF secara bermakna lebih tinggi pada kelompok

perlakuan dibandingkan dengan kontrol (1.78 + 0,13 vs 1.66 + 0,17 ng/ml ,

p<0,05). Letrozol memberi kontribusi paling besar pada peningkatan e-cadherin.

Integrin β3 bersama dengan e-cadherin dan letrozol memberi kontribusi bagi

peningkatan LIF sebesar 31,4%.

Penambahan letrozol pada protokol antagonis mengakibatkan ekspresi

integrin β3, e-cadherin dan kadar LIF yang lebih tinggi dibandingkan protokol

antagonis standar. Letrozol memberi kontribusi paling besar pada peningkatan e-

cadherin. Integrin β3 bersama dengan e-cadherin dan letrozol juga memberi

kontribusi bagi peningkatan LIF.

Kata kunci: Letrozol, Protokol antagonis, Integrin β3, e-cadherin, LIF.

Page 2: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

THE EFFECT OF ADDING LETROZOLE TO FERTILIZATION IN

VITRO ANTAGONIST PROTOCOL ON INTEGRIN β3, E-CADHERIN

EXPRESSIONS AND LEUKEMIA INHIBITORY FACTOR LEVEL OF

MICE UTERINE.

ABSTRACT

The implantation rate of IVF remains low due to the adverse effect of

ovarian stimulation on endometrial receptivity. Integrin β3, e-cadherin and

Leukemia Inhibitory Factor (LIF) are the best known marker for endometrial

receptivity evaluation. In this study, the impact of adding letrozole to antagonist

protocol on the expression of integrin β3, e-cadherin and LIF level during

implantation window was investigated. Letrozol is an inhibitor of aromatase that

can prevent the supraphysiologic estrogen level. The goal of the study was to

prove that adding letrozole to IVF antagonist protocol can increase the expression

of Integrin β3, E-cadherin, and LIF concentration of mice uterine.

The study design was the experimental post test only group design with

Balb/c mice mimicked ovarian stimulated IVF. Antagonist Protocol was applied

to one group as ovarian stimulation, while the other group received the

combination of letrozole and antagonist protocol. Uterus sample were collected

48 hr after ovarian stimulation. Integrin β3 and e-cadherin expression were

detected by immunohystochemistry technique, and LIF level assay by ELISA.

Datas normality were tested by Shapiro-Wilk Test, homogeneity test by

Levene’s T. Comparation of integrin β3 and e-cadherin expression were tested by

Mann Whitney and Fisher's exact, while comparation of LIF were tested by

Mann Whitney, with p <0,05 considered as significant. Path analisis was done to

know each variable contribution.

The letrozole + GnRH antagonist treated mice showed significantly higher

integrin β3 (2,71 + 0,61 vs 1,04 + 0,08 , p<0,05). and e-cadherin (3,73 + 0,28 vs

1,16 + 0,29 , p<0,05) expression in endometrium, and significantly higher level of

uterine LIF (1.78 + 0,13 vs 1.66 + 0,17 ng/ml , p<0,05) during window of

implantation than GnRH antagonist alone treated mice.

Strong and very strong expression of integrin β3 (2= 22,91 , p<0,05) and e-

cadherin (2=36,00, p<0,05) were significantly higher in letrozole group if

compared to control. Letrozole had the highest contribution on the increase of e-

cadherin. Integrin β3 together with e-cadherin and letrozole had 31,4%

contribution on the increase of LIF.

Letrozole caused higher expression of Integrin β3, E- cadherin, and LIF

concentration in Mice uterine stimulated by antagonist protocol. Letrozole had the

highest contribution on the increase of e-cadherin. Integrin β3 together with e-

cadherin and letrozole had 31,4% contribution on the increase of LIF.

Keyword: Letrozole, antagonist protocol, integrin β3, e-cadherin, LIF.

Page 3: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL i

LEMBAR PERSETUJUAN ii

PENETAPAN PANITIA PENGUJI iii

SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIARISME iv

UCAPAN TERIMAKASIH v

ABSTRAK ix

ABSTRACT x

DAFTAR ISI xi

DAFTAR GAMBAR xvi

DAFTAR TABEL xix

DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG xx

DAFTAR LAMPIRAN xxiii

BAB I PENDAHULUAN 1

1.1 Latar Belakang 1

1.2 Rumusan Masalah 5

1.3 Tujuan Penelitian 6

1.3.1 Tujuan umum 6

1.3.2 Tujuan khusus 6

1.4 Manfaat Penelitian 7

1.4.1 Manfaat keilmuan 7

1.4.2 Manfaat praktis 7

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 8

Page 4: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

2.1 Endometrium pada Siklus Menstruasi Normal. 8

2.1.1 Endometrium fase menstruasi 10

2.1.2 Endometrium fase proliferasi 11

2.1.3 Endometrium fase sekresi 13

2.1.4 Endometrium fase implantasi 15

2.2 Reseptivitas Endometrium 20

2.3 Integrin αvβ3 Sebagai Marker Reseptivitas Endometrium 27

2.4 E-cadherin 36

2.5 Leukemia Inhibitory Factor Sebagai Marker Reseptivitas

Endometrium 50

2.6 Stimulasi Ovarium pada Program Fertilisasi In Vitro 63

2.6.1 Perkembangan folikel dan ovulasi 63

2.6.2 Obat-obatan untuk stimulasi ovarium pada

fertilisasi invitro 69

2.6.2.1 Folicle stimulating hormon 70

2.6.2.2 Luteinizing hormon 72

2.6.2.3 Gonadotropin releasing hormone analog 73

2.6.2.4 Protokol stimulasi ovarium pada program

fertilisasi invitro 75

2.6.2.4.1 Protokol pendek agonis 76

2.6.2.4.2 Protokol panjang agonis 76

2.6.2.4.3 Protokol antagonis 78

2.7 Pengaruh Kadar Suprafisiologis Estrogen pada

Page 5: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

Reseptivitas Endometrium 88

2.7.1 Pengaruh stimulasi ovarium terhadap

hormon steroid 88

2.7.2 Pengaruh stimulasi ovarium terhadap

endometrium 89

2.8 Inhibitor Aromatase 96

BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS

PENELITIAN 107

3.1 Kerangka Berpikir 107

3.2 Konsep Penelitian 108

3.3 Hipotesis Penelitian 109

BAB IV METODE PENELITIAN 110

4.1 Rancangan Penelitian 110

4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian 111

4.3 Ruang Lingkup Penelitian 111

4.4 Penentuan Sumber Data 111

4.4.1 Populasi target 111

4.4.2 Populasi terjangkau 111

4.4.3 Kriteria inklusi 112

4.4.4 Kriteria eksklusi 112

4.4.5 Kriteria drop out 112

4.4.6 Sampel penelitian 112

4.4.6.1 Besar sampel 112

Page 6: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

4.4.6.2 Randomisasi 112

4.5 Variabel Penelitian 113

4.5.1 Identifikasi dan klasifikasi variabel 113

4.5.2 Hubungan antar variabel 114

4.5.3 Definisi operasional variabel 114

4.6 Bahan Penelitian 117

4.7 Instrumen Penelitian 117

4.8 Prosedur Penelitian 118

4.8.1 Perlakuan binatang coba 118

4.8.2 Prosedur stimulasi ovarium 119

4.8.3 Prosedur pemeriksaan imunohistokimia dan ELISA 121

4.8.4 Alur penelitian 127

4.9 Analisis Data 128

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN 130

5.1 Distribusi Subyek Penelitian 131

5.2 Pengaruh Penambahan Letrozol Pada Protokol Antagonis

Fertilisasi In vitro terhadap Ekspresi Integrin β3

Endometrium mencit 133

5.3 Pengaruh Penambahan Letrozol Pada Protokol Antagonis

Fertilisasi In vitro terhadap Ekspresi E-Cadherin

Endometrium mencit 140

5.4 Pengaruh Penambahan Letrozol Pada Protokol Antagonis

Fertilisasi In Vitro terhadap Kadar Leukemia Inhibitory

Page 7: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

Factor Uterus Mencit 146

5.5 Analisis Jalur Peran Letrozol terhadap Ekspresi Integrin β3,

e-cadherin Endometrium dan Kadar LIF Uterus 150

5.6 Kebaharuan Penelitian (Novelty) 155

BAB VI SIMPULAN 157

6.1 Simpulan 157

6.2 Saran 158

DAFTAR PUSTAKA 159

LAMPIRAN 174

Page 8: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

DAFTAR GAMBAR

1. Gambar 2.1 Lapisan endometrium 10

2. Gambar 2.2 Endometrium fase proliferasi 13

3. Gambar 2.3 Kontrol hormonal implantasi embrio mencit 19

4. Gambar 2.4 Faktor faktor dalam implantasi normal 23

5. Gambar 2.5 Anggota superfamili integrin manusia dan

kombinasinya 28

6. Gambar 2.6 Regio ekstraseluler integrin manusia. 29

7. Gambar 2.7 Sinyal "inside-out" integrin 32

8. Gambar 2.8 Sinyal "outside-in" integrin 33

9. Gambar 2.9 Integrin sebagai situs adhesi focal 34

10. Gambar 2.10 Cell junctional complexes yang menghubungkan

sel epithelial 37

11. Gambar 2.11 Struktur cadherin 38

12. Gambar 2.12 Proses EMT pada invasi trofoblas 44

13. Gambar 2.13 Regulasi e-cadherin 47

14. Gambar 2.14 Hubungan ekspresi e-cadherin dan calcitonin 49

15. Gambar 2.15 STAT-dependent signaling dan ekspresi gen gen pada

sel trofoblas yang diberikan LIF 55

16. Gambar 2.16 Peran LIF dalam implantasi embrio 62

17. Gambar 2.17 Konsep FSH threshold and window 69

18. Gambar 2.18 Protokol pendek agonis GnRH 76

19. Gambar 2.19 Protokol panjang agonis GnRH 77

Page 9: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

20. Gambar 2.20 Protokol antagonis dosis tunggal 86

21. Gambar 2.21 Protokol antagonis dosis multipel 86

22. Gambar 2.22 Classical pathway biosintesis estrogen dari kolesterol 97

23. Gambar 2.23 Mekanisme biosintesis estrogen 97

24. Gambar 2.24 Berbagai tipe inhibitor aromatase 98

25. Gambar 3.1 Konsep penelitian 108

26. Gambar 4.1 Rancangan penelitian 110

27. Gambar 4.2 Hubungan antar variabel 114

28. Gambar 4.3 Prosedur stimulasi ovarium 120

29. Gambar 4.4 Alur penelitian 127

30. Gambar 5.1 Ekspresi integrin β3 kelompok perlakuan.

H-score=3,78 136

31. Gambar 5.2 Ekspresi integrin β3 kelompok perlakuan.

H-score=2,45 136

32. Gambar 5.3 Ekspresi integrin β3 kelompok kontrol.

H-score = 1,33. 137

33. Gambar 5.4 Ekspresi integrin β3 kelompok kontrol.

H-score = 1. 137

34. Gambar 5.5. Ekspresi e-cadherin kelompok perlakuan.

H-score = 4 142

35. Gambar 5.6 Ekspresi e-cadherin kelompok perlakuan.

H-score = 3,06 142

Page 10: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

36. Gambar 5.7 Ekspresi e-cadherin kelompok kontrol.

H-score = 1,64 143

37. Gambar 5.8 Ekspresi e-cadherin kelompok kontrol.

H-score = 1 143

38. Gambar 5.9 Model goodness of fit peran letrozol terhadap ekspresi

integrin, IHC-E-CDH (e-cadherin), dan LIF

berdasarkan analisis jalur ......................................................

151

Page 11: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

DAFTAR TABEL

1. Tabel 2.1 Biomarker bagi penilaian reseptivitas endometrium 26

2. Tabel 2.2 Struktur GnRH alamiah dan analog GnRH 80

3. Tabel 2.3 Klasifikasi inhibitor aromatase 99

4. Tabel 2.4 Aktifitas penghambatan aromatase pada berbagai jaringan. 101

5. Tabel 2.5 Penghambatan aromatase in-vivo. 102

6. Tabel 2.6 RCT Penggunaan letrozole untuk induksi ovulasi pada IVF/ICSI. 106

7. Tabel 5.1 Distribusi karakteristik umur, berat badan awal, dan berat

badan akhir pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan 132

8. Tabel 5.2 Distribusi rerata H-score integrin β3, e-cadherin dan kadar

LIF pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan 134

9. Tabel 5.3 Perbedaan ekspresi integrin β3 antara kelompok perlakuan

dengan kelompok kontrol 135

10. Tabel 5.4 Perbedaan ekspresi IHC e-cadherin antara kelompok

perlakuan dengan kelompok kontrol 141

11. Tabel 5.5 Distribusi rerata LIF kelompok perlakuan dan kelompok

kontrol 146

Page 12: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG

AI : Aromatase Inhibitor

Ar : Amphiregulin

C/EBP𝛽 : CCAAT/Enhancer Binding Protein 𝛽

CC : Clomiphene Citrate

CCAAT : Cytidine-Cytidine-Adenosine-Adenosine-Thymidine

COH : Controlled Ovarian Hyperstimulation

COUP-TF : Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor

COX-2 : Cyclooxygenase-2

E : Estrogen

ECM : Extracellular Matrix

EGF : Epithelial Growth Factor

ER : Estrogen Receptor

Ereg : Epiregulin

ERK : Extracellular Signal-Regulated Kinases

FGF : Fibroblast Growth Factor .

FGG : Fibrinogen-𝛾

FIV : Fertilisasi In Vitro.

FSH : Follicle-Stimulating Hormone

GM-CSF : Granulocyte-Monocyte Colony Stimulating Factor .

GnRH : Gonadotrophin Releasing Hormon.

HBEGF : Heparin-Binding Epidermal Growth Factor

Page 13: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

hCG : human Chorionic Gonadotrophin.

HESCs : Human Endometrial Stromal Cells

hMG : human Menopausal Gonadotrophin

HPO : Hyphothalamus-Pituitary-Ovarium

ICAM : Intercellular Adhesion Molecule

IGFBP : Insulin-like Growth Factor Binding Protein

IGF-I : Insulin-like Growth Factor-I.

IR : Implantation rate

ISIS : Injeksi Sperma Intra Sitoplasma

JAM : Junctional Adhesion Molecule

K : Körnchenzellen.

LH : Luteinizing Hormon

LIF : Leukemia Inbitory Factor

LIFR : Leukemia Inhibitory Factor Receptor.

MIDAS : Metal Ion Dependent Adhesive Site

MMP : Matrix Metalloproteinase

mRNA : Messenger Ribonucleic Acid

MUC-1 : Mucin-1.

NK : Natural Killer

OHSS : Ovarian Hyper Stimulation Syndrome

PBMC : Peripheral Blood Mononuclear Cell

PCOS : Polycystic Ovarian Syndrome

PSI : Plexin Semaphorin Integrin

RGD : Arginine-Glycine-Aspartate

Page 14: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

rhCG : recombinant Human Chorionic Gonadotrophin

SOCS3 : Suppressor iof Cytokine Signaling 3

STAT3 : Signal Transducer and Activator of Transcription 3

TGF : Transforming Growth Factor.

TIMP : Tissue Inhibitor of Metalloproteinase

uhCG : Urinary Human Chorionic Gonadotrophin

USG : Ultra Sono Graphy.

VCAM-1 : Vascular Cell Adhesion Molecule 1

VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor

WOI : Window of Implantation

Page 15: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

DAFTAR LAMPIRAN

1. Lampiran 1: Persetujuan pelaksanaan proposal.

2. Lampiran 2: Keterangan kelaikan etik (ethical clearance).

3. Lampiran 3: Umur mencit pada awal penelitian.

4. Lampiran 4: Data LIF, Umur, Berat Badan Awal, Berat Badan Akhir Kelompok

Perlakuan.

5. Lampiran 5: Data LIF, Umur, Berat Badan Awal, Berat Badan Akhir Kelompok

Kontrol.

6. Lampiran 6: Hasil IHC integrin β3 kelompok perlakuan.

7. Lampiran 7: Hasil IHC integrin β3 kelompok kontrol.

8. Lampiran 8: Hasil IHC e-cadherin kelompok perlakuan.

9. Lampiran 9: Hasil IHC e-cadherin kelompok kontrol.

10. Lampiran 10: Uji t-independent Data Karakateristik Umur, Berat Badan Awal

dan Akhir antara Kelompok Perlakuan dengan Kelompok Kontrol

11. Lampiran 11: Uji Mann-Whitney Data Integrin antara Kelompok Perlakuan

dengan Kelompok Kontrol

12. Lampiran 12: Uji Chi-Square Integrin antara Kelompok Perlakuan dengan

Kelompok Kontrol

13. Lampiran 13: Uji Mann-Whitney Data IHC E-Cadherin antara Kelompok

Perlakuan dengan Kelompok Kontrol

14. Lampiran 14: Uji Chi-Square IHC E-Cadherin antara Kelompok Perlakuan

dengan Kelompok Kontrol

Page 16: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

15. Lampiran 15: Uji Mann-Whitney Data LIF antara Kelompok Perlakuan

dengan Kelompok Kontrol

16. Lampiran 16: Analisis Jalur Peran Letrozol terhadap Ekspresi Integrin β3, e-

cadherin Endometrium dan Kadar LIF Uterus

17. Lampiran 17: Gambar pelaksanaan penelitian.

Page 17: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dalam satu dekade terakhir, keberhasilan Fertilisasi In Vitro - Injeksi Sperma

Intra Sitoplasma (FIV-ISIS) masih rendah dan cenderung menetap; terutama

terkait dengan implantation rate (IR), selain stimulasi ovarium dan fertilization

rate. Hal ini memberikan dampak terhadap kondisi psikologik pasangan dan

keluarga, sosial dan ekonomi, pengakuan serta harga diri.

Di Indonesia, rerata IR FIV-ISIS pada 28 senter pelayanan bayi tabung

adalah 13,30 % (IAIVF, 2016). Di Klinik Graha Tunjung Senter Bayi Tabung RS

Sanglah Denpasar adalah 9,14% (2005-2010) dan 12,66% (2010-2015) (Tim bayi

Tabung RS Sanglah, 2015). Di Amerika dan Eropa, IR dilaporkan 29 %

(Sunderam, 2015) dan 29,3% (Kupka, et al., 2016) dimana persentase ini relatif

tidak berubah selama lima tahun terakhir. Angka ini lebih rendah dari program

FIV pada siklus alamiah yang mencapai 50% (Pelinck, et al.,2002).

Ketidakberhasilan FIV-ISIS dilaporkan memicu adanya depresi pada 60%

wanita dan 40% pria. Selain itu, kegagalan ini meningkatkan kejadian stres dan

depresi serta memiliki ketidakpuasan hidup dan rendah diri (Bryson dan Traub,

2002). Hal ini diperburuk oleh keluhan pembiayaan yang tinggi, 21% adopsi bayi

dengan berbagai kemungkinan masalah pengakuan dan harga diri dikemudian hari

(Katz, et al., 2002).

Page 18: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

Berbagai upaya telah dilakukan untuk meningkatkan IR pada program

FIV-ISIS seperti pemilihan embrio, jumlah dan fase embrio, dan hari tranfer

embrio. Upaya tersebut meliputi teknik pemilihan embrio dengan kualitas terbaik

(Davar, et al., 2007) dan transfer embrio lebih dari satu dan atau transfer embrio

pada fase blastokis (Santos, et al., 2003).

Demikian juga dengan penyesuaian waktu transfer embrio (TE) dengan jendela

implantasi dimana TE delapan sel yaitu pada hari ketiga pasca petik ovum dan

TE fase blastokis yaitu hari kelima paska petik ovum (Nawroth dan Ludwig,

2005).

Pada beberapa tahun terakhir, rendahnya IR adalah bukti klinik

reseptivitas endometrium yang diduga terkait dengan kegagalan tahap aposisi,

adhesi dan invasi pada proses implantasi-plasentasi awal.

Molekul molekul adhesi seperti integrin ß3 dan e-cadherin, serta protein

Leukemia Inhibitory Factor diduga berperan sangat penting dalam memunculkan

reseptivitas endometrium.

Integrin sub unit ß3 (ITGB3) atau integrin ß3 adalah protein yang

diekspresikan oleh gen pada lengan panjang 17q21.32. Protein ini berperan pada

adhesi sel-sel endometrium yang mengawali proses implantasi. Integrin ß3

terdapat pada epitel luminal dan kelenjar yang terekspresi setelah hari ke 19 siklus

menstruasi. Protein yang terekspresi pada permukaan epitel luminal endometrium

ini diduga berperan pada interaksi pertama dengan trofoblas embrio. Integrin αvβ3

berikatan dengan ligannya osteopontin, bersama dengan reseptor CD44

hyaluronate membentuk pasangan "sandwich" antara embrio dan epithel

Page 19: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

endometrium (Lessey & Young, 2014). Integrin merupakan marker untuk

mengukur reseptivitas endometrium (Franasiak, et al., 2014) yang ekspresinya

diatur oleh estrogen dan progesteron melalui gen pengatur Homeobox A10

(HOXA10) (Daftary, 2002).

E-Cadherin merupakan ekspresi gen Cadherin1 (CDH1) yang terletak

pada kromosom 16q22.1 (Berx, et al.,1995). Protein ini termasuk ke dalam famili

cell adhesion molecules yang berperan penting dalam implantasi (Rowland, etal.,

2000). Pada mencit, protein ini berperan dalam adhesi sel endometrium dengan

sel trofoblas embrio yang berimplantasi melalui pengecilan kavum uterus ,

menyebabkan mengecilnya lumen uterus (uterine closure) yang dapat

meningkatkan keberhasilan implantasi (Hyland, et al., 1998).

Ekspresi E-cadherin di sel endometrium meningkat sekitar jendela

implantasi (Slater, et al., 2002; Jha, et al., 2006) dan meningkatkan kemampuan

endometrium pada tahap adhesi embrio (Rahnama, et al., 2009). E-cadherin

merupakan komponen utama adheren junction pada epithel luminal endometrium.

Adheren junction pada epithel endometrium menghilang pada proses kehamilan

normal, akan tetapi keadaan ini tidak terjadi pada kehamilan yang didahului

dengan stimulasi ovarium. Retensi adheren junction diduga akan mengganggu

implantasi blastokis, yang mungkin berperan pada rendahnya implantation rate

pada FIV-ISIS (Dowland et al., 2016).

Leukemia inhibitory factor (LIF) merupakan famili sitokin IL-6, gen LIF

terletak pada kromosom 22q12.2 dimana ekspresinya diatur oleh kadar estrogen

dan progesteron. Protein ini berperan pada aposisi, adhesi, dan invasi proses

Page 20: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

implantasi blastokis. Lessey dan Young (2014) melaporkan bahwa wild type

embrio gagal berimplantasi pada tikus dengan defisiensi gen LIF homozigot.

Sementara, terjadi peningkatan ekspresi LIF mRNA dua kali lipat pada

pertengahan dan akhir fase sekresi dibandingkan dengan pada fase proliferasi.

Pada program FIV-ISIS, dilakukan stimulasi ovarium dengan dua jenis

protokol yaitu antagonis dan agonis.

Protokol antagonis lebih banyak dipilih oleh para klinisi karena lebih murah, lebih

mudah dilakukan, serta memerlukan waktu yang lebih pendek sehingga lebih

nyaman bagi pasien dibandingkan protokol agonis (Bart, et al., 2014). Sementara,

stimulasi ovarium dengan kedua jenis protokol tersebut akan mengganggu milieu

endokrin fisiologis yang akan mengakibatkan gangguan regulasi reseptor

estrogen dan progesteron dalam stroma dan sel epitel endometrium. Kadar

suprafisiologi hormon estrogen dan progesteron pada fase luteal dini diduga

secara tidak langsung akan mempengaruhi ekspresi sel molekul adhesi terutama

integrin subunit β3, e-cadherin dan LIF pada sel epitel endometrium yang terlihat

pada reseptivitas endometrium itu sendiri (Mitwally, et al., 2005).

Protokol antagonis pada stimulasi ovarium FIV-ISIS meningkatkan kadar serum

estrogen (Mitwally, et al., 2005) dimana hal ini dapat menurunkan reseptifitas

endometrium.

Pada beberapa tahun terakhir ditemukan Letrozol yang dapat menekan

efek buruk stimulasi ovarium protokol antagonis pada endometrium.

Letrozol merupakan preparat aromatase inhibitor generasi ketiga. Letrozol

menghambat secara selektif enzim aromatase yang mengkatalisis androgen

Page 21: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

(androstenedion dan testosteron) menjadi estrogen (estron dan estradiol) di

ovarium. Pada dosis 1-5 mg perhari dapat menurunkan kadar estrogen sampai 97-

99% yang tidak mampu dideteksi dengan teknik immunoassay yang paling

sensitif. Preparat ini diabsorbsi lengkap lewat pemberian oral dengan half-life rata

rata 45 jam (30-60jam). Diduga, preparat ini dapat meningkatkan luaran program

FIV-ISIS melalui penurunan kadar estradiol, pengurangan dosis gonadotropin

yang dibutuhkan, peningkatan respon ovarium terhadap FSH, mencegah lonjakan

LH prematur, serta menurunkan risiko terjadinya sindroma hiperstimulasi

ovarium (Mitwally, et al., 2005; Klauss, et al., 2015). Sejak tahun 2001,

pemakaian preparat ini dalam bidang stimulasi ovarium masih bersifat off-label.

Studi tentang pemakaian preparat ini serta Cochrane reviews sedang berlangsung

(Klauss, et al., 2015).

Penambahan letrozol pada protokol antagonis FIV-ISIS diharapkan dapat

memperbaiki reseptivitas endometrium. Pembuktian pada penelitian ini dapat

dipakai untuk menjelaskan mekanisme terjadinya peningkatan IR pada program

FIV-ISIS melalui peran integrin ß3, e-cadherin dan LIF. Selanjutnya, dapat

dipergunakan sebagai dasar penelitian pada kasus infertilitas yang menjalani

program FIV-ISIS.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan uraian tersebut di atas maka disusunlah rumusan masalah

sebagai berikut :

1. Apakah penambahan letrozol pada protokol antagonis FIV-ISIS

Page 22: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

meningkatkan ekspresi Integrin ß3 endometrium mencit?

2. Apakah penambahan letrozol pada protokol antagonis FIV-ISIS

meningkatkan ekspresi E-Cadherin endometrium mencit?

3. Apakah penambahan letrozol pada protokol antagonis FIV-ISIS

meningkatkan kadar Leukemia Inhibitory Factor uterus mencit?

1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan umum

Penggunaan letrozol dalam bidang reproduksi masih bersifat off-label.

Pembuktian bahwa penambahan letrozol pada protokol stimulasi ovarium dengan

GnRH antagonis mengakibatkan ekspresi integrin β3, e-cadherin dan kadar LIF

pada epitel endometrium mencit lebih tinggi dibandingkan dengan protokol

stimulasi ovarium dengan GnRH antagonis standar akan dapat mengembangkan

teori bahwa penambahan letrozol pada protokol antagonis akan dapat

memperbaiki reseptivitas endometrium pada siklus yang mengalami stimulasi

ovarium melalui perbaikan pada ekspresi integrin β3, e-cadherin dan kadar LIF

pada epitel endometrium. Dengan demikian akan memberikan dukungan bagi

pemakaian letrozol dalam bidang stimulasi ovarium khususnya untuk mengatasi

pengaruh buruk kadar estrogen yang suprafisiologis pada reseptivitas

endometrium.

1.3.2 Tujuan khusus

Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa :

1. Penambahan letrozol pada protokol antagonis meningkatkan ekspresi

Integrin ß3 endometrium mencit.

Page 23: EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS ... · EFEK PENAMBAHAN LETROZOL PADA PROTOKOL ANTAGONIS FERTILISASI IN VITRO TERHADAP EKSPRESI INTEGRIN β3, E- CADHERIN, DAN KADAR

2. Penambahan letrozol pada protokol antagonis meningkatkan ekspresi

E-Cadherin endometrium mencit.

3. Penambahan letrozol pada protokol antagonis meningkatkan kadar LIF

uterus mencit.

1.4 Manfaat Penelitian

1.4.1 Manfaat keilmuan

Pembuktian bahwa penambahan letrozol pada protokol stimulasi ovarium

dengan GnRH antagonis mengakibatkan ekspresi integrin subunit β3, e-cadherin

dan kadar LIF pada epitel endometrium mencit lebih tinggi dibandingkan dengan

protokol stimulasi ovarium dengan GnRH antagonis standar akan dapat

memperkaya mekanisme terbentuknya reseptivitas endometrium pada program

FIV-ISIS.

1.4.2 Manfaat praktis

Pembuktian bahwa penambahan letrozol pada protokol stimulasi ovarium

dengan GnRH antagonis mengakibatkan ekspresi integrin β3, e-cadherin dan LIF

pada epitel endometrium mencit lebih tinggi dibandingkan dengan protokol

stimulasi ovarium GnRH antagonis standar, akan mendapatkan suatu cara

stimulasi ovarium yang lebih baik, yang akan menghasilkan angka implantasi

yang lebih tinggi, melalui perbaikan reseptivitas endometrium sehingga sangat

bermanfaat bagi pasangan infertil yang menginginkan kehamilan lewat program

FIV-ISIS.