Efectos AntiaterogEfectos Antiaterogéénicosnicos de de ββ--Sitosterol, Sitosterol, Hormonas Femeninas y Extractos de Plantas Hormonas Femeninas y Extractos de Plantas

Sobre Modelos de CSobre Modelos de Céélulas Endoteliales lulas Endoteliales HumanasHumanas

Universidad de ConcepciónFacultad de Farmacia

Departamento de Bioquímica Clínica e Inmunología

Prof. Paulina Bustos Araya, Químico Farmacéutico, MSc en Inmunología

pbustos@udec.cl

EpidemiologEpidemiologíía de la Enfermedad a de la Enfermedad Cardiovascular (ECV)Cardiovascular (ECV)

Las ECV representan la principal causa de muerte en todo el mundo.

En el año 2005 murieron 17,5 millones de personas, lo cual representa un 30% de todas las muertes registradas en el mundo.

Se estima que en el año 2015 morirán cerca de 20 millones de personas por ECV, y se prevé que sigan siendo la principal causa de muerte.

En Chile, el 28% de las muertes son por ECV (INE Chile, 2000).

Enfermedades isquémicas del corazón y enfermedades cerebrovasculares constituyen las primeras causas de muerte (MINSAL, 2005).

AterosclerosisAterosclerosis

La aterosclerosis se define como un proceso inflamatorio crónico que involucra una compleja interacción entre el endotelio vascular, lípidos séricos, células inflamatorias, plaquetas y células de la musculatura lisa vascular.

1) Eventos tempranos en el desarrollo de la placa aterosclerótica

Glass E et al, 2001

Glass E et al, 2001

2) Progresión de la lesión aterosclerótica

Glass E et al, 2001

3) Ruptura de la placa y trombosis

MolMoléécula de adhesicula de adhesióón ICAMn ICAM--11

Getz G et al, 2005

Inmunidad innata y eventos

tempranos de la aterosclerosis

Hígado

MonocitosMonocitos

Endotelio Endotelio VascularVascular

Disfunción Endotelial

LDLLDL

Oxidación LDL

Migración

Infiltración

Diferenciación

IL-1, IL-6, TNFα,

IFNγ, MCP-1

Moléculas de adhesión (CAMs)Citoquinas

E-selectina,

ICAM-1, VCAM-1

1.Modificación oxidativa de lipoproteínas de baja densidad (LDL).(LDL).

2.Expresión de moléculas de adhesión por parte de las células endoteliales (VCAM-1, ICAM-1).

3.Producción de quimioquinas: MCP-1.

4.Adhesión de monocitos a células endoteliales, posterior migración hacia la íntima y activación de macrófagos.

Eventos aterogEventos aterogéénicos tempranosnicos tempranos

PrevenciPrevencióón eventos aterogn eventos aterogéénicos nicos tempranostempranos

II. Antioxidantes Inhibición oxidación de la LDL

I. Moléculas Moduladoras de Expresión Génica

FitoesterolesRegulación de la homeostasis del colesterol.

Agonistas del receptor de estrógenosModificación de moléculas de adhesión y secreción de MCP-1.

MolMolééculas moduladoras de la culas moduladoras de la expresiexpresióón gn géénicanica

17-β-Estradiol Progesterona

Fitoesteroles

Efectos del 17β-estradiol en el endotelio vascular

(Simoncini et. al, 2004)

Activación de eNOS

Aumenta la transcripción de eNOS (Hayashi et.al, 1995)

Inhibe la expresión de CAMs (VCAM-1, ICAM-1, E-selectina) (Caulin -Glaser et. al, 1996), y síntesis de MCP-1 (Rodríguez et. al, 2002)

Inhibe la actividad de NADPH oxidasa en monocitos (Sumi et. al, 2003) y células endoteliales (Wagner et. al, 2001), lo cual suprime la activación de NF-kB estimulada por TNF-α e INF-γ

Okada M et al, 1997

Efecto del estradiol sobre la síntesis de MCP-1 por células THP-1

Efectos de progesterona en el endotelio vascular

Inhibe la expresión de VCAM-1 en HUVECs inducida por TNF-α (Mendelsohn et. al, 1999)

Sin efecto sobre la expresión de CAMs estimulada por LDLox en HUVECs (Tatsumi et. al, 2002)

Disminuye la expresión de CAMs estimulada por LPS en HUVECs, a través de la inactivación de NF-kB (Simoncini et. al, 2004)

Aumenta la activación y expresión de eNOS de forma aditiva al efecto de E2 (Simoncini et. al, 2004)

Otsuki M, 2001

Efecto de la progesterona sobre la expresión de VCAM-1

Fitoesteroles:Moléculas esteroidales presentes en plantas

Eficiencia de absorción intestinal: 2-5%Niveles plasmáticos: 1000 veces menor que el colesterolConsumo promedio: 160-400 mg/día

Propiedades de β-sitosterolInhiben la absorción del colesterol a nivel intestinal (Ikeda et al, 1988) y regulan la homeostasis (Brown, 1998)

Disminuyen oxidación de LDL in vitro, captación y síntesis de colesterol, actividad de HMG-CoA reductasa (Revisado en Moghadasian, 1999)

Agonistas débiles de ambas isoformas del receptor de estrógenos (Gutendorf et al, 2001)

Reducen la esterificaciReducen la esterificacióón de colesterol en macrn de colesterol en macróófagos THPfagos THP--1 e 1 e incrementan el eflujo de colesterol desde estas cincrementan el eflujo de colesterol desde estas céélulas lulas (Ulloa et al, datos no publicados)

ReducciReduccióón tanto de la concentracin tanto de la concentracióón de colesterol como de la n de colesterol como de la extensiextensióón y severidad de la aterosclerosis en modelo de ratones n y severidad de la aterosclerosis en modelo de ratones knocked outknocked out para apo E para apo E (Nashed B, 2005)

Fitoesteroles

Células de bazo de ratones apo E-KO tratados con fitoesteroles y control se cultivaron y estimularon con LPS.

Respuestas de citoquinas en ratones tratados con fitoesteroles

Nashed B et al, 2005

Esteroles previenen la liberación de mediadores derivados del AA

pro-inflamatorios y pro-aterogénicos en macrófagos

estimulados con LDLox

Antioxidantes Fenólicos

Moléculas presentes en plantas

Los POLIFENOLES presentan un núcleo bencénico con al menos un grupo OH libre: son capaces de atrapar radicales libres.

Condensación de ácidos fenólicos: moléculas complejas llamadas flavonoides.

La ingesta de flavonoides se estima en 100 a 150 mg/día.

Los polifenoles son los antioxidantes más abundantes de la dieta. Su consumo es 10 veces mayor que el de vitamina C y 100 veces mayor que la vitamina E o carotenoides.

Ácido cafeico Ácido Gálico

Propiedades de los antioxidantes fenPropiedades de los antioxidantes fenóólicoslicos

Inhiben oxidación de LDL, aumentan la resistencia a oxidación del plasma humano (Martínez-Flores et al, 2002)

Disminuyen la expresión de VCAM-1 por inactivación de NF-kB (Carluccio et al, 2003) y del factor de transcripción AP-1 (Subbaramaiah et al, 1998)

Inhiben la liberación de citoquinas (TNF-α, INF-γ) desde monocitos y células endoteliales humanas (Kaliora et. al, 2005)

Koga T et al, 2001

Efecto de la quercetina y metabolitos sobre la Efecto de la quercetina y metabolitos sobre la adhesiadhesióón de cn de céélulas monocitoides U937 en HAECslulas monocitoides U937 en HAECs

Curin Y et al, 2005

Efecto protectores de los polifenoles sobre las ECVsEfecto protectores de los polifenoles sobre las ECVs

Extracto metanExtracto metanóólico purificado de hojas de Ugni lico purificado de hojas de Ugni molinae (Murtilla): EMEbmolinae (Murtilla): EMEb

Propiedades de EMEb

Inhibe la oxidación de LDL in vitro por iones cobre.

Revierte la inhibición del transporte de L-arginina y la inhibición de eNOS en células endoteliales expuestas a LDLox.

Planta autóctona del sur de Chile.

Contiene flavonoides y otros compuestos fenólicos tales como ácidos gálico, ácido cafeico y catequina.

Modelos con cModelos con céélulas endoteliales de lulas endoteliales de cordcordóón umbilical humano (HUVECs)n umbilical humano (HUVECs)

DetecciDeteccióón de ICAMn de ICAM--1 en HUVECs1 en HUVECs

Adición de estímulos y efectores durante 20 h:

- LDLox, LDLn, TNF-α

-17-β-estradiol (E2), progesterona (PG),

β-sitosterol, EMEb

Detección de ICAM-1 utilizando un AcMo anti ICAM-1 y un Ac anti IgG de ratón marcado con fluoresceína (FITC)

EXPRESIEXPRESIÓÓN DE ICAMN DE ICAM--1 EN 1 EN HUVECSHUVECS

Control negativoControl negativo

TNF-α 10 ng mL-1Control negativo LDLn 50 µg mL-1 LDLox 50 µg mL-1

Efecto de 17β-estradiol y progesterona en la expresión de ICAM-1 inducida por

LDLox

PG (nM) 75 150 300LDLox

E2(nM) 3.75 7.5 15LDLox

LDLn LDLox

Control negativo

LDLox 50 µg mL-1

TNF-α 10 ng mL-1

3,75 µM 7,5 µM 25 µM

+LDLox

+TNF-α

Efecto de β-sitosterol en la expresión de ICAM-1 inducida por LDLox y TNF-α

Efecto de EMEb en la expresión de ICAM-1 inducida por LDLox

Control negativo

LDLox 50 µg mL-1

TNF-α 10 ng mL-1

EMEb+E2 EMEb+PG EMEb+B-SIT

0.1nM 10nm 50nm

Co-cultivos de HUVECs y células THP1

Chamber Slide (Nunc)

THP1 fueron marcadas con BCECF-AM.

Observación en microscopio de fluorescencia de la adhesión de células THP1 a HUVECs

LDLoxE2 7.5 nMLDLox

PG 150 nMLDLox

β-SIT 7.5 µMLDLox

EMEb 10 nMLDLox

E2 7.5 nMPG 150 nMβ-SIT 7.5 µMLDLox

E2 7.5 nMPG 150 nMEMEb 10 nMLDLox

Adhesión de células THP1 en co-cultivo con HUVECs

Ensayos de migración y adhesión de células THP1 en co-cultivos con células endoteliales

THP-1 fluorescentes

THP1 fueron marcadas con BCECF-AM.

Placas Transwell con poros de diámetro 12 um

LDLn 50 µg mL-1 LDLox 50 µg mL-1β-sitosterol

7.5 µM

β-sitosterol 7.5 µM

E2 7,5 nM

PG 150 nM

E2 7,5 nM

PG 150 nM

EMEb 10 nM

Migración y adhesión de células THP1 en co-cultivos con HUVECs

f

EMEb 10 nM

E2 7,5 nM

PG 150 nM

[3H]-Thy THP-1

Ensayos de quimiotaxis

THP1 fueron marcadas con 1 µCi [3H]-timidina

Placas Transwell con poros de diámetro 3 um

Migración de células THP1 en co-cultivos con HUVECs

LDLox 50 µg mL-1

E2 7,5 nMPG 150 nMB-SIT 7,5 mMEMEb 10 nM EAG

0

25

50

75

100

125

% M

igra

ción

0

25

50

75

100

125 *

% M

igra

ción

TNF-α 10 ng mL-1

LDLox 50 µg mL-1

B-SIT 7,5 mMEMEb 10 nM EAG

*: p = 0,0156

+ +

Kit comercial de ELISA sandwich

Cuantificación de MCP-1 en sobrenadantes de HUVECs y de co-cultivos

MCP-1 MCP-1 MCP-1 MCP-1

AcMo anti MCP-1

Ac anti MCP-1/peroxidasa

Cuantificación de quimioquina MCP-1 por ELISA

25000Cuantificación de MCP-1 en cultivos de HUVECs

0

5000

10000

15000

20000

25000

&&

MC

P-1

pg m

L-1***

&& &&

&&&

LDL n 50 µg mL-1

TNF-α 10 ng mL-1

LDLox 50 µg mL-1

E2 7,5 nMPG 150 nmB-SIT 7.5 mMEMEb 10 nM EAG

***: p<0.001&& : p<0.01&&&:p<0.001

E2 PGβ-sitosterol

EMEbExpresión de

ICAM-1

Transcripción de genes ICAM-1, MCP-1

LOX

-1

LDLox

Monocito

Quimiotaxis y migración

Producción de MCP-1

Desacoplamiento eNOSActivación NADPH

oxidasaActivación NF-kB

E2 PGβ-sitosterol

EMEb

E2 PGβ-sitosterol

EMEb

HUVECs

Los efectos de esteroles, molLos efectos de esteroles, molééculas culas antioxidantes y de hormonas esteroidales antioxidantes y de hormonas esteroidales sobre eventos aterogsobre eventos aterogéénicos tempranos nicos tempranos pueden ser evaluados en modelos con pueden ser evaluados en modelos con cultivos de HUVECs.cultivos de HUVECs.

Conclusión

GRACIAS