“Evaluación de la actividad hormonal de: Thidiazuron (TDZ), Thidiazuron con ácido α-naftalen acético (TDZ/ANA) Vs. 6 –

Bencil amino purina (BAP), 6 – Bencil amino purina con ácido α-naftalen acético (BAP/ANA); como inductores de

brotes en la etapa de multiplicación a partir de yemas apicales de Balsa (Ochroma lagopus).”

Previo a la obtención de título deIngeniero en Biotecnología

Directora: M.Sc. Mónica JadánCodirector: Ing. Pedro RomeroAutor: David Dávila A. Sangolquí, 09 de Diciembre 2011

OBJETIVO GENERALOBJETIVO GENERAL

Estandarizar métodos de micropropagación para la obtención de clones viables

de plantas de Balsa (Ochroma lagopus) mediante su cultivo in vitro.

OBJETIVOS ESPECOBJETIVOS ESPECÍFICOSÍFICOS

•Establecer protocolos de: establecimiento, multiplicación y enraizamiento de Balsa (Ochroma lagopus).

•Evaluar los métodos estandarizados de cultivo y micropropagación in vitro de Balsa (Ochroma lagopus).

•Obtener plántulas de Balsa (Ochroma lagopus) para su uso potencial en la industria maderera.

MARCO TEÓRICO

Clasificación taxonómica

Nombre científico: Ochroma lagopus Género: OchromaFamilia: Bombacaceae Orden: MalvalesClase: MagnoliopsidaDivisión/Phylum: MagnoliophytaReino: Plantae

Distribución natural de la balsa, Ochroma lagopus, en el neotrópico.

Fuente: Tomado de K. Francis, John, 2002

Justificación del Problema

Justificación del Problema

Cultivo in vitro • Sobre una superficie

pequeña.

• Optimización de las condiciones ambientales.

• Elimina por completo la presencia de microorganismos y organismos patógenos o plagas.

Etapas del cultivo in vitro

HipótesisEl Thidiazuron TDZ y el Thidiazuron con el ácido α-naftalen acético (TDZ/ANA), es el mejor inductor de brotes en la etapa de multiplicación a partir de yemas apicales de Balsa (Ochroma lagopus).

MATERIALES Y MÉTODOS

Etapa I: Introducción

(a) Plantas de balsa en condiciones de invernadero sometidas a tratamiento fitosanitario.

(b) Medición de tamaño promedio para cumplir condiciones fenotípicas.

(a) (b)

Etapa II: Desinfección

Protocolo de Desinfección:

(a)Yemas apicales (b)Lavado en agua corriente. (c) Lavado en agua estéril. (d) Combinación de fungicidas. (e) Alcohol. (f) Cloro.

(a) (b) (c)

(d)

(e) (f)

Etapa III: Siembra

(a) Procedimiento mecánico para la eliminación de tricomas.

(b) Yema apical de Balsa, se distingue presencia de tricomas.

(a) (b)

Medio de cultivoMedio Murashige&Skoog

Componentes Concentración mg/L

NH4NO3 1650

KNO3 1900

MgSO4.7H2O 370

MnSO4.H2O 16,9

ZnSO4.7H2O 8,6

CuSO4.5H2O 0,025

CaCl2.2H2O 440

KI 0,83

CoCl2.6H2O 0,025

KH2PO4 170

H3BO3 6,2

Na2MoO4.2H2O 0,25

FeSO4.7H2O 27,84

Na2EDTA 37,24

Las concentraciones usadas fueron: agar 6,5 g/LAzúcar 25 g/LSulfato de adenina 0,5 mg/LL – Cisteína 30 mg/LÁcido ascórbico 30 mg/LCarbón activado 200 mg/LInositol 100 mg/LAmistar TOP (Azoxystrobin, Difenoconazol) 50 ul/L pH 5,7

El medio de cultivo fue esterilizado en el autoclave durante 30 minutos a 121oC y 15 PSI.

Etapa de desinfección

TratamientoConcentración de

cloro %Tiempo de

Inmersión (min)

1 0,5 40

2 1,0 30

3 1,5 20

4 2,5 10

Tratamientos de desinfección utilizando hipoclorito de sodio

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

ContaminaciónTabla de comparación de Fisher para la contaminación

con respecto a la concentración de hipoclorito de sodio y sus respectivos tiempos de inmersión.

NecrosisTabla de comparación de Fisher para la necrosis con respecto a la concentración de hipoclorito de sodio y sus respectivos tiempos de

inmersión.

SupervivenciaTabla de comparación de Fisher para la supervivencia con respecto a la concentración de hipoclorito de sodio y sus

respectivos tiempos de inmersión

Contaminación, Necrosis y Supervivencia

Explantes vivos, explantes contaminados, explantes necrosados en los tratamientos de hipoclorito de sodio: Tratamiento 1 (0.5% - 40 min) Tratamiento 2 (1.0% - 30 min) Tratamiento 3 (1.5% - 20 min) Tratamiento 4 (2.5% - 10 min).

Desinfección con fungicidas más hipoclorito de sodio 0,5% y 40 min de

inmersión

Tratamiento Concentración de fungicida %Tiempo de Inmersión

(min)

5 Captan 0,1 15

6 Cobre Nordox 0,1 15

7 Amistar 0,1 15

8 Amistar 0,3 15

9 Captan 0,1+Cobre Nordox 0,1 15

10 Amistar 0,1+Captan 0,1 15

11 Amistar 0,1+Cobre Nordox 0,1 15

12 Amistar 0,3+Captan 0,1 15

13 Amistar 0,3+Cobre Nordox 0,1 15

14 Amistar 0,3+Cobre Nordox 0,1+Captan 0,1 15

ContaminaciónTabla de comparación de Fisher para la contaminación con respecto a concentración de hipoclorito de sodio 0,5% - 40 min, mezclada con la

concentración de fungicida y la mejor combinación de fungicida.

NecrosisTabla de comparación de Fisher para la necrosis con respecto a la

concentración de hipoclorito de sodio 0,5% - 40 min, mezclada con la concentración de fungicida y la mejor combinación de fungicidas.

Supervivencia 

Tabla de comparación de Fisher para la supervivencia con respecto a la concentración de fungicida y combinaciones de fungicida con el mejor

tratamiento de hipoclorito de sodio (0.5% - 40 min).

Contaminación, Necrosis y Supervivencia

Explantes vivos, necrosados y contaminados en los tratamientos de fungicida más hipoclorito de sodio 0.5% - 40 min.

Supervivencia

Explantes vivos en los tratamientos con hipoclorito de sodio y en los tratamientos con fungicida más hipoclorito de sodio 0.5% - 40 min.

Etapa IV: Incubación

Yema apical de balsa con aparecimiento de brote

Yema apical de balsa con aparecimiento de callo

Tratamientos de inducción

Tratamiento BAP mg/L1 0,12 0,23 0,34 0,45 0,5

Tratamientos para inducción de brotes

Formación de callo y aparecimiento de brote

Formación de brote vs. aparecimiento de callo en los tratamientos de inducción para yemas de Ochroma lagopus; tratamiento 1 (BAP 0.1 mg/L), tratamiento 2 (BAP 0.2 mg/L), tratamiento 3 (BAP 0.3 mg/L), tratamiento 4 (BAP 0.4 mg/L), tratamiento 5 (BAP 0.5 mg/L).

Etapa V: Multiplicación

1

2

3

4

Conteo número de brotes que contiene cada explante.

1 2

Etapa V: Multiplicación

(a)

Explantes en etapa de multiplicación (a) BAP, (b) TDZ

(b)

Multiplicación

Tratamiento BAP (mg/L) ANA (mg/L)1 0 02 0,2 03 0,2 0,14 0,2 0,25 1 06 1 0,17 1 0,28 2 09 2 0,1

10 2 0,2

Tratamientos para multiplicación utilizando BAP en combinación con ANA, nueve tratamientos más un testigo.

BAP vs. ANATratamiento BAP (mg/L) ANA (mg/L)

1 0 02 0,2 03 0,2 0,14 0,2 0,25 1 06 1 0,17 1 0,28 2 09 2 0,1

10 2 0,2

Formación de brotes en los tratamientos de multiplicación para Ochroma lagopus, utilizando combinaciones de BAP y ANA.

Formación de brotes BAP vs. ANA

 Porcentaje de formación de brotes en los tratamientos de multiplicación en

los que se utilizó combinaciones de BAP vs. ANA.

Longitud del explante BAP vs. ANATratamiento BAP (mg/L) ANA (mg/L)

1 0 02 0,2 03 0,2 0,14 0,2 0,25 1 06 1 0,17 1 0,28 2 09 2 0,1

10 2 0,2

Longitud promedio de los explantes medidas en (mm), obtenidas de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de BAP vs. ANA.

Porcentaje de longitud del explante BAP vs. ANA

Porcentaje de la longitud de los explantes, obtenidas de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de BAP vs. ANA.

Longitud de brotes BAP vs. ANA

Análisis de varianza para la longitud de los brotes usando combinaciones de hormonas: BAP vs. ANA

Longitud de explantes BAP vs. ANA

Longitud promedio de los explantes, obtenidas de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de BAP vs. ANA.

Formación de brotes BAP vs. ANATabla de contingencia para la formación de brotes usando

combinaciones de hormonas: BAP vs. ANA

Multiplicación

Tratamiento TDZ (mg/L) ANA (mg/L)1 0 02 0,2 03 0,2 0,14 0,2 0,25 1 06 1 0,17 1 0,28 2 09 2 0,110 2 0,2

  Tratamientos para multiplicación utilizando TDZ en combinación con ANA, nueve

tratamientos más un testigo.

Brotes TDZ vs.ANATratamiento TDZ (mg/L) ANA (mg/L)

1 0 02 0,2 03 0,2 0,14 0,2 0,25 1 06 1 0,17 1 0,28 2 09 2 0,110 2 0,2

Formación de brotes en los tratamientos de multiplicación para Ochroma lagopus, utilizando combinaciones de TDZ y ANA.

Brotes TDZ vs.ANA

Porcentaje de formación de brotes en los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de TDZ vs. ANA.

Brotes TDZ vs. ANA

Tabla de contingencia para la formación de brotes usando combinaciones de hormonas: TDZ vs. ANA

Longitud de Brotes TDZ vs.ANA

Longitud promedio de los explantes medidos en (mm), obtenidos de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de TDZ vs. ANA.

Longitud de Brotes TDZ vs.ANA

Porcentajes de la longitud de los explantes, obtenidos de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de TDZ vs. ANA.

Longitud de brotes TDZ vs. ANA

Longitud promedio de los explantes, obtenidos de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de BAP vs. ANA .

Longitud de brotes TDZ vs ANA comparado con BAP vs ANA

Formación de brotes TDZ vs ANA con BAP vs ANA

Etapa VI: Enraizamiento

Enraizamiento de plántulas de balsa

CONCLUSIONES

El tratamiento fitosanitario aplicado a las plántulas de Balsa previa su introducción es determinante para reducir la contaminación en condiciones in vitro; la aplicación de 0,1% de óxido cuproso con aplicaciones mensuales cada tres días.

La desinfección mecánica que consistió en retirar los primordios foliares del tejido meristemático de la zona apical y la remoción de los tricomas que recubrían el material a introducir contribuyo a mejorar la desinfección.

El mejor tratamiento de desinfección para las yemas apicales de Balsa (Ochroma lagopus) fue el tratamiento 14: Captan 0,1% -Óxido cuproso 0,1%- Azoxystrobin; Difenoconazol 0,3%, (15 min) más la solución de hipoclorito de sodio: 0,5% de concentración y 40 minutos de inmersión, obteniendo el promedio más bajo tanto en contaminación como en necrosis y el mejor promedio con relación a la supervivencia.

La adición al medio de cultivo de sulfato de adenina 0,5 mg/L; L – Cisteína 30 mg/L; ácido ascórbico 30 mg/L; Carbón activado 200 mg/L al medio de cultivo contribuyo a la reducción del proceso de oxidación de los explantes de Balsa en la etapa de establecimiento.

La mejor combinación de citoquinina vs. auxina para la elongación de brotes fue: BAP vs. ANA (BAP 1 mg/L – ANA 0,2 mg/L) con una altura promedio de 31, 32 mm por cada repetición comparada con TDZ vs. ANA (TDZ 2 mg/L – ANA 0 mg/L) en donde se obtuvo una altura promedio de 23,68 mm por cada repetición.

La mejor combinación de citoquinina vs. auxina para la obtención de brotes fue: TDZ vs. ANA (TDZ 1 mg/L – ANA 0 mg/L); con 23 brotes en promedio por cada repetición comparada con BAP vs. ANA (BAP 0,2mg/L – ANA 0,1 mg/L) en donde se obtuvo 7 brotes en promedio por cada repetición.

RECOMENDACIONES

Aplicar un rango más amplio al evaluar citoquinina vs. auxina en la etapa de multiplicación de yemas apicales de Balsa, para poder determinar de mejor forma la concentración adecuada para la etapa de multiplicación en la especie.

Utilizar la información generada en esta investigación para la introducción in vitro de especies leñosas, y de esta forma contribuir en la reducción de la contaminación y la necrosis, y por su puesto poder preservar especies de importancia comercial así como las que se encuentren en peligro de extinción.