Diamino-pimelinsav meghatározása

23.04.20.2011.03.31

Diamino-pimelinsav

meghatározása

Készítette: Kelényi Janka

23.04.20. Kelényi Janka 2

Diamino-pimelinsav (DAP)

• Diaminosavak csoportjába tartozik.• Lizin ε-karboxi-származéka.• Nem-fehérjeépítő aminosav.• Baktériumok sejtfalának jellemzője. Jelenlétében

normál növekedés, hiányában nem képesek új sejtfal-proteoglikánokat előállítani.

• Minden Gram-negatív baktériumban, azonban csak néhány Gram-pozitív baktériumban jelenik meg.


DAP

• A Braun-féle lipoproteinek diaminopimelinsavon keresztül kapcsolódnak a Gram-negatív sejtfalakhoz.

• A Gram-negatív Escherichia coli esetében diaminopimelinsavhoz közvetlenül kapcsolódik a szomszéd láncvégi D‑alanin. A sejtfal teichoinsav nélkül tömörebb, így kisebb rétegvastagság mellett is szilárd.


DAP meghatározás

Grant és West egyszerűsített módszere

• Hidrolízis tömény sósavval

• Tisztítás

• Papír kormatográfiás vizsgálat

• Elemzés

• 80%-os visszanyerés


DAP meghatározás

Mikrohullámmal gyorsított eljárás• Egészsejtes hidrolízis folyadék és gőzfázisban lévő 6 N

sósavval, lezárt edényben.• Nyomás és hőmérséklet érzékelővel ellátott mikro használata.• Folyadék- és gőzfázisú mikrohullámmal történő eljárással

azonos minőségű eredmény nyerhető, mint a hagyományos módszerrel.

• A hidrolízis időtartama így 16-20 óráról kevesebb, mint 10 percre csökkenthető

• A teljes vizsgálati idő kevesebb mint 90 perc• A gőzfáziú megoldás esetében megkönnyíti az eljárás menetét

a fázisok közötti sósavmosás elhagyása


Grant és West módszere I.

Módszer elve:• DAP extrakció talajból• Hidrolízis HCl-al• Mennyiségi meghatározás• Vékonyréteg kromatográfia

Anyagok és eszközök:• Spektrométer• Rotációs bepárló• Kromatográfiás papír• Rázógép• Vízfürdő (25-100°C között állítható)• Szűrőpapír• Centrifuga és centrifuga csövek


Grant és West módszere II.

Vegyszerek:• HCl (12 M)• trimetilkloroszilán (1% toluol)• pellet NaOH• Mozgó fázis I (30:20:6:24 V/V)

– Bután-1-ol– Piridin– Ecetsav, tömény– Víz

• Mozgó fázis II (7:1 V/V)– Buán-1-ol– Hangyasav


Grant és West módszere III.

Vegyszerek: (folytatás)• Ninhidrin reagens

– 1g ninhidrin– 100 mg kadmium-acetát– 5 ml ecetsav– 100 ml aceton– 10 ml desztillált víz

• H2SO4 (tömény)• Metanol• DAP standard oldat


Grant és West módszere IV.

Eljárás:• 3 db 2,5g talajminta bemérése• Inkubálás rázógépen (100 fordulat/perc)– 25°C– 48 óra– 20 ml HCl (12 M)• Hidrolizálás– 20 ml desztillált víz– 105°C– 18 óra• Hidrolizátumok szűrése• Maradékok kimosása 2x10 ml desztillált vízzel• Lombik szililezése a felszíni DAP abszorpció megelőzésére• Rotációs bepárlóval 45-50°C-on a szűrőket kiszárítjuk (3x)


Grant és West módszere V.

Eljárás: (folytatás)• Semlegesített hidrolizátumot desztillált vízbe

visszaoldjuk• Huminanyagok eltávolítása centrifugálással• A felülúszókat adott térfogatra egészítjük ki• DAP meghatározás

– Whatman papír– 2 cm-es távolságban viszik fel az egyes mintákat– 72 óra

• Levegőn szárítása a kromatográfiás papíroknak• Ninhidrin reagensbe mártás


Grant és West módszere VI.Eljárás: (folytatás)• Folt előhívása, kivágása

– 24 órán belül– Tömény H2SO4-val– Sötétben

• A foltok eluálása 4 ml metil-alkohollal• 500 nm-en spektrofotometriás mérés• Minden kromatográfiás papírból kivágunk egy ugyanakkora

darabot (vak minta), mint a mintáknál és mossuk 4 ml metil-alkohollal. Ezzel a háttér-abszorbancia értékkel korrigálunk a mérés során.


Grant és West módszere VII.

Eredmények:

• Érzékenysége kb. 10 μg/ g talaj

• Extrakciós veszteség max. 38 %

• Talaj élettelen szerves frakciójában megjelenik a DAP


Felhasznált irodalom• http://hu.wikipedia.org/wiki/Diamino-pimelinsav• delfin.unideb.hu/~szentirm/mikrobana.doc • http://davidcwhite.org/fulltext/310.pdf• Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in

Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995

23.04.20.2011.03.31

Köszönöm a figyelmet!

Kelényi Janka

Diamino-pimelinsav meghatározása

Documents

Transcript of Diamino-pimelinsav meghatározása