九州大学学術情報リポジトリKyushu University Institutional Repository

Development of Novel Molecular TargetingTherapy for Diabetic Retinopathy Based onGenome-wide Gene Expression Profiling

吉田, 茂生九州大学大学院医学研究院眼科学分野

石橋, 達朗九州大学大学院医学研究院眼科学分野

https://doi.org/10.15017/27427

出版情報：福岡醫學雜誌. 104 (8), pp.240-248, 2013-08-25. Fukuoka Medical Associationバージョン：権利関係：

福岡医誌 104(８)：240―248，2013

ゲノムワイド遺伝子発現解析を基盤とした

新しい糖尿病網膜症治療薬の創製

九州大学大学院医学研究院眼科学分野

吉 田 茂 生，石 橋 達 朗

はじめに

日本人の生活様式の欧米化や高齢化社会の進展により，近年糖尿病患者は増加の一途をたどっている．

それに伴い糖尿病三大合併症の一つである糖尿病網膜症の患者数も増加し，年間約 3,000人が失明してい

る．今後も糖尿病網膜症の患者数は増加するといわれており，よりよい予防法や治療法の確立が社会的急

務である．

糖尿病網膜症は大きく非増殖と増殖網膜症に分類される（図 1)1)．非増殖網膜症に対しては網膜光凝固

術の有効性が確立されている．しかし，網膜光凝固術にもかかわらず病状が進行する例や，眼科受診時に

すでに進行した増殖網膜症の段階で失明の危機に瀕していることもある．増殖糖尿病網膜症（PDR）では

網膜上に線維血管増殖組織（fibrovascular membrane（FVM）；以下増殖組織）を生じ（図 2），その収縮に

伴う牽引性網膜剥離が失明の原因となる2)3)．現在のところ，増殖組織生成の分子機序は不明で，近年の安

全な硝子体手術の進歩に伴い治療成績は向上してきているが，視機能を保持できない場合も少なくない．

また手術侵襲に伴う術後眼内細胞増殖による増殖硝子体網膜症（PVR）がしばしば病状を悪化させるが，

その分子機序も殆ど明らかでない4)．

増殖組織の形態学的観察では，網膜グリア細胞，筋線維芽細胞，マクロファージ，硝子体細胞，網膜色

素上皮（以下RPE）細胞や新生血管内皮細胞が認められる5)．このうち増殖組織収縮による牽引性網膜剥

離の病態の中心となっているのは筋線維芽細胞であり，その由来は主にRPE細胞であるとされている6)．

PDR患者の硝子体液や増殖組織で線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor ; bFGF），血管内

皮増殖因子（vascular endothelial growth factor ; VEGF），腫瘍壊死因子-α（tumor necrosis factor-α ;

TNF-α），インターロイキン-1ß（interleukin-1ß ; IL-1ß），単球遊走因子（monocyte chemoattractant

protein-1 ; MCP-1）などのサイトカインや増殖因子の発現が認められている7)8)．我もこれまでに PDR

患者硝子体中に血管新生関連因子であるインターロイキン 8（interleukin-8 ; IL8）が上昇していること，in

vitro の網膜グリア細胞や血管内皮細胞にTNF-αが作用すると IL8，MCP1や bFGFの発現レベルを上昇

させることなどを明らかにしてきた9)~11)．しかし，これまで蓄積されてきた知見はこれらの少数の因子

だけではなく，より複雑な分子間の相互作用の結果，増殖組織が生成されることを示唆している．

１．ヒトゲノム情報の蓄積は研究の方法論を変えた

2003 年にヒトゲノムDNAの全塩基配列が解明されたことに伴い，ヒト遺伝子産物の構造と機能の情報

が加速度的に蓄積された12)．これに伴い，ゲノム情報を利用した医学研究と臨床応用への興味が急速に広

まり，ゲノム医科学という新しい学問体系が形成された．また，ゲノムワイド（すべての遺伝子領域）で

遺伝子発現パターン（遺伝子発現プロファイルという）を明らかにできるマイクロアレイ法や次世代シー

クエンス法などの解析法が発展した．

一つの個体は，全ての細胞内に同一のゲノムDNAを持つ．ヒト眼球の各組織を構成する特異的細胞群

240

Shigeo YOSHIDA and Tatsuro ISHIBASHI

Department of Ophthalmology, Graduate School of Medical Science, Kyushu UniversityDevelopment of Novel Molecular Targeting Therapy for Diabetic Retinopathy Based on Genome-wide Gene Expression Profiling

はこのゲノム情報をもとに約 2万のタンパク質コード遺伝子を発現しうるが，各細胞で同じように全遺伝

子を発現しているのでなく，その細胞の機能に必要な 1〜2万の遺伝子を各々必要な時期に必要な量だけ

発現している（図 3）．したがって，この遺伝子発現パターンの違いが各組織の形態や機能の特性を規定し

ていることになる．

ゲノムワイドの遺伝子発現解析により，従来の仮説に基づいた少数の遺伝子のみに注目して全体のしく

みを推し量る微小環境研究（演繹的アプローチ）に加えて，まず特定の組織中に発現する数万の全遺伝子

の発現パターンを同定し，全体像を把握してから重要な遺伝子について詳細に検討する研究（帰納的アプ

ローチ）が可能となった12)．

２．増殖組織のゲノムワイド遺伝子発現解析

近年，眼内血管新生病に対して抗 VEGF薬が臨床応用され，単一の分子を標的とした治療が有効である

新規糖尿病網膜症治療薬の創製 241

非増殖網膜症

増殖網膜症

網膜症の病期(国際分類)

硝子体手術

網膜光凝固術

治療

糖尿病黄斑浮腫 抗VEGF薬

網膜症なし

増殖硝子体網膜症

新規増殖抑制薬

図 1 糖尿病網膜症の国際分類と治療糖尿病黄斑浮腫は非増殖・増殖網膜症のいずれからも生じうる．筆者らは従来の治療に加えて新しい眼内増殖抑制薬の創製を目指している．

図 2 増殖糖尿病網膜症（32歳男性）の右眼硝子体手術中の眼底写真．網膜上線維血管増殖組織（矢印）とこれによる牽引性網膜剥離を認める．

図 3 組織特異的遺伝子発現プロファイル遺伝子A：増殖組織で高発現．遺伝子 B：正常網膜で高発現．遺伝子 C：両組織で同程度にわずかに発現．VEGFは増殖組織で比較的高発現あるが，正常網膜でも一定の発現がある．網膜でほとんど発現がなく，増殖組織で有意に発現の高い遺伝子（矢印）が網膜上線維血管増殖組織の治療の分子標的として理想的と考えられる．

こと，硝子体注射が安全・確実な投与経路であることが示された（図 4）．しかし増殖組織の抑制効果は限

定的であり，増殖組織の病因に基づいた抗 VEGF薬以外の新たな分子標的薬の創製が期待される．

それでは VEGF以外の重要な分子標的はどうしたら明らかにできるのであろうか？我々は，患者サン

プルに全体像を把握できるゲノム医科学的手法を適用することで，真に患者に役立つ新しい治療の分子標

的を同定できると考えた．この目標に向け，2002 年より硝子体手術時に採取した増殖組織のゲノムワイド

遺伝子発現解析を基盤とした新しい分子標的療法を開発する試みを行ってきた（図 5）．

もし，ゲノムワイドで増殖組織の遺伝子発現パターンを明らかにし，網膜でほとんど発現がなく，増殖

組織で有意に発現の高い特徴的遺伝子を同定できれば，当該分子を抑制する分子標的薬は，網膜にはほと

んど障害を与えることなく，増殖組織のみを抑制する薬剤となることが期待される（図 3）．

これまで眼科領域では，米国国立眼研究所（National Eye Institute : NEI）バンクプロジェクトなどによ

り，ヒト網膜や RPE などのゲノムワイド遺伝子発現解析が報告されているが12)13)，極小検体である増殖

組織のゲノムワイド遺伝子発現解析は行われてこなかった．この理由の 1つとしてヒト ERMの採取組織

量が少量であることが挙げられる．

近年，少量の組織産物から PCR 法を用いた比較的簡便な cDNA ライブラリの作成法（Switching

Mechanism At 5' end of RNA Transcript ; SMART法）が開発されている14)15)．この方法ではファースト

ストランド cDNAの 3'末端にシトシン残基を付加するMMLVリバーストランスクリプターゼの特性を

利用している．3つのグアニン残基をもつ RNAオリゴヌクレオチドが反応液中に存在すると，これが付

加した 3つのグアニン残基とハイブリダイズし，延長した逆転写の鋳型となる．スマート法を用いてヒト

増殖組織からゲノムワイドの遺伝子配列を決定し，公のデータベースと照合して発現遺伝子の注釈づけを

行い，日本DNAデータバンク（DNAData Bank of Japan ; DDBJ）と共同で増殖組織のデータベースを作

成した16)17)．

このデータベースを用いて増殖組織とより増殖の緩やかな続発黄斑上膜（ERM）との遺伝子発現パター

ンの比較を行ったところ，PVR由来増殖組織では続発ERMと比較して細胞接着や増殖に関与する遺伝子

群の発現頻度が高値を示していた17)．この PVR でより発現頻度の高い遺伝子群は網膜上増殖の活動性を

規定していると考えられ，ペリオスチンを含んでいた．

さらに，増殖組織と正常網膜由来の RNAを用いて 4万遺伝子のマイクロアレイ解析を行い，網膜での

発現がほとんど無く，増殖組織で有意に高発現である増殖組織特徴的遺伝子を約 100 遺伝子抽出した（図

6，7）．この解析においてもペリオスチンが含まれていた．また，増殖組織特徴的遺伝子群は，VEGF関連

シグナル伝達因子を含んでいないことが明らかとなった（図 7）．このことは，日常臨床でしばしばみかけ

る増殖組織の段階において，もはや VEGFは主役ではないことを示唆している．

以上の 2つのゲノムワイド遺伝子発現解析により，ペリオスチンは増殖組織特徴的遺伝子かつ活動性規

定遺伝子であることが明らかとなった．したがってペリオスチン蛋白は，増殖組織で特異的に発現が誘導

され，その増殖活性を促進している重要分子であると考えられた．

３．ペリオスチンの増殖組織への関与

ペリオスチンは fasciclinファミリーに属し，細胞外マトリックスに存在し生理活性を示すマトリセル

ラー蛋白質である．N末端から，シグナルペプチド，システインリッチドメイン，4つの繰り返し配列とC

末端の親水性ドメインから成る（図 8)18)19)．炎症病態において transforming growth factor-β（TGF-β）

により発現が誘導される．また fasciclin1 と transforming growth factor beta-induced（TGFBI）との高い

相同性から細胞接着や遊走に関与することが示唆されている19)．

ペリオスチンは膵臓，大腸，卵巣，口腔，肺の悪性腫瘍で高い発現がみられ，その発現が高いほど腫瘍

の悪性度が高いことが報告されている19)．心臓においては，血管新生を促進し，マトリックスメタロプロ

テアーゼ（matrix metalloproteinases : MMPs）の産生により心臓弁複合体の退化を誘導する20)．また，気

管支喘息21)，骨髄線維症22)やアトピー性皮膚炎23)における線維化にも関与する．

吉 田 茂 生 ・ 石 橋 達 朗242

新規糖尿病網膜症治療薬の創製 243

図 4 硝子体注射法散瞳，局所麻酔および広範囲抗菌点眼剤を点眼後，眼周囲皮膚，眼瞼縁や睫毛に消毒液を塗布し，滅菌ドレープで被覆する．滅菌開瞼器で開瞼後，消毒用点眼液を投与し，結 膜 囊 内 を 消 毒 す る．角 膜 輪 部 の3.5〜4.0 mm の部分から，水晶体に接触しないよう眼球の中心に向けて 30 ゲージ針を刺入し，薬剤 0.05 mL を硝子体内にゆっくり注入する．最後に広範囲抗菌点眼剤を再度点眼する．

患者サンプルの収集・データベース化増殖組織・血清・硝子体サンプル

モデルシステムによる検証In vitro細胞培養系、虚血網膜血管新生モデルなど

増殖組織のゲノムワイド遺伝子発現解析EST解析・マイクロアレイ解析(4万遺伝子)

高 vs 低活動性増殖組織

分子標的治療の臨床展開増殖組織の特異的抑制薬

ケミカル増殖膜切除に適した硝子体融解薬剤

分子標的薬創製(RNAi、中和抗体）

網膜 vs 増殖組織

増殖組織特徴的遺伝子群の抽出 活動性規定遺伝子群の抽出

産学連携製薬

知的財産化

I.分子標的抽出期

II.分子標的薬創製期

III.臨床応用期

図 5 ゲノムワイド遺伝子発現解析による新しい眼内増殖抑制薬創製の戦略．

図 6 増殖組織特徴的遺伝子群正常網膜，増殖糖尿病網膜症由来増殖組織（PDR），増殖硝子体網膜症由来増殖組織（PVR）からcRNAプローブを作成し，マイクロアレイ解析を行った．網膜で低発現かつ増殖組織で高発現の増殖組織特徴的遺伝子を抽出し，階層的クラスタリングにより視覚化した．増殖組織特徴的遺伝子群の中にペリオスチンが含まれていた．青は低発現，赤は高発現を示す．

図 7 糖尿病網膜症に伴う増殖組織の形成過程と関連因子網膜虚血が重要な前駆病変であり，血管新生，線維芽細胞，マクロファージ（Mφ）の遊走，線維性増殖と収縮（牽引性網膜剥離）のプロセスを経る．増殖組織のゲノムワイド遺伝子発現解析により，赤枠内の病態を反映する増殖組織特徴的遺伝子群を抽出した．VEGF（血管内皮増殖因子）はこの特徴的遺伝子群には含まれておらず，前駆病変の網膜虚血で主に産生が亢進し，以後漸減すると考えられる．

図 8 ペリオスチンの構造N末端から EMI ドメイン，4つの fasI ドメインからなる．C末端近傍にはスプライスバリアント領域が存在する．

ペリオスチン蛋白質の増殖組織中の局在を明らかに

するため，ペリオスチン抗体および血管平滑筋細胞の

マーカーであるα-smooth muscle actin（α-SMA）に

対する抗体を用いて増殖糖尿病網膜症（PDR）患者の

線維血管増殖組織切片の免疫染色を行ったところ，増

殖組織中のα-SMA陽性細胞に共染色され，一部管腔

様構造にも認められた24)．したがってペリオスチン

は，線維芽細胞および周皮細胞に発現していると考え

られた24)．

次に PDR 患者由来硝子体液 106検体，黄斑円孔あ

るいは ERM 患者由来硝子体液 31検体を用いてペリ

オスチン蛋白質の定量を行ったところ，PDR 患者由

来硝子体液（9.09 ng/ml）ではコントロールに比べ有

意に高値を示した（図 9）．さらに PDRの 106眼でペ

リオスチンと VEGF 濃度の相関を検討したところ，

ペリオスチンと VEGF との有意な相関はなかった24)．

このことは，ペリオスチンと VEGFは独立した分子

経路を介して増殖組織形成に関与することを示してい

る．

In vitroで，ペリオスチン蛋白の投与により，増殖

組織の構成細胞の一つであるヒト RPEの増殖，遊走，

接着が亢進した（論文投稿中）．また，野生型（WT）及びぺリオスチン完全 KO（Knockout）マウスを用

いて虚血網膜血管新生モデルを作成し，網膜面上に生じる病的血管新生量を比較した．KOマウスでは

WTに比し，網膜上増殖は著明に抑制されたが，網膜内に伸長する生理的血管新生に差は認めなかった

（論文準備中）．

前述のように，近年抗 VEGF薬が臨床応用され一定の成果を挙げているが，網膜血管閉塞や脳梗塞など

の有害事象も報告されている25)26)．この事実は，中枢神経系における VEGF の恒常的な発現に起因し

（図 3），VEGF阻害が予期せぬ正常網膜の障害をもたらしうることを示唆している27)．

一方，ペリオスチンは正常網膜ではほとんど発現が認められず（図 6），正常網膜での役割は非常に小さ

いと考えられる24)．したがって網膜への副作用の少ない，病態特異的な治療標的となる可能性がある．

４．ペリオスチン標的核酸医薬の創製

１）核酸医薬品の特性

PDR において，ペリオスチンと VEGF の相関が無かったこと24)および増殖組織特徴的遺伝子が VEGF

シグナル関連遺伝子を含んでなかったより，ペリオスチンを標的とした分子標的薬を創製できれば，抗

VEGF薬と組み合わせて用いることができる可能性がある．そこで，新しいペリオスチン分子標的薬を開

発する目的で，低分子医薬品・抗体医薬品に次ぐ次世代の医薬プラットフォームとして注目を浴びつつあ

る核酸医薬品に着目し，日本発のペリオスチン標的核酸医薬品の創製を開始した．

核酸医薬品は DNAや RNAの成分である 4種類の塩基が十数個〜数十個つながった鎖状の構造を持ち，

そのものが機能を持つ医薬品の総称である．抗体医薬品と同様，生体分子を用いるため従来の低分子化合

物に比べて副作用が格段に低いと考えられる．また，抗体医薬品と比べても中和自己抗体の発生が低いと

予想される上，製造プロセスで組み換え微生物や細胞培養などによる生産の必要がなく，安定した品質管

理が可能である．

吉 田 茂 生 ・ 石 橋 達 朗244

図 9 増殖糖尿病網膜症患者硝子体中のペリオスチン蛋白レベル．増殖糖尿病網膜症患者（n=106）と対照コントロール（黄斑上膜；n=10 と黄斑円孔；n=21）患者硝子体中のペリオスチン蛋白レベルを ELISA法により測定した．増殖糖尿病網膜症患者からの硝子体ではペリオスチン蛋白が有意に増加している．ERM=黄斑上膜；MH=黄斑円孔；PDR=増殖糖尿病網膜症．*P＜ 0.0001.

２）二本鎖 siRNA（small interfering RNA）

核酸医薬品には，転写を阻害するアンチジーン核酸，デコイ核酸，翻訳を阻害するアンチセンス核酸，

siRNA（small interfering RNA），miRNA（microRNA），リボザイム，タンパク質に結合してその働きを阻

害するアプタマーなどがある．このうち siRNAは，細胞内に導入されると切れ味（効果）が鋭いメッセン

ジャー（m）RNAからのタンパク質合成抑制効果を示す．この現象は RNA干渉とよばれ，広く生命体に

備わる生体反応機構である．標準的な RNA干渉医薬品は，この生体反応機構を利用して人工的に二本鎖

RNAを導入することで，特定の遺伝子発現を抑制し，疾患の原因となるタンパク質の産生を妨げること

で治療しようとする手法である．

このように副作用が少なく，特異的，効果的に標的分子を抑制する RNA干渉医薬品は難治性眼疾患の

夢の治療薬となる可能性を秘めている．しかし，前述のように RNA干渉医薬品として現在広く用いられ

ているのは二本鎖 siRNAであり，二本鎖 RNAを認識するToll様受容体（TLR)-3 を活性化し，自然免疫

（炎症）を惹起してしまうことが知られている28)．このTLR-3 を介する自然免疫の亢進は，二本鎖 RNA

の構造に依存し，塩基配列とは無関係に生じる．加えて通常の二本鎖 siRNA医薬品は米国のAlnylam社

が主要特許を押さえており，本プラットフォームを用いた創薬は我が国からの参入が難しいのが現状である．

３）革新的ペリオスチン標的一本鎖核酸医薬（nkRNA）の創製

最近この二本鎖 siRNA における 2つの問題点を回避する新技術である革新的一本鎖 RNA干渉医薬品

「nkRNA」が我が国で開発された29)．nkRNAは「1 本鎖長鎖 RNA」と「1 本鎖 RNA内相補鎖の水素結合

による特異的な 2次構造」を特徴とする（図 10）．図 10 の枠線（点線）内に任意の二本鎖発現抑制配列を

組み込むことが可能である．nkRNAには，標準的な二本鎖 siRNAと比べ，化学修飾なしに生物学的に安

定，Toll-like Receptor（TLR)-3 を介した自然免疫応答を回避，生産が容易，日本独自の技術，などの利点

がある．

そこで我々はこの革新的一本鎖核酸医薬をプラットフォームとして，ペリオスチンの異なる部位を標的

とした nkRNAを数十種類作成し，ペリオスチン遺伝子を 95%以上抑制する「最強配列」を同定した．さ

らに，in vivo虚血網膜血管新生モデルにおいて，この「最強配列」ペリオスチン標的 nkRNAは正常組織

に明らかな障害を及ぼすことなく網膜血管新生を著明に抑制することを確認している（論文準備中）．さ

新規糖尿病網膜症治療薬の創製 245

図 10 新的一本鎖長鎖 nkRNAと二本鎖 siRNAnkRNAは RNA核酸が分子内結合により折り返され二重鎖となる，独特の分子構造を持つ．黒の枠線（点線）部に任意の二本鎖 RNA干渉配列を組み込むことができる．

らに我々は，この「最強配列」ペリオスチン標的 nkRNAの臨床応用へ向けた準備をすすめている．

おわりに

医療が常に待ち望んでいるのは難治性疾患に対する革新的な技術の開発とその治療応用である．難治性

疾患に対する新しい分子標的治療薬の開発においては，前提として真に患者に役立つ標的分子の同定が重

要であり，臨床の問題点を熟知した「研究する臨床医」の役割は大きいと考えられる．臨床への還元を念

頭に分子標的の抽出を試みる場合，患者サンプルを出発点とした研究を行うのは理にかなっており，その

方法論としてゲノム医科学的アプローチは有効であった．

本稿で述べたペリオスチン標的核酸医薬品の開発プロジェクトは臨床応用と製剤化にむけて 2012度か

ら科学技術振興機構（JST）により研究成果最適展開支援プログラム（A-STEP）に採択された．さらに

2013 年 4 月には，産業革新機構からの支援も決定した．今後，産学官の連携により，2015 年度には，革新

的ペリオスチン標的核酸医薬の第一相臨床試験が始まる見込みである．近い将来，オープンイノベーショ

ン（新技術・新製品の開発に際して，組織の枠組みを越え，広く知識・技術の結集を図ること）によりこ

の画期的新薬が臨床応用され，DR患者の治療予後向上につながることが期待される．

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（参考文献のうち，数字がゴシック体で表示されているものについては，著者により重要なものと指定された分です．）

新規糖尿病網膜症治療薬の創製 247

吉 田 茂 生 ・ 石 橋 達 朗248

吉田 茂生（よしだ しげお）

九州大学講師．医博．

◆略歴：1968年福岡市に生る．1993 年九州大学医学部卒業．1999 年九州大学大学院医学系研究科

卒業（生化学）．1999 年ミシガン大学眼科研究員．2002 年九州大学眼科助手（現助教）．2007 年福岡

大学筑紫病院眼科講師．2010 年より現職．

◆研究テーマと抱負：ゲノム医科学的手法を用いた網膜硝子体疾患に対する新規分子標的薬の開発

が主な研究テーマです．眼科医として現役の間に日本発の新しい眼内増殖抑制薬を臨床に定着させ

ることを目標に研究を続けています．

◆趣味：音楽鑑賞，カラオケ

プロフィール