Determinación de cadenas ligeras: totales y libres. Aspectos prácticos e

interpretación de resultados

Elena Hernández Álvarez Residente de Bioquímica Clínica

Introducción

Cadenas ligeras libres (CLLs)

o  Son pequeños polipéptidos de peso molecular 22-25 KDa que contienen ≈ 212 residuos de aminoácidos.

o  Las células plasmáticas producen 500mg/día à κ=2λ

n  Cadenas libres kappa: o  mezclas constituidas por monómeros y dímeros no covalentes

disociables y especies truncadas.

n  Cadenas libres lambda: o  Dímeros covalentes.

Aclaramiento renal diferencial

CLL κ:

Monómero Peso molecular: 22,5 kDa Aclaramiento renal: 40% t1/2 suero 2-4 horas

CLL λ: Dímero Peso molecular: 45 kDa Aclaramiento: 20% t1/2 suero 3-6 horas.

Cadenas ligeras libres

2κ ≈ λ

ACLARAMIENTO SÍNTESIS

Concentración de CLLs en suero

Intact  Immunoglobulin   Light  chain  only   Nonsecretory  

Mul6ple  myeloma  

AL  Amyloidosis  LCDD  

Kappa  FLC  

Lambda  FLC  

Plasma  cell  

MGUS  

Gammapatías monoclonales

o  Detección

n  Electroforesis en suero (SPEP) n  Electroforesis en orina (UPEP)

o  Identificación n  Inmunofijación (SIFE) n  Inmunofijación en suero (UIFE)

o  Cuantificación n  Nefelometría

o  Ensayo de cadenas ligeras totales (CLTs) o  Ensayo de cadenas ligeras libres (CLLs)

20  g/L

Serum  Protein  Electrophoresis:

Paraproteina =    banda anormal en  el  gel  de  electroforesis

Nefelometria:+  Analiticamente  precisa  para  bajas  concentraciones-­‐ Cuantifica  tanto  la  proteina  monoclonal  como  el  background  policlonal

20  g/L

Serum  Protein  Electrophoresis:

20  g/L

Serum  Protein  Electrophoresis:

Paraproteina =    banda anormal en  el  gel  de  electroforesis

Nefelometria:+  Analiticamente  precisa  para  bajas  concentraciones-­‐ Cuantifica  tanto  la  proteina  monoclonal  como  el  background  policlonal

Determinación de cadenas ligeras (CL)

Albα1 β1α2 β2 γ

Polyclonal  antibodies(g/L)

Serum  Protein  Electrophoresis  

(SPE)

Normal  serum SPE:+  Test  sencillo-­‐ Baja  sensibilidad  (>1-­‐3g/L),  especialmente  en  los  casos  en  que  la  paraproteina  comigra  con  otras  bandas,  como  la  transferrina  o  el  C3

IFE:+  Mas  sensible  que  la  SPE-­‐ Método  no  cuantitativo;  requiere  interpretación

Albα1 β1α2 β2 γ

Polyclonal  antibodies(g/L)

Serum  Protein  Electrophoresis  

(SPE)

Normal  serum SPE:+  Test  sencillo-­‐ Baja  sensibilidad  (>1-­‐3g/L),  especialmente  en  los  casos  en  que  la  paraproteina  comigra  con  otras  bandas,  como  la  transferrina  o  el  C3

IFE:+  Mas  sensible  que  la  SPE-­‐ Método  no  cuantitativo;  requiere  interpretación

Albα1 β1α2 β2 γ

Polyclonal  antibodies(g/L)

Serum  Protein  Electrophoresis  

(SPE)

Normal  serum

Albα1 β1α2 β2 γ

Polyclonal  antibodies(g/L)

Serum  Protein  Electrophoresis  

(SPE)

Normal  serum SPE:+  Test  sencillo-­‐ Baja  sensibilidad  (>1-­‐3g/L),  especialmente  en  los  casos  en  que  la  paraproteina  comigra  con  otras  bandas,  como  la  transferrina  o  el  C3

IFE:+  Mas  sensible  que  la  SPE-­‐ Método  no  cuantitativo;  requiere  interpretación

CLLs en suero vs CLTs

v  Intervalos de normalidad muy diferentes. - La cantidad circulante de CLL es muy baja comparada con la cantidad de CLT. - El ensayo de CLT no tiene sensibilidad para distinguir variaciones en los niveles de CLLs. v  Pocos datos clínicos publicados sobre el ensayo de CLT vs más de 1400 sobre CLLs.

v  CLT - no recomendadas para evaluación del MM.

TOTALES

Ratio κ/λ

CL κ CL λ Ratio κ/λ

CLTs Siemens 1,3-3,7 g/L 0,9-2,1 g/L 1,35-2,65

CLLs Freelite 3,3-19,4 mg/L 5,7-26,3 mg/L 0,26-1,65

CLLs N Latex 6,7-22,4 mg/L 8,3-27 mg/L 0,31-1,56

o  Gammapatía policlonal à se mantiene el ratio o  Gammapatía monoclonal à desviación del ratio

n  Aumento del ratio à CL κ n  Disminución del ratio à CL λ

LIBRES

Ratio κ/λ

Con

centración

 de  ca

dena

s  lig

eras

,  mg/L

1

10

100

1000

κ &  λtotal

R ango Normal  en  S uero

R ango Normal  en  Orina

S PE P500  – 2000  mg/L C ZE

400  mg/Ls IF E

150  – 500  mg/L

UPE PuIF E

Con

centración

 de  ca

dena

s  lig

eras

,  mg/L

1

10

100

1000

κ &  λtotal

R ango Normal  en  S uero

R ango Normal  en  Orina

S PE P500  – 2000  mg/L C ZE

400  mg/Ls IF E

150  – 500  mg/L

UPE P

Con

centración

 de  ca

dena

s  lig

eras

,  mg/L

1

10

100

1000

κ &  λtotal

R ango Normal  en  S uero

R ango Normal  en  Orina

S PE P500  – 2000  mg/L C ZE

400  mg/Ls IF E

150  – 500  mg/L

UPE P

Con

centración

 de  ca

dena

s  lig

eras

,  mg/L

1

10

100

1000

κ &  λtotalκ &  λtotal

R ango Normal  en  S uero

R ango Normal  en  Orina

S PE P500  – 2000  mg/LS PE P500  – 2000  mg/L C ZE

400  mg/LC ZE400  mg/L

s IF E150  – 500  mg/L

s IF E150  – 500  mg/L

UPE PUPE PuIF EuIF EuIF E

Sensibilidad  de  las  técnicas  de  ensayo  de  CLL    

Adapted from Bradwell et al. Serum Free Light Chain Analysis.

3rd ed. 2005. The Binding Site, Ltd.

Sensibilidad de las técnicas de ensayo de CLL

IgGλ  Monoclonal  

Proteinuria de Bence Jones (PBJ)

o  Marcador biológico de malignidad desde hace más de 150 años (The Lancet, 1847).

o  Son cadenas l i ge ras l i b res monoc lona les d e inmunoglobulinas o sus fragmentos, secretadas por células B derivadas de un único clon que prolifera.

o  Aparecen en orina cuando la producción supera la capacidad de reabsorción tubular renal.

o  Presentes en la orina como moléculas intactas, formas incompletas o fragmentos y con un grado de polimerización variable (monómeros, dímeros, y formas poliméricas (tetrámeros y formas aberrantes) de alto peso molecular.

n  Muestra o  Orina de 24 horas o  Segunda orina o  Orina aleatoria

n  Pretratamiento

o  Centrifugar a 400 x g, 10 min para eliminar partículas y precipitados.

o  Concentrar la muestra n  Si no se dispone de métodos con adecuada sensibilidad n  Métodos: Absorción de la fase acuosa o por ultracentrifugación

- Elevado coste - Tiempo - Desnaturalización de las proteínas - Pérdidas por adsorción y por filtración

Análisis PBJ: preanalítica

Análisis PBJ en el laboratorio o  Inmunofijación à Método de elección

n  Sensibilidad: 10mg/L n  Inconveniente:

o  Patrón en escalera de CLLs policlonales: n  Sin significado clínico. n  Dificulta interpretación de PBJ

o  Electroforesis n  En gel de agarosa à densitometría

o  Sensibilidad 100mg/L o  Colorantes sensibles y concentrar muestras

n  Capilar à múltiples substancias en la orina absorben radiación en la región UV.

o  Métodos inmunoquímico: n  Cribado de PBJ à si resultado positivo, realizar UPEP, UIF. n  Limitaciones:

o  Presencia en orina de diferentes especies moleculares de cadenas ligeras libres policlonales y monoclonales, como formas poliméricas y fragmentos con masa molar altamente variable.

o  Reactividad cruzada. o  Exceso de antígeno.

PBJ – Utilidad Clínica

n  En caso de sospecha clínica o de laboratorio de:

o  mieloma de CLs (adultos con hipogammaglobulinemia).

o  Amiloidosis AL asociada a cadenas ligeras o enfermedad por depósito de cadenas ligeras.

n  En las gammapatías monoclonales como marcador pronóstico de la evolución.

n  En la evaluación del estado de remisión en pacientes con mieloma múltiple tras quimioterapia intensiva y transplante autólogo de médula ósea.

CLLs en suero vs CLLs en orina

Cuantificación de CLLs en suero

CLTs CLLs

o  Métodos de determinación:

n  La medida de la concentración de las CLLs se basa en métodos inmunoquímicos.

n  Se utilizan anticuerpos dirigidos a epítopos de las CLs ocultos en las inmunoglobulinas intactas.

n  Estos epítopos quedan expuestos cuando no están asociadas a las cadenas pesadas.

n  Los Ac están dirigidos frente a las regiones constantes de las CLs, que tienen poca variación estructural.

Determinacción de CLLs en suero o  Existen dos métodos:

n  Freelite (The Binding Site, Reino Unido, 2001): o  Método inmunoquímico con aplicación nefelométrica

y turbidimétrica adaptado a diferentes analizadores. o  Anticuerpos policlonales de oveja.

n  N Látex FLC (Siemens Healthcare Diagnostic, Marburg, Alemania, 2009): o  Inmunonefelométrico. o  Anticuerpos monoclonales de ratón.

Anticuerpos policlonales vs monoclonales

Determinacción de CLLs en suero

o  Estandarización n  No existe material de referencia certificado ni patrón

internacional.

n  Material de calibración: o  Freelite:

n  CLLs policlonales altamente purificadas procedentes de una mezcla de sueros de pacientes con lupus eritematoso diseminado. Valorado frente a calibrador primario preparado por The Binding Site a partir de CLLs monoméricas policlonales altamente purificadas, obtenidas de Igs G completas de una mezcla de sueros.

o  N Latex FLC: n  Solución de CLLs policlonales, purificadas en PBS con 10g/L de

albúmina.

Determinación de CLLs en suero

o  Valor κ (mg/L) n  Freelite: 3,3-19,4 n  N Latex: 6,7-22,4

o  Valor λ (mg/L) n  Freelite: 5,7-26,3 n  N Latex: 8,3-27

o  Ratio κ/ λ n  Freelite: 0,26-1,65 n  N Latex: 0,31-1,56

o  Screening

n  Recomendado en combinación SPE y sIFE n  En MM, sFLC puede sustituir la uIFE 24 h* *En el screening de amiloidosis AL la uIFE 24 h sigue siendo recomendada

o  Pronóstico

n  CLLs deben ser determinadas en el momento del diagnóstico en todos los pacientes con MGUS, SMM o MM, plasmacitoma solitario y amiloidosis AL.

o  Evaluación de la respuesta n  Determinaciones seriadas de CLLs deberán ser realizadas de

forma rutinaria en: o  Amiloidosis AL o  MM Oligosecretor o  Todos los pacientes para definir respuesta completa estricta

Determinación de CLLs en suero: aplicaciones

“Interna6onal  guidelines  for  sFLC  analysis  in  MM”  and  related  disorders”  Dispenzieri et al. Leukemia epub 20 Nov 2008

Determinación de CLLs en suero

o  Ventajas: n  Identificar proteína monoclonal a concentraciones no

detectables por electroforesis o por otro método inmunoquímico.

n  Cociente κ/λ alterado à persistencia de la proteína monoclonal.

n  Marcador de respuesta al tratamiento y detector precoz de recidivas.

o  Limitaciones: n  Falta de estandarización

o  Diferentes intervalos de referencia à establecer valores de referencia propios de cada laboratorio.

n  Falta de experiencia

¡Muchas gracias!