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MAPA/SDA/CGAL Laboratório Nacional Agropecuário - LANAGRO/RS Laboratório de Produtos de Origem Animal/SLAV Método de Ensaio – MET Código: MET POA/SLAV/30/02/01 Página 1 de 12 Emissão: 27/02//2014 Detecção de β-lactoglobulina em queijos por eletroforese em gel de poliacrilamida 1 Escopo O presente método tem por finalidade avaliar a presença da proteína β-lactoglobulina em amostras de queijos (Minas Frescal, Mussarela e Prato), utilizando a técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida. 2 Fundamentos Neste método, é utilizada a acrilamida, que através de co-polimerização com a bis- acrilamida e na presença de catalisadores de polimerização como o persulfato de amônio e o N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina (TEMED), forma gel, meio no qual ocorre a separação das proteínas. O sistema descontínuo utilizado consiste de dois géis, o gel de separação e o gel de empilhamento. Enquanto no gel de empilhamento as moléculas de proteínas concentram-se numa banda estreita e compacta, no gel de separação elas se separam de acordo com as respectivas massas moleculares. As condições desnaturantes, através da utilização de dodecil-sulfato de sódio (SDS) e de 2-mercaptoetanol (2-ME), facilitam a solubilização e auxiliam na separação das proteínas. O SDS se liga às moléculas de proteínas, gerando um aumento de cargas negativas, tornando-as praticamente indistinguíveis do ponto de vista de carga. O 2-ME age no rompimento das pontes dissulfeto das proteínas e facilita o acesso do SDS. Dessa forma, há uma normalização das cargas e das formas das proteínas que o elemento de distinção entre essas passa a ser as suas massas moleculares. Na eletroforese, uma maior distância de migração é observada para as proteínas com menor massa molecular, e vice versa. A β-lactoglobulina (β-LG) é uma proteína do soro de leite com massa molecular de aproximadamente 18 kDa. A presença da banda de β-LG nos perfis eletroforéticos de amostras de queijo Minas Frescal, Mussarela e Prato, identificada por comparação da sua mobilidade eletroforética com padrão de β-LG, é um marcador de adulteração, indicando a utilização de soro de leite na elaboração desses produtos lácteos.

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Detecção de β-lactoglobulina em queijos por eletroforese em gel de poliacrilamida

1 Escopo

O presente método tem por finalidade avaliar a presença da proteína β-lactoglobulina em

amostras de queijos (Minas Frescal, Mussarela e Prato), utilizando a técnica de eletroforese

em gel de poliacrilamida.

2 Fundamentos

Neste método, é utilizada a acrilamida, que através de co-polimerização com a bis-

acrilamida e na presença de catalisadores de polimerização como o persulfato de amônio e o

N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina (TEMED), forma gel, meio no qual ocorre a separação das

proteínas.

O sistema descontínuo utilizado consiste de dois géis, o gel de separação e o gel de

empilhamento. Enquanto no gel de empilhamento as moléculas de proteínas concentram-se

numa banda estreita e compacta, no gel de separação elas se separam de acordo com as

respectivas massas moleculares.

As condições desnaturantes, através da utilização de dodecil-sulfato de sódio (SDS) e

de 2-mercaptoetanol (2-ME), facilitam a solubilização e auxiliam na separação das proteínas.

O SDS se liga às moléculas de proteínas, gerando um aumento de cargas negativas,

tornando-as praticamente indistinguíveis do ponto de vista de carga. O 2-ME age no

rompimento das pontes dissulfeto das proteínas e facilita o acesso do SDS. Dessa forma, há

uma normalização das cargas e das formas das proteínas que o elemento de distinção entre

essas passa a ser as suas massas moleculares. Na eletroforese, uma maior distância de

migração é observada para as proteínas com menor massa molecular, e vice versa.

A β-lactoglobulina (β-LG) é uma proteína do soro de leite com massa molecular de

aproximadamente 18 kDa. A presença da banda de β-LG nos perfis eletroforéticos de

amostras de queijo Minas Frescal, Mussarela e Prato, identificada por comparação da sua

mobilidade eletroforética com padrão de β-LG, é um marcador de adulteração, indicando a

utilização de soro de leite na elaboração desses produtos lácteos.

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3 Reagentes, padrões e materiais

Todos os reagentes são de grau analítico, exceto quando especificado. A água utilizada nos

procedimentos deve ser de grau ultrapuro e recém-obtida.

3.1 Reagentes

- 2-mercaptoetanol;

- Ácido acético;

- Ácido clorídrico (HCl) 6 M;

- Acrilamida;

- Azul de bromofenol;

- Azul de Coomassie R-250;

- Bis-acrilamida;

- Glicerol;

- Glicina;

- Metanol;

- Persulfato de amônio;

- SDS (dodecil-sulfato de sódio);

- TEMED (N,N,N´,N´-tetrametiletilenodiamina);

- Tris base (hidroximetil) aminometano.

3.2 Materiais

- Becker com capacidade de 100 mL;

- Funil;

- Micropipeta e ponteiras para faixa de volume de 5 a 50 µL;

- Micropipeta e ponteiras para faixa de volume de 20 a 200 µL;

- Micropipeta e ponteiras para faixa de volume de 100 a 1000 µL;

- Micropipeta e ponteiras para faixa de volume de 100 a 5000 µL;

- Microtubos com capacidade de 1,5 mL;

- Papel de filtração qualitativa;

- Proveta com capacidade de 100 mL;

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- Proveta com capacidade de 1 L;

- Tubo tipo falcon com capacidade de 15 e 50 mL;

- Vasilha plástica para a coloração dos géis.

4 Equipamentos

- Agitador orbital;

- Balança analítica;

- Balança semi-analítica;

- Banho-maria;

- Conjunto para corrida eletroforética (composto de: placas de vidro internas e externas;

borrachas de vedação; pentes espaçadores; cuba de eletroforese com tampa; módulo de

preparo dos géis; separador para aplicação das amostras);

- Fonte de energia para eletroforese;

- Liofilizador;

- Potenciômetro.

5 Precauções analíticas

Este método emprega substâncias químicas nocivas e procedimentos que podem

representar risco ao operador. Equipamentos de proteção individual apropriados à condução

da análise devem ser utilizados durante todo o processo.

Solventes orgânicos devem ser manipulados em ambientes com exaustão adequada.

Inalação ou ingestão de acrilamida pode causar danos ao sistema nervoso central e

periférico.

Amostras de alimentos em geral devem ser consideradas como de risco biológico,

evitando-se o contato direto com pele e mucosas.

6 Procedimentos

Todos os procedimentos analíticos devem ser registrados no formulário “Dados brutos

– Detecção de β-LG em queijos por eletroforese em gel de poliacrilamida” (Anexo A).

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6.1 Preparo de soluções estoque e tampões

6.1.1 Ácido clorídrico 6 M

Transferir para um balão volumétrico de 100 mL aproximadamente 40 mL de água. Transferir

cuidadosamente 50 mL de ácido clorídrico, sob exaustão e com o auxílio de uma pipeta

volumétrica, para o balão e completar o volume com água. Homogeneizar.

6.1.2 Acrilamida/Bis-acrilamida (30% T, 2,67% C)

Dissolver 29,2 g de acrilamida e 0,8 g de bis-acrilamida em 100 mL de água. Filtrar e

armazenar sob refrigeração e ao abrigo da luz (validade: 30 dias).

Alternativamente, utilizar solução de acrilamida/bis-acrilamida, mistura de 37,5:1 (30% T,

2,67% C) (Bio-Rad, catálogo: 161-0158, 500 mL).

6.1.3 Dodecil-sulfato de sódio (SDS) 10% (m/v)

Dissolver 10 g de SDS para balão volumétrico de 100 mL em água. Completar o volume e

armazenar em temperatura ambiente.

6.1.4 Tampão Tris-HCl 1,5M, pH 8,8

Pesar 27,23 g de Tris base (18,15 g/100 mL) e dissolver em 80 mL de água. Ajustar o pH para

8,8 com HCl 6 M. Completar o volume para 150 mL e armazenar sob refrigeração.

6.1.5 Tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8

Pesar 6 g de Tris base e dissolver em 60 mL de água. Ajustar o pH para 6,8 com HCl 6 M.

Completar o volume para 100 mL e armazenar sob refrigeração.

6.1.6 Tampão de amostra (tampão redutor SDS)

Preparar o tampão de amostra com a mistura dos seguintes reagentes:

• Água deionizada: 3,8 mL;

• Tampão Tris HCl 0,5 M, pH 6,8: 1,0 mL;

• Glicerol: 0,8 mL;

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• SDS 10% (m/v): 1,6 mL;

• Azul de bromofenol 0,5% (m/v): 0,4 mL.

Homogeneizar e armazenar em temperatura ambiente.

Adicionar 50 µL de 2-mercaptoetanol para 950 µL de tampão de amostra para cada amostra.

A adição de 2-mercaptoetanol deve ser feita somente antes do uso.

6.1.7 Tampão para corrida (10x), pH 8,3

Preparar o tampão para corrida com a mistura dos seguintes reagentes:

• Tris base: 30,3 g;

• Glicina: 144 g;

• SDS: 10 g.

Dissolver e avolumar para 1000 mL com água. Não ajustar o pH com ácido ou base.

Armazenar sob refrigeração. Em caso de precipitação, deixar à temperatura ambiente antes

do uso.

Diluir 50 mL do tampão com 450 mL de água para cada corrida com dois géis e 100 mL de

solução estoque para 900 mL de água para corrida com quatro géis.

6.1.8 Persulfato de amônio (APS) 10% (m/v)

Pesar 100 mg de APS e dissolver em 1 mL de água. Preparar somente antes do uso.

Alternativamente, alíquotas da solução de APS 10% podem ser armazenadas sob

congelamento.

6.1.9 Solução corante de Azul de Coomassie R-250 0, 3% (m/v) em 40% de metanol e

10% de ácido acético

Pesar 0,3 g de corante Azul de Coomassie R-250 e dissolver em 40 mL de metanol. Após

completar dissolução, filtrar em papel de filtro e misturar com 10 mL de ácido acético e água

q.s.p. para 100 mL. Armazenar em frasco âmbar à temperatura ambiente.

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6.1.10 Solução fixadora (descorante) 40% de metanol e 10% de ácido acético

Misturar 40 mL de metanol com 10 mL de ácido acético e água q.s.p. para 100 mL.

Armazenar em frasco âmbar à temperatura ambiente.

6.1.11 Solução padrão de β-LG 0,5 mg/mL

Pesar 10 mg do padrão de β-LG e dissolver em 20 mL de solução tampão de amostra

adicionada de 2-mercaptoetanol.

6.2 Formulações dos géis

6.2.1 Preparo do gel de separação com 15% de poliac rilamida (10 mL = 2 géis):

• 2,4 mL de água deionizada;

• 5,0 mL de acrilamida/bisacrilamida 30%;

• 2,5 mL de tampão Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8;

• 0,1 mL SDS 10% (m/v).

Homogeneizar e adicionar, para cada 10 mL de solução e imediatamente antes de colocar o

gel entre as placas:

• 50 µL de APS 10% + 5 µL de TEMED

6.2.2 Preparo do gel de empilhamento com 4% de poli acrilamida (10 mL = 2 géis):

• 6,1 mL de água deionizada;

• 1,3 mL de acrilamida/bisacrilamida 30%;

• 2,5 mL de tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8;

• 0,1 mL SDS 10% (m/v).

Homogeneizar e adicionar, para cada 10 mL de solução e imediatamente antes de colocar o

gel entre as placas:

• 50 µL de APS 10% + 10 µL de TEMED

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6.3 Preparo das amostras

As amostras de queijo devem ser trituradas manualmente, congeladas e liofilizadas antes da

análise.

O preparo das amostras para serem aplicadas nos géis inclui as seguintes etapas:

- Pesar 10 mg da amostra liofilizada;

- Adicionar 2,5 mL de tampão de amostra (2,375 mL de tampão de amostra e 125 µL de 2-

ME. Essa mistura deve ser feita imediatamente antes do uso);

- Agitar em agitador orbital por aproximadamente uma hora até completa solubilização da

amostra;

- Aquecer a 95°C por 5 minutos em banho-maria.

6.3.1 Fortificação da amostra branca com β-LG na concentração correspondente ao

nível de ação (0,1 mg/mL)

- Pesagem de 10 mg de uma amostra branca liofilizada;

- Adição de 2,0 mL de tampão de amostra (1,9 mL de tampão e 100 µL de 2-ME. Essa

mistura deve ser feita imediatamente antes do uso);

- Adição de 500 µL de solução de β-LG padrão (0,5 mg/mL);

- Agitação em agitador orbital por aproximadamente uma hora até completa solubilização da

amostra;

- Aquecimento a 95°C por 5 minutos em banho-maria;

- Adição de uma alíquota de 5 µL no gel.

6.4 Aplicação das amostras no gel

Em cada gel deve ser aplicado:

- Amostra branca de queijo (5 µL);

- Amostra branca de queijo fortificada com β-LG na concentração correspondente ao nível de

ação (0,1 mg/mL) (5 µL);

- Amostras de análise de rotina (máximo de seis por gel) (5 µL).

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6.5 Corrida eletroforética

• Após a montagem do sistema de eletroforese (conforme IU POA/SLAV/40/01), introduzir

o módulo com as placas na cuba e preenchê-lo com o tampão de amostra.

• Verificar se não há vazamento do tampão do módulo.

• Proceder à injeção das amostras nos poços.

• Preencher a cuba com o restante do tampão de amostra até o volume indicado (para dois

ou quatro géis).

• Acoplar a tampa da cuba e conectar à fonte de energia.

• Programar a fonte para 200 V (conforme IU POA/SLAV/43/01).

• Encerrar a corrida antes que a linha de migração do corante azul de bromofenol

ultrapasse 1 cm do limite inferior do gel (entre 30 a 45 minutos).

6.6 Coloração dos géis

• Retirar cuidadosamente os géis das placas e colocá-los em contato com a solução

corante.

• Manter os géis no corante sob agitação lenta durante a noite.

6.7 Descoloração dos géis

• Remover a solução corante.

• Lavar os géis com água para a retirada do excesso de corante.

• Mergulhar os géis na solução fixadora (descorante) e submetê-los à agitação lenta.

• Efetuar a troca da solução de descorante até remoção do corante e aparecimento das

bandas.

6.8 Recuperação da solução descorante

A solução descorante usada pode ser recuperada pela filtração da mesma com carvão

ativado até total limpidez.

6.9 Armazenamento dos géis

O armazenamento dos géis pode ser feito em solução de ácido acético 7%.

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6.10 Digitalização e densitometria dos géis

Digitalizar os géis no Densitômetro de imagem (Bio Rad – GS 800) e através do software

Quantity-one® (conforme IU POA/SLAV/41/01) obter a densidade das bandas de β-LG das

amostras analisadas, da amostra branca de queijo e da amostra branca de queijo adicionada

de padrão de β-LG na concentração correspondente ao nível de ação.

7 Resultados

Os valores da densidade das bandas de β-LG obtidos na densitometria dos géis das amostras

analisadas devem ser comparados com o valor da densidade obtido da amostra branca

adicionada de padrão de β-LG na concentração correspondente ao nível de ação (0,1

mg/mL).

Os resultados serão reportados quanto à presença ou ausência da proteína β-LG, sendo

emitido resultado positivo ou negativo, respectivamente.

Para o resultado ser considerado negativo (ausência da proteína β-LG na amostra), o valor

da densidade da banda de β-LG da amostra analisada deve ser menor ao apresentado pela

amostra branca adicionada de padrão na concentração correspondente a 0,1 mg/mL,

conforme exemplo apresentado na Figura 1a para queijo Minas Frescal, 2 para queijo

Mussarela e para queijo Prato 3.

Para o resultado ser considerado positivo , o valor da densidade da banda de β-LG da

amostra analisada deve ser maior ao apresentado pela amostra branca adicionada de padrão

na concentração correspondente a 0,1 mg/mL, conforme exemplo apresentado na Figura 1b

para queijo Minas Frescal.

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Figura 1. Avaliação qualitativa de amostras comerciais de queijo Minas Frescal quanto à presença de β-LG. (a) Exemplo de amostras comerciais que apresentaram resultado negativo. (b) Exemplo de amostras comerciais que apresentaram resultado positivo.

(a) (b)

Figura 2. Avaliação qualitativa de amostras comerciais de queijo Mussarela quanto à presença de β-LG e exemplo de amostras comerciais que apresentaram resultado negativo.

Amostra branca adicionada de β-LG no nível

de ação Amostra branca

Amostras negativas

Amostra branca adicionada de β-LG no nível de

ação Amostra branca

Amostras positivas

Amostra branca adicionada de β-LG no nível

de ação Amostra branca

Amostras negativas

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Figura 3. Avaliação qualitativa de amostras comerciais de queijo Prato quanto à presença de β-LG. Exemplo de amostras comerciais que apresentaram resultado negativo.

8 Arquivamento dos registros

Os formulários de dados brutos são arquivados na pasta “Dados brutos” do POA/SLAV e as

imagens digitalizadas dos géis deverão ser impressas no formulário correspondente (Anexo

A) .

9 Referências

FARRELL, JR., H.M., JIMENEZ-FLORES, R., BLECK, G.T., BROWN, E.M., BUTLER, J.E. et

al. Nomenclature of the proteins of the cows’ milk – sixth revision. Journal of Dairy Science ,

v.87, p.1641-1674, 2004.

LAEMMLI, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature , 227(5259), 680–685.

10 Anexos

Amostra branca adicionada de β-LG no nível de

ação Amostra branca

Amostras negativas

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Anexo A MET POA/SLAV/30/01 Formulário “Dados brutos – Detecção de β-lactoglobulina em

queijos por eletroforese em gel de poliacrilamida”.

11 Alterações

Mudança no título: Detecção de β-lactoglobulina em queijo Minas Frescal por eletroforese em

gel de poliacrilamida por Detecção de β-lactoglobulina em queijos por eletroforese em gel de

poliacrilamida.

Inclusão dos queijos Mussarela e Prato no escopo do método.

Inclusão das Figuras 2 e 3 referentes à avaliação qualitativa de amostras comerciais de

queijo. Mussarela e Prato quanto à presença de β-LG, respectivamente.

Anexo A: acrescentados campos para as amostras 9 e 10.

12 Responsabilidades

O Responsável pelo POA/SLAV deve garantir a elaboração, aprovação, emissão, distribuição

de cópias, implementação, capacitação do pessoal para utilização, gerenciamento de não

conformidades, análise crítica e revisão deste MET.

O Responsável pelo POA/SLAV é responsável pela aprovação técnica deste MET.

A UGQ é responsável pela verificação deste MET.

Elaboração/Revisão: Aprovação: Verificação:

Renata B. Magenis – POA/SLAV Heitor Daguer – POA/SL AV Angélica P. Wielewicki – UGQ

Data: 25/02/2014 Data: 25/02/2014 Data: 27/02/2014