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DESENVOLVIMENTO DE MATRIZES POLIMÉRICAS COMPOSTAS POR POLI (ε-CAPROLACTONA) E POLI (L- ÁCIDO LÁTICO) -

PCL/PLLA - COM TETRACICLINA PELA TÉCNICA DE ROTOFIAÇÃO. M. T.O. Machado¹, J.J.Bonvent¹, M.R.Manhani ², S. A. A. Pinto3, C. A. C. Zavaglia3,

A.R.Santos¹ ¹ Centro de Ciências Naturais e Humanas (CCNH), Universidade Federal do ABC,

Santo André; ²Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de São Paulo, Suzano; 3Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São

Paulo, Brasil.

Resumo. A rotofiação é uma técnica que surgiu para melhorar a produção de

fibras que podem ser usadas na regeneração ou cicatrização tecidual. As lesões de

pele são de grande interesse no mundo industrial, a produção de matrizes

poliméricas com o objetivo de auxiliar a cicatrização são cada vez mais importantes

devido às limitações dos produtos disponíveis. Foram construídas soluções

poliméricas compostas por PCL/PLLA (50/50%) e tetraciclina (TC), pela técnica de

rotofiação. Para analise morfológica foi utilizado o Microscópio Eletrônico de

Varredura (MEV), modelo JCM 6000(Jeol) e microscópio invertido de fluorescência,

modelo DMI 6000 (Leica). Obtivemos materiais fibrosos com diâmetro de fibras entre

2 a 5 µm. As fibras mostraram-se homogêneas na incorporação de TC indicando

uma boa incorporação da tetraciclina ao material. Nossos resultados apontam para a

produção de fibras em escala nanométricas e micrométricas incorporadas com TC,

sugerindo utilização para procedimentos na regeneração e cicatrização tecidual.

Palavras-chave: biomateriais, engenharia de tecidos, poli(ε-caprolactona),

poli(L- ácido lático), tetraciclina, cicatrização.

1.INTRODUÇÃO

Cerca de 1,5 bilhões de pessoas no mundo possuem algum tipo de doenças de

pele como consequência de maus cuidados ou do envelhecimento, apesar dos

avanços recentes na compreensão do processo de cicatrização de feridas e lesões

agudas e crônicas (Valacchi et al., 2012).

Anualmente, segundo dados da OMS, em todo o mundo, 11 milhões de

pessoas sofrem por queimaduras e são atribuídas a elas 300 mil mortes. Além disso,

mais de 6 milhões de pessoas sofrem de úlceras cutâneas, só nos EUA mais de 3

milhões de pacientes sofrem de feridas crônicas (Yildirimer; Thanh; Seifalian, 2012;

Pereira et al., 2013; Sun et al., 2014).

9º Congresso Latino-Americano de Orgãos Artificiais e Biomateriais13º Congresso da Sociedade Latino Americana de Biomateriais, Orgãos Artificiais e Engenharia de Tecidos - SLABO

24 a 27 de Agosto de 2016, Foz do Iguaçu, PR

911

Estima-se que aproximadamente 1,5% da população sofrem de problemas

relacionados com a recuperação adequada da função da pele, citando em especial

os pacientes idosos ou aqueles com arteriosclerose, que podem facilmente sofrer de

úlceras e escaras (Valacchi et al., 2012).

Há um interesse mundial em lesões de pele devido as diferentes situações

clinicas, tais como os traumatismos, infecções, doenças autoimunes e feridas

agudas e crônicas que predispõem á infecções, a perda de água que gera a

hipotermia aumentando a morbidade ocasionando em internações prolongadas com

alto custo e até mesmo levando à morte (Ferreira et al., 2011; Valacchi et al., 2012).

Limitações como o implante de pele, têm impulsionado a procura de meios

alternativos, o interesse por materiais sintéticos ou biológicos que possam ser

utilizados como substitutos cutâneos são notadamente crescente (Atiyeh &

Costagliola, 2007; Ferreira et al., 2011).

A escolha do substituto cutâneo depende de fatores que envolvem o tipo,

tamanho e profundidade da ferida, presença de comorbidades do paciente assim

como a experiência do cirurgião. As opções disponíveis são os aloenxertos

(derivados da pele de cadáver); os xenoenxertos – derivados da pele de animais ou

os sintéticos que são construídos por Engenharia de Tecidos (Ferreira et al., 2011).

A Engenharia de Tecidos, termo criado durante o encontro da National Science

Foundation (NSF) em 1987, é uma técnica que se refere à combinação de métodos

da Biologia Celular e Tecidual com áreas da Engenharia e Cirurgia, para reparar ou

substituir o tecido lesionado e está interligada com a medicina regenerativa (Hench,

1998; Santos Jr et al., 2009; Atala, 2009).

Surgiu para auxilia na resolução do problema dos curativo de pele, a

necessidade de se criar um curativo que seja capaz de interagir com o tecido

lesionado acelerando o processo de cicatrização de modo que o tecido formado seja

o desejado, que a função original seja restabelecida e que o procedimento seja

reprodutível e de baixo custo se faz cada vez mais necessários. Desta forma, nosso

trabalho veio para somar com as poucas informações existentes sobre a rotofiação e

a produção de fibras.



912

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Materiais utilizados.

Os polímeros estudados neste trabalho foram a poli(ε-caprolactona) (PCL) CAS

24980-41-04 com massa molar reportada de 70.000 g/mol, comprados da empresa

Sigma Aldrich e o poli L- ácido lático (PLLA) com massa molecular entre 185.000 e

259.000g/mol CAS 4511-42-6-95-6-5 fornecidos pela empresa PURAC. Os solventes

utilizados foram clorofórmio [CHCL3, 99%], acetona [(CH3)2CO, 99.5%] e

Dimetilformamida (CH3)2NC(O)H todos obtidos pelo laboratório Sigma Aldrich.

2.2. Preparação de solução da Blenda de PCL/PLLA.

Os polímeros foram utilizados nas proporções 50/50% (m/m). Os polímeros

foram pesados utilizando balança analítica, solubilizados primeiramente em

clorofórmio deixados sobre agitação mecânica por 1h. Foram preparadas soluções

nas concentrações 3%, 5%, 7% (m/v) utilizando o clorofórmio como solvente. Para a

solução denominada 20:80% (m/v), os polímeros foram pesados na concentração de

5% (m/v) e solubilizados em 80% de clorofórmio por 45 minutos e após foi

adicionada 20% de acetona sob agitação por mais 15 minutos.

2.3. Incorporação da Tetraciclina (TC) à Blenda.

Para a incorporação da TC ao material, pesou-se 250mg de TC e adicionou-se

a 1 mililitro de Dimetilformamida (DMF) sob agitação mecânica por 1h. A solução

contendo TC foi preparada utilizando 9ml de solução controle adicionando 1ml da

solução de TC.

2.4. Produção de matrizes poliméricas pela técnica de rotofiação.

Foi empregada a técnica de rotofiação para a preparação das amostras

utilizando equipamento disponível no Departamento de Engenharia de Materiais

(DEMA) da Faculdade de Engenharia Mecânica (FEM), Universidade Estadual de

Campinas (Unicamp), sob a supervisão da professora Dra. Cecília Amélia de

Carvalho Zavaglia. As condições ambientais no dia da preparação giravam em torno

de 23°C e 50% de umidade relativa do ar. Foram rotofiados 10ml de cada solução a

velocidade de 3554rpm. As soluções foram vertidas no aparelho de maneira manual

e produziram amostras em forma de fibras. As fibras serão denominadas conforme a



913

sua composição (concentração da solução polimérica), como demonstra a tabela 1.

Esta tabela também apresenta todos os componentes utilizados no preparo das

soluções.

Tabela 1. Soluções poliméricas utilizadas no preparo das amostras com a

nomenclatura

Nomenclatura Amostras Composição Massa % TC

F3% C Fibra 3% controle 10ml de CHCL3+ 150mg de

PCL+ 150 de PLLA

300mg PCL/PLLA -

F3%T Fibra 3% com TC 9ml da solução 3%C + 1ml de

TC/250mg

270mg PCL/PLLA

+250mg TC

48,07%


PCL+ 150 de PLLA

400mg PCL/PLLA -


TC/250mg

360mg PCL/PLLA

+250mg TC

40,98%


PCL+ 250mg de PLLA

500mg PCL/PLLA -

F5% T Fibra 5% com TC 9ml da solução 5%C + 1ml

de TC/250mg

450mg PCL/PLLA

+250mg TC

35,71%

F7%C Fibra 7% controle 10ml de CHCL3+ 315mg de PCL

+315mg de PLLA

700mg PCL/PLLA -


TC/250mg

630mg PCL/PLLA

+250mg TC

28,40%

F20:80%C Fibra 20:80%

controle

8ml da solução 5%C+ 2ml de

(CH3)2CO

500mg PCL/PLLA -

F20:80%T Fibra 20:80%

com TC

9ml da solução 20:80C+ 1ml de

TC/250mg

450mg PCL/PLLA

+250mg TC

35,71%

2.5. Análise de superfície por (MEV).

A morfologia das amostras foi caracterizada pelo aparelho de microscopia

eletrônica de varredura Jeol (Tokyo, Japão), modelo JCM 6000. Todas as amostras

foram afixadas em suportes e recobertas por ouro em metalizador Sputter Coater

(Scancoat Six), sob corrente de 20mA durante 1m15s com tensão de recobrimento

em 2.0Kv.

A morfologia de superfície foi analisada em aumento de até 1000x devido às



914

diferenças de espessura de cada material. As fibras foram esticadas para melhorar a

observação.

2.6. Espectroscopia na região do infravermelho por transformada de

Fourier (FTIR).

Para a análise de FTIR foi utilizado o Espectrofotômetro Perkin Elmer

(Massachusetts, EUA) modelo Frontier 100 FT-IR, no modo de refletância total

atenuada (ATR) na região de 4000 a 650 cm-1, com resolução de 4cm-1 e 32

varreduras com temperatura e umidade controladas. Equipamento está localizado no

Laboratório de Espectroscopia, Eletrônica e Óptica, na Universidade Federal do

ABC, Campus Santo André. A finalidade da análise foi verificar a presença dos

polímeros PCL/PLLA utilizados nas soluções poliméricas.

2.7. Microscopia de fluorescência.

2.7.1. Análise de Fluorescência

A fluorescência emitida pela molécula de TC é atribuída a sua estrutura

molecular conter anéis aromáticos. Utilizamos o microscópio de luz invertido de

fluorescência Leica (Wetzlar, Alemanha), modelo DMI 6000, para determinar e

quantificar a incorporação da TC.

2.7.2. Quantificação de TC

A produção de fibras e membranas ocorre de forma simultânea e para saber

qual a quantidade de TC foi incorporada as amostras fizemos o teste quantificação

usando a fluorescência emitida pela amostra e correlacionamos com a quantidade

de TC incorporada a mesma. Para isso, todos os parâmetros para obtenção e

captação das imagens foram padronizados utilizando o software Leica Application

Suite - LAS - AF6000 Modular System – Advanced Fluorescence. Foram utilizadas 3

amostras e selecionados 10 campos aleatoriamente, totalizando 30 valores, a partir

destes foi gerado um valor médio para cada amostra e foi posteriormente comparado

entre todas as amostras por meio de gráfico.

2.8. Análise Microbiológica.

Somente as fibras 7% foram submetidas aos testes de atividade antibacteriana,



915

devido a pouca produção de fibras obtidas a partir das demais concentrações. Os

testes foram realizados na Universidade São Judas Tadeu, sob a supervisão da

Professora Dra. Maria Raquel Manhani. O testes foram realizados em triplicata com

bactérias Staphylococcus aureus.

2.9. Cultura celular e toxicidade in vitro

Foram utilizadas células Vero, uma linhagem celular fibroblástica de células do

rim de macaco verde africano (Cercopithecus aeothiops), obtidas no Instituto Adolfo

Lutz, São Paulo, Brasil. Foram cultivadas em meio de cultura 199 (Lonza Group Ltd,

USA) com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB, Nutricell Nutrientes Celulares,

Campinas, SP, Brazil) a 37o C em estufa com 5% de CO2. Foram feitas trocas de

meio sempre que houvesse acidificação do mesmo e os subcultivos foram efetuados

duas vezes por semana. As células Vero são recomendadas para estudos sobre

citotoxicidade e interações entre células em biomateriais (ISO 10993-5, Kirkpatrick,

1992). As células Vero foram inoculadas em placa de cultura de 24 poços na

concentração de cerca de 4,0 x 105 células/poço (1,0ml) sobre as blendas de

PLLA/PCL (com e sem tetraciclina). Foram utilizados anéis de titânio como peso

para manter as amostras no fundo dos poços. As células foram mantidas em meio

199 com 10% de SFB a 37o C com 5% CO2, o meio foi trocado diariamente. Após

48hs de incubação o meio contido nos poços foi retirado e guardado para posterior

analise bioquímica. As amostras foram fixadas em Paraformaldeido 2,5% (em PBS

0,1M em pH 7,2) na própria placa de cultura e lavadas em água destilada duas

vezes. Então, foram fotografadas em microscópio invertido Zeiss Axio observer A1

com a objetiva de 20x. As imagens foram capturas pelo programa Axiovision.

3. RESULTADOS

3.1. Produção das amostras

A quantidade de fibras produzidas foi relacionada à concentração da solução,

as concentrações 3% e 4% não produziram fibras, as concentrações 5%, 7% e

20:80% produziram fibras em diferentes taxas, conforme demonstra a tabela 2.



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Tabela 2. Produção de membranas e fibras utilizando 10ml de solução.

Concentração

Da solução

Fibras

3% Controle -

3% Tetra -

4% Controle -

4% Tetra -

5% Controle +

5% Tetra +

7% Controle +++

7% Tetra +++

20:80% Controle +

20:80% Tetra +

3.2. Aspecto macroscópico das amostras

A Figura 1 mostra o aspecto macroscópico das fibras obtidas pelo processo de

rotofiação. As fibras apresentam aspecto volumoso com aspecto de fios enovelados.

As amostras incorporadas com TC são amarelas por causa da cor característica das

TCs e as amostras controles são brancas, devido à cor dos polímeros PCL e PLLA.

Figura 1. Amostras produzidas pela técnica de rotofiação. Fibra controle

(branca) fibra incorporada com TC (amarela).

3.3. Análise de superfície por Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

3.3.1 Fibras

Em todas as fibras observam-se diferenças morfológicas significativas entre as

fibras controles e as com TC. Conforme pode ser observado nas figuras 2, 3 e 4.



917

3.3.1.1. Fibras 5%

Figura 2. Micrografia das Fibras 5%. Na F5%C observam-se poucas fibras e

predominância de esferas porosas. Na F5%T maior presença de fibras com esferas

menos porosas.

3.3.1.2. Fibras 7%

Figura 3. Micrografia das Fibras 7%. Na F7%C predominância de fibras e

presença de esferas porosas. Na F7%T poucas fibras, presença de esferas com

menor porosidade.



918

3.3.1.3. Fibras 20:80%

Figura 4. Micrografia das Fibras 20:80%. Na F20:80%C observam-se

predominância de esferas porosas com poucas fibras. Na F20:80%T presença de

muitas esferas sem poros com pouquíssimas fibras.

3.5. Análise de Fluorescência

Para identificar a TC as fibras foram submetidas ao teste de fluorescência e

verificou-se a incorporação da mesma em todas as amostras. Conforme a figura 5

demonstra.



919

Figura 5. Fibras com e sem TC. Campo claro observa-se Fibras sem emissão

de fluorescência. Campo de fluorescência com emissão de fluorescência somente

nas fibras incorporada à TC. Barra de aumento: 150 µm.

3.6. Análise de quantificação de fluorescência das Fibras

Para mensurar a quantidade de TC incorporada as fibras foram realizados os

testes de quantificação. O resultado da figura 6 demonstra que as fibras 5% e

20:80% incorporaram TC de forma equivalente e a fibra 7% incorporou mais quando

comparadas.

Fibras 5%T Fibras 7%T Fibras 20:80%T

10

20

30

40

50

Flu

ore

scê

ncia

(%

)

Figura 6. Gráfico da quantificação de fluorescência das fibras.

3.7. Teste microbiológico em Placas de Petri

Verificou-se atividade antibacteriana na F7%T, verificou-se halos com medidas

aproximadas em triplicata . Conforme a tabela 3 demonstram.

Tabela 3. Medidas dos halos formados pela atividade da tetraciclina

Amostra 1°amostra (mm) 2°amostra(mm) 3°amostra(mm) Média (mm)

7%T Fibra 21 21 21 21

3.8. Cultura celular e toxicidade in vitro

Somente as Fibras 7% foram cultivadas devido a falta de fibras nas demais

concentrações. Com 48h de incubação observamos nas amostras controles um

tapete celular confluente com grande quantidade de células com um padrão



920

morfológico semelhante ao controle de crescimento em placa. Por outro lado, nas

F7%T observamos células retraídas e/ou fragmentadas, condizentes com toxicidade

celular.

Figura 7. Imagens obtidas pela microscopia óptica de luz invertida das fibras

com células. Barra de aumento: 100 µm.

4. DISCUSSÃO

A técnica de rotofiação demonstrou que a formação de fibras é dependente da

concentração da solução polimérica. A concentração 3% e 4% não foi capaz de

gerar fibras, a concentração 5% produziu pouca quantidade e a concentração

20:80% que foi elaborada como comparativo de solvente produziu em escala

equivalente a concentração 5% demonstrando que a adição de acetona como

solvente, neste trabalho não influenciou positivamente o aumento da taxa de

produção das fibras. Apesar das análises das fibras em todas as concentrações,

somente a concentração 7% produziu quantidade favorável para uma possível

produção em larga escala. Demonstrando que quanto maior a concentração da

solução polimérica mais fibras são formadas. Tão pouco a inserção da TC promoveu

melhora na produção das mesmas.

No MEV foi observado em todas as fibras presença de esferas e fios com

diâmetro entre 2 a 5 µm, e em menor quantidade fios menores que 2 µm. A TC

influenciou na porosidade, demonstrando diminuição tanto nas fibras como nas

esferas. Somente nas F7%C foi observado fibras com poros. Na observação de

fluorescência, foram tomados todos os cuidados necessários de padronização de

parâmetros para que a emissão de fluorescência fosse igual para todos os materiais.

As fibras mostraram-se homogêneas, desta maneira, indicando uma boa

incorporação da tetraciclina ao material. Na análise quantitativa foi demonstrado

fluorescência de forma equivalente nas F5%T e F20:80%T e maior fluorescência nas



921

F7%T. No teste antibacteriano foi avaliado somente a F7%T devido a falta a pouca

produção das outras fibras, e demonstrou que a técnica de rotofiação não interferiu

na atividade de TC, formando halos de inibição nas placas de Petri. Porém, nos

testes em célula a quantidade de 250mg de TC foi citotóxica. Já as fibras controles

formaram tapete confluente de células demonstrando adesão e proliferação celular.

5. CONCLUSÃO

Nossos resultados apontam para a produção de fibras em maior escala a partir

da solução polimérica com concentração de 7%. A concentração de 250mg de TC

interfere na morfologia das fibras e na adesão celular, dependendo de ajustes para

serem utilizadas. As fibras controles são indicadas para procedimentos de

engenharia tecidual ou regeneração tecidual guiada.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Valacchi, G.; Zanardi, I.; Sticozzi, C.; Bocci, V.; Travagli V. Emerging topics in cutaneous wound repair. Ann. N.Y. Acad. Sci, 1259, 136-44, 2012.

Yildirimer, L.; Thanh, NTK.; Seifalian, AM. Skin regeneration scaffolds: a multimodal bottom-up approach. Trends Biotechnol, vol.30, n°12, 638-48, 2012.

Cisneros, L.L. Evaluation of a neuropathic ulcers prevention program for patients with diabetes. Rev. Bras. Fisioter, vol.14, n°1, 31-7, 2010.

Mendonça, J.R.; Coutinho-Netto, J. Cellular aspects of wound healing. An. Bras. Dermatol, 84, 257-62, 2009.

Ferreira, M.C.; Paggiaro, A. O.; Neto, N.T.; Isaac, C.; Santos, G. B. Skin substitutes: current concepts and a new classification system. Rev. Bras. Cir. Plást, vol.26, n°4, 696-702, 2011.

Atiyeh BS & Costagliola M. Cultured epithelial autograft (CEA) in burn treatment: three decades later. Burns, 33, 405-13, 2007.

Hench, L.L. Biomaterials: a forecast for the future. Biomaterials, 19, 1419-23, 1998.

Atala, A. Engineering organs. Cur. Opin. Biotechnol. Vol. 20, 575-592, 2009.

Santos Jr, A.R.; Barbanti, S.H.; Duek, E.A.R.; Wada, M.L.F.. Analysis of the growth pattern of Vero cells cultured on dense and porous poly(l-lactic acid) scaffolds. Mater. Res., 12, 257-263, 2009.



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