Dampak poly-β-hydroxybutirate pada pemeliharaan larva udang galah Macrobrachium rosenbergii

T E R J E M A H A N

Disadur dari makalah :

The effect of poly-β-hydroxybutirate on larviculture of

the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii

Oleh :

Dinh The Nhana,b, Mathieu Willea, Peter De Schryver c, Tom Defoirdt a, Peter Bossiera and Patrick Sorgeloosa

Diterjemahkan Oleh :

ROMI NOVRIADI

KEMENTERIAN KELAUTAN DAN PERIKANAN DIREKTORAT JENDERAL PERIKANAN BUDIDAYA

BALAI BUDIDAYA LAUT BATAM 2013

Dampak poly-β-hydroxybutirate pada pemeliharaan larva udang galah Macrobrachium rosenbergii

Dinh The Nhana,b, Mathieu Willea, Peter De Schryver c, Tom Defoirdt a, Peter Bossiera and Patrick Sorgeloosa

a Laboratorium Budidaya perikanan dan Pusat Referensi Artemia, Universitas Ghent, Rozier

44, 9000, Ghent, Belgia b Fakultas perikanan, Universitas Nong Lam, HCM city, Vietnam c Laboratorium Ekologi mikrobial dan Teknologi, Universitas Ghent, Coupure Links 653,

9000 Ghent, Belgia.

Abstrak

Pada kajian ini, kami meneliti dampak poly-β-hydroxybutirate (PHB) pada aspek kultur larva udang galah Macrobrachium rosenbergii dan tingkatan bakteri didalam usus larva. Naupli Artemia instar II dikultur dengan atau tanpa PHB (5 g l-1) dan/atau sebuah emulsi lemak kaya dengan asam lemak tidak jenuh tinggi (HUFA) selama 24 jam. Dampak pemberian pakan PHB dan/atau naupli Artemia yang diperkaya dengan HUFA pada performa larva Macrobrachium rosenbergii telah diamati. Pemberian pakan pada larva udang galah dengan PHB-mengandung naupli Artemia secara nyata meningkatkan kelulushidupan dan perkembaangan larva. Selain itu, perhitungan total bakteri dan perhitungan bakteri Vibrio spp ditemukan secara nyata lebih rendah pada larva yang diberi pakan PHB ketika dibandingkan dengan larva kontrol, menunjukkan bahwa penambahan PHB memiliki dampak penghambat-pertumbuhan terhadap mikroorganisme yang secara potensial bersifat patogen. Pada akhirnya, kombinasi penambahan PHB dan pengkayaan lemak menghasilkan performa kultur yang baik secara keseluruhan karna secara nyata meningkatkan kelulushidupan larva begitu juga dengan perkembangan larva. Konsentrasi optimal PHB dan formulasi bio-enkapsulasi kedalam Artemia sebaiknya diteliti lebih lanjut untuk meningkatkan efisiensi ekonomi pada produksi larva Macrobrachium.

©2010 Elsevier.

I. Pendahuluan

Udang galah, Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879), adalah sebuah komoditas budidaya ekonomis penting. Budidayanya telah berkembang dengan cepat tidak hanya di Asia tetapi juga di wilayah lain yang jauh dari distribusi alamiah udang ini (FAO, 2000). Bagaimanapun, ketersediaan benih yang sehat dan berkualitas tinggi selalu menjadi penghambat utama dalam pengembangan budidaya M. Rosenbergii. Satu faktor utama yang menjadi penghambat kualitas benih yang dipelihara di panti benih, pemeliharaan dengan kepadatan rendah karena kematian massal, adalah penyakit. Timbulnya wabah penyakit pada udang seringkali ditujukan kepada infeksi bakteri (Sung et al., 2000; Phatarpekar et al., 2002; Al-Harbi, 2003). Kematian massal pada larva di panti benih membatasi produksi rutin benih berkualitas tinggi. Kematian tersebut seringkali dikaitkan dengan bakteri patogen oportunis (Skjermo dan Vadstein, 1999). Vibrio telah dilaporkan sebagai penyebab untuk sejumlah wabah penyakit (Alavandi et al., 2004; Kennedy et al., 2006) dan seringkali dilaporkan sebagai masalah utama dalam panti benih udang (Nayak dan Mukherjee, 1997; Jayaprakash et al., 2006). Antibiotika dan bahan desinfeksi, pendekatan konvensional untuk pengendalian populasi bakteri dalam panti benih udang, cukup populer. Namun, mereka mulai ditarik peredarannya dari pasar di banyak negara karena kekhawatiran tentang kesehatan masyarakat dan keamanan lingkungan (Schneider et al., 2003). Bagaimanapun, penggunaan antibiotika dengan dosis rendah sebagai tindakan pencegahan telah menghasilkan perkembangan resistensi terhadap antibiotika (Teo et al, 2000, 2002), menyebabkan pengobatan antibiotika tidak efektif dalam pengendalian penyakit (Karunasagar et al., 1994). Oleh karena itu, merupakan sebuah kebutuhan mendesak untuk mencari teknik pengendalian alternatif ramah lingkungan yang membantu untuk mempertahankan kesehatan hewan.

Mempertimbangkan bahwa antibiotika sebaiknya tidak digunakan kembali sebagai pendukung pertumbuhan hewan, saat ini terdapat ketertarikan yang nyata pada asam lemak rantai pendek (SCFAs) sebagai biokontrol dalam produksi hewan (Defoirdt et al., 2006). Beberapa kajian telah menunjukkan bahwa SCFAs menghambat pertumbuhan ragi dan enterobakter seperti Salmonella typhimurium, Escherichia coli dan Shigella flexneri (Cherrington et al., 1991; Bearson et al., 1997; Sun et al., 1998; Van Immerseel et al., 2003). SCFAs sebelumnya telah terbukti dapat menghambat atau menurunkan pertumbuhan Salmonella di ayam (Waldroup et al., 1995; Van Der Wielen et al., 2000; Van Immerseel et al., 2005) dan menurunkan bakteri patogen luminiscent Vibrio pada uji secara in vitro (Defoirdt et al., 2006). Selain itu, SCFAs terbukti dapat secara nyata meningkatkan kelulushidupan naupli Artemia yang diuji tantang. Sebagai tambahan, SCFAs mungkin juga menyediakan energi untuk udang (Defoirdt et al., 2006). Konsentrasi efektif asam lemak cukup tinggi dan akibatnya, hal ini secara ekonomi tidak memungkinkan untuk memberikan asam lemak pada air kultur sistem budidaya perikanan dalam rangka melindungi hewan. Terlebih lagi, penambahan karbon konsentrasi tinggi dalam air dapat memberikan peningkatan kepada pertumbuhan yang berlebihan bakteri heterotropik yang mungkin memiliki dampak negatif terhadap kesehatan hewan (karena penurunan oksigen dan/atau karna pertumbuhan bakteri dapat menjadi patogen). Polyhydroxylalkanoates (PHAs) merupakan polimer yang tidak larut dalam air dari asam lemak rantai pendek β-hydroxy yang dihasilkan sebagai bahan cadangan oleh sejumlah bakteri (Anderson dan Dawes, 1990). Yang menarik, kajian berbeda menyajikan beberapa bukti bahwa PHAs dapat juga

didegradasi menjadi beberapa bagian melalui saluran pencernaan hewan dan akibatnya, penambahan senyawa ini ke dalam pakan dapat menghasilkan dampak biokontrol seperti yang digambarkan untuk SCFAs (Defoirdt et al., 2009). Defoirdt et al. (2007) melaporkan bahwa SCFA β-hydroxybutirate mampu menghambat pertumbuhan strain jahat Vibrio campbelli secara in vitro. Berdasarkan hasil ini, penulis menginvestigasi apakah polimer dari SCFA ini, senyawa penyimpan bakteri yang sudah diketahui dengan baik poly-β-hydroxybutirate (PHB), dapat digunakan untuk melindungi hewan akuatik dari bakteri patogen. Penambahan partikel PHB komersil (rata-rata diameter 30 µm) pada konsentrasi 1000 mg l-1 ke air kultur menghasilkan perlindungan menyeluruh pada Artemia dari keganasan V.campbellii (Defoirdt et a.l, 2007).

Pada kajian ini, kami menginvestigasi dampak PHB (diberikan melalui pakan hidup) terhadap kelulushidupan dan pertumbuhan larva udang galah Macrobrachium rosenbergii dan terhadap mikrobiota (total bakteri dan Vibrio spp) yang berkaitan dengan larva. Untuk menunjukkan potensi penerapan, penambahan naupli Artemia dengan PHB dikombinasikan dengan pengkayaan lemak, sebuah teknik yang rutin diterapkan di banyak panti benih ikan dan udang. 2. Bahan dan Metoda 2.1 Hewan percobaan Kajian ini melibatkan 2 percobaan pada performa pemeliharaan larva M. Rosenbergii dalam botol gelas 1 L. M. Rosenbergii dewasa didatangkan dari Thailand dan digunakan sebagai induk. Parameter kulaitas air bak induk, periode cahaya, dan pengelolaan pakan disesuaikan berdasarkan rekomendasi untuk pemeliharaan udang (New, 2003). Air diganti dengan rata-rata kurang lebih 20% per hari setelah membuang limbah dan pakan yang tidak dikonsumsi melalui proses penyiponan. Konsentrasi NH4-N; NO2-N, dan NO3-N dipertahankan dibawah 0.2, o.1, dan 10.0 mg l-1 secara berurutan. Periode cahaya diatur pada 12 jam cahaya dengan intensitas 600lx dengan lampu fluoresen (neon) diatas permukaan air. Suhu dipertahankan pada 28±10C. Udang diberi pakan secara ad libitum dengan pakan udang formulasi komersil dua kali dalam sehari (pada jam 09.00 dan jam 17.00). Larva diperoleh dari induk betina ovigerous tunggal (Cavalli et al, 1999, 2000; Baruah et al, 2009). Larva yang baru menetas dipelihara selama 4-10 hari sebelum ditempatkan dalam percobaan. Dua puluh empat jam setelah menetas, larva dipindahkan kedalam botol konikel silinder 10 L yang terhubung dengan sistem resirkulasi tunggal seperti yang digambarkan oleh Cavalli et al, (2001). Air diganti dengan rata-rata kurang lebih 50% per hari setelah membuang limbah dan pakan yang tidak dikonsumsi dengan penyiponan. Konsentrasi NH4-N; NO2-N, dan NO3-N dipertahankan dibawah 0.2, o.1, dan 10.0 mg l-1 secara berurutan. Salinitas air disesuaikan dengan melarutkan air laut ke 12g L-1 dengan air yang di-deionisasi. Suhu dipertahankan pada 28±10C. Aerasi ringan diaplikasikan di seluruh botol. Sistem lampu fluoresen dipasang, menyediakan sekitar 900-1000 lx pada permukaan air selama 12 jam per hari. Naupli Artemia fransiscana yang baru ditetaskan (Tipe EG©, Batch 041004, INVE Aquaculture, Baasrode, Belgia) digunakan sebagai pakan hidup dan diberikan melalui air kultur Macrobrachium rosenbergii secara ad libitum (kepadatan selalu melebihi 6 naupli Artemia ml-1) dari hari ke-2 hingga hari ke-10. Dosis pemberian Artemia dibagi menjadi dua pemberian pakan pada jam 09.00 dan jam 17.00.

2.2 Disain Percobaan

Percobaan dilakukan di tabung gelas kerucut yang mengandung 1000 mL air payau (salinitas 12 g L-1). Gelas kerucut ditempatkan di dalam bak akuarium yang berisikan air dipertahankan pada suhu 29±10C menggunakan pemanas thermostatic. Sistem lampu dipasang untuk menyediakan sekitar 900-1000lx pada permukaan air selama 12 jam per hari. Gelas kerucut di suplai dengan aerasi lembut untuk memastikan konsentrasi oksigen terlarut di dalam air pemeliharaan selalu diatas 5 mg L-1. Di dalam seluruh percobaan, sistem air bersih terbuka digunakan dengan pergantian air harian sekitar 50% . Selama pergantian air, Artemia sisa dan limbah dari hari sebelumnya dibuang melalui penyiponan. Kegiatan ini dilakukan dengan hati-hati untuk mencegah hilangnya larva. Pemberian pakan dilakukan setelah pergantian air. Larva secara eksklusif diberi pakan naupli A. Fransiscana (strain Great Salt Lake) secara ad libitum dua kali dalam sehari pada jam 09.00 dan 17.00 selama masa percobaan. Tergantung kepada perlakuan, naupli Artemia instar II diperkaya dengan partikel PHB (rata-rata diameter 30 µm, Lot : S68924-488, Sigma-Aldrich, Bornem, Belgia) pada konsentrasi 5 g L-1 kultur Artemia dan/atau sebuah emulsi lemak (ICES 30/0.6/C, mengandung 30% total Ω-3 HUFA dengan perbandingan DHA/EPA 0,6, Lot: 903003.01, Han et al, 2001) pada konsentrasi 0,6 g L-1 air kultur Artemia selama 24 jam sebelum memberikan mereka sebagai pakan ke larva Macrobrachium. Pada perlakuan kontrol, naupli Artemia diberi perlakuan yang sama, tanpa pengkayaan baik dengan PHB atau emulsi lemak.

Percobaan 1 terdiri atas dua perlakuan dengan memberi pakan larva Macrobrachium

dengan naupli Artemia yang diperkaya dengan PHB atau kontrol naulii (tanpa pengkayaan). Pada awal percobaan, larva berumur 10 hari ditempatkan dengan kepadatan awal 50 L-1. Percobaan kedua terdiri atas 4 perlakuan dengan penambahan PHB dan/atau emulsi lemak dan kontrol tanpa adanya pengkayaan (+P +L : PHB dan lemak ditambahkan; +P –L: Hanya PHB yang ditambahkan, -P+L : hanya lemak yang ditambahkan, -P-L : tidak ada yang ditambahkan). Pada percobaan ini, larva berumur 4 hari ditempatkan dengan kepadatan awal 100 L-1. Durasi percobaan adalah selama 15 hari untuk percobaan 1, dan 28 hari untuk percobaan dua. Pada kedua percobaan, perlakuan dilakukan dengan enam pengulangan.

2.3 Analisa 2.3.1 Deteksi PHB dalam naupli Artemia yang digunakan untuk memberi makan

Macrobrachium Naupli Artemia instar II diperkaya dengan partikel PHB (rata-rata diameter 30 µm Lot: S68924-488, Sigma-Aldrich, Bornem, Belgia), yang ditambahkan ke air kultur dengan konsentrasi 5 g l-1. PHB dideteksi di dalam nauplii berdasarkan metodologi yang dijelaskan dalam Defoirdt et al (2007). Secara singkat, setelah 15 menit inkubasi, sejumlah 10 naupli dibunuh dengan etanol absolut dan diwarnai dengan fluoresen dye Nile Blue A (Ostle dan Holt, 1982). Naupli dianalisa dengan menggunakan mikroskop Axioskop II (Carl Zeiss, Jena, Jerman) dilengkapi dengan sebuah kamera digital peltier-cooled chip tunggal (Orca Illm; Hamamatsu, Massay, Perancis) yang dihubungkan ke komputer

2.3.2 Indeks stadium larva

Pada hari ke-10 dan 15, perkembangan larva di tiap perlakuan diperkirakan melalui penentuan indeks stadium larva (LSI) menurut Maddox dan Manzi (1976). Rata-rata stadium larva dari 60 larva pada setiap perlakuan dicatat berdasarkan penjelasan oleh Uno dan Kwon (1969).

2.3.3 Kelulushidupan larva Kelulushidupan larva dianalisa pada hari ke 5,10 dan 15 pada percobaan 1. Dalam percobaan 2, kelulushidupan larva diperiksa pada hari ke 10, 15, 20 dan 28. Perhitungan larva dilakukan dengan hati-hati untuk mencegah stres pada larva. 2.3.4 Bakteri dalam pencernaan larva Sampel larva udang diambil pada awal dan di akhir percobaan. Tiga sampel dari sepuluh larva diambil secara acak dari seluruh pengulangan untuk analisa perhitungan bakteri dalam pencernaan udang. Permukaan bakteri dihilangkan berdasarkan prosedur yang digambarkan oleh Huys et al. (2001). Sampel udang pertama direndam dalam larutan benzocaine (Sigma, 0.1%) selama 10 detik, dipindahkan ke larutan benzalkonium chloride (Sigma, 0.1%) selama 10 detik lainnya, dan dicuci tiga kali dengan larutan sembilan garam yang sudah diautoklaf (NSS) (Olsson et al.,1992) selama 5 detik setiap waktu. Larva kemudian dipindahkan ke plastik steril yang berisikan 10 mL NSS, dan dihomogenisasi dengan pengenceran bertingkat dalam NSS. Lima puluh µl dari tiap pengenceran di isolasi pada Marine agar, dan pada Thiosulphate-Citrate-Bile salt-Sucrose (Biokar Diagnostics, Perancis) untuk menghitung jumlah bakteri yang dapat dikultur, dan Vibrio spp, secara berurutan. Jumlah koloni dihitung setelah inkubasi pada suhu 280C selama 48 jam. 2.3.5 Statistik Indek stadium larva, kelulushidupan larva, dan kepadatan bakteri yang dapat dihitung dianalisa menggunakan analisa ragam (one way ANOVA) dan, jika perbedaan yang nyata ditemukan (P<0,05), analisa perbedaan yang paling nyata (Duncan, Piranti lunak SPSS versi 13.0) dilakukan. Seluruh persentase data di normalisasi dengan transformasi arcsine untuk analisa statistik, tetapi hanya rata-rata yang tidak ditransformasi yang disajikan. 3. Hasil 3.1 Percobaan 1 Pada percobaan pertama, dampak pemberian pakan PHB ke larva Macrobrachium dengan memperkaya pakan didalam pakan hidup diamati. Naupli Artemia instar II digunakan sebagai pakan hidup untuk larva Macrobrachium yng dikultur dengan atau tanpa PHB (5 g l-1). Analisa mikroskopik menunjukkan bahwa usus naupli Artemia dalam perlakuan tanpa PHB kosong (Gambar 1), Sedangkan pada perlakuan dengan PHB, bagian atas usus hampir seluruhnya terisi. Gambar epifluorescen pewarnaan naupli Nile Blue A menunjukkan bahwa kandungan usus naupli yang diberi perlakuan PHB secara fluorescen lebih terang dan dapat dengan jelas dibedakan dari (auto) fluorescen naupli, yang mengindikasikan bahwa

naupli telah mencerna partikel PHB. Dampak penambahan PHB ke pakan hidup pada performa larva Macrobrachium dipelajari dengan menentukan kelulushidupan larva dan perkembangan selama masa kultur 15 hari. Evaluasi perkembangan larva berdasarkan pada indeks stadium larva menunjukkan bahwa larva dengan perlakuan PHB telah tumbuh secara nyata lebih baik dibandingkan dengan kontrol (tanpa penambahan PHB) setelah 10 hari (P<0,05) (Gambar 2). Kelulushidupan larva ditentukan pada hari ke 5, 10, dan 15 (akhir percobaan) dan selalu secara nyata lebih tinggi pada perlakuan PHB dibandingkan dengan perlakuan kontrol (P<0,05). Perbedaan dalam kelulushidupan menjadi lebih dan lebih jelas mendekati akhir percobaan (Gambar 3).

Gambar 1. Gambar perwakilan cahaya (baris atas) dan mikroskopi epifluoresen (baris bawah) dari pewarnaan Nile Blue A naupli Artemia setelah 15 menit tanpa (panel A dan C) dan dengan (Panel B dan D) PHB ditambahkan pada air kultur dengan konsentrasi 5 g L-1. 3.2 Percobaan 2 Pada percobaan ini, dampak kombinasi PHB dan emulsi lemak (keduanya diberikan melalui pakan hidup) pada performa larva Macrobrachium dipelajari. Perlakuan dengan pengkayaan lemak menunjukkan nilai tertinggi dari LSI, sementara perlakuan kontrol memiliki perkembangan larva yang sangat rendah. LSI pada perlakuan dengan PHB secara nyata lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan kontrol, tetapi lebih rendah bila dibandingkan pada perlakuan dengan pengkayaan lemak (Gambar 4). Terdapat interaksi yang nyata pada pemberian pakan PHB dan pengkayaan lemak terhadap Indeks stadium larva pada hari ke-10 dan 15 (P<0,05). Kelulushidupan larva diperiksa di empat interval

waktu yang berbeda selama percobaan. Perbedaan diantara perlakuan memiliki kemiripan di semua titik waktu. Perlakuan dengan PHB dan pengkayaan lemak menghasilkan kelulushidupan tertinggi (56% pada akhir percobaan), sementara kelulushidupan pada kontrol adalah yang terendah (12% pada akhir percobaan). Perlakuan baik dengan PHB atau pengkayaan lemak secara terpisah berada di titik pertengahan dan secara nyata tidak berbeda antara yang satu dengan yang lain (gambar 5). Setelah 28 hari percobaan (32 hari setelah menetas), 90% larva pada perlakuan dengan pengkayaan lemak telah mencapai stadium post larva, sementara pada perlakuan dengan PHB hanya berkisar 50% yang bermetamorfosa, dan pada perlakuan kontrol hanya 10% dari hewan yang mencapai post larva. Tidak terdapat interaksi antara PHB dan pengkayaan lemak terhadap kelulushidupan larva. Gambar 2. Indeks stadium larva pada hari ke-10 percobaan (20 hari setelah menetas) larva Macrobrachium rosenbergii yang diberi pakan dengan atau tanpa pengkayaan PHB pada percobaan 1. Nilai adalah rata-rata±SE, n=6, Perbedaan huruf subskrip menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05). Total bakteri dan jumlah Vibrio spp pada usus larva udang ditentukan pada awal dan akhir percobaan dengan menghitung di Marine agar dan media TCBS, secara berurutan, pada akhir percobaan, jumlah total bakteri pada usus larva secara nyata lebih tinggi pada perlakuan dengan hanya pengkayaan lemak (mencapai 28 x 104 CFU larva-1) jika dibandingkan dengan perlakuan lain. Jumlah Vibrio di usus larva pada akhir percobaan secara nyata lebih tinggi pada perlakuan tanpa PHB ketika dibandingkan pada perlakuan dengan penambahan PHB . Jumlah Vibrio spp, pada usus larva diawali dengan 21±6 CFU larva-1, dan meningkat ke 1,3-2,2 x 103 CFU larva-1 pada akhir percobaan pada perlakuan tanpa PHB (Tabel 1). Terdapat interaksi yang nyata antara pemberian pakan dengan PHB dan emulsi lemak terhadap kepadatan populasi mikroflora didalam usus larva (P<0,05).

4. Diskusi Pada kajian ini, kami menginvestigasi dampak PHB pada performa kultur larva udang

galah Macrobrachium rosenbergii dan pada tingkatan bakteri didalam usus larva. Naupli Artemia umum digunakan sebagai pakan hidup untuk larva Macrobrachium (Lavens et al, 2000) dan karna Defoird, et al (2007) melaporkan bahwa PHB dapat diakumulasi oleh Artemia ketika dimasukkan ke air kultur, kami memberikan PHB ke larva udang melalui Artemia. Akumulasi partikel PHB didalam usus Artemia dikonfirmasi menggunakan mikroskopi epifluoresen (gambar 1). Tidak memungkinkan untuk mendeteksi PHB dalam usus larva Macrobrachium karna larva karna tidak cukup transparan untuk mikroskopi fluoresen dan mungkin karena kandungan PHB sangat kecil untuk dideteksi menggunakan kromatografi. Hasil yang disajikan dalam makalah ini menunjukkan bahwa pemberian pakan larva Macrobrachium dengan naupli Artemia yang mengandung PHB secara nyata meningkatkan kelulushidupan larva (Gambar 3,5)

Gambar 3. Kelulushidupan larva Macrobrachium rosenbergii yang diberi pakan naupli Artemia dengan atau tanpa pengkayaan PHB setelah hari ke 5, 10, dan hari ke-15 analisa pada percobaan 1. Nilai adalah rata-rata±SE, n=6, Perbedaan huruf menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05). Jenis berbeda dari superscipt menunjukkan perbandingan yang berbeda. Gambar 4. Indeks stadium larva Macrobrachium rosenbergii pada hari ke-10 dan 15 yang diberi pakan naupli Artemia dengan atau tanpa PHB dan/atau pengkayaan lemak di percobaan 2; +P+L : PHB dan lemak ditambahkan, +P-L : hanya PHB yang ditambahkan, -P+L : hanya lemak yang ditambahkan, -P-L : Tidak ada yang ditambahkan. Nilai adalah rata-rata±SE, n=6, Perbedaan huruf subskrip menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05). Huruf besar dan kecil menunjukkan perbandingan yang berbeda.

Pada percobaan 2 dimana kombinasi PHB dan emulsi lemak kaya akan asam lemak tidak jenuh tinggi telah dikaji, tingkat kelulushidupan yang tinggi dicatat pada perlakuan dengan penambahan PHB dan emulsi (Gambar 3,5). Perlakuan dengan hanya menggunakan PHB dan hanya emulsi lipid juga meningkatkan secara nyata kelulushidupan larva, meskipun kurang nyata dibandingkan dengan perlakuan menggunakan kedua bahan tambahan tersebut. Hasil ini berdasarkan laporan Defoirdt, et al (2007), yang menemukan bahwa PHB secara nyata meningkatkan kelulushidupan larva Artemia yang diuji tantang dengan bakteri patogen Vibrio spp. Kelulushidupan yang rendah pada larva udang di perlakuan kontrol pada kajian ini mungkin disebabkan oleh keberadaan bakteri oportunistik yang berkaitan dengan larva (seperti yang juga dilaporkan oleh Baruah et al. 2009). Pada kajian kami, kami menemukan bahwa pemberian pakan larva Macrobrachium rosenbergii dengan naupli Artemia yang mengandung PHB menghasilkan konsentrasi total bakteri dan Vibrio yang secara nyata lebih rendah (Tabel 1), yang seringkali dikaitkan dengan penyakit organisme akuatik (Lightner, 1996; Otta et al., 2001). Phatarpekar et al (2002) menginvestigasi flora bakteri pada larva udang dan menemukan bahwa Vibrio spp dideteksi pada telur dan air namun secara mencolok absen di larva. Bagaimanapun, jumlah total bakteri pada larva bervariasi dari 2,5 x 104 ke 1,6 x 108 CFU g-1. Pada kajian terkini, jumlah bakteri dan Vibrio yang dihitung pada perlakuan larva tanpa penambahan PHB bervariasi dari 15,9 ke 28,0 x 104 dan 0,4 ke 22,0 x 102 CFU larva-1, secara berurutan, sementara pada perlakuan PHB jumlah bakteri hanya 1,7 hingga 5,6 x 104 dan 0,3 ke 1,6 x 102 CFU larva-1, secara berurutan.

Gambar 5. Kelulushidupan larva Macrobrachium rosenbergii yang diberi pakan naupli Artemia dengan atau tanpa PHB dan/atau pengkayaan di percobaan 2. +P+L : PHB dan lemak ditambahkan, +P-L : hanya PHB yang ditambahkan, -P+L : hanya lemak yang ditambahkan, -P-L : Tidak ada yang ditambahkan. Nilai adalah rata-rata±SE, n=6, Perbedaan huruf menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05). Jenis huruf yang berbeda menunjukkan perbandingan yang berbeda.

Tabel 1. Mikroflora didalam usus larva Macrobrachium rosenbergii yang diberi pakan naupli Artemia dengan atau tanpa PHB dan/atau pengkayaan lemak di percobaan 2. Nilai adalah rata-rata±SE, n=3, Huruf yang berbeda didalam kolom menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05). Defoirdt et al. (2007) menemukan bahwa partikel PHB melindungi larva Artemia dari bakteri patogen V.campbellii dan diduga bahwa partikel PHB (sebahagian) didegradasi menjadi β-hydroxybutirate dalam usus udang dan keluarnya asam lemak ini melindungi udang dari patogen dengan dua cara, seperti dengan menyediakan udang dengan energi (dihasilkan dalam epitel usus yang lebih resisten terhadap infeksi) dan dengan menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Ini juga menjelaskan mengapa pemberian pakan pada larva Macrobrachium rosenbergii dengan naupli Artemia meningkatkan kelulushidupan dan pertumbuhan larva ketika dibandingkan dengan kontrol. Bagaimanapun, pemberian emulsi lemak secara nyata meningkatkan perkembangan larva ketika dibandingkan dengan penambahan hanya menggunakan PHB. Memang, larva dapat menggunakan produk degradasi dari partikel PHB sebagai sumber energi, tetapi mereka akan kehilangan gizi penting yang dibutuhkan untuk pertumbuhan, yang terdapat pada emulsi lemak. Lemak diketahui memainkan peranan penting pada perkembangan larva krustasea (Teshima 1972, 1997; Middleditch et al., 1980; Teshima dan Kanazawa, 1983; Harrison, 1990). Selain menjadi sumber utama energi metabolisme dan bentuk utama dari penyimpanan energi, lemak juga menyediakan asam lemak esensial yang dibutuhkan untuk pemeliharaan dan keutuhan jaringan membran, dan berfungsi sebagai prekursor steroid dan moulting hormon (Teshima, 1972; Harrison, 1990). Asam lemak yang dikeluarkan dari PHB adalah asam lemak rantai pendek, yang menyediakan sumber energi tambahan, tetapi tidak menyediakan asam lemak rantai panjang yang dibutuhkan untuk mengoptimalkan fungsi metabolisme. Beberapa kajian telah menginvestigasi metabolisme lemak pada tahapan larva dan benih udang galah (Devresse et al., 1990; Sheen dan D'Abramo, 1991; Teshima et al., 1992, 1997; D'Abramo dan Sheen, 1993; Querijero et al., 1997; Roustaian et al., 1999). Pemberian pakan ke larva dengan emulsi lemak kaya akan asam lemak tidak jenuh tinggi (HUFA) keduanya menyediakan larva dengan sumber energi yang sangat baik (Tidwell, et al, 1998), dan struktur komponen yang dibutuhkan untuk perkembangan jaringan dan pembuatan hormon, menghasilkan pertumbuhan yang lebih baik. Hasil ini sesuai dengan beberapa kajian terdahulu, sebagai contoh Romdhane et al (1995) yang mendemonstrasikan bahwa semakin panjang masa pemberian pakan nauplii Artemia yang diperkaya dengan (Ω-3) HUFA, semakin baik hasilnya dalam hal pertumbuhan, tingkat metamorfosa, kelulushidupan

dan perlawanan terhadap stres pada larva udang. Demikian pula, Sorgeloos dan Leger (1992) dan Alam et al (1995) melaporkan bahwa aplikasi pakan hidup yang dilengkapi dengan minyak laut kaya akan asam lemak Ω-3 meningkatkan pertumbuhan larva Macrobrachium rosenbergii. Degradasi PHB dapat terjadi melalui beberapa mekanisme, termasuk dekomposisi kimia atau hidrolisis dan hidrolisis enzim (Defoirdt et al., 2009). Bagaimanapun, mekanisme pasti dimana polimer PHB dipecah dalam saluran pencernaan hewan, sebagai contoh apakah ini utamanya didorong oleh sifat fisika-kimia lingkungan usus atau dengan keluarnya enzim pencernaan oleh inang dan/atau oleh mikroorganisme yang ada di usus, masih belum diketahui. Defoirdt et al. (2007) melaporkan bahwa degradasi PHB pada larva Artemia kemungkinan utama disebabkan oleh sifat fisika-kimia atau dimediasi oleh aktivitas enzim Artemia dan bukan oleh mikroba karna pemeliharaan larva dilakukan dalam kondisi axenic. Larva Macrobrachium rosenbergii yang digunakan dalam kajian ini, bertolak belakang, dilakukan tidak dalam kondisi axenic dan sebagai akibatnya, mikroorganisme yang berkaitan dengan larva juga berkontribusi dalam pemecahan PHB. Memang, degradasi enzim PHB oleh mikroorganisme yang menghasilkan depolimerisasi PHB didokumentasikan dengan baik (Doi et al., 1990; Yoshie et al., 1999; Quinteros et al., 1999; Jendrossek dan Handrick, 2002; Choi et al., 2004; Khanna dan Srivastava, 2004), meskipun sepanjang yang kami ketahui belum ada mikroorganisme yang mendegradasi PHB di saluran pencernaan dilaporkan hingga saat ini. Aplikasi PHB dalam pemeliharaan larva akuakultur, atau lebih spesifik ke produksi larva udang, mungkin terhambat harga produk komersil PHB yang tinggi saat ini. Namun, PHB dapat dihasilkan dengan mudah menggunakan Bacillus dan Lctobacillus spp ( Anderson and Dawes, 1990; Aslim et al., 1998; Yilmaz et al., 2005) dari substrat yang tidak mahal, seperti molase, membuat teknik ini efektif dalam pembiayaan dan berkelanjutan (Kim, 2000). Lebih lanjut, Defoirdt et al. (2007) percaya bahwa akan dapat diproduksi PHB secara in situ pada air kultur dengan menambahkan senyawa yang kaya akan karbon (C) atau meningkatkan rasio C/N pada pakan. Seluruh konsep ini dapat membuka kesempatan baru untuk memproduksi PHB dengan harga yang lebih rendah di masa mendatang, dengan aplikasi yang memungkinkan pada produksi akuakultur dan benih akuatik. Sebagai kesimpulan, hasil yang diperoleh dalam kajian ini menunjukkan bahwa pemberian pakan larva Macrobrachium rosenbergii dengan naupi Artemia mengandung PHB secara nyata meningkatkan kelulushidupan larva dan perkembangan. Selain itu, perhitungan total bakteri dan perhitungan Vibrio ditemukan secara nyata lebih rendah pada larva yang diberi pakan PHB ketika dibandingkan dengan larva kontrol, menunjukkan bahwa penambahan PHB memiliki dampak daya hambat pertumbuhan terhadap mikrorganisme yang secara potensial bersifat patogen. Akhirnya, sebuah kombinasi penambahan PHB dan emulsi lemak menghasilkan secara keseluruhan performa yang terbaik karna secara nyata dapat meningkatkan kelulushidupan larva dan juga perkembangan larva. Konsentrasi optimal PHB dan formulasi untuk enkapsulasi kedalam Artemia sebaiknya dikaji lebih lanjut untuk meningkatkan efisiensi ekonomi produksi larva.

Ucapan Penghargaan Penelitian ini didukung oleh Belgian Technical Cooperation (BTC) melalui bantuan dana sekolah doktor kepada Dinh The Nhan (Proc.05 VIE/2991). Daftar Pustaka Alam, M.J., Ang, K.J., Begum, M., 1995. Use of egg custard augmented with cod liver oil and

Moina micrura on production of freshwater prawn postlarvae. Aquaculture International 3, 249–259.

Alavandi, S.V., Vijayan, K.K., Santiogo, T.C., Poornima, M., Jithendran, K.P., Ali, S.A., Rajan, J.J.S., 2004. Evaluation of Pseudomonas sp. PM 11 and Vibrio fluvialis PM 17 on immune indices of tiger shrimp, Penaeus monodon. Fish Shellfish Immunology 17, 115–120.

Al-Harbi,A.H., 2003. Bacterialflora of freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (deMan), cultured in concrete tanks in Saudi Arabia. Applied Aquaculture 14, 113–124.

Anderson, A.J., Dawes, E.A., 1990. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbiology Reviews 54, 450–472.

Aslim, B., Caliskan, F., Beyatli, Y., Gündüz, U., 1998. Poly-β-hydroxybutyrate production by lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Letter 159, 293–297.

Baruah, K., Cam, D.T.V., Dierckens, K., Wille, M., Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P., 2009. In vivo effects of single or combined N-acyl homoserine lactone quorum sensing signals on the performance of Macrobrachium rosenbergii larvae. Aquaculture 288, 233–238.

Bearson, S., Bearson, B., Foster, J.W., 1997. Acid stress responses in enterobacteria. FEMS Microbiology Letter 147, 173–180.

Cavalli, R.O., Lavens, P., Sorgeloos, P., 1999. Performance of Macrobrachium rosenbergii broodstock fed diets with different fatty acid composition. Aquaculture 179, 387–402.

Cavalli, R.O., Berghe, E.V., Lavens, P., Thuy, N.T.T., Mathieu, W., Sorgeloos, P., 2000. Ammonia toxicity as a criterion for the evaluation of larvae quality in the prawn Macrobrachium rosenbergii. Comparative Biochemistry and Physiology 125, 333–343.

Cavalli, R.O., Lavens, P., Sorgeloos, P., 2001. Reproductive performance of Macrobrachium rosenbergii female in captivity. Journal of theWorld Aquaculture Society 32 (1), 60–67.

Cherrington, C.A., Hinton, M., Pearson, G.R., Chopra, I., 1991. Short-chain organic acids at pH 5.0 kill Escherichia coli and Salmonella spp. without causing membrane perturbation. Journal of Applied Bacteriology 70, 161–165.

Choi, G.G., Kim, H.W., Rhee, Y.H., 2004. Enzymatic and non-enzymatic degradation of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) copolyesters produced by Alcaligenes sp MT-16. Journal of Microbiology 42, 346–352.

D'Abramo, L.R., Sheen, S.S., 1993. Polyunsaturated fatty acid nutrition in juvenile freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii. Aquaculture 115, 63–86.

Defoirdt, T., Halet, D., Sorgeloos, P., Bossier, P., Verstraete, W., 2006. Short chain fatty acids protect gnotobiotic Artemia franciscana from pathogenic Vibrio campbellii. Aquaculture 261, 804–808.

Defoirdt, T., Halet, D., Vervaeren, H., Boon, N., Wiele, T.V., Sorgeloos, P., Bossier, P., Verstraete, W., 2007. The bacterial storage compound poly-β-hydroxybutyrate protects Artemia franciscana from pathogenic Vibrio campbellii. Environmental Microbiology 9, 445–452.

Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P., 2009. Short-chain fatty acids and poly-β-hydroxyalkanoates: (new) biocontrol agents for a sustainable animal production (review). Biotechnology Advances 27, 680–685.

De Man, J.G., 1879. On some species of the genus Palaemon Fabr. with descriptions of two new forms. Notes from the Royal Zoological Museum of the Netherlands at Leiden, 1, pp. 165–184.

Devresse, B., Romdhane, M., Buzzi, M., Rasowo, J., Léger, P., Brown, J., Sorgeloos, P., 1990. Improved larviculture outputs in the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii fed a diet of Artemia enriched with n−3 HUFA and phospholipids. World Aquaculture 21, 123–125.

Doi, Y., Kanesawa, Y., Kunioka,M., Saito, T., 1990. Biodegradation ofmicrobial copolyesters: poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) and poly (3-hydroxybutyrate-co-4- hydroxybutyrate). Macromolecules 23, 26–31.

FAO, 2000. Aquaculture Production Statistics 1989–1998. FAO Fisheries Circular, vol. 815. FAO, Rome. Rev. 12. Han, K., Geurden, I., Sorgeloos, P., 2000. Enrichment strategies for Artemia using emulsions

providing different levels of n−3 highly unsaturated fatty acids. Aquaculture 183, 335–347.

Harrison, K.E., 1990. The role of nutrition in maturation, reproduction and embryonic development of decapod crustaceans: a review. Journal of Shellfish Research 9, 1–28.

Huys, L., Dhert, P., Robles, R., Ollevier, F., Sorgeloos, P., Swings, J., 2001. Search for beneficial bacterial strains for turbot (Scophthalmus maximus L.) larviculture. Aquaculture 193, 25–37.

Jayaprakash, N.S., Rejish, K.V.J., Philip, R., Bright, S.I.S., 2006. Vibrios associated with Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879) larvae from three hatcheries on the Indian southwest coast. Aquaculture Research 37, 351–358.

Jendrossek, D., Handrick, R., 2002. Microbial degradation of polyhydroxyalkanoates. Annual Review of Microbiology 56, 403–432.

Karunasagar, I., Pai, R., Malathi, G.R., Karunasagar, I., 1994. Mass mortality of Penaeus monodon larvae due to antibiotic resistant Vibrio harveyi infection. Aquaculture 128, 203–209.

Kennedy, B., Venugopal, M.N., Karunasagar, I., 2006. Bacterial flora associated with the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii in the hatchery system. Aquaculture 216, 1156–1167.

Khanna, S., Srivastava, A.K., 2004. Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates. Process Biochemistry 40, 607–619.

Kim, B.S., 2000. Production of poly(3-hydroxybutyrate) from inexpensive substrates. Enzyme and Microbial Technology 27, 774–777.

Lavens, P., Thongrod, S., Sorgeloos, P., 2000. Larval prawn feeds and the dietary importance of Artemia. In: New, M.B., Valenti, W.C. (Eds.), Freshwater Prawn Culture. Blackwell, Oxford, pp. 91–111.

Lightner, D.V., 1996. Disease of culture penaeid shrimp, In: McVey, J.P. (Ed.), Handbook of Mariculture: Crustacean Aquaculture, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL.

Maddox, M.B., Manzi, J.J., 1976. The effects of algal supplements on static system culture of Macrobrachium rosenbergii (de Man) larvae. Proceedings of the World Mariculture Society 7, 677–698.

Middleditch, B.S., Missler, S.R., Hines, H.B., McVey, J.P., Brown, A., Ward, D.J., Lawrence, A.L., 1980. Metabolic profiles of penaeid shrimp: dietary lipids and ovarian maturation. Journal of Chromatography 195, 359–368.

Nayak, S.K., Mukherjee, S.C., 1997. Microbial pathogens involved in the coastal shrimp, Penaeus monodon farming in Orissa. Fish Chimes 17, 37–39.

New, M.B., 2003. Farming freshwater prawns: a manual for the culture of the giant river prawn, Macrobrachium rosenbergii. FAO Fisheries Technical Paper No. 428. FAO, Rome, Italy, pp. 145–146.

Olsson, J.H., Allan,W., Conway, P.L., Kjelleberg, S., 1992. Intestinal colonization potential of Turbot (Scophthalmus maximus) and Dab (Limanda limanda)-associated bacteriawith inhibitory effects against Vibrio anguillarum. Applied Environmental Microbiological 58, 551–556.

Ostle, A.G., Holt, J.G., 1982. Nile Blue A as a fluorescent stain for poly-β-hydroxybutyrate. Applied Environmental Microbiology 44, 238–241.

Otta, S.K., Karunasagar, I., Karunasagar, I., 2001. Bacteriological study of shrimp, Penaeus monodon Fabricius, hatcheries in India. Journal of Applied Ichthyology 17, 59–63.

Phatarpekar, P.V., Kenkre, V.D., Sreepada, R.A., Desai, U.M., Achuthankutty, C.T., 2002. Bacterial flora associated with larval rearing of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. Aquaculture 203, 279–291.

Querijero, B.V.L., Teshima, S., Koshio, S., Ishikawa, M., 1997. Utilization ofmonounsaturated fatty acid (18:1n–9) by freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii (de Man) juveniles. Aquaculture Nutrition 3, 127–139.

Quinteros, R., Goodwin, S., Lenz, R.W., Park, W.H., 1999. Extracellular degradation of medium chain length poly (β-hydroxyalkanoates) by Comamonas sp. International Journal of Biological Macromolecules 25, 135–143.

Romdhane, M.S., Devresse, B., Léger, Ph., Sorgeloos, P., 1995. Effects of feeding (ω−3) HUFA-enriched Artemia during a progressively increasing period on the larviculture of freshwater prawns. Aquaculture International 3, 236–242.

Roustaian, P., Kamarudin, M.S., Omar, H., Saad, C.R., Ahmad, M.H., 1999. Changes in fatty acid profile during larval development of freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii (de Man). Aquaculture Research 30, 815–824.

Schneider, S.M., Rosskopf, E.N., Leesch, J.G., Chellemi, D.O., Bull, C.T., Mazzola, M., 2003. Research on alternatives to methyl bromide: pre-plant and post-harvest. Pest Management Science 59, 814–826.

Sheen, S.S., D'Abramo, L.R., 1991. Response of juvenile freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, to different feeding levels of a cod liver oil/corn oil mixture in a semipurified diet. Aquaculture 93, 121–134.

Skjermo, J., Vadstein, O., 1999. Techniques for microbial control in the intensive rearing of marine larvae. Aquaculture 177, 333–343.

Sorgeloos, P., Léger, P., 1992. Improved larviculture outputs of marine fish, shrimp and prawn. Journal of World Aquaculture Society 23, 251–264.

Sun, C.Q., O'connor, C.J., Turner, S.J., Lewis, G.D., Stanley, R.A., Roberton, A.M., 1998. The effect of pH on the inhibition of bacterial growth by physiological concentrations of butyric acid: implications for neonates fed on suckled milk. Chemical–Biological Interactions 113, 117–131.

Sung, H.H., Hwang, S.F., Tasi, F.M., 2000. Responses of Giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii to challenge by two strain of Aeremonas spp. Journal of Invertebrate Pathology 76, 278–284.

Teo, J.W.P., Suwanto, A., Laa Poh, C., 2000. Novel β-macatmase genes from two environmental isolates of Vibrio harveyi. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 44, 1309–1314.

Teo, J.W.P., Tan, T.M.C., Laa Poh, C., 2002. Genetic determinants of tetracycline resistance in Vibrio harveyi. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46, 1038–1045.

Teshima, S., 1972. Sterol metabolism. Memoirs of Faculty of Fisheries, Kagoshima University 21, 69–147.

Teshima, S., 1997. Phospholipids and sterols. In: D'Abramo, L.R., Conklin, D.E., Akiyama, D.M. (Eds.), Crustacean Nutrition.World Aquaculture Society, Baton Rouge, LA, pp. 85–107.

Teshima, S., Kanazawa, A., 1983. Variation in lipid composition during the ovarian maturation of the prawn. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries. 49, 957–962.

Teshima, S., Kanazawa, A., Hitotsumatsu, K., Kim, K.S., Oshida, K., Koshio, S., 1992. Tissue uptake and bioconversion of eicosapentaenoic acid and phosphatidylcholine in prawns, Penaeus and Macrobrachium. Comparative Biochemistry Physiology 102B, 885–890.

Teshima, S., Ishikawa, M., Koshio, S., Kanazawa, A., 1997. Necessity of dietary cholesterol for the freshwater prawn. Fisheries Sciences 63, 596–599.

Tidwell, J.H.,Webster, C.D., Coyle, S.D., Daniels,W.H., D'Abramo, L.R., 1998. Fatty acid and amino acid composition of eggs, muscle and mid gut glands of freshwater prawns, Macrobrachium rosenbergii (de Man), raised in fertilized ponds, unfertilized ponds or fed prepared diets. Aquaculture Research 29, 37–45.

Uno, Y., Kwon, C.S., 1969. Larval development of Macrobrachium rosenbergii (de Man) reared in the laboratory. Journal of the Tokyo University of Fisheries 55, 179–190.

Van Der Wielen, P., Biesterveld, S., Notermans, S., Hofstra, H., Urlings, B.A.P., Van Knapen, F., 2000. Role of volatile fatty acids in development of the cecal microflora in broiler chickens during growth. Applied and Environmental Microbiology 66, 2536–2540.

Van Immerseel, F., Boyen, F., Gantois, I., Timbermont, L., Bohez, L., Pasmans, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R., 2005. Supplementation of coated butyric acid in the feed reduces colonization and shedding of Salmonella in poultry. Poultry Science 84, 1851–1856.

Van Immerseel, F., De Buck, J., Pasmans, F., Velge, P., Bottreau, E., Fievez, V., Haesebrouck, F., Ducatelle, R., 2003. Invasion of Salmonella enteritidis in avian intestinal epithelial cells in vitro is influenced by short-chain fatty acids. International Journal of Food Microbiology 85, 237–248.

Waldroup, A., Kaniawati, S., Mauromoustakos, A., 1995. Performance characteristics and microbiological aspects of broilers fed diets supplemented with organic acids. Journal of Food Protection 58, 482–489.

Yilmaz, M., Soran, H., Beyatli, Y., 2005. Determination of poly-beta-hydroxybutyrate (PHB) production by some Bacillus spp.World Journal of Microbiology and Biotechnology 21, 565–566.

Yoshie, N., Fujiwara, M., Kasuya, K.I., Abe, H.Y., Doi, Y., Inoue, Y., 1999. Effect of monomer composition and composition distribution on enzymatic degradation of poly (β-hydroxybutyrate-co-β-hydroxyvalerate). Macromolecular Chemitry and Physics 200, 977–982.