Electroforeza proteinelor serice

Imunofixarea proteinelor serice

- Metoda nefelometrica- determinarea cantitativa a lanturilor usoare k si

Electroforeza proteinelor sericePrincipiul metodei Electroforeza este metoda de separare a moleculelor proteice n funcie de sarcina electric i de greutatea molecular. Metoda electroforetic se aplic probelor de ser, urinii i lichidului cerebrospinal. Viteza cu care proteina migreaza intr-un camp electric (mobilitatea electroforetica) este specifica fiecarei proteine in parte si depinde att de proprietile proteinei de separat ct i de proprietile soluiei n care se face separarea: pH, fora ionic a tamponului, temperatura i intensitatea curentului electric.

Fig. 16. Migrarea electroforetic a unor proteine in funcie de sarcina electrica.A. n mediu acid:B. n mediu alcalin:

Electroforeza proteinelor sericeMateriale si metode- aparatul semiautomat Hydrasys , SEBIA - kit Hydragel 12; - camer umed furnizat cu sistemul HYDRASYS; - pipete: 10 L si 200 L - densitometru / scanner capabil s citeasc geluri de 82 x 51 mm sau 82 x 102 mm la o lungime de und de 570 nm sau cu filtru galben ;

Coninutul kit-ului:10 geluri de agaroz;- 10 pachete ce conin fiecare cte doi burei cu tampon (fiecare burete conine tampon tris-barbital pH 8.5 0.3);1 recipient (60 mL) ce conine diluant pentru colorant;1 recipient (20 mL) ce conine colorant amidoblack;1 pachet cu 10 aplicatoare (fiecare aplicator conine cte 7, 15 i respectiv 30 de poziii);1 pachet cu 10 buci de hrtie de filtru;1 recipient (100 mL) ce conine soluie de decolorare.Fiecare gel conine: agaroz, 0.8 g/dL ; soluie tampon tris-barbital (pH 8.5 0.1). Bureii cu soluie tampon conin: tampon tris-barbital (pH 8.5 0.3); azida de sodiu.

Aplicarea probelor, poziionarea aplicatoarelor n camera umed, pregtirea modulului de migrare i selectarea programului de migrare.

Aplicarea probelor, poziionarea aplicatoarelor n camera umed, pregtirea modulului de migrare i selectarea programului de migrare.

Electroforeza proteinelor serice

Prezentarea si interpretarea rezultatelor

Rezultatele sunt prezentate sub 2 forme : scanare densitometrica si valori numerice pentru fiecare fractiune (% si g/dl).

Prezentarea si interpretarea rezultatelor

FractiuneInterval de ref.(%)Interval de ref.(conc.) g/dLAlbumina53.5 66.53.60 5.201- globuline1.4 -4.00.10 0.302- globuline8.0 15.70.50 0.901- globuline5.6 12.10.60 0.802- globuline1.8 7.20.20 0.40-globuline7.9 18.91.00 1.60

Electroforeza proteinelor sericeProteinele identificate in cele 6 fractiuni majore separate prin electroforeza

Fractiunea electroforetica majoraTipul de proteinaAlbuminaprealbumina1-globuline1-glicoproteina acida ( orosomucoidul)1-antitripsina1-lipoproteinele (HDL)1-antichimotripsinaprotrombina2-globuline2-macroglobulinahaptoglobinaantitrombina III1- globulineTransferina- lipoproteine (LDL)transcobalamina IIhemopexina2- globulineProteina C reactivaComplement C32- microglobulina2- glicoproteina I si IIIIgA- globulineFibrinogenIgGIgAIgMIgEIgD

Modificarile ce pot aparea intr-o migrare electroforetica la nivelul fractiunilor majore

Bisalbuminemia se poate datora unor mutatii ereditare fara sa aiba consecinte patologice - dobandita (tranzitorie) datorata unei pancreatite sau tratamentului cu doze mari de lactamHiperalbuminemia- este intalnita cel mai des la pacientii spitalizati care au beneficiat de perfuzii cu albuminaHipoalbuminemia- se poate datora unei subnutritii severe, unei sinteze scazute a acesteia ( insuficienta hepatocelulara, inflamatie), sindrom nefrotic, hipercatabolism ( endocrinopatii dobandite).

Sindrom inflamator acutSindromul inflamator acut este asociat cu valori crescute ale fractiunii 2- globulinice si valori scazute ale albuminei. Acest proces este datorat cresterii proteinelor de faza acuta: 1- antitripsina si haptoglobina .

Lanturi usoare Prezenta lantului usor in aceasta zona de migrare a fost confirmata prin dou metode: imunofixarea proteinelor serice si metoda nefelometrica.

Sindrom nefrotic Sindromul nefrotic este asociat cu : valori crescute ale fractiunii 2-globuline lor datorate 2- macroglobulinei hipoalbuminemievalori crescute ale fractiunii -globulina hipogamaglobulinemie.

Ciroza alcoolica In ciroza alcoolica supraproductia de IgA si IgM duce la fuzionarea fractiilor si creand un aspect al electroforegramei de bloc

HipogamaglobulinemiaApare in imunodeficienta primara sau in imunodeficienta secundara datorata tratamentului cu corticosteroizi, imunosupresoare, chimio si radioterapiei. Aspectul de hipogamaglobulinemie mai este prezent si in cazul mielomului multiplu micromolecular cand in urina se identifica proteine Bence Jones

HipergamaglobulinemiaAspectul este de crestere difuza a fractiunii gama datorata in principal bolilor hepatice, infectiilor bacteriene si parazitare sau bolilor autoimune

Proteina MProteina M - se prezinta sub forma unei benzi bine delimitate iar aspectul pe electroforegrama este acela al unui pic ascutit cu baza ingusta. Apare in neoplaziile limfoproliferative ( mielom multiplu).

Proteina M

Proteina M

Imunofixarea proteinelor sericePrincipiul metodei Imunofixarea proteinelor serice consta in doua etape:

A. Separarea electroforetica in mediu alcalin, la un pH de 9.1, a proteinelor serice;

B. Imunoprecipitarea folosind antiseruri monospecifice.

Imunoprecipitarea este rezultatul interactiunii antigenelor cu anticorpii specifici intr-un mediu suport care poate fi un gel de agaroza sau un mediu lichid. Factorul cel mai important in acest proces este natura bivalenta a moleculelor de anticorp care reactioneaza cu epitopii multipli ai antigenului solubil.

Materiale, echipamente i accesorii necesare:

- kit Hydragel 1IF, 2 IF, 4 IF sau 9 IF furnizate de SEBIA; - sistem semiautomat HYDRASYS 2 SEBIA;- camer umed furnizat cu sistemul HYDRASYS;- pipete: 10 L si 200 L;masc standard SEBIA; Fiecare kit este nsoit de un set de antiseruri monospecifice: anti lanuri grele ,, i anti lanuri usoare i care formeaz complexe imunoprecipitante cu proteinele anormale separate electroforetic.

Coninutul kit-ului:-10 geluri de agaroz;-10 pachete ce conin fiecare cte doi burei cu tampon (pH 9.1 0.3);-1 recipient (60 mL) ce conine diluant pentru colorant;-1 recipient (20 mL) ce conine colorant amidoblack;-1 recipient (32 mL) ce conine diluent (soluie alcalin pH 7.5 0.3 i bromfenol albastru) i este utilizat pentru diluia probelor;-1pachet cu 10 aplicatoare (fiecare aplicator conine cte 7, 15 i respectiv 30 de poziii);-1 pachet cu 10 buci de hartie de filtru fin;-1 pachet cu 10 buci de hrtie de filtru pieptn; -1 recipient (100 mL) ce conine soluie de decolorare.-1 recipient de 14,4 ml cu soluie de fixare;-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lan greu gama;-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lan greu miu;-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lan greu alfa;-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lan usor kappa;-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lan usor lambda.-1 pachet cu 10 buci de hartie de filtru groas;

Imunofixarea proteinelor sericePentru fiecare caz este necesar sa se aplice cate 10 l de proba diluata in sase godeuri dupa cum urmeaza: ELF, IgG, IgA, IgM, si .Inainte de a se incepe separarea electroforetica a proteinelor, proba trebuie diluata, pentru fiecare tip de lant greu si lant usor existand o anumita dilutie standard prezentata in tabelul de mai jos.

Dilutii speciale: pentru valori ale IgG > 20 g/l se recomanda dublarea cantitatii de diluant pentru valori ale IgG < 5 g/ l se recomanda reducerea la jumatate a cantitatii de dilaunt

Tipul de Ig Cantitatea de ser si diluantElectroforeza tuturor proteinelor30 l ser + 60 l diluant IgG20 l ser + 100 l diluant IgA, IgM, , 30 l ser + 60 l diluant

Imunofixarea proteinelor sericeMod de lucru: - Aplicarea probei: in decurs de 2 minute se pun cate 10 l de ser diluat in cele 6 godeuri, primul godeu corespunde unei migrari electroforetice normale iar celelalte godeuri corespund celor trei tipuri de lant greu (, si ) si celor dou tipuri de lant usor si ;

Aplicarea probelor n godeurile de pe aplicator i poziionarea aplicatorului n camera umed.

Aplicarea soluiei de fixare i a antiserurilor. n cele 6 godeuri corespunztoare unei singure probe sunt adugate dup cum urmeaz: soluie de fixare (40 l), i cte 25 l de antiser anti lan , antiser anti lan , antiser anti lan , antiser anti lan , antiser anti lan .

Imunofixare- interpretareRezultatele sunt calitative si permit identificarea tipului de lant greu (H) si lant usor (L) al unei proteine monoclonale.

Imunofixare- interpretareRezultatele sunt calitative si permit identificarea tipului de lant greu (H) si lant usor (L) al unei proteine monoclonale.

Imunofixare- interpretare

Cuantificarea lanturilor libere usoare k si prin metoda nefelometricaPrincipiul metodei: Nefelometria masoara intensitatea luminii dispersate de catre un complex Ac-Ag. Fasciculul de lumina trece prin cuva de reactie in care se afla complexul Ac-Ag iar lumina dispersata de acest complex este detectata de catre un fotodetector situat la un unghi < 900 fata de unghiul initial al fasciculului de lumina. Cantitatea de lumina dispersata este corelata cu concentratia proteinei de analizat.In timpul reactiei in vitro, lantul usor se leaga de anticorpul policlonal conjugat cu latex cu specificitate pentru epitopii expusi pe lanturile usoare libere.

Reactivi necesari: Kitul FREELITE compatibil cu nefelometrul Dade-Behring BNProSpec care contine:a) anticorpi policlonali anti k si uman conjugati cu latex;b) Calibrator ( ser uman ce contine lant policlonal kapa si lambda )- pana in prezent nu exista un calibrator universal care sa permita realizarea unui control de calitate extern; c)seruri control +/- (nivel scazut si ridicat).Fiecare serie de reactivi are propriul calibrator si control.Reactivi suplimentari: tampon de reactie, diluant.

Cuantificarea lanturilor libere usoare k si prin metoda nefelometrica

SERInterval de referintaLant liber k3.30-19.40 mg/LLant liber 5.71-26.30 mg/LRaport k/ 0.26- 1.65

Evolutia in dinamica a unui pacient diagnosticat cu mielom de tip IgG, Separarea electroforetica in gel de agaroza(poz nr.2)Imunofixarea proteinelor serice in gel de agarozaMO 32-33%Electroforeza nu a mai identificat prezenta componentei monoclonale

DataComponenta monoclonala g/dlg2 IgGmg/dlKmg/lmg/lRk/ 1gama2-2.7736.530.4

MO 3%autotransplant16.8 luni post t21.46 luni post t MO 6%29.86 luni post t.VADVELCADEZOMETALENALIDOMIDAVarsta : 45 ani

MO 11-12% celule mieloideELF: 2.88 g/dl- 2 globuline

6 luni de la diagnostic : autotransplant5 luni dupa transplant: - ELF proteina M - k normal - raportul / a scazut cu 27 % 11.5 luni dupa transplant - ELF normala - k sub intervalul de referinta - raportul / crescut16.8 luni dupa transplant: - ELF normala - k si raportul / recadere21.46 luni ELF proteina M29.86 luni- ELF si lantul k remisiune34.6 luni- recadere

*MGUS reprezinta o forma de gamapatie in care componentul monoclonal este sub 3 g /dL, plasmocite medulare sub 10 %.De obicei aceasta forma de boala nu necesita tratament ci numai o monotorizare foarte atenta deoarece o parte din aceste cazuri au progresie sper mielom multiplu. Noi am efectuat analiza FLC la 7 pacienti cu MGUS. La 3 pacienti raportul FLC este in limite normale, la un pacient raportul este usor modificat dar valoarea absoluta a lanturilor libere se afla in intervalul de normalitate , la alti 3 pacienti raportul FLC este usor modificat.

**