CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...
Transcript of CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...
UNIVERSITATEA TEHNICĂ ,, GHEORGHE ASACHI ” IAȘI
FACULTATEA DE INGINERIE CHIMICĂ ȘI PROTECȚIA
MEDIULUI
CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE
HIDROGEL PE BAZĂ DE BIOPOLIMERI CU
APLICAȚII ÎN INDUSTRIA ALIMENTARĂ
-Teză de doctorat -
Inginer chimist Camelia-Elene Iurciuc ( casatorita Tincu)
Conducător științific
Prof. em. dr. ing. dr.h.c. Marcel Popa
Iași - 2016
1
CUPRINS
Pg.
Introducere 6
CERCETARE BIBLIOGRAFICA 9
CAPITOLUL 1.Tipuri de compuși biologic activi utilizați în industria
alimentară
9
1.1.Celule de drojdie 9
1.1.1.Influența ionilor metalici asupra celulelor de drojdie și asupra eficienței
proceselor fermentative.
10
1.1.1.1 Magneziul 11
1.1.1.2. Zincul 15
1.1.1.3. Calciul 17
1.1.1.4. Manganul 18
1.1.1.5. Fierul 18
1.1.2. Procese fermentative 19
1.2. Enzime 20
1.2.1. Structura chimică a enzimelor 22
1.2.2. Tipuri de enzime 22
1.2.3. -Amilaza 23
1.2.3.1. Aplicații ale α-amilazei în medicină 25
1.2.3.2. Aplicații ale α-amilazei în industria alimentară 25
1.2.3.3. Amidonul-substrat pentru hidroliză 26
1.3. Substanțe nutraceutice 28
1.3.1 Tipuri de substanțe nutraceutice utilizate în industria alimentară 28
1.3.2 Curcumina: structură, proprietăți, aplicații 31
1.3.2.1.Separarea curcuminei 32
1.3.2.2. Caracteristici structurale ale curcuminei 33
1.3.2.3. Reactivitatea curcuminei 34
1.3.2.4. Studii farmacologice efectuate pe curcumină 38
CAPITOLUL 2. Polimeri utilizați pentru imobilizarea principiilor active în
industria alimentară
40
2.1. Polimeri naturali 40
2.1.1.Proteine 40
2.1.1.1. Proteine din plante 41
2.1.1.2. Proteine de origine animală 43
2.1.2. Polizaharide 44
2
2.1.2.1. Gelanul 45
2.1.2.2. Derivați celulozici 57
2.1.2.3. Chitina/Chitosanul 61
2.1.2.4. Caragenanul 66
2.1.2.5. Alginații 68
2.1.2.6. Polimeri sintetici 69
CAPITOLUL 3. Metode de imobilizare 71
3.1. Metoda extruderii sau a gelifierii ionice 72
3.2. Metoda emulsiei 75
3.3. Coacervarea 76
3.4. Uscarea prin pulverizare 78
3.5. Alte metode de formare a micro/nanoparticulelor 80
3.5.1. Obţinerea particulelor din polimeri preformaţi 80
3.5.2. Obţinerea micro/nanoparticulelor prin reticularea polimerilor în soluţie
/suspensie
80
3.5.3. Metoda reticulării termice 80
3.5.4. Metoda micelelor inverse 81
3.5.5. Chelatizarea 81
3.5.6. Coalescenţa picăturilor de emulsie 81
3.5.7. Procedeul spray – chilling (pulverizare-congelare) 82
3.5.8. Procedeul spray - cooling (pulverizare – răcire) 82
3.5.9. Procedeul în pat fluidizat – (bed coating) 82
3.5.10. Extruderea centrifugală 83
3.5.11. Procedeul de extracţie /evaporare a solventului 83
3.5.12. Procedeul sitării/sortării 83
3.5.13. Procedeul de depunere strat cu strat (layer by layer) 83
CAPITOLUL 4. Metode de imobilizare a principiilor active cu utilizări în
industria alimentară
84
4.1. Imobilizarea celulelor de drojdie de bere 84
4.2. Metode de imobilizare a -amilazei 87
4.3. Metode de imobilizare a curcuminei 90
4.3.1. Complecși cu ciclodextrine 90
4.3.2. Complecși cu fosfatidilcolină 90
4.3.3. Nanoparticule lipidice 91
4.3.4. Lipozomi 91
4.3.5. Micro/nanoemulsii 92
4.3.6. Imobilizarea în particule de polimer 92
3
REZULTATE PROPRII 94
Obiectivele lucrării 96
CAPITOLUL 5. Materiale, tehnici experimentale, metode de caracterizare 97
5.1. Materiale 96
5.2. Tehnici experimentale 99
5.2.1. Prepararea particulelor conținând celule de drojdie de bere imobilizate în
matrici polimere (polizaharide).
99
5.2.2. Prepararea particulelor conținând α-amilază imobilizată în matrice de
gelan.
101
5.2.3. Prepararea particulelor conținând cucrcumină imobilizată în matrici de
polizaharide
103
5.3. Tehnici de caracterizare 105
5.3.1. Spectroscopia FTIR-ATR 105
5.3.2. Morfologia particulelor (microscopie electronică de baleiaj) 105
5.3.3. Stabilitatea structurală a particulelor conținând drojdie de bere 106
5.3.4. Stabilitatea în diferite medii a sistemelor particulate conținând drojdie
de bere
107
5.3.5.Gradul de umflare 108
5.3.6.Viabilitatea celulară şi concentraţia celulelor de drojdie din medii apoase
și din particulele de imobilizat
109
5.3.7. Testarea activității fermentative a particulelor ce conțin celule de
drojdie.
112
5.3.8. Determinarea activității -amilazei libere și imobilizate 114
5.3.9.Determinarea constantei Michaelis-Menten și a vitezei maxime de
hidroliză -amilaza liberă și imobilizată
115
5.3.10. Influența pH-ului și a temperaturii asupra activității enzimatice 116
5.3.11.Testarea activității enzimatice a particulelor conținând enzimă
imobilizată, în mai multe cicluri hidrolitice
116
5.3.12.Cinetica eliberării curcuminei din particulele de imobilizat 117
CAPITOLUL 6. Obținerea de sisteme particulate pe bază de polizaharide
reticulate
ionic conținând celule de drojdie de bere imobilizate
118
6.1. Particule pe bază de gelan reticulat cu clorura de calciu conținând celule
de drojdie de bere imobilizate
119
6.1.1. Teste preliminare de obținere a particulelor de hidrogel 121
6.1.2.Stabilitatea particulelor și viabilitatea celulară 123
6.1.3. Gradul de umflare 126
6.1.4. Morfologia particulelor 127
6.1.5. Activitatea fermentativă a biorectoarelor 128
4
6.1.6.Evaluarea viabilității celulare și a cantității de celule din particule după
fiecare ciclu de fermentare
133
6.1.7. Productivitatea specifică și viteza de fermentare 134
Concluzii 135
6.2. Particule pe bază de gelan reticulat cu acetat de magneziu conținând celule
de drojdie de bere imobilizate
135
6.2.1. Morfologia particulelor 139
6.2.2. Stabilitatea în apă şi viabilitatea celulară 140
6.2.3. Stabilitatea în soluții alcoolice și viabilitatea celulară 143
6.2.4. Caracteristicile de umflare în apă 143
6.2.5. Stabilitatea mecanică a particulelor evaluată prin teste reologice 145
6.2.6. Testarea activităţii fermentative a imobilizatelor 148
Concluzii 154
6.3. Particule pe bază de gelan reticulat cu acetat de zinc conținând celule de
drojdie de bere imobilizate
155
6.3.1. Stabilitatea particulelor și viabilitatea celulară 158
6.3.2. Stabilitatea mecanică a particulelor 161
6.3.3. Gradul de umflare 163
6.3.4. Morfologia particulelor 163
6.3.5. Activitatea fermentativă a particulelor ce conțin celule de drojdie 165
6.3.5.1. Influența concentrației de agent de reticulare din preextrudat. 165
6.3.5.2. Influența concentrației de acetat de zinc din baia de extrudere 167
6.3.5.3. Influența timpului de păstrare a particulelor în baia de extrudere 168
6.3.5.4. Influența pH-ului din baia de fermentare 170
6.3.5.5. Influența concentrației de acetat de zinc din baia de fermentare 171
6.3.6. Productivitatea specifică și viteza de fermentare 176
Concluzii 178
6.4. Particule pe bază de amestecuri de gelan și carboximetil celuloză
reticulate cu acetat de zinc, conținând celule de drojdie de bere imobilizate
179
6.4.1. Evaluarea stabilității și a viabilității celulare 181
6.4.2. Gradul de umflare în apă 185
6.4.3. Morfologia particulelor 186
6.4.4. Evaluarea capacității de fermentare a glucozei în prezența imobilizatelor
obținute în diferite condiții
187
6.4.5. Productivitatea specifică și viteza de fermentare 190
Concluzii 191
6.5. Particule pe bază de amestecuri de gelan, carboximetil celuloză și
caragenan reticulate cu acetat de zinc, conținând celule de drojdie de bere
191
5
imobilizate
6.5.1. Caracterizarea particulelor prin spectroscopie FTIR-ATR 195
6.5.2. Stabilitatea în timp a particulelor fără celule de drojdie în diferite medii
(apoase)
196
6.5.3. Stabilitatea în timp a particulelor cu celule de drojdie imobilizate –
evaluarea concentrației de celule difuzate și a viabilității celulare
199
6.5.4. Capacitatea particulelor de a reține apa 201
6.5.5. Morfologia particulelor 203
6.5.6.Testarea activității fermentative a particulelelor ce conțin celule de
drojdie
205
6.5.7. Evaluarea viabilității celulare și a cantității de celule din particule după
fiecare ciclu de fermentare
211
6.5.8. Productivitatea specifică și viteza de fermentare 216
Concluzii 217
CAPITOLUL 7. Imobilizarea -amilazei în particule de gelan reticulat ionic. 219
7.1. Morfologia particulelor cu α-amilază imobilizată 223
7.2. Capacitatea de umflare în mediu apos 224
7.3. Caracterizarea enzimei libere 225
7.4. Determinarea constantei Michaelis-Menten și a vitezei maxime de
hidroliză
226
7.5. Influența pH-ului și a temperaturii asupra activității enzimei libere și
imobilizate
228
7.6. Testarea activității enzimatice a enzimei imobilizate în mai multe cicluri
hidrolitice
229
Concluzii 230
CAPITOLUL 8. Imobilizarea curcuminei în particule pe bază de polizaharide
complexate polielectrolitic și reticulate ionic cu acetat de magneziu
231
8.1. Morfologia particulelor 236
8.2. Capacitatea de umflare în medii apoase 236
8.3. Cinetica de eliberare a curcuminei din particule 237
Concluzii 240
CONCLUZII GENERALE 241
Bibliografie 247
6
Introducere
Procesele biocatalitice stau la baza a numeroase tehnologii utilizate în prezent nu
doar în industria alimentară, ci și cea farmaceutică, cosmetică sau chiar chimică determinând
o preocupare continuă a cercetătorilor din domeniu.
Biotehnologiile utilizate în industria alimentară apelează frecvent la compuși
biologic activi ce catalizează fermentarea sau hidroliza unor substraturi prin a căror
transformare se obțin produși de mare interes și utilitate. De cele mai multe ori, procesele
tehnologice la care se apelează sunt discontinui, iar biocatalizatorul – fie microorganism,
celulă, enzimă – este greu de îndepărtat din mediul de reacție, nu mai poate fi reutilizat ca
orice alt catalizator clasic, complică operațiile de purificare pentru obținerea unui produs
pur, așa cum impune utilizarea sa ca aliment.
Aceste câteva aspecte explică cercetările continui care se fac în domeniu, ce se referă
în esență la imobilizarea diferitelor tipuri de biocatalizatori pe suporturi netoxice, conducând
la realizarea de noi formulări ușor de recuperat din mediile în care lucrează, capabile de a fi
reutilizate de un număr mare de ori în procese discontinui, sau de utilizare o durată mai mare
de timp în procese continui.
O categorie importantă de produse de interes nu doar din punct de vedere alimentar
ci și prin beneficiile aduse sănătății sunt nutraceuticele – îmbinare originală a doi termeni:
‖nutriție‖ și ‖farmaceutic‖. Solubilitatea și biodisponibiitatea adeseori reduse ale acestora
impun adeseori realizarea de formulări care să le îmbunătățească aceste caracteristici.
Pornind de la aceste premize, teza de doctorat își propune să aducă contribuții
originale pe trei direcții:
- obținerea de particule pe bază de polizaharide ionice gelifiate ionotrop, conținând
celule de drojdie de bere imobilizate, caracterizarea și testarea lor în procese de fermentare
a glucozei;
- obținerea de particule pe bază de gelan, reticulat ionic, conținând -amilază
imobilizată, caracterizarea lor și testarea în procesul de hidroliză a amidonului;
- realizarea unei noi formulări nutraceutice prin încapsularea curcuminei în porticule
pe bază de polizaharide ionice cu caracter diferit, complexate polielectrolitic și prin gelifiere
ionotropă, caracterizarea lor și testarea din punct de vedere al capacității de eliberare
controlată/susținută a principiului activ.
Teza este structurată în două părți, prima constituind-o un studiu bibliografic extins
asupra problemelor abordate în cea de a doua parte a lucrării, care prezintă rezutale proprii
obținute în urma cercetărilor efectuate. Lucrarea se întinde pe 305 pagini, conține un număr
7
de 89 figuri, 44 tabele...scheme de reacție, 9 relații de calcul, încheindu-se cu concluziile
generale și cu lista referințelor bibliografice.
Studiul bibliografic este prezentat pe parcursul a 4 capitole ce tratează probleme
privind compușii biologic activi de interes pentru industria alimentară (cap. 1), polimerii
utilizați ca suport pentru imobilizarea acestora (cap. 2), tipurile de particule utilizabile
pentru încapsularea/includerea lor (cap. 3) și metodele generale de imobilizare a compușilor
biologic activi cu aplicații în industria alimentară (cap. 4).
Capitolul 5 prezintă materialele, tehnicile de lucru și de ceracterizare utilizate.
Capitolul 6 deschide seria celor 3 capitole care raportează rezultatele originale
obținute în cadrul lucrării. Având o extindere mai matre, el tratează pe parcursul a 5
subcapitole diferite tipuri de imobilizate pentru celule de drojdie de bere, obținute utilizând
polizaharide ionice și diferiți agenți reticulanți de tipul cationilor metalici divalenți. Primele
trei subcapitole prezintă imobilizate pe bază de gelan reticulat cu cationi de Ca2+
, Mg2+
, Zn2+
relevând caracteristicile morfologice, fizico-chimice și biochimice ale acestora.
Următoarele subcapitole discută obțierea de particule pe bază de amestecuri de polizaharide
(binar, ternar) – gelan, carboximetil celuloză sare de sodiu, caregenan -, relevând ca și
anterior proprietățile imobilizatelor cu accent pe capacitatea de a cataliza fermentarea
glucozei.
Capitolul 7 prezintă obținerea prin procedeul amintit anterior și caracterizarea fizico-
chimică și din punct de vedere al acțiunii biocatalitice, a unor particule pe bază de gelan
conținând imobilizată -amilaza.
Ultimul capitol (8) se referă la obținerea unei noi formulări nutraceutice conținând
curcumină, având comun cu cele precedente suportul polimeric pentru imobilizare
(polizaharide ionice) și parțial metode de obținere care implică însă nu doar gelifierea
ionotropă ci și complexarea polielectrolitică. Particulele obținute sunt catracterizate
morfologic, fizico-chimic și din punct de vedere al capacității de includere dar îndeosebi de
eliberare a curcuminei.
La finalul lucrării sunt prezentate concluziile generale și lista bibliografică.
Rezultatele cercetărilor efectuate au fost valorificate prin elaborarea a 10 lucrări
științifice care se află în următoarele stadii:
- 3 lucrări publicate (2 în reviste cu coeficient de impact)
- 2 lucrări acceptate pentru publicare (1 în revistă cu coeficient de impact)
- 7 lucrări redactate, trimise la reviste cu coeficient de impact
8
- 13 comunicări la manifestări științifice interne (2) și internaționale (11) între care
7 comunicări orale.
9
CAPITOLUL 1
Tipuri de compuși biologic activi utilizați în industria alimentară
Industria farmaceutică utilizează predominant compuși naturali și biotehnologii
pentru procesarea acestora. O categorie importrantă o constituie compușii cu activitate
biologică, ce au acțiune fie în biotehnologiile de procesare, fie în produsul rezultat.
In cele ce urmează va fi efectuată o prezentare a 3 tipuri de compuși biologic activi,
selectați pentru cercetările întreprinse în cadrul tezei de doctorat.
1.1. Celule de drojdie
Saccharomyces cerevisiae sunt microorganisme eucariote clasificate în domeniul
fungilor. Sunt cunoscute ca drojdii de bere sau de panificație și sunt utilizate în industria de
panificație sau pentru producerea berii. Celulele se reproduc asexuat prin înmugurire iar
diametrul lor este cuprinsă între 3-4 μm. Drojdiile Saccharomyces cerevisiae sunt facultativ
anaerobe, dar pot supraviețui atât în condiții anaerobe cât și aerobe.
Drojdia de panificație reprezintă o masă de celule vii Saccharomyces cerevisiae. În
prezența glucozei utilizată ca sursă de carbon, în condiții anaerobe, se produce etanol ca un
rezultat al procesului de fermentare a glucozei. Atunci când celule de drojdie sunt cultivate
cu melasă în condiții aerobe, se produc cantități mari de drojdie, cunoscută și comercializată
ca drojdie de panificație [1-3].
Istoria drojdiei este foarte veche, prima înregistrare a existenței pâinii a fost în anul
266 Î.H., în Babilonia. Se crede că egiptenii antici au fost primii care au descoperit pâinea
dospită, preparată pentru prima dată prin amestecarea berii în fermentație cu făină de grâu.
În anul 1780 drojdia era produsă prin utilizarea a 70% secară și 30% malț urmând procesul
de fermentare iar apoi separarea drojdiei. Randamentul de producție a drojdiei a crescut
atunci după anul 1840, când în Austria a început să fie utilizat porumbul în scopul producerii
sale.
Primele studii ale proceselor fermentative au început cu Pasteur în 1860. După
1870 a fost fondat la Berlin primul laborator experimental. Descoperirea aerării a fost
eficientă pentru fermentarea drojdiei și prima drojdie uscată a fost obținută în 1890. Melasa
a fost introdusă în procesul de producere a drojdiei de panificație în 1915, în Germania.
Modificări ale procedeului de producere a drojdie de panificație sunt aduse ți în zilele
noastre.
Materia primă utilizată pentru producția drojdiei de panificație este melasa, bogată
în surse de carbon și ioni importanți pentru metabolismul drojdiei, cu un conținut de 40-55%
10
în greutate zaharuri, în formă de zaharoză. Nutrienții și mineralele necesare în producția de
drojdie se găsesc în melasă și cei mai importanți sunt: azot, potasiu, fosfați, magneziu, calciu
și urme de fier, zinc, mangan și molibden [4].
Pentru cercetările efectuate în cadrul tezei a fost selectată o tulpină de drojdie
comercială, de panificatie, care se găsește sub formă comprimată și are un conținut de apă de
70%. Ea reprezintă o biomasă de celule din specia Saccharomyces cerevisiae (drojdie de
fermentație superioară), formată de celule vii, capabile să producă fermentarea zaharurilor
cu formarea de alcool etilic și dioxid de carbon. [4-9]. Caracteristicile celulei sunt: diametrul
-2-8 μm; volumul: 0,8-2 x10-3
cm3; greutatea: 0,2-0,4x 10
-10 g, numărul de celule/g: 8-14
x109; suprafața per g: 8-14 x10
9. Aceste celule absorb cel mai ușor hexozele (glucoza), apoi
zaharoza și maltoza. Celula de drojdie este constituită dintr-o varietate de biopolimeri și
macromolecule [5-9].
Cunoașterea compoziției lor și a cantității este esențială pentru metabolism și pentru
analiza creșterii biomasei. Biomasa de celule Saccharomyces cerevisiae este constituită din
cinci grupe de macromolecule: proteine, carbohidrați, lipide, ARN și ADN [10].
1.1.1. Influența ionilor metalici asupra celulelor de drojdie și asupra eficienței
proceselor fermentative.
Celulele de drojdie necesită o gamă largă de metale pentru creșterea lor și pentru
metabolism. Cercetările efectuate au evidențiat faptul că ionii metalici pot avea un impact
major asupra progresului, creșterii eficienței proceselor fermentative industriale și asupra
unor parametri importanți, inclusiv în viteza de conversie a zahărului în etanol, în
randamentul final în etanol, în creșterea și multiplicarea drojdiei, asupra viabilității celulare,
asupra factorilor de stres și asupra comportamentului de floculare a drojdiei.
Metale cum ar fi magneziul și potasiul sunt necesare, în general, pentru creșterea
celulelor de drojdie și se utilizează în concentrații milimolare în timp ce altele precum
calciul și zincul în cantități micromolare sunt necesare celulei pentru a-și îndeplini funcțiile
fiziologice [11,12]. Metalele grele însă pot fi toxice pentru celulele de drojdie [13].
În procesele fermentative pentru obținerea berii, ionii metalici principali sunt
reprezentați de către magneziu și zinc, care acționează ca și cofactori pentru multe enzime
glicolitice importante și, de asemenea, ca modulatori la factorii de stres pentru drojdie.
În cazul proceselor industriale factorii de stres care pot afecta celulele de drojdie
rezultă din produsele secundare produse de etanol (metaboliții) și de natura sistemului în
11
care sunt utilizate. Un alt factor de stres pentru celulele de drojdie poate fi un mediu
deficient în nutrienți. [14, 15]
Condițiile de mediu care duc la apariția factorilor de stres pot fi fluctuații rapide de
temperatură, presiune osmotică ridicată, concentrația crescută în etanol și lipsa nutrienților
care afectează în mod negativ metabolismul celulelor de drojdie detrminând astfel un proces
de fermentare ineficient. [16,17]
Celulele de drojdie afectate de factorii de stres sunt identificate printr-o creștere a
capacității lor de acidifiere odată cu transferul într-un mediu bogat nutritiv. [18] Cercetările
efectuate au constatat faptul că performantele celulelor de drojdie sunt afectate diferit de
factorii de stres menționați anterior și rezistența lor la acești factori depinde de tulpina
drojdiei, starea fiziologică a celulei, natura fizico-chimică a mediului de fermentare și de
prezența altor microorganisme cum ar fi drojdia sălbatică și bacteriile. [19]
Rezultatele cercetărilor au evidențiat faptul că toleranța la factorii de stres a
celulelor este dependentă de compoziția nutrițională a mediului de fermentare. [20, 21]
Compoziția mediului include surse de carbon, azot și câțiva ioni metalici care ajută la
creșterea performanței fermentării. Ionii metalici mențin integritatea structurală și
funcționalitatea organitelor intracelulare, induse de interacțiunile celulă-celulă cum ar fi
flocularea, reglarea expresiei genelor, mecanismul de absorbție a nutrienților, activarea
enzimelor implicate în metabolism și de asemenea acționează ca protectori la factorii de
stres. [22-27]
Drojdiile au capacitatea de a absorbi foarte eficient mineralele esențiale din mediu
și să le excludă pe cele neesențiale. Magneziul și zincul sunt absorbite în mod activ din
mustul de bere pentru a-și îndeplini rolurile fiziologice esențiale. Biodisponibilitatea ionilor
metalici în mediul de fermentare este un factor important care influențează fiziologia celulei
de drojdie și obținerea produșilor de fermentație a drojdiei. [28]
1.1.1.1 Magneziul
Ionul divalent de magneziu este cel mai abundent, implicat într-o gamă largă de
procese biologice. [29-31] El constituie cam 0,3% din întreaga masă de drojdie uscată [32]
și activează peste 300 de enzime [22,33]. Menținerea integrității celulare, ceea ce include
stabilizarea structurală a acizilor nucleici, a plinucleotidelor, a cromozomilor,
polizaharidelor și lipidelor au fost atribuite magneziului. [27]. Mg2+
este un cofactor esențial
pentru enzime și componentul structural cheie în cele mai multe molecule biologice dar
identitatea moleculară a reglării sale în celula de drojdie este încă slab elucidată. [31]
Membranele periplasmatice ale drojdiei mitocondriale și cele mai importante, vacuolare,
12
sunt identificate a fi canale și depozite ale ionilor metalici prin care aportul ionilor Mg2+
este
reglat prin medierea proteinelor de transport, de care se leagă. Reglarea aportului de
magneziu în celulele de drojdie are loc în două faze: chemosorbția și bioacumularea. [31,
34]
Chemosorbția este prima fază a absorbției pentru transport, fiind dependentă de
structura (permeabilitatea) peretelui celular al drojdiei. Acesta este constituit în mare parte
din β-1,3-glucan (până la 50% din compozitia peretelui celular), manoproteine (40%) și β-
1,6-glucan (10 %).[35] Servește ca loc de legare pentru magneziu datorită prezenței grupelor
anionice încărcate negativ (fosfonat, carboxil, hidroxil și amine) prezente pe stratul exterior
al peretelui celular [12, 31]. Dinamismul magneziului la nivelul peretelui celular a fost
raportat a fi afectat în mod semnificat de temperatură, pH, numărul celulelor viabile și nu în
ultimul rând de prezența altor ioni. [36] Cercetările efectuate au recomandat temperatura
optimă și variația pH-ului între anumite limite, respectiv T=25-35˚C și pH=4-8 pentru
creșterea absorbției ionilor metalici. [37, 38]
Au fost stabilite corelații antagoniste ale ionului Mg2+
cu alți ioni metalici cum ar fi
stronțiul, pe care îl elimină parțial din vacuolele celulare în cadrul activității celulelor
consolidate (Avery si Tolin, 1992). Cadmiul afectează negativ procesul de legare a
cationului Mg2+
, iar magneziul scade capacitatea celulei de drojdie de a absorbi zincul. [36,
39, 40]
Un alt factor important pentru absorbția magneziului este vitalitatea celulară. Un
efect inhibitor în procesul de legare al ionului metalic în celule cu volume mari a fost
raportat de Park și colab. (2003) [36], deși celulele foarte viabile s-au dovedit a se lega în
mod activ la magneziu.[31, 39]
Influența diferitelor condiții de mediu, a surselor de carbon și azot asupra creșterii
celulare și asupra biodisponibilității magneziului au fost arătate în cercetările privind
procesele de obținere a berii și a fost dovedit faptul ca ionul Mg2+ este esențial pentru
creșterea celulelor de drojdie.[28]
Bioacumularea este a 2-a fază în procesul de transport al ionului de Mg2+
și implică
absorbția magneziului din peretele celular și membrana citoplasmatică în citoplasma
celulelor de drojdie. Acumularea intracelulară de magneziu este mediată de către principalul
transportor al proteinelor de care magneziul este legat și anume Alr1p și Alr2p (aluminium –
resistance permeases) și sunt codate ca și gene ALR1 și ALR2. [31, 32, 34]. Ambele
proteine de transport fac parte din proteinele membranare integrate, numite și transportori de
ioni metalici (TIM). Acestea au asemănări în ceea ce privește structura, masa moleculară și
13
punctul izoelectric [31, 32] și se presupune că împart aceeași linie de activitate. Inactivarea
ambelor proteine de transport opresc creșterea dependentă de magneziu a celulelor dar și
afectarea absorbției de magneziu în drojdie. [31, 41]
Procesu de bioacumulare are un ritm mai lent în comparație cu procesul de
chemosorbție.[34] Ionul de magneziu eliberat este ulterior sechestrat de polifosfații
intracelulari, ARN și ATP, lăsând o cantitate mică de magneziu liberă,disponibilă pentru
procese biochimice cum ar fi activarea enzimelor, reglarea pH-ului intracelular,
osmoreglarea, stabilizarea proteinelor și a membranelor și semnalizarea căii de transducție.
[32]
Magneziul poate restabili creșterea celulară în Schizosaccharomyces pombe, a cărui
diviziune celulară a fost inițial inhibată cu un metal chelator ionofor A23187. [32] Maynard
(1993) afirmă că celulele intră în fază staționară pentru producția maximă de etanol la o
concentrație minimă de zahăr atunci când concentrația ionilor de magneziu din mediul de
creștere este maximă. [31, 42]
Ionii de Mg2+ sunt esențiali pentru duplicarea ADN-ului, iar polimerazele și lipazele
au arătat o cerință pentru acest metal. Producerea de specii reactive de oxigen care sunt
cunoscute de a provoca daune ADN-ului s-a dovedit a fi redusă în mod semnificativ prin
creșterea concentrației de magneziu atât în celulele de drojdie cât și în organismul uman.
[42,43]
Walker (1998) [44] a raportat o îmbunătățire a viabilității celulelor de la 0 la 5 %
pentru drojdia de vin care a fost supusă unui șoc de etanol de 10-20% timp de 24 ore sub
concentrații de magneziu între 50-500 ppm.[44] Hu și colab. (2003) [45] au arătat că o
expunere a celulelor de drojdie la 20 % etanol conduce la moartea totală a celulelor, spre
deosebire de mediile unde a fost adăugat magneziu (85 ppm), unde viabilitatea celulară a
avut valori între 25-55% utilizând același mediu. [45]
De o importanță majoră a ionilor de magneziu este proprietatea acestora de a reduce
stresul în celulele de drojdie. Studiul lui Birch și Walker (2000) [27] demonstreză efectul
protector al ionilor de magneziu atât la temperatură cât și la metaboliții toxici din etanol
pentru celulele de drojdie. [27, 31]
Spre deosebire de relația antagonistă de bază Mg2+ și Ca
2+, studiile efectuate de
Trofimova și colab. (2010) [46] relevă faptul că aceste două metale pot reface complet
creșterea celulară și oferă stabilitate membranei pentru Blastomyces dermatidis și
Saccharomyces cerevisiae. [31, 46] S-a emis ipoteza că ambele metale cooperează,
14
stabilizează și reduc fluctuațiile în fluiditatea membranei care a fost găsită a avea o funcție
importantă în rata de supraviețuire a drojdiilor. [31]
Cu toate acestea, s-a arătat că ionii de magneziu modelează cinetica calciului,
deoarece destabilizează complexele de calciu și contracarează în mod activ acțiunea de
legare a ionilor de calciu la liganzii intracelulari și extracelulari [47]. Alți cercetători au
identificat calciul ca și metal dominant în relația antagonistă, ca un rezultat al afinității
calciului pentru locurile de legare pe liganzi cum ar fi ATP și acizii nucleici [12, 14].
Ultimele cercetări demonstrează o corelație inversă între magneziu și calciu. Este
evident că competiția de dominare între cele două metale depinde enorm de concentrația lor;
un raport Mg:Ca în care magneziu are o concentrație mai mare are cel mai bun impact
asupra fiziologiei drojdiei și în procesele fermentative.[27, 31, 48]
Procesele fermentative în biotehnologie au un rol foarte important iar magneziul
influențează numeroase procese metabolice ale tulpinilor de drojdie comerciale. Piruvat
kinaza, hexokinaza, fosfofructokinaza, fosfoglicerat kinaza și enolaza necesită pentru
activitatea lor ionii de magneziu. S-a emis ipoteza că aceștia prezintă un rol care dictează
metabolismul piruvatului, astfel încât biodisponibilitatea sa în controlul metabolic al fluxului
de carbon, fie în dehidrogenaza piruvat sau în piruvat decarboxilaza este foarte importantă.
Ionii de magneziu controlează astfel procesele de respirație și pe cele fermentative în
celulele de drojdie.[22]
Villen și colab. (2009) au arătat că celule de drojdie ar necesita o cantitate mică
constantă de ioni de magneziu pentru a susține o productivitate ridicată în etanol, deoarece o
cantitate mai mare ar conduce la o acumulare excesivă de ioni de magneziu care nu
determină neapărat o eficiență mărită în fermentare. [50] O acumulare constantă de biomasă
de celule în prezența magneziului a fost raportată de Alexander și colab. (2009) [23] care
indică, de asemenea, importanța ionilor de magneziu în creșterea celulară și în faza activă în
formarea etanolului.[23]
S-a demonstrat că biodisponibilitatea magneziului exercită o influență pozitivă
asupra substratului de fermentare deoarece ameliorează impactul presiunii osmotice asupra
celulelor de drojdie. Comportamentul ordonat de floculare al celulelor de drojdie în timpul
procesului de fermentare a fost demostrat în timpul procesului de fermentare la o
concentrație de aproximativ 10 ppm ioni de Mg ce substitue Ca în condiții experimentale.
[14, 31]
Din aceste cercetări reiese deci faptul că biodisponibilitatea magneziului este un
indiciu de performanță fermentativă a drojdiei, dar suplimentarea mediului de fermentare cu
15
ioni de magneziu trebuie efectuată cu precizie luând în considerare și alți parametri care ar
putea afecta biodisponibilitatea.[31]
1.1.1.2. Zincul
În procesele fermentative pentru obținerea berii ionii metalici cheie sunt
reprezentați de către magneziu și zinc, care acționează ca și cofactori pentru enzimele
glicolitice importante și, de asemenea, ajută la reducerea efectelor determinate de factorii de
stres asupra celulelor de drojdie. Zincul se utilizează în concentrații foarte mici, ca urme, cea
minimă fiind de 0,3 ppm. Este un cofactor pentru numeroase enzime biosintetice și
metabolice incluzând aici enzimele glicolitice și alcool dehidrogenaza. În plus, joacă un rol
important prin acțiunea sa asupra ADN-ului din proteinele de legare și afectează flocularea
celulelor de drojdie. Ionii de zinc au fost implicați în funcția activării alcool dehidrogenazei
care este esențială pentru formarea etanolului și este foarte important ca element structural
cheie. [28, 32] . Privarea drojdiei de ioni de zinc se utilizează pentru a preveni înmugurirea
sau creșterea celulelei Saccharomyces cerevisiae și rezultă adesea o fermentație lentă. [13]
Concentrația de zinc poate scade în timpul zdrobirii și în timpul fermentării
mustului deoarece ionul metalic creează complecși în borhotul precipitat. În consecință
nivele de zinc pot deveni compromise ceea ce conduce la o performanță scăzută în
fermentare. Un mediu deficient în zinc poate conduce la încetinire sau la o fermentație
incompletă. În plus față de impactul asupra enzimelor metabolice importante, zincul poate
avea un rol benefic asupra stabilității și dinamicii membranelor celulare. [51, 52]
Zincul este absorbit în mod activ de către celulele de drojdie din mediul de
fermentare pentru a îndeplini roluri fiziologice esențiale, fiind apoi transferat în vacuolele
din drojdie.[28]
Stewart și Russel(1998) au studiat rolul ionilor metalici în ceea ce privește
procesele fermentative din industria berii. Cele mai multe cercetări s-au concentrat până în
prezent pe rolul ionilor de Zn și Ca asupra influenței fermentării mustului și asupra
procesului de floculare a drojdiei. [53] Este demn de remarcat faptul că zincul este un
micronutrient esențial pentru drojdie și ocazional mustul de bere poate fi deficient în zinc,
având ca rezultat o eficiență scăzută în fermentare. [28, 53] Acest fenomen care poate duce
la încetinirea procesului de fermentare la obținerea berii și este dependent de tulpina de
drojdie dar poate surveni și atunci când concentrația de zinc din must este mai mică de 0,1
ppm. Zincul joacă un rol major în metabolismul fermentativ al drojdiei și pentru că poate
stimula absorbția de maltoză și maltotrioză de către celulele de drojdie, sporind astfel
vitezele de fermentare. [28]
16
Elucidarea posibilelor efecte ale zincului asupra stabilității și dinamicii membranei
celulare pot determina în continuare îmbunătățiri ale fermentării. Zincul este preluat complet
și rapid de celulele de drojdie în timpul fermentării ceea ce conduce la concentrații scăzute și
variabile de zinc. Concentrațiile optime pentru o fermentare optimă sunt cuprinse între 0,5-
1ppm (0,25-0,5 mg/ml). Cu toate acestea, în procesele de fabricare a berii și în cele de
distilare, este important să se determine în fiecare situație concentrația optimă a ionilor de
zinc pentru a obține un randament crescut în etanol, deoarece concentrația de zinc depinde
de tulpinile de drojdie alese și de modul de preparare al mustului.
Adăugarea de zinc în timpul fermentării conduce la o creștere în producția de
alcooli și esteri dar reduce formarea aldehidei acetice. Concentrații mari ale compușilor
organici volatili în mediu pot determina creșterea numărului de acizi grași responsabili
pentru gustul nedorit de săpun, gras sau rânced. În general, când concentrațiile scad sub
0,1mg/l procesul de fermentare se oprește. [54]
În procesul de fabricare al berii mustul de fermentare al malțului reduce
biodisponibilitatea zincului deoarece metalul poate forma complecși și precipitate cu
proteinele, cum ar fi grupele cisteinei din peptide și aminoacizii. [14]
Suplimentarea cu ioni de zinc a mediului de fermentare duce la îmbunătățirea
flocurării și descrește dimensiunea medie a aglomeratelor de drojdie [53], probabil pe de o
parte datorită schimbului cu ionii de calciu în celulele de drojdie dar și datorită legării
zincului de pereții celulari. Taylor și Orton au arătat că zincul poate inhiba flocularea dar
doar în concentrații foarte mari (65,4 ppm). [14]
Udeh 2014 a urmărit influența ionilor metalici asupra proceselor fermentative. El a
adăugat diferite concentrații de zinc în must, respectiv 8, 10 și 12 ppm. Ipotetic, efectul
mustului de vin în fermentare la o concentrație de 10 ppm ioni de zinc ar putea fi atribuit
efectului său represiv asupra sistemelor de absorție a zincului la concentrația stabilită.
Această observație a fost făcută și în [28], unde se spune că nivele mari de zinc ar inhiba
funcția genei ZAP1(gena care reglează aportul de zinc). Aceste cercetări sunt în acord cu
alte studii, unde nivele de zinc care au variat între 0.05 -1.07 ppm Zn2+în must au adus o
creștere mai mare a randamentului în fermentare la unele tulpini de Sacharomices cerevisiae
decât utilizarea a 10 ppm Zn2+. Totușu, alte cercetări au afirmat că la concentrații destul de
mari de zinc (65,5, 327,5 și 1300 ppm) randamentul în fermentare este îmbunătățit.[28]
Îmbunătățirea producției în etanol odată cu creșterea concentrației de zinc poate
sugera faptul că ionii de zinc ajută la protecția celulelor împotriva metaboliților toxici din
etanol. Celulele de drojdie au arătat o rezistență mai mare cu 18 %, la șocul produs de etanol
17
atunci când în mediul de fermentare s-a adăugat o concentrație de ioni de zinc de 8 ppm. Ea
este datorată creșterii producției de trehaloză și ergosteroli, cunoscuți pentru faptul că
protejează membranele împotriva distrugerilor produse de etanol [14].
Deficiența în ioni de zinc în celulele de drojdie conduce la creșterea stresului
oxidativ prin producerea speciilor reactive de oxigen intracelulare, rezultând distrugeri ale
ADN-ului iar pentru a preveni aceste distrugeri este necesară utilizarea unui antioxidant.
Pentru a păstra biodisponibilitatea zincului acesta ar trebui adăugat la începutul
fermentării, odată cu drojdia. Ionii de zinc nu vor avea un efect direct asupra aromei berii
deoarece se utilizează în cantități foarte mici.[14,28]
1.1.1.3. Calciul
Calciul este cel mai mult implicat în procesul de floculare, proprietate importantă a
drojdiei care depinde de mai mulți factori cum ar fi: sarcina electrică a celulei, o proliferare
scăzută a celulelor, o fermentare înceată, prezența diferiților ioni metalici (bi și trivalenți),
acțiunea metaboliților produși de etanol, influența diferitelor bacterii (dacă mediul nu este
steril) și vârsta celulei.
La punctul izoelectric, drojdiile sedimentează sub formă de fulgi. Flocularea are loc
prin atracția reciprocă dintre celulele de drojdie și albuminele din mediu. Punctul izoelectric
pentru drojdii și albumine este la un pH cu valoarea de 4,4, când se produce flocularea[55,
56]
S-a emis o ipoteză - „ipoteza legăturii de calciu‖ -, conform căreia ionii de calciu se
pot lega de proteine și le oferă acestora structura corectă pentru a forma legături
carbohidrate. [55] Procesul de floculare utilizând ionii de calciu este un fenomen reversibil.
Celulele floculate pot fi din nou disociate prin adăugarea unui agent de chelatizare care
îndepărtează ionii de calciu, prin adăugarea de manoză care înlocuiește continuu resturile de
manoză de pe peretele celular din locurile de legare ale calciului sau prin aducerea celulelor
de drojdie floculate într-un mediu de cultură nou, prin inoculare [55].
Ionii de calciu pot avea un rol în protejarea celulelor de drojdie împotriva efectelor
toxice produse de etanol la fel ca și ionii de magneziu sau zinc. Datorită efectului antagonist
al magneziului, efectele pozitive asupra proliferării celulare în momentul suplimentării
mediului cu ioni de calciu sunt compromise. Cererea celulelor de drojdie pentru ionii de
magneziu este mai mare decît cea pentru calciu și o concentrație mărită de calciu în must
este posibil să înrăutățească deficitul de magneziu prin interacțiuni antagoniste [14]. De
aceea suplimentarea cu ioni de calciu trebuie efectuată cu grijă. Poate fi benefică doar în
unele cazuri: dacă ionii de calciu sunt suplimentați în concentrații mari pot înlocui
18
magneziul într-o serie de căi biochimice, dar aceasta poate duce în timp la deteriorarea
celulei. Trebuie remarcat faptul că suplimentarea calciului în must sau prin barbotare are un
efect tampon ce împiedică creșterea pH-ului în mediu. Efectul potențial negativ în creșterea
celulară și în procesele fermentative trebuie luat în considerare [14].
1.1.1.4.Manganul
Celulele de drojdie necesită ionul de mangan în concentrații foarte mici, ca urme de
element esențial, la o concentrație de 2-10 ppm pentru o creștere optimă a drojdiei. El este
esențial pentru creșterea mugurilor de drojdie, ajutând la proliferarea celulelor, în special în
condiții aerobe. Manganul este de asemenea prezent în aparatul Golgi și activează glicozil
transferaza, care este implicată în procesele biochimice având funcția de a secreta proteinele.
[57]. Prezența ionilor de mangan a fost raportată a fi necesară în celulele de drojdie pentru a
tolera nivelele de zinc de peste 2 ppm [22]. Toleranța la zinc depinde mult de tulpina de
drojdie astfel încât concentrația de mangan este dificil de estimat. Ionul metalic a fost
raportat a avea un rol important în protecția celulelor împotriva toxicității etanolului [14].
Manganul are o influență decisivă asupra îmbătrânirii drojdiei. La fel ca fierul și
cuprul, manganul poate cataliza formarea radicalilor liberi în bere fără influența oxigenului
(ex: formarea raicalilor liberi de acizi grași), proces care produce deteriorarea aromei în
timpul păstrării (depozitării). În contrast cu fierul și cuprul, ionii de mangan nu sunt
îndepărtați din must sau bere în nici un moment în timpul procesului de fermentare [57].
1.1.1.5. Fierul
Fierul pare să fie important pentru creșterea celulelor. Shakoury-Elizeh și colab.
2004, au arătat că proliferarea celulară într-un mediu cu o concentrație mică de fier prezintă
o creștere mai scăzută, fierul fiind un factor limitativ de creștere. Proliferarea celulară într-
un mediu cu concentrații mari de fier arată o creștere scăzută; atunci când timpul a fost
dublat s-a observat o creștere celulară mai mare cu 40 % față de cazul anterior. Acest
comportament confirmă faptul că celulele bogate în fier sunt expuse la o anumită toxicitate
[59, 60].
Pentru ca metabolismul în respirație să se realizeze într-un mod adecvat, celulele de
drojdie au nevoie de multă energie și necesită cantități mari de fier, care se găsesc în celule
sub formă de complecși respiratorii ce contin fier legat de diferite enzime. Drojdia poate
utiliza doar sursele de carbon pentru creștere iar acestea pot fi metabolizate doar prin
respirație. Respirația în celulele de drojdie nu se poate realiza dacă mediul este deficient în
fier [60, 61].
19
1.1.2. Procese fermentative
Etanolul, metanolul, propanolul sunt bio-alcooli produți sub acțiunea
microorganismelor. Etanolul (alcoolul etilic) este biodegradabil, slab toxic și nepoluant.
Producția de etanol implică fermentarea zaharozei sau a zahărului simplu
biocatalizată de drojdie, de obicei Saccharomyces cerevisiae. Celulele de drojdie produc o
enzime, invertaza, care catalizează hidroliza zaharozei pentru a produce glucoză și fructoză.
Acestea sunt apoi convertite în bioetanol prin acțiunea altei enzime, zimaza, produsă de
celulele de drojdie.
Reacțiile care au loc sunt prezentate mai jos.
C12H22O11 Invertaza C6H12O6 + C6H12O6
Zaharoză Glucoză Fructoză
C6H12O6 Zimaza C2H5OH + 2CO2
Glucoză/Fructoză Etanol Dioxid de carbon
Aceste zaharuri (glucoza/fructoza) conțin o singură grupă de hexoză care este
compusă din 6 atomi de carbon în formula chimică C6H12O6. [1, 62]
În mustul de fermentare al berii se găsesc monozaharide, dizaharide, trizaharide
(maltotrioza) și dextrine. Dextrinele conțin patru unități de monozaharid legate între ele prin
legături glicozidice și nu sunt fermentate de către drojdie. Pentru ca dizaharidele și
trizaharidele să poată fi fermentate, trebuie să fie scindate la monozaharide. Celulele de
drojdie fac acest lucru prin utilizarea diferitelor enzime atât din interiorul cât și din
exteriorul celulei.
Invertaza catalizează hidroliza zaharozei prin scindarea legăturii glicozidice -C-O-.
Alte enzime sunt maltaze care scindează maltoza și maltotrioza în glucoză în interiorul
celulei.
După ce zaharurile sunt transformate în monozaharide, celulele de drojdie le pot
utiliza pentru a produce alcool etilic, în mai multor etape.
Prima etapă este denumită glicoliză, când glucoza este transformată în piruvat, două
unități de energie, și două unități de NADH. Glicoliza are loc în absența oxigenului la fel ca
și toate procesele fermentative utilizate în obținerea alcoolului. [66]
După glicoliză piruvatul poate fi utilizat fie în ciclul Krebs (respirație aerobă) sau în
respirație anaerobă. Respirația aerobă are loc în mitocondriile din drojdie. Energia din
piruvat este extrasă când trece prin procese metabolice cum este ciclul Krebs.
Ciclul Krebs, de asemenea cunoscut ca și ciclul acidului tricarboxilic, este un set de
reacții în cerc, ce se repetă, care au nevoie de oxigen. În procesele de producere a berii,
20
ciclul Krebs apare în prima etapă a fermentării, când drojdia este adăugată într-un mediu de
fermentare bine aerat (must) și are loc până când tot oxigenul este utilizat.
Piruvatul este convertit la acetil_CoA prin următoarea reacție:
Piruvat + 2NAD++ CoA-SH → acetil-CoA + CO2+ NAD
cu ajutorul complexului de enzime piruvat dehidrogenază.[65]
Acetil-CoA intră apoi în ciclul de reacții și conduce la formarea a două molecule de
CO2, una de GTP (trifosfat guanozină, o altă unitate de energie echivalentă cu ATP, trei
unități de NADH și una de FADH2 (flavin adenin dinucleotidă care funcționează similar cu
NAHD). După completarea ciclului o altă moleculă de acetil-CoA intră în reacție și ciclul se
repetă.
Se formează cantități tot mai mari de NADH, reacția este reversibilă, iar NAD+
trebuie regenerată pentru ca glicoliza să continue. NADH și FADH2 își donează electronii
unui proces denumit transportator de lanturi de electroni/ fosforilare oxidativă.Rezultatul
este o revenire a NAD la starea NAD +
și rezultă o cantitate mare de energie celulară ATP.
Deoarece ciclul Krebs este eficient în producerea unităților de energie ATP aceasta
este calea metabolică preferată de celulele de drojdie, dar nu se formează etanol. Etanolul se
formează doar în absența oxigenului [63, 64].
Fermentarea anaerobă este mult mai simplă comparativ cu ciclul Krebs.
Fermentarea alcoolică începe cu cele două grupări piruvat obținute din glicoliză. O
enzimă, piruvat decarboxilaza transformă cele două grupări piruvat în acetaldehidă (toxic) și
CO2. Sub acțiunea alcool dehidrogenazei, la oameni, alcoolul este transformat în
acetaldehidă dar în cazul drojdiilor are loc un proces invers iar acetaldehida este
transformată în etanol.
Etapa finală este reprezentată de adăugarea (reducerea) unui ion de hidrogen la
aldehidă pentru a forma etanolul. Acest ion de hidrogen provine de la NADH, obținut în
urma reacției de glicoliză, și este transformat înapoi la NAD+. Etanolul este toxic pentru
celulele de drojdie dar reprezintă și o formă de apărare pentru celule deoarece bacteriile nu
cresc în acest mediu [66].
1.2. Enzime
Implicaţiile enzimelor în biotehnologie sunt evidente şi binecunoscute [67].
Enzimele sunt catalizatori biologici ce reduc energia de activare a unor reacții
chimice iar domeniul biotehnologic depinde de activitatea enzimelor. Ele respectă toate
legile catalizei:
21
• nu se consumă în timpul reacţiei şi teoretic pot provoca transformarea unui
număr nelimitat de molecule de substrat.
• nu modifică natura reacţiei, echilibrul sau bilanţul ei termodinamic, reacţia
fiind posibilă si in absenţa sa;
• accelerează viteza de reacţie, pentru acest parametru cinetic înregistrându-se
valori de aproximativ 10 ori mai mari decăt cele obţinute în absenţa biocatalizatorului [68].
Cu excepţia ribozimelor, enzimele sunt în majoritate proteine, putând conţine şi
componente lipidice sau zaharoase.
Descoperirea primei enzime aparţine lui Payen şi Persoz, care in anul 1833 publică
o lucrare privind separarea dintr-un extract apos de malţ a unui produs care scindează
amidonul la zaharuri mai simple – amilaza [69].
Avantajele folosirii enzimelor includ: o posibilă viteză catalitică mare, funcționează
în condiţii moderate de mediu, realizează o cataliză nepoluantă, optimizarea uneia sau a
două reacţii catalizate de enzime uşurează optimizarea întregului proces ce are loc într-o
celulă, enzimele catalizează o gama largă de reacţii, unele cu stereospecificitate înaltă
(reacţii de oxidare, reducere, dehidrogenare, dehalogenare, hidratare si deshidratare) [68].
În ciuda acestor caracteristici, enzimele nu au fost folosite intens, deoarece există şi
unele neajunsuri:
majoritatea enzimelor izolate nu sunt suficient de stabile pentru utilizarea în condiţii
industriale (slabă stabilitate la temperatură, pH sau prezenţa ionilor metalici).
în celule, toate enzimele sunt supuse ―turn-over‖-ului celular: cele îmbatrânite sunt
înlocuite de altele noi, ceea ce face dificilă izolarea in vitro.
majoritatea enzimelor sunt hidrosolubile şi, de aceea, dificil de separat din reactanți sau
din produșii de reacție și nu pot fi utilizate decât într-un singur ciclu enzimatic.
rămânând în produşii de reacție, enzima constitue o impuritate, impunând îndepărtarea sa
prin diferite metode, ceea ce complică tehnologiile ce apelează la astfel de catalizatori.
multe enzime utile se găsesc intracelular şi de aceea sunt dificil de izolat [70].
Aceste dezavantaje pot fi parţial sau total eliminate prin insolubilizare pe un suport
mineral sau organic, prin legare chimică sau prin interacţiuni fizice. Enzimele imobilizate
pot fi ușor separate din produşii de reacţie şi ulterior regenerate prin tratare cu soluții tampon
de pH corespunzător celui de activare maximă a biocatalizatorului, fiind reutilizate într-un
alt ciclu enzimatic, cu avantajele ce decurg de aici [71, 72].
22
1.2.1. Structura chimică a unei enzime
Natura chimică a enzimelor a fost mult timp necunoscută. Caracterul proteic al
enzimelor este bine dovedit, stabilindu-se că ele sunt formate fie din catene polipeptidice ale
căror unităţi de bază sunt resturi de aminoacizi şi din punct de vedere chimic proteine simple
(sau homoproteine), fie din două componente (una de natură proteică si alta de natură
neproteică) definite ca heteroproteine. Partea neproteică poate fi o coenzimă, atunci cand se
leagă de partea proteică prin legături necovalente, sau o grupare prostetică când este legată
prin legături de tip covalent.
Partea proteică, numită apoenzimă poate fi constituită din una sau mai multe catene
polipeptidice. Fiecare enzimă conţine o secvenţă unică din aproximativ 20 de L-aminoacizi,
legați prin legături peptidice. Conformaţiile catenei polipeptidice condiţionează manifestarea
anumitor funcţii biologice prin centrul catalitic activ al enzimei. Rolul acestuia este de a
―recunoaşte‖ structura chimică a substratului şi de a-l lega de enzimă prin formarea unui
complex enzimă-substrat, deosebit de reactiv, care scindează spontan punând în libertate
produşii de reacţie şi enzima, aceasta din urmă nemodificată din punct de vedere chimic
[70].
1.2.2. Tipuri de enzime
Enzimele catalizează transformarea unei singure substanţe chimice având
specificitate absolută, fiind însă posibilă şi acţiunea asupra unui număr de substanţe, înrudite
structural prin aceeaşi grupare sau aceleasi grupe de atomi pe care biocatalizatorul le
recunoaşte (specificitate relativă).
În funcţie de tipul de reacţie pe care îl catalizează enzimele sunt clasificate in şase
mari clase: oxidoreductaze (catalizează reacţiile redox), transferaze (catalizează reacţii de
transfer a unor grupări chimice), hidrolaze (catalizează scindarea hidrolitică a unor legături
sau grupări chimice), liaze (catalizează reacţii de eliminare sau de adiţie a unor grupari
din/sau la molecula substratului fără participarea apei cu formarea unei duble legături),
izomeraze şi ligaze sau sintetaze (catalizează reacţii de sinteză prin condensarea a două
molecule) [73].
Preparatele enzimatice sunt utilizate în numeroase domenii, detaşându-se în primul
rând cel al producerii alimentelor, dar şi alte procese industriale ce apelează la biotehnologii.
Numeroase enzime se utilizează în industria berii, vinului, zahărului, băuturilor alcoolice a
laptelui, ş.a. [74] (Tabel 1)
Tabel 1. Utilizarea enzimelor în analiza biochimică şi obţinerea unor produşi [74]
23
Enzima insolubilă Utilizări
Amilaze Producţia continuă a glucozei
Invertază Hidroliza continuă a zahărului
Aminoacilază Separarea continuă a acil-D-L-aminoacilazelor
Urează Determinarea continuă a ureei din lichide
biologice
Galactozidază Conversia continuă a β-D-galactozidelor
Asparaginază Dozarea continuă a D-L-asparaginei; tratamentul
limfosarcomelor
Steroid esteraze Sinteze de steroizi
Penicilinamidaze Hidroliza continua a penicilinei
Glucozizomerază Obținerea fructozei
Catalază Conservarea alimentelor
Amiloglucozidază Transformarea continuă a maltozei la glucoză
Glucozoxidază Electrod de detecţie continuă a glucozei.
Transformarea continuă a glucozei în acid
glucuronic
Celulază Transformarea continuă a celulozei în produse
solubile în apă
Lipaze Hidroliza continuă a grăsimilor
Pectinaze Clarificarea sucurilor de fructe
1.2.3. -Amilaza
Hidrolazele sunt enzime care catalizează reacţii de scindare hidrolitică a unor
legături chimice formate prin reacţii în urma cărora se elimină apa [69].
α-Amilaza există în plante, microorganisme și animale. Este produsă comercial prin
fermentare microbiană [75]. α-Amilaza hidrolizează intern legăturile α-1,4 glicozidice în
polizaharide în care gradul de polimerizare este mai mare sau egal cu 3. Sub acţiunea lor,
amiloza si amilopectina sunt fragmentate la oligozaharide cu grad de polimerizare mai mic,
numite dextrine. Ea realizează o solubilizare a amidonului şi o hidroliză prelungită la
maltoză şi maltotrioze. α-Amilazele nu pot scinda legăturile α-1,6-glucozidice din
amilopectină.
24
Reacțiile de hidroliză au loc la un pH optim și temperatură ce variază în funcție de
tipul de α-amilază utilizat. În general cerința de calciu pentru α-amilază este de 1-20 ppm ca
și cofactor pentru activitate și stabilitate. Scăzând dependența de calciu pentru α-amilază
costul produsului final se poate reduce. [76] Alți ioni metalici cum sunt Mg2+ și Mn
2+ sunt
raportați ca și cofactori care stimulează activitatea.
Structura supramoleculară schematizată a α-amilazei este prezentată în figura 1.
Fig.1 Structura supramoleculară a α-amilazei
Amilazele pot fi clasificate în trei grupe principale pe baza modului lor de acțiune:
endoamilaze, exoamilaze și amilaze care ajută la ruperea ramificațiilor.
Endoamilazele sunt cunoscute ca enzime care lichefiază. Aceste enzime
hidrolizează legăturile α-1,4 glicozidice în amiloză, amilopectină și polizaharide cum ar fi
glicogenul, rezultând o descreștere rapidă a vâscozității soluțiilor de amidon precum;
puterea de colorare a soluției de iod scade. Produșii de hidroliză sunt oligozaharide cu
lungimi ale lanțului ce variază.
Exoamilazele sunt cunoscute ca enzime care zaharifică. Aceste enzime scindează
legăturile α-1,4 glicozidice în amiloză, amilopectină și glicogen de la capetele nereducătoare
prin îndepărtarea succesivă a maltozei și glucozei, în etape. Din această categorie fac parte -
amilaza din cereale și glucoamilaza fungică.[77]
α-Amilazele pot fi de origine animală (amilaza produsă de glanda salivară şi
pancreas) sunt, de origine vegetală (cereale încolţite, în special malţ) având aplicații în
industria alimentară şi de origine microbiană (bacterii, mucegaiuri şi drojdii) care au
aplicativitate în industria farmaceutică și în domeniul biotehnologiei.
Amilazele de origine bacteriană sunt mai stabile la temperatură decât cele de
origine fungică. α-Amilaza din Bacillus subtillis are o stabilitate termică remarcabilă în
prezenţa ionilor de Ca2+ fiind o metaloenzimă. Dupa 45 de minute la 70˚C, α-amilaza reţine
81% din activitatea iniţială, pe când proteaza alcalină doar 1% și proteaza neutră 0%. Are un
25
domeniu larg de stabilitate la pH în prezenţa ionilor de Ca2+
și își păstrează practic întreaga
activitate de la pH 5,5 la pH 9,5 indiferent de soluția tampon utilizată. pH-ul optim de
activitate este 6.0 iar temperatura optimă de activitate este 60˚C. [77]
1.2.3.1.Aplicații ale α-amilazei în medicină
α-Amilaza este prezentă în smalţul dinţilor și poate duce la formarea legăturilor α-
amilază – bacterie, aceasta având un grad crescut de afinitatea cu anumiți streptococi orali.
Acest contact între legătura α-amilază – bacterie şi dinţi poate conduce la apariţia plăcii
dentare şi a cariilor. Carbohidrații din alimente sunt supuși hidrolizei sub acțiunea α-
amilazei din cavitatea bucală transformându-se în acid lactic care în final determină
demineralizarea dinților. De asemenea, α-amilaza reprezintă un agent antiinflamator. [78,79]
α-Amilaza este secretată de glandele salivare şi de pancreas. În funcție de valorile
α-amilazei serice detectate la analize se pot diagnostica diferite afecțiuni. De exemplu în
pancreatita acută apare hiperamilazemia iar valorile α-amilazei sunt de 6-8 ori mai mari dar
este tranzitorie (în 3-5 zile revin la valorile normale). Dacă valorile serice ale α-amilazei
serice sunt de 3 ori mai mari decât cele normale indică o inflamație a pancreasului iar o
creștere de 40 de ori mai mare indică necroza pancreasului. Valori crescute moderate ale
amilazemiei apar în diferite afecțiuni cum ar fi: cancer de pancreas, afecțiuni abdominale
acute, parotidă acută epidemică, hepatită acută, după intervenții chirurgicale, după
administrarea unor medicamente (morfină, corticosteroizi), cancer pulmonar, în unele
afecțiuni renale. Valori scăzute se constată în atrofiile pancreatice, afectarea acută sau
cronică hepatocelulară [80, 81].
1.2.3.2. Aplicațiile α-amilazei în industria alimentară:
α-Amilaza se utilizează în industria de panificație.
Suplimentarea făinii cu α-amilază are ca efect intensificarea amilolazei şi creşterea
cantităţii de zaharuri fermentescibile în aluat, capabile să susţină procesul de fermentare şi
deci formarea de gaze pe toată durata procesului tehnologic, la un nivel care să asigure pâine
de calitate. Acţiunea de zaharificare cea mai puternică o are α-amilaza bacteriană, urmată de
cea din malţ şi cea de origine fungică. Proprietăţile fizice ale aluatului și activitatea
microflorei sunt influențate de adăugarea α-amilazei aceasta ajutând la proliferarea celulelor
de drojdie şi se intensifică activitatea fermentativă a drojdiei şi a microflorei bacteriene. Ca
urmare durata de fermentare a aluatului este dimunuată. Asupra calităţii pâinii, adaosul de α-
amilază are influenţe multiple și determină: creşterea volumului (prin formarea unor cantităţi
mai mari de dextrine), inchiderea culorii cojii de pâine (datorită zaharurilor de pe suprafața
pâinii ce conduc la un proces de caramelizare sau la reacţii Maillard prin formarea de
26
melanoidine), intensificarea aromei, prelungirea prospeţimii (datorită creşterii cantităţii de
amidon hidrolizat sau a scăderii cantităţii de amidon care gelifică), creșterea elasticității
miezului.
Utilizarea α-amilazelor bacteriene pentru fluidificarea plămezii de cereale
nemalţificate evită apariţia unui gust nedorit iar prin utilizarea enzimei în etapa de brasaj se
realizează o ‖lichefiere‖ a amidonului cu obţinerea de zaharuri ce pot fermenta; prin
utilizarea α-amilazei fungice se realizează o zaharificare a dextrinelor, ducând la creșterea
fermentescibilităţii.
Utilizarea α-amilazei în procesul de fabricare a berii în diferite etape de fabricare
determină obținerea unor proprietăți necesare obținerii unei beri de calitate.
α-Amilaza a fost utilizată în procesele fermentative de obținere a etanolului [82,
83].
1.2.3.3. Amidonul-substrat pentru hidroliză
Amidonul este o polizaharidă contituită din monomeri ai glucozei legați prin
legături glicozidice, având rolul de a depozita glucoza în plante. Este compus din doi
polimeri ai glucozei: amiloza și amilopectina. Amiloza este un polimer liniar cu legături α-
1,4 glicozidice și lanțurile sale sunt formate dintr-un helix simplu sau dublu cu 6 unități de
glucoză/rotație spiră [84]. Cea din amidon din cartofi sau tapioca are un grad de
polimerizare ce variază între 1000 și 6000, cu un conținut de amiloză de 10-20 % [85, 86].
Amilopectina este un polimer ramificat, cu un grad mediu de polimerizare de aprox.
2000000. Prezintă o structură constituită dintr-o catenă principală pe care se găsesc legături
1,4-glicozidice și ramificații cu legături α-1,6 glicozidice ce conțin 15-45 unități de glucoză
[87]. Ramificarea catenei principale se găsește produce la fiecare 22-70 unități de glucoză
[84]. Aproape 95% din legăturile glicozidice din amilopectină sunt legături α-1,4 glicozidice
și 5 % sunt restul fiind legături α-1,6 glicozidice.
Structura este reprezentată în figura 2.
27
Figura 2. Structura chimică a amilozei (a) și (b) amilopectinei.
Hidroliza amidonului poate fi indusă de enzime, acid sau tratament alcalin. In
aceste condiții, legăturile glicozidice scindează conducând la oligozaharide sau zaharuri cum
ar fi maltotrioza, maltoza și glucoza. Mai multe enzime pot produce hidroliza amidonului.
α-Amilaza este o endoamilază, scindează legătura α-1,4 glicozidică în mod
aleatoriu și produce oligozaharide. Glucoamilaza este o exoenzimă ce produce secvențial
glucoza din capetele nereducătoare și scindează legăturile α-1,6 glicozidice. O enzimă care
acționează asupra legăturilor α-1,6 glicozidice este pululanaza și produce glucoza.
În industria alimentară glucoza este transformată în fructoză de către
glucozoizomeraza deoarece fructoza este cea mai dulce dintre zaharuri. Această enzimă este
utilizată în formă imobilizată iar magneziul este adăugat ca și cofactor. Calciul are un efect
inhibitor asupra glucozo-izomerazei [75, 88, 89].
Principalele obiective biotehnologice care se pot realiza cu ajutorul enzimelor
amilolitice (care conţin şi α-amilază) de origine microbiană în etapa de zaharificare a
materiilor prime pe bază de amidon din cadrul procesului de fabricare a etanolului sunt:
îmbunătățirea parametrilor de fermentare (scăderea presiunii și a temperaturii din proces),
înlocuirea parţiala a malţului (enzima poate fi folosită în scopul lichefierii, a zaharificării
amidonului, sau pentru amândouă), înlocuirea totală a malţului (care necesită pe lângă
prezenţa α-amilazei şi prezenţa amiloglucozidazei fungice pentru zaharificare) [90].
În acest raport ne-am propus realizarea imobilizării unor hidrolaze în particule de
polizaharide - gelan reticulat -şi caracterizarea imobilizatelor astfel obţinute. Pentru studiu a
fost aleasă o enzimă binecunoscută, α-amilaza.
28
1.3. Substanțe nutraceutice
Termenul de nutraceutic a fost inventat de către Stephen DeFellce în 1979, fondator
şi preşedinte al fundatiei pentru inovaţie din Cranford, New Jersey; el combină cuvântul
nutriţie cu farmaceutic. Este definit ca un aliment care oferă beneficii medicale sau de
sănătate, inclusiv în prevenirea şi tratamentul bolilor [91,92].
Prevenţia bolilor cronice este o problemă pentru ţările dezvoltate. Factori cum ar fi
îmbătrânirea populaţiei şi creşterea costurilor de îngrijire a sănătăţii subliniază necesitatea de
prevenire a bolilor în lumea dezvoltată. Terapii nutriţionale, cum ar fi alimentele funcţionale
şi suplimentele alimentare reprezintă o abordare pentru prevenirea bolilor cronice [93].
1.3.1 Tipuri de substanțe nutraceutice utilizate în industria alimentară
Deşi există multe definiţii ale alimentelor funcţionale, o temă comună este faptul că
alimentele funcţionale pot oferi beneficii pentru sănătate ―dincolo de hrana de bază‖ [94].
Aceste beneficii pentru sănătate sunt de obicei asociate cu încorporarea unuia sau mai
multor compuşi bioactivi [95].
Nutraceutice şi ingrediente bioactive:
prebiotice: inulina, oligozaharidele –susţin sănătatea intestinului şi ajută la refacerea
microflorei intestinale;
probiotice: lactobacili, bifidobacterii- îmbunătăţesc sănătatea intestinului[96];
substanţe fitochimice: beta-caroten, licopen, flavonoizi, proantocianidine, polifenoli,
alicina: reduc riscul apariţiei bolilor cardiovasculare, cancer, diabet, boli degenerative
[97];
lanţuri lungi de acizi graşi omega-3: acid dodecahexaecanoic (DHA), acid
eicosapentaenoic (EPA)- susţin îmbunătăţirea sănătaţii cardiovasculare [98];
peptide bioactive: peptide derivate din lapte-reduc presiunea sangelui [99];
carotenoizii: beta-caroten, licopen, luteina, zeaxantina, astaxantina- reduc riscul bolilor
de ochi şi cancerul [100];
ierburi şi condimente: uleiuri esenţiale, diverse preparate de ierburi-au o gamă largă de
beneficii [101];
Cei mai mulţi compuşi activi se încadrează în una din cele trei clasificări si anume:
lipide, proteine sau carbohidraţi. Dintre aceste categorii, compuşii bioactivi lipofili ridică o
serie de provocări în ceea ce priveşte încorporarea lor în produsele alimentare deoarece sunt
dificil de încorporat în cele apoase şi sunt sensibili la deteriorarea oxidativă [102].
29
Există de aceea o mare nevoie de a dezvolta sisteme de eliberare pentru industria
alimentară care pot fi utilizate pentru a încapsula şi proteja componenţii bioactivi. Sistemele
de eliberare pentru alimente funcţionale cu componenţi bioactivi lipofili trebuie să posede
unele calităţi importante, esențială fiind compatibilitatea atât cu componentul bioactiv cât şi
cu produsul în care vor fi încorporate pentru a crea un aliment sau o băutură funcţională.
Alte atribute ale sistemelor includ creşterea stabilităţii sau eliberarea controlată a
componenţilor bioactivi. Sistemele de eliberare pe bază de emulsii sunt cele mai potrivite
pentru a crea sisteme de transport al lipidelor bioactive [103].
Reologia sau textura alimentelor poate fi afectată pozitiv sau negativ prin
încorporarea în particule de hidrogel. În general, reologia unei suspensii coloidale depinde
efectiv de concentraţia particulelor, de forma lor şi de orice interacţiune între ele.
Comportamentul de curgere a dispersiei este controlat prin trei forţe: hidrodinamică,
browniană si coloidală. Pentru dispersii ce constau din particule mari (> 10 μm) forţele
hidrodinamice domină. Pentru dispersii ce constau din particule între 1 nm-10μm (referindu-
ne la dispersiile coloidale) mişcarea bowniană şi forţele interparticulare domină la viteze
scăzute de forfecare, în timp ce în viteze mari de forfecare forţele hidrodinamice sunt cele
mai importante [104].
Particulele de hidrogel pot fi create pentru a furniza atributele reologice dorite
pentru un anumit produs cum ar fi grosimea, structura, sau pot fi elaborate pentru a avea un
impact neglijabil asupra produsului. Factorii care influențează reologia alimentelor sunt
concentraţia, mărimea, forma şi compoziţia acestor particule Pentru orice sistem de eliberare
este esenţial ca acesta să rămână stabil pentru întregul ciclu de viaţă al produsului și nu
trebuie să influențeze termenul de valabilitate al produsului în sine. Este absolut necesar ca
mecanismele fizico-chimice majore care promovează instabilitatea particulelor, cum ar fi
separarea gravitaţională, agregarea, schimbări volumetrice (umflare și contractare) și
disocierea (eroziunea sau dezintegrarea), să fie identificate, inhibate sau prevenite cu succes
[105].
Multe din abordările pentru eliberarea medicamentului la ţintă din industria
farmaceutică pot fi aplicate şi în industria alimentară pentru elaborarea de alimente
funcţionale şi suplimente alimentare cu proprietăţi superioare cum ar fi îmbunătăţirea
eliberării şi a absorbţiei [106].
Există o mare necesitate în industria alimentară de a elabora sisteme noi de
transport pentru componenţi bioactivi. Mulţi dintre aceştia, cum sunt acizii graşi omega 3,
carotenoizii, vitaminele liposolubile în grăsimi şi fitosterolii, sunt lipofili, făcând ca
30
încorporarea lor în alimentele apoase şi băuturi să fie o provocare. În plus, multe dintre
aceste componente lipofile sunt chimic instabile şi tind să se degradeze în timpul depozitării
când sunt încorporate în alimente [103, 106].
Teste in vitro şi in vivo au fost des utilizate pentru a testa biodisponibilitatea.
Evaluarea in vitro poate include teste de dizolvare prin simularea conditțiilor
gastrointestinale, teste de culturi celulare pentru a evalua permeabilitatea şi fluxul, teste
pentru evaluarea adeziunii sistemului de eliberare la ţesutul intestinal și permit înțelegerea
mecanismelor, viteza şi gradul de eliberare a componentelor bioactive. Există însă şi limitări
deoarece testele nu ţin cont de schimbările biologice, asimilarea activă, răspunsul metabolic
şi de influenţa altor alimente în timpul consumului, iar pentru o validare ulterioară a
eficienţei sistemului de eliberare, testele in vivo sunt necesare pentru a identifica locul şi
profilul de eliberare a componenţilor bioactivi, asimilarea, biodistribuţia în ţesut şi
răspunsurile fiziologice [107, 108].
Studiile in vitro şi in vivo au fost efectuate pentru a investiga modul în care
încapsularea lipidelor afectează digestia [109, 110].
Testele in vivo au arătat că biodisponibilitatea unui ingredient activ este dependentă
de tipul sistemului de încapsulare, de mărimea particulei şi de structura alimentelor [111].
Studiile clinice la om sunt necesare pentru a stabili eficienţa in vivo a ingredientelor active
transportate cu diverse sisteme de eliberare și pentru a stabili dacă sistemul ce conţine
ingredientul activ încapsulat furnizează beneficiul pentru sănătate final la populaţia ţintă
[112].
Pentru a preveni deteriorarea oxidativă au fost dezvoltate diferite strategii cum ar fi
reducerea nivelului de oxigen, modificarea proprietăţilor interfaciale sau adăugarea unui
chelator de metal util pentru controlul oxidării lipidelor în alimentele îmbogăţite cu omega
3. Cercetările au arătat că proteinele alimentare pot inhiba oxidarea în emulsiile alimentare
[113, 114]. O gamă largă de mecanisme sunt asociate cu proprietăţile antioxidante ale
proteinelor incluzând inactivarea de specii reactive, reducerea hidroperoxidarii, îndepărtarea
enzimatică a oxidanţilor şi crearea unei bariere fizice între reactanţi. Antioxidanţii sunt
substanţele din alimente care sunt proiectate pentru a inhiba sau întârzia oxidarea lipidelor în
acestea. Depinzând de mecanismul lor de acţiune antioxidanţii pot fi divizaţi în două
categorii:
antioxidanţi primari - lucrează prin acceptarea directă a radicalilor liberi
pentru a-i transforma în produse mai stabile (ex. Tocoferolii).
31
antioxidanţi secundari - nu au capacitatea de a reacţiona direct cu radicalii
liberi, în schimb inhibă indirect oxidarea prin mecanisme cum ar fi chelatarea
metalelor de tranziţie, regenerarea antioxidanţilor şi oprirea oxigenului. (ex.: EDTA
si acidul citric) [115].
Majoritatea claselor de antioxidanţi alimentari naturali includ carotenoizii,
componenţii fenolici, acidul ascorbic, proteinele şi derivatele lor, produşii de reacţie
Maillard, fosfolipidele şi sterolii. [116]. Cercetările recente au arătat, de asemenea, că
polizaharidele sunt capabile de a inhiba oxidarea emulsiei ulei în apă.
Din moment ce particulele de hidrogel cu componenţi bioactivi încapsulaţi sunt
obținute din polizaharide, ar putea fi posibil să luăm ca un avantaj proprietăţile naturale
antioxidante ale acestor biopolimeri pentru a proteja lipidele bioactive. Integrarea picăturilor
de lipide emulsionate în interiorul unei particule de hidrogel pe bază de polizaharide ar fi o
cale de a crea un mediu care, teoretic, ar inhiba oxidarea lipidelor.[91]
1.3.2 Curcumina: structură, proprietăți, aplicații.
Cercetările științifice au confirmat efectele farmacologice ale curcuminei și au
stabilit capacitatea sa de a acționa în prevenția și tratarea unor boli cronice [117-121].
Curcumina a fost prima dată izolată din turmeric în 1815, dar până în 1970 există
puține rapoarte care prezintă structura chimică, sinteza, activitatea sa chimică și biochimică.
[122,123]. După raportarea de către Aggarwal și colab. în 1990 a potențialului său efect
anticancer, ritmul cercetărilor asupra curcuminei a început să crească rapid [124]. În timp ce
majoritatea cercetărilor au urmărit aspectele biologice, doar câțiva cercetători au fost
interesați de înțelegerea importanței structurii chimice a curcuminei pe lângă activitatea
biologică.
În chimia organică extragerea și sinteza curcuminei și a noilor derivați sintetici a
fost principalul scop al cercetărilor. Chimia anorganică a utilizat abilitatea sa de chelator
metalic prin gruparea α, β-diceto pentru a forma noi entități structurale cu modificarea
activității biochimice. Fizico-chimia s-a concentrat pe proprietățile spectroscopice foarte
sensibile ale curcuminei pentru a studia interacțiunile sale cu structurile microeterogene și
biomolecule. Chimia analitică a fost implicată în proprietățile sale unice spectroscopice de
absorbție pentru a identifica și estima urmele de elemente [125]. Alte studii chimice
folositoare în întelegerea activității biologice a curcuminei sunt reactivitatea sa chimică cu
specii reactive de oxigen, reacții de adiție, reacții de degradare și formarea nanoconjugatelor
și a formulării lor.
32
Curcuma Longa (turmeric) este cultivat în regiunile tropicale și subtropicale. Cea
mai mare producătoare de turmeric este India, unde a fost utilizat de foarte mult timp ca
remediu în casă pentru câteva afecțiuni. Depinzând de originea sa și de condițiile solului
unde a crescut, turmeric conține între 2-9 % curcuminoizi. Cuvântul „curcuminoid‖ indică
un grup de compuși cum ar fi curcumina, demetoxicurcumina, bis-demetoxicurcumina și
curcumina ciclică. Dintre acestea curcumina este componentul major iar curcumina ciclică
este componentul minor [117-120]. Structura chimică a curcuminei este redată în figura 3.
Fig. 3 Structura principalilor curcuminoizi din turmeric
1.3.2.1.Separarea curcuminei
Cu toate că extracția și separarea curcuminei din pudră de turmeric a fost raportată
încă din 1815, metode îmbunătățite și avansate de extracție sunt încă raportate chiar și după
două secole [126-134]. Extracția cu solvent urmată de cromatografia pe coloană au fost
metodele cele mai des raportate pentru separarea curcuminei din turmeric; aceasta implică o
serie de solvenți organici polari și nepolari incluzând hexan, etilacetat, acetonă, metanol, etc.
Dintre toți solvenții organici etanolul este prefera. Pe de altă parte, extracția curcuminei cu
solvenți clorurați este foarte eficientă, dar industria alimentară nu acceptă utilizarea lor. Cele
mai eficiente metode de extracție identificate au fost extracțiile la Soxhlet, cu ultrasunete și
cu microunde [126-131].
Odată cu creșterea utilizării sale în suplimente alimentare, cercetătorii au dezvoltat
metode de extracție care implică solvenți utilizați în industria alimentară cum ar fi
triglicerolii, pentru a obține un randament mai bun [132]. O altă metodă comercială viabilă
și eficientă este folosirea CO2 supercritic [133, 134]. Condițiile normale de operare sunt:
presiune 25-30 Mpa și temperatură de 318 K.
Există puține rapoarte privind extracția curcuminei pe bază de enzime. Procedeul
presupune un pretratament al turmericului cu enzime cum ar fi α-amilază și glucoamilază iar
33
randamentul în curcumină obținut este foarte bun. Oricum, datorită costului această metodă
nu este momentan viabilă [135].
Curcumina poate fi separată din amestecul de curcuminoizi (un amestec de
curcumină, demetoxicurcumină și bis-demetoxicurcumină) prin cromatografie pe coloană,
prin adsorbția amestecului pe gel de silice utilizând un amestec de solvenți cum ar fi
diclormetan/acid acetic sau metanol/cloroform pentru a obține trei fracții diferite. Fracția de
curcumină este purificată în continuare pe gel de silice utilizând un amestec de solvenți
obținut din cloroform/diclormetan și etanol/metanol [119, 120, 136-139].
Metodele de detectare și estimare a curcuminei au fost implicat
cromatografialichidă de înaltă performanță (HPLC). În general, ca fază mobilă s-a utilizat
amestec acetonitril/apă sau cloroform/metanol. Detectarea curcuminei se face la lungimi de
undă cuprinse între 350-450 nm sau în regiunea UV între 250-270 nm [136-139].
Cromatografia lichidă cuplată cu spectrometria de masă este o altă metodă pentru a detecta
curcumina. Metoda cea mai sensibilă (până la 1 ng/ml) este însă fluorescența, în regiunea
400-450 nm.
La un secol după izolarea din turmeric, prima lucrare privind sinteza curcuminei a
fost raportată de Lampe în 1913 [140]. Metoda implică 5 etape începând cu clorura de
carboximetil feruloil și acetoacetil etil. Mai târziu Pabon (1964) [141] a raportat o metodă
simplă de sinteză cu randamente mai mari utilizând acetil acetonă și a substituit aldehidele
aromatice în prezența trioxidului de bor, trialchil borat și n-butil amină; metoda a fost
adoptată de câteva grupe de cercetatori în sinteze ulterioare [119, 120, 141-143].
Pentru a produce curcuminoizi trifluoroborați a fost propusă utilizarea
trifluoroboratului, ce poate fi hidrolizat într-o soluție de metanol la pH 5,8. Etapa primară
este formarea de 2,4 dicetone cu un substituent de aldehidă aromatică. Pentru a preveni
participarea dicetonelor la condensarea Knoevenagel se efectuează complexarea cu bor.
Complexul de bor disociază și eliberează curcumina în condiții slab acide. Curcumina din
acest amestec de reacție poate fi separat prin spălări și precipitări repetate, urmată de
cromatografia pe coloană [144].
1.3.2.2. Caracteristici structurale ale curcuminei
Curcumina este o moleculă simetrică, cunoscută sub denumirea de diferuloil metan.
Termenul IUPAC al curcuminei este (1E, 6E)-1,7-bis-(4-hidroxi-3-metoxi fenil)-1,6-
heptadienă-3,5 dionă, având formula chimică C21H20O6 și masa moleculară 368,38. Conține
trei entități ciclice în structură: două sisteme ciclice aromatice conținând grupe fenolice o-
34
metoxi, conectate printr-un element de legătură la C7 constând dintr-o grupare nesaturată
α,β-dicetonă. Gruparea diceto prezintă tautomerie ceto-enol, care poate exista în diferite
tipuri de conformeri, în funcție de mediu [145]. În majoritatea solvenților nepolari și
moderat polari forma enol este în general mai stabilă decât forma ceto cu 5 până la 8
kcal/mol, în funcție de natura solventului.
Datorită conjugării extinse, norul de electroni π este delocalizat de-a lungul
moleculei. În soluție curcumina manifestă izomerie cis-trans. Valoarea momentului de dipol
este de 10.77 D.
Este aproape insolubilă în apă și ușor solubilă în solvenți polari cum ar fi DMSO,
metanol, etanol, acetonitril, cloroform, acetat de etil, etc. Este greu solubilă în solvenți
hidrocarbonați cum ar fi ciclohexan și hexan. Este un acid Bronsted slab cu 3 protoni labili
și în consecință 3 pKa-uri corespunzând la trei echilibre prototropice. Reactivitatea chimică
și solubilitatea cresc la pH bazic.
Soluțiile apoase de curcumină pot fi preparate prin adăugarea surfactanților,
lipidelor, albuminei, ciclodextrinelor, biopolimerilor, etc. Soluțiile micelare care utilizează
surfactanți sunt mai potrivite în prepararea soluțiilor apoase de curcumină la o concentrație
ridicată. Când se utilizează soluții apoase cu surfactanți în sisteme biologice, este necesară o
grijă suplimentară la efectuarea experimentelor, deoarece surfactanții pot interfera în studiile
biologice [144, 145].
1.3.2.3. Reactivitatea curcuminei
Curcumina are 3 grupe funcționale reactive: o grupare dicetonă și două grupări
fenolice. Reacții chimice importante asociate cu activitatea biologică a curcuminei sunt cele
de cedare a hidrogenului care conduc la oxidarea curcuminei, adiție reversibilă sau
ireversibilă (reacții Michael), hidroliza, degradarea și reacții enzimatice.
1.3.2.3.1 Reacții cu specii reactive de oxigen
Curcumina s-a dovedit a fi un compus de eliminare excelent al speciilor reactive de
oxigen, proprietate care îi conferă activitate antioxidantă în celulele normale. Speciile
reactive de oxigen sunt formate din ambii radicali liberi oxidanți și oxidanți moleculari [145-
152]. Toate cele trei locuri active ale curcuminei pot fi supuse oxidării prin transferul de
electroni și captarea oxigenului. Investigații detaliate au confirmat că în timpul reacțiilor cu
radicali liberi cel mai ușor se detașează hidrogenul de la gruparea fenol cu formarea
35
radicalilor fenoxil, care sunt stabilizați prin rezonanță de-a lungul structurii ceto-enol. Ca
exemplu reacția radicalilor peroxil cu curcumina produce radicali fenoxil care sunt mai puțin
reactivi decât radicalii peroxil și prin aceasta comportare determină o protecție față de
speciile reactive de oxigen. [146, 149, 153]. Reacțiile sunt reversibile iar compusul poate
reveni la structura chimică inițială prin intermediul antioxidanților solubili în apă cum ar fi
acidul ascorbic [149].
Literatura menționează reacțiile de eliminare ale altor radicali liberi din speciile
reactive de oxigen: radicalii hidroxil, radicalii superoxid, radicalii alcoxi [147-150].
Dintre oxidanții moleculari, reacțiile cu peroxinitril, peroxid de hidrogen sunt cele
mai comune. În multe modele biologice, curcumina poate proteja celulele în condiții în care
există o producere excesivă a acestor oxidanți moleculari.
Există puține rapoarte în literatura de specialitate privind reacția directă a
curcuminei cu peroxinitril [154]. Constantele de viteză și concentrațiile de inhibare a
curcuminei pentru a preveni formarea de nitrotirozină indică faptul că aceasta este un
antioxidant puternic împotriva stresului oxidativ [144].
1.3.2.3.2. Degradarea chimică și metabolism
Curcumina suferă o degradare chimică în soluții apoase-organice, ce se intensifică
cu creșterea pH-ului, ceea ce reprezintă o problemă serioasă în aplicațiile sale [122, 145,
155-158]. Degradarea curcuminei au loc prin gruparea nesaturată α, β-diceto, fiind mai puțin
intensă în soluții concentrate, când produșii rezultați sunt 6-trans-(4‘hidroxi-3‘-metoxifenil)-
2,4-dioxo-5 hexanal, aldehida felurică, feruloil metan și vanilină.
Deși nu este pe deplin înțeleasă se crede că degradarea se efectuează prin
intermediul fragmentului diceto. Cu toate acestea, degradarea este redusă în mod
semnificativ atunci când curcumina este atașată la lipide: lipozomi, albumină, ciclodextrină,
curcubituril, surfactanți, polimeri și alte macromoleculare și microeterogene [145, 146].
Astfel s-a dovedit a fi de mare folos faptul că soluții stabile de curcumină ar putea fi
preparate într-un mediu de cultură ce conține 10 % ser fetal bovin, precum și sânge uman.
Curcumina suferă o degradare mult mai rapidă atunci când este expusă la lumina
soarelui [144, 145, 159]. Produsele identificate în timpul fotodegradării sunt: vanilina, acidul
feluric și alți fenoli mai mici indicând o distribuție a produșilor de degradare fotochimică
similară cu degradarea chimică în soluție. Unele rapoarte indică faptul că curcumina
generează oxigen singlet și alte specii reactive de oxigen în momentul
fotodegradării,reponsabile pentru activitatea sa fotobiologică și fotodinamică [160].
36
Fotodegradarea este accelerată în prezența nanoparticulelor de TiO2, iar această metodă
poate fi utilizată pentru a îndepărta petele de turmeric din țesuturile de bumbac [161].
Metabolizarea curcuminei la șobolani și oameni produce diferite produse. Două căi
biologice majore au fost identificate pentru metabolizarea curcuminei cum ar fi cea de
conjugare cu oxigen și de reducere. Produșii de conjugare cu oxigen sunt glucuronid
curcumina și sulfat de curcumină iar cei de reducere sunt tetrahidrocurcumin,
hexahidrocurcumin și octahidrocurcumin. Alți produși pot fi: dihidrocurcumin glucuronid,
tetrahidrocurcumin glucuronid, acid ferulic și acid dihidroferulic. [144]
Deși s-a raportat că procesele au loc pe cale enzimatică, enzimele implicate în toate
aceste produse de reacție specifice sunt încă un subiect de dezbatere. Reacțiile enzimatice
specifice sunt probabil, mult mai rapide și nu permit degradarea hidrolitică lentă, prin
urmare, procesul hidrolitic nu poate concura cu reacțiile enzimatice. [121, 122]
1.3.2.3.3. Reacții de adiție nucleofilă
Gruparea nesaturată α, β-diceto din curcumină participă la reacția de adiție
nucleofilă (adiția Michael), cu anioni de –OH, -SH, -SeH ca donori. Această reacție a fost
raportată ca fiind utilă pentru a explica chimia și activitatea biologică a curcuminei în
celulele vii. [119, 121, 122, 162-165].
Un interes deosebit a primit reacția tiolilor biologici, cum ar fi glutation ce conține
grupări –SH [162, 163]. Conjugatele curcumină-glutation au fost izolate din diferite sisteme
biologice. Formarea acestui produs de adiție ar conduce la epuizarea nivelurilor de glutation
în celule, conducând astfel la reducerea apărării antioxidante. Cu toate că unele rapoarte
sugerează că acestă reacție este reversibilă, teoria nu este încă confirmată încă în celulele vii.
O reacție similară a fost observată în timpul inhibării tioredoxin reductazei, de către
curcumină [164]. Centrul activ al acestei enzime este selenocisteina. Selenol din
selenocisteină fiind puternic nucleofil la pH fiziologic este supus ușor reacției de adiție 1,4
cu curcumina, formând diferite specii legate covalent. Se speculează că această reacție este
responsabilă pentru inhibarea enzimei tioredoxin reductaza de către curcumină.
Hidrogenul metilenic al fragmentului diceto/enol a curcuminei poate acționa ca și
un nucleofil și să participe la reacții de adiție Michael cu electrofilie puternică, dar acestea
nu pot avea o semnificație în sisteme biologice [166]. Derivații de curcumină obținuți prin
modificare chimică au fost preparați prin reacții de condensare și adiție, cum ar fi, de
exemplu, derivații de semicarbazonă și derivații oximă ai curcuminei. Aceste produse
stabile, preparate independent au fost examinate pentru activitatea anticancer. În cele mai
37
multe dintre studii s-a raportat că acești derivați sunt mai citotoxici pentru celulele
canceroase decât curcumina liberă [167, 168].
1.3.2.3.4. Interacțiune cu ioni metalici
Curcumina formează complecși puternici cu majoritatea ionilor metalici cunoscuți.
Gruparea nesaturată α, β-diceto a curcuminei este un agent de chelare excelent.
Curcumina este considerat un ligand monobazic bidentat și formează complecși
stabili cu aproape toate metalele și non-metalele, obținându-se structuri stabile la un raport
stoechiometric curcumină: ion metalic de 2:1. Există foarte puține studii pentru raportul 3:1.
A fost raportat un complex octaedral cu Fe3+
[169]. Coordinarea curcuminei cu metalul are
loc prin gruparea enolică.
Există mai multe lucrări privind complecșii de curcumină cu metale tranziționale
cum ar fi Fe3+
, Mn2+
, Ni2+
, Cu2+
, Zn2+
, Pb2+
, Cd2+
, Ru3+
, Re3+
și multe altele. Există
complecși cu metale netranziționale și ioni rari cum ar fi: Al3+
, Ga3+
, Sm3+
, Eu3+
, Dy3+
, Y3+
,
Se2+
, precum și oxizi metalici cum ar fi VO2+. Structura și proprietățile fizice ale acestor
complecși depind de natura ionului metalic precum și de stoechiometria condițiilor de
reacție care la rândul lor decid stabilitatea și reactivitatea lor.
Complecșii metalici nu modifică numai proprietățile fizice ale curcuminei dar
afectează și reactivitatea biologică a metalelor. În general s-a observat că complexarea cu
curcumină reduce toxicitatea metalelor și unele complexe de curcumină cu metale cum ar fi
Cu2+
, Mn2+ acționează ca antioxidanți [170-177].
Datorită reacției reversibile de transfer de electroni cu ionul superoxid, complecșii
de Cu2+
, Mn2+
ale curcuminei acționează ca o enzimă ce mimează superoxid dismutaza.
Complecșii metalici ai curcuminei au o mare semnificație în ceea ce privește
patologia bolii Alzheimer, în cazul căreia s-a constatat că datorită naturii lipofile, curcumina
poate trece de bariera hemato-encefalică și ionii metalici chelați sunt toxici pentru neuroni.
S-a observat, de asemenea, că incidența bolii Alzheimer este redusă în mod semnificativ în
rândul persoanelor care sunt cunoscute a consuma în mod frecvent curcumină. Curcumina
formează complecși stabili cu toate metalele implicate în boala Alzheimer [177-179].
Interacțiunea Al3+
cu curcumina, anterior considerată a fi responsabilă pentru
apariția bolii a fost studiată extensiv. Curcumina formează trei tipuri diferite de complecși
cu Al3+, în funcție de stoechiometria reacției. Raportul stoechiometric curcumină: Al
3+ de
1:1 a prezentat o afinitate mai mică la legarea ADN-ului decât Al3+ liber, care a fost atribuită
abilității sale de reducere a incidenței bolii Alzheimer [178, 179].
38
Au fost raportate numeroase alte aplicații ale complecșilor metalici cu curcumina.
Complexele de Ga3+
cu curcumină au fost concepute pentru materiale bioceramice inovative
[180]. Complexul de curcumină cu zinc a prezentat efecte anticancer, gastroprotective și
antidepresive la șobolani [181, 182]. Complecșii de curcumină cu aur au arătat o activitate
antiartritică la testele in vivo [183]. Complecții vanadil-curcumină au prezentat activitate
antioxidantă și antireumatică [184]. Prin formarea complecșilor metalici cu curcumină se
reduce toxicitatea metalelor grele cum ar fi Hg2+
, Cd2+
, Pb2+
unde stresul oxidativ indus de
metalele grele este redus semnificativ prin formarea complexului [185-189].
Datorită sarcinii pozitive complecșii metalici ai curcuminei se pot leaga de ADN
[174, 190]. Unele rapoarte afirmă faptul că aceștia induc deteriorarea ADN-ului și prin
urmare prezintă un efect pro-oxidant. Ca urmare, ei sunt explorați ca agenți antitumorali mai
buni decât curcumina în sine [191, 192]. Evaluarea biologică a acestor complecși este mai
dificil de efectuat in vivo, deoarece biodisponibilitatea lor este foarte scăzută iar
experimentele sunt dificil de efectuat datorită solubilității scăzute în solvenți organici cum
sunt DMSO sau în fluidele biologice. Cu toate acestea fără nici o îndoială această
complexare in vivo a curcuminei cu metalele joacă un rol semnificativ în reducerea
toxicității induse de metale.
Curcumina poate complexa cu diferiți liganzi. Complecșii cu punți de porfirină cu
Cu2+
, Ni2+
și Zn2+ prezintă o îmbunătățire a activității fotodinamice în modele de ADN
plasmidic [193]. Complecșii cu 4,4 bipiridină și Zn2+
sunt mai eficienți decât curcumina
pentru a distruge celulele de neuroblastom. Cei cu terpiridin lantanida (La3+) au arătat o
creștere în fototoxicitate în celulele HeLa [194]. Complecșii de bipirdin-curcumină cu Pd2+
inhibă formarea celulelor canceroase de prostată [191].
1.3.2.4. Studii farmacologice efectuate pe curcumină
Insolubilitatea în apă și biodisponibilitatea scăzută a curcuminei în celule au
determinat dezvoltarea de noi formulări pe bază de substanțe organice biocompatibile:
lipozomi, biopolimeri, hidrogeluri [195-197]. Pentru a crește biodisponibilitatea și a obține o
circulație mai eficientă, o permeabilitate mai bună și rezistență la procesele metabolice au
fost preparate mai multe formulări ce includ nanoparticule, lipozomi, micele și complexe
fosfolipidice. Studiile farmacologice relevă faptul că curcumina este sigură și eficientă, ceea
ce a determinat să fie utilizată în tratamentul și prevenirea unei game largi de boli umane.
Cu toate acestea, datele acumulate au arătat că curcumina are o biodisponibilitate relativ
scăzută și o slabă solubilitate în soluții apoase.
39
Pentru prima dată Wahlstrom și Blennow (1978) au raportat faptul că după
administrarea orală a 1 g curcumină/kg la șobolani concentrațiile de curcumină care s-au
găsit în plasmă au fost neglijabile, fapt care se poate datora slabei absorbții din intestin
[198]. Într-un studiu în care curcumina a fost administrată oral la o doză de 2 g/kg la
șobolani, o concentrație serică maximă de 1,35 μg/ml a fost observată la un interval
de timp de 83 h, în timp ce la oameni la aceeași doză, cantitatea de curcumină este
nedectabilă sau foarte redusă în concentrațiile serice (0,006 ) [199].
Un alt studiu efectuat pe șobolani a arătat că administrarea per os a curcuminei 500
mg/kg a condus la o biodisponibilitate de 1% în plasmă; s-a observat faptul că administrarea
orală a curcuminei (1000 mg/kg) la șobolani a prezentat o concentrație plasmatică de 15
ng/ml după 50 min [200]. Spre deosebire de administrarea la rozătoare, administrarea a 4-8
g de curcumină la om au arătat nivele plasmatice maxime de 0,41-1,75 μM după o oră de la
administrare [201].
Într-un alt studiu efectuat pe voluntari umani sănătoși, 3,6 g curcumină administrată
oral a fost regăsită la nivel plasmatic într-o concentrație de 11,1 μmol/l, după o oră de la
administrare [202].
S-a constatat că 10 mg/kg curcumină administrată intravenos la șobolani a atins
nivelul seric maxim în curcumină de 0,36 μg/ml, în timp ce o doză de 50 de ori mai mare
administrată pe cale orală a dat o concentrație doar de 0,06 0,01 μg/ml în nivelele serice ale
șobolanilor [203]. Sun și colab. au arătat că administrarea intravenoasă a curcuminei libere
la șobolani prezintă o mai bună biodisponibilate in plasma sangvină. Concentrația a fost de
6,6 μg/ml în sânge cand s-au administrat 2 mg/kg curcumină intravenos [204].
Aceste studii sugerează rolul căii de administrare pentru atingerea nivelelor serice ale
curcuminei și, de asemenea, comparația între nivelele serice la rozătoare și oameni.
40
CAPITOLUL 2
Polimeri utilizați pentru imobilizarea principiilor active în industria alimentară
Progresele in domeniul științei polimerilor au condus la numeroase apicații și în
domeniul industriei alimentare, îndeosebi a celor care apelează la biotehnologii. Inițial
polimerii au fost utilizați pentru solubilizarea sau stabilizarea principiilor biologic active, dar
treptat au fost dezvoltate sisteme noi de eliberare a acestora. Dezvoltarea continuă a științei
polimerilor a determinat obținerea de materiale performante pe bază de polimeri naturali și
sintetici cu proprietăți unice remarcabile pentru bioaplcații.
Polimerii pot fi clasificați în funcție de sursa de proveniență (naturali, semisintetici
și sintetici), geometria moleculei (liniari, ramificați, reticulați), procedeul de sinteză
(polimerizare înlănțuită sau treptiformă, policondensare), comportare termică (elastomeri,
termoplaste, fibre), biodegradabilitat (biodegradabil, nebiodegradabil).
În cele ce urmeazxă se va face o trecere în revistă a polimerilor utilizabili în diferite
aplicații din industria alimentară, în corelare și cu strctura lor [205].
2.1. Polimeri naturali
Polimerii naturali sunt biodegradabili, capabili să se descompună prin hidroliză
chimică sau catalizată de enzime în produse secundare biocompatibile. Această proprietate
face posibil ca ei să poată fi implantaţi în corpul uman fără a fi nevoie de îndepărtarea lor
ulterioară prin operaţii chirurgicale. Medicamentele și principiile active încorporate în aceşti
biopolimeri diferit formulați se eliberează controlat pe o perioadă prelungită de timp,
concentrația lor la locul ţintă din corp menținându-se în domeniul terapeutic [206, 207].
Viteza de eliberare a medicamentelor din biopolimeri poate fi controlata de un număr de
factori cum ar fi: cinetica de biodegradare a polimerilor [208], proprietăţile fizico-chimice
ale polimerilor şi ale medicamentelor [209] compatibilitatea termodinamică între polimeri şi
medicament [210], forma dispozitivelor [211, 212]. Faptul că pot fi utilizați în domeniul
medical îi recomandă cu prisosință și pentru aplicații în industrria alimentară, pentru
imobilizarea altor principii bioactive precum celule, microorganisme, enzime etc.
Polimerii naturali sunt reprezentați de proteine și polizaharide. Pentru îmbunătățirea
proprietăților mecanice sau pentru modificarea vitezei de degradare polimerii naturali sunt
deseori modificați chimic [213].
2.1.1.Proteine
Cuvântul „proteină‖ este definit ca oricare grupare de compuși organici complecși
având în compoziție, în principal, combinații de aminoacizi princși în legături peptidice,
41
care conțin de obicei carbon, hidrogen, oxigen, azot și sulf. Se găsesc în plante și animale,
reprezentând principalul component al protoplasmei tuturor celulelor și sunt esențiale
pentru viață. Cuvântul „proteine‖ provine din limba greacă și înseamnă „prima‖ sau
„primară‖ datorită rolului esențial al proteinelor în susținerea vieții [214, 215].
Proteinele joacă in rol fundamental nu numai în susținerea vieții, dar și în produsele
alimentare provenite din plante și animale. Produsele alimentare variază prin conținutul lor
de proteine iar proprietățile proteinelor diferă în funcție de tipul lor. În plus față de
contribuția lor la proprietățile nutritive ale alimentelor, prin furnizarea aminoacizilor
esențiali pentru menținerea și creșterea sănătății umane, proteinele conferă și o bază
structurală pentru diferite proprietăți funcționale ale produselor alimentare.
Produsele animale, carnea, laptele, produsele din lapte, ouă, carnea de pui și
peștele sunt surse bogate în proteine conținând un nivel echilibrat de aminoacizi. Alimentele
pe bază de plante, legumele și nucile (oleaginoasele) sunt și ele surse de proteine. Proteinele
animale și cele din plante sunt diferențiate prin:
- Proteinele animale sunt în general asociate cu un conținut mare de grăsimi și datorită
acestui fapt, dacă sunt consumate în cantități mari există riscul de îmbolnăvire
conducând la declanșarea hipertensiunii arteriale și alte boli de inimă.
- Proteinele animale dispun de o combinație echilibrată a aminoacizilor, prin urmare
sunt numite și proteine complete. În schimb, proteinele vegetale sunt proteine
incomplete, singura excepție constituind-o proteina din soia [216].
2.1.1.1. Proteine din plante
Legumele și fructele sunt o sursă bună de proteine. Leguminoasele au un conținut
mai mare de proteine decât legume și fructe [217].
Câteva proteine mai importante, precum și caracteristicile și utilizările lor sunt
prezentate mai jos.
Proteine din soia reprezintă un amestec de proteine globulare pe bază de
conglicinine și sunt obținute din specia de plante Glycine max, familia Fabaceae [218]. În
funcție de masa moleculară și coeficientul de sedimentare proteinele acestea pot fi separate
în diferite fracții: 2S, 7S, 11S sau 15 S [219]. Fracțiile de globulină 7S și 11S au un conținut
de 37% și 31% proteinele din soia. În combinație cu alte proteine acestea pot forma filme;
glicinina este cunoscută ca agent de gelifiere, emulsifiere și agent de spumare [220]. β-
Conglicinina este mai puțin rezistentă la temperatură decât glicinina și este denaturată la
temperaturi cuprinse între 70-80˚C [221]
42
Proteine din grâu
În funcție de solubilitate, proteinelor din grâu sunt clasificate în albumine (solubile
în apă), globuline (solubile în soluții diluate de săruri), gliadine (solubile în 70-90% etanol,
cuprind 34% din totalul de proteine) și glutenina (insolubilă în toți solvenții menționați
anterior, cuprind 47% din totalul de proteine) [222,223].
Gliadina joacă un rol important în formarea filmelor, cărora le conferă rezistență și
elasticitate [223]. Glutenina reprezintă un amestec de proteinecu diferite valori ale masei
moleculare. Legăturile disulfidice prezente în glutenină și gliadină determină rezistența
matricei de proteine [224].
Zeina din porumb
Zeina conține un procentaj mare de aminoacizi nepolari, în special glutamina (26
%), leucină (20%) și prolină (10%) și aminoacizi bazici și acizi în proporții scăzute. Este
insolubilă în apă [225]. Cele două fracții majore ale zeinei sunt: α-zeina, solubilă în 95%
etanol și β-zeina solubilă în 60% etanol. Comercial este utilizată ca strat de acoperire a
tabletelor și în ambalaje biodegradabile [224].
Proteinele din mazăre reprezintă un procent de 20-30% extrase din semințele de
mazăre și includ în principal din globuline (65-80%) și două fracții minore de albumină și
glutelină. Globulinele sunt compuse din trei proteine diferite: legumina, vicilina și
convicilina [226]. Fracția 11S de globulină este reprezentată de către legumină, în timp ce
fracția 7S de globulină este reprezentată de vicilină și convicilină [227].
Proteinele din orez
În timpul procesării orezului alb, se obține tărâțea care reprezintă o sursă de
proteine de înaltă calitat, ieftină, rezultând în urma procesului de măcinare [228]. În tărâțea
de orez se găsește o cantitate mai mare de proteine decât în boabele de orez și variază între
6% și 15% [229]. Sunt separate în general prin extracție cu alcali urmată de precipitare cu
alcali[230, 231] și prin tratament subcritic al apei [232]. După extracția succesivă conțin:
glutenina 75%, globulină 15%, albumină 6% și 3% prolamina [233]. Conținutul principal de
aminoacizi din proteinele de orez este similar cu cel din proteinele de cazeină și soia [234].
Proteinele din floarea soarelui
Proteinele sunt constituenți majoritari în turtele de ulei din floarea soarelui. Făina
de floarea soarelui degresată conține proteine în proporție de 2% din greutatea uscată [235],
sub forma a 4 fracții [236]: globuline 55-60 %, albumine 17-23% gluteline și prolamine (în
mai mică proporție. Sunt prezentate două fracții majore: globuline 11S (de asemenea
denumite heliantinine) și albumine 2S [216, 237].
43
2.1.1.2. Proteine de origine animală
Proteinele care provin din surse animale conțin aminoacizi esențiali necesari pentru
o dietă la adulți.
Cazeina
Cazeina are o proprietate unică de a forma filme [216, 238, 239]. Se găsește în
lapte și produsele lactate. Sensibilitatea la ionii de Ca2+ determină agregarea și precipitarea
la concentrații mici ale ionului. Nu participă la formarea legăturilor de disulfide și la
reticulare datorită absenței grupărilor de cisteină libere. Cazeina este stabilă la temperatură
deoarece este bogată în prolină dar scindeazăp proteolitic. Această caracteristică împreună
cu punțile fosfat-calciu care scindează ușor în mediu acid le conferă posibilitatea de a fi
utilizate ca suporturi pentru transport și eliberare la tintă a unor medicamente în tractul
gastrointestinal [240, 241].
Proteinele din zer
Proteinele din zer sunt cele care rămân în lapte după coagularea cazeinei la pH 4.6
și 20˚C. Conțin β-lactoglobuline (M=66 kDa, conținând 160 de aminoacizi), α-lactalbumina
(M=14,2 kDa), BSA (M=66 kDa) și imunoglobine (un amestec de proteine termolabile)
[216, 242, 243].
Proteinele din carne
Tipurile de proteine din carne sunt: sarcoplasmice, stromale miofibrilare.
Colagenul și elastina fac parte din conținutul proteinelor stromale în timp ce miozina, actina
tropomizina și troponinele fac parte din conținutul proteinelor miofibrilare. Proteinele
stromale și miofibrilare sunt solubile în solutie de diferite săruri și sunt utilizate pentru
obținerea de filme și pentru acoperiri. Colagenul este o proteină stromală fibroasă, extrasă
din țesutul conjunctiv, tendoane, piele, oase și din sistemul vascular. La temperatură medie
și în condiții acide sau alcaline formează gelatina [244, 245].
Albumina din ouă
Fracțiile de proteină sunt: ovalbumina, ovotransferina, ovomucoid, ovomucina și
lizozima (un agent antimicrobian gram negativ prezent în albumină) [246].
Proteinele ovalbumina, ovotransferinași lizozima la denaturare formează structuri
puternice intermoleculare, de exemplu formează geluri la temperatură deoarece sunt
sensibile la temperatură [216].
44
Proteinele de mătase
Viermii de mătase Bombyx mori produc mătase pe care o țes în coconul lor.
Biocompatibilitatea, biodegradabilitatea lentă, autoasamblarea, proprietățile mecanice
excelente, structura și morfologia controlabilă conduc la obținerea unor materiale
promițătoare pentru eliberarea medicamentelor și pentru ingineria tisulară [247].
Componentele proteice majoritare din mătase sunt fibroina (o proteină fibroasă) și
sericina care acoperă fibroina în coconul format [248].
Proteinele sunt utilizate pentru elaborarea de sisteme de eliberare controlat[ a
medicamentelor sau a genelor, sub formă de film pentru a acoperi diferite suprafețe,
hidrogeluri, nano/microparticule [249, 250].
Unele exemple sunt:
-Proteinele din grâu sunt utilizate ca și hidrogeluri, sisteme nanoparticulate pentru
încapsulare și eliberare controlată a compușilor bioactivi [216].
-Semințele de soia modificate genetic acumulează novochinină și pot fi utilizate în
tratamentul bolii HTA (hipertensiune arterială) [251].
-Pot crește solubilitatea curcuminei și sunt utilizate în industria alimentară sub
formă de micele (β-cazeina) [252].
-Proteinele din lapte pot fi utilizate ca vehicule pentru transportul componenților
bioactivi. Cazeina care provine din 4 peptide bioactive principale acționează asupra
sistemului cardiovascular, asupra sistemului nervos, asupra sistemului imunitar și asupra
sistemului nutrițional [253].
-Proteine vegetale cum ar fi proteinele din soia, mazăre, grâu, orez și floarea
soarelui, sunt utilizate pentru microîncapsulare [216].
2.1.2. Polizaharide
Polizaharidele joacă un rol central în toate organismele vii pentru suplimentarea și
depozitarea energiei și pentru integritatea structurală și protecția celulelor, permițând și
obținerea de noi materiale cu aplicații în domeniul medical, cosmetic, alimentar.
Polizaharidele prezintă multe interacțiuni moleculare: cu alte polizaharide, cu alte
tipuri de polimer (proteine, lignine, polifenoli, polimeri sintetici) și cu molecule mai mici
(apă, solvenți (ionici) care conduc la dizolvarea polizaharidelor) [254].
În ultimii ani un număr mare de studii au contribuit la înțelegerea rețelelor de
hidrogel pe bază de polizaharide. Gelurile obținute prin reticulare fizică sunt de mare interes,
45
în special datorită faptului că formarea gelului poate avea loc în condiții blânde în absența
solvenților organici.
Pentru aplicații în industria alimentară se utlizează polizaharidele microbiene
utilizate: xantan, xililan, gelan, curdlan, pululan, dextran, scleroglucan, schizofilan și
polizaharide cianobacteriene, chitosan [255].
Clasificarea polizaharidelor se poate efectua după mai multe criterii:
după sarcina electrică:
- anionice: gelan, agar, pectină, caragenan.
- cationice: chitina și chitosanul.
- neionice: gumă guar, tamarind, xantan, celuloză.
după origine:
-marină: alginați, agar, caragenan.
-animală: chitosan, condroidin sulfat, acid hialuronic;
-vegetală: gumă guar, amidon, celuloză, pectină.
-microbiană: glicani, pululan, dextran, xantan, gelan.
după geometria macromoleculei:
-liniare: amiloza, pectina, celuloza
-ramificate: gumă guar, gumă arabică.
Polizaharidele îndeplinesc condiţiile cerute pentru imobilizarea unui principiu
biologic activ: sunt lipsite de toxicitate, inerte farmacologic, nu conţin impurităţi sau aditivi
şi compuşi reziduali ai proceselor de reticulare sau polimerizare, prezintă structură chimică
bine precizată. Abilitatea polizaharidelor de a forma geluri chiar şi la concentraţii foarte mici
reprezintă una dintre cele mai importante proprietaţi funcţionale ale acestora. Formarea
structurilor tridimensionale oferă o cale de creştere a stabilitaţii chimice şi mecanice a
sistemului [256].
Numărul polizaharidelor care au fost investigate pentru prepararea particulelor de
hidrogel potrivite pentru sistemele de eliberarea a compușilor biologic activi este foarte
variat iar în cele ce urmează vom trece în revistă aspecte privind structura, proprietățile și
aplicațiile unor pentru polizaharidele selectate în vederea realizării părții experimentale a
tezei.
2.1.2.1. Gelanul
Polizaharidele microbiene sunt polimeri solubili în apă şi pot fi ionice sau neionice.
Exopolizaharidele sunt sintetizate din microorganisme care se găsesc ataşate de suprafaţa
46
celulei sau în mediul extracelular într-un amestec amorf. Unităţile din exopolizaharide se
repetă regulat, fiind ramificate sau neramificate şi sunt conectate prin legături glicozidice.
Primul glicopolimer sintetizat prin fermentare microbiană a fost dextranul în 1880. Xantanul
fost obtinut in urma cercetarilor efectuate în 1960 în mai multe laboratoare [257-259].
Kaneko si Kang au descoperit, în laboratorul Kelco de Merck & Co, California,
USA în 1978 un polimer solubil în apă – gelanul -, care a căpătat o importanţă majoră în
industria alimentară, farmaceutică şi chimică datorită proprietăţilor funcţionale pe care le
posedă. Succesul producției de gelan la nivel de laborator a fost raportat pentru prima dată în
1982 [260].
Gelanul este o polizaharidă anionică cu masă moleculară mare, produsă prin
fermentare microbiană, în condiţii aerobe din bacteria Auromonas (Pseudomonas) Elodea,
redenumită Sphingomonas paucimobilis. În 1988, după efectuarea studiilor de toxicitate,
Japonia aprobă guma gelan pentru utilizare în produsele alimentare. De asemenea, FDA
aprobă utilizarea gumei gelan ca aditiv în 1992 [261]. In prezent gelanul este obținut la scară
industrială, fiind cunoscute mai multe varietăți de tulpini tulpini Sphingomonas paucimobilis
capabile sa il produca: ATCC31461 , E2-DSM6314, NK 2000 si GS1 – cel mai bun
randament obtinându-se cu prima dintre acestea.
Gelanul este comercializat cu patru
denumiri diferite: Kelcogel, Gelrite, Phytagel şi Gel-Gro. Kelcogel este utilizat pe scară
largă în industria alimentară ca agent de îngroşare şi agent de gelifiere, în timp ce Gelrite,
Phytagel şi Gel-Gro sunt utilizați ca agenţi de solidifiere, ca substituenţi pentru agar, ca
medii pentru creşterea microbiană şi culturi de ţesuturi de plante [262-264].
În industria alimentară, gelanul este utilizat ca stabilizator, gelifiant, filmogen si ca
agent de încapsulare. În tehnologia farmaceutică, este adaptat la scară largă ca şi vehicul de
transport al medicamentelor. Aceste proprietăţi derivă din reactivitatea cu cationii şi din
abilitatea sa de a forma un gel la concentraţii remarcabil de mici în comparaţie cu alţi
hidrocoloizi cum ar fi carageenan, alginat, pectina sau gelatina [265].
Din punct de vedere structural este un polimer anionic, liniar cu secvenţe de
tetrazaharide care se repetă şi sunt constituite din două reziduuri de de β-D-glucoză, unul de
acid β-D-glucuronat şi unul de α-L-ramnoză (fig. 1) într-un raport 2:1:1 [266, 267]. În figura
4 este prezentată structura gelanului.
47
Figura 4. Unitatea structurală a gelanului deacetilat (sunt indicate locurile unde substituenţii
gliceril si acetil sunt ataşati în gelanul bogat in grupe acil) [266, 267].
Polizaharida nativă are un substituent L-gliceril pe O(2) de la al 3-lea reziduu de
glucoză legat de secvenţa de tetrazaharide şi, în cel puţin câteva unităţi care se repetă o
grupă acetil la O(6) al aceluiasi reziduu [268].
În producţia comercială obişnuită ambele tipuri de substituenţi sunt îndepărtaţi prin
tratarea masei de fermentaţie cu alcali fierbinţi. Polimerul deacetilat rezultat este cunoscut ca
şi ―gumă gelan‖ sau prin numele comercial Kelcogel (pentru aplicaţii alimentare) sau Gelrite
(pentru aplicaţii nealimentare). Este comercializat şi gelanul bogat în grupe acil. Grupările
acil pot fi păstrate prin utilizarea procedurilor de extracţie mai blânde.
Macromoleculele de gelan se asociază câte două, într-o structură de dublu helix
(figura 5). Cele două lanţuri polimerice sunt paralele unul faţă de celălalt şi sunt imbinate
exact la jumătate (cu o rotaţie a lanţului de 180º), în aşa fel încât distanţa care se repetă a
helixului este jumătate din catena individuală, un aranjament similar cu cel observat pentru
caragenan. [269, 270].
(a) (b)
Figura 5: Structura de dublu helix a gelanului deacetilat vizualizat (a) perpendicular
pe axa helix şi (b) de-a lungul axei helix (locurile unde sunt ataşati substituenţii gliceril şi
acetil în gelanul bogat în grupe acil, în raport cu poziţia grupelor carboxil din vecinătatea
rezidului glucuronat, sunt indicate in (b) [269].
Proprietăți de gelifiere ale gelanului
Gelanul este exopolizaharidă microbiană anionică, solubilă în apă, cu masa
moleculară cuprinsă între 1-2x 106 Da pentru gelanul bogat în grupe acil şi 2-3 x10
5 Da
pentru gelanul deacetilat [270]. Gelanul acetilat este solubil în apă caldă în timp ce gelanul
48
deacetilat sau cel care conţine puţine grupe acil (deacetilat) este solubil atât în apă caldă cât
şi în apă rece. Solubilitatea depinde de numărul de grupe acil/mol [271, 272]. Încălzirea la
85-95ºC a gelanului bogat în grupe acil este suficientă pentru solubilizarea sa în apă [273].
În cazul gelanului deacetilat sau cu puţine grupe acil hidratarea depinde de tipul şi
concentraţia ionilor, el fiind solubil în apă deionizată la temperatura camerei, la fel ca şi
sarea sa de sodiu. Prin adăugarea unei concentraţii foarte mici de ioni în soluţia de gelan
aceasta se schimbă în hidrogel la modificarea temperaturii. În comparaţie cu alte geluri de
polizaharide gelul de gelan este mai rezistent la temperatură şi mai puţin sensibil la pH [274,
275].
Gelifierea gelanului a fost investigată de mulţi cercetători, constatându-se ca este
un proces în două etape. În prima etapă are loc o schimbare conformaţională de la o
conformație dezordonată la una ordonată de dublu helix şi în a doua are loc agregarea dublu
helixului şi formare punctelor de joncţiune [276, 277]. Gelifierea depinde de concentraţia
soluției, temperatură şi de prezenţa în soluţie a cationilor monovalenţi sau bivalenţi. Gelanul
formează un helix ordonat din catene duble la temperaturi scăzute, în timp ce la temperaturi
înalte apare o singură catenă de polizaharidă, ceea ce reduce semnificativ vâscozitatea
soluţiei. Temperatura de tranziţie pentru transformarea de fază sol-gel este de 35ºC dar poate
varia între 30-50 ºC. Sub această temperatură se formează gelul de gelan. Mecanismul de
gelifiere constă în formarea unor zone de joncţiune dublu elicoidale, urmată de agregarea
segmentelor dublu elicodale pentru a forma o reţea tridimensională prin complexare cu
cationi şi prin legături de hidrogen cu apa [278, 279].
S-a sugerat că mecanismul de gelifiere a gelanului deacetilat în prezenţa ionilor
bivalenţi este diferit de mecanismul de gelifiere care are loc în prezenţa ionilor monovalenţi
[270]. În prezenţa cationilor monovalenţi, gelifierea apare cu agregarea ulterioară a dublu
helixului şi la o temperatură mai scăzută decât cea la care apare tranziţia de la o structură
neregulată la structura ordonată de dublu helix. În schimb, se presupune ca în cazul
cationilor bivalenţi aceştia ar interacţiona imediat cu segmentele de lanţ din gelan atunci
când are loc răcirea, formând o structură ordonată specifică la o temperatură mai ridicată
decât temperatura de tranziţie. Reţelele de gel astfel formate devin foarte stabile la
temperatură după adăugarea progresivă de cationi [280, 281].
Cationii monovalenţi scad repulsia electrostatică prin legarea lor la structura
elicoidală în locurile specifice din jurul grupelor carboxilice ale polimerului. Puterea
legăturii creşte cu creşterea razei ionice (Li+< Na
+< K
+< Rb
+< Cs
+). Sunt necesare
concentraţii mai mari de cationi monovalenţi pentru obţinerea unor geluri de gelan cu o tărie
49
optimă în timp ce sunt necesare concentraţii de cationi bivalenţi mult mai mici pentru
obţinerea unui gel cu aceeasi tărie [269, 276]. Agregare şi gelifierea cu cationii bivalenţi
apare direct în zonele de legare din helixul dublu al ionilor bivalenţi. Concentraţii mari de
sare sau de acid cauzează agregarea excesivă și în consecinţă scade tăria gelului.
Aceste structuri ordonate devin extrem de stabile la temperatură prin adăugarea
progresivă de cationi bivalenţi, mai eficienţi decât cei monovalenţi. Cationii bivalenţi ai
metalelor tranziţionale (Zn2+
, Cu2+ şi Pb
2+) dau geluri mai puternice decât metalele din grupa
II [282]. Gelurile care conţin cationii Ca2+
sunt de 1.1-1.4 ori mai puternice decât cele care
conţin cationii Mg2+
la aceeaşi concentraţie de sare [276].
Potenţialul de gelifiere a gelanului este îmbunătăţit prin adăugarea de cationi
monovalenţi sau bivalenţi în timpul procesului de răcire ceea ce duce la creşterea numărului
de punţi de sare din zona de joncţiune [283].
Metodele reologice reprezintă o cale de monitorizare a procesului de gelifiere a
fluidului vâscoelastic, deoarece vâscoelasticitatea soluţiei de polimer se schimbă mult la
punctul de gel. Temperatura de gelifiere crește cu creșterea concentraţiei de cationi [284-
286].
Studiile reologice şi de microscopie confocală laser de baleiaj demonstrează că
soluţiile cu concentraţii de gelan între 0.005-0.05 %, în prezenţa a 10 mM CaCl2 duc la
formarea unei reţele de gel. La concentraţii mai mici de gelan, spectrul mecanic arată un
comportament de gel iar observaţiile microscopice indică formarea unei reţele
tridimensionale chiar dacă vâscozitatea soluţiei este redusă semnificativ. Creşterea
progresivă a concentraţiei de gelan determină un caracter elastic al sistemelor de gel obţinute
dar îmbunătăţirea proprietăţilor gelului depinde de concentraţia de cationi [275, 287].
Figura 6 prezintă două modele de mecanism de gelifiere, propuse de Robinson [288]
respectiv de Grunning [289].
=
50
Fig 6. Modele de gelifiere propuse de a) Robinson şi colab.(1991)şi b) Gunning şi Morris
(1990). Cationii care promovează agregarea structurii dublu elicoidale sunt reprezentaţi prin
prin cerculeţe umplute [289, 290].
Au fost efectuate diverse studii asupra factorilor care influenţează tăria gelului, cei
mai importanţi dovedindu-se următorii:
Conţinutul de grupe acil
Cercetările au evidentiat faptul că acesta este cel mai important factor care
influenţează proprietăţile şi tăria gelului. Gelanul nativ, bogat în grupe acil formează geluri
moi, elastice, termoreversibile şi foarte slabe. Grupările acetil şi gliceril împiedică asocierea
strânsă între lanţurile polimerice pentru formarea structurii elicoidale şi, de asemenea,
împiedică împachetarea compactă în dublu helix. Gelanul deacetilat formează geluri ferme,
fragile (casante) şi termoreversibile datorită absenţei grupelor acetil şi gliceril [291].
Tipul şi concentraţia ionilor
Ionii au impact asupra tăriei gelului şi asupra fragilităţii acestuia. Gelanul nu
formează geluri în apă deionizată, dar prin adăugarea de săruri de calciu, potasiu, sodiu şi
magneziu se observă o imbunătățire a acestor două proprietăţi. Cationii bivalenţi sunt mult
mai eficienţi în realizarea acestei proprietăţi. Chiar şi la concentraţie foarte mică de gelan
(0,2% m/v) a fost realizat un gel cu o rezistenţă ridicată, cu o concentraţie de 0.004 % (m/v)
ioni de calciu şi 0.005 % (m/v) ioni de magneziu. Un gel la fel de puternic poate fi obţinut
utilizând o concentraţie de 0,16 % ioni de sodiu şi 0,12 % (m/v) ioni de potasiu. O
concentraţie de 0.1- 0.2 % de gelan este potrivită pentru multe sisteme alimentare. Din punct
de vedere economic este important să se obțină geluri puternice la o concentraţie cât mai
mică de gelan, cu încorporarea unei cantităţi infime de sare [281, 292].
PH-ul
Sanderson şi Clark au arătat că tăria gelului poate fi îmbunătăţită în domeniul de pH
3.5-8, care corespunde domeniului de pH natural din majoritatea alimentelor. Modificarea
pH-ului nu modifică punctul de formare a gelului, dar afectează în unele cazuri temperatura
de topire. De exemplu, geluri preparate cu concentraţii foarte scăzute de ioni monovalenţi se
topesc la 70ºC, la un pH neutru, dar la un pH=3,5 temperatura de topire este uşor crescută.
Această tendinţă nu a fost observată pentru ionii bivalenţi [293, 294].
Prezenţa ingredientelor hidrofile
Adăugarea de ingrediente hidrofile, cum ar fi zaharoza (cu o concentraţie de
aproximativ 10% m/v) tinde să scadă concentraţia de ioni necesari pentru crearea unui gel
rezistent. Au fost preparate şi studiate amestecuri formate din gelan deacetilat (< 1 % ) cu
51
zahăr în concentraţii mici (0 - 20 %) şi mari (80-85 %). Micrografiile gelurilor de gelan cu
conţinut ridicat de zahăr dovedesc reducerea reticulării în reţeaua de polizaharide, care după
răcire prezintă o tranziție de la o consistenţă elastica la una sticloasă [295].
Tang şi colaboratorii au studiat efectul fructozei şi zaharozei asupra proprietăţilor
gelurilor de gelan reticulate cu ioni de calciu sau sodiu (temperatura de gelifiere, claritatea
gelurilor şi textura). Au raportat faptul că creşterea concentraţiei de zaharoză şi fructoză în
geluri cu până la 35% nu a avut nici un efect peste temperatura de gelificare.
Încorporarea de fructoză şi zaharoză în geluri a dus la creşterea clarităţii acestora.
Efectul zaharozei asupra tăriei gelului s-a găsit a fi dependent de concentraţia de cationi. La
o concentraţie scăzută de cationi zaharoza consolidează (întăreşte) gelurile, dar la
concentraţii mari aceasta face ca gelurile sa fie mai slabe [296].
Influenţa zahărului în soluţia de gelan a fost investigată de Miyoshi şi Nishinari
(1999) [297], respectiv de Miyoshi şi colab.(1998) utilizând ca metode de caracterizare DSC
şi testele reologice [298]. Concentrația de zahăr a variat de la 0 la 72%. Bayarri şi colab.,
2002, studiază efectul zaharozei (0-25%) pentru trei probe de gelan de concentraţii diferite
0.3, 0,75 şi 1.2%, utilizînd teste de compresiune. Crescând cantitatea de zaharoză gelurile
devin mai puternice şi mai puţin fragile. Modificările s-au putut distinge mai bine atunci
când au fost utilizate concentrații mai mari de gelan [299].
Sworn şi Kasapis (1998) au făcut studii privind influenţa zaharozei asupra tăriei
gelului, utilizand concentraţii de peste 40% zaharoză; ei observă o creştere a tăriei gelului în
aceste condiții [300]. Adăugarea unor cantităţi de glucoză sau fructoză împreună cu o
cantitate de zaharoză până la o concentraţie totală de 60% zaharuri a dus la obţinerea unui
gel mai puternic decât dacă s-a utilizat doar zaharoza. Valoarea modulului la rupere a fost
mai mare pentru gelurile de gelan în care s-a adăugat fructoza decât pentru gelurile de gelan
în care s-a adăugat doar zaharoza în aceeaşi concentraţie [301]. După cercetările efectuate de
Gibson (1997) eficienţa zaharurilor pentru obţinerea unor geluri de gelan cu o tărie optimă
este următoarea:
fructoză> glucoză> zaharoză.
Miyoshi şi Nishinari (1999) [297] afirmă exact opusul celor spuse de Gibson,
ordinea eficienţei fiind după aceşti cercetători
zaharoză> glucoză> fructoză.
Morris şi colaboratorii (2012) afirmă că această diferenţă se datorează tipurilor
diferite de gelan utilizate în cercetare, gelanul comercial având cantităţi mai mari de cationi
bivalenţi decat gelanul cu conţinut mare în ioni de sodiu utilizat de către Miyoshi şi
52
Nishinari (1999). Gelanul comercial cu un conţinut mai mare în cationi bivalenţi utilizat
pentru obţinerea de geluri, în prezenţa zahărului manifestă o agregare excesivă. Aceasta
determină o scădere în tăria gelului conducând la următoarea ordine a eficienţei zaharurilor
pentru obţinerea unor geluri de gelan mai puternice :
fructoză> glucoză> zaharoză [276]
Temperatura şi punctul de topire
Gelanul este stabil la temperaturi mari şi îşi menţine rezistenţa până la 90ºC.
Potrivit celor spuse de Sanderson şi colaboratori, temperatura de topire poate fi mai mică sau
mai mare de 100 ºC, în funcţie de condiţiile de formare a gelului. Cel mai important factor
responsabil pentru modificarea punctului de topire este concentraţia cationilor din geluri
deoarece cationii monovalenţi şi bivalenţi cresc semnificativ numărul de zone de joncţiune
în geluri şi le face mai rezistente la temperatură. Prin posibilitatea de modificare a punctului
de topire se pot înlocui cu succes alţi agenţi de îngroşare/stabilizatori convenţionali,
utilizând în acelaşi timp o concentraţie mult mai mică de polimer [272].
Absorbţia de apă
Capacitatea de absorbţie a apei este un parametru important pentru materialele care
urmează să fie utilizate în diverse aplicaţii alimentare şi biomedicale. Absorbţia de apă a
hidrogelurilor fizice şi chimice de gelan a fost evaluată în diverse medii. Hidrogelurile fizice
au arătat un comportament similar în diferite medii, ceea ce înseamnă că absorbţia de apă nu
este influenţată de compoziţia hidrogelurilor de gelan. Doar hidrogelul fizic cu o
concentraţie de 2% gelan arată valori mai scăzute ale proprietăților de umflare, în special în
soluţia care simulează fluidul gastric (HCl 0.1 M; pH=1), cînd se formează zone de
joncţiune mai stabile. De fapt, la pH=1, apare o suprimare a comportamentului
polielectrolitic în lanţurile de gelan, deoarece grupele carboxilat sunt în forma lor acidă. În
aceste condiţii lanţurile polimerice pot fi mai apropiate între ele ceea ce duce la diminuarea
macroscopică a gelului. Pentru probele reticulate chimic absorbţia de apă este puternic
dependentă atât de compoziţia hidrogelului cât şi de cea a soluţiei. Absorbţia de apă este
invers proporţională cu gradul de reticulare al probei. Când hidrogelurile sunt umflate în
apă, comportamentul lor este similar cu cel al materialelor superabsorbante, arătând valori
foarte mari ale parametrilor de umflare [292].
În soluţie de ser fiziologic (0,9 % g/v) şi în soluţia care simulează fluidul intestinal
(tampon fosfat; pH=7.4) hidrogelurile reticulate şi cele fizice arată valori scăzute ale
gradului de umflare, datorită prezenţei ionilor de sodiu în cantități mari, contraioni care
reduc repulsiile electrostatice între grupările carboxilice ale lanturilor polimerice şi crează
53
astfel o structură mai compactă. Proba cu o concentraţie în gelan de 2% reticulat chimic cu
lizină 0.1 % reprezintă o excepţie de la acest comportament. În acest caz absorbţia de apă
este mai mare datorită faptului că lanţurile polimerului sunt în conformaţie de helix şi
reţeaua, cu un grad de reticulare destul de redus, este capabilă să absoarbă cantităţi mari de
apă. Din nou, în fluidul gastric simulat se observă o absorbţie redusă de apă [292].
Pe lângă parametri cum ar fi masa moleculară, structura chimică şi grupele
funcţionale care determină proprietăţile soluţiilor de gelan, vâscozitatea intrinsecă este o altă
proprietate importantă [302], ce depinde de masa moleculară, structură moleculară, pH, tăria
ionică a soluţiei şi temperatura. Ea scade cu creşterea concentraţiei de sare şi a temperaturii
[303].
Aplicaţii alimentare ale gelanului
Hidrocoloizii sau gumele aparţin unor clase de polimeri naturali iar atunci când sunt
dispersaţi în apă formează dispersii apoase sau geluri. Datorită numeroaselor grupări
hidroxil pe care le pospermit utilizarea lor în industria alimentară ca agenţi de îngroşare,
gelifiere, emulsifiere, stabilizare, sunt utilizaţi pentru acoperiri (filme alimentare) etc.
Motivul principal pentru care sunt utilizaţi în alimente este reprezentat de proprietatea lor de
a modifica din punct de vedere reologic alimentele – modifică vâscozitatea şi textura
alimentelor [304]
În ultimii ani au apărut tot mai multe cazuri de obezitate şi boli cronice datorate
unui mod de viaţă nesănătos şi a unei alimentaţii ce conţine puţine substanţe nutritive, cu
alimente bogate în grăsimi ce pot dăuna sănătăţii. Terapiile alternative şi alimentele
funcţionale sunt o alternativă în prevenirea şi tratarea acestor boli. Numeroase produse pe
bază de hidrocoloizi au fost elaborate pentru înlocuirea grăsimilor din alimente [305].
Datorită proprietăţilor sale funcţionale gelanul a devenit un polimer mult utilizat în
industria farmaceutică, cosmetică, alimentară. Astfel, este folosit pentru producerea de
geluri lichide, filme alimentare, deserturi gelatinoase, gemuri şi este utilizat şi ca sistem
polimeric pentru încapsularea a numeroşi componenţi bioactivi [306]. El poate fi utilizat și
pentru înlocuirea ingredientelor nedorite, în mod special a grăsimilor,obţinând în acest mod
alimente cu un conţinut scăzut în calorii sau produse care pot creşte senzația de saţietate
[307-309].
Poate fi utilizat ca suport biopolimeric pentru încapsularea diverselor ingrediente
bioactive, pentru protecţia şi eliberarea lor controlată şi pentru obţinerea de alimente
funcţionale care au numeroase beneficii în prevenţia şi tratarea bolilor cronice [103].
54
Fiind un înlocuitor al gelatinei asigură structura, textura şi gustul în multe alimente
mai bine decât aceasta. Este utilizat în cofetărie, înlocuieşte jeleurile produse din amidon,
deoarece are timpul de gelifiere mai mic, oferă o structură optimă şi o altă senzaţie la
gustarea acestor alimente, previne pierderea umidităţii în alimentele dulci. În deserturile
gelatinoase este utilizat deoarece conferă acestora o mai mare claritate şi temperatura de
topire a gelului de gelan poate fi crescută, păstrând în acest mod alimentele moi şi suculente
[261].
În produsele alimentare pe bază de amidon modificat este utilizat pentru a le creşte
stabilitatea, fiind şi un agent de legare cu apa; previne efectul amidonului asupra aromei
alimentelor; poate fi utilizat în multe produse alimentare pentru a oferi o formă şi o structură
după procesele de încălzire-răcire. Alimentele fabricate din carne, fructe, produse zaharoase
se încadrează în această categorie [309-311].
Geluri lichide
Gelurile lichide sunt soluţii vâscoase care la viteze mici de forfecare au un
comportament similar cu al gelurilor cu o tărie mai mare, iar la viteze mari de forfecare
acţionează ca fluide. Datorită posibilităţii de creare a anumitor texturi şi proprietăţilor
reologice unice ale gelanului au fost realizate geluri lichide cu aplicaţii în industria
alimentară. Gelurile de gelan împiedică sedimentarea particulelor şi de aceea sunt utilizate în
sucuri cu pulpă de fructe sau în alimente cu textură lichidă ce conţin cacao, fibre sau
minerale insolubile. Particulele sunt prinse în structura de gel [312].
Factorii care influenţează formarea gelului sunt: temperatura, concentraţia
gelanului, tipul și concentraţia cationilor, de cationi, agitarea şi tensiunea de forfecare
aplicată. O schimbare a acestora conduce la comportamente reologice diferite pentru un
produs ce are o compoziţie constantă, rezultând geluri elastice sau fluide [313, 314].
Gelurile amintite fac parte din categoria gelurilor fizice deoarece punctele de
legătură sunt formate prin legături fizice precum: legături de hidrogen, legaturi hidrofobe şi
îmbinările transversale cu ajutorul cationilor. Bazat pe aceastăp proprietate, gelanul a fost
utilizat pentru a stabiliza Doogh, o băutură produsă prin fermentarea laptelui care conţine
particule de mentă sau fibre de grâu insolubile. În ambele studii utilizarea gelului lichid de
gelan împiedică separarea fazelor în Doogh, ceea ce conduce la schimbarea
comportamentului reologic şi ajută la formarea unei texturi adecvate în băutura tradiţională
iraniană. Proprietăţile reologice ale Doogh au fost schimbate prin adăugarea de fibre şi gelan
de la un comportament Newtonian la un comportament pseudoplastic [315, 316].
55
Au fost obținut un ingredient alimentar format dintr-un amestec de gelan deacetilat
şi gelan acetilat care să ajute la structurarea conţinului din stomac şi astfel să aibă efect
asupra saţietăţii. PH-ul acid afectează gelifierea şi structura amestecului devine cea de rețea
semi-interpenetrată. Obţinerea unui astfel de gel depinde de raportul cantităţilor de
biopolimeri. Gelanul acetilat este utilizat într-o proporţie de aproximativ 60 % [317].
S-au făcut cercetări pentru producerea de geluri mixte fabricate din mai mulţi
hidrocoloizi cu aplicaţii în industria alimentară. Gelurile mixte oferă caracteristici superioare
produsului alimentar fiind mai eficiente decât cele în care se utilizează un singur hidrocoloid
[318]; totodataă, ele oferă avantaje economice şi beneficii pentru sănătate deoarece ajută la
fabricarea alimentelor funcţionale [319].
Studiile pentru prepararea gelurilor nutriţionale cu suc/pulpă de morcov au
demonstrat că pot fi elaborate în mod particular cu gelan [320]. Soumya Banerjee şi
colaboratorii [321] au făcut cercetări pentru determinarea proprietăţilor texturale ale gelului
nutriţional mixt format din agar, gelan şi suc de morcov. Pentru prepararea gelului s-au
utilizat cantităţi egale de soluţie de hidrocoloid (1%) şi suc de morcov şi o cantitate de
zaharoză care a variat de la 7.5% până la 15 % [321]. Datorită pectinei din sucul de morcov,
tensiunea de rupere, energia de comprimare şi sinereza cresc în gelul de gelan. Zaharoza
îmbunătăţeşte coeziunea gelului format. Aceste geluri fiind bogate în β-caroten aduc
beneficii pentru sănatate şi se arată promiţătoare pentru comercializare [321].
Filme alimentare
Filmele alimentare reprezintă un strat subţire de biopolimeri care acoperă produsele
alimentare.
Biopolimerii au un rol semnificativ în reducerea absorbţiei de ulei în alimentele
prăjite. Studii privind privind aplicaţii ale biopolimerilor pentru prelucrarea alimentelor
prăjite au luat amploare în ultimii ani [322]. Gelanul are proprietatea de gelifiere termică
ceea ce explică capacitatea sa de a reduce absorbţia de ulei. El reduce deshidratarea şi oferă
mai puţin spaţiu pentru absorbţia uleiului în textura alimentelor în timpul prăjirii [323].
Deserturi gelatinoase şi gemuri
Gelanul este un biopolimer potrivit pentru producerea deserturilor gelatinoase şi
gemurilor, din moment ce poate fi uşor gelifiat şi umiditatea poate fi controlată. Deserturile
gelatinoase obţinute prin utilizarea gelanului au o mare claritate (transparenţă) similară cu
cea dată de gelatină. Punctul de topire ridicat al gelurilor de gelan duce la păstrarea
proprietăţilor deserturilor la temperatura camerei. Pentru a prepara astfel de produse gelanul
este în mod normal utilizat la o concentraţie de 0.3% [262].
56
În producţia de gemuri, pectina poate fi înlocuită de gelan.Gelanul oferă produse cu
o sinereză inferioară, cu proprietăţi senzoriale dorite şi cu mai puţine calorii în comparaţie
cu pectina [324].
Microîncapsularea
Incapsularea şi proteja componenţilor bioactivi este de mare interes pentru
industria alimentară. O cerință esenţială a acestora este compatibilitatea atât cu componentul
bioactiv cât şi cu produsul în care vor fi încorporate pentru a crea un aliment funcţional sau
o băutură funcţională. Alte atribute ale sistemelor includ creşterea stabilităţii sau eliberarea
controlată a componenţilor bioactivi [103].
Probioticele sunt microorganisme ce pot oferi beneficii pentru sănătate
organismului uman, prin menţinerea echilibrului microbian în tractul digestiv [325].
Beneficiile pe care le furnizează sunt: menţin flora intestinală sănătoasă, inhibă creşterea
bacteriilor patogene, ajută la stimularea creşterii sistemului imunitar, ajută sinteza
vitaminelor, sunt agenţi antimicrobieni şi ajută la îmbunătăţirea absorbţiei de calciu atunci
când există suficiente probiotice în colon. Speciile bifidobacteria şi lactobacillus sunt cele
mai cunoscute şi mai importante probiotice ce ajută la menţinerea sănătăţii tractului
gastrointestinal [326, 327]. Viabilitatea celulelor probiotice din alimente depinde de o serie
de factori cum ar fi: pH-ul, acidifierea în timpul proceselor fermentative ale alimentelor,
producerea peroxidului de oxigen şi temperatura de depozitare. Prin metoda
microîncapsulării, supravieţuirea şi stabilitatea celulelor creşte în mediile neprielnice iar
eliberarea se face controlat într-un anumit loc ţintă din tractul gastrointestinal. Alimentele în
care probioticele au fost încorporate sunt, în general, produse lactate: iaurt, brânză,
îngheţată, deserturi lactate dar şi alte alimente: ciocolată, cereale, sucuri [328].
Cercetările au demonstrat că gelanul este un biopolimer adecvat pentru
încapsularea probioticelor. El nu numai că poate rezista în condiţii acide, dar, de asemenea,
este stabilizat cu ajutorul ionilor de calciu şi devine capabil de a proteja celulele de mediul
acid. Gelanul în combinaţie cu xantanul a fost utilizat cu succes pentru acoperirea speciilor
de bifidobacterii [329]. Celule de Lactobacillus casei au fost incluse într-o matrice de gel
formată dintr-un amestec de cazeinat de sodiu şi gelan, utilizând ca metodă de obţinere
emulsia apă în ulei. Gelifierea amestecului de biopolimeri s-a realizat prin scăderea treptată
a pH-ului cu glucocono-δ-lactonă. S-a obţinut o eficienţă de încapsulare de 89,5%. Testele
in vitro efectuate pentru a observa rata de supravieţuire a celulelor au constatat că
viabilitatea celulelor încapsulate este mai mare decât cea a celulelor libere [330].
57
Suporturi şi tehnici de imobilizare variate au fost propuse şi testate în aplicaţii
pentru producţia de băuturi alcoolice. S-a propus spre elaborare un biocatalizator cu
perspective reale de a fi utilizat în tehnologia de producere a vinurilor spumante format din
particule sferice de gelan în care au fost imobilizate celule de drojdie. Bilele s-au format prin
extruderea soluției de gelan printr-o capilară într-o baie de soluţie de 2% CaCl2 (reticulant
ionic) [331].
Tan si colab., au investigat fezabilitatea încapsulării celulelor de drojdie utilizând
ca suport gelanul, printr-o metodă de emulsifiere; microbioreactoarelor rezultate pot fi
reutilizate. Producţia de etanol în primele trei cicluri a fost comparabilă cu cea care
utilizează drojdia liberă. Microbioreactoarele sunt stabile şi au fost uşor de recuperat din
mediul de fermentaţie prin filtrare, putand fi reutilizate pentru cel puţin 10 cicluri cu un
randament relativ mare de etanol [332].
Administrarea ingredientelor pe bază de proteine se face pe cale orală. Acestea au
o capacitate redusă de a trece peste bariera intestinală epitelială deoarece sunt sensibile la
enzimele din tractul gastrointestinal [333, 334]. Sistemele polimerice pot proteja proteinele
de aceste enzime. Astfel, absorbţia proteinelor şi a peptidelor are loc în colon și nu în
segmentele anterioare ale tractului digestiv [335].
Gelanul este rezistent la enzime cum sunt pectinaza, amilaza, celulaza, papaina şi
lipaza [336]. O degradare semnificativă se produce în prezenţa galactomanazei, ceea ce
facilitează eliberarea componenţilor bioactivi din sistemul polimeric în fluidele din colon
[337].
Fei Yang şi colab. (2013) au preparat şi evaluat particulele sferice obţinute din
chitosan şi gelan prin gelifiere ionotropică şi complexare polielectrolitică pentru
încapsularea şi eliberarea controlată a proteinelor, utilizând ionii de calciu. Albumina a fost
încorporată în paticulele obținute cu o eficienţă ce variază între 65-85%. Eficienţa în
încapsulare şi viteza de eliberare a proteinei depind de concentraţiile de chitosan, calciu şi
gelan. Concentraţii mai mari de gelan combinate cu uscarea la vid încetinesc eliberarea
rapidă a proteinei la pH=1.2, dar se obţine o eliberare susţinută la pH= 6.8; o eliberare
eficientă este observată la pH=7 [338].
2.1.2.2. Derivați celulozici
Sunt compuși rezultați prin modificarea chimică a celulozei.
Celuloza este un polimer natural produs de plante. Este o polizaharidă structurală și
cel mai abundent polimer produs de plante. Gradul de polimerizare variază funcție de sursă.
Este solubilă doar în unii solvenți agresivi cum ar fi lichidele ionice și nu poate fi procesată
58
termic deoarece se degradează înainte de punctul de topire [339]. Este importantă în
domeniul aplicațiilor alimentare îndeosebi prin derivații săi, care vor fi discutați în cele ce
urmează.[340].
Majoritatea derivaților celulozici aparțin categoriei eterilor, cuprinzând alchil,
hidroxialchil și alchilhidroxialchil celuloze. Prezența grupelor hidroxil în catena principală a
celulozei condiționează realizarea diverselor reacții de eterificare (substituirea hidrogenului
din grupa OH cu un rest alchil sau aril) sau esterificare (substituirea hidrogenului din grupa
OH cu un rest acil) a celulozei, prin care polimerul îsi modifică esențial proprietățile fizico-
chimice și în particular solubilitatea, putându-se obține polimeri solubili în apă sau în soluții
diluate alcaline, în solvenți organici (alcool, acetonă, etc).
Proprietățile chimice și fizice ale derivaților celulozici sunt influențate de tipul
substituentului, gradul de substituţie, uniformitatea distribuirii substituentului din catenă,
gradul de polimerizare şi distribuţia maselor moleculare. Agregarea unor porţiuni de lanţ
nesubstituit sau slab substituit duce la formarea de macrogeluri, utilizate în realizarea unor
produse farmaceutice cu proprietăţi reologice tixotrope [341].
Eterii celulozei posedă stabilitate chimică, capacitate slabă de ardere, o bună
fotostabilitate, termostabilitate (la căldură şi la frig) şi solubilitate în solvenţii obişnuiţi.
Proprietăţile eterilor celulozici depind de natura radicalului introdus prin O-alchilare, de
gradul de polimerizare şi de polidispersitatea eterului rezultat. Cu creşterea dimensiunilor
restului alchilic introdus se micşorează interacţiunea dintre lanţurile compusului, scade
temperatura de înmuiere şi se reduce rezistenţa mecanică a preparatelor.
Sinteza eterilor celulozici se realizează prin O-alchilarea celulozei cu halogenuri
alchilice sau cu alchilsulfaţi în prezenţa alcalilor. (Schema1)
[C6H7O2(OH)3]n + nRHal + nxNaOH [C6H7O2(OH)3-x(OR)x]n + nxNaOH + nx H2O
[C6H7O2(OH)3]n + nx(CH3)2SO4 + nx NaOH [C6H7O2(OH)3-x(OCH3)x]n+ nx
(CH3)NaSO4 + nx H2O
Schema 1: Reacție schematică a obținerii eterilor celulozici.
Cu ajutorul dialchilsulfaţilor se prepară numai metil celuloza şi etilceluloza. Pentru
eterii superiori se folosesc exclusiv alchilhalogenurile [342].
Dintre eterii celulozei cu utilizare largă în domeniul medical, farmaceutic şi
cosmetic se remarcă: metilceluloza, etilceluloza, hidroxietilceluloza, şi carboximetilceluloza.
Materialele pentru uz farmaceutic au început să se comercializeze la sfârșitul anilor ‘40 în
scopul înlocuirii gumelor naturale, cât şi datorită înaltei purităţi, bunei stabilităţi şi
posibilităţilor de manipulare a proprietăţilor acestora.
59
Derivaţii celulozici folosiţi astăzi în tehnologiile farmaceutice sunt, în general,
metilceluloza şi produşii foarte asemănători substituiţi cu grupe hidroxialchil [343]:
- hidroxietilmetilceluloza-HEMC
- hidroxipropilmetilceluloza-HPMC
- etilhidroxietilceluloza-EHEC
- hidroxietilceluloza-HEC
- hidroxipropilceluloza-HPC
- carboximetilceluloza sodică-CMCNa
Câțiva derivați cu importanță deosebită în aplicațiile alimentare sunt discutați în
cele ce urmează:
Etilceluloza
Derivat cu rezistenţă mecanică superioară şi o bună stabilitate chimică [344].
Carboximetilceluloza sodică (CMCNa)
Este sarea de sodiu a eterului hidroxiacetic al celulozei. În figura 7 este prezentată
structura celulozei și a carboximetil celulozei de sodiu.
(a) (b)
Figura 7. Structura celulozei (a) și a carboximetil celulozei (b)
Cel-ONa + Cl-CH2-COOH Cel-O-CH2-COOH + NaCl
Principalele caracteristici şi denumirile comerciale ale produsului sunt prezentate în
următorul tabel.
Tabel 2. Principalele caracteristici ale carboximetil celulozei.
Structura chimică Carboximetilceluloza sodică
Denumiri comerciale Cellulose Gum, Cellosid CMC, Tylose C., Coulose,
Edifas B., Herkules CMC, Polyfibrom Spezial,
Dehidazol, Ultraquellstoff.
Masa moleculară 21000-500000
Grad de polimerizare 100-2000
Grad de substituţie 0.6-1.0
Aspect Pulbere, granule sau fibre higroscopice
60
Proprietăţi fizice Substanţă inodoră şi insipidă;
Solubilă în apă rece şi la cald, cu formarea unei
soluţii vâscoase;
Solubilă în amestecuri de apă cu alcool etilic sau
acetonă,
pH-ul soluţiei apoase:6.5-8;
Soluţia apoasă este solubilă la încălzire.
Aplicaţii Agent de aglutinare pentru comprimate;
Stabilizator pentru emulsii;
Agent de îngroşare pentru siropuri.
Dizolvarea CMCNa în apă conduce la formarea unor soluţii coloidale, care conţin,
la concentraţii mici, macromolecule filiforme, iar la concentraţii mari geluri. Soluţiile de
CMCNa sunt pseudoplastice, iar gelurile tixotrope. CMCNa are comportare de electrolit
coloid, fiind susceptibilă să participe la reacţii ionice. Grupele hidroxil neeterificate pot
participa la reacţii chimice.
Mucilagiul de CMCNa 2% este un gel vâscos, slab gălbui, translucid sau uşor
opalescent, fără miros şi gust; soluţia 10% este neutră. Se amestecă în orice proporţie cu apa
sau glicerina. Vâscozitatea soluţiilor de CMCNa este influenţată de concentraţie, pH,
temperatură, prezenţa electroliţilor, prezenţa altor polimeri hidrosolubili, solvenţi organici,
bacterii. Soluţiile de CMCNa sunt vâscoase între pH 6-9; sub pH 6 are loc o scădere
accentuată a acesteia până la pH 2; rar peste pH 9 valorile de vâscozitate scad mai lent. Este
un agent de suspensie pseudoplastic şi tixotrop a cărui vâscozitate scade cu temperatura, dar
revine la valorile iniţiale după răcire.
Electroliţii precipită CMCNa din soluţie. CMC este compatibilă cu acidul tanic, cu
zahărul şi poliolii. În prezenţa poliolilor puternic higroscopici are loc o deshidratare.
Prezintă tendinţa de a forma complecşi cu unele substanţe medicamentoase pe care le
floculează sau le precipită sau cu agenţi microbieni cărora le micşorează activitatea. Se
obţine rezistenţă maximă faţă de sedimentare în stare de repaus conferită de agentul tixotrop
şi o curgere uşoară după agitare datorită CMC care funcţionează ca agent pseudoplastic
[345]. CMCNa poate fi utilizat ca agent de îngroșare, agent de stabilizare a diferitelor
emulsii și poate forma filme. Datorită numărului mare de grupe funcționale hidrofile cum ar
fi grupele OH și COONa prezintă o hidrofilie mai bună decât celuloza și poate și ajută
alimentele să-și păstreze o anumită umiditate, formă și structură. Se utilizează în înghețată,
61
în diferite produse de patiserie, în diferite băuturi care conțin suspensii cum sunt sucurile
nectar care conțin pulpă de fructe.
Modificată prin grefare cu N-vinil-2-pirolidona (CMC-g-PVP), în amestec cu
polimerul inițial s-a utilizat pentru imobilizarea drojdiei de panificație Saccharomyces
cerevisiae prin metoda extruderii utilizând ca agent de reticulare AlCl3. Particulele sferice
obținute, supuse testării activității fermentative pentru 27 de ore, au condus la un randament
în etanol de 57 g/L. Randamentul în etanol crește atunci când gradul de reticulare al
particulelor formate scade [348, 349].
Hidroxipropilmetilceluloza
HPMC prezintă o bună activitate de suprafaţă dar nu formează geluri. Este cel mai
utilizat polimer de acoperire obţinut în urma reacţiei dintre clorura de metil şi oxid de
propilen cu celuloza sodică. Are excelente proprietăţi filmogene, rezultând filme flexibile,
rezistente, stabile şi care nu influenţează dezagregarea. Se pretează la acoperirea în pat
fluidizat sau prin atomizare (aerosolizare). Este solubil în sucul gastrointestinal şi în sisteme
de solvenţi organici, ceea ce permite folosirea sa fără ca să interfereze cu dezintegrarea
comprimatelor şi biodisponibilitatea medicamentelor. Învelişul format de HPMC este stabil
la lumină, căldură, aer şi la un anumit grad de umiditate. Se dizolvă atât în soluţii apoase
acide sau alcaline cât şi în solvenţi organici.
HPMC se fabrică în diferite tipuri: Methocel E, F şi K Premium, prezentând
diferite grade de substituţie cu hidroxipropoxi şi cu metoxi [346, 347].
2.1.2.3. Chitina/Chitosanul
Chitina este o polizaharidă naturală de mare importanță, fiind prima dată
identificată în 1884. Acest biopolimer este sintetizat de un număr mare de organisme vii iar
după celuloză este cel mai abundent polimer natural. Este constitută din unități structurale de
2-acetamido-2-deoxi-D-glucoză fiind unite între ele prin legături β(1-4). Chitina se obține
din natură din microfibrile cristaline ordonate componente ale scheletului exterior ale
artropodelor sau în peretele celular al fungilor și a drojdiei. Chitina se găsește în două forme
α-chitina și β-chitina. α-Chitina izomorfă este forma cea mai abundentă.
Ambii polimeri au potențialul de a forma diverse matrici polimere cu o gamă largă
de aplicații în diferite domenii datorită biocompatibilității (sunt netoxice și au o
imunogenitate scăzută), biodegradabilității, proprietăților antimicrobiene [350, 351].
Chitina, datorită grupelor de acetamidă din unitatea structurală, poate fi modificată chimic
62
mai ușor decât celuloza. Insolubilitatea chitinei în aproape toți solvenții comuni determinată
de legăturile de hidrogen numeroase, reprezintă un obstacol în utilizarea sa [350, 352].
Fibrele de chitină sunt indicate pentru utilizare la suturile chirurgicale. Studiile in
vivo au arătat că suturile efectuate cu fibre de chitină au fost absorbite în mușchii
șobolanilor în aproape 4 luni [351, 353].
Chitosanul reprezintă produsul principalul obținut prin procedeul de deacetilare
alcalină a chitinei și este un polimer liniar natural semi-cristalin, policationic, cu structură
liniară, compus din unități (1→4)-2-acetamido-2-deoxi-β-D-glucan (N-acetil-D-
glucozamină) și (1→4)-2-amino-2-deoxi-β-D-glucan (D-glucozamină) [354]. S-au efectuat
multe studii referitoare la posibilitatea de a fi utilizat în diferite domenii, [350, 351, 355]
datorită proprietăților sale excelente cum ar fi: biodegradabilitate, biocompatibilitate,
netoxicitate, mucoadezivitate și datorită prezenței grupelor funcționale amino și hidroxilice
ce determină posibilitatea de modificare chimică facilă [356, 357].
Denumirea de chitosan este atribuită chitinei care are peste 60% resturi D-
glucozaminice, ceea ce corespunde unui grad de deacetilare de 60% [358, 359].
Chitina și chitosanul sunt polizaharide foarte reactive în comparație cu alte
polizaharide naturale cum sunt celuloza, dextrina, pectina acidul alginic etc. deoarece
proprietățile lor antioxidante, hemostatice, caracteristicile de solubilitate și cele structurale
sunt diferite în multe medii [360-362].
Datorită proprietăților atractive biologice au fost efectuate multe studii pentru
utilizarea chitinei și chitosanului în aplicații din domeniul farmaceutic și medical [363-366].
În general, chitina este mai potrivită pentru a fi utilizată ca biomaterial comparativ
cu chitosanul datorită prezenței grupelor de acetamidă (NHCOCH3) care sunt prezente într-
o cantitate mai mare în lanțul polimeric decât în chitosan. Această grupare este similară cu
gruparea amidică a proteinei din țesutul viu, de aceea are diferite aplicații în ingineria
tisulară [367]. La chitosan, grupele amino se găsesc într-un procentaj mai mare la poziția de
la C2 ceea ce conferă caractereristici hemostatice dispozitivelor implantate [368].
În figura 8 este prezentată structura chitinei și a chitosanului.
63
(a) (b)
Fig.8 Structura chimică a chitinei (a) și chitosanului (b)
Aplicații avantaje și limitări:
Chitina și chitosanul au o varietate de aplicații în domeniul biomedical în
vindecarea rănilor, în obținerea unor pansamente, pentru acoperiri antibacteriene, în
ingineria tisulară, obținerea de membrane de separare, senzori și sisteme de eliberare
controlată a medicamentelor [369, 370]. Sunt utilizați pentru imobilizarea de enzime în
industria alimentară și de celule cum ar fi cele implicate în prelucrarea laptelui; amilazele
pot fi grefate pe chitină [370]. Recent chitina a fost studiată pentru aplicații în domeniul
farmaceutic și medical deoarece poate forma filme, fibre și poate fi utilizată pentru
vindecarea rănilor [371, 372] și ca suport pentru eliberarea controlată a medicamentelor.
[351, 373].
Chitina și chitosanul au un spectru larg de aplicații alimentare cum ar fi conservarea
alimentelor, deoarece previne deteriorarea microbiană (are efect antimicrobian).[374,
375].Oferă claritate sucurilor de fructe și împiedică acidifierea lor [376, 377], formează
filme biodegradabile [378-381] și ajută la purificarea apei [382].
Cei doi polimeri pot fi utilizați ca adjuvanți farmaceutici [383], aditivi în cosmetică
[384, 385], finisaje textile, agent chelator de metale grele, membrane, cimenturi, fibre
tubulare și în producția de hârtie [386, 387].
Au fost raportate studii în care au fost preparați derivați funcționali de chitosan prin
modificări chimice [351, 385]. Mulți cercetători au raportat faptul că chitina și chitosanul
Chitina este de natură hidrofobă și este insolubilă în apă și în mulți solvenți organici. Este
solubilă în solvenți specifici precum: hexafluoroacetonă, hexafluoro-2-propanol sau N, N-
dimetilacetamidă [349, 390].
Unele utilizări ale chitosanului sunt redate în talelul 3
64
Tabel.3 Utilizări ale chitosanului în industria alimentară
Compozitia suportului utilizat
Compusul
biologic activ
imobilizat
Tipul de
formulare Obiectivul urmarit
Biblio
grafie
Chitosan 0,05% reticulat ionic
cu 0,1% TPP Curcumină Nanoparticule
Cresterea biodisponibilității
și a stabilității curcuminei-
administrare orală
[391]
Lecitină/Chitosan Quercetină Nanoparticule Utilizarea în alimente
funcționale [392]
Cazeină(sau BSA)/Chitosan
(complex electrostatic)
Fluoresceina,
rodamina B și
riboflavină
Nanoparticule Încapsularea și eliberarea
substanțelor nutraceutice [393]
Chitosan/ Gelatină /Pectină-
aldehida glutarică utilizată
pentru reticulare
BSA Film încapsularea și eliberarea
compușilor bioactivi [394]
Chitosan (tehnica coacervării) Ulei esențial
limonena Microcapsule
Încapsularea și eliberarea
compușilor bioactivi [395]
Alginat de
sodiu/Chitosan/CaCl2
(reticulare ionică, complexare
polielectrolitică)
Celule de
drojdie de bere Particule
Influența imobilizării
celulelor asupra procesului
de fermentare pentru
producerea berii
[396]
Chitosan/TPP/Aldehidă
glutarică (metoda reticulării) Papaină Microparticule
Influența imobilizării
enzimei asupra activității
enzimatice, recuperarea și
posibilitatea de reutilizare a
enzimei proteolitice.
[397]
Polibutilcianoacrilat(polimeriz
are în emulsie), chitosan
(pentru acoperirea
nanoparticulelor)
Curcumină Nanoparticule Activitatea antitumorală-
administrare parenterală [398]
65
2.1.2.4. Caragenanul
Caragenanul aparține familiei de galactani hidrofili liniari sulfatați cu o masă
moleculară mare, fiind format din unități alternante de D-galactopiranoză și 3,6-anhidro-
galactoză (3,6-AG) unite prin legături alternative alternante de α-1,3 și β-1,4- glicozidice.
Tipurile de caragenan cum ar fi λ, κ, ι, ε, μ, θ au un conținut de 22-35 % grupe sulfat,
clasificare realizată în funcție de solubilitatea acestora în clorură de potasiu[399].
În procesul de obținere a caragenanilor, pe lîngă galactoză și sulfat, pot exista și alte
reziduuri de carbohidrați: xiloza, glucoza, acizi uronici și substituienți cum ar fi grupe de
metil eteri și piruvat [400]. Proprietățile caragenanilor sunt influențate în principal de
numărul și poziția grupelor de ester sulfat și de asemenea de conținutul de 3,6-anhidro-
galactoză (3,6-AG). Conținutul de grupe ester-sulfat pentru kappa-caragenan este în jur de
25-30% și 28-35 % grupe 3,6-anhidro-galactoză, iotta-caragenan conține grupe sulfat în jur
de 28-30% și 25-30 % grupe 3,6-anhidro-galactoză, iar lambda-caragenan conține grupe
ester-sulfat în jur de 32-39 % și nu conține nici o grupă 3,6-anhidro-galactoză.
Structura chimică a principalelor tipuri de caragenani este redată în figura 9
Fig.9 Structura principalelor tipuri de caragenan utilizate pentru aplicații în industria
alimentară: (a) kappa (k), (b) iota (i) și (c) lambda (λ)
Masa moleculară medie a caragenanilor diferă în funcție de natura sa; spre exemplu
caragenanul nativ ar avea o valoare a masei moleculare medii de la 1.5 × 106 la 2 × 10
7, iar
cel de calitate alimentară o valoare de 100.000–800.000 sau 200.000– 400.000, pe când
caragenanul degradat (poligeenan) are o masă moleculară medie de 20.000–30.000.
Domeniul de toleranță a pH-ului pentru caragenani este cuprins în intervalul 4-10,
în mediu acid acestia având o stabilitate slabă. Caragenanii sunt sensibili la depolimerizarea
realizată prin hidroliză acidă, pentru că o temperatură ridicată și un pH scăzut conduc la
pierderea completă a funcționalității lor. Studiile au relevat că acesta este netoxic și neiritant,
este sigur de utilizat în industria alimentară nefiind stocat în organele animalelor testate
66
(șoareci, maimuțe, iepuri, porcușori), și nu este nici cancerigen; de asemenea toxicitatea
depinde de masa moleculară și nu de grupele sulfat [399].
Soluțiile de caragenan sunt destul de stabile la pH neutru sau alcalin. La pH mic
stabilitatea soluțiilor scade, în special la temperaturi ridicate, datorită hidrolizei care conduce
la pierderea capacității de vâscozitate și de gelifiere; în cazul în care gelul este deja format
nu mai intervine procesul de hidroliză acesta fiind stabil chiar și la pH 3,5 – 4. Datorită
limitărilor caragenanului în condiții acide pentru aplicațiile practice este de dorit evitarea
prelucrării soluțiilor lor la pH mai puternic acid și temeraturi ridicate pe o perioadă mai
îndelungată de timp [401]. În tabelul 4 sunt redate câteva suporturi pentru imobilizarea
compușilor biologic activi pe bază de caragenan cu posibile aplicații în domeniul alimentar.
67
Tabel 4: Utilizarea caragenanului în industria alimentară
Compozitia suportului
utilizat
Compusul
biologic
activ
imobilizat
Tipul de
formulare Obiectivul urmarit Bibliografie
Chitosan/k-
Caragenan/CMCNa-
metoda emulsiei duble
O/W/W și înghețare
(criogenare)
Curcumină Gel criotropic
Imobilizarea și
eliberarea controlată a
curcuminei
[402]
I-Caragenan (reticulare
ionică cu ioni de
potasiu, calciu și fier
3+)
Curcumina Fibre
Imobilizarea și
eliberarea controlată a
curcuminei
[403]
Chitosan(np)/k-
Caragenan/Alginat de
sodiu (reticulare ionică)
Curcumina
Nanoparticule
de chitosan în
microparticule
de polizaharide
Creșterea solubilității și
a biodisponibilității
curcuminei și eliberarea
controlată
[404]
k-Caragenan (reticulare
ionică cu KCl)
Celule de
drojdie Particule
Creșterea
randamentului în etanol
în procese fermentative
[405-407]
k-Caragenan (metoda
emulsiei/uscare prin
pulverizare)
Coenzima
Q10 Microparticule
Imobilizarea coenzimei
Q10 și creșterea
solubilității și a
biodisponibilității
[408]
k-Caragenan reticulat
ionic cu KCl pe o
membrana filtrantă
Urează Film
Păstrarea activității
catalitice a enzimei
imobilizate și
reutilizarea enzimei
imobilizate în mai
multe cicluri hidrolitice
[409]
68
2.1.2.5. Alginații
Acidul alginic este o polizaharidă coloidală hidrofilă naturală obținută din specii
variate de alge maro (Phaeophyceae). A fost investigat extensiv și utilizat pentru multe
aplicații biomedicale, datorită biocompatibilității sale, toxicității reduse, a costului relativ
scăzut și formează ușor geluri prin adăugarea de cationi bivalenți, cum ar fi Ca2+
.
Fisher și Dörfel au fost primii care au identificat restul de L-guluronat [410] iar
reziduul de D-manuronat a fost considerat component major al alginaților. Alginații sunt
acum cunoscuți ca fiind bloc copolimeri naturali conținând reziduuri legate 1,4 de β-D-
manuronat (M) și α-L-guluronat (G). Conținutul în resturile din alginați de D-manuronat și
α-L-guluronat și lungimea fiecărui bloc poate diferi în funcție de specia de alge care se
utilizează pentru extracția lor.
Se crede că doar blocurile de α-L-guluronat participă la reticularea intermoleculară
cu cationi bivalenți pentru a forma hidrogeluri. Raportul dintre β-D-manuronat și α-L-
guluronat, lungimea blocului de guluronat și masa moleculară reprezintă factori importanți
care pot afecta proprietățile fizice ale alginaților și a hidrogelurilor obținute.
Structura acidului alginic este prezentată în figura 10.
Figura 10: Structura acidului alginic
Masa moleculară a tipului de alginat care este comercializat este cuprinsă între
32.000 și 400.000 g/mol. Vâscozitatea soluțiilor de alginat crește atunci când pH-ul scade și
atinge o valoare maximă la pH 3-3.5, când grupările carboxilat din catena principală a
alginaților se protonează și formează legături de hidrogen.
Alginații sunt în general utilizați sub formă de hidrogel în multe domenii cum sunt
cele biomedicale. Hidrogelurile sunt de multe ori biocompatibile și pot fi utilizate ca
suporturi pentru eliberarea controlată a compușilor bioactivi. Reticularea chimică și/sau
fizică a polimerilor hidrofili reprezintă abordări tipice pentru a obține hidrogeluri.iar
proprietățile lor fizico-chimice sunt dependente de tipul de reticulare și de densitatea de
reticulare, în plus față de masa moleculară și compoziția chimică [411]. Câteva aplicații ale
alginaților în industria alimentară sunt exemplificate în tabelul 5.
69
Tabel 5. Aplicații ale suporturilor polimerice pe bază de alginați în industria
alimentară
Compozitia
suportului
utilizat
Compusul
biologic activ
imobilizat
Tipul de
formulare Obiectivul urmarit Bibliografie
Alginat de
sodiu reticulat
cu CaCl2
Țesut din
rizomi de
turmeric
Particule
Extragerea curcuminei
și a proteinelor din
rizomii de turmeric
[412]
Alginat de
sodiu reticulat
cu CaCl2
Celule de
drojdie Particule
Creșterea
randamentului în
etanol în procese
fermentative continue
sau repetate
[413-415]
Alginat de
sodiu reticulat
covalent cu 1-
etil-3-(3-
dimetilamino-
propil)
carbodiimide
(EDAC) și
reticulat ionic
cu CaCl2
α-Amilază Particule
Utilizarea particulelor
obținute în cicluri de
hidroliză repetate
utilizând ca substrat
amidonul
[416]
2.2. Polimeri sintetici
În funcție de proprietățile lor de degradare polimerii sintetici pot fi clasificați în
biodegradabili și nebiodegradabili. În ultimii ani dezvoltarea ingineriei tisulare, a medicinei
regenerative, a eliberării controlate din diferite suporturi polimerice a medicamentelor și a
compușilor biologic activi au determinat obținerea de noi biomateriale cu proprietăți
îmbunătățite de biodegradabilitate. Polizaharidele și proteinele sunt polimeri tipici biologici
biodegradabili, în timp ce poliesterii alifatici și polifosfoesterii sunt biopolimeri tipici
sintetici biodegradabili.[205]
Polimerii sintetici biodegradabili au devenit o alternativă atractivă pentru aplicațiile
biomedicale determinată de următoarele considerente:
70
Deși polimerii biodegradabili naturali au o mai bună compatibilitate, există posibilitatea
ca să se declanșeze un răspuns imun în corpul uman, ceea ce ar putea fi evitat prin
utilizarea unui polimer sintetic biodegradabil.
Modificările chimice ale biopolimerilor naturali biodegradabili sunt dificil de efectuat.
Modificările chimice pot provoca alterarea proprietăților polimerilor naturali. [417].
Proprietățile fizice și chimice ale polimerilor sintetici pot fi controlate prin reacțiile de
polimerizare, prin alegerea monomerilor, iar concentrațiile acestora condițiile de reacție
pot fi reglate pentru a obține copolimeri
Pot fi menținuți în organism un anumit interval de timp iar apoi pot fi eliminați fără a fi
nevoie de intervenții chirurgicale.[418]
În funcție de domeniul în care sunt utilizați sunt cerute unele proprietăți specifice
pentru a putea fi utilizați ca materiale utilizate în domeniul biomedical. Ca exemplu, diferite
materiale pentru ingineria tisulară trebuie să dețină proprietăți de biocompatibilitate,
proprietăți de adeziune celulară și în plus trebuie să fie biodegradabile. Sistemele de
eliberare controlată a medicamentelor trebuie să fie dotate cu proprietăți ce răspund la
diferiți stimuli pentru eliberarea controlată. Funcționalizarea polimerilor sintetici
biodegradabili pentru a obține și îmbunătăți proprietățile este inevitabilă. Există două
strategii comune utilizate în funcționalizare: grupele funcționale sunt întroduse în reacție
odată cu monomerul, înainte de polimerizare, grupele funcționale sunt întroduse pe lanțurile
polimerului după ce acesta a fost obținut.[213, 417]
Câteva exemple de polimeri sintetici biodegradabili, ce prezintă în structura lor
grupări esterice, ortoesterice, amidice, ureice sau uretanice sunt enumerate mai jos.
Poliesteri: poli(acidul lactic), poli (acidul glicolic), poli(caprolactona), poli(acidul
lactic-co-glicolic).
Polianhidride: poli(acid adipic), poli(acid sebacic), poli(acid tereftalic)
Poliacetali
Poliamide: poliaminoacizi, poliaminocarbonați
Derivați pe bază de fosfor: polifosfați, polifosfonați, polifosfazene
Poli(alchil cianoacrilați)
Poliuretani.
Deoarece în prezenta lucrare nu am utilizat polimeri sintetici ca suporturi pentru
imobilizarea compușilor biologic activi cu care am lucrat, nu am extins studiul bibliografic
și asupra lor, limitându-ne doar la cele prezentate mai sus.
71
CAPITOLUL 3
Metode de imobilizare
Metodele de obţinere a hidrogelurilor de polizaharide se bazează pe reticularea
fizică sau chimică. Hidrogelurile reprezintă reţele tridimensionale, capabile să absoarbă
cantităţi mari de apă sau fluide biologice. Proprietăţile funcţionale ale hidrogelurilor au dus
la utilizarea lor în aplicaţii de transport și eliberare a principiilor active determinând
utilizarea atât în domeniul farmaceutic și medical cât și în industria alimentară.
Hidrogelurile au, in general, o structură poroasă ce poate fi reglată prin controlul densităţii
de reticulare în matricea de gel [419]. Se aseamănă cu ţesutul viu natural mai mult decât cu
orice alt biomaterial iar conţinutul mare de apă contribuie la buna lor biocompatibilitate.
Modificarea de fază a polimerilor utilizaţi ca sisteme de transport poate declanşa eliberarea
primcipiului activ imobilizat, ca un răspuns la stimulii externi. Hidrogelurile pe bază de
astfel de polimeri pot suferi tranziţii de fază, de volum sau transformări de fază sol-gel în
funcţie de condiţiile de mediu. In consecinta, ele joacă un rol important deoarece pot
determina unde și cum să fie eliberat medicamentul, dar şi când, respectiv în ce interval de
timp să se produca acest proces. [420, 421].
Există diferite considerente pentru care se preferă încapsularea în particule de
diferite dimensiuni a componenților bioactivi și a medicamentelor. O parte din aceste motive
sunt redate în cele ce urmează:
-principalul motiv pentru încapsulare este de a elibera susținut sau prelungit
principiile active iar concentrația terapeutică în plasmă să fie menținută constantă o perioadă
mai mare de timp;
-această tehnică a fost utilizată mult pentru a masca gustul și mirosul multor
medicamente și de a îmbunătăți complianța pacienților;
-această tehnică a fost utilizată pentru a transforma medicamentele din stare lichidă
în pudră;
-principiile active care sunt sensibile la oxigen, umiditate sau lumină, pot fi
stabilizate prin încapsulare;
-incompatibilitatea între diverse medicamente poate fi prevenită prin încapsulare;
-vaporizarea multor substanțe active volatile (ca exemplu salicilat de metil, ulei de
mentă) poate fi prevenită prin oîncapsulare;
-multe medicamente au fost immobilizate pentru a le reduce efectele adverse cum
ar fi toxicitatea și iritarea gastro-intestinală;
-prin încapsulare, biodisponibilitatea principiului activ poate fi crescută [422, 423].
72
Sistemele de încapsulare care sunt utilizate în alimente includ lipozomi, coacervate,
particule, geluri si complecşi de incluziune moleculară [93, 424].
Deşi polimerii sunt des utilizaţi pentru a crea hidrogeluri pentru aplicaţii
farmaceutice şi biomedicale, mulţi nu sunt permişi în alimente şi băuturi [425].
În locul polimerilor sintetici, polizaharidele şi unele proteine alimentare pot fi
utilizate pentru a crea hidrogeluri de tip alimentar. Există mai multe tehnici pentru a forma
particule de hidrogel. Multe se bazează fie pe ruperea matricei continue de gel pentru a
forma particule de hidrogel sau formarea picăturilor dispersate care apoi sunt gelifiate printr-
un mecanism specific cum ar fi schimbarea temperaturii (gelifierea prin încălzire sau la rece
), prin adăugarea unei enzime sau prin adăugarea de ioni, cum ar fi calciul [426, 427].
În acord cu McClements principalele metode pentru a crea particule de hidrogel cu
aplicații pentru industria alimentară sunt următoarele: ruperea gelului macroscopic,
coacervarea simplă, injecția și emulsionarea. În scopul de a elabora sisteme de eliberare
potrivite, nutraceuticele şi suplimentele nutritive pot fi clasificate în componente hidrofile,
lipofile şi amfifile şi componente care nu sunt solubile nici în ulei nici în apă (ex.
probiotice). Cele hidrofile pot fi transportate într-o matrice formată din biopolimeri, în timp
ce componentele lipofile sunt în general transportate într-un sistem pe bază de emulsie
[427].
Cele mai utilizate metode pentru obținerea de microparticule cu aplicații în
industria alimentară sunt discutate în cele ce urmerază.
3.1. Metoda extruderii sau a gelifierii ionice
Este cea mai utilizată pentru imobilizarea celulelor microbiene și a principiilor active
[428-430]. Ea are loc în condiţii blânde care permit ca încapsularea să se producă fără a
distruge microorganismele [431].
Metoda a fost folosită foarte des deoarece este o metodă simplă. Gelifierea ionică
este bazată pe abilitatea polielectroliţilor de a gelifia în prezenţa contraionilor pentru a forma
hidrogeluri. Tehnica de gelifiere ionotropică a fost utilizată la scară largă pentru
încapsularea componenţilor bioactivi în alginaţi, gelan şi carboximetil celuloză. Particulele
de hidrogel sunt produse prin picurarea soluţiei de polimer în care componenţii bioactivi
sunt încorporaţi, într-o soluţie apoasă ce conţine cationi. Cationii difuzează în picăturile
polimerice încărcate cu componenţii bioactivi şi formează o reţea tridimensională reticulată
ionic [432].
73
Producţia la scară industrială prin această metodă este dificil de realizat şi
nepractică chiar dacă s-a încercat îmbunătăţirea ei prin introducerea unor dispozitive cu jet
de aer şi dispozitive vibraţionale, deoarece apar probleme operaţionale prin blocarea
capilarei, apar dificultăţi la curăţare şi probleme sanitare [433]. Particulele obţinute prin
această metodă sunt de dimensiuni mari, de aproximativ 1 mm în diametru [434, 435].
Microsferele sunt în general preferate pentru încapsularea celulelor microbiene
pentru a forma microbioreactoare datorită dimensiunii mici şi suprafeţei mari raportată la
unitatea de volum pentru un transfer de masă eficient [436].
Dispozitive de extrudere cu capilare mai fine pot produce particule mici, dar
înfundarea orificiilor este des întâlnită mai ales atunci când se produc particule mai mici de
100 μm. [437, 438]. În tabelul 6 sunt prezentate câteva tipuri de particule obținute prin
gelifiere ionotropă .
74
Tabel 6: Exemple de suporturi polimerice obținute prin gelifiere ionică
Compoziția suportului Tipul de suport
Compusul
biologic activ
imobilizat
Obiectivul urmărit Bibliografie
Alginat de sodiu/CaCl2 Particule Celule de drojdie Creșterea productivității în
etanol [439-441]
Gelan/CaCl2 Particule Celule de drojdie Creșterea productivității în
etanol [442]
Gelan/Acetat de magneziu Particule Celule de drojdie Creșterea productivității în
etanol [443]
k-Caragenan/KCl/CaCl2 Particule Celule de drojdie Creșterea productivității în
etanol [444-446]
CMC-g-PVP/AlCl3 Particule Celule de drojdie Creșterea productivității în
etanol [447, 448]
Chitosan/TPP Nanoparticule
polifenoli din
extract E.
splendens extract
Imbunătățirea
caracteristicilor și a
activității antioxidante
[449]
Chitosan/TPP și Alginat/k-
Caragenan/KCl/CaCl2
Nanoparticule
de chitosan în
microparticule
de polizaharide
Curcumină
Creșterea solubilității și a
biodisponibilității
curcuminei
[404]
Alginat de sodiu/CaCl2 Particule α-Amilază
Utilizarea în cicluri de
hidroliză repetate utilizând
ca substrat amidonul
[450]
Alginat de
sodiu/Gelatină/CaCl2 Particule β-galactozidază
Utilizarea în cicluri de
hidroliză repetate utilizând
ca substrat lactoza
[451]
Alginat/Chitosan /CaCl2 Nanoparticule Vitamina B2
Incorporarea în alimente a
nanoparticulelor încărcate
cu vitamina B2
[452]
Alginat–chitosan Nanoparticule Insulina Imobilizarea și eliberarea
controlată a insulinei [453]
75
3.2. Metoda emulsiei
O tehnică de încapsulare alternativă este procesul de emulsifiere care a fost
dezvoltată pentru a preîntâmpina problemele care apar în tehnica gelifierii ionice descrisă
anterior [454].
Multe studii au pornit de la imobilizarea medicamentelor prin emulsifierea unei
soluţii apoase ce formează un gel într-o fază nemiscibilă compusă dintr-un solvent organic
sau ulei [455]. Prin metoda emulsifierii se obţin particule de dimensiuni mici, cu un
diametru ce variază de la câţiva microni la aproape 1 mm. Polidispersitatea dimensională
este largă în comparaţie cu a particulelor produse prin metoda extruderii [456].
Emulsionarea se realizează, de regulă, într-un vas unde soluţia cu materialul de
încapsulat şi polimerul sunt dispersate într-o fază organică nemiscibilă, prin utilizarea unui
rotor de viteză mare [455]. Picăturile dispersate sunt stabilizate prin adăugarea unui amestec
de surfactanţi [457].
Microsferele sunt formate prin gelifierea picăturilor folosind diferite metode care
depind de natura polimerului. Microîncapsularea prin emulsionare necesită un control strict
al unor parametri cum ar fi concentraţia de polimer, tipul şi cantitatea de surfactanţi [458].
Dimensiunea picăturilor dispersate prin emulsionare va determina dimensiunea
microsferelor produse. Pe lângă surfactanţi, dimensiunea particulelor este influenţată de
viteza de agitare şi de vâscozitatea soluției de polimer [455]. Caracteristicile microsferelor
sunt influenţate de structura chimică şi de masa moleculară a polimerului utilizat pentru
imobilizarea celulelor microbiene. În tabelul 7 sunt prezentate câteva exemple de suporturi
polimerice pentru imobilizarea compușilor biologic activi obținute prin tehnica emulsionării.
76
Tabel 7. Exemple de suporturi obținute prin metoda emulsifierii
Compoziția
suportului
Tipul de
suport
Compusul
biologic
activ
imobilizat
Obiectivul urmărit Bibliografie
Gellan/CaCl2 Microparticule Celule de
drojdie
Creșterea producției
de etanol [332]
k-Caragenan/
Chitosan/KCl Microparticule
Celule de
drojdie
Creșterea producției
de etanol [459]
Chitosan/k-
Caragenan/CMCNa Criogel Curcumină
Imobilizarea și
eliberarea controlată
a curcuminei
[402]
Alginat/Oligochitosan Microemulsie BSA
Imobilizarea și
eliberarea controlată
a BSA
[460]
Alginat/k-
Caragenan/CaCl2 Particule Curcumină
Imobilizarea și
eliberarea
curcuminei în
diverse modele de
digestie in vitro
[461]
3.3. Coacervarea
Coacervarea este o metodă fizico-chimică de microîncapsulare. Termenul de
coacervare provine de la cuvântul latin cuacervus care înseamnă gramadă sau teanc.
Coacervarea reprezintă procesul de formare a unor agregate macromoleculare ca urmare a
separării de fază ce are loc într-o soluţie omogenă de polimer, la adăugarea unui nesolvent.
În acest proces atât medicamentul cât și polimerul ar trebui să fie insolubile în apă.
Coacervatul reprezintă un ansamblu de molecule mari, cum ar fi proteinele,
lipidele, acizii nucleici care formează o unitate coloidală stabilă cu proprietaţi care seamănă
cu materia vie. Multe sunt acoperite cu o membrană lipidică şi conţin enzime care sunt
capabile de conversie pentru substanţe ca glucoza, în molecule mai complexe, cum ar fi
amidonul. Coacervatele au mărimi cuprinse între 1 şi peste 100 micrometri, au proprietăţi
osmotice şi se formează în mod spontan de la anumite soluţii organice diluate [462, 463].
77
Complexul de coacervare implică separarea unei soluţii compusă din cel puţin două
macromolecule în două faze nemiscibile: o fază bogată în ambele macromolecule şi o altă
fază constând într-o fază de echilibru. Cele două macromolecule implicate în complexul de
coacervare sunt în general de sarcini opuse ( spre exemplu o proteină şi o polizaharidă). În
funcţie de puterea de interacţiune dintre cele două macromolecule ar putea apare
coacervarea Precipitatele sunt complecși destul de denși, care tind să se separe din soluţie
sub formă solidă [464, 465].
Structura coacervatelor în comparaţie cu precipitatele este mai ordonată şi sunt mai
puţin predispuse la agregare şi sedimentare. Pentru aceste motive, coacervarea este de obicei
preferată în locul precipitării pentru încapsularea ingredientelor bioactive. Pentru
încapsularea substanţelor active uleioase în interiorul coacervatelor şi pentru a forma
particule de biopolimeri care conţin componenți bioactivi lipidici, în primul rând uleiul este
dispersat într-o soluţie de doi polielectroliţi care au abilitatea de a forma coacervate.
Condiţiile ( temperatură, pH, viteză de agitare etc) sunt ajustate astfel încât coacervarea să
fie favorizată şi uleiul dispersat să fie încapsulat în interiorul noilor complexe formate.
Pentru a obţine o încapsulare maximă pH-ul trebuie ajustat la o valoare optimă.
Coacervatele disociază şi se rup în momentul ajustării pH-ului sau atunci când tăria
ionică este reglată; coacervatele sunt, de asemenea, susceptbile la fuziune. Pentru a
îmbunătăţi stabilitatea coacervatelor, unul sau ambii polielectroliţi prezenţi trebuie să fie
reticulați chimic, enzimatic sau printr-un tratament termic [427, 465].
Utilizând tehnica coacervării, microparticulele pot fi preparate sub agitare continuă
utilizând următoarele etape:
Prima etapă constă în formarea a trei faze nemiscibile. În această etapă miezul
de material este dispersat în soluția de polimer pentru acoperire. Parametrii care influențează
dimensiunea particulelor sunt: viteza de agitare, forma agitatorului, tensiunea superficială și
vâscozitatea. Dimensiunea microparticulelor variază între 2 și 1200 μm. Coacervarea începe
cu schimbarea pH-ului dispersiei (prin adăugarea de H2SO4, HCl sau acizi organici).
Rezultatul este reducerea solubilității fazei dispersate (a materialului de acoperire).
Materialul de acoperire (coacervatul) începe să precipite din soluție
Coacervatele sunt apoi răcite la o temperatură scăzută pentru a se stabiliza și
întări și astfel se formează capsulele finale. Pentru formarea peretelui microcapsulei se
adaugă un agent de reticulare (aldehida glutarica, taninuri, etc). Prin coacervare simplă se
pot încapsula substanţe medicamentoase solide, insolubile în apa (sulfanilamide, antibiotice
etc).
78
Materialul de acoperire formează un perete în jurul picăturilor dispersate în
soluție [423, 462].
În tabelul 8 sunt prezentate câteva tipuri de particule ce pot imobiliza compuși
biologic activi obținute prin petoda coacervării.
Tabel 8. Exemple de suporturi obținute prin metoda coacervării
Compoziția suportului Tipul de suport
Compusul
biologic activ
imobilizat
Obiectivul
urmărit Bibliografie
Cazeina Microparticule Curcumină
Imobilizarea și
eliberarea
curcuminei
[462]
Gelatina/formaldehidă Microcapsule Curcumină
Imobilizarea și
eliberarea
curcuminei
[466]
Colodion Capsule Eritrocite
hemolizate
Imobilizarea și
testarea
activității
[467]
Gelatină/ gumă
arabică/aldehidă
glutarică (pentru
reticulare)
Microparticule
Rășini
uleioase din
ardei
(paprika)
Imobilizare și
eliberarea
controlată
[468]
Gelatină/ Gumă arabică Microcapsule Licopen
Creșterea
stabilității
carotenoidului
și utilizarea sa
în alimente
[469]
3.4. Uscarea prin pulverizare
Este cea mai utilizată metodă folosită la nivel industrial pentru formarea particulelor.
Este un proces rapid într-un singur pas utilizând un pulverizator pentru uscare. Este o
metodă potrivită pentru o gamă largă de aplicaţii în diferite industrii cum ar fi cele
biomedicale, alimentare şi farmaceutice [470].
79
Studiile au arătat că metoda de uscare prin pulverizare poate fi aplicată pentru a
încapsula medicamente [470], proteine [471], celule de drojdie şi alte microorganisme [472].
Uscarea prin pulverizare a fost, de asemenea, utilizată pentru acoperirea
materialelor magnetice utilizate în aplicaţii terapeutice [473] şi obținerea de microparticule
încărcate cu medicament pentru eliberare controlată.
Procesul de uscare prin pulverizare începe cu atomizarea lichidului de alimentare
pentru a forma picături fine în camera de uscare. Picăturile pot fi produse prin utilizarea
diferitelor tipuri de atomizoare rotative sau tip duză. Picăturile sunt uscate prin evaporarea
umidităţii, prin adăugarea de aer fierbinte în camera de uscare cu controlul temperaturii şi al
debitului de aer. Picăturile fine au o suprafaţă specifică mare care facilitează uscarea rapidă.
Particulele fine produse sunt evacuate continuu din camera de uscare şi colectate prin
intermediul unui ciclon sau al unui sac de filtrare.[423] Câteva exemple de particule obținute
prin această metodă cu aplicații în domeniul alimentar sunt redate în tabelul 9.
Tabel 9. Exemple de suporturi pentru încapsulare obținute prin tehnica uscării-
pulverizării
Compoziția
suportului
Tipul de
suport
Compusul
biologic
activ
imobilizat
Obiectivul
urmărit Bibliografie
Poli( acid D-
lactic-co-
glicolic)
(PLGA)
/PEG-g-
chitosan
Nanoparticule
de PLGA in
microparticule
de PEG-g-
chitosan
Curcumină
Eliberarea
controlată a
curcuminei în
plămâni
[474]
Gelatină Microparticule Curcumină
Microparticule
pentru diferite
aplicații
alimentare
[475]
Gelatină Microparticule Curcumină
Microparticule
pentru diferite
aplicații
alimentare
[476]
80
3.5. Alte metode de formare a micro/nanoparticulelor:
3.5.1. Obţinerea particulelor din polimeri preformaţi
Prezintă avantaje economice datorită timpului diminuat al procesului tehnologic, dar,
nu în ultimul rând şi faptului că polimeri de calitate superioară pot fi achiziționați ușor fiind
disponibili comercial şi caracterizarea lor poate fi mai uşor efectuată şi cu precizie.
3.5.2. Obţinerea micro/nanoparticulelor prin reticularea polimerilor în soluţie
/suspensie
Procedeul presupune prepararea unei emulsii sau suspensii cu bună stabilitate în care
soluţia de polimer sub formă de picături este dispersată într-un lichid nemiscibil.
Stabilitatea picăturilor este asigurată de agentul reticulant, în final particulele formate fiind
recuperate. Particularitatea procesului de reticulare în soluţie/suspensie este dată de
transformarea picăturilor de soluţie de polimer în particule cu dimensiune identică. Acest
efect este realizat prin reacţia intermoleculară a grupelor funcţionale sau între grupele
funcţionale ale polimerului şi cele ale agentului reticulant care rigidizează picăturile de
polimer, transformându-le în particule stabile. Ca agenţi de reticulare pot fi utilizaţi
reticulanţi covalenţi reprezentaţi de aldehida glutarică, glioxalul, epiclorhidrina etc. Pe
parcursul procesului, sistemul este menţinut sub agitare mecanică, sonicare, ultraturaxare.
Intensitatea şi durata acestora influenţează dimensiunea particulelor. Pentru a împiedica
coalescenţa particulelor se foloseşte în procesul de preparare a emulsiei/suspensiei un
stabilizator. Acesta trebuie să fie insolubil în faza de formare a picăturilor şi doar uşor
solubil în faza continuă. El conduce la creşterea vâscozităţii mediului de reacţie, cu scăderea
dimensiunii particulelor.
Un factor important cu influenţă asupra intensităţii procesului de reticulare îl
constitue masa moleculară a polimerului. Dacă aceasta este mică şi concentraţia este
scăzută, reticularea va fi diminuată, fapt răsfrânt într-o reţea mai puţin densă ce va avea
capacitate de umflare mai mare. Acest aspect favorizează o capacitate de încapsulare mai
mare cu compuşi bioactivi a produsului astfel preparat [477, 478]
3.5.3. Metoda reticulării termice
O astfel de metodă, dezvoltată de Orienti şi colab. presupune emulsionarea fazelor la
diferite temperaturi; s-a folosit pentru reticulare chimică acidul citric. Soluţia polimerică a
fost menţinută sub agitare, răcită la 0º C, când i s-a adăugat ulei de porumb şi sub agitare
continuă s-a format o emulsie apă-în-ulei care apoi a fost picurată într-un volum de ulei de
porumb care, de data aceasta a fost încălzit la 120 ºC. Dimensiunea particulelor a fost
81
controlată şi prin continuarea energică a agitării la 1000 rpm, timp de 40 minute.
Microsferele astfel obţinute au fost purificate prin spălări cu dietil eter, uscate şi sortate
[479].
3.5.4. Metoda micelelor inverse
Micelele inverse sunt lichide stabile termodinamic bazate pe apă, ulei şi un strat de
agent tensioactiv care este dizolvat în faza uleioasă. Comportamentul dinamic al acestora
oferă caracteristici foarte importante. Dacă în polimerizarea în emulsie convenţională se
obţin nanoparticule cu dimensiuni mai mari de 200 nm, prin folosirea mediului micelar
invers se obţin entităţi particulate ultrafine. Faza apoasă a polimerului trebuie să se menţină
optic transparentă. Polimerul şi medicamentul sunt amestecați în rapoarte diferite; treptat
microemulsia transparentă se transformă într-una translucidă. Este momentul în care se
adaugă agentul de reticulare; emulsia este menţinută sub agitare pe timpul nopţii.
Evaporarea solventului organic se efectuează pentru a obţine particule transparente uscate.
Produsul este dispersat în apă, apoi, prin adăugarea unei sări, are loc precipitarea
particulelor cu eliminarea tensioactivului. Amestecul este centrifugat şi supernatantul ce
conţine particule încărcate cu medicament este dializat timp de o oră, lichidul este liofilizat
şi se obţine pulberea uscată de polimer încărcat cu principiul activ [480, 481].
3.5.5. Chelatizare
Tehnica este asemănătoare reticulării suspensiilor de polimeri preformaţi, tip
polielectroliţi anionici. Agentul de reticulare este un ion bi- sau polivalent. Avantajul pe care
îl aduce metoda este dat de utilizarea ionilor de metale tranziționale ca agent de reticulare în
locul celor clasici (formaldehidă, epiclorhidrină, diizocianaţi) despre care se cunoaşte că pot
da împreună toxicitate produşilor de reacţie.
3.5.6. Coalescenţa picăturilor din emulsie
Tokumitsu şi colab. au dezvoltat această tehnică prin combinarea principiilor
reticulării în emulsie cu cele ale precipitării. Reticularea picăturilor stabile este înlocuită cu
precipitarea care este indusă când are loc coalescenţa picăturilor de chitosan cu NaOH.
Pentru aceasta se prepară mai întâi emulsiile: cea care conţine soluţie de chitosan și
medicament în ulei de parafină lichidă, apoi o alta stabilă, cu soluție apoasă de NaOH. Celor
două emulsii, puse în contact, dacă li se aplică o agitare de mare viteză, are loc ciocnirea
picăturilor, cu coalgularea acestora în dimensiuni foarte mici. Metoda a stat la baza
preparării nanoparticulelor de chitosan încărcate cu acid gadopentetic pentru terapia capturii
neutronilor gadolinium. S-a constatat o capacitate mare de încărcare cu medicament (45%),
82
în particule care au diametrul în jurul valorii de 452 nm, comparativ cu metoda reticulării în
emulsie simplă [482].
3.5.7. Procedeul spray – chilling (pulverizare-congelare)
Această tehnică este un procedeu opus procedeului de pulverizare-uscare.
Particulele se formează prin răcire, nu prin uscare. Învelişul acestora este realizat din ceară
sau grăsimi care sunt topite într-un lichid în care se află dispersat şi materialul care asigură
miezul particulei. Amestecul este pulverizat într-o cameră cu aer rece pentru ca învelişul să
se întărească în jurul miezului, formând capsula. Procedeul este preferat când se doreşte
protejarea de umezeală a principiului activ aflat în miez, eliberarea lui realizându-se la o
temperatură specifică [483].
3.5.8. Procedeul spray - cooling (pulverizare – răcire)
Prin această tehnică se pot încapsula materiale solide sau insolubile în solvenţi
obişnuiţi precum şi lichide transformate în solide în urma congelării. Produsul final este
insolubil în apă dar eliberarea principiului activ este efectuată sub punctul de topire al
materialului învelişului [483].
3.5.9. Procedeul în pat fluidizat – (bed coating)
Cunoscut şi sub numele de procedeul Wurster - metoda de obţinere a particulelor în
pat fluidizat -, tehnica este utilizată pentru acoperirea particulelor foarte mici, iar materialul
miezului este constituit din particule solide. Principiul metodei presupune ca particulele să
circule într-o cameră unde există un curent de aer ascendent. Acestea sunt antrenate ciclic şi
ridicate în zona superioară a camerei, când sunt acoperite cu material de înveliş prin
pulverizare cu straturi fine, succesive. Odată cu creşterea numărului de straturi se va asigura
o protecţie mai bună a principiului. Specialiştii aplică această variantă de obţinere a
sistemelor particulate când straturile ce învelesc principiul activ sunt din materiale diferite.
Procedeul se derulează în următoarea ordine: uscare, răcire, aglomerare, granulare,
acoperire. Ultima etapă, realizată în curent de aer, altfel numit „pat fluidizat‖, presupune
suspendarea particulelor solide ce au înglobate principii active într-un ciclon de aer cald sau
rece. Materialul de acoperire (derivaţi ai celulozei, dextrine, lipide, proteine) topit sau
dizolvat într-un solvent volatil este pulverizat în camera cu aer cald şi se va depune în
straturi la suprafaţa particulelor. Definitivarea acoperirii particulelor poate dura de la 2-12
ore, când se obţin particule cu dimensiuni cuprinse între 50 – 500 µm [483, 484].
83
.5.10. Extruderea centrifugală
Presupune formarea unor tuburi concentrice de miez şi înveliş, care amestecate în
extruder duc la forme sferice la ieşirea prin capul de profilare. Acestea pot fi acoperite cu
ceruri sau grăsimi care la rece se solidifică.
3.5.11. Procedeul de extracţie /evaporare a solventului
Metoda elimină tratamentele termice care pot degrada polimerul sau agenţii chimici
de reticulare, ce pot fi toxici dacă nu există un control fin al concentraţiei acestora în sistem.
Prin această tehnică particulele se prepară parcurgând succesiv anumiţi paşi redaţi mai jos:
- dizolvarea polimerului în solvenţi cu puncte de fierbere scăzute în care se dizolvă şi
medicamentul;
- dispersarea soluţiei polimerului sub formă de picături într-un lichid nemiscibil,
reprezentând faza continuă;
- evaporarea solventului din picături care se transformă în particule [485];
3.5.12. Procedeul sitării/sortării
Metoda presupune formarea gelului, care prin sortare pe site lasă să treacă
micro/nanoparticule încărcate cu principiul activ. Microparticule polimerice pot fi preparate
prin această tehnică deoarece este uşor de abordat şi a fost dezvoltată de Agnihotri şi
Aminabhavi. Reticulat în prealabil, gelul polimeric este încărcat cu un principiu activ,
respectiv Clozapină. Microparticulele preparate au prezentat dimensiuni cuprinse în
intervalul 540 - 700 nm, după trecerea gelului sticlos pritr-o sită foarte fină. Cu o eficienţă
de încapsulare înregistrând o valoare de 99%, clozarina a prezentat o cinetică de eliberare
controlată / lentă [486].
3.5.13. Procedeul de depunere strat cu strat (layer by layer)
Prin această tehnică se obţin nanocapsule cu largi aplicaţii în domeniul biomedical.
Tehnica a fost pusă la punct prima dată în 1998 de Sukhorukov. La baza preparării
nanocapsulelor stă procesul de atracţie electrostatică ireversibilă a polielectroliţilor încărcaţi
contrar, la suprafaţa particulei. Pe suport coloidal se depune un strat de polimer, prin
incubare în soluţia de polimer urmată de spălare, sau prin scăderea solubilităţii polimerului
asigurată prin adăugarea în picături a solventului miscibil. Depunerea în straturi continuă cu
alţi polimeri, care alternează din punct de vedere al naturii ionilor substituienţi formându-se
straturile depuse consecutiv [487, 488].
84
CAPITOLUL 4
Metode de imobilizare a principiilor active cu utilizări în industria alimentară
4.1. Imobilizarea celulelor de drojdie
În prezent există un interes general pentru eficientizarea producției de etanol, pentru
industria bauturilor alcoolice și pentru utilizarea sa ca biocombustibil. Costurile producției,
problemele de mediu, diminuarea rezervelor de combustibil fosili și creșterea prețului
gazelor naturale au fost identificați ca factori majori ce au condus la cercetări pentru găsirea
unor metode eficiente de fermentare [489-493].
Imobilizarea celulară în fermentarea alcoolului este un domeniu de cercetare ce s-a
extins mult datorită tehnicii sale atractive și avantajelor economice pe care le prezintă.
Procesele continui sunt preferate deoarece determină o eficiență substanțial îmbunătățită,o
productivitate mai mare și un cost de operare mai mic [494]. De asemenea, producerea de
etanol pentru utilizarea sa ca și combustibil a câștigat în ultimii ani un mare interes.
Producerea de combustibil din etanol diferă de cea pentru băuturi datorită faptului că nu este
necesar un proces lent pentru calitatea produsului final. Este de dorit un proces rapid și
complet de fermentare pentru a asigura o profitabilitate maximă a procesului [495].
Drojdiile, în special speciile Saccharomyces sunt preferate datorită capacității mari
de fermentare, a toleranței la etanol și la alți inhibitori, a capacității de creștere rapidă în
condiții anaerobe, care sunt caracteristice proceselor fermentative [496, 497].
Avantajele imobilizării celulelor de drojdie în diferite suporturi sunt multiple:
productivitatea volumetrică mare ca un rezultat a densității mari de celule, toleranța
crescută la diferiți factori de stres (cum ar fi concentrații mai mari de etanol și la metaboliții
toxici produși prin fermentare, temperatură crescută și pH), stabilitate mecanică și chimică
îmbunătățită, reducerea riscului de contaminare și inhibare, păstrarea viabilității celulare,
scăderea costului procesului datorită faptului că microbioreactoarele pot fi recuperate cu
ușurință din mediul de reacție și reutilizate în alte procese fermentative, posibilitatea
utilizării microbioreactoarelor în procese fermentative continui [498-500].
S-au dezvoltat numeroase tehnici de imobilizare prin legare fizică (adsorbţie) sau
chimică (legare covalentă) a celulelor de o matrice suport organică sau anorganică, prin
floculare (agregarea biomasei) şi prin includerea în particule polimere mai mult sau mai
puțin poroase sau în microcapsule [501]. Metodele implicate în imobilizarea celulelor
microbiene cel mai frecvent utilizate în industria alimentară sunt emulsifierea [332, 438]
85
extruderea [431], coacervarea complexă [502], uscarea prin pulverizare (spray drying) [472],
includerea în matricea de gel (gel entrapment) şi polimerizarea prin radiaţii [503].
Metoda de imobilizare trebuie să fie simplă, ieftină iar produsul cu celule de drojdie
imobilizate trebuie să aibă o activitate fermentativă adecvată, să fie stabil în mediul de
operare, fiind esențial să păstreze viabilitatea microorganismelor [504]. Pentru celulele
microbiene metoda extruderii este cel mai des utilizată datorită condiţiilor blânde de
procesare ce permit o încapsulare optimă iar viabilitatea microorganismelor nu este afectată.
Această metodă a fost utilizată des în cazul alginaţilor şi a caragenanului şi presupune
extruderea în picături mici a unei soluţii de biopolimer ce conţine o suspensie cu celule într-
o soluție ce conține agentul de reticulare [501].
Materialele cel mai des utilizate pentru imobilizare sunt alginații [505-508],
suporturi de sticlă sau de ceramică [509], materialele celulozice [510], γ-alumina [511],
filme sol-gel de siliciu [512] , geluri de poliacrilamidă [513] și combinații de diverse
materiale [514].
Celulele microbiene au fost imobilizate în geluri de poliacrilamidă utilizând
polimerizarea prin radiații gamma [515, 516], care comparativ cu polimerizarea inițiată
chimic prezintă avantajul ca poate avea loc la temperaturi joase, de până la -75˚C. Această
tehnică nu numai că previne inactivarea provocată de temperatură dar probele pot fi
înghețate în orice formă ajutând la obținerea de celule imobilizate sub formă de particule,
tuburi sau membrane. Tehnica polimerizării prin radiație a fost extinsă la imobilizarea
celulelor în gelatină [517].
Metoda includerii celulelor în alginați prin gelifiere ionotropă prezintă o serie de
dezavantaje cum ar fi limitarea difuziei nutrienților, a metaboliților și oxigenului datorită
matricei de gel și a densității mari de celule prinse în particule [518]. Gelurile de alginat
dețin o stabilitate mecanică joasă, stabilitate redusă la compuși chimici, ceea ce poate
conduce la difuzia unui număr mare de celule în afara matricei odată cu proliferarea lor
[508, 519, 520].
Călinescu (2012) [439]a preparat două suporturi pentru imobilizarea celulelor de
drojdie, utilizând alginații și poliacrilamida. Gelul de poliacrilamidă a fost utilizat la scară
largă pentru imobilizarea mai multor tipuri de celule microbiene [521]. Matricele cu celule
de drojdie imobilizate preparate au fost testate din punct de vedere al activității fermentative
și s-a constatat că manifestă o activitate fermentativă comparabilă cu particulele de alginați,
dar o stabilitate superioară [439].
86
Unele abordări pentru stabilizarea gelurilor de alginat includ reticularea covalentă
directă și grefarea alginaților cu polimeri sintetici. Densitatea și rezistența mecanică a
acestora poate fi crescută, de asemenea, prin încorporarea materialelor anorganice cum ar fi
siliciul, nisip și aliminiul [522, 523].
Materialele pe bază de siliciu au atras atenția cercetătorilor fiind determinată de
unele proprietăți fizice și chimice ale silicei, cum este tăria legăturii Si-O (425 J.mol-1) care
oferă o mare stabilitate materialului. S-au preparat particule de hidrogel pe bază de alginați
prin reticulare ionică utilizând diferiți cationi cum ar fi calciu și bariu, care au fost acoperite
ulterior cu un strat de gel de siliciu. Astfel celulele de drojdie sunt protejate de matricea de
alginat, iar stratul de siliciu de la suprafața celulelor le oferă stabilitate și posibilitatea de a fi
utilizate în procese fermentative continue [441].
Alegerea adecvată a suporturilor pentru imobilizare este esențială. Caracterăsticile
pe care trebuie să le dețină sunt: stabilitate mecanică și chimică bună, trebuie să fie netoxice
și biocompatibile cu celulele și trebuie să dețină un coeficient mare de difuzie atât pentru
substraturi cat și pentru produșii de fermentare [501].
Gelanul a fost utilizat pentru imobilizarea celulelor de drojdie permițând obținerea
unui biocatalizator cu perspective reale de a fi utilizat în tehnologia de producere a vinurilor
spumante, sub formă de particule sferice. Acestea s-au format prin extruderea gelului ce
conține o suspensie de celule de drojdie printr-o capilară într-o baie de soluţie de 2% CaCl2
(utilizat ca agent de reticulare ionic) [442]. Tan si colab.(2011), au imobilizat celulele de
drojdie utilizând ca suport gelanul printr-o metodă de emulsifiere şi au semnalat posibilitatea
reutilizării microbioreactoarelor rezultate. Producţia de etanol în primele trei cicluri a fost
comparabilă cu cea care utilizează drojdia liberă. Microbioreactoarele sunt stabile şi uşor de
recuperat din mediul de fermentare prin filtrare şi pot fi reutilizate pentru cel puţin 10
cicluri, cu un randament relativ mare de etanol [332].
CMCNa a fost modificată prin reacția de copolimerizare prin grefare cu N-vinil-2-
pirolidona (PVP) utilizând ca inițiator AIBN(azo-bis-izobutironitril). CMCNa și copolimerul
CMC-g-PVP au fost utilizați pentru imobilizarea drojdiei de panificație Saccharomyces
cerevisiae prin metoda extruderii utilizând ca agent de reticulare AlCl3. S-au obținut
particule sferice care testate în fermentare timp de 27 ore au permis obținerea unei
concentrații de etanol de 57 g/L. Randamentul în etanol crește atunci când gradul de
reticulare al particulelor formate scade [447, 448].
K-caragenan a fost cu succes utilizat ca matrice pentru imobilizarea celulelor de
drojdie și pentru a obține o productivitate crescută în etanol. H.Y. Wang and D. Hettwer
87
(1982) au adăugat în matricea de gel pe bază de k-caragenan hidroxiapatită sau fosfat
tricalcic. Pentru a dizolva fosfatul tricalcic și pentru a crește porozitatea matricei, particulele
care il conțin au fost introduse într-o soluție acidă ce conține 1 % KCl. Fosfatul tricalcic
inclus în matrice poate menține pH-ul la un nivel optim, poate susține viabilitatea celulară,
poate să crească densitatea gelului și productivitatea în etanol. Aceasta a devenit mai mare
decât la drojdia liberă (1,7 mg/108celule x h) și anume: 1,8 mg/10
8celule x h pentru
particulele fără fosfat tricalcic și 2,5 mg/108celule x h pentru particulele în care s-a utilizat
fosfatul tricalcic [444]. Particule de k-caragenan cu celule de drojdie imobilizată prin
metoda extruderii utilizând ca agent de reticulare KCl au fost obținute și de către A.M.
Martinez et al.,(2016) și Francesc Godia et al.(1987) [445, 446].
O altă tehnică utilizată pentru imobilizarea celulelor este cea a emulsifierii, fiind
indicată în cazul în care se dorește obținerea unor cantități mari de microsfere. Tehnica
emulsifierii presupune dispersia fazei apoase ce conține K-caragenanul dizolvat, într-o fază
organică nemiscibilă urmată de gelifierea și separarea microparticulelor. Deoarece
particulele de k-caragenan nu sunt foarte stabile ele pot fi acoperite cu un strat de chitosan
care reduce mărimea porilor iar stabilitatea mecanică și chimică a gelului crește [459].
4.2. Metode de imobilizare a -amilazei
Imobilizarea enzimelor este considerată o tehnică avansată în tehnologia enzimelor.
La ora actuală există un volum mare de informaţii asupra imobilizării enzimelor în ceea ce
priveşte noile metode de imobilizare şi suporturile pentru imobilizare [524].
Prin imobilizare enzimele își îmbunătăţesc stabilitatea, activitatea enzimatică se
păstrează şi pot fi reutilizate și se previne dezactivarea enzimei [72]. Este necesar ca
enzimele imobilizate să dețină o stabilitate înaltă şi să poată fi reutilizate în scopuri analitice
şi ca biosenzori [525].
Prima încercare de a imobiliza o enzimă a fost realizată de Michaelis şi Ehrenreich
în 1908 [526] prin adsorbţia invertazei pe cărbune, dar acest preparat precum si altele
obţinute prin imobilizarea altor enzime au dovedit o activitate scazută şi inconstantă.
Rezultate superioare au fost obţinute după cel de-al doilea război mondial, când
tehnicile de imobilizare s-au diversificat, incluzând legarea covalentă la suport, legarea
ionică, includerea în geluri, încapsularea sau simpla reticulare cu alte molecule de enzimă,
pentru a forma particule [527, 528]. În aceeaşi perioadă s-au utilizat şi tehnici de includere
pentru imobilizarea celulelor microbiene, dar comparativ cu studiile de imobilizare a
enzimelor acestea sunt mai puţin numeroase [529].
88
Purificarea şi imobilizarea proteinelor biologic active, enzimelor şi antigenelor,
prezintă o importanţă majoră atât pentru industrie cât şi pentru cercetare. La ora actuală
simplitatea utilizării şi costurile cât mai reduse sunt preocupările dominante ale acestor
procese.
Principiul general al procedeelor de imobilizare a enzimelor constă în legarea sau
fixarea unei enzime sau a unui sistem multienzimatic de suportul insolubil în apă, în
condiţiile păstrării proprietăţilor catalitice, respectiv specificitatea de acţiune şi posibilitatea
de a acţiona la pH şi temperatură asemănătoare enzimelor libere (neimobilizate).
Suporturile sau matricile utilizate în imobilizarea enzimelor pot fi de natură
anorganică: silicea coloidală, caolinita, particule sau perle de sticlă cu grad de porozitate
controlat, oxizi metalici (alumina, oxid de zirconiu, oxid de titan, cărbune etc.), şi de natură
organică: celuloza şi derivaţii acesteia, agaroză, amidon, dextran, colagen, polimeri obţinuţi
prin polimerizarea unor monomeri de tipul acrilamidă, acid metacrilic ş.a., răşini
formaldehidice etc. [530].
La imobilizarea enzimelor trebuie să se aibă în vedere următorul aspect:
conformaţia spaţială a moleculelor de enzimă în sistemul imobilizat este diferită de cea a
mediului natural din care s-a extras enzima. Pe de altă parte, conformația tridimensională a
moleculei de enzimă este distorsionată de legăturile sale cu suportul; micromediul moleculei
de enzimă imobilizat este diferit de cel al enzimei aflate în soluţie, fiind afectată viteza de
difuzie a substratului şi a produşilor de reacţie. Inhibiţia de substrat şi de produs pot, de
asemenea, juca un rol important; procesul de transport al substanţelor este un proces pasiv,
în comparaţie cu situaţia enzimei din celula vie, iar aceasta va avea desigur influenţă şi
asupra vitezei de reacţie.
Utilizarea enzimelor imobilizate permite rezolvarea unor probleme importante cum
ar fi:
Folosirea multiplă, repetată, a unui singur grup de enzime.
Posibilitatea întreruperii reacției prin îndepărtarea enzimei din mediul de reacție (sau
invers).
Enzimele sunt în general stabilizate prin legări la substrat;
Separarea produşilor puri prin descompunerea enzimatică a substratului, produsul
final nefiind contaminat cu enzimă;
Activarea enzimei cu îndepărtarea ulterioară a agentului de activare;
89
Sorbţia selectivă şi studiul inhibitorilor enzimei cu îndepărtarea ulterioară a agentului
de activare.
Are loc o creştere a vitezei de lucru, prin controlul riguros al vitezei fluxului de
substrat şi al concentraţiei acestuia [530-532].
Amilaza produsă de Hylocereus polyhirus a fost încapsulată într-o matrice formată
din gumă arabică si chitosan cu o eficienţă în încapsulare de 96,2 %. Procesul de încapsulare
ajută enzima sa fie stabilă în prezenţa agenţilor de oxidare şi a surfactanţilor. Studiul
demonstrează că această combinaţie de polimeri ca agenţi de acoperire protejează enzima de
pierderea activităţii în timpul liofilizării. Creşterea stabilităţii şi activitatea înaltă a amilazei
încapsulate ar putea face ca această abordare să constituie o alegere atractivă pentru aplicaţii
în biotehnologie si enzimologie [533].
Au fost efectuat câteva cercetări pentru a imobiliza α-amilaza prin adsorbție pe
suporturi solide. Imobilizarea enzimei se realizează pe baza a trei tehnici principale și
anume: încapsularea enzimei, adsorbția pe suport solid și legarea ionică sau covalentă.
Enzimele imobilizate au fost utilizate în multe procese industriale. Metoda includerii este
preferată deoarece previne pierderea activității enzimei după imobilizare; prin imobilizare
crește stabilitatea enzimei și este protejată enzima de contaminarea microbiană.
Includerea fizică a α-amilazei în particule de alginat reticulate cu ioni de Ca2+
a fost
prezentată ca fiind o tehnică ușoară de imobilizare, rapidă și sigură în comparație cu alte
metode. Metoda de imobilizare trebuie aleasă astfel încât structura enzimei să necesite cât
mai puține schimbări conformaționale. Natura suportului solid sau a matricei joacă un rol
important în menținerea conformației inițiale și a activității enzimei în procesul utilizat
pentru imobilizarea biocatalizatorului.[534].
Pentru ca imobilizarea enzimei să fie eficientă moleculele de α-amilază trebuie să
fie suficient de mari pentru a fi păstrate în interiorul matricei dar substratul și produsul
trebuie să fie suficient de mici pentru a trece prin porii gelului. S-au obținut particule de
alginat de calciu reticulate ionic cu CaCl2 (soluție de concentrație 2%) iar diametrul porilor a
fost între 80-100Ȧ. Moleculele de amidon sunt foarte mari și este de așteptat ca reacția de
hidroliză a amidonului să nu fie la fel de eficientă cu enzima imobilizată comparativ cu cea
liberă.
Avantajul principal al imobilizării constă în posibilitatea utilizării imobilizatului în
mai multe cicluri de hidroliză repetate cu păstrarea stabilității și a activității enzimei o
perioadă mai mare de timp. [535].
90
4.3. Metode de imobilizare a curcuminei
Pentru a crește biodisponibilitatea curcuminei au fost preparate diferite formulări. De
exemplu, nanoglobule pe bază de nanoemulsii au fost preparate pentru a evalua potențialul
de creștere a solubilității curcuminei. În timpul studiilor ex vivo eliberarea curcuminei din
nanoemulsii a fost mult mai eficientă decât din suspensiile de curcumină standard. Această
comportare indică creșterea solubilității în medii apoase. [536]
4.3.1. Complecși cu ciclodextrine
Ciclodextrinele sunt oligozaharide ce conțin între 6 și 8 molecule de zahăr într-o
structură ciclică. Ele pot imobiliza în cavitatea lor hidrofobă compuși insolubili,
îmbunătățind solubilitatea și stabilitatea chimică sau enzimatică a acestora.
S-a obținut un compus hidroxil-β-ciclodextrină cu curcumină ce prezintă o creștere
în absorbția orală în studiile efectuate pe șobolani. [537] Concentrația maximă atinsă la nivel
plasmatic la administrarea acestui compus a fost de 370 ng/ml, de 9 ori mai mare decât
concentrația obținută utilizând suspesia de curcumină standard ( la administrarea unei doze
de 500 mg/kg). Un produs cu ciclodextrină în care curcumina a fost inclusă este disponibil
în farmacii CavamaxTM
W8 Curcumin fiind produs de compania Wacker [538]. Prin
administrarea sa pe cale orală la șobolani concentrația de curcumină din plasmă crește de
10-20 de ori mai mult decât la administrarea curcuminei pudră pură.
4.3.2. Complecși cu fosfatidilcolină
Complexele fosfolipidice, lipozomii și micelele pot reduce hidrofobicitatea
curcuminei, crescând permeabilitatea prin interacțiunea lor cu componentele membranei
celulare.
Absorbția curcuminei din complecșii de fosfatidilcolină hidrogenată din soia a fost
studiată pe șobolani. La 1 g curcumină/Kg, acest preparat dă o concentrație maximă în
plasmă de 1,2 μg/ml la 90 minute după administrare în timp ce curcumina standard utilizată
are o concentrație de 0,5 μg/ml după 45 min [539].
În alte studii au fost preparați complecși similari de curcumină cu fosfatidilcolină
iar doza administrată la șobolani a fost de 1 g/ml. Concentrația maximă de curcumină găsită
în plasmă a fost de trei ori mai mare decât concentrația standard [540].
MerivaTM
(Indena) este un compus format din complecși de curcuminoizi
(curcumin I, II și III) cu lecitina (în special fosfatidilcolina). Concentrațiile din plasmă ale
celor 3 componente au fost testate la administrarea orală la voluntari umani sănătoși,
91
absorbția totală a lor în sânge fiind de 29 de ori mai mare decât pentru amestecul de
curcuminoizi neformulați. Trebuie remarcat faptul că absorbția curcuminei astfel formulate
este mai mare decât a curcuminei libere [541].
4.3.3. Nanoparticule lipidice
Sunt constituite din materiale biocompatibile și biodegradabile cum ar fi
trigliceridele și acizii grași.
Au fost preparate nanoparticule solide de lipide compuse din polisorbat, lecitină din
soia și Compritol 888 ATO™ prin metoda emulsifierii. Particulele au formă sferică și o
dimensiune de 134,6 nm; a fost administrată la șobolani o doză de 50 mg/kg. Concentrația
maximă plasmatică a fost de 14,3 μg/ml iar biodisponibilitatea a fost de 39 ori mai mare
decât a soluției de control ce conține curcumină [552].
Alte nanoparticule lipidice au fost compuse din poloxamer 188, gliceril
monostearat, lecitină din soia, trigliceride cu catene medii și curcumină. Dimensiunea
particulelor a fost de 129 nm. Administrate la șobolani cu o doză de 80 mg/kg au condus la
obținerea unei concentrații maxime mărite (565 ng/ml și 279 ng/ml) după diferite intervale
de timp 30 min și 1 h. [543].
4.3.4. Lipozomi
Sunt sisteme de eliberare care încorporează principii active nesolubile și permit
eliberarea lor în medii apoase, utilizate în general utilizați pentru administrarea parenterală
Există doar câteva exemple de administrare a lipozomilor ce conțin curcumină pe cale orală
[544, 545]. Lipozomi obținuți din lecitină cu diametrul de 253 nm încărcați cu curcumină au
fost administrați pe cale orală la șobolani. La administrare unei doze de 100mg/kg
concentrația maximă de curcumină în plasmă este de 319 ng/ml la 30 minute după
administrare în timp ce concentrația plasmatică maximă atinsă după administrarea souției de
control a fost de 65 ng/ml la 2 h de la administrare [546]. Lipozomi acoperiți cu silice și
încărcați cu curcumină au fost preparați pentru protejarea lor de mediul agresiv din tractul
gastrointestinal. Testele in vitro au arătat că aceste sisteme prezintă o mai mare stabilitate la
acțiunea lichidului gastric și eliberează controlat curcumina. Au fost efectuate teste in vivo
pe șobolani. Doza administrata a fost de 50 mg/kg iar concentrația maximă atinsă a fost de
450 ng/ml după 2 ore de la administrare. Biodisponibilitatea a fost de 7-8 ori mai mare decât
cea a soluției standard [547].
92
4.3.5. Micro/nanoemulsii
Sunt definite ca formulări coloidale, izotropice, transparente sau puțin opalescente
conținând surfactanți, ulei și apă.
O micro/nano emulsie formată din Capryol 90 (propilen glicol monocaprilat, 11%
ulei), cremofor RH 40 (propilen glicol 40 hidrogenat-ulei castor, 44 %, surfactant) și
Transcutol P (eter înalt purificat –dietilen glicol monoetil, 42%, co-surfactant) a fost
preparată într-o soluție apoasă. Solubilitatea curcuminei a fost de 32,5 mg/ml iar
dimensiunea picăturilor a fost de 27,3 nm. Studiul farmacocinetic a fost condus pe șobolani
iar rezultatele au fost comparate cu cele obținute la utilizarea soluției standard de curcumină.
La o doză de 200 mg/kg concentrația plasmatică maximă a fost de 3,75 μg/ml după un timp
de 138 minute, în timp ce doza de control la 100 mg/ml a avut o concentrație maximă de
0,83 μg/ml după 1,5 ore. Biodisponibilitatea curcuminei din emulsie a crescut de 22,6 ori
comparativ cu cea din soluția de control [548].
Alți cercetători au preparat o microemulsie cu dimensiunea picăturilor de 218 nm
utilizând curcumină, ulei, surfactanți și apă. Doza administrată șoarecilor a fost de 197
mg/kg iar concentrația plasmatică maximă atinsă a fost de 29,9 μg/ml după o oră, iar
biodisponibilitatea a fost de 9,8 % , de 9 ori mai mare decât cea a curcuminei neformulate
[549].
O micro/nanoemulsie compusă din curcumină, PEG600 și Cremofor a fost
preparată în așa fel încât concentrația de curcumină să ajungă la 100 mg/ml iar dimensiunea
picăturilor a fost de 69 nm. Testările in vivo s-au efectuat pe șobolani doza administrată
fiind de 1,8 g/kg iar concentrația curcuminei în plasmă găsită a fost de 4,73 μg/ml după 20
de minute de la administrare. Alte sisteme utilizate pentru a crește solubilitatea și
biodisponibilitatea curcuminei sunt sistemele de autoemulsionare și micelele [550].
4.3.6. Imobilizarea în particule de polimer
Un alt studiu prezintă încapsularea curcuminei în nanoparticule de hidrogel
(chitosan). Nanoparticulele pe bază de amestec de polizaharide au eliberat 95% curcumină
în 7 ore iar eficiența depinde de raportul dintre polimeri (de cantitatea de caragenan din
particule) [551].
Au fost preparate nanoparticule de apotransferină încărcate cu curcumină utilizând
metoda soluție-ulei (sol-oil chemistry) constatându-se o eliberare treptată pentru o perioadă
destul de îndelungată; 50 % din curcumină rămâne încă în particule după 6 ore de la
eliberare. [163]
93
Nanoparticule coloidale denumite Theracurmin au fost preparate din curcumină,
guma ghatti și apă [552, 553] iar la administrarea orală a 50 mg/kg și 10 mg/kg la șobolani
concentrația găsită în plasmă a fost de 764 ng/ml, repectiv 900 ng/ml după o oră de la
administrare. Administrarea orală a 30 mg/kg theracurmin la voluntarii umani sănătoși a
condus la creșterea de 27 de ori a biodisponibilității comparativ cu administrarea pudrei de
curcumină standard. [554]
Nanoparticulele de curcumină preparate de Cheng și colab (2013) pe bază de
poli(etilen glicol), poli(acid lactic) și poli(vinil pirolidonă) [555] conduc la obținerea unei
concentrații de 6 ori mai mare de curcumină în plasmă sangvină după administrarea
intravenoasă comparativ cu pudra de curcumină. Se poate concluziona că prin imobilizare
solubilitatea și biodisponibilitatea curcuminei crește.
Polimerii utilizați în mod frecvent în imobilizarea curcuminei sunt poli(acidul
lactic), poli(acidul glicolic) și copolimerul lor acid poli(lactic-co-glicolic) (PLGA).
Au fost preparate microsfere de PLGA cu curcumină cu dimensiunea de 20-30 μm
și s-au dovedit eficiente în eliberarea controlată și pentru administrarea sub formă injectabilă
subcutanată sau intramusculară. Particulele au diametrul mediu de 264 nm și au fost
administrate oral la șobolani cu o doză de 100 mg/kg. [556] Concentrația plasmatică
maximă a fost de 265 ng/ml (la 2 ore după administrare) iar biodisponibilitatea a fost de 10
ori mai mare decât la pudra de curcumină neîncapsulată. Nanosfere similare de PLGA s-au
obținut cu dimensiuni mai mici de 200 nm și aceeași doză de curcumină a fost administrată
oral la șobolani [556]. Concentrația de curcumină din plasmă a fost de 6,75 μg/ml după 2 ore
de la administrare iar biodisponibilitatea a fost cu 26,5 % mai mare decât la suspensia de
curcumină standard. Biodisponibilitatea soluției standard de curcumină în acest studiu a fost
de 4,7 % dar alte studii afirmă că biodisponibilitatea soluției standard de curcumină este de 1
% [202, 557].
În alte rapoarte unde nanoparticulele de PLGA au dimensiuni mai mici 163 nm,
concentrația maximă plasmatică a curcuminei a fost de 57 ng/ml după 15 minute de la
administrare la șobolani. Studiile pe aceste sisteme se concentrează pe investigarea
influenței dimensiunii particulelor și a diferitelor tehnici de obținere asupra creșterii
biodisponibilității și a concentrației de curcumină în sânge [558].
94
REZULTATE ORIGINALE
95
Obiectivul principal al tezei de doctorat îl constituie obținerea unor sisteme
particulate cu caracter de hidrogel, pe bază de polizaharide reticulate ionic, destinate
imobilizării de principii active cu potențiale aplicații în industria alimentară.
Selecția unor polizaharide în vederea obținerii particulelor suport pentru imobilizare
se bazează pe caracterul lor biocompatibil și a lipsei de toxicitate, condiții absolut obligatorii
pentru realizarea de materiale cu aplicații în domeniul alimentar, farmaceutic sau cosmetic,
dat fiind faptul că lucrează în contact sau în interiorul organismului uman. La aceste
considerente se adaugă abundența dat fiind faptul că provin din surse regenerabile, ceea ce
determină un preț redus, precum și reactivitatea ridicată în condiții blânde de temperatură și
presiune și în absența catalizatorilor, adeseori toxici și greu de îndepărtat din produsul
rezultat. Totodată, metodele alese pentru obținerea particulelor sunt simple, ușor de utilizat,
asigurând o bună reproductibilitate.
Realizarea obiectivului principal a presupus îndeplinirea mai multor obiective
asociate, precizate în cele ce urmează.
* Elaborarea unei metode de obținere a unor particule pe bază de gelan sau
amestecuri ale acestuia cu alte polizaharide, destinate includerii de principii active de
interes pentru industria alimetară, prin gelifiere ionotropă în prezența unor cationi
metalici divalenți.
* Caracterizarea fizico-chimică a particulelor obținute prin metode adecvate scopului
pentru care au fost preparate, respectiv obținerea de bioreactoare pentru fermentarea
glucozei
* Obținerea de sisteme particulate conținând celule de drojdie imobilizate în matricea
de tip hidrogel și stabilirea parametrilor optimi de lucru pentru realizarea de sisteme
stabile, cu performanțe bune în fermentarea glucozei
* Caracterizarea sistemelor particulate conținând celule de drojdie imobilizate în
matricea de hidrogel, din punct de vedere al stabilității structurale, al activității
biocatalitice și al posibilității de utilizare repetată în cicluri de fermentare a glucozei.
* Obținerea de sisteme particulate pe bază de gelan, obținute prin gelifiere ionotropă
cu cationi metalici divalenți, conținând -amilază imobilizată; caracterizarea lor
fizico-chimică și din punct de vedere al activității biologice în procesul de hidroliză a
amidonului
* Obținerea și caracterizarea fizico-chimică a unor sisteme particulate pe bază de
complecși polielectrolitici de natură polizaharidică conținând curcumină imobilizată;
studiul procesului de eliberare in vitro a principiului activ.
96
CAPITOLUL 5
MATERIALE, TEHNICI EXPERIMENTALE, METODE DE CARACTERIZARE
Prezentul capitol are ca scop prezentarea materialelor care au stat la baza obținerii
particulelor de hidrogel cu compuși biologic activi imobilizați cu aplicații în industria
alimentară , al tehnicilor experimentale precum și a metodelor de caracterizare utilizate.
5.1. Materiale
Biopolimeri utilizați în obținerea particulelor de hidrogel cu compuși biologic activi
imobilizați
Biopolimerii utilizați în obținerea particulelor de hidrogel cu celule de drojdie
imobilizată au fost gelanul, i-caragenanul și sarea de sodiu de carboximetil celulozei.
Polizaharidele sunt principalele materiale utilizate pentru imobilizarea celulelor de drojdie
datorită biocompatibilității și lipsei de toxicitate.
Gelanul este un biopolimer anionic liniar cu secvențe de tetrazaharide care se repetă
formate din două reziduuri de β-D-glucoză, un reziduu de acid β-D-glucuronic și unul de α-
L-ramnoză într-un raport 2:1:1 [267]. Structura chimică a gelanului este prezentată în figura
4.
Gelanul deacetilat utilizat pentru obținerea particulelor de hidrogel a fost procurat de
la Kelkogel (pentru aplicații alimentare) și are masa moleculară cuprinsă între 2-3 × 105
Da.
Carboximetil celuloza (CMC) este un eter celulozic conținând gruparea –CH2-
COOH (Na) legata prin legatura eterica la gruparea hidroxilica de la C6 a celulozei. Gradul
de substitutie variaza intre 0.4-2.2, si se prezinta de regula sub forma sarii de sodiu
(CMCNa), cu solubilitate ridicata in apa. Structura carboximetil celulozei este redată în
figura 7(b). Carboximetil celuloza a fost cumpărată de la Sigma Aldrich și are un grad de
substituție de 75%.
Caragenanul aparține familiei de galactani hidrofili liniari sulfatați cu o masă
moleculară mare, fiind format din unități alternante de D-galactopiranoză și 3,6-anhidro-
galactoză (3,6-AG) unite prin legături alternante de α-1,3 și β-1,4- glicozidice. Structura
caragenanului este prezentată în figura 9(b). I-caragenan (Car), conține 2 grupari –HOSO3-
/mol (464 Da). A fost procurat de la Sigma Aldrich.
Chitosanul reprezintă produsul principalul obținut prin procedeul de deacetilare
alcalină a chitinei și este un polimer cationic liniar natural semi-cristalin, policationic, cu
structură liniară, compus din unități (1→4)-2-acetamido-2-deoxi-β-D-glucan (N-acetil-D-
glucozamină) și (1→4)-2-amino-2-deoxi-β-D-glucan (D-glucozamină) [354]. Structura
97
chitosanului este prezentată în figura 8(b). Chitosanul utilizat este procurat de la Sigma
Aldrich, are o masă moleculară medie și un grad de deacetilare de 75%.
Polizaharidele menționate anterior au un spectru larg de aplicații în diferite domenii
dar în special în domeniul biomedical și alimentar.
Agenții de reticulare utilizați
Ca agenți de reticulare ionici au fost utilizați:
Acetat de magneziu tetrahidrat: M=214,45 g/mol, Procurat de la Sigma Aldrich
Figura 11. Structura acetatului de magneziu
Acetatul de calciu: M=158,17 g/mol, procurat de la Sigma Aldrich
Figura 12. Structura acetatului de calciu
Acetatul de zinc: M=183,48 g/mol, procurat de la sigma Aldrich
Figura 13: Structura acetatului de zinc
Clorura de calciu: CaCl2, M=110,98 g/mol, procurat de la Sigma Aldrich
Sulfatul de sodiu: Na2SO4, M=142,04 g/mol, procurat de la Sigma Aldrich
Figura 14: Structura chimică a sulfatului de sodiu
Compuși biologic activi utilizați pentru imobilizare
Drojdia utilizată este o drojdie comercială de panificație, de gen Saccharomyces
cerevisiae, cu un conținut de 70% apă, procurată de la Pakmaya, România.
Curcumina pudră, extrasă din Curcuma Longa, are formula chimică C21H20O6,
M=368,38 g/mol., se păstrează la -20˚C. Structura sa chimică este prezentată în
figura 3.
98
α-Amilază extrasă din pancreas porcin, sub formă de pudră, temperatura la care se
păstrează este de 2-8˚C și este procurată de la Sigma Aldrich. Formula sa
supramoleculară este prezentată în figura 1.
Alte substanțe utilizate:
Amidonul solubil este utilizat ca substrat pentru hidroliza enzimatică în prezența α-
amilazei. Are masa moleculară 342,3 g/mol și este achiziționat de la Sigma Aldrich.
Figura 15. Structura chimică a amidonului
α-D-Glucoza anhidră este utilizată ca substrat în procese fermentative în prezența
drojdiei pentru formarea alcoolului etilic. Are masa moleculară 180,16 g/mol. A fost
procurată de la Sigma Aldrich.
Figura 16. Structura chimică a glucozei
Albumina serică bovină are masa moleculară de aproximativ 66 kDa. A fost
achiziționată sub formă de pudră de la Sigma Aldrich. Este utilizată pentru determinarea
proteinelor prin metoda Lowry.
Tween 20 este un tensioactiv non-ionic cu masa moleculară 1228g/mol și balanța
hidrofil-lipofil de 16,7. A fost utilizat pentru stabilizarea emulsiilor și pentru a crește
solubilitatea curcuminei în medii apoase. A fost procurat de la Sigma Aldrich.
Figura 17. Structura chimică pentru polietilen glicol sorbitan monolaurat (Tween 20).
5.1.5. Alti reactivi utilizat:
Fosfat disodic, Na2HPO4·12H2O, M = 358,14 g/mol, Chemical Company.
Fosfat monosodic, NaH2PO4·2H2O, M = 156,02 g/mol, Chemical Company.
99
Acetat de sodiu, M= 82,0343 g/mol
Bicarbonat de sodiu, M= 84,007g/mol
Soluție de Iod,
Acid clorhidric
Reactiv Folin Ciocâlteu
NaOH, M=40 g/mol
CuSO4
Na2CO3
Solvenți
Apă bidistilată produsă în laboratoarele proprii;
Alcool etilic C2H5-OH, M= 46,07 g/mol, achiziționat de la Chemical Company
Acid acetic glacial, M=60,05 g/mol, Chemical Company.
5.2. Tehnici experimentale
In acest paragraf sunt descrise toate tehnicile de caracterizare a celor trei tipuri de
imobilizate obținute în cadrul tezei, unele dintre ele fiind comune.
5.2.1. Prepararea particulelor conținând celule de drojdie imobilizate în matrici
polimere (polizaharide).
Obținerea particulelor pe bază de polizaharide conținând drojdie imobilizată este
schematic prezentată în fig. 18.
Figura18. Prezentare schematică a procesului de obținere a particulelor din polizaharide
conținînd celule de drojdie imobilizate, prin gelifiere ionotropă,
utilizând procedeul extruderii prin capilară.
100
Modul de lucru este următorul. 0.25 g polimer (amestec de polimeri) se dizolvă în
25 ml apă bidistilată, sub agitare, la temperatura de 70-80ºC. Întrucât soluţia de polimer este
destul de fluidă şi nu formează particule stabile la picurarea în baia de reticulant ionic, se
procedează la prereticularea polimerului/amestecului de polimeri, anterior extruderii, prin
adăugarea unui volum de soluţie agent de reticulare (clorură sau acetat al metalului divalent)
de diferite concentraţii, când se obţine un fluid vâscos, posibil a fi extrudat. Soluția se
răcește la 30º-35ºC, iar apoi se extrude în picături cu ajutorul unei seringi printr-un ac cu
diametrul de 23 Gauge și lungimea de 30 mm, la presiune de apăsare constantă a pistonului
seringii, în 125 ml soluţie de agent de reticulare de diferite concentraţii. Procesul de
extrudere al întregii soluții durează aproximativ 10 minute. Particulele sferice se formează
instantaneu la contactul picăturilor cu soluția de acetat al metalului divalent din baia de
coagulare, fiind lăsate pentru maturare în soluţia de extrudere timp de 2 ore, după care sunt
spălate cu apă bidistilată pentru îndepărtarea excesului de agent de reticulare. Particulele se
separă prin filtrare şi se păstrează în stare umflată la frigider la temperatura de 4-6˚C până la
efectuarea caracterizărilor.
Particulele conținând celule de drojdie imobilizată s-au obţinut similar, după
adăugarea prealabilă în soluția de polimeri ce urmează a fi extrusă, a unei suspensii de
drojdie (1,25 g drojdie conținând 0.375 g celule, în 5 ml apă), la temperatura de 40˚C,
asigurând astfel un raport masic drojdie/polimer de 5/1 (g/g). Suspensia este agitată timp de
10 min până la obținerea unui amestec omogen, după care este extrusă în condițiile precizate
anterior. Particulele cu celule de drojdie sunt ținute pentru maturare timp de 1 oră în soluția
din baia de coagulare, după care sunt separate prin filtrare, se spală pe filtru cu trei porții de
câte 100 ml apă bidistilată și se păstrează în recipienti închiși, la o temperatură cuprinsă între
4-6ºC, până la caracterizarea și testarea lor ulterioară.
Prepararea fiecăruia dintre imobilizatele de celule în diferite matrici de polizaharide
prezintă unele particularități ce vor fi prezentate în cele ce urmează.
Particule cu celule de drojdie imobilizate în matrice de gelan reticulate cu Ca2+
Agentul de reticulare utilizat în acest caz este clorura de calciu. Prereticularea se
face cu un volum de 1.25 ml soluție de CaCl2 de concentrații diferite (c = 0.1; 0.3; 0.4; 0.5%
- g/100 ml), acesta fiind un parametru de influență a caracteristicilor particulelor obținute.
În scopul stabilirii influenței cantității de reticulant asupra proprietăților
particulelor, în baia de extrudere s-au utilizat soluții de CaCl2 cu diferite concentrații: 2%,
3% și 4 % (g/100 ml).
101
Particule cu celule de drojdie imobilizate în matrice de gelan reticulate cu Mg2+
Pentru a stabili influența concentrației soluției de gelan asupra caracteristicilor
particulelor, s-a lucrat la valori ale acesteia de 0.8%, 1%, 1.15% și 1.3% (g/100 ml).
Agentul de reticulare utilizat este acetatul de magneziu. Prereticularea se face cu
soluții de diferite concentrații: 0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8% (g/100 ml).
Concentrația soluțiilor de Mg(OCOCH3)2 în baia de reticulare a fost de 1%, 2%,
3%, 4% (g/100 ml).
Particule cu celule de drojdie imobilizate în matrice de gelan reticulate cu Zn2+
Agentul de reticulare este acetatul de zinc. Prereticularea se face cu soluții de
diferite concentrații, respectiv 0.02%, 0.04%, 0.06%, 0.08% și 0.1% (g/100 ml).
Concentrația soluțiilor de Zn(OCOCH3)2 în baia de reticulare a fost de 0.07%,
0.08%, 0.1% și 0.3% (g/100 ml).
Particule cu celule de drojdie imobilizate în matrice de gelan în amestec cu
carboximetil celuloză (sare de sodiu), reticulate cu Mg2+
S-a lucrat cu 0.25 g amestec de gelan și carboximetil celuloză (CMCNa) în diferite
rapoarte masice și anume: gelan/CMCNa = 100/0; 80/20; 65/35; 50/50 și 35/65 (g/g).
S-a utilizat cu acetat de magneziu ca agent de reticulare.
Concentrația Mg(OCOCH3)2 în soluția de prereticulare a fost constantă (0,4% -
g/100 ml), iar în baia de coagulare de 2% g/100 ml (cxonstantă în toate experimentele).
Particule cu celule de drojdie imobilizate în matrice de gelan în amestec cu
carboximetil celuloză (sare de sodiu) și caragenan reticulate cu diferiți cationiu
divalenți
S-a lucrat cu amestecuri în diferite proporții de gelan, CMCNa si caragenan,
rapoartele masice ale celor trei polizaharide fiind precizate mai jos.
Gelan/CMCNa/Caragenan = 40/30/30; 40/20/40; 20/40/40; 33/33/33 (g/g/g).
Sau utilizat trei agenți de reticulare – acetat de calciu, acetat de magneziu, acetat de
zinc -, de concentrații diferite în prereticulant și în baia de extrudere.
Concentrația soluțiilor de prereticulare a fost de 2.8 x10-2
M pentru acetatul de
magneziu și de calciu, respectiv 1.1x10-3
M pentru acetatul de zinc.
102
Concentrația soluțiilor în baia de extrudere (reticulare) a fost de 2.8 x10-1
M pentru
acetatul de magneziu și de calciu, respectiv 1.1x10-2
M pentru acetatul de zinc.
5.2.2. Prepararea particulelor conținând α-amilază imobilizată în matrice de gelan.
Particulele de gelan cu α-amilază imobilizată au fost obținute prin reticulare ionică
cu acetat de magneziu, utilizând metoda extruderii. Schematic, procesul de obținere este
prezentat în figura 1. S-a lucrat cu mai multe concentrații de α-amilază pentru a determina
concentrația optimă care poate fi imobilizată în particule de gelan.
0.1 g gelan (1%) au fost dizolvate la temperatura de 80-90˚C, sub agitare, în 10 ml
soluție tampon acetat care are un pH de 5.6. Soluția astfel obținută se răcește până la
temperatura de 60˚C când se adaugă sub agitare cantitatea de α-amilază dizolvată în 2 ml
soluție tampon acetat, pH 5.6. Baia de gelifiere ionotropă conține 10 ml soluție tampon
acetat și 10 ml soluție acetat de magneziu de concentrație 2%. Extruderea se efectuează în
picături cu ajutorul unei seringi, la temperatura de 60˚C (la o temperatură mai mică soluția
de gelan astfel obținută devine foarte vâscoasă iar activitatea enzimatică a α-amilazei scade).
La contactul cu soluția de reticulant, picăturile extruse se transformă instantaneu în particule
sferice, umflate. Particulele cu α-amilază imobilizată obținute se păstrează la frigider la
temperatura de 4-6˚C până la efectuarea testelor ulterioare.
Figura 19. Prezentare schematică a preparării particulelor de gelan cu α-amilază
imobilizată
Eficiența de imobilizare a enzimei se determină cu relația (1)
E =
x 1 (1)
unde, mEi-cantitatea de enzimă inițială
mEs-cantitatea de enzimă care se găsește în supernatant după extrudere.
103
5.2.3. Prepararea particulelor conținând cucrcumină imobilizată în matrici de
polizaharide
Au fost utilizate două tehnici de realizare a sistemelor particulate polimer-
curcumină, ambele având la bază realizarea de complecși polielectrolitici între polizaharide
cu caracter ionic diferit.
Prima metodă se referă la realizarea particulelor pe bază de gelan, respectiv
gelan/caragenan prin complexare polielectrolitică cu chitosan, fiind prezentată schematic în
figura 2.
O cantitate de 20 mg curcumină se dizolvă în 10 ml ulei de măsline sub agitare, la
60˚C. Soluția de polimer (concentrație de 0.75% gelan sau gelan/i-caragenan) se prepară
separat prin dizolvarea a 1.5 g polimer în 20 ml apă distilată, sub agitare, la temperatura de
80-90˚C. Soluția uleioasă de curcumină se emulsionează prin adăugare în picături în soluția
apoasă de polizaharidă, după ce în aceasta din urmă se adaugă 1% Tween 20 (surfactant).
Emulsionarea are loc sub agitare energică (2000 rot/min), timp de 30 minute.
Figura 20. Prezentarea schematică a procesului de obținere a particulelor cu curcumină prin
metoda emulsiei și a complexării polielectrolitice.
Emulsia formată se extrude apoi cu ajutorul unei seringi și a unui ac cu
dimensiunea de 23 Gauge într-o soluție de 60 ml chitosan 1% (1% chitosan dizolvat în 1 %
acid acetic) ce conține și 20 ml soluție de acetat de magneziu 2%. Particulele se lasă în
amestecul rezultat, la frigider, la temperatura de 4-6˚C pentru 4-5 ore pentru stabilizare după
care se filtrează și se spală cu apă bidistilată pentru îndepărtarea excesului de chitosan și
104
acetat de magneziu. Uscarea particulelor se efectuează la vid la temperatura de 30˚C, după
care acestea se păstrează în recipiente închise până la efectuarea caracterizărilor ulterioare.
A doua metodă utilizată pentru imobilizarea curcuminei în particule de polizaharide
se bazează, de asemenea, pe formarea unui complex polielectrolitic fiind prezentată
schematic în figura 3. Metoda presupune parcurgerea a două etape pentru obținerea
particulelor.
Etapa I. Prepararea microparticulelor de chitosan cu curcumină imobilizată.
În această etapă 200 mg curcumină se dizolvă în 20 ml alcool etilic absolut. Se
prepară separat o soluție de chitosan 0,05% în 0,06 M acid acetic (40 ml), în care se adaugă
o soluție de Na2SO4 de concentrație 0,1% (16 ml). Amestecul este supus ultrasonării (sondă
de ultrasunete tip Sonics and Materials, Vibra Cell) timp de 4 minute, cu adăugarea în
picături a curcuminei dizolvată în alcool etilic.
Figura 21. Prezentarea schematică a procesului de obținere a particulelor de gelan
ce conțin microparticule de chitosan cu curcumină imobilizată, reticulate ionic
cu acetat de magneziu, prin metoda extruderii.
Suspensia de particule de chitosan reticulat ionic astfel rezultată, este menținută la
40˚C sub agitare pentru evaporarea alcoolului etilic, după care separarea microparticulelor
se efectuează prin centrifugare. Final, microparticulele se spală de trei ori cu apă bidistilată
și se resuspendă în 100 ml apă bidistilată. Suspensia rezultată, dacă nu este folosită imediat
se păstreaza la T = 4-6˚C până la utilizarea în următoarea etapă.
105
Etapa II. Prepararea particulelor de hidrogel pe bază de gelan conținând
microparticule de chitosan.
Gelanul se dizolvă în 20 ml apă bidistilată la 80-90˚C, pentru obținerea unei soluții
de concentrație 2%. Când se ajunge la temperatura 50˚C se adaugă sub agitare puternică
(2000 rot/min), în picături, 20 de ml din suspesia de microparticule de chitosan cu
curcumină, preparată în etapa I. Amestecul format se extrude cu ajutorul unei seringi printr-
un ac cu diametrul de 23 Gauge în 100 ml soluție acetat de magneziu de concentrație 2%. Se
formează simultan complexul polielectrolitic și aree loc și reticularea gelșanului. Particulele
de complex formate se păstrează în soluția de reticulare timp de 3 ore după care sunt
separate prin filtrare. Uscarea particulelor se face la temperatura camerei, la 25˚C, după care
acestea se păstrează în recipiente etanșe, la rece, până la efectuarea caracterizărilor.
5.3. Tehnici de caracterizare
5.3.1. Spectroscopia FTIR-ATR
Spectrele FTIR ale unor polizaharide precum și ale unor particule obținute pe bază
de amestecuri de polimeri, prin reticulare cu diferiți cationi divalenți, au fost înregistrate
utilizând un spectrofotometru FTIR Cary 630 cu ATR la interfața probelor pe un interval de
frecvența de 4,000–650 cm−1
la o rezoluție de 4-cm−1
(fig. 4). Software-ul utilizat pentru
colectarea datelor a fost Cary 630 MicroLab PC și software-ul Agilent Resolution Pro a fost
utilizat pentru determinarea poziției picurilor.
Figura 22. Spectrofotometru FTIR Cary 630 (Agilent Technologies, USA)
5.3.2. Morfologia particulelor (microscopie electronică de baleiaj)
Particulele, atât cele conținând celule de drojdie cât și cele conținând - amilază
sau curcumină au fost caracterizate prin microscopie electronică de baleiaj pentru a
determina morfologia, porozitatea și a evalua calitativ măsura în care celulele de drojdie se
106
regăsesc în matricea polimeră. Particulele au fost secționate și uscate, au fost metalizate cu
aur utilizând un dispozitiv de pulverizare catodică (Cressington 108 auto) si analizate cu
ajutorul unui microscop HITACHI SU), respectiv TEMP 3000 HITACHI fig. 23)
Figura 23. Microscop electronic de baleiaj tip (a)-TEMP 3000 HITACHI;
Microscop Hitachi SU 1510 (b)
5.3.3. Stabilitatea structurală a particulelor conținând drojdie
Stabilitatea structurală a particulelor conținând drojdie imobilizatăa fost evaluată
indirect, prin teste reologice de baleiaj în amplitudine și frecvență. S-a pornit de la
presupunerea că o structură mai stabilă, puternică, realizată prin reticulare, determină valori
ridicate ale modulului de acumulare (G‘) probând o mai bună stabilitate mecanică. Testele
au fost effectuate pe un reometru modular Physica MCR 501 (Anton Paar, Austria) (fig. 24),
utilizând un sistem Peltier pentru reglarea temperaturii și o geometrie plan-paralelă.
a b
Figura 24. Reometru modular Physica MCR 501(a) și schema dispozitivului plan-plan
folosit pentru studii reologice
Toți parametrii reologici măsurați au fost determinați în regim dinamic oscilatoriu.
Același număr de particule din fiecare probă, selectate astfel încât să aibă același diametru,
au fost plaste între plăcile dispozitivului reometrului, până când cea superioară le atinge,
asigurându-se apoi o ușoară presiune. Testele de baleiaj în amplitudine au fost aplicate cu
107
scopul de a determina limita domeniul vâscoelastic (domeniul LVE), care permite să se
stabilească deformația maximă tolerată de probă înainte ca structura sa internă să fie
distrusă. Frecvența a fost menținută constantă (ω = 10 rad/s) în timp ce deformația (γ) a
variat în domeniul 0,01’100%. Pentru testul de baleiaj în frecvență, deformația a fost
păstrată constantă în domeniul vâscoelastic liniar, iar frecvența a variat în domeniul 01 - 100
rad/s.
Toate măsurătorile au fost efectuate la temperatură constantă (T=30oC),
monitorizându-se variația în timp a modulelor de acumulare și pierdere.
5.3.4. Stabilitatea în diferite medii a sistemelor particulate conținând drojdie
Stabilitatea particulelor cu și fără celule de drojdie imobilizate a fost determinată
atât în soluția din baia de reticulare cât și în apă bidistilată. Se consideră că din particulele
mai puțin stabile se pot desprinde fragmente de polimer care determină turbiditatea soluțiilor
apoase în care sunt păstrate. O valoare mai coborâtă a transmitanței se corelează cu o
stabilitate structurală mai redusă a particulelor. De asemenea, turbiditatea soluției la
particulele cu celule de drojdie imobilizate, în cazul celor mai puțin stabile, poate fi
determinată de celulele de drojdie ce pot difuza din matricea polimeră în mediul în care sunt
păstrate.
Turbiditatea mediilor apoase în care sunt păstrate particulele este evaluată prin
măsurarea transmitanței T%, la o lungime de undă de 550 nm, la diferite intervale de timp,
atât în soluția de extrudere cât și în apă bidistilată, cu ajutorul unui spectrofotometru
BOECO S-22, la lungimea de undă de 550 nm (fig. 25)
Figura 25. Spectrofotometru UV-VIS tip BOECO S-22.
Particulele (10 g) au fost păstrate în 50 ml soluție de reticulare timp de 24 de ore
după care au fost spălate cu apă bidistilată; cele care conțin celule de drojdie imobilizată au
fost păstrate în apă bidistilată timp de 24 de ore iar particulele fără celule de drojdie au fost
păstrate 36 de ore in același mediu. Măsurarea transmitanței s-a efectuat la fiecare 12 ore.
108
Particulele fără celule de drojdie au fost păstrate la temperatura camerei între măsurători, iar
cele cu celule de drojdie au fost păstrate la temperatura de 4-6˚C. Măsurarea transmitanței a
fost efectuată în triplicat, deviația standard fiind în limita de ± 0,3%.
Imobilizarea celulelor în particule de polimeri, are ca efect printre altele protejarea
biocatalizatorului de mediile, uneori agresive, în care lucrează. Se impune însă ca
imobilizatele să fie stabile în soluții alcoolice (formate în urma fermentării) cu concentrația
de minim 80 g/l, care să justifice separarea alcoolului prin distilare și să permită reutilizarea
lor. Pentru acest motiv, câteva tipuri de particule au fost analizate din punct de vedere al
stabilității într-o soluție alcoolică de 100g/l, această proprietate fiind evaluată, ca și în cazul
anterior, prin monitorizarea transmitanței mediului alcoolic în care au fost suspendate
probele, la diferite durate (intre 12 si 84 ore). Particulele cu celule de drojdie au fost păstrate
la frigider la 4-6˚C intre măsurători. Înainte de determinarea transmitanței probele au fost
păstrate la temperatura de 30˚C (temperatura la care are loc procesul de fermentare) timp de
255 min (durata unui ciclu fermentativ).
5.3.6. Gradul de umflare
Particulele obținute au caracter de hidrogel, astfel încât s-a considerat utilă
determinarea capacității lor de a reține apa – uzual cuantificată prin gradul de umflare
(Q,%). Acestă caracteristică este foarte importantă, deoarece ea determină difuzia mai mult
sau mai puțin intensă a substratului în matricea de hidrogel către celulele sau enzima
imobilizate, cât și difuzia produșilor rezultați în exteriorul imobilizatelor.
Atât pentru particulele cu cât și fără celule de drojdie imobilizate, precum și pentru
cele conținând -amilază, Q% a fost determinat gravimetric.
In cazul particulelor de gelan conținând drojdie de berte, reticulate cu acetat de
magneziu, au fost utilizate două metode de determinare a gradului de umflare.
Prima metodă a constat în monitorizarea comportării particulelor în timpul uscării
controlate. O cantitate exact cântărită de particule umflate (menținute timp de 24 ore în apă
bidistilată) au fost suouse uscării controlate la T=30 0C (temperatura la care se face
fermentarea glucozei). La intervale de timp de câte 1 oră, particulele au fost cântărite, iar
operațiunea a fost repetată până caând proba a ajuns la greutate constantă, ce semnifică
pierderea completă a apei (deci, particulele ajung în stare perfect uscată).
Pentru toate celelalte tipuri de particule s-a folosit metoda clasică de determinare a
gradului de umflare. Probele au fost uscate la temperatura de 40˚C până la greutate
constantă. O cantitate de particule exact cântărită (Muscat) a fost imersată în 5 ml apă
109
bidistilată, ce a fost îndepărtată prin filtrare la intervale de câte o oră iar suprafața
particulelor a fost tamponată cu hârtie de filtru pentru a îndepărta excesul de apă. Masa
particulelor umflate (Mparticule umflate) a fost stabilită prin cântărire. Apa reținută de particule
(Mapă) reprezintă diferența dintre masa particulelor umflate (Mparticule uscate ) și masa
particulelor uscate (Muscat). După cântărire probele au fost reintroduse în apă, operațiunea
repetându-se după fiecare oră până la atingerea echilibrului. Gradul de umflare s-a exprimat
ca raport între cantitatea de apă existentă în particule la fiecare interval de timp și cantitatea
de particule complet uscate (relația 2)
(2) 100 M
M Q(%)
uscate particule
apă
Determinarea gradului de umflare s-a făcut în triplicat. Deviația standard este in
limita de ± 3%.
5.3.6.Viabilitatea celulară şi concentraţia celulelor de drojdie din medii apoase și
din particulele de imobilizat
Se consideră că din particulele cu celule de drojdie imobilizată mai puțin stabile pot
difuza mai multe celule. Pentru a stabili dacă viabilitatea celulară se păstrează în timp s-a
considerat util măsurarea concentrației de celule și a viabilității celulare din soluția apoasă în
care acestea sunt păstrate. Particulele de imobilizat au fost păstrate în 50 ml soluție ce
conține diferite concentrații de agent de reticulare timp de 24 de ore, apoi au fost spălate cu
apă bidistilată pentru îndepărtarea excesului de reticulant și păstrate pentru încă 36 de ore în
50 ml de apă bidistilată. După fiecare determinare particulele au fost păstrate la frigider la
temperatura de 4-6˚C în soluția de extrudere sau în apă bidistilată, în funcție de mediul
pentru care se evaluează aceasta caracteristică.
Metoda se aplică frecvent pentru evaluarea calităţii drojdiei comprimate, a stării
fiziologice şi determinarea procentuală a celulelor autolizate, a influenţei unor factori de
mediu asupra activităţii fiziologice a celulei de drojdie. Ea se bazează pe faptul că celulele
de drojdie neviabile fie în urma procesului de autoliză, fie a unui factor exterior ce produce
modificări ireversibile în structura proteinelor, işi pierd proprietăţile fermentative. Prin
suspendarea celulelor de drojdie în soluţie diluată de albastru de metilen și citrat de sodiu,
celulele inactive fiziologic se vor colora în albastru deoarece în urma inactivării
reductazelor, nu se mai produce trecerea colorantului în forma sa de leucoderivat incolor,
asa cum are loc în celula vie activă.
110
Concret, viabilitatea celulară si numărul de celule de drojdie din mediile în care
particulele au fost suspendate, în soluţie diluată de albastru de metilen și citrat de sodiu 2%,
au fost determinate cu ajutorul unui microscop optic (Optika Model B-330) şi a unei camere
de numărare Marienfeld (Neubauer) (fig. 26). Cu ajutorul acesteia se pot număra celulele
neviabile (autolizate – de culoare albastră), din totalul de celule care se exprimă apoi
procentual (număr sau greutate, aceasta din urmă determinată din curba de etalonare).
(a) (b)
Figura 26. Microscop optic (Optika Model B-330) (a) şi cameră de numărare Marienfeld
(Neubauer) (b)
Concentraţia de celule de drojdie (număr celule/ml) din soluţia de extrudere s-a
determinat după 12 ore și 24 de ore; ulterior, particulele au fost spălate şi resuspendate în
apă bidistilată; s-a determinat concentraţia de celule după 12 ore, 24 ore și în unele cazuri,
36 ore. În funcţie de numărul de celule de drojdie vii si lizate ce se găsesc în soluţia de
extrudere după perioadele de timp menţionate anterior s-a determinat viabilitatea celulară
(Vc %) (relația 4)
(3) 100 lizate) celuleN viicelule(N
viiceluleN Vc
În care :
Vc -reprezintă viabilitatea celulară ;
Ncelule vii-reprezintă numărul de celule vii determinate cu ajutorul camerei de numărare ;
Ncelule lizate-reprezintă numărul de celule moarte (autolizate) determinate cu ajutorul camerei
de numărare.
Pentru determinarea cantității de celule de drojdie care se găsesc în supernatant
după obținerea particulelor și pentru determinarea cantității de celule de drojdie care se
consumă după fiecare ciclu de fermentare s-a construit în prealabil o curbă de etalonare care
corelează concentrația de celule de drojdie cu greutatea lor (fig. 27).
111
Pentru prepararea soluției stoc cu celule de drojdie 0,1 g drojdie au fost dizolvate în
50 ml soluție acetat de magneziu de concentrație 0,5 %. Au fost făcute mai multe diluții
până în momentul în care celule au putut fi numărate cu ajutorul camerei de numărare și a
microscopului optic. Soluțiile au avut concentrații ce variază între 0,39 x 10-2
mg drojdie/ml
și 2,5 x 10-2
mg drojdie/ml. Cu ajutorul microscopului optic și a camerei de numărare s-a
determinat numărul de celule care se găsește în fiecare probă iar apoi s-a trasat curba de
calibrare prezentată în figura 27.
Figura 27. Curba de etalonare care corelează concentrația de celule de drojdie cu greutatea
lor.
Pe baza acestei curbe a putut fi calculată greutatea unei celule de drojdie, care este
de = 3.7x10-11
g /celula . Corectitudinea rezultatului obținut este atestată de faptul că
literatura raportează o valoare cuprinsă între 2.4 x 10-11
și 12 x 10-11
g/celula [559].
Masurătorile viabilității celulare au fost efectuate în triplicat, în tabelele de la
capitolele ulterioare fiind indicate valorile medii ale rezultatelor obținute. Deviația standard
este in limitele de ± 0,3%.
Păstrarea viabilității celulare în timpul procesului de fermentare este o condiție
esențială pentru ca particulele să poată fi utilizate în mai multe cicluri fermentative. Pentru a
stabili dacă celulele proliferează în matricea polimeră în intervalul dintre diferite cicluri de
fermentare, s-a procedat astfel. Câte 2-3 particule exact cântarite din fiecare probă testată din
punct de vedere al activității fermentative au fost dezintegrate mecanic cu ajutorul unui
ultraturax la 2000 rot/min in 100 ml H2O bidistilată, pentru a obține o dispersie omogenă de
celule. Prin colorarea dispersiei cu celule cu albastru de metilen, prin metoda anterior
descrisa, s-a determinat concentrația de celule și viabilitatea celulară din particule. În funcție
de numărul de celule/ml (concentrația de celule) din curba de calibrare trasată s-a evaluat
112
cantitatea de celule care se găsește în particule după fiecare ciclu de fermentare (g celule/g
particule).
5.3.7. Testarea activității fermentative a particulelor ce conțin celule de drojdie.
Testarea capacităţii imobilizatelor de a produce fermentarea glucozei s-a efectuat
într-un fermentator (fig. 11) în care s-a introdus un volum de 50 ml soluţie glucoză (c = 8%)
și o cantitate totdeauna constantă de particule de imobilizat (30 g). Pentru a permite
compararea procesului de fermentare în prezența particulelor de imobilizat cu cel realizat în
prezența drojdiei libere, s-a realizat fermentarea glucozei în prezența celei din urmă într-o
cantitate practic egală cu cea din particule.
Fermentarea s-a condus la temperatura de 30˚C, monitorizându-se volumul de CO2
degajat, pe baza căruia s-a stabilit cantitatea de glucoză fermentată în timp, respectiv
eficienţa (randamentul) procesului. Fiecare ciclu de fermentare durează 255 de minute, iar
volumul de CO2 este citit după fiecare 15 minute. După fiecare ciclu de fermentare
particulele au fost recuperate din fermentator, spălate cu apă bidistilată pentru îndepărtarea
excesului de glucoză şi reticulant şi păstrate în frigider la temperatura de 4-6ºC diferite
perioade de timp, care pentru diferitele tipuri de imobilizat obținute au variat între 0,5 – 24
ore, până la următorul ciclu de fermentare.
Figura 28. Instalația de fermentare. 1 – reactorul de fermentare termostat; 2-
ciclindru pentru măsurarea volumului de CO2; 3-particule cu celule de drojdie imobilizate.
În unele cazuri, ce vor fi prezentate la capitolul ‖Rezultate și discuții‖, în
fermantator s-au mai introdus diferite cantități de agent de reticulare, sau s-a cret un mediu
113
de o anumită valoare a pH-ului. Acesta a fost ajustat fie cu soluție 2% acid acetic fie cu
bicarbonat de sodiu (NaHCO3).
Rezultatele obținute în urma studiului cinetic al procesului de fermentare au stat la
baza calculării unor parametri specifici ai acestuia, respectiv productivitatea specifică și
viteza de fermentare.
Teoretic cantitatea de etanol formată, se poate deduce pe baza volumului de CO2
măsurat, deoarece în condițiile de lucru alese, fermentația alcoolică este singura activitate
metabolică a drojdiei. Calculele se efectueaza pe baza reacției de fermentare a glucozei:
C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2
180g 2x46g 2x22,4L
Productivitatea specifică în etanol a fost determinată astfel:
Se trasează curba de fermentare : volumul măsurat VCO2 (ml) în funcție de timp
T(min)
Din porțiunea liniară se calculează panta dreptei alegând două puncte de pe aceasta
(V1, V2 și t1, t2 sunt coordonatele celor două puncte) și se determină viteza de
formare a CO2 exprimată în ml CO2/min de pe dreptă (relația 5).
=
, tg α = vCO2/t ml/min (4)
Volumul de gaz la 0˚C (273K) se calculează în funcție de volumul de CO2 (ml/min)-
obținut în etapa anterioară-la temperatura de colectare (30˚C-303 K). (Volumul de
gaz la 0˚C va fi exprimat în l/h) (relația 6)
VCO2 (0˚C)=
⁄
, ⁄ (5)
Din ecuația de fermentare a glucozei se determină debitul de etanol (g
etanol/h)(relația7).
=
(6)
Productivitatea specifică (g etanol/h x g drojdie) rezultă ca raportul dintre debitul de
etanol și masa de drojdie uscată.
Cantitatea de drojdie comprimată utilizată pentru fiecare probă a fost de 1.25 g.
Cantitatea totală de drojdie uscată reprezintă 30% din cantitatea totală de drojdie
comprimată adică 0.375g (relația 8)
=
x ⁄ (7)
114
5.3.8. Determinarea activității -amilazei libere și imobilizate
Testele pe enzima liberă, respectiv imobilizată au fost efectuate pentru a determina
variația activității enzimatice în funcție de concentrația de amidon. S-a lucrat cu o soluție
stoc de amidon cu concentrația de 0.4%, respectiv o soluție de enzimă cu concentrația de
0,3922 mg/ml.
1 ml din soluția stoc de amidon se adaugă peste 6 ml de soluție tampon acetat pH
5,6 aflată într-un pahar sub agitare. Concentrația totală de amidon în cei 7 ml soluție este de
0,57 mg/ml. Se adaugă 200 μl din soluția stoc de enzimă iar din acest moment se începe
cronometrarea. In cazul caracterizării enzimei imobilizate, este luat în lucru 1 g particule
care conțin aproximativ aceeași cantitate de enzimă, ca și cea liberă. Din pahar se iau câte
200 μl probă din minut în minut și se adaugă într-o eprubetă care conține 1 ml HCl utilizat
pentru a opri reacția de hidroliză. 200 μl din eprubeta care conține enzime și HCl se adaugă
într-o eprubetă care conține 5 ml soluție de iod de concentrație 0.05 N. Determinarea se
efectuează colorimetric (amidonul în prezența iodului se colorează în albastru-violet) iar
absorbanța se citește după 20 de minute la o lungime de undă de 620 nm cu ajutorul unui
spectrofotometru.
Viteza reprezintă cantitatea de amidon transformată în glucoză pe minut.
Activitatea enzimatică s-a exprimat ca raport între cantitatea de amidon consumată
și cantitatea de enzimă luată în lucru. În figura 29 este prezentat schematic modul de lucru
pentru determinarea activității enzimatice.
Figura 29. Prezentarea schematică a modului de lucru pentru determinarea
activității α-amilazei libere sau imobilizate.
Cantitatea de amidon nehidrolizată care stă la baza evaluării activității celor două
forme de prezentare a enzimei se stabilește pe baza curbei de etalonare prezentată în fig.30
115
(a) (b)
Figura 30. Curbele de calibrare pentru amidon utilizând (a) concentrații mai mici de 1 mg/ml
și (b) concentrații până la 4 mg/ml.
Pentru trasarea curbelor de calibrare ale amidonului au fost preparate mai multe
soluții de amidon de concentrații diferite.
Soluția stoc de amidon are o concentrație de 0.4% din care ulterior au fost
obținute prin diluție soluții a căror concentrație a fost:
- 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6 mg/ml (pentru trasarea curbei din figura 30 (a)).
- 0.5; 1; 1.5; 2; 2.5; 3; 3.5; 4 mg/ml (pentru trasarea curbei din figura 30 (b))
După ce soluțiile de amidon au fost preparate se iau câte 200 μl din fiecare probă și
se adaugă într-o eprubetă ce conține HCl 0.5 N. Din acest amestec se iau încă 200 μl și se
adaugă în 5 ml soluție de iod 0.05 N. După 15-20 minute se măsoară absorbanța la o
lungime de undă de 620 nm utilizând pentru măsurare un spectrofotometru UV-VIS tip
BOECO S-22.
5.3.9.Determinarea constantei Michaelis-Menten și a vitezei maxime de hidroliză -
amilaza liberă și imobilizată
Principiile generale ale cineticii reacțiilor chimice se aplică și la reacțiile catalizate
de enzime dar acestea au în plus o trăsătură proprie și anume saturarea cu substrat. Teoria
Michaelis-Menten presupune că enzima E se combină mai întâi cu substratul S pentru a
forma complexul enzime-substrat ES. Acest complex se descompune într-o etapă ulterioară
obținându-se enzima liberă E și produsul P.
Ecuația Michaelis Menten exprimă relația matematică dintre viteza inițială a unei
reacții catalizată enzimatic, concentrația substratului și anumite caracteristici ale enzimei,
fiind valabilă doar pentru reacțiile catalizate enzimatic, cu un singur substrat (relația 8)
v =
(8)
y = 0,1508x R² = 0,9944
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0 0,2 0,4 0,6 0,8 Concentratia amidon, mg/ml
Abso
rban
ta
y = 0,0791x R² = 0,9986
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 1 2 3 4 5
Absorbanța
Concentrația de amidon, mg/ml
116
unde, v0-viteza inițială de reacție.
Vmax-Viteza maximă de reacție
Km-constanta Michaelis Menten
[S]-concentrația substratului.
Pentru determinarea constantei Km și a vitezei maxime de reacție, Vmax, au fost
utilizate mai multe concentrații de amidon între 3 și 30 mg/ml. Câte 1 ml din fiecare soluție
de amidon a fost adăugat în 6 ml soluție tampon acetat, pH 5,6.
Cantitatea de enzimă imobilizată și cantitatea de enzimă liberă utilizată în reacția de
hidroliză a fost aceeași (cantitatea de enzimă liberă adăugată a fost de 400 μl din soluția stoc
de enzimă, adică 0,16 mg enzimă iar cantitatea de enzimă imobilizată în 0,5 g particule a
fost tot de 0,16 mg enzimă). Determinarea vitezei de reacție s-a efectuat după 10 min
(utilizând testele de determinare a activității enzimatice descrise anterior ) și a fost exprimată
ca fiind cantitatea de amidon consumată într-un minut.
5.3.11. Influența pH-ului și a temperaturii asupra activității enzimatice
Pentru a determina pH-ul la care activitatea enzimatică este maximă s-a lucrat la
mai multe valori ale acestuia în baia de hidroliză enzimatică: 4; 4,5; 5; 5,6; 6 și 6,5.
Temperatura la care a fost efectuată hidroliza amidonului a fost de 60˚C.
Pentru a determina temperatura la care activitatea enzimatică este maximă s-a
efectuat hidroliza enzimatică în prezența enzimei libere sau a enzimei imobilizate utilizând
mai multe temperaturi cuprinse între 20 și 75˚C. PH-ul utilizat în mediul de hidroliză a fost
5,6.
Procedeul prin care s-a determinat activitatea enzimatică la diferite valori ale celor
doi parametri este cel descris anterior.
5.3.11.Testarea activității enzimatice a particulelor conținând enzimă imobilizată, în
mai multe cicluri hidrolitice
Particulele cu α-amilază imobilizată au fost testate în mai multe cicluri de hidroliză
repetate și s-a urmărit modul în care activitatea enzimatică evoluează de la un ciclu la altul.
Pentru această determinare s-au utilizat 1 ml amidon 0,4% in 6 ml soluție tampon
acetat la pH 5,6, 0,5 g particule conținând enzimă (0,15 mg enzimă) iar temperatura la care
s-a determinat activitatea enzimatică (prin procedeul descris anterior) a fost de 35˚C. S-a
ales această temperatură deoarece la 60˚C, după ciclul 4 de hidroliză particulele devin
instabile. Fiecare ciclu de hidroliza durează 10 minute.
117
5.3.12.Cinetica eliberării curcuminei din particulele de imobilizat
Capacitatea de eliberare a curcuminei din particule a fost studiată prin difuzie în
două medii de pH diferit. S-a studiat eliberarea curcuminei în soluție tampon fosfat la
pH=7,4 care este specific sângelui, respectiv pH-ul care se găsește în fluidele din colon și la
pH = 2 utilizând o soluție preparată din NaCl și HCl care simulează pH-ul din mediul
gastric.
0,5 g de particule preparate prin metoda I sau 0,05 g particule preparate prin metoda
II sunt imersate în 20 ml soluție tampon fosfat pH =7.4 sau pH= 2, sub agitare, la
temperatura de 37˚ C iar din timp în timp sunt prelevate probe pentru a determina
spectrofotometric cantitatea de curcumină eliberată, la lungimea de undă de 425 nm
utilizând un spectrofotometru Boeco UV.
Deoarece curcumina este o substanță hidrofobă și este foarte puțin solubilă în medii
apoase (solubilitatea este de 0,006% în apă) s-a adăugat Tween 20 (tensioactiv) în fluidul în
care se efectuează eliberarea 1%. Curbele de etalonare pentru curcumina neimobilizată,
construite în soluția tampon fosfat și în soluția ce simulează lichidul gastric intestinal sunt
prezentate în figura 31.
Modul de lucru a fost următorul:
Pentru prepararea soluției stoc de curcumină s-au dizolvat la 10 mg curcumină în
50 de ml soluție (de pH 7.4 sau pH 2) ce conține și 1% Tween 20. Din această soluție prin
diluție au fost preparate 8 soluții a căror concentrație variază între 1μg/ml și 8 μg/ml.
Absorbanța s-a măsurat la o lungime de undă de 425 nm cu ajutorul unui spectrofotometru.
(a) (b)
Figura 31. Curbe de etalonare a curcuminei în soluție tampon fosfat pH 7,4 (a) și în soluție
ce simulează lichidul gastric, pH 2 (b)
y = 0,1201x R² = 0,9987
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 5 10
Absorbanța
Concentrația de curcumină, μg/ml
y = 0,1161x R² = 0,999
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 2 4 6 8 10
Absorbanța
Concentrația de curcumină, μg/ml
118
CAPITOLUL 6
Obținerea de sisteme particulate pe bază de polizaharide reticulate
ionic conținând celule de drojdie imobilizate
Imobilizarea celulelor de drojdie în/pe diferite suporturi pentru obținerea alcoolului
etilic prin fermentare este studiată de peste 4 decenii, și continua să suscite interesul
cercetătorilor. Avantajele utilizării imobilizatelor de celule de drojdie comparativ cu
utilizarea lor tradiționala – în formă liberă -, sunt numeroase, printre ele putând aminti:
- protectia celulelor față de distrugere prin solicitare mecanică, factori de mediu sau
metaboliți toxici cum sunt cei produși de alcoolul etilic, ceea ce le păstrează viabilitatea și
activitatea o perioadă mare de timp [560, 561];
- productivitate crescută a utilajului de fermentare prin creșterea densității populației de
celule și utilizarea unor debite mari de substrat în procesul de producție;
- posibilitatea reutilizării catalizatorului biologic în cicluri ferementative repetate[332];
- reducerea pericolului de contaminare a produsului de fermentare prin ușurința separării
biocatalizatorului la sfârșitul procesului prin simplă filtrare;
- posibilitatea trecerii la procese continui, cu avantajele binecunoscute: eficiență ridicată,
productivitate ridicată, costuri mai reduse de operare, control mai bun al procesului și
posibilitatea de automatizare și conducere pe calculator, etc.[494].
Imobilizarea celulelor de drojdie este încă mult explorată în industria alimentară
pentru producerea vinului şi a berii în procese fermentative continue. Sistemele particulate
sferice conținând celule de drojdie de bere pot fi considerate adevărate bioreactoare de mici
dimensiuni, ceea ce a impus utilizarea acestui termen - pe care îl vom folosi adeseori pe
parcursul lucrării -, în literatura de specialitate.
Cercetările raportate în prezentul capitol se referă la obținerea mai multor tipuri de
particule sferice pe bază de polianioniți de natură polizaharidică (simpli sau în amestec),
conținând celule de drojdie de imobilizate, prin gelifiere ionotropă - reticulare -, în prezența
a diferiți cationi metalici divalenți, printr-un proces de extrudere prin capilară.
Abordarea noastră în obținerea acestui tip de imobilizate are, în cea mai mare parte,
caracter original pe de o parte fiindcă sunt utilizate ca suport, în unele cazuri, amestecuri de
polizaharide anionice, și pe de altă parte fiindcă utilizează ca reticulanți cationi ai unor
metale divalente care după cunoștința noastră nu au mai fost semnalați în literatura
domeniului.
Trebuie menționat faptul că în compoziția tuturor biorectoarelor astfel obținute intră
gelanul, adăugat relativ recent la gama de agenți de gelifiere disponibili comercial având
119
utilizare în industria alimentară. Argumentele pentru utilizarea sa tot mai extensivă, nu doar
în domeniul alimentar ci și în cel farmaceutic, o constituie biodegradabilitatea, lipsa de
toxicitate, stabilitatea chimică pe un domeniu larg de valori de pH (pH = 2-10), rezistența la
numeroase enzime; aceleași argumente au stat la baza deciziei noastre de a-l folosi în
cercetările intreprinse în cadrul acestei lucrări de doctorat.
Prin reticulare ionică sau covalentă, gelanul poate include, datorită caracterului de
hidrogel al rețelelor formate, importante de compuși hidrofili, celule, microorganisme,
enzime etc. Există însă puține lucrări dedicate obținerii de hidrogeluri pe bază de gelan
reticulat ionic, destinate includerii de celule de drojdie. O excelentă trecere în revistă a
tehnicilor de obținere a particulelor de gelan prin gelifiere ionotropă sau complexare
polielectrolitică este realizată de Patil ș.a. [432], aplicația acestora constituind-o însă
realizarea de sisteme polimer-medicament cu eliberare controlată.
Rezultatele cercetărilor noastre au fost au fost grupate în 5 subcapitole, funcție de
natura ionului metalic utilizat ca reticulant sau de natura suportului (polizaharidă simplă sau
amestecuri de polizaharide).
6.1. Particule pe bază de gelan reticulat cu clorura de calciu conținând celule de
drojdie imobilizate
CaCl2 a fost ales ca agent de reticulare în acest studiu deoarece ionii de calciu pot
avea un rol în protejarea celulelor de drojdie împotriva efectelor toxice produse de etanol la
fel ca și ionii de magneziu sau zinc. Ionii de calciu, dacă sunt suplimentați în concentrații
mari, pot înlocui magneziul într-o serie de căi biochimice ceea ce poate conduce la o
creștere celulară și păstrarea viabilității celulare. Alte cercetări au reliefat faptul că
suplimentarea calciului în mediul de fermentare are un efect tampon ce împiedică creșterea
pH-ului în mediu ceea ce conduce la obținerea unei eficiențe mărite în fermentare.
Particulele obținute în cadrul studiului nostru au fost caracterizate din punct de vedere
morfologic, fizico-chimic iar activitatea lor fermentativă a fost testată și comparată cu cea a
drojdiei libere.
Formarea rețelei polimere care include în ochiurile sale celulele de drojdie, are la
bază interacțiile ionice realizate între grupările carboxilat ale gelanului și ionii de Ca2+
.
Celula de drojdie este un coloid încărcat electric, putând pierde această sarcină electrică sau
să-și schimbe semnul. Ea este încărcată pozitiv în stare normală, dar în mediul de
fermentare, după o perioadă de timp are loc înmugurirea sa iar celula își schimbă sarcina
electrică care devine negativă. La finele fermentării sarcina electrică redevine pozitivă. [561,
562] Ionul de calciu poate adera la membrana plasmatică celulară când este încărcată
120
negativ, conferindu-i acesteia mai multa stabilitate la factorii de stres care pot interveni în
procesele fermentative. [28, 31]. In acest mod, celulele de drojdie pot participa la
ranforsarea rețelei, crescându-i astfel stabilitatea mecanică. In principiu însă, dimensiunea
mai mare a acestora comparative cu raza ionică a Ca2+
determină împiedicări sterice care pot
influența negativ formarea rețelei si deci stabilitatea sa structurală. Trebuie găsit deci un
echiliberu între cantitatea de celule de drojdie imobilizată și cantitatea de reticulant folosit,
pentru a asigura o structură puternică, stabilă în timp.
Figura 32 prezintă schematic structura rețelei pe bază de gelan reticulat cu inii de Ca2+
conținând în ochiurile sale celule de drojdie.
Figura 32. Reprezentarea schematică a rețelei de gelan reticulat ionic, conținând celule de
drojdie în ochiurile sale.
Teste preliminare au probat faptul că particule obținute în absența celulelor de
drojdie prezintă o bună stabilitate structurală (mecanică), chiar și după perioade destul de
îndelungate de păstrare.
Indiferent dacă structura este foarte stabilă, și cu atât mai mult, mai slabă, este
posibil ca după realizarea reticulării unele fragmente de polimer sau celulele de drojdie să nu
fie bine prinse în rețeaua polimeră și să se desprindă de aceasta, ceea ce poate determina o
anumită turbiditate în soluția de reticulare.
Pentru a înțelege mai bine factorii predominanți asupra stabilității structurale a
particulelor, s-a efectuat mai întâi un studiu privind stabilitatea particulelor considerând
drept criteriu turbiditatea supernatantului în care sunt suspendate acestea, respective
măsurând transmitanța acestuia.
121
Gradul de reticulare, care determină stabilitatea structurală a rețelei, va determina
deci turbiditatea mediului de păstrare a particulelor. La rândul său, această caracteristică
structurală este funcție de cantitatea de ioni de Ca2+
utilizați ca reticulant. Ionii alcalini de Ca
pot fi introduși în polimer fie în stadiul de preparare a soluției de gelan (după cum s-a
precizat în paragraful 5.3, cu scopul de a crește ușor vâscozitatea acesteia și a permite
formarea de picături sferice la ieșirea din capilară), fie în stadiul de gelifiere ionotropă când
soluția de polizaharid este introdusă în picături în baia de coagulare.
6.1.1. Teste preliminare de obținere a particulelor de hidrogel
Anterior cercetărilor detaliate, s-a realizat un număr de teste preliminare cu scopul
de a stabili parametrii cei mai semnificativi de influență a proprietăților particulelor de
gelan, cu și fără celule imobilizate.
S-a constatat că unul dintre aceștia îl constituie cantitatea de ioni de Ca2+
, respectiv
raportul dintre cantitatea de gelan și cea de CaCl2, în etapa de pregelifiere (înainte de
extrudere). La o cantitate constantă de polizaharid (0,25 g) și drojdie (1,25 g), s-a adăugat un
volum de 1,25 ml soluție de CaCl2 de diferite concentrații. S-a constatat că un raport masic
de 3,3 mg CaCl2/g gelan permite obținerea unor particule mai stabile, turbiditatea
supernatantului în care s-au păstrat fiind mai miccă decât la utilizarea unui raport masic de
2,5 mg CaCl2/ g gelan. Concluzia firească este aceea că un număr mai mare de ioni Ca2+
la
prereticulare conduce la o mai buna stabilitate a particulelor finale. Valoarea menționată mai
sus a raportului nu trebuie depăsită, totuși, deoarece vâscozitatea soluției crește nedorit de
mult făcând greu posibilă extruderea prin capilară.
Reticularea devine intensă, influențând decisiv stabilitatea structurală a particulelor,
când picătura de soluție de gelan vine în contact cu o soluție mai concentrată de CaCl2 în
baia de extrudere. Ionii de Ca2+
din această soluție interacționează cu grupele carboxilat și cu
celulele de drojdie din suprafața picăturilor, contribuind la formarea unei rețele mai dense și
mai stabile, păstrând însă caracter de hidrogel ce îi permite absorbția unor cantități mari de
apă. Ca urmare, un alt parametru de ionfluență al stabilității particulelor îl constituie
concentrația ionilor de Ca2+
din baia de coagulare. Teste realizate la două concentrații
diferite de CaCl2 în baia de coagulare au relevat că valoarea transmitanței supernatantului
după 2 ore de păstrare a particulelor în acest mediu a fost de peste 91,5 %, crescând cu
concentrația reticulantului. Este un efect la care ne-am așteptat, cauzat de creșterea gradului
de reticulare ce implică în mai mare măsură atașarea în rețea a macromoleculelor de
polizaharid prin punțile ionice formate .
122
Un alt potențial factor de influență îl constituie raportul gravimetric dintre
cantitatea de drojdie de imobilizat și cea de gelan. Câteva experimente realizate pentru a
elucida această influență au indicat că un raport drojdie/gelan de 5/1 (g/g) permite cea mai
eficientă imobilizare. Supernatantul în care se află particulele astfel obținute prezintă o
valoare ridicată a transmitanței (> 90%). Peste această valoare, valoarea transmitanței scade
drastic. Koyama and Seki [428] au ajuns la aceeași concluzie: o cantitate mai ridicată de
celule de drojdie poate reduce rezistența rețelei, determinând detașarea unor fragmente din
rețeaua polimeră sau migrarea celulelor din imobilizat.
Pe baza acestor rezultate preliminare s-a efectuat un studio mai amplu de elucidarea
a influenței parametrilor importanți ai procesului la obținerea particulelor cu și fără cellule
imobilizate, care pot afecta proprietăți ale acestora precum: capacitatea de umflare în medii
apoase, morfologia, activitatea biocatalitică. Pornind de la raportul optim drojdie/gelan de
5/1 (g/g), a fost variată concentrația ionilor Ca2+
din soluția inytrodusă la pre-extrudere
(prereticulare) și în baia de coagulare.
Programul experimental și codul probelor realizate sunt prezentate în tabelul 10.
Tabel 10. Programul experimental și codul probelor *
*25 mL soluție de gelan, c =1 % (w/v)
**1.25 mL soluție de clorură de calciu
***125 mL ml soluție de clorură de calciu
Se discută în cele de mai jos influența parametrilor considerați în studiu asupra unor
caracteristici importante ale particulelor obținute.
Proba Concentrația
soluției de
CaCl2 la pre-
extrudere
(%, w/v)**
Concentrația
soluției de
CaCl2 în baia
de coagulare
(%, w/v)***
Fără
celule
Cu
celule
PD1 0.1 2
P2 PD2 0.3 2
PD3 0.4 2
PD4 0.5 2
P5 PD5 0.3 3
P6 PD6 0.3 4
123
6.1.2. Stabilitatea particulelor și viabilitatea celulară
După cum s-a precizat anterior,valorile transmitanței supernatantului în care s-au
păstrat particulele după extrudere constitiue o măsură a stabilitătții structurale a acestora.
Tabelul 11 prezintă valorile transmitanței pentru particulele cu și fără drojodie păstrate în
două medii: cel din baia de extrudere, respective apă bidistilată.
Table 11. Valorile transmitanței pentru două medii în care au fost păstrate
particulele cu și fără drojdie după extrudere, la diferite durate.
Proba
Transmitanța (%)
In soluția din
baia de
coagulare
In apă bidistilată
12 h 24 h. 12 h. 24 h. 36 h. 48 h
P2 95.6 95.2 99.1 98.3 97.5 95.9
P5 96.5 95.4 99.4 98.5 97.9 96.1
P6 96.5 95.6 99.8 99.2 98.7 96.3
Se constată că particulele sunt, în general, stabile, după cum probează valorile
ridicate ale transmitanței. După cum era de așteptat, cele mai stabile sunt particulele obținute
prin coagulare într-o soluție de CaCl2 concentrație 4% (P6).
Valorile transmitanței scad ușor cu durata de păstrare în mediul apos, pentru toate
probele. Particulele s-au dovedit a fi mai stabile în apă bidistilată, probabil și datorită
faptului că după păstrarea lor mai întâi în bala de coagulare fragmentele de polimer mai slab
prinse în rețea au fost deja îndepărtate.
Pentru particulele conținând celule de drojdie, turbiditatea a fost măsurată în
mediile diferite în care au fost păstrate. In acest caz, turbiditatea mediului lichid poate fi
influențată nu doar de fragmentele de polimer desprinse din rețea, dar și de celulele de
drojdie ce pot difuza din particule. Pentru aceste probe, transmitanța, concentrația celulelor
și viabilitatea celulară au fost determinate după 12 și 24 ore.
Tabelul 12 prezintă rezultatele obținute, în corelare și cu concentrațiile CaCl2
utilizate la pre-extrudere, respectiv cu durata de păstrare.
124
Tabel 12. Influența concentrației soluției de CaCl2 utilizată la pre-extrudere și a duratei de
păstrare asupra stabilității particulelor și a viabilității celulare.
Proba
Transmitanța (%)
Concentrația celulelor
(nr. celule/ml) x 104 în
supernatant
Viabilitatea celulară, %
În soluția
de CaCl2
din baia de
coagulare
În apă
bidistilată
În soluția
de CaCl2
din baia de
coagulare
În apă
bidistilată
În soluția
de CaCl2
din baia de
coagulare
În apă
bidistilată
12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h
PD1 97.9 95.9 99.2 98.3 7.75 9 3.5 4 100 97.3 100 94.1
PD2 97.9 97 99.4 98.8 10 13 3.5 5.5 100 98.1 100 95.6
PD3 98.7 93.4 98.7 97.4 17.5 42.5 10.5 13.3 100 98.8 97.7 96.7
PD4 93 91.5 97.6 97 30 45 13 16.3 99.2 98.4 98.1 95.6
Exceptând proba PD4 (cu concentrația de 0,5% CaCl2 în pre-extrudat și 2% CaCl2
în baia de coagulare), valorile transmitanței sunt ridicate, chiar mai mari decât în cazul celor
înregistrate pentru același tip de particule fără celule imobilizate, sugerând buna stabilitate
structurală a celor dintâi. Acest rezultat constituie și un argument indirect că celulele incluse
în rețeaua hidrogelului interacționează cu ionii de Ca2+
, stabilizând strutura particulei.
Transmitanța scade ușor cu durata de păstrare în mediul apos. Trebuie menționat căp
viabilitatea celulară este ridicată chiar și după mai mult de 24 de ore de păstrare în lichid;
valorile înregistrate sunt, în general, mai mari de 95%.
Concluzii similare rezultă dacă se analizează rezultatele prezentate în tabelul 13,
pentru particulele cu celule imobilizate obținute la diferite concentrații ale reticulantului în
baia de coagulare. Stabilitatea acestora rămâne ridicată în comparație chiar cu particulele
fără celule imobilizate, și crește ușor cu concentrația ionilor de Ca2+, consecință a difuziei
unei cantități mai mici de celule din rețeaua polimeră. Viabilitatea celulară scade și ea, dar
valorile rămân ridicate (>90%). Concentrații mai mici de celule difuzate se constată după 24
h în soluția de coagulare, înainte de transferul în apă bidistilată.
125
Tabel 13. Influența concentrației soluției de CaCl2 din baia de coagulare și a duratei de
păstrare asupra stabilității particulelor cu celule de drojdie și a viabilității celulare
Proba
Transmitanța (%)
Concentrația celulelor
(nr. celule/ml) x 104 in
supernatant
Viabilitatea celulară,
%
În soluția
de CaCl2
din baia de
coagulare
În apă bidistilată
În soluția
de CaCl2
din baia
de
coagulare
În apă
bidistilată
În soluția
de CaCl2
din baia
de
coagulare
În apă
bidistilată
12h 24h 12h 24h 36h 24h 12h 36h 24h 24h 36h
PD2 96.8 96 99.3 98.3 97.8 35 3.3 15 97.9 97 95.2
PD5 97 96.1 99.4 98.7 98.3 26.5 3.3 13.8 97.2 97 94.8
PD6 97.5 96.2 99.4 98.8 98.5 20 3 9.75 96.4 93.9 92.9
Utilizarea celulelor imobilizate în cicluri repetate de fermentare implică staționarea
lor perioade îndelungate de timp în mediul alcooloc format, ceea ce le poate distruge.
Examinând rezultatele prezentate în tabelul 14, se poate constata că valorile transmitanței
mediului alcoolic în care au fost suspendate particulele de imobilizat sunt încă ridicate chiar
și după 84 ore, cele mai mari înregistrându-se pentru particulele cu nivelul cel mai ridicat de
reticulare (PD6). S-a observat atunci când concentrația celulelor în supernatant a fost joasă,
viabilitatea celuară s-a menținut la valori ridicate.
Tabelul 14. Influența mediului alcoolic asupra stabilității în timp
a particulelor și viabilității celulelor de drojdie.
Proba Transmitanța (%)
Concentrația celulelor de
drojdie în supernatant
(nr. celule /ml x)
Viabilitatea celulară, %
12h 36h 60 h 84h 12h 36h 60h 84h 12h 36h 60 h 84h
PD2 97.8 96.6 95.8 94.7 16.3 20 25.8 38.3 98.5 96.4 97.2 96.8
PD5 98.4 97.4 96.8 96.1 8.8 12 14.3 21.3 97.2 96 95 94.4
PD6 98.7 97.8 97.3 96.5 8.3 10.5 11 18.8 97.1 95.5 95.7 93.8
126
Concluzia evidentă este aceea că particulele conținând cellule de drojdie
imobilizate sunt stabile în mediul alcoolic, ceea ce este o condiție importantă pentru
utilizarea lor în cicluri fermentative repetate.
6.1.3. Gradul de umflare
Particulele de gelan conținând celule de drojdie imobilizată pot fi considerate
adevărate bioreactoare de mici dimensiuni. Substratul de fermentare (în acest caz glucoza)
difuzează în matricea polimeră unde intră în contact cu celulele de drojdie. Difuzia este
influențată de capacitatea particulelor de a se umfla în mediul apos, deci în final de gradul
lor de reticulare. Difuzia produsului de fermentare – alcoolul etilic -, din particule este
influențată de aceeași caracteristică alor. S-a considerat util din acest motiv să se evalueze
abilitatea particulelor de a se umfla în medii apoase, pentru a o corela cu alte proprietăți,
inclusiv cu capacitatea de fermentare.
Figura 33 ilustrează variația gradului de umflare (Q, %) în timp, pentru particule de
gelan cu și fără drojdie imobilizată, obținute utilizând ca reticulant în baia de coagulere,
soluții de CaCl2 de diferite concentrații.
Rezultatele prezentate demonstrează valori ridicate ale gradului de umflare în apă,
indiciu puternic al caracterului de hidrogel al particulelor.
(a) (b)
Figura 33. Variația gradului de umflare in apă, în timp, pentru particule de gelan fără (a) și
cu (b) celule de drojdie imobilizate, obținute în diferite condiții de extrudere
Gradul maxim de umflare ca și viteza procesului (panta porțiunii liniare a curbelor)
scad cu creșterea concentrației reticulantului din baia de coagulare. Trebuie notat, de
asemenea, că valorile maxime ale umflare pentru particulele conținând celule de drojdie
imobilizate sunt mai coborâte decât ale particulelor (fig. 4 b) fără celule, pentru aceleași
condiții de extrudere. Efectul este datorat, evident, interacției suprafeței negative a celulelor
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 5 10
Gra
du
l d
e u
mfl
are
, Q
%
P2 P5 P6
Timp (h)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 10 20 30 40
PD2 PD5 PD6
Gra
du
l d
e u
mfl
are
, Q
%
Timp (h)
127
cu ionii de Ca2+, ceea ce contribuie suplimentar la reticularea matricii, după cum s-a mai
discutat anterior.
Rezultatele obținute sunt în deplină concordanță cu cele privind stabilitatea
structurală a particulelor, evaluată indirect prin transmitanța mediilor apoase în care au fost
suspendate. Particulele caracterizate de un grad maxim de umflare mai ridicat determină o
valoare mai ridicată a trransmitanței nu doar în mediile apoase în care au fost suspendate ci
și în alcool.
6.1.4. Morfologia particulelor
Informații importrante referitoare la morfologia particulelor, atât fără cât și cu cellule
imobilizate, au fost aduse de analiza prin microscopie electroniucă de baleiaj. Fotografiile au
fost realizate în secțiune, atât la probe umflate în apă cât și uscate, pentru mai multe
particule, dar pentru ilustraree au fost alese doar cele referitoare la particulele P2, respectiv
PD2, fiind prezentate în fig. 3.
Se constată că particulele fără celule de drojdie (fig. 34, A) prezintă o morfologie
poroasă în stare umflată, în timp ce particulele cu celule imobilizate (fig. 34 B) prezintă o
morfologie mai compactă, celulele fiind puternic ancorate în matricea polimeră, desigur
datprită și interacțiilor de natură ionică stabilite cu agentul de reticulare; ele prezintă tendința
de a forma aglomerate.
Morfologia acestor particule este și în accord cu comportarea lor la umflare, care
evidențiază valori mai coborâte ale gradului maxim de umflare pentru acest tip de particule.
Celulele de drojdie sunt relative uniform distribuite în matricea polimeră, și se poate
constata că aceasta le acoperă cu un strat subțire (fig. 34 C).
Toate rezultatele prezentate anterior probează faptul că particulele de gelan conțin un
mare număr de celule, matricea polimeră protejandu-le și fixându-le puternic, ceea ce
permite să anticipăm că aceste bioreactoare ar putea fi utilizate cu secces în cicluri repetate
de fermentare.
128
Figura 34. Fotografii de microscopie electronică de baleiaj pentru particulele de tip P2 și
PD2 umflate în apă (A) sau uscate (B).
6.1.5. Activitatea fermentativă a biorectoarelor
Scopul obținerii imobilizatelor a fost acela de utilizare a lor în procese de
fermentare a glucozei, ceea ce a impus evaluarea lor realizate în diferite condiții de a cataliza
reacția în corelare cu parametrii procesului de obținere, și îndeosebi de a verifica dacă sunt
capabile de a fi utilizate în cicluri fermentative repetate.
Au fost selectate pentru acest studiu două tipuri de imobilizate, ceracterizate de
grade de reticulare diferite, respectiv PD2 și PD5. Rezultatele obținute sunt prezentate în fig.
35, care ilustrează variația randamentului de transformare a glucozei în timp, pentru 5 cicluri
fermentative repetate, la cele două tipuri de biorecatoare, comparativ cu fermentarea în
prezența drojdiei libere.
A - P2 particule umflate în apă
B - PD2 particule cu celule imobilizate, umflate în apă
C - PD2 particule cu celule imobilizate, uscate
129
(a) (b)
Figura 35. Variația în timp a randamentului de fermentare a glucozei pentru 5 cicluri, în
prezența bioreactoarelor de tip PD2 (a) și PD5 (b) comparativ cu fermentarea în prezența
drojdiei libere (curba 0 din diagrame)
Se constată că după 255 minute (durata unui clclu), randamentul de fermentare
obținut cu ambele tipuri de imobilizate este superior celui obținut în prezența drojdiei libere.
Un randament superior se obține cu particulele PD2 comparativ cu PD5, pentru toate cele 5
cicluri fermentative (fig. 4 a). O explicație plauzibilă este aceea poate fi pusă pe seama
gradului diferit de reticulare al celor două tipuri de paticule. In mod evident, procesul de
fermentare este catalizat de celulele de drojdie imobilizate în matricea polimeră, și doar unm
mic procent este datorat fermentării declanșate de cellule libere din mediu, care sunt în
număr mic (după cum s-a probat anterior) și nu pot justifica randamentele ridicate de
transformare a glucozei. Substratul (soluția de glucoză) difuzează în matricea de hidrogel
unde intră în contact cu celulele imobilizate, suferind transformarea. Intensitatea difuziei
este determinată de densitatea rețelei reticulate; difuzie mai intensă și mai rapidă se produce
printr-un hidrogel cu grad ai redus de reticulare. Rezultă că difuzia substratului prin matricea
de tip PD2 este mai intensă, ceea ce explică randamentele de fermentare mai ridicate, în
perfectă concordanță cu valorile gradului de umflare și a transmitanței celor două tipuri de
particule. Reamintim că în ambele tipuri de particule se află imobilizată aceeași cantitate de
celule de drojdie, iar concentrația și volumul soluției de glucoză supusă fermentării au fost
aceleași în ambele cazuri.
Cercetările anterioare au arătat că pentru particulele de alginat reticule ionic cu
CaCl2 concentrația optima din baia de gelifiere care determină obținerea de randamente
optime în procesul de fermentare a fost de 2 %. Un grad de reticulare mai mic conduce la un
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 100 200 300
1
2
3
4
5
0
Timp (min)
Ra
nd
am
entu
l în
glu
coză
ferm
enta
tă, η
%
0
10
20
30
40
50
60
70
0 100 200 300
Ran
dam
entu
l în
glu
coză
ferm
enta
tă,
η%
Timp (min)
1
2
3
4
5
0
130
transfer de masă mai mare datorită difuziei substratului la celulele de drojdie din interiorul
matricei [439]. Limitarea transferului de masă este o problemă în imobilizarea celulelor prin
metoda includerii deoarece celulele iși pot păstra viabilitatea ridicată și se poate obține o
productivitate mare în etanol doar dacă există un schimb eficient între nutrienți si particule.
[405].
Constatarea cea mai importantă rezultată în urma acestui studio este aceea că
particulele de imobilizat pot fi utilizate în cicluri repetate de fermentare, după separarea
facilă prin filtrare și spălarea cu apă bidistilată, în urma fiecărui ciclu realizat. Figura 36
prezintă valoarea randamentelor maxime de fermentare (după 255 min) obținute după 10
cicluri fermentative. O observația surprinzătoare este aceea că randamentul obținut cu
bioreactoarele de tip PD2 sunt mai mari pentru ciclurile 2 și 3, comparativ cu primul.
Același fenomen s-a constatat și pentru ciclul 2 al probei PD3. Explicația poate fi legată de
faptul că celulele imobilizate în cele două matrici suferă un proces de multiuplicare după
primul ciclu de fermentare, efect ce a fost verificat ulterior pentru alte tipuri de imibolizate
prezentate în această lucrare. Pentru ambele tipuri de particule fermentarea a continu at
timp de 10 cicluri; randamentele maxime atinse sunt prezentate în fig. 36.
(a) (b)
Figura 36. Valoarea maximă a randamentului de fermentare a glucozei (după 155 min),
pentru 10 cicluri repetate, la probele PD2 (a) și PD5 (b).
Pentru proba PD5 se poate aprecia că randamentul de fermentare rămâne practic constant
(cu excepția discutată anterior) pentru cele 10 cicluri; particulele PD5 prezintă însă fluctuații
mai mari ale valorii randamentului de fermentare pe parcursul celor 10 cicluri. Randamentul
în fermentare la proba PD5 nu variază foarte mult deoarece gradul de reticulare al
particulelor este mai mare iar particulele sunt mai stabile.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1 2 3 6 7 8 9 10 0 Numărul de cicluri de fermentare
Randam
entul în glucoză
fermentată, η
%
0
10
20
30
40
50
60
70
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0
Numărul de cicluri de fermentare
Ran
dam
entu
l în
glu
coză
ferm
enta
tă, η
%
131
Trebuie totuși menționat că, în toate cele 10 cicluri fermentative realizate cu ambele
tipuri de particule, se obțin randamente superioare comparativ cu cel realizat în prezența
drojdiei libere.
Rezultate similare privind variația randamentului în fermentare au fost observate și
de alți cercetători. Mariam și colab, 2009 a obținut microbioreactoare de alginat de sodiu cu
celule de drojdie imobilizate obținute prin reticulare ionică utilizând ca agent de reticulare
clorura de calciu care au fost testate din punct de vedere al activității fermentative. Numărul
maxim de cicluri de fermentare a fost de 6 iar o valoare maximă a randamentului de
fermentare s-a observat după al 4-lea ciclu de fermentare după care randamentul scade
brusc. Explicația dată pentru acest comporament a fost că microbioreactoarele devin
instabile după al 4-lea ciclu de fermentare și își schimbă forma [440].
Pentru a stabili dacă particulele sunt stabile în mediul de fermentare după fiecare
ciclu de fermentare, a fost determinat, pe baza curbei de calibrare, numărul celulelor de
drojdie din mediul de reacție și cantitatea lor. Se cunoaște cantitatea inițială de celule de
drojdie care a fost imobilizată ca fiind 30% din 1.25 g, mai exact 0.375 g. Prin diferență cu
cantitatea de celule ce se găsește în mediul de fermentare după fiecare ciclu fermentativ, se
poate deterimina teoretic cantitatea de celule rămasă în particule, neglijând totuși posibila lor
proliferare. Prin această evaluare s-a dorit a se evidenția îndeosebi faptul că celulele sunt
bine ancorate în matricea polimeră și nu difuzează în măsură mare în mediul de fermentare
chiar și după mai multe cicluri fermentative.
Pentru exemplificare, în tabelul 6 sunt prezentate rezultatele referitoare la
imobilizatele de tip PD5.
132
Tabel 15. Cantitatea de celule de drojdie rămase în particule
după fiecare din cele 10 cicluri fermentatiove
Numărul ciclului de fermentare
Cantitatea de celule
(g) în 10 ml soluție
(în baia de
fermentare) x 104
Cantitatea de
celule rămase în
particule (g)
I 1.667 0.3743
II 3.196 0.374
III 0.835 0.3739
IV 0.879 0.3738
V 0.556 0.3737
VI 1.019 0.3736
VII 1.7139 0.3735
VIII 0.602 0.3734
IX 0.509 0.3734
X 0.162 0.3732
Se constată din datele prezentate în tabel că numărul de celule care difuzează din
particule (în fapt, cantitatea lor) este foarte mic în comparație cu cantitatea de celule care
rămân prinse în rețeaua polimeră. Se poate deci afirma că particulele sunt stabile și pot fi
utilizate în mai multe cicluri fermentative repetate.
6.1.6.Evaluarea viabilității celulare și a cantității de celule din particule după fiecare ciclu de
fermentare
Păstrarea viabilității celulare în timpul procesului de fermentare este o condiție
esențială pentru ca particulele să poată fi utilizate în mai multe cicluri fermentative. In
tabelul 16 sunt prezentate valorile viabilității celulare și numărului/cantității de celule de
drojdie rămase în particule (stabilite după dezagregarea mecanică a imobilizatelor), în
funcție de numărul ciclului de fermentare (considerat selectiv).
133
Tabel 16. Viabilitatea celulară și cantitatea de celule/gram de particule
determinate după diferite cicluri de fermentare repetate, pentru proba PD2.
Numărul
ciclului de
fermentare
Numărul de
celule/g
particule x
108
Cantitatea
de celule
din particule
(mg/g)
Viabilitatea
celulară, %
0 4,81 17,81 94,16
1 5,9 21,86 94,9
2 5,97 21,86 95,3
4 6,44 23,71 92,24
8 7,56 27,78 90,16
9 6,4 23,71 90,36
10 5,95 22,04 90,26
Viabilitatea celulară din particule tinde să scadă de la un ciclu la altul. O creștere ușoară se
observă la ciclurile 1 și 2 determinată de proliferarea celulelor. Valorile mari ale viabilității
celulare demonstrează că matricea polimeră protejează celulele de drojdie de factorii care
pot să afecteze creșterea celulară. În figura 8 este prezentată evoluția randamentului maxim
de fermentare în corelare cu cantitatea de celule din particule după fiecare ciclu de
fermentare. Rezultatele prezentate în tabelul 7 și fig. 8 atestă că celulele din matricea
polimeră nu diminuiază de la un ciclu la altul ci chiar proliferează în interiorul particulelor.
Există o bună concordanță între cantitatea de celule din particule și evoluția randamentului
în fermentare. După ciclul 6 de fermentare randamentul începe să scadă, la fel ca și
cantitatea de celule din particule.
Figura 37. Evoluția cantității de celule (mg)/g particule în funcție de numărul ciclului de
134
fermentare pentru proba PD2 în corelare cu randamentul maxim obținut după fiecare ciclu
de fermentare.
Rezultatele obținute demonstrează, de asemenea, că gradul de reticulare al
particulelor este optim asigurând o porozitate adecvată, necesară pentru un schimb eficient
de nutrienți între mediul de fermentare și celulele din interiorul particlelor. Randamentele în
fermentare obținute sunt optime, comparabile cu cele obținute la fermentarea cu drojdia
liberă, iar particulele pot fi cu ușurință recuperate din fermentator și reutilizate în mai multe
cicluri fermentative.
6.1.7. Productivitatea specifică și viteza de fermentare
Curbele cinetice de fermentare au o alură practice liniară, ceea ce permite cu
ușurință estimarea vitezeri procesului, exprimată ca procent de glucoză transformată în
unitatea de timp. Pe baza lor se poate evcalua, de asemenea, productivitatea specifică în
etanol (g etanol/g drojdie x h, din particulele de imobilizat).
Valorile acestor caracteristici sunt prezentate în tabelul 17. Este interesant faptul că
valorile productivității specifice sunt practice aceleași pentru cele mai multe dintre ciclurile
de fermentare, și sunt comparabile sau chiar superioare celei corespunzătoare fermentării în
prezența celulelor de drojdie libere.
Tabel 17. Valorile vitezei de fermentare și ale productivității specifice
în etanol pentru imobilizatele PD2 and PD3, pentru cele 10 cicluri de fermentare.
Numărul
ciclului de
fermentare
Viteza de fermentare
(% glucose
transformată /min)
Productivitatea
specifică în etanol
(g etanol / h .g
drojdie)
PD2 PD3 PD2 PD3
1 0.24 0.27 0.6 0.6
2 0.31 0.27 0.97 0.8
3 0.29 0.22 1.07 0.6
4 0.2 0.2 0.6 0.6
5 0.22 0.2 0.6 0.6
6 0.27 0.2 0.83 0.6
7 0.24 0.2 0.6 0.6
8 0.22 0.16 0.6 0.6
9 0.18 0.16 0.6 0.5
10 0.2 0.2 0.6 0.6
Drojdie liberă 0.07 0.6
135
Concluzii
Gelanul constuituie o matrice convenabilă pentru imobilizarea celuleor de drojdie,
fiind ușor de reticulat cu ioni de Ca2+, conducând la particule stabile în medii apoase sau
alcoolice, astfel încât pot fi utilizate într-un număr ridicat de cicluri de fermentare.
Stabilitatea particulelor este ușor influențată de cantitatea de reticulant introdus în
soluția de polizaharid înainte de extrudere, sau în baia de coagulare.
Agentul de reticulare influențează, totuși, comportarea particulelor în medii apoase
prin gradul de reticulare atins, care la rândul său deterină intemnsitatea difuziei substratului
către celulele imobilizate.
Particulele fără celule de drojdie prezintă o morfologie ușor poroasă, care devine
mai compactă în prezența celulelor de drojdie ce pot participa la reticulare.
Studiul demonstrează potențialul bioreactoarelor obținute de a fi utilizate în procese
de ferementare repetate, cu eficiență ridicată, superioară chiar drojdiei libere; ele pot fi luate
în considerare în procese fermentative continue ale glucozei, de interes pentru industria de
profil.
6.2. Particule pe bază de gelan reticulat cu acetat de magneziu conținând celule de
drojdie imobilizate
Magneziul, metal divalent din aceeași grupă cu calciul, face parte din clasa
metalelor alcalino-pâmăntoase cu electropozitivitate destul de ridicată care îi imprimă și
reactivitate mare. El poate participa, ca si calciul, la formarea de legături ionice suficient de
puternice, argument important pentru a-l selecta ca agent de reticulare ionică a gelanului. Pe
lângă acest argument, s-a ținut cont și de alte avantajele aduse de magneziu și de sarea pe
care am selectat-o ca reticulant – respectiv acetatul de magneziu -, comparativ cu clorura de
calciu utilizată anterior.
Avantajele utilizării magneziului pentru creșterea celulară și în procese
fermentative sunt multiple. Ionul de magneziu este un ionul metalic cel mai abundent
implicat într-o gamă largă de procese metabolice [29, 30]. El constitue cam 0,3% din
întreaga cantitate de drojdie uscată și activează peste 300 de enzime [22, 33, 48]. Menținerea
integrității celulare, ceea ce include stabilizarea structurală a acizilor nucleici, a
polinucleotidelor, a cromozomilor, polizaharidelor și lipidelor a fost atribuită magneziului
[27]
136
Magneziul este absorbit in mod activ de către celulele de drojdie din mediul de
fermentare pentru a îndeplini roluri fiziologice esențiale [28] și este necesar pentru activarea
unor enzime glicolitice cum ar fi glucokinaza, glucoză-6-fosfat dehidrogenaza, fosfoglicerat
kinaza și enolaza; rolul ionului metalic de a ajuta la creșterea celulară și la protejarea celulei
în timpul fermentării este cunoscut [27]. Deficiența de magneziu din mediu poate conduce la
încetinirea metabolismului drojdiei iar o consecință poate fi incetinirea sau oprirea
procesului fermentativ [28] Ionul magneziu favorizeaza proliferarea celulelor de drojdie
constituind un factor de creștere (până la o anumită concentrație).
Ionul CH3COO-, spre deosebire de ionul Cl
-, favorizează deplasarea echilibrului
reacției de schimb ionic spre formarea rețelei, ceea ce conduce la structuri mai stabile din
punct de vedere mecanic. La concentrații sub 0,7 % (masic) nu afectează viabilitatea
celulelor, spre deosebire de ionul de Cl-.
La aceste caracteristici se adauga, desigur, lipsa de toxicitate a reticulantului
utilizat.
Un ultim argument îl constituie faptul că, după informațiile noastre, în literatura nu
este semnalată obținerea de imobilizate de celule de drojdie în matrici de gelan reticulat cu
ionul magneziu.
Așadar, cercetarea de față are ca scop obținerea de particule sferice cu caracter de
hidrogel conținând celule de drojdie, pe bază de gelan reticulat ionic – gelifiere ionotropă -,
printr-un proces de extrudere, utilizând ca agent de reticulare acetatul de magneziu.
Particulele obținute sunt caracterizate fizico-chimic și morfologic, din punct de vedere al
stabilității structurale, al activității biocatalitice, al posibilității de a fi utilizat în cicluri
fermentative repetate, al productivității specifice.
Realizarea imobilizatelor de drojdie în matricea de gelan are la bază fixarea
celulelor de drojdie în ochiurile rețelei formate prin reticularea polizaharidului, ca urmare a
legării ionice a cationilor de magneziu la anionii carboxilat ai gelanului. Reacția de
bazaăeste urmatoarea:
Mg2+
(-OCOCH3)2 + 2 Gelan-COO
-Na
+ Gelan-COO
- Mg
2+ -OCO-Gelan + 2Na
+
+2CH3COO-
Structura rezultată este reprezentată schematic in fig. 38.
137
Figura 38. Prezentarea schematica a structurii imobilizatelor de celule de drojdie (bulinele
albastre) in sfere de gelan reticulat cu cationi de Mg2+
.
In scopul stabilirii condițiilor optime de obținere a particulelor au fost luați în
considerare mai mulți parametri, pornind de la informațiile obținute în urma studiului
privind reticularea gelanului cu ioni de Ca 2+
și anume:
- concentrația solutiei de gelan: 0.8%, 1%, 1.15%, 1.3 % (w/v)
- concentrația soluţiei de Mg(OCOCH3)2 în preextrudat (v = 0,5 ml): 0.2%, 0.4%, 0.6%,
0.8% (w/v)
- concentrația soluţieide Mg(OCOCH3)2 în care se face extruderea (v = 50 ml): 1%, 2%, 3%,
4% (w/v)
Majoritatea particulelor au fost obţinute prin extrudere în capilară (ac de seringă) cu
diametrul interior de 600 microni şi lungimea de 30 mm. Incercarea de utilizare a unei
capilare cu diametrul de 800 microni, la o lungime de 40 mm, conduce la sfere cu diametru
mai mare, mai puțin stabile în mediu apos (valori mai reduse ale transmitanţei). In toate
cazurile, particulele obţinute sunt sferice şi au dimensiuni cuprinse între 2.5 si 3.7 mm în
funcţie de valoarea parametrilor procesului și de caracterristicile capilarei. In fotografia din
fig. 10 sunt prezentate, comparativ, particule sferice de gelan fără (a) și cu drojdie
imobilizată (b), obținute la aceleași valori ale parametrilor procesului de extrudere (proba P5
din tabelul 18).
a b
138
Fig. 39. Fotografie prezentând aspectul particulelor de gelan reticulat cu
ioni de Mg2+
fără (a) și cu (b) drojdie imobilizată
In tabelul 18 sunt prezentate câteva dintre probele obținute, cu codificarea lor,
valorile concrete ale parametrilor procesului de extrudere și diametrul particulelor.
Tabelul 18. Tipuri de particule de gelan obținute prin gelifiere ionotropa: parametrii
procesului de obținere prin extrudere si diametrul lor mediu.
Se constată o influență că parametrilor procesului de extrudere luați în considerare
influențează diametrul particulelor obținute. Astfel, creșterea concentrației soluției de
polimer determină creșterea ușoară a diametrului sferelor (probele P1-P3), efect firesc dat
fiind faptul că reticularea, care se face pe seama aceleiași cantități de reticulant din
preextrudat și din baia de extrudere, devine mai puțin intensă. Efectul cel mai pronunțat îl
produce concentrația soluției de reticulant în preextrudat (probele P4 – P7; P11 ; p13), când
diametrul scade de la 3,3 la 2,5 mm. Cantitatea de reticulant din baia de extrudere contribuie
la reticularea suplimentară a gelanului din particulă, dar mai ales la suprafața acesteia, căreia
îi conferă stabilitate mecanică; diametrul particulei scade cu creșterea concentrației
Proba Caracteristicile
capilarei
(diametru x
lungime)
(mm/mm)
Concentrația
Soluției de
gelan
(g/100 ml )
Concentrația
soluției de
Mg(OCOCH3)2î
n preextrudat
( g/100 ml )
Concentrația soluției
de Mg(OCOCH3)2
în baia de extrudere
(g/100 ml )
Diametrul
mediu al
particulei
(mm)
P1 0.6 x 30 0.8 0.4 2 2.5
P2 0.6 x 30 1.15 0.4 2 2.6
P3 0.6 x 30 1.3 0.4 2 3.0
P4 0.6 x 30 1 0.2 2 3.3
P5 0.6 x 30 1 0.4 2 2.8
P6 0.6 x 30 1 0.6 2 2.7
P7 0.6 x 30 1 0.8 2 2.5
P8 0.6 x 30 1 0.4 1 3.1
P9 0.6 x 30 1 0.4 3 2.6
P10 0.6 x 30 1 0.4 4 2.5
P11 0.8 x 40 1 0.4 1 3.7
P12 0.8 x 40 1 0.4 2 3.0
P13 0.8 x 40 1 0.8 2 2.6
139
reticulantului în baia de extrudere (probele P8, P5, P9, P10; P11-P12). Caracteristicile
geometrice ale capilarei influențează diametrul particulelor, ăn sensul creșterii acestuia cu
creșterea diametrului (lungimea capilarei nu variază semnificativ) (probele P8, P11).
Pentru caracterizarea ulterioară a particulelor, au fost luate în considerare doar cele
obținute prin extrudere prin capilara cu caracteristicile diametru/lungime = 0.6/30
(mm/mm).
6.2.1. Morfologia particulelor
Influența observată anterior, a cantității agentului de reticulare asupra dimensiunii
particulelor de imobilizat a impus analiza morfologică a acestora, prin microscopie
electronică de baleiaj. S-a constatat o influență evidentă a cantității de reticulant utilizat
asupra acestei caracteristici. Pentru ilustrare (fig. 40) s-au reținut probele P9 si P10, care
diferă prin cantitatea de reticulant utilizat în baia de coagulare.
Este evident din analiza fotografiilor, indiferent de rezoluție, că proba P10 are o
structură mai compactă, determinată de utilizarea unei cantități mai mari de reticulant.
Figurile relevă, de asemenea, prezența matricii de gelan reticulat care ancorează celulele de
drojdie, cu caracter mai poros în cazul probei P9. In concordanță cu aspectul morfologic
sunt unele proprietati fizico-chimice, precum stabilitatea structural, comportarea la umflare
in medii apoase, stabilitatea mecanica, ce vor fi discutate în cele ce urmează.
140
a b
Fig. 40. Fotografii de microscopie electronică de baleiaj
ale particulelor P9 (a) și P10 (b) (trei rezoluții)
6.2.2. Stabilitatea în apă şi viabilitatea celulară
Pentru a aprecia stabilitatea particulelor obținute determinată de o structurare mai
mult sau mai puțin puternică a lor, s-a considerat utilă și semnificativă, la fel ca în cazul
reticulării cu ionul Ca2+, în primul rând determinarea turbidității (transmitanței) mediilor
apoase în care acestea sunt obținute, respectiv păstrate. Evident, valori ridicate ale
transmitanței sugereaza stabilitate ridicată a particulelor, tradusă prin puține fragmente de
gelan care se desprind din acestea. In cazul imobilizatelor, transmitanța poate fi afectată și
de trecerea în mediul lichid a unor celule nefixate în rețeaua polimeră.
Valorile mari ale transmitanţei obținute în urma determinărilor atestă faptul că
particulele sunt stabile în timp atât în soluţia de extrudere cât şi în apă bidistilată; câteva
rezultate sunt prezentate in Tabelul 19.
141
Tabel.19. Valorile transmitanței soluției de extrudere, respectiv a apei bidistilate în care s-au
păstrat câteva dintre particulele obținute
Proba Concentrația
soluției de
gelan
(g/100 ml)
Concentrația
soluției de
Mg(OCOCH3)2în
preextrudat
( g/100 ml)
Concentrația
soluției de
Mg(OCOCH3)2în
baia de extrudere
(g/100 ml)
Transmitanța T (%)
în soluția de
extrudere în apă bidistilată
30 min.
12
h. 3 h. 12h. 24 h.
P4 1 0,2 2 99,6 98,8 98,5 97,0 95,6
P5 1 0,4 2 99,8 99,0 99,0 98,2 96,7
P9 1 0,4 3 99,2 99,1 99,1 99,0 97,9
P10 1 0,4 4 99,8 99,3 99,1 99,0 98,2
Transmitanţa în soluţia de extrudere este de peste 99% după 30 de minute scăzând
ușor după 12 h, ccea ce sugerează prinderea în rețea a întregii cantități de gelan, dar și
imobilizarea practic totală a cantității de drojdie supusă încapsulării. Păstrarea probelor în
apă bidistilată, după separarea din supernatantul din baia de extrudere, evidențiază o scădere
treptată a transmitanței cu durata de păstrare (între 3 si 24 ore), valoarea acesteia rămânând
totuși ridicată. Valorile cele mai mari ale transmitanței se înregistrează la particulele mai
reticulate, respectiv cele cu mai mult reticulant fie în preextrudat (P2) fie în baia de
extrudere (P10). Efectul este firesc, datorită faptului că macromoleculele de gelan sunt mai
bine fixate în rețea o dată cu creșterea cantității de Mg(OCOCH3)2.
Valorile transmitanţei sunt mai reduse la particulele cu drojdie încapsulată (Pi+D)
în comparaţie cu cele înregistrate la particulele obținute în aceleași condiții fără drojdie, dar
totuşi sunt destul de ridicate, ceea ce conduce la concluzia că drojdia a fost imobilizată
eficient în rețeaua polimeră (Tabelul 20).
142
Tabel 20. Valorile transmitanței soluției de extrudere, respectiv a apei bidistilate în care s-au
păstrat câteva dintre particulele obținuteconținînd drojdie încapsulată, în corelare cu
concentrația celulelor în cele două medii și cu viabilitatea celulară
În cazul păstrării particulelor în soluţia de acetat de magneziu din baia de extrudere
valorile transmitanţei au fost cuprinse între 86,5-99,8 (dupa 4 h) scăzând ușor cu durata
păstrării (86.5-98.8). Transmitanța crește cu creșterea concentrației reticulantului atât ăn
preextrudat (probele P4+D, P5+D) cât și în baia de extrudere (P9+D, P10+D), atât la
păstrarea în supernatantul din baia de extrudere, cât și în apa bidistilată, indiferent de durata
păstrării.
Desigur, cele mai mici valori ale transmitanței se înregistrează la păstrarea mai
îndelungată în apă (24 h). Transmitanța este corelată foarte bine cu concentrația celulelor
care au părăsit imobilizatul, respectiv cu gradul de reticulare al matricei de gelan. Se
constată că atât în supernatantul continând reticulant, cât și ulterior, la păstrarea în apă
distilată, concentrația celulelor libere scade cu gradul de reticulare, și crește cu durata
păstrării iîn aceste lichide (transmitanța variază invers proporțional).
Deși numărul de celule care părăsesc matricea polimeră scade cu creșterea gradului
de reticulare a acesteia, numărul de celule moarte din totalul de celule libere crește ușor
(viabilitatea celulară scade, atât în supernatantul de la extrudere cât și în apa distilată).
Efectul este logic: creșterea gradului de reticulare determină difuzia mai dificilă a
nutrienților către celulele de drojdie imobilizate în matrice, astfel încât acestea mor
Proba
Transmitanța, T%
Concentraţia celulelor de
drojdie/ml x 104 in
supernatant
Viabilitatea celulară, %
în soluție de
Mg(OCOCH3)2 în apă bidistilată
în soluția de
Mg(OCOCH3)2
în apă
bidistilată
în soluția de
Mg(OCOCH3)
2în
în apă
bidistilată
4h 12h 4h 12h 24h 12h 12h 24h 12h 12h 24h
P4+D 93,7 86,5 94 85,3 86,4 16,5 38 58,5 96 95,73 94,15
P5+D 96,3 94,8 96,8 90,2 88 10,75 11 23,5 93 93,18 93,49
P9+D 97,7 96,4 97,4 96,4 95 6,25 9,25 18,5 92 89,19 88,24
P10+D 99,8 98,8 98,3 96,7 95,5 2,5 6 14,5 90 88,07 87,93
143
(autoliză) în măsura mai mare, și se regasesc printre celulele ce părăsesc matricea în
proporție mai ridicată (viabilitatea celulară scade).
6.2.3. Stabilitatea în soluții alcoolice și viabilitatea celulară
Incapsularea celulelor de drojdie în gelan, ca și în alți polimeri, are ca efect printre altele
protejarea biocatalizatorului de mediile, uneori agresive, în care lucrează. Acest efect
permite reutilizarea imobilizatelor în cicluri fermentative succesive. Se impune însă ca
imobilizatele sa fie stabile în soluții alcoolice (formate în urma fermentării) cu concentrația
de minim 80 g/l, care să justifice separarea alcoolului prin distilare și să permită reutilizarea
lor. Pentru acest motiv, câteva tipuri de particule au fost analizate din punct de vedere al
stabilității într-o soluție alcoolică de 100g/l, această proprietate fiind evaluată, ca și în cazul
anterior, prin monitorizarea transmitanței mediului alcoolic în care au fost suspendate sferele
de gelan cu drojdie încapsulată, la diferite durate (între 12 si 84ore). Rezultatele obținute
sunt prezentate în Tabelul 21.
Tabel 21. Valorile transmitanței soluției alcoolice (100 g/l), în care au fost suspendate câteva
dintre particulele obținute, conținând drojdie încapsulată
Probe
Transmitanța în alcool
T%
Concentraţia celulelor
de drojdie/ml x 104 Viabilitatea celulara, %
12h 36h 60 h 84h 12h 36h 60h 84h 12h 36h 60 h 84h
P5+D 99,2 98,3 98 97,6 3 3,5 4,5 5,5 100 93,3 90 88
P9+D 99,4 99,1 98,3 97,8 2,75 3,5 4 5,25 100 93,3 94,11 91,3
P10+D 99,7 99,4 99 98,1 2 2,5 3,5 4 100 90,9 93,33 88,88
Se constată că matricea polimeră protejează celulele de drojdie imobilizate de metaboliții
toxici din etanol și le păstrează viabilitatea celulară mai mult timp, la valori ridicate.
6.2.4. Caracteristicile de umflare în apă
Sferele de gelan obținute prin gelifiere ionotropă prezintă un evident caracter de
hidrogel, astfel încât caracteristicile lor de umflare în apă sunt importante atât pentru
stabilitatea lor, cât și pentru utilizarea ulterioară în fermentare, unde se impune ca substratul
(glucoza) să poata difuza la celulele de drojdie prinse în rețeaua polimeră.
144
Comportamentul în apă al particulelor cu și fără celule de drojdie, s-a evaluat prin gradul de
umflare (Q, %). S-au utilizat pentru această determinare doar o parte din probe (P4, P5, P9,
P10), respectiv cele mai stabile (care au valori mai mari ale transmitanţei) şi cu diferite
concentraţii fie in preextrudat, fie în baia de extrudere. Gradul de umflare a fost determinat
în două variante:
Variația in timp a gradului de umflare determinat prin uscarea treptată a particulelor
la temperatură constantă, este reprezentată în fig. 41.
a b
Figure.41. Variația în timp a gradului de umflare în condițiile uscării unor particule până la
greutate constantă. a – particule fără drojdie; b – particule cu drojdie.
Se constată că proba cea mai reticulată (P10) prezintă valorile cele mai coborâte
ale gradului de umflare, efectul fiind determinat de gradul lor mai ridicat de reticulare.
Evoluții apropiate ale acestei proprietăți prezinta celelalte trei tipuri de particule (Fig. 41, a).
La un grad de reticulare identic, particulele încărcate cu drojdie prezintă valori mai coborâte
ale gradului de umflare, efect care sprijină, indirect, ipoteza că între grupele funcționale ale
polimerului și cele ale proteinei din compoziția drojdiei se manifestă interacții puternice, la
care se adaugă cele dintre ionii de Mg2+
și celulă având drept consecință creșterea densității
rețelei polimere (Fig. 41 b). În cazul probei P10 acest efect este însă mai putin evident,
comportarea sa fiind foarte apropiată de cea a celorlalte trei tipuri de particule, probabil
datorită faptului ca densitatatea maximă a rețelei este asigurată de cantitatea mare de
reticulant ionic, iar interacțiunile dintre drojdie și gelan contribuie doar în măsură
neînsemnată la creșterea densității de reticulare.
Determinarea gradului de umflare prin suspendarea particulelor inițial uscate
perfect, în apă distilată și cântărirea lor după diferite perioade de timp, a condus la rezultate
diferite. Se constată că procesul de pierdere, respectiv reținere de apă nu sunt reversibile.
Uscarea probelor conduce la formarea de legături puternice de hidrogen între lanțurile de
145
gelan, accentuând reticularea matricei; ca urmare, valoarea gradului de umflare obținută prin
imersarea în apă a particulelor este inferioară celei obtinută prin varianta anterioară, pe toată
durata de studiu a procesului (Figura 13). Evident însă, gradul de umflare scade cu creşterea
densităţii de reticulare (probele P1, P2, P10).
a b
Figura 42. Variația în timp a gradului de umflare în condițiile umflării unor particule ce nu
conţin drojdie (a) și la cele care conțin celule de drojdie (b) pînă la greutate constantă.
Gradul de umflare la particulele ce conţin celule de drojdie depinde, de asemenea, de
gradul de reticulare. La un grad de reticulare identic, particulele încărcate cu drojdie prezintă
valori mai coborâte ale gradului de umflare în comparaţie cu cele care nu conţin drojdie,
prin posibila participare a biocatalizatorului la reticularea polizharidului.
6.2.5. Stabilitatea mecanică a particulelor evaluată prin teste reologice
Utilizarea in cicluri repetate de fermentare a imobilizatelor presupune o stabilitate
structurală ridicată, informații preliminare fiind obținute prin evaluarea, după cum s-a
prezentat anterior, a stabilității în medii apoase. S-a considerat utilă însă și efectuarea unor
teste reologice care pot oferi informații asupra acestei proprietăți.
Testele oscilatorii sunt foarte utile în descrierea microstructurii materialelor
vâscoelastice, oferind informaţii despre structura şi elasticitatea unui material. Parametrii
reologici măsuraţi sunt modulul de acumulare G‘ (o măsură a energiei de deformare
acumulată de probă în timpul forfecării, reprezentând comportamentul elastic al
materialului), modulul de pierderi G‖ (o măsură a energiei de deformare utilizată de probă în
timpul forfecării, reprezentând comportamentul vâscos al materialului), unghiul de fază δ,
factorul de amortizare sau de pierderi tan δ = G‖/G‘ (care descrie raportul dintre componenta
vâscoasă şi cea elastică a unui comportament vâscoelastic) şi vâscozitatea complexă η*.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 10 20 30 40
P5 P9P10
Sw
ell
ing
de
gre
e, S
D %
T
146
Pentru studiu au fost alese două probe, care diferă prin gradul de reticulare conferit
de cantitățile diferite de reticulant utilizat, considerând că ele pot oferi concluzii ce pot fi
generalizate apoi la celelalte probe, care din punct de vedere al gradului de reticulare
(evaluat indirect prin gradul de umflare în apă) se situiază între acestea două. Acestea sunt
P5 si P10, cu și fără drojdie (L).
Un prim set de teste l-a constituit baleiajul de amplitudine (AS – amplitude sweep),
cu ajutorul căruia s-au determinat limitele domeniului vâscoelastic liniar ca fiind 0,1%
pentru probele P5 şi P5+D şi 0,05% pentru probele P10 şi P10+D (figura 43).
Fig. 43 Rezultatele testului de baleiaj în amplitudine pentru probele P5 și (P5)+D respectiv
pentru probele P10 şi P10+D
Al doilea set de teste, realizat pentru aceleași probe, l-a constituit baleiajul de
frecvenţă (FS - frequency sweep), ale cărui rezultate sunt prezentate în Figura 44.
Fig.44.Rezultatele testului de baleiaj în frecvență pentru probele P5 şi P5+D,
respectiv P10 şi P10+D
În cazul diagramelor obtinuţe la testele de baleiaj de frecvenţă, modulul de
acumulare (G') descrie comportarea elastică a probei dând informaţii cu privire la stabilitatea
şi rezistenţa sa structurală (―rigiditate‖), în timp ce modulul de pierderi (G") oferă informaţii
100
101
102
103
104
Pa
G'
G''
0.01 0.1 1 10 100%
Strain
1
Storage Modulus
Loss Modulus
2
Storage Modulus
Loss Modulus
3
Storage Modulus
Loss Modulus
4
Storage Modulus
Loss Modulus
101
102
103
104
105
Pa·s
| *|
102
103
104
Pa
G'
G''
0.1 1 10 1001/s
Angular Frequency
1
Complex Viscosity
Storage Modulus
Loss Modulus
2
Complex Viscosity
Storage Modulus
Loss Modulus
3
Complex Viscosity
Storage Modulus
Loss Modulus
4
Complex Viscosity
Storage Modulus
Loss Modulus
147
cu privire la comportarea vâscoasă (―flexibilitatea‖). Tangenta unghiului de pierderi, tan(δ),
se calculează ca raport al celor doi moduli: tan(δ) = G''/G'.
Testele de baleiaj de frecvenţă au permis observarea influenţei gradului de reticulare,
respectiv a adaosului de drojdie asupra stabilităţii particulelor. Astfel, valorile mai mari ale
modulului de acumulare G‘ şi creşterea diferenţei dintre cei doi moduli dinamici indică
prezenţa unei reţele interne mai stabile, o stabilitate mecanică şi structurală mai bună.
Se constată că valorile modulului G‘ pentru cele două probe sunt apropiate, semnificând
faptul că stabilitatea şi rezistenţa structurală ale probelor sunt apropiate, în concordanţă şi cu
valorile transmitanţei soluţiilor din supernatant. Proba cu un grad mai mare de reticulare
(concentraţia în baia de extrudere de 4 % faţa de 2% din cealaltă probă) prezintă o stabilitate
uşor superioară. Rezultatele sunt în concordanţă, de asemenea, cu caracteristicile de umflare
ale probelor: valoarea mai redusă a gradului maxim de umflare pentru proba mai reticulată
este determinată de densitatea sa superioară de reticulare, care conferă totodată rezistență
structurală (și deci rigiditate) mai ridicate.
Testele reologice au permis, totodată, evidenţierea faptului că stabilitatea
particulelor încărcate cu drojdie este mai ridicată decât a celor neîncărcate, păstrându-se
totodata mai ridicată la particulele mai reticulate. Și în acest caz, concordanța cu rezultatele
anterioare privind comportarea la umflare a particulelor este deplină, întărind concluzia că
insăși drojdia contribuie la ranforsarea structurii rețelei.
6.2.6. Testarea activităţii fermentative a imobilizatelor
Au fost realizate fermentări cu toate tipurile de imobilizate, constatându-se obținerea
de randamente ridicate, comparabile cu cele realizate cu drojdia liberă. Dintre acestea au fost
selectate trei tipuri de particule (P5, P9, P10), utilizate într-un număr mare de cicluri
repetate.
Figura 45 prezintă curbe de fermentare (variația în timp a randamentului de
fermentare a glucozei) realizate cu cele trei tipuri de particule comparativ cu drojdia liberă,
pentru câteva cicluri de fermentare (1 – 4). Trebuie menționat că ciclurile de fermentare s-au
succedat la intervale de timp de maxim 15 minute între ele, intervale necesare spălării
particulelor după ciclul anterior și termostatării soluției de substrat la temperatura de 300C.
In fig. 45 au fost reprezentate curbele primelor 4 cicluri de fermentare. Pentru comparație,
pe fiecare figură este prezentată și curba de fermentare în prezența drojdiei libere (aceeași
cantitate cu cea încapsulată în particulele de gelan) - P0.
148
Se constată că cele mai ridicate randamente în fermentare se ating cu particulele P5,
caracterizate de un grad mai redus de reticulare (cu excepția ciclului 2, mai eficace pentru
proba 9). Explicația constă în densitatea de reticulare mai mică a rețelei de hidrogel, care
facilitează difuzia moleculelor voluminoase de substrat (glucoza) la celule de drojdie. In
sprijinul acestei explicații vin si rezultatele fermentării în prezența probei P10, randamentele
fiind în acest caz cele mai coborâte, evident datorită gradului de reticulare cel mai ridicat al
acesteia, în corelare si cu curbele de umflare (fig. 41, 42). Pentru toate probele au fost
realizate 20 de cicluri fermentative, constatându-se că se obțin randamente ridicate, chiar
superioare primului ciclu de fermentare.
Pentru studii mai aprofundate, a fost reținută proba P5, figura 46 prezentând curbe
de fermentare pentru primele 5 cicluri, comparativ cu o cantitate de drojdie liberă
echivalentă celei imobilizată în matricile sferice de gelan. Proba P5Y are o concentrație de
2% acetat de magneziu în baia de reticulare.
a
b
c
d
Fig. 45. Curbe de fermentare realizate de particulele de tip P5, P9 si P10 în cicluri de
fermentare diferite: a - ciclul 1; b – ciclul 2; c – ciclul 3; d – ciclul 4.
149
Figura. 46. Variația în timp a randamentului de fermentare a glucozei în prezența
imobilizatului P5, în 5 cicluri de fermentare succesive, comparativ cu drojdia liberă.
Valorile ridicate ale randamentului atinse chiar dupa 5 cicluri, au determinat utilizarea în
continuare a imobilizatului până la 20 de cicluri, intervalul de timp între cicluri fiind de 15
min. In figura 47 este ilustrat randamentul maxim de fermentare a glucozei, selectiv, pentru
câteva dintre cele 20 de cicluri. Trebuie precizat că randamentul de fermentare, indiferent de
ciclul la care se face referire, este superior celui atins în prezența drojdiei libere, fapt
confirmat și de alte rezultate raportate în literatură [332].
Surprinzator este faptul că cel mai mic randament se obține la primul ciclu de
fermentare, chiar dacă este superior celui obținut în prezenta drojdiei libere. O creștere
însemnată a acestuia se înregistrează între ciclurile 2-4. Microbioreactoare de alginat de
sodiu cu celule de drojdie imobilizate obținute de Irfana Mariam și colab. în 2009 au fost
testate în mai multe cicluri fermentative, iar o creștere maximă a randamentului de
fermentare s-a observat după al 4-lea ciclu de fermentare după care randamentul scade
brusc. Datorită faptului că reactoarele devin instabile și își schimbă forma numărul maxim
de cicluri de fermentare efectuate a fost de 6 [440]. O explicație posibilă ar fi faptul că dupa
primul ciclu se produce o umflare mai accentuată a particulelor, care facilitează difuzia
substratului la celulele imobilizate. După ciclul 6 de fermentare, valoarea randamentului
maxim scade ușor, păstrându-se la valori relativ constante până la ciclul 20. Scăderea
treptată a randamentului în următoarele cicluri poate fi datorată, în principiu, reducerii
numărului de celule de drojdie din matricea sferică de gelan.
150
Figura 47. Randamentul maxim de fermentare a glucozei în prezența drojdiei libere (0),
respectiv a drojdiei imobilizate în particulele de tip P5+D, pentru cîteva dintre cele 20 de
cicluri de fermentare (interval de 15 min între cicluri)
Pentru a determina dacă particulele sunt stabile în mediul de fermentare după
fiecare ciclu de fermentare a fost determinat numărul de celule de drojdie care difuzează în
mediul de fermentare și pe baza curbei de etalonare a fost determinată cantitatea lor. Am
dorit să arătăm prin această determinare faptul că celulele sunt bine prinse în rețeaua
polimeră și nu difuzează în număr mare în mediul de fermentare chiar și după multe cicluri
de fermentare. Cantitatea inițială de celule a fost de 0.375 g și din această cantitate s-a
scăzut cantitatea de celule determinată după fiecare ciclu de fermentare și s-a determinat
cantitatea teoretică de celule care a rămas imobilizată în particule. În această determinare nu
s-a luat în considerare posibilitatea particulelor de a prolifera. Rezultatele obținute sunt
prezentate în tabelul 22 (pentru proba P5+D).
151
Tabelul 22. Cantitatea de celule de drojdie rămasă în particulele de gelan (g) după fiecare
ciclu de fermentare
Numărul
ciclului de
fermentare
Numărul de
celule /ml
după fiecare
fermentare
Cantitatea de
celule de
drojdie /ml
după fiecare
fermentare
(g/ml)
Cantitatea de
celule de
drojdie/ 50 ml
după fiecare
fermentare
(g/50 ml)
Cantitatea
teoretică de
celule de
drojdie
rămasă în
particulele de
gelan (g) după
fiecare
fermentare
I 54,25 x 10 4
2,01 x 10-5
1,005 x 10 -3
0,373416
II 26,5 x10 4
9,8 x 10-6
4,9 x 10-4
0,372926
III 13,5 x10 4
5 x 10 -6
2,5 x 10-4
0,372676
IV 12,5 x 10 4
4,63 x 10-6
2,315 x 10-4
0,3724445
V 13,5 x 104 5 x 10
-6 2,5 x 10
-4 0,3721945
VI 10.5 x 104 3,89 x 10
-6 1,94 x 10
-4 0,3720005
VII 11,5 x 104 4,2 x 10
-6 2,1 x 10
-4 0,371795
VIII 6.5 x 104 2.4 x 10
-6 1,2 x 10
-4 0.371675
IX 4,75 x 104 1,76 x 10
-6 0.88 x 10
-4 0,371587
X 4.5 x 104 1,67 x 10
-6 0.835 x 10
-4 0,3715035
XI 4.5 x 104 1,67 x 10
-6 0.835 x 10
-4 0.37142
XII 11,25 x 104 4,17 x 10
-6 2,085 x 10
-4 0.3712115
XIII 94,25 x 104 34,9 x 10
-6 17.45 x 10
-4 0.3694665
XIV 4.5 x 104 1,67 x 10
-6 0.835 x 10
-4 0,369383
XV 6,25 x 104 2,3 x 10
-6 1.15 x 10
-4 0,369268
XVI 6,25 x 104 2,3 x 10
-6 1.15 x 10
-4 0.369153
XVII 9.25 x 104 3,43 x 10
-6 1.715 x 10
-4 0.3689815
XVIII 6,25 x 104 2,3 x 10
-6 1.15 x 10
-4 0.3688665
XIX 4.5 x 104 1,67 x 10
-6 0.835 x 10
-4 0.368783
XX 5,75 x 104 2,13 x 10
-6 1,065 x 10
-4 0,3686765
152
Se constată că după fiecare ciclu de fermentare, din matricea de gelan iese o
cantitate de celule foarte redusă însă comparativ cu cea imobilizată (6,323 x 10-3
g).
Rezultatele obținute demonstrează că particulele testate în procese fermentative
repetate sunt stabile. Este evident că fermentarea se produce practic în matricea sferică de
gelan, în care difuzează glucoza. Singura explicație pentru obținerea de randamente ridicate
chiar dupa 20 de cicluri, o constituie faptul că, pe de o parte matricea de gelan protejează
celulele de drojdie de inactivare şi păstrează viabilitatea acestora, iar pe de altă parte că ionul
magneziu din acetatul de magneziu, la concentrația de 0.5% din fermentator, nu numai că
păstreaza viabilitatea celulară ci, este posibil ca prin difuzia sa în matricea polimeră să
contribuie la proliferarea celulelor imobilizate în aceasta. Randamentul de fermentare, chiar
dacă nu variază după o lege evidentă, se păstrează la valori ridicate cel puţin până la cel de
al 20-lea ciclu.
După cum s-a menționat anterior, randamentele de fermentare depind și de tipul de
particule în care s-a imobilizat drojdia, respectiv de condițiile în care acestea au fost
obţinute. Astfel, eficacitatea fermentării depinde de concentrația soluției de acetat de
magneziu din baia de coagulare, respectiv de gradul de reticulare a particulelor. Cu creșterea
densității de reticulare scade randamentul de fermentare, efect constatat nu doar după primul
ciclu. Explicația poate fi următoarea: pe de o parte, cu creșterea gradului de reticulare
responsabil de scăderea gradului de umflare a particulelor în mediul apos, se realizează o
difuzie mai lentă a substratului (glucoza în soluție) în interiorul matricii polimere, respectiv
spre celulele de drojdie. Pe de altă parte, rețeaua densă, ale cărei ochiuri devin comparabile
probabil cu dimensiunea celulelor de drojdie, împiedică eventuala proliferare a acestora,
datorita difuziei mai lente a acetatului de magneziu (ionul magneziu care stimuleaza
proliferarea celulară). Se constată, totodată, că numarul de celule prezente în supernatant
după fiecare ciclu de fermentare este tot mai redus, ceea ce semnifică faptul că ele sunt
imobilizate puternic în matricea polimeră prin care nu mai pot difuza.Trebuie remarcat și
faptul că numărul de cicluri de fermentare ce poate fi realizat cu particulele de imobilizat
scade pentru cele trei tipuri de particule, de la 20 (proba P5) la 9 (proba P9), respectiv 6
(proba P10).
Lipsa de hrană (glucoza) ăn celulele de drojdie poate duce la liza acestora (moartea)
de aceea schimbul de nutrienţi între mediul de fermentare și particulele ce conţin drojdie
trebuie să fie optim. Particulele de gelan ce conţin celule de drojdie nu trebuie sa fie, deci,
prea reticulate şi trebuie sa aibă o porozitate bună care sa permită acest schimb.
153
Rezultatele foarte bune obtinute cu particulele de tip P5, au incurajat încercarea de a realiza
un numar cât mai mare de cicluri de fermentare. In acest caz, între ciclurile de fermentare s-a
mărit intervalul de timp la 4 ore, pentru a obține informații indirecte și asupra acestui
parametru, asupra performanțelor imobilizatului. S-au realizat astfel un numar de 40 de
cicluri, și este foarte probabil ca particulele să mai poată fi utilizate încă un numar de cicluri
până la pierderea totală a activității biocatalitice. In fig. 48 este prezentată doar valoarea
randamentului de fermentare atins după 255 minute, pentru câteva cicluri considerate
aleator. Se constată că în toate cazurile se obțin randamente superioare celui realizat în
prezența unei cantități de drojdie liberă, echivalentă cu cea din imobilizat.
Figura 48. Valoarea randamentului de fermentare a glucozei atins dupa 255 minute, în cazul
utilizării succesive a imobilizatului P5, comparativ cu drojdia liberă
(Prezentare aleatorie a unor cicluri din totalul de 40 realizate).
Pe de altă parte, valoarea randamentelor atinse la diferite cicluri de fermentare este
practic constantă (cel puțin până la cel de al 20-lea ciclu), cu puțin inferioară celei
corespunzătoare primului ciclu. O creștere neașteptată a randamentului se produce la
ultimele 15 cicluri de fermentare, o explicație putând fi faptul că celulele de drojdie au
proliferat în matricea polimeră, mărind astfel activitatea biocatalitică a acestora. Se mai
constată și faptul că mărirea intervalului de timp dintre cicluri are ca efect ușoara scădere a
randamentului de fermentare, comparativ cu cazul anterior, cand ciclurile s-au succedat cu
un interval de doar 15 minute între ele.
Comparativ cu randamentele în fermentare obținute utillizând particule cu drojdie
reticulate cu ioni de Ca2+
, cele obținute utilizând particule reticulate cu ioni de Mg2+
sunt
constant mai ridicate. Rezultatul nu este surprinzător, fiind cunoscut fapul că magneziul este
benefic pentru celulele de drojdie de bere amplificând proliferarea lor. Determinarea
numărului/cantității de celule din particule după dezagregarea lor mecanică au evidențiat
0
10
20
30
40
50
60
1 3 8 10 13 16 18 20 24 31 35 40
Number of fermentation cycles
154
valori superioare față de cele raportate în subcapitolul 5.2., referitor la particulele reticulate
cu Ca2+. Tabelul 23, prezintă numărul, cantitatea și viabilitatea celulelor de drojdie din
imobilizatele realizate în prezența magneziului, după fiecare ciclu de fermentare, pe durata a
10 cicluri.
Tabel 23. Numărul, cantitatea și viabilitatea celulară a drojdiei de bere
din imobilizate de gelan reticulat cu ioni de Mg2+
determinate
după fiecare din cele 10 cicluri de fermentare
Număru
ciclului de
fermentare
Numărul
de
celule/g
particule
x 10 8
Cantitatea
de
celule/g
particule,
mg
Viabilitatea
celulară, %
0 6,36 23,56 94,98
1 7,04 26,08 93,72
2 6,09 22,56 93,91
3 6,45 23,9
4 7,22 26,75 94,23
5 6,65 24,64
6 6,14 22,75
7 7,35 27,23
8 7,06 26,89 88,94
9 6,29 23,3 91,66
10 7,08 26,23
Este evident din rezultatele prezentate rolul protector al matricii față de celulele de
drojdie imobilizate, ceea ce permite proliferarea lor în rețeaua polimeră, menținându-le într-
un număr ridicat ce favorizează obținerea de randamente mari, permanent superioare celui
obținut cu drojdia liberă.
Concluzii.
Acetatul de magneziu constituie un agent de reticulare adecvat pentru obținerea de
particule de gelan destinate imobilizării celulelor de drojdie, conducând la structuri stabile
din punct de vedere mecanic, fără a afecta viabilitatea celulară.
Creșterea cantității de reticulant determină obținerea unor structuri mai compacte a
matricii sferice de gelan prin creșterea gradului de reticulare, mărind stabilitatea structurală a
imobilizatelor și reducând gradul maxim de umflare în medii apoase.
Capacitatea de fermentare a glucozei prin utilizarea acestor imobilizate crește cu
reducerea cantității de reticulant utilizat, deoarece este facilitată astfel difuzia substratului la
celulele de drojdie din particula polimeră.
155
Particulele de gelan continînd celule de drojdie imobilizată pot fi reutilizate un
număr mare de cicluri fermentative (cel puțin 40 cicluri) fără pierderea semnificativă a
activității biocatalitice, și asigurând valori ale randamentului de fermentare a glucozei
superioare celui atins prin utilizarea celulelor libere.
Bioreactoarele obținute prezintă potential aplicativ în procese fermentative din
industria alimentară, dat fiind și caracterul netoxic al reticulantului utilizat.
6.3. Particule pe bază de gelan reticulat cu acetat de zinc conținând celule de
drojdie imobilizate
Este cunoscut faptul că celulele de drojdie necesită o gamă largă de metale pentru
proliferarea lor și pentru metabolism [28]. În procesele fermentative, în special cele din
industria berii, ionii metalici cheie sunt cei de magneziu și zinc care acționeaza ca și
cofactori pentru multe enzime biosintetice și metabolice incluzând aici și diverse enzime
glicolitice și alcool dehidrogenaza. Celulele de drojdie necesită pentru o creștere optimă o
cantitate mai mare de magneziu și potasiu, în timp ce ionii de zinc, mangan, fier și cupru
sunt necesari în cantități foarte mici, ca urme, concentrațiile necesare fiind micromolare [32,
53]. Metalele grele, chiar în concentrații micromolare, pot fi toxice pentru celulele de
drojdie[13].
Zincul este un element foarte important în procesele fermentative deoarece are rol
de activator enzimatic al alcoologenazei și al dehidrogenazei. Un mediu deficient în zinc
poate duce la încetinirea sau la o fermentare incompletă iar această problemă a fost
semnalată în industria berii [51].
Ocazional, biodisponibilitatea unor minerale esențiale poate fi limitativă iar acest
lucru poate afecta negativ procesul de fermentație. De exemplu, concentrațiile de zinc pot
descrește în timpul zdrobirii strugurilor, în timpul fermentării și limpezirii mustului deoarece
ionul metalic, fiind un metal tranzițional, creează complecși în precipitatul din vin (borhot).
În consecință, concentrațiile de zinc din must pot deveni compromise ceea ce duce
la o performantă scăzută în fermentare. Ionul de zinc are un rol semnificativ în metabolismul
celulei de drojdie și nu doar pentru că este un activator enzimatic dar și pentru că poate
stimula absorbția de maltoză și maltotrioză în procesele de obținere a drojdiei, realizându-se
astfel randamente mari în fermentare [20,22,23].
Ionul de zinc poate avea un rol benefic asupra stabilității și dinamicii membranei
celulare [52].
156
Celulele de drojdie au capacitatea de a absorbi foarte eficient mineralele esențiale și
a le exclude pe cele neesențiale. Zincul poate fi absorbit de către celule din mediul de
fermentare pentru a îndeplini roluri fiziologice esențiale [28].
Nutriția minerală a drojdiilor este importantă pentru producătorii de bere, vinuri,
pentru cei ce produc bioetanol sau băuturi obținute prin distilare, deoarece se dorește
creșterea capacitații fermentative a celulelor de drojdie, obținerea de randamente optime în
fermentare și produse de calitate.
Prezentul subcapitol raportează rezultatele obținute în realizarea particulelor de
gelan cu celule de drojdie imobilizate reticulate ionic, prin metoda extruderii, în prezența
ionilor de Zn2+, cu reale perspective de a fi utilizate în industria băuturilor alcoolice.
Selectarea acetatului de zinc drept agent de reticulare este argumentată de considerentele
expuse anterior: lipsa de toxicitate și rolul important pe care îl joacă zincul în procesele de
fermentare.
Particulele obținute au fost caracterizate din punct de vedere morfologic, fizico-
chimic iar activitatea lor fermentativă a fost testată și comparată cu activitatea fermentativă a
drojdiei libere. Particulele pot fi ușor recuperate din fermentator prin filtrare, sunt stabile și
pot fi utilizate în mai multe cicluri de fermentare repetate.
Ca și în cazurile anterior discutate, reticularea gelanului cu ionii de Zn2+
(provenit
din acetat de zinc) are la bază reacția de mai jos:
2 Gelan-COO-Na
+ + (CH3COO
-)2Zn
2+ (Gelan-COO
-)2Zn
2+ + 2 CH3COO
- Na
+
Celulele de drojdie sunt prinse în ochiurile rețelei formată prin reticulare ionică.
Caracterul de metal tranzițional al zincului metal determină și reacţii de complexare, ceea ce
conduce la formarea unei reţele de gel mai puternice (mai reticulate) comparativ cu
utilizarea altor metale divalente din grupa a IIA principală (Ca, Mg).
Structura rețelei formate este prezentată în figura 49.
157
Figura 49. Prezentare schematică a structurii particulelor sferice de gelan cu celule de
drojdie imobilizate, reticulate ionic cu Zn2+
.
După cum s-a discutat anterior, celula de drojdie este un coloid încărcat electric,
putând pierde sarcina electrică sau să-și schimbe semnul. În suprafață este încărcată pozitiv
dar după introducerea în mediul de fermentare, după o perioadă de timp are loc înmugurirea
iar celula iși schimbă sarcina electrică care devine negativă, putând stabili interacții cu ionul
reticulant. La finele fermentării sarcina electrică a celulei de drojdie redevine pozitivă. Ionii
de zinc, pe lângă rolurile fiziologice pe care le au în metabolismul celulei de drojdie, pot
adera la membrana plasmatică celulară, încarcată negativ, conferindu-i acesteia mai multă
stabilitate la factorii de stres care pot interveni în procesele fermentative [561,562].
Posibilitatea formării de legături coordinative între ionii de zinc și matrice, permite
a priori realizarea unor rețele mai ferme de gelan, ceea ce necesită reevaluarea concentrației
acestora atât în pre-extrudat cât și în baia de reticulare. S-a impus astfel determinarea
concentrației optime de agent de reticulare necesară, atât în baia de extrudere cât și în pre-
extrudat, care să permită obținerea unor particule cu și fără celule de drojdie stabile în
mediile apoase în care lucrează.
Comparativ cu reticularea cu ioni de Ca2+
, respectiv de Mg2+
, pentru ionii de Zn2+
s-a lucrat cu concentrații de acetat cu un ordin de mărime mai mic. Între particulele cu celule
de drojdie imobilizată și mediul de fermentare (în care se găsește soluția de glucoză) trebuie
să existe un schimb eficient de nutrienți pentru ca celulele să poată prolifera, pentru a obține
mai multe cicluri de fermentare repetate și o eficiență optimă a procesului.
S-au realizat în consecință mai multe particule urmărindu-se influența concentrației
de acetat de zinc în cele două medii. De asemenea, comportarea în procese fermentative a
158
particulelor cu celule de drojdie imobilizata a fost verificată pentru fiecare probă în parte.
Programul experimental realizat este redat in tabelul 24.
Tabel 24. Programul experimental pentru obținerea particulelor de
gelan reticulat cu Zn2+
fără și cu celule de drojdie
*volumul soluției:1.25 ml ; **volumul soluției: 125 ml
Același program experimental s-a utilizat pentru obținerea particulelor cu celule de
drojdie imobilizate, codul probelor conținând în plus litera D.
Proba Concentrația
de gelan (%)
Concentrația
de acetat de
zinc în
preextrudat*
(%)
Concentrația
de acetat de
zinc în baia
de
reticulare**
(%)
A2
0.1
0.02
0.1 A3 0.04
A4 0.06
A5 0.08
L2
0.1
0.02
0.08 L3 0.04
L4 0.06
L5 0.08
N2
0.1
0.02
0.05 N3 0.04
N4 0.06
N5 0.08
159
6.3.1. Stabilitatea particulelor și viabilitatea celulară
Stabilitatea în apă a particulelor cu și fără celule de drojdie imobilizată s-a evaluat ca și în
cazurile anterioare, prin determinarea turbidității (transmitanței) soluției în care particulele
sunt suspendate diferite perioade de timp; rezultatele pentru o parte din probe fără celule de
drojdie sunt redate în tabelul 25.
Tabel 25. Valorile transmitanței pentru particule fără celule de drojdie imobilizate,
determinate după diferite perioade de păstrare în medii apoase.
Proba
Transmitanța, T %
În soluția
din baia de
extrudere
În apă bidistilată
12 h 24 h 12 h 24 h 48 h
A2 99 98,8 99,4 99,2 99
A3 99.6 99,3 99,6 99,3 99,1
A4 99.4 99,2 99,7 99,4 99,1
A5 99,6 99,4 99,7 99,6 98,7
L2 99,2 98,6 99,4 99,1 98,5
L3 99,3 98,8 99,4 99,2 98,9
L4 99,4 99,1 99,6 99,3 99
L5 99,5 99,2 99,7 99,4 99,2
N2 99,1 98,2 99,2 98,9 97,1
N3 99,4 98,3 99,3 98,9 97,4
N4 99,5 98,4 99,9 99 97,7
N5 99,2 98,8 99,2 98,8 97,9
160
Datele prezentate atestă că stabilitatea particulelor este foarte ridicată în ambele
medii de păstrare, chiar dacă în pre-extrudat și în baia de reticulare s-au utilizat soluții de
concentrații net inferioare celor folosite la reticularea cu clorură de calciu sau acetat de
magneziu.
Cu cât crește concentrația de reticulant din preextrudat cresc ușor și valorile
transmitanței, indiferent de tipul de probă analizat. De asemenea, cu creșterea concentrației
de reticulant din baia de extrudere se observă că turbiditatea soluției în care sunt păstrate
probele scade ușor (valorile transmitanței cresc). Evident, se poate erafirma că valorile
transmitanței cresc cu creșterea gradului de reticulare.
Valorile transmitanței nu au variat foarte mult după 24 de ore de păstrare a
particulelor în soluția de reticulare. Se observă că ele scad foarte puțin chiar și după 48 de
ore de păstrare în apă bidistilată. Evident rezultatele obținute sunt consecința structurilor
puternic reticulate la care zincul participă nu doar prin legăturile ionice formate cu gelanul ci
și prin cele coordinative.
Turbiditatea soluției apoase în care particulele cu celule de drojdie imobilizate sunt
păstrate a fost determinată prin măsurarea transmitanței după anumite intervale de timp. În
acest caz turbiditatea mediului poate fi determinată nu doar de fragmentele de polimer care
nu sunt bine prinse în rețeaua polimerică ci și de celulele de drojdie care ipotetic difuzează
în timp din particule. S-a impus pentru probele ce conțin celule de drojdie determinarea la
diferite intervale de timp (la fiecare 12 ore) a transmitanței, a concentrației de celule/ml și a
viabilității celulare.
Concentrația de celule și viabilitatea celulară au fost stabilite după 12 ore, respectiv
24 de ore de păstrare a particulelor în soluția în care s-a efectuat extruderea și după 12 ore,
respectiv 24 ore de păstrare a particulelor în apă bidistilată. Rezultatele obținute sunt
prezentate în tabelul 26.
Tabel 26. Valorile transmitanței și viabilității celulare la câteva probe
păstrate în diferite medii
Proba
Transmitanța, T% Concentrația celulelor x
104
in supernatant Viabilitatea celulară, %
în soluția de
acetat de
zinc
în apă
distilată
în soluția de
acetat de
zinc
în apă
distilată
în soluția de
acetat de zinc în apă distilată
161
12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h
A2D 98,9 98,1 98,9 97,9 7 10 2,75 5,5 100 95,24 84,62 88
A4D 98,1 97,7 97,5 97,2 16 10,25 9,25 18 96.96 95.34 92.5 92.3
A5D 98,8 97,9 98,9 97,5 2 10 2,75 5 98.88 97.56 91.66 86.95
L2D 98,5 97,9 98,7 97,4 7,25 11,25 3,5 6,25 100 95,74 87,5 89,2
L4D 98,6 96,9 97,6 97,4 7,25 9,25 3 4,5 93,54 92.5 92.3 85.71
L5D 97,6 97,5 98,4 97,8 5,25 6,25 2,5 5 91.3 89,28 83.33 83.3
N2D 98,4 97 98,6 96,5 8,5 12,5 4,75 8 100 92,59 95 91,43
N4D 97,4 97,1 98,2 96.8 7,5 9,25 3 5.25 90.9 90.2 92.3 91.3
N5D 98,2 97,9 99 97.5 5 6,25 2,5 4.75 90.9 89.2 83.33 82.6
Pentru toate particulele cu celule de drojdie analizate se observă că valorile
transmitanței cresc atunci cînd crește concentrația soluției de acetat de zinc în baia de
extrudere sau în preextrudat. Toate probele au valori ale transmitanței apropiate.
La probele A4D, A5D după 24 de ore de păstrare în apă bidistilată se observă că
valoarea transmitanței scade puțin cu creșterea gradului de reticulare. Aceste rezultate pot fi
o consecință a gradului mare de reticulare, ceea ce determină ca în ochiurile rețelei polimere
să nu poată fi imobilizate numeroase celule, deoarece se formează o rețea mai densă și
compactă.
Datorită legăturilor coordinative foarte stabile create de ionul de zinc, particulele de
gelan cu și fără celule de drojdie imobilizate sunt prezintă o stabilitate structurală ridicată,
care crește, în general, cu creșterea gradului de reticulare.
Concentrația de celule/ml care se regăsesc în baia de reticulare sau apă bidistilată
scade atunci când gradul de reticulare crește, dar numărul de celule ce difuzează din
matricea polimerică este redus.
Concentrația de celule din baia de reticulare măsurată la diferite intervale de timp
este mai mare decât concentrația de celule de drojdie ce se găsește la păstrarea particulelor
în apă bidistilată. O ipoteză ar fi aceea că o parte din celulele de drojdie care nu au fost
prinse în rețea (datorită densității mari a acestei) se regăsesc în soluția de extrudere. Această
ipoteză ar putea fi susținută și de faptul că după 24 de ore de păstrare în soluția de extrudere
concentrația de celule existente în supernatant nu a crescut foarte mult.
După 24 de ore de păstrare în baia de reticulare particulele sunt spălate cu apă
bidistilată și păstrate în acest mediu pentru încă 24 de ore (măsurătorile se efectuează la
fiecare 12 h). Concentrația de celule/ml care difuzează din particule este mult mai mică după
162
păstrarea particulelor în apă bidistilată, ceea ce ar putea confirma ipoteza mai sus
menționată.
Viabilitatea celulară are valoarea de 82,6% pentru o singură probă analizată,
celelate probe prezentând valori ale acestei proprietăți de peste 88 % după 48 de ore de
păstrare în apă bidistilată. Aceasta sugerează că particulele de gelan ajută la păstrarea
viabilității celulare în timp iar particulele cu celule de drojdie imobilizate ar putea fi utilizate
în procese fermentative în cicluri repetate de fermentare.
6.3.2. Stabilitatea mecanică a particulelor
Pentru utilizarea particulelor în cicluri repetate de fermentare stabilitatea lor
structurală este foarte importantă, așa încâ evauarea sa prin teste reologice devine necesară,
chiar dacă este o metodă indirectă.
Au fost alese pentru analiză 6 probe obținute la aceeași concentrație de acetat de
zinc în preextrudat (0,06%), aceeași concentrație în polimer (1 %) dar cu concentrații
diferite în baia de reticulare. Probele alese pentru testare au fost particule cu și fără celule de
drojdie imobilizate.
Un prim set de teste l-a constituit baleiajul de amplitudine (cu ajutorul căruia s-au
determinat limitele domeniului vâscoelastic liniar (figura 50).
Se constată că valorile modulului G‘ pentru cele trei probe sunt apropiate,
semnificând faptul că stabilitatea și rezistența structurală ale probelor (―rigiditatea‖) sunt
apropiate, în concordanța și cu valorile transmitanței soluțiilor de supernatant. Proba L4
manifestă stabilitate uşor superioară în comparaţie cu proba N4, explicabilă prin gradul de
reticulare mai ridicat. Testele reologice au pus în evidenţă faptul că particulele ce conţin
celule de drojdie (A4D, L4D și N4D) au o stabilitate puţin mai redusă în comparaţie cu
particulele fără drojdie (A4, L4, N4) iar stabilitatea lor creşte cu creşterea gradului de
reticulare.
163
Figura 50: Baleiaj de amplitudine (AS – amplitude sweep) pentru probele A4 şi A4D, L4 și
L4D respectiv N4 şi N4D
T = 30 OC, deformaţia γ = 0,01’100%, frecvenţa unghiulară constantă, ω=10 rad/s
Al doilea set de teste, realizat pentru aceleasi probe, l-a constituit baleiajul de frecvenţă (FS -
frequency sweep), ale cărui rezultate sunt prezentate in Figura 51.
Figura 51. Baleiaj de frecvenţă (FS – frequency sweep) pentru probele A4şi A4D, L4 și L4D
respectiv N4 şi N4D (T=30 OC, deformaţia constantă în domeniul liniar vâscoelastic,
frecvenţa unghiulară ω=0,1’100 rad/s)
Se constată în acest caz valoarea ușor superioară a modulului G‘, pentru probele A4
și A4D față de valoarea corespunzătoare probei L4 și L4D, argumentând o stabilitate
ridicată a probei cu grad mai înalt de reticulare.
6.3.3. Gradul de umflare
Comportamentul în apă al particulelor sferice de gelan, cu și fără celule de drojdie,
s-a evaluat prin gradul de umflare (Q %).
S-au utilizat pentru această determinare doar o parte din probe (A2, L2 și N2),
respectiv cele mai stabile obținute la diferite concentraţii de acetat de zinc în baia de
extrudere, cea din preextrudat fiind aceeași pentru toate probele analizate.
În figura 52 este prezentată variația în timp a gradului de umflare.
101
102
103
104
Pa
G'
G''
0.01 0.1 1 10 100%
Strain
A4
Storage Modulus
Loss Modulus
A4+D
Storage Modulus
Loss Modulus
N4
Storage Modulus
Loss Modulus
N4+D
Storage Modulus
Loss Modulus
L4
Storage Modulus
Loss Modulus
L4+D
Storage Modulus
Loss Modulus
101
102
103
104
105
Pa·s
| *|
102
103
104
Pa
G'
G''
0.1 1 10 1001/s
Angular Frequency
A4
Complex Viscosity
Storage Modulus
Loss Modulus
A4+D
Complex Viscosity
Storage Modulus
Loss Modulus
N4
Complex Viscosity
Storage Modulus
Loss Modulus
N4+D
Complex Viscosity
Storage Modulus
Loss Modulus
L4
Complex Viscosity
Storage Modulus
Loss Modulus
L4+D
Complex Viscosity
Storage Modulus
Loss Modulus
164
Figura 52. Variația în timp a gradului de umflare pentru probele A2, L2 și N2.
Rezultatele obținute demonstrează că particulele au un puternic caracter de
hidrogel, ele putând absorbi cantități mari de apă. Gradul de umflare depinde de gradul de
reticulare al particulelor. Cu cât densitatea de reticulare este mai mare cu atât valoarea
gradului de umflare scade. Rezultatele obținute sunt în concordanță cu rezultatele obținute la
testele reologice și la testarea stabilității particulelor în medii apoase prin măsurarea
transmitanței.
6.3.4. Morfologia particulelor
Fotografiile realizate prin microscopie electronică de baleiaj pun în evidență
morfologia particulelor cu celule de drojdie. Probele alese pentru analiză, A2D și L2D au
aceeași concentrație de acetat de zinc în preextrudat și diferă prin concentrația de reticulant
din baia de extrudere. Analiza a fost efectuată pe secțiunea transversală a particulelor de
gelan uscate conținând celule de drojdie imobilizate.
În fig. 53 sunt prezentate fotografiile realizate prin microscopie electronică de baleiaj pentru
cele două probe analizate. Ele pun în evidență faptul că celulele de drojdie se găsesc în
număr mare în interiorul particulelor, fiind bine prinse în matricea polimeră în ambele tipuri
de particule.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 2 4 6 8 10
Q % A2
Q% L2
Q% N2
Time(h)
Sw
elli
ng
deg
ree,
Q %
A2D L2D
165
Figura 53. Fotografii de microscopie electronică de baleiaj pentru perticulele A2D și L2D.
(3 grade de mărire)
Probele analizate au grade diferite de reticulare. Fotografiile evidențiază faptul că în
cazul probei A2 se formează o rețea polimerică mai densă (compactă), celulele de drojdie
fiind mai bine prinse în ochiurile sale comparativ cu proba L2. Dimensiunea celulelor de
drojdie este de 3-4 μm. În cazul probei L2 se observă o structură mai poroasă comparativ cu
proba A2, tot datoriaă gradului mai redus de reticulare.
(a) (b)
(d) (e)
(f) (g)
166
6.3.5. Activitatea fermentativă a particulelor ce conțin celule de drojdie
S-a analizat cinetica procesului de fermentare în prezența mai multor tipuri de
particule, monitorizând variația în timp a eficienței de transformare a glucozei. Au fost
efectuate mai multe cicluri de fermentare pentru fiecare probă în parte, intervalul de timp
dintre cicluri fiind de 24 de ore. Pentru a optimiza procesul de fermentare din punct de
vedere al eficienței procesului, s-a studiat influența mai multor factori:
a) concentrația de acetat de zinc adăugată înainte de extrudere (din preextrudat);
b) concentrația de acetat de zinc din baia de extrudere;
c) timpul de păstrare al particulelor în baia de reticulare după extrudere
d) pH-ul din baia de fermentare;
e) concentrația de acetat de zinc din baia de fermentare.
6.3.5.1. Influența concentrației de agent de reticulare din preextrudat.
Au fost selectate probe care diferă prin concentrația de acetat de zinc adăugată
înainte de extrudere, restul parametrilor care pot influența procesul de fermentare fiind
mentinuți constanți. Probele analizate au fost L2D, L4D și L5D. Concentrația de acetat de
zinc din soluția de fermentare a fost de 0,01%, pH-ul fiind ajustat la valoarea 6. În figura 54
sunt prezentate curbele de fermentare la probele menționate anterior.
Se poate observa după primul ciclu de fermentare că valorile randamentelor
obținute sunt aproximativ egale, superioare celui obținut la fermentarea cu drojdie. Începând
cu al doilea ciclu de fermentare eficiența fermentării scade mult la probele obținute cu o
concentrație de acetat de zinc de 0,06% (L4D) și 0,08% (L5D) în preextrudat. Același
comportament îl putem observa și după al treilea ciclu de fermentare. Pentru particulele
obținute cu o concentrație de 0,02% acetat de zinc în preextrudat putem observa că
randamentul în fermentare la primele 2 cicluri de fermentare este menținut aproape constant
iar în al treilea ciclu de fermentare scade dar este superior randamentului obținut cu drojdia
liberă.
167
(a) (b)
(c)
Figura 54: Variația în timp a eficienței fermentării pentru probe la care diferă concentrația
de acetat de zinc din preextrudat respectiv după diferite cicluri de fermentare: (a) primul
ciclu; (b) al doilea ciclu; (c) treilea ciclu.
Această comportare a particulelor de imobilizat în procesele fermentative este
influențată de gradul de reticulare. Cu creșterea concentrației de acetat de zinc din
preextrudat crește gradul de reticulare al particulelor. La particulele cu un grad de reticulare
mai ridicat eficiența în fermentare scade. În figura 55 sunt prezentate valorile randamentului
de fermentare funcție de numărul de cicluri la fiecare tip de probă analizat.
(a|) (b)
168
(c)
Figura 55: Randamentul maxim obținut în diferite cicluri de fermentare, cu diferite tipuri de
imobilizat, comparativ cu randamentul obținut la fermentarea cu drojdie liberă (0) :
(a) L2D, (b) L4D, (c) L5D.
Pentru toate probele analizate se constată că randamentul în fermentare scade de la
un ciclu la altul. Proba cu cel mai bun randament în fermentare este L2, deci cu un grad mic
de reticulare, considerată ca fiind optimă.
6.3.5.2. Influența concentrației de acetat de zinc din baia de extrudere
Probele selectate sunt A2D, L2D și N2D. PH-ul soluției din baia de fermentare a
fost ajustat la valoarea pH = 5, cunoscut fiind faptul că pH-ul optim de proliferare a celulelor
de drojdie este cuprins între 4 și 6. În figura 56 sunt prezentate curbele de fermentare a celor
trei probe după primul ciclu de fermentare. Soluția de glucoză din fermentator a avut o
concentrație de 0.007 % acetat de zinc.
169
Figura 56: Variația în timp a eficienței fermentării glucozei pentru probe care diferă prin
concentrația de reticulant din baia de extrudere
Se poate observa că prin scăderea concentrației de reticulant din baia de extrudere
eficiența fermentării crește. Este evident că efectul se datorează gradului mai mic de
reticulare și porozității mai mari a particulelor, având ca efect intensificarea difuziei
substratului (glucoza) către celulele de drojdie din matricea de gelan.
Totodată, nutrienții din baia de fermentare difuzează mai ușor în interiorul
particulelor cu celule de drojdie imobilizate, care pot prolifera în interiorul matrticei
polimere crescând eficiența fermentării.
6.3.5.3. Influența timpului de păstrare a particulelor în baia de extrudere
Pentru a determina timpul optim de păstrare al particulelor în baia de reticulare
după extrudere a fost selectată proba L2D. Timpul stabilit pentru păstrarea particulelor în
baia de gelifiere este de 2 h, respectiv 12 h. După perioada de păstrare în soluția de extrudere
probele au fost spălate cu apă bidistilată pentru îndepărtarea excesului de acetat de zinc și
testate din punct de vedere al activității fermentative.
Au fost alese două concentrații diferite de acetat de zinc din baia de fermentare:
0.015% și 0.01 %. PH-ul soluției în care se face fermentarea a fost 5 în cazul utilizării unei
concentrații de acetat de zinc de 0.015%, repectiv 6 pentru concentrația de 0.01 %. În figura
57 sunt prezentate valorile randamentului de fermentare după diferite cicluri pentru probele
analizate.
170
(a) (b)
(c) (d)
Figura 57: Influența timpului de păstrare al particulelor în soluția de extrudere pentru proba
L2D la pH 5 și 0,015% acetat de zinc în baia de fermentare: (a) după 2 ore de păstrare a
particulelor în soluția de extrudere, (b) după 12 h de păstrare a particulelor în soluția de
extrudere; respectiv la pH 6 si 0,01% acetat de zinc în baia de fermentare (c) după 2 ore de
păstrare a particulelor în soluția de extrudere și (d)după 12 ore de păstrare a particulelor în
soluția de extrudere.
Păstrarea în soluția de extrudere a particulelor o perioadă mai lungă de timp
determină apariția unui grad de reticulare mai mare, sub acțiunea ionului Zn2+
. Eficiența
fermentării crește atunci când gradul de reticulare este mai mic deoarece nutrienții ce se
găsesc în baia de fermentare difuzează mai ușor la celulele de drojdie ce se găsesc în
interiorul particulelor de gelan iar acestea pot prolifera.
Celulele de drojdie necesită cantități foarte de mici de ioni de zinc, în concentrații
micromolare, pentru indeplinirea rolului fiziologic din cadrul metabolismului celular.
Se poate observa o ușoară creștere a eficienței fermentării atunci când soluția pentru
fermentare conține 0.015% acetat de zinc la pH 5 comparativ cu utilizarea soluției de 0.01%
acetat de zinc, pH 6. Această comportare la fermentare a particulelor poate fi determinată de
faptul că zincul în concentrații mici este un factor de creștere pentru celulele de drojdie iar
pH-ul optim pentru proliferarea lor variază între 4 și 6.
171
În ambele cazuri analizate se observă că eficiența fermentării crește atunci când
particulele sunt păstrate în baia de reticulare timp de 2 ore.
6.3.5.4. Influența pH-ului din baia de fermentare
PH-ul mediului de fermentare nu este considerat de mulți cercetători un factor
esențial de influență în procesele fermentative. O serie de studii au relatat însă faptul că pH-
ul mediului de fermentare joacă un rol important în asimilarea ionilor metalici de către
celulele de drojdie în timpul proceselor fermentative. De asemenea, unele cercetări afirmă că
pH-ul are un rol important în legarea cationilor metalici în locurile de absorbție de pe
peretele celular al celulei.[57, 563]
S-a utilizat pentru această determinare proba L2D care s-a dovedit cea mai eficace
din punct de vedere al randamentelor de fermentare iar pH-ul din baia de fermentare a fost
reglat la valorile 5, respectiv 6. Particulele au fost păstrate în baia de reticulare după obținere
pentru 2 ore după care au fost spălate cu apă bidistilată și testate în procese fermentative
repetate. Baia de fermentare conține glucoză dizolvată în soluție aposă de acetat de zinc
acetat de zinc de concentrație 0,01%. Ciclurile de fermentare au fost repetate după 24 de ore.
Diagramele de fermentare ale probei L2D realizate la valori diferite de pH în baia de
fermentare sunt redate în figura 58.
(a)
172
(b)
Figura 58: Randamentele obținute la diferite cicluri de fermentare pentru proba L2D la (a)
pH 6 și (b) pH 5
Rezultatele obținute demonstrează faptul că pH-ul este un factor foarte important
pentru obținerea unor randamente optime în fermentarea glucozei în prezența particulelor cu
celule de drojdie imobilizate și pentru utilizarea particulelor în cât mai multe cicluri de
fermentare repetate. Scăzând valoarea pH-ului de la 6 la 5 observăm că eficiența în
fermentare crește și este comparabilă cu eficiența pe care o obținem la drojdia liberă; de
asemenea, numărul ciclurilor de fermentare crește. Rezultatele obținute ne determină să
afirmăm că celulele de drojdie pot prolifera mai eficient în interiorul particulelor de gelan la
valoarea 5 a pH -ului.
Rezultatele sunt în acord cu cercetările amintrite anterior, care raportează faptul că
pentru o fermentare optimă pH-ul mediului de fermentare trebuie sa fie între 4,5 și 5.
6.3.5.5. Influența concentrației de acetat de zinc din baia de fermentare
Pentru proba L2D a fost testată activitatea fermentativă utilizând diferite
concentrații de acetat de zinc în baia de fermentare. Concentrația de glucoză dizolvată a fost
de 8% și a fost menținută constantă iar pH-ul în baia de fermentare a fost menținut la
valoarea pH = 5 în toate cazurile analizate.
Glucoza a fost dizolvată în soluții apoase de acetat de zinc de trei concentrații:
0,015 %, 0,01% respectiv, 0,007%. În figura 59 sunt prezentate diagramele obținute după
mai multe cicluri de fermentare a particulelor în condițiile mai sus menționate.
173
(a) (b)
(c)
Figura 59. Numărul de cicluri de fermentarer realizate cu proba L2D la pH 5 cu diferite
concentrații de acetat de zinc in baia de fermentare
(a) 0,015%, (b) 0,01% și (c) 0,007%.
Este evident că eficiența fermentării depinde de concentrația de acetat de zinc din
baia de fermentare. Cele mai multe cicluri de fermentare sunt obținute în cazul utilizării unei
concentrații de 0,01 % acetat de zinc. Utilizarea unei concentrații mai mici de 0,07% duce la
realizarea unui număr mai mic de cicluri de fermentare. Această comportare se datorează
faptului că ionul de zinc este un factor de creștere pentru celulele de drojdie în anumite
concentrații. O concentrație mai mică în baia de fermentare poate determina o rată de
proliferare mai scăzută a celulelor, iar în consecință, randamentul în fermentare poate să
scadă.
În cazul utilizării unei concentrații mai mari de acetat de zinc se poate realiza un
număr mai mic de cicluri de fermentare deoarece ionul de Zn2+
poate reticula suplimentar
matricea de gelan; ca urmare, difuzia nutrienților din mediul de fermentare în particule se
realizează dificil. Celulele de drojdie imobilizate în particulele de gelan nu pot difuza din
particule și nici nu pot prolifera în interiorul particulelor. În timp apare liza (autoliza)
celulelor iar procesul de fermentare încetinește sau chiar se oprește.
Din curbele de fermentare și din diagramele analizate anterior s-a observat faptul că
în procesele fermentative ce conțin în mediul de fermentare o concentrație de 0,01 %
174
respectiv, 0,007 % acetat de zinc, pH-ul mediului de fermentare fiind 5, se obțin randamente
ridicate după câteva cicluri fermentative. Randamentele obținute nu evoluează totuși după o
lege clară cu numătul de cicluri de fermentare. Se poate însă observa, după 5 cicluri, o
tendință de scădere a randamentului a acestuia.
Acest comportament ar putea fi explicat prin faptul că substratul împreună cu ionii
de zinc difuzează mai greu în interiorul particulelor, ceea ce le poate întârzia proliferarea.
Este posibil ca ionii de zinc să fie în deficit în interiorul particulelor cu celule de drojdie
imobilizată, iar cei din mediul de fermentare să ajungă după un anumit timp la celule pentru
a fi absorbiți de acestea. Ionii de zinc au un rol semnificativ în nutriția celulelor de drojdie
având pe lângă rolul de activator enzimatic și rolul de a stimula absorbția de maltoză și
maltotrioză de către celule, nutrienți care sporesc viteza de fermentare.
Această variație a randamentului în timp este posibil să fie determinată, deci, de
proliferarea celulelor de drojdie în interiorul particulelor de gelan.
Randamentul de fermentare obținut în prezența particulelor este comparat cu randamentul
obținut la fermentarea drojdiei libere. Se poate observa că în cele mai multe cazuri eficiența
fermentării în prezența imobilizatelor este superioară celei obținute în prezența drojdiei
libere.
După cum s-a menționat anterior, în particule s-a adăugat o suspensie de drojdie
obținută din 1,25 g drojdie și 5 ml apă. Cantitatea de celule de drojdie reprezintă 30% din
cantitatea totală de drojdie, adică 0,375 g. Înainte de fiecare ciclu de fermentare, pe baza
curbei de etalonare s-a stabilit cantitatea de celule de drojdie care a fost imobilizată în
particule în funcție de numărul de celule care difuzează în mediul de păstrare al particulelor.
Eficiența în imobilizare pentru toate probele analizate a fost de peste 99 %.
După fiecare ciclu de fermentare s-a stabilit cantitatea de celule de drojdie care
difuzează în supernatant. Aceasta determinare s-a efectuat pentru a stabili dacă proliferarea
celulară are loc sau nu în interiorul particulelor de gelan ce conțin celule de drojdie. În
tabelul 27 sunt prezentate rezultatele obținute în urma determinărilor efectuate.
175
Tabel 27. Cantitatea de celule de drojdie din baia de fermentare consumată după fiecare
ciclu de fermentare:
Proba
Numărul
ciclului de
fermentare
Concentrația
de acetat de
zinc din baia
de extrudere
(%)
Numărul
total de
celule/ml x
104 măsurat
după
fiecare
ciclu de
fermentare
Cantitatea
totală de
celule de
drojdie
consumată
(mg)
Cantitatea
teoretică de
celule de
drojdie
rămasă în
particule (g)
A2D 6 0.01 51.5 0.142 0.37394
6 0.007 40.25 0.86065 0.37414
L2D 13 0.01 184.5 3.667852 0.37133
9 0.007 75.75 1.496716 0.3735
Testarea activității fermentative pentru probele analizate a avut loc în două medii de
fermentare diferite ce se diferențiază prin cantitatea de acetat de zinc în care este dizolvată
glucoza (0,01 %, respectiv 0,007%). PH-ul mediului de fermentare în toate cazurile
analizate a fost reglat la 5.
Rezultatele din tabelul 4 arată că din particulele testate în procesul de fermentare
difuzează un număr mic de celule, mult inferior celui rămas în particule. Ele demonstrează
faptul că fermentarea are loc dominant în particulele de gelan și nu este determinată de
celulele libere din supernatant.
Cantitatea de celule de drojdie care difuzează din particule după fiecare ciclu de
fermentare depinde de concentrația de acetat de zinc din baia de reticulare. Pentru proba
A2D cantitatea de celule este mai mică față de cantitatea de celule care difuzează din proba
L2D deoarece gradul de reticulare al probei A2D este mai mare.
Concentrația de acetat de zinc din mediul de fermentare are o influență
semnificativă asupra cantității de celule care difuzează din particule. Pentru obținerea unei
eficiențe optime în fermentare trebuie ca ionii de zinc din mediul de fermentare să aibă o
concentrație optimă. Astfel pentru probele cu 0,01% acetat de zinc în baia de fermentare
cantitatea de celule care difuzează din particule este mai mare decât în cazul probelor unde
s-au utilizat alte concentrații. Rezultatele obținute anterior în urma fermentărilor efectuate
într-un mediu cu concentrația în acetat de zinc de 0,01% și faptul că din particule difuzează
un număr mai mare de celule în mediul cu acestă concentrație ne determină să afirmăm că
aceasta poate fi concentrația optimă de acetat de zinc în mediul de fermentare pentru
obținerea unei eficiențe crescute a procesului. Difuzia unui număr mai mare de celule în
176
mediul de fermentare poate fi o consecință a faptului că ionii de zinc sunt absorbiți eficient
de celulele de drojdie care iși pot îndeplini rolurile fiziologice esențiale cum ar fi creșterea și
nutriția, ele se pot multiplica mai ușor la această concentrație ceea ce ar putea explica și
difuzia unui număr mai mare de celule în mediul de fermentare.
Faptul că particulele cu celule de drojdie pot fi recuperate cu ușurință din
fermentator și pot fi reutilizate în mai multe cicluri fermentative arată că matricea de gelan
protejeaza celulele de drojdie de metaboliții toxici produși de etanol, viabilitatea celulară se
păstrează iar celulele de drojdie ar putea prolifera în interiorul particulelor de gelan.
Procesul de fermentare depinde mult de concentrația de acetat de zinc utilizată în
baia de fermentare. Astfel pentru aceeași probă utilizând o concentrație de 0,01% se pot
obține mai multe cicluri fermentative cu randamente comparabile cu cele obținute la
fermentarea drojdiei libere, sau decât dacă în baia de fermentare utilizăm concentrații mai
mari sau mai mici de reticulant. O explicatie ar putea fi aceea că un mediu cu deficit în zinc
poate duce la încetinirea procesului de fermentare iar în cazul utilizării unei concentrații mai
mari de acetat de zinc are loc o reticulare suplimentară a particulelor de gelan. Nutrienții din
mediul de fermentare nu mai pot difuza în particule, iar în timp procesul de fermentare se
oprește deoarece celulele nu pot prolifera și nu isi pot exercita funcțiile metabolice necesare.
Trebuie menționat faptul că matricea polimeră are un rol protector față de celulele
imobilizate, permițând proliferarea lor și menținerea viabilității celulare la valori ridicate
(tabelul 5). Numărul, cantitatea și viabilitatea celulară au fost determinate după
dezintegrarea particulelor de imobilizat la terminarea celului fermentativ la care s-au
raposrta rezultatele în tabelul 5.
Se explică și în acest mod posibilitatea de reutilizare a imobilizatelor pe parcursul
mai multor cicluri de fermentare, cu randamente convenabile, superioare în majoritatea
cazurilor celui atins cu drojdia liberă.
177
Tabel 28. Numărul, cantitatea și viabilitatea celulelor de drojdie de bere imobilizate
în matricea de gelan reticulat cu ioni de Zn2+
după diferite
cicluri fermentative (L2D)
Numărul
ciclului de
fermentare
Numărul
de
celule/g
particule
x 10 8
Cantitatea
de
celule/g
particule,
mg
Viabilitatea
celulară, %
0 4,84 17,93 95,43
1 4,94 18,3 91,48
2 6,75 25 92,69
3 8,08 29,94
4 7,44 27,57 92,82
5 6,6 24,45
6 6,62 24,53
7 7,93 29,38
8 5,51 20,41 91,9
9 6,36 23,56 88,79
10 6,32 23,45
6.3.6. Productivitatea specifică și viteza de fermentare
Porțiunea liniară a curbelor cinetice ale procesului de fermentare permite evaluări
privind viteza cu care acesta se produce. Pe baza acestor informații s-a putut calcula
productivitatea specifică în etanol, rezultatele obținute pentru fiecare tip de particule.
Tabelul 29 prezintă, spre ilustrare rezultatele obținute în cazul fermentărilor cu probele A2D și
L2D.
178
Tabel 29:Valorile vitezei de fermentare și productivității specifice în etanol
obținute după fiecare ciclu de fermentare efectuat pentru probele A2D și L2D.
Proba
Numărul
ciclului de
fermentare
Concentrația
acetatului de
zinc în baia de
reticulare (%)
Viteza de
transformare
a glucozei
%/min
Productivitatea
specifică în
etanol, g
etanol/h x g
yeast
A2D
1
2
3
4
5
6
0.01
0.11
0.13
0.13
0.13
0.13
0.089
0.59
0.59
0.59
0.59
0.2
0.2
1
2
3
4
5
6
0.007
0.13
0.13
0.089
0.13
0.089
0.067
0.59
0.59
0.59
0.39
0.59
0.37
L2D
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
0.01
0.13
0.13
0.11
0.089
0.49
0.089
0.067
0.84
0.13
0.29
0.089
0.156
0.044
0.59
0.59
0.39
0.39
0.74
0.59
0.59
0.59
0.39
0.82
0.39
0.39
0.59
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.007
0.13
0.13
0.22
0.51
0.22
0.13
0.13
0.13
0.18
0.59
0.67
0.99
0.99
1.03
0.59
0.59
0.32
0.59
Viteza de fermentare pentru drojdia liberă este de 0.067 % conversie glucoză/ min
iar productivitatea specifică pentru drojdia liberă este de 0,18 g etanol/g glucoză x g drojdie.
Se constata că viteza procesului se plaseaza în aceeași ordine cu randamentul de
fermentare, pentru toate probele analizate. Viteza de fermentare pentru majoritatea ciclurilor
179
fermentative efectuate este superioară celei obținute la fermentarea drojdiei libere. Procesele
fermentative pentru probele A2D și L2D s-au efectuat în două medii de fermentare ce diferă
prin concentrația de acetat de zinc în care se dizolvă glucoza.
În majoritatea ciclurilor de fermentare vitezele de fermentare obținute cu particulele L2D sunt
superioare celor obținute la fermentarea probei A2D.
Referitor la productivitatea specifică în etanol se constată că pentru cele mai multe
cicluri de fermentare efectuate s-a obținut o productivitate superioară sau egală cu
productivitatea specifică obținută la fermentarea cu drojdie liberă.
Concluzii
Acetatul de zinc poate constitui un candidat important ca reticulant ioinic al
gelanului, permițînd obținerea de imobilizate de drojdie în matricea polizaharidului.
Comparativ cu reticulările determinate de ionii de Ca2+
respectiv Mg2+, concentrațiile ionului
de Zn2+
pentru obținerea acelorași performanțe în reticulare sunt cu un ordin de mărime mai
mici, datorită capacității acestui metal tranzițional de a realiza rticulări suplimentare prin
angajarea de legături coordinative cu gelanul.
Particulele obținutsunt stabile în timp în medii apoase iar viabilitatea celulară are
valori de peste 85% după 24 de ore de păstrare a particulelor în apă bidistilată ceea ce
semnifică că matricea de gelan are un rol protector.
Valoarea gradului de umflare crește atunci când gradul de reticulare scade iar
rezultatele sunt în concordanță cu cele obținute la testele reologice.
Particulele care au un grad de reticulare mai mare sunt cele mai stabile din punct de vedere
mecanic.
Microscopia electronică de baleiaj evidențiază faptul că celulele de drojdie se
găsesc în număr mare în particulele de gelan, iar probele mai puțin reticulate au o structură
mai poroasă, porozitatea lor scazând cu creșterea gradului de reticulare.
Activitatea fermentativă depinde mult de concentrația de acetat de zinc utilizată în
preextrudat, în baia de reticulare și în mediul de fermentare.
PH-ul mediului de fermentare și timpul de păstrare al particulelor în baia de
reticulare influențează activitatea fermentativă a particulelor.
Rezultatele obținute conduc la stabilirea condițiilor optime de obținere a imobilizatelor:
concentrația soluției de gelan 1%, concentrația acetatului de zinc în preextrudat 0,02 %,
concentrația acetatului de zinc din baia de reticulare 0,07%, concentrația acetatului de zinc
180
din mediul de fermentare 0,01%, pH-ul mediului de fermentare 5, timpul optim de păstrare
al particulelor în baia de reticulare 2 ore.
Particulele de imobilizat reticulate ionic cu acetat de zinc pot fi recuperate cu
ușurință din mediul de fermentare prin filtrare și pot fi utilizate în mai multe cicluri
fermentative, numărul maxim fiind 13.
Productivitatea specifică în etanol obținută la fermentarea probelor cu celule de
drojdie imobilizate este comparabilă (la unele cicluri de fermentare chiar mai buna) cu
productivitatea specifică în etanol obținută la drojdia liberă.
Particulele de gelan cu celule de drojdie imobilizate obținute pot fi utilizate cu
succes în procese fermentative și ar putea reprezenta o nouă abordare în rezolvarea
problemei deficitului de zinc cu care se confruntă producătorii din industria berii.
6.4. Particule pe bază de amestecuri de gelan și carboximetil celuloză reticulate cu
acetat de zinc, conținând celule de drojdie imobilizate
Imobilizarea celulelor de drojdie în matrici polimere are numeroase consecințe
pozitive: protecția celulelor față de acțiunile mecanice și factori de mediu (pH, presiune
osmotică, turbulența mediului în care lucrează), realizarea unui schimb eficient de nutrienți
și metaboliți cu mediul exterior, recuperarea ușoară din mediile de fermentare și reutilizarea
într-un alt ciclu fermentativ etc. Imobilizatele astfel obtinute pot fi considerate adevarate
bioreactoare, cu eficiență mult mai ridicată decât în cazul utilizării drojdiei libere,
dependentă și de suprafaţa lor specifică, porozitate, capacitate de umflare şi stabilitate.
Polizaharidele îndeplinesc condiţiile cerute pentru imobilizarea unui principiu
biologic activ, în particular a celulelor de drojdie, așa cum s-a evidențiat în mai multe
rânduri pe parcursul acestei lucrări de doctorat: sunt lipsite de toxicitate, inerte
farmacologic, nu conţin impurităţi sau aditivi şi compuşi reziduali ai proceselor de reticulare
sau polimerizare, prezintă structură chimică bine precizată. Abilitatea lor de a forma geluri
fizice chiar şi la concentraţii foarte mici reprezintă una dintre cele mai importante proprietaţi
funcţionale ale acestora. Formarea structurilor tridimensionale oferă o cale de creştere a
stabilităţii chimice şi mecanice a sistemului.
Posibilitatea utilizării gelanului ca matrice polimeră pentru realizarea de astfel de
imobilizate a fost discutată anterior. In literatură există informații privind posibilitatea
utilizării de amestecuri de polizaharide ionice, una dintre acestea fiind carboximetil celuloza
în forma sa solubilă în apă – sarea de sodiu (CMCNa).
181
Carboximetil celuloza (CMC) este un eter celulozic care dizlovat în apă conduce la
formarea unor soluţii coloidale, ce conţin, la concentraţii mici, macromolecule filiforme, iar
la concentraţii mari geluri. Soluţiile de CMCNa sunt pseudoplastice, iar gelurile tixotrope;
sunt vâscoase la pH acid (vâscozitatea creste cu scaderea valorii pH-ului), vâscozitatea
scăzând cu cu temperatura, dar revinind la valoarea iniţială după răcire [564]. CMCNa este
un polimer biocompatibi, netoxic, dar nebiodegradabil. După informațiile noastre nu a fost
încă utilizat în scopul imobilizarii celulelor de drojdie de bere. De asemenea, în literatura nu
există informații privind utilizarea unor amestecuri de Gelan și CMCNa pentru realizarea de
matrici destinate încapsulării celulelor de drojdie.
Prezentul subcapitol raportează rezultatele obținute utilizând amestecuri de gelan și
CMCNa ca suporturi pentru imobilizarea de celule de drojdie. Imobilizatele au fost realizate
prin gelifiere ionotropă în prezența acetatului de magneziu, printr-un proces de extrudere
prin capilară a suspensiilor de drojdie în solutia de polimer. La baza alegerii procedeului,
agentului de reticulare și a parametrilor procesului au stat informațiile prezentate în
subcapitolul 5.2, referitor la obținerea matricilor sferice doar din gelan reticulat ionotrop cu
ioni de Mg2+
.
Cele două polizaharide cu care s-a lucrat sunt deci polianioni, care diferă prin masa
moleculară (mai redusă la CMCNa) si prin densitatea anionilor carboxilat de-a lungul
lanțului polimeric: un anion la fiecare patru cicluri de glucoza din gelan (unitatea
structurală) respectiv 0,75 anioni pe fiecare ciclu de glucoză din CMCNa. Rezultă că
CMCNa, deși se caracterizează prin masă moleculară mai coborâtă, poate genera rețele mai
dense decât gelanul prin reticulare ionotropă cu cationi bivalenti.
Realizarea imobilizatelor de drojdie în matricea de polizaharide are la bază,
evident, fixarea celulelor în ochiurile rețelei formate prin reticularea ionică a lanțurilor
polimere, ca urmare a legării ionice a cationilor de magneziu la anionii carboxilat ai Gll și ai
CMCNa. Teste preliminare au dovedit că CMCNa nu formează singură particule stabile,
probabil datorita masei moleculare mai reduse.
Utilizând însâ amestecuri ale celor două polizaharide se formează o rețea
interpenetrată/interconectată, foarte stabilă. Structura schematică a unei astfel de rețele este
prezentată în figura 60. Celulele de drojdie, cu sarcina electrică negativă în suprafață, pot
lega ionii de Mg2+
consolidând astfel structura rețelei polimere.
Pe baza rezultatelor preliminare,în scopul efectuării studiului au fost obținute 5
tipuri de particule, cu și fără drojdie, ale caror notații și compoziții ale amestecului de
polizaharide de plecare sunt prezentate în tabelul 30.
182
Figura 60. Structura schematică a rețelei ionice interpenetrate/interconectate dintre gelan și
CMCNa, formată prin reticulare ionică cu Mg2+
.
Tabel 30. Codificarea probelor obținute și compoziția acestora*
Codificarea probei
Gelan
(%)
CMCNa
(%)
fără
drojdie
cu
drojdie
P0 PD0 100 0
P1 PD1 80 20
P2 PD2 65 35
P3 PD3 50 50
P4 PD4 35 65
*Concentrația soluției de Mg(OCOCH3)2 în preextrudat = 0.4 %
Concentrația soluției de Mg(OCOCH3)2 în baia de extrudere = 2 %
În toate cazurile, particulele obţinute sunt sferice şi au diametrul de aproximativ 2,5
mm în stare umflată, așa cum se obțin din procesul de extrudere.
Rezultatele obținute pentru particulele pe baza amestecului de polizaharide vor fi
comparate, în multe cazuri, cu cele obținute pentru particule pe bază doar de gelan, chiar
dacă acestea au fost discutate la subcapitolul 5.2.
183
6.4.1. Evaluarea stabilității și a viabilității celulare
Pentru evaluarea stabilității în timp, a cărei importanță a fost subliniată în mai multe
rînduri, s-a procedat la determinarea turbidității soluțiilor în care particulele au fost
suspendate. S-a stabilit această mărime la diferite intervale de timp atât în soluția de
extrudere cât și în apă bidistilată. În tabelul 2 sunt prezentate rezultatele obținute în urma
măsurării turbidității (transmitanței) a două medii apoase în care au fost suspendate
particulele. Codurile particulelor conținând drojdie conțin literea D.
Tabel 31. Valoarea transmitanței unor medii apoase în care au fost suspendate particulele cu
și fără drojdie încapsulată*
Se observă că particulele care nu conțin celule de drojdie au valori ridicate ale
transmitanței atât în soluția de reticulare după 24 ore, cât și în apă bidistilată după 48 h (P0-
P4 comparativ cu PD0-PD4). Valoare ușor mai coborâtă a transmitanței în apă distilată se
obține în cazul particulelor constituite doar din gelan. Se poate deci afirma că particulele de
hidrogel formate din amestecuri gelan/CMCNa sunt puțin mai stabile comparativ cu
particulele de gelan obținute în aceleași condiții, evident datorită densității mai mari a
rețelei.
Totuși cu creșterea cantității de CMCNa se observă o ușoară scădere a valorilor
transmitanței. Singura explicație posibila este aceea ca datorită dimensiunii mult mai mici a
macromoleculelor de CMCNa comparativ cu cele ale gelanului, cele situate pe suprafața
Proba
Transmitanța , T %
în soluția de
extrudere în apă bidistilată
12h 24 h. 12h 24h. 36h. 48h
P0 99.8 99.0 99 98.2 96.7 96,7
P1 99.3 99,1 99,8 99,5 98,9 98,6
P2 99,3 98,8 99,5 99,4 98,8 98,5
P3 99 98,4 99,5 99,1 98,7 98,3
P4 98,4 98,2 99,3 98,7 98,3 98,1
P0D 96.3 94.8 96.8 90.2 88 88
P1D 98,4 98 99,1 98,7 98,3 98
P2D 98,4 97,4 99,1 98,6 98,1 97,8
P3D 97,9 97,4 99,2 98,2 97,5 97
P4D 97,3 96,7 99 98,2 97,4 96,9
184
particulelor, nefiind legate în rețea, se pot desprinde în număr tot mai mare odata cu
creșterea cantității acestui polimer în amestec. De altfel, după cum am menționat anterior,
CMCNa singur nu poate forma particule stabile, acestea dezagregându-se imediat după
extrudere. Și la particulele ce conțin drojdie valorile transmitanței scad puțin cu creșterea
conținutului de CMCNa, dar se mențin totuși mai mari în comparație cu proba care conține
doar gelan.
În cazul tuturor particulelor, cu și fără drojdie încapsulată, stabilitatea scade ușor în
timp, păstrându-se totuși ridicată (minimul înregistrat pentru transmitanță este de 96,7 %).
Pentru utilizarea în cicluri fermentative repetate a particulelor ce conțin celule de
drojdie eficiența biocatalitica depinde mult de viabilitate și de capacitatea de proliferare a
celulelor. Tabelul 32 prezintă rezultatele obținute în urma determinărilor efectuate.
Tabel 32. Viabilitatea celulară concentrațiade celule din mediile în care au fost păstrate
imobilizatele
Proba
Concentraţia celulelor de drojdie
(număr celule/ml x 104) în supernatant
Viabilitatea celulară, %
în soluție de
acetat de
magneziu
2%
în apă bidistilată
în soluție de
acetat de
magneziu
2%
în apă bidistilată
12h 24h 12h 24h 36h 48h 12h 24h 12h 24h 36h 48h
P0D 16,5 38 58,5 96 95,73 94,15
P1D 2,5 4,5 1,5 2,5 2,75 4,5 100 94,74 100 90,91 91,66 90
P2D 2,75 6 2 3 3,75 5 100 96 88,89 92,31 93,75 90,9
P3D 7,25 9 2,75 7 9,25 12 100 94,73 100 94,11 94,87 94,11
P4D 7,75 9,5 5,75 8 9,5 14 100 95 94,44 93,33 95 94,92
Se constată că la probele care au o valoare a transmitanței mai scăzută, concentrația
celulelor în supernatant este mai ridicată, ceea ce semnifică faptul că turbiditatea
supernatantului este dată nu doar de polimerul desprins din rețea ci și de celulele neprinse în
matrice. Cu creșterea concentrației de CMCNa în amestecul de polimeri se observă o
creștere a concentrației celulelor. Aceste rezultate sunt în completarea celor obținute la
măsurarea transmitanței. Cu cât crește gradul de reticulare cu atât ochiurile rețelei
polimerice sunt mai mici, rețeaua este mai densă, și nu mai permite includerea tuturor
celulelor, o parte dintre acestea rămânând, probabil, doar adsorbite în suprafață. În cazul
185
probei P0D se poate observa faptul că numărul de celule care difuzează din particule este
mult mai mare în comparație cu numărul de celule care difuzează din celelalte probe
analizate.
Se observă că viabilitatea celulară are valori ridicate pentru toate probele analizate
după diferite perioade de timp. Acestea atestă faptul că matricea polimeră protejează celulele
impotriva unor factori degradativi, astfel încât viabilitatea lor se pastrează în timp.
Stabilitatea în medii alcoolice a fost evaluată pentru a evidenția faptul că matricea
polimeră în care celulele de drojdie sunt imobilizate le protejează de metaboliții toxici care
se găsesc în etanol. În tabelul 4 sunt prezentate valorile transmitanței și ale viabilității
celulare pentru probele P2D si P4D, comparativ cu proba P0D. Valorile transmitanței la
probele cu drojdie sunt redate în tabelul 32.
Tabel 33. Valorile transmitanței și viabilității celulare în medii alcoolice
Proba Transmitanța, T%
Concentraţia celulelor
de drojdie
(număr celule/ml x 104)
Viabilitatea celulară, %
12h 36h 60 h 84h 12h 36h 60h 84h 12h 36h 60 h 84h
P0D 99.2 98.3 98 97.6 3 3.5 4.5 5.5 100 93.3 90 88
P2D 98,9 98,4 98,2 97,8 1,75 2,75 4 5 87,5 91,66 94,11 90,9
P4D 98,9 98,8 98,6 97,9 3,75 5 6 7,25 93,75 90,91 92,3 90,62
Transmitanța are valori mari, ceea ce semnifică faptul că stabilitatea în alcool a
particulelor este ridicată. Rezultatele arată faptul că valoarea transmitanței crește cu
creșterea conținutului de CMCNa. Viabilitatea celulară se păstrează la valori ridicate chiar și
după 84 h de păstrare în medii alcoolice (peste 90 %) pentru particulele cu celule de drojdie
imobilizate ce conțin CMCNa, fiind ușor mai redusă pentru pentru particulele de gelan
(88%).
Se poate afirma pe baza rezultatelor obținute, că matricea polimeră alcătuită din
cele două polizaharide protejează celulele de drojdie imobilizate de metaboliții toxici din
etanol, iar particulele de pe bază de amestec gelan-CMCNa oferă o protecție îmbunătățită
celulelor de drojdie imobilizate comparativ cu particulele doar de gelan.
186
6.4.2. Gradul de umflare în apă
Toate particulele obtinute manifesta un puternic caracter de hidrogel, astfel încât s-a
considerat utilă și în acest caz evaluarea comportarii lor la umflare în apă, prin determinarea
variației gradului de umflare pe un interval de timp de 20 ore (fig. 4)
Figura 61. Cinetica procesului de umflare pentru particule fără drojdie.
Pentru particulele care conțin CMCNa se obțin valori mai mici ale gradului maxim
de umflare comparativ cu P0 (care conține doar gelan), rezultat al densității mai mari de
reticulare, în concordanță cu valorile transmitanței discutate anterior. Gradul maxim de
umflare scade cu creșterea concentrației de CMCNa în particule, deci cu creșterea gradului
de reticulare, efect pe care l-am anticipat când am selectat CMCNa ca partener în
coreticulare cu gelanul, dat fiind numărul mare de grupări carboxilat, reticulabile, pe care îl
conține.
Pentru particulele continand celule de drojdie imobilizate se constată că gradul
maxim de umflare pentru toate probele analizate este mai mic comparativ cu cel caracteristic
celor fără drojdie (Fig. 62). Acest efect probează încă o dată faptul că celulele de drojdie, cu
sarcini electrice negative pe suprafață, participă practic la reticulare ranforsând structura și
rămânând astfel puternic ancorate în rețeaua polimeră. Și în acest caz valoarea gradului de
umflare scade cu creșterea concentrației de CMC.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
0 5 10 15 20 25
P1 P2 P3 P4P0
Time (h)
Sw
ell
ing
de
gre
e, S
D %
187
Figura 62. Cinetica procesului de umflare în apă la particulele ce conțin celule de drojdie
imobilizate.
6.4.3. Morfologia particulelor
Morfologia particulelor în stare de echilibru apă/gheață, ca și uscate a fost
evidențiată prin microscopie electronică de baleiaj a secțiunilor acestora. În figura 63 sunt
prezentate fotografii corespunzatoare particulelor fără celule de drojdie, realizate prin
înghețarea acestora și analiza lor prin tehnica ‖environemental‖.
a b c
Figura 63. Fotografii de microscope electronică de baleiaj pentru particule fără celule de
drojdie realizate în secțiune pe probe înghețate: P0 (a), P2 (b), P4 (c) (grade diferite de
mărire).
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 10 20 30 40
Q% P1 +D Q% P2+D
Q% P3+D Q% P4+D
Time (h)
Sw
ell
ing
de
gre
e, S
D%
188
Se constată ca proba P0, prezintă o secțiune mai neuniformă și o porozitate mai
accentuată. Cu creșterea concentrației de CMCNa suprafața particulelor devine tot mai
uniformă iar porozitatea scade.
În figura 64 sunt prezentate fotografii de microscopie electronica de baleiaj în
secțiune pentru particule ce contin celule de drojdie.
(a) (b) (c)
Figura 64. Microscopie electronică de baleiaj pentru particule cu celule de drojdie
încapsulată, realizate în secțiune în stare uscată, metalizate: P0D (a), P2D (b), P4D (c)
(diferite grade de mărire)
Cu creșterea conținutului de CMCNa, suprafața particulelor devine mai densă,
gradul de reticulare al particulelor crește iar porozitatea diminuiază. Trebuie evidențiată
populația mare de celule din particulele de imobilizat, atestând faptul că aceste particule pot
constitui microbioreactoare utilizabile în procese fermentative.
6.4.4. Evaluarea capacității de fermentare a glucozei în prezența imobilizatelor
obținute în diferite condiții
Activitatea fermentativă a fost evaluată pentru toate particulele cu drojdie
imobilizată obținute, la temperatura de 30˚C și pH 5 (dovedit optim în testele anterioare).
189
După fiecare ciclu de fermentare particulele au fost recuperate din fermentator prin filtrare,
spălate cu apă bidistilată și păstrate la frigider la temperatura de 4-6˚C până la următorul
ciclu fermentativ. Fiecare ciclu de fermentare a durat 255 minute iar intervalul dintre cicluri
a fost de 24 ore.
Câteva curbe de fermentare obținute sunt prezentate în figura 65.
I II III
IV V VI
VII VIII IX
Figura 65. Evoluția în timp a randamentului în glucoză fermentată pentru 9 cicluri succesive de
fermentare, în prezența particulelor de gelan și gelan/CMC ce conțin celule de drojdie. (Indicele
numeric reprezintă numărul ciclului de fermentare)
Eficiența fermentării dupa 255 minute pentru cele 9 cicluri, la cele 5 tipuri de particule
este prezentată în diagramele din figura 66:
190
a b c
d e f
g h i
Figura 66: Randamentul maxim în glucoză fermentată după câteva cicluri de fermentare pentru
particule cu celule de drojdie imobilizate comparativ cu drojdia liberă
Din curbele de fermentare și din diagrame se poate constata că pentru proba P0D
eficiența procesului este mai bună comparativ cu celelalte probe analizate, începând cu cel de al
patrulea ciclu de fermentare. Explicația poate fi corelată cu porozitatea mai mare a particulelor,
respectiv densitatea de reticulare mai mică, ce facilitează difuzia substratului la celulele de
drojdie imobilizate. Eficiență ușor mai ridicată în fermentare față de proba P0D, manifestă în
primele 3 cicluri imobilizatele pe bază de gelan/CMCNa. Ea poate fi determinată de faptul că
gradul mai redus de reticulare permite ieșirea din matricea polimeră a unui număr mai mare de
celule, după cum demonstreaza rezultatele privind viabilitatea celulară (Tabelul 31). Probele de
gelan/CMCNa formează o rețea interpenetrată mai densă și mai stabilă datorită gradului de
reticulare mai mare, astfel încât din rețea difezează mai puține celule, cele rămase în matrice
determinând o eficiență mai ridicată a fermentarii.
Important este faptul ca imobilizatele, indiferent de tipul matricii, pot fi reutilizate în
numeroase cicluri de fermentare (în studiul de față s-a mers până la 9 cicluri) fără o pierdere
191
prea mare a activității biocatalitice. Matricea polimeră păstrează, deci, viabilitatea celulară și
protejează celulele de metaboliții toxici produși de etanol și de factorii de mediu, efecte
demonstrate anterior prin testele de stabilitate în alcool. Mai mult, este foarte probabil ca
celulele sa prolifereze în matrice, efect care poate explica parțial activitatea biocatalitică foarte
puțin modificată în timp.
Eficiența fermentării cu toate tipurile de biorecatoare analizate, în majoritatea
ciclurilor realizate este superioară față de cea obținută la fermentare cu drojdie liberă.
Particulele sunt recuperate cu ușurință din fermentator și se pot utiliza în mai multe cicluri de
fermentare repetate.
6.4.5. Productivitatea specifică și viteza de fermentare
Viteza procesului de fermentare și productivitatea specifică, calculate pe baza curbelor
cinetice, permit următoarele constatări. Vitezele se plasează în aceeași ordine cu randamentul de
fermentare pentru toate probele analizate, excepție făcând proba P0D pentru care viteza este
superioară începând cu ciclul 4 de fermentare.
Valorile productivității specifice a bioreactoarelor comparativ cu drojdia liberă, pentru
câteva cicluri de fermentare alese aleator, sunt prezentate in Tabelul 34.
Tabelul 34. Productivitatea bioreactoarelor pentru cele 5 tipuri de particule conținând celule de
drojdie imobilizată, pentru câteva cicluri de fermentare (alegere aleatorie).
Number of
the
fermentation
cycles
Productivity [(g ethanol/h x g yeast])/particles type
Free
Yeast
P0D P1D P2D P3D P4D
I 0,70 0,63 0,60 0,60 0,60
II 0,60 0,80 0,80 0,60 0,60
III 1,83 0,60 0,60 0,80 0,60
IV 0,57 1,30 0,60 0,80 0,60 0,60
V 1,73 0,60 0,60 0,60 0,60
VI 2,00 0,60 0,60 0,60 0,60
VII 0,60 0,60 0,80 0,60 0,60
VIII 1,00 0,60 0,60 0,60 0,60
IX 1,57 0,60 0,60 0,60 0,60
192
Concluzii
Gelanul în amestec cu carboximetil celuloza pot fi reticulate ionic formând entități
sferice, capabile să încorporeze celule de drojdie. Avantajul potențial al acestui amestec,
comparativ cu gelanul simplu, îl poate constitui prețul de cost mai scăzut implicat de realizarea
particulelor, dat fiind costul unitar mai redus al derivatului de celuloză.
Coreticularea celor două polizaharide cu ioni de Mg2+
este mai avantajoasă decât cu ioni
de calciu, date fiind beneficiile aduse de prezența Mg celulelor de drojdie.
Densitatea de reticulare a amestecului de polizaharide depinde de compoziția sa, crescând cu
creșterea conținutului de carboximetil celuloză, și se reflectă în toate caracteristicile particulelor
obținute: stabilitate strcturală, morfologie, comportare în mdeii apoase, capacitate de fermentare
a glucozei.
Bioreactoarele pe bază de amestec al celor două polizaharide pot fi utilizate într-un
număr mare de cicluri fermentative, fără o pierdere semnificativă a activității biocatalitice, și pot
fi foarte ușor separate din mediul de fermentare prin simplă filtrare.
6.5. Particule pe bază de amestecuri de gelan, carboximetil celuloză și caragenan
reticulate cu acetat de zinc, conținând celule de drojdie imobilizate
După cum s-a subliniat de mai multe ori pe parcursul lucrării, polizaharidele ionice
sunt candidați ideali pentru imobilizarea de principii biologic active, în particular celule de
drojde. Frecvent utilizați sunt alginații, ale căror avantaje și dezavantaje au fost precizat în
studiul bibliografic. Mai multe lucrări semnalează utilizarea gelanului, care și pentru
cercetările din cadrul tezei de doctorat a constituit suportul de bază. Mai puțin utilizată este
carboximetil celuloza sare de Na (CMCNa), în forma liberă sau modificat chimic, de
exemplu prin grefare cu lanțuri de polimeri sintetici, dar biocompatibili.
Un candidat important pentru bioaplicații îl constiue caragenanul, poligalactan
bogat în esteri sulfat, care ii imprima o temperatură de solubilizare mai mică dar o tărie mai
mică a gelului [399]. K-caragenan a fost cu succes utilizat ca matrice pentru imobilizarea
celulelor de drojdie permițând obținerea unei productivități crescute în etanol. H.Y. Wang
and D. Hettwer (1982) au adăugat în matricea de gel pe bază de k-caragenan hidroxiapatita
sau fosfat tricalcic. Fosfatul tricalcic menține pH-ul la un nivel optim, susține viabilitatea
celulară, creste densitatea gelului și productivitatea în etanol [405]. Particule de k-caragenan
cu celule de drojdie imobilizată prin metoda extruderii utilizând ca agent de reticulare KCl
au mai fost obținute de către A.M. Martinez et al.,(2016) și Francesc Godia et al.(1987).[
193
406, 446]. Particule de K-karageenan au fost obținute și prin tehnica emulsifierii, care
presupune dispersia soluției apoase de polizaharid într-o fază organică nemiscibilă urmată de
gelifierea și separarea microparticulelor. Deoarece particulele de k-caragenan nu sunt foarte
stabile ele pot fi acoperite cu un strat de chitosan care reduce mărimea porilor iar stabilitatea
mecanică și chimică a gelului crește [459].
Celulele de drojdie necesită o gamă largă de metale pentru proliferarea lor și pentru
metabolism. Ionii metalici au un impact semnificativ asupra unor parametri importanți:
viteza de conversie a zahărului în etanol, în randamentul final în etanol, creșterea și
multiplicarea drojdiei, viabilitatea celulara, factorii de stres și comportamentul de floculare a
drojdiei. [11]. Cationii Mg2+
și Zn2+
sunt cofactori pentru multe enzime glicolitice și
constituie modulatori la factorii de stres pentru drojdie: fluctuații rapide de temperatură,
presiune osmotică ridicată, concentrația crescută în etanol și lipsa nutrienților care afectează
în mod negativ metabolismul celulelor de drojdie și poate rezulta astfel un proces de
fermentare ineficient. [14, 15].
Mg are un rol important în reglarea metabolismului celulei de drojdie, in
menținerea integrității structurale și funcționalității organitelor intracelulare induse de
interacțiunile celulă-celulă cum ar fi flocularea, reglarea expresiei genelor, mecanismul de
absorbție a nutrienților, activarea enzimelor implicate în metabolism [28, 31]
Zincul are rol de activator enzimatic al alcoologenazei și al dehidrogenazei,
stimulează absorbția de maltoză și maltotrioză în procesele de obținere a drojdiei, permițând
obținerea unor randamente mari în fermentare. De asemenea, el are un rol benefic asupra
stabilității și dinamicii membranei celulare.
Calciul protejează, de asemenea, celulele de drojdie împotriva efectelor toxice
produse de etanol. Dacă se utilizează în concentrații mari, pot înlocui magneziul și conduce
la o creștere celulară și păstrarea viabilității celulare; totodată, are un efect tampon
împiedicând creșterea pH-ului în mediu și favorizând creșterea randamentului de
transformare a glucozei.
Puține lucrări tratând obținerea de imobilizate de drojdie prin gelifierea ionotropă a
unor polizaharide anionice au abordat utilizarea unor amestecuri de astfel de polimeri. De
asemenea, puține studii discută, comparativ, rezultatele obținute în utilizarea celor tipuri de
cationi meralici amintiți mai sus.
Cercetarea intreprinsa de noi are ca scop imobilizarea celulelor de drojdie in matrici
obținută din amestecul a trei polizaharide: gelan, i-caragenan și CMCNa, prin metoda
gelifierii ionotrope prin extrudere utilizând ca agenți de reticulare acetatul de calciu, acetatul
194
de magneziu și acetatul de zinc. Caracterul original constă pe de o parte în utilizarea
amestecului de trei polizaharide în preparea matricei pentru imobilizarea celulelor precum și
in utilizarea a trei agenți de reticulare diferiți. Utilizarea amestecului celor trei polizaharide
este justificată de următoarele considerente.
Gelanul poate genera singur particule prin gelifiere ionotropă, dar nu conferă o
porozitate adecvată. CMCNa are rolul de a crește gradul de reticulare al particulelor datorită
numărului mai mare de grupe carboxilat conținute. Caragenanul participă la reticulare prin
grupele –SO3H dar imprimă și porozitate ridicată particulelor facilitând difuzia substratului
și a produșilor de reacție. S-a studiat, în consecință, influența raportului dintre cei trei
polimeri asupra caracteristicilor fizico-chimice și morfologice, respectiv a capacității de
fermentare a bioreactoarelor formate prin imobilizarea celulelor de drojdie în matricile
sferice formate pe baza amestecului celor trei polizaharide.
Pe baza informațiilor din literatură privind capacitatea diferită de reticulare a unor
cationi metalici divalenti, precum și influența acestora asupra proliferării celulelor de
drojdie, s-a studiat influenta a trei cationi metalici (Mg2+
, Ca2+
, Zn2+
) asupra caracteristicile
fizico-chimice ale particulelor cât, mai ales, asupra activității fermentative a bioreactoarelor
obținute.
Polizaharidele selectate pentru acest studiu au caracter de polianion, și în consecință
capacitatea de gelifiere ionotropă, respectiv de formare a unor rețele cu caracter de hidrogel,
datorită caracterului lor puternic hidrofil. Teste preliminare au condus la concluzia ca
gelanul în amestec cu i-caragenanul formează în prezența cationilor bivalenți o rețea
polimerică interconectată cu o porozitate mare. Celulele de drojdie incluse în particule
difuzează din matrice într-un numar mare în mediul în care sunt păstrate, iar particulele de
imobilizat devin instabile în timp. Pentru a crea o rețea polimerică, mai stabilă și mai densă
astfel încât celulele de drojdie să fie bine fixate în matrice, s-a optat pentru utilizarea
suplimentară a CMCNa cu masă moleculară mai redusă, care conține numeroase grupări
carboxilice și poate genera împreună cu gelanul și caragenanul, prin gelifiere ionotropă,
rețele polimerice interconectate mai stabile structural. Imobilizarea celulelor de drojdie în
matricea de polizaharide are la bază fixarea acestora în ochiurile rețelei obținute prin
reticularea ionică a lanțurilor polimere, ca urmare a legării cationilor metalici la anionii
carboxilat ai gelanului, ai CMCNa și la grupările sulfat acid din caragenan. Utilizând
amestecuri ale celor trei polizaharide se formează o rețea interconectata, stabilă, cu o
porozitate adecvată care permite o difuzie optimă a nutrienților în matricea polimeră astfel
încât viabilitatea celulară să fie păstrată în timp. Structura schematică a unei astfel de rețele
195
este prezentată în figura 67. Celulele de drojdie, cu sarcina electrică negativă în suprafață se
pot lega de ionii de Me2+
consolidând astfel structura rețelei polimere.
Figura 67. Reprezentare schematică a matricei polimere
conținând celule de drojdie imobilizate.
Studii sistematice anterioare [443] au permis să se stabilească faptul că în cazul
utilizării gelanului ca matrice, concentrația optimă a soluțiilor de (CH3COO)2Ca si
(CH3COO)2Mg în baia de reticulare este de (2,1x10-1
M) astfel încât pentru obținerea tuturor
particulelor s-a utilizat această valoare. Incercări preliminare de reticulare cu (CH3COO)2Zn
la aceeași concentrație au condus însă la imobilizate incapabile, practic, să declanșeze
procesul de fermentare. Explicația este datorată faptului că densitatea rețelei este mult prea
ridicată, datorată participării Zn (metal tranzitional) la reticulare nu numai prin legături
ionice, ci și coordinative. Randamente și viteze de fermentare comparabile cu ale
imobilizatelor realizate în prezența ionilor de Ca și Mg (metale din grupa II-a principală), s-
au obținut pentru concentrații ale ionilor de Zn cu un ordin de mărime mai redus, motiv
pentru care reticularea cu acest cation s-a realizat la o concentrație a (CH3COO)2Zn de 1.1 x
10-2
M (respectiv 0,2%). Concentrațiile celor trei cationi au fost diferite și în preextrudat:
0.028 M pentru acetații de Ca și Mg, respectiv 1,1 x 10-3
M pentru sarea de Zn.
Concentrațiile diferite ale cationilor se justifică și din alt motiv: celulele de drojdie
necesită pentru o creștere optimă o cantitate mai mare de magneziu și calciu, în timp ce ionii
de zinc sunt necesari în cantități foarte mici. [73]
Pentru obținerea particulelor de Gel\CMCNa\Car reticulate ionic cu Ac2Ca, Ac2Mg
si Ac2Zn au fost utilizate diferite rapoarte masice ale polimerilor, programul experimental
complet fiind prezentat în Tabelul 35.
Tabel 35. Programul experimental
196
Proba Gel
% Car %
CMCNa
%
Concentrația agentului de
reticulare din preextrudat,
M*
Concentrația de agent de
reticulare din baia de
extrudere, M**
Ac2Mg Ac2Ca Ac2Zn Ac2Mg Ac2Ca Ac2Zn
D1 40 30 30
2,8
x10-2
2,8x10
-2
1,1x10
-3
2,1x10
-1
2,1x10
-1
1,1x10
-2
D2 40 20 40
D3 20 40 40
D4 33 33 33
*Volumul de soluție de reticulant în preextrudat - 1,25 ml; **volumul de soluție de
reticulant în baia de gelifiere - 125 ml.
Particulele cu celule de drojdie imobilizate au același raport masic între polimeri și
au fost obținute în aceleași condiții. Pentru a le diferenția față de cele fără celule de drojdie
au fost codificate cu D1Y, D2Y, D3Y și D4Y. Toate particulele obținute sunt sferice și au
diametrul mediu de 2-3 cm.
6.5.1. Caracterizarea particulelor prin spectroscopie FTIR-ATR
Spectroscopia FTIR a fost utilizată pentru a stabili prezența polizaharidelor ăîn
particulele obținute. S-au înregistrat spectrele IR pentru cei trei polimeri (Gel, Car, CMCNa)
și spectrele pentru particulele obținute, reticulate cu Ac2Ca și Ac2Zn.
Figura 68 prezintă spectrele FTIR inregistrate.
(a) (b)
197
(c) (d)
(e)
Figura 68. Spectrele FTIR pentru:(a) Gel, (b) Car, (c) CMCNa și pentru particulele
obținute din amestecul cu cei trei polimeri reticulate cu (d) acetat de calciu și (e) acetat de
zinc.
Spectrele FTIR atestă calitativ prezența fiecărei polizaharide în compoziția
particulelor. Astfel banda de la 1052,9 cm-1
este specifică grupării HSO3- prezentă în
caragenan. Benzile de la 1029,4 (specifică grupării CH-OH-alcooli ciclici), 1409,4
(specifică grupării OH din gruparea carboxilică) și 1604 (specifică sărurilor acizilor
carboxilici) atestă prezența în particule a gelanului și a CMCNa ale căror spectre sunt practic
identice nepermițând diferențierea lor. Concluzii similare se obțin prin analiza spectrului IR
al particulelor reticulate cu acetat de zinc unde semnalele benzilor menționate anterior se
regăsesc ușor deplasate.
6.5.2. Stabilitatea în timp a particulelor fără celule de drojdie în diferite medii
(apoase)
Pentru ca particulele să poată fi utilizate în procese fermentative repetate este
important ca stabilitatea lor să fie testată în diferite medii apoase.
Asa cum s-a menționat în secțiunea „Metode de caracterizare‖, din particulele mai
puțin stabile se pot detașa fragmente de polimer ce pot difuza din matrice în soluția în care
sunt păstrate determinând creșterea turbidității acesteia. Rezultatele măsurătorilor de
198
transmitanță pentru particule fără celule imobilizate sunt prezentate în Tabelul 34. Pentru a
putea diferenția probele s-au adoptat următoarele notații: particulele reticulate cu acetat de
magneziu au fost codificate cu DiMg, particulele reticulate cu acetat de calciu au fost notate
cu DiCa și particulele reticulate cu acetat de zinc au fost notate cu DiZn (unde i- reprezintă
numărul probei)
Tabel 36. Valorile transmitanței pentru probele fără celule de drojdie determinată
după diferite perioade de păstrare în medii apoase.
Proba
Transmitanța , T %
în baia de
coagulare în apă bidistilată
12h 24 h. 12h 24h. 36h.
D1Mg 99,6 98,7 99 98,5 97,1
D2Mg 99,6 98,5 99,1 98,5 97,8
D3Mg 99,6 99,1 98,9 98 95,5
D4Mg 99,4 99,2 99,2 98,5 95,3
D1Ca 99,4 98,2 98,9 97,3 96
D2Ca 98,9 98,1 99,2 97,9 96,1
D3Ca 99,1 98,4 98,5 97,0 95,9
D4Ca 98,3 98 98,8 97,2 96,8
D1Zn 98,7 96,8 99,7 99 96,7
D2Zn 98,3 97,1 99,7 99,1 97,5
D3Zn 99,3 97,3 99,7 98,5 97,6
D4Zn 99,5 97,3 99,5 98,7 98,0
Se poate observa din tabel că valorile transmitanței sunt apropiate indiferent de
perioada de păstrare a particulelor în diferite soluții apoase. După 24 de ore de păstrare în
soluția de reticulare valorile transmitanței scad ușor, cele mai mici observându-se la
199
particulele reticulate cu (CH3COO)2Zn. Pentru acestea, efectul poate fi datorat unei
densități de reticulare ușor inferioare celorlalte două rețele, ceea ce face ca macromolecule
mai scurte din straturile exterioare ale matricii să se desprinda din rețea mai ușor, difuzând
în mediul înconjurator.
Păstrate în apă bidistilată, toate particulele manifestă o ușoara scădere a
transmitanței în timp, evident mai mare dupa 36 ore. Surprinzător, particulele reticulate cu
(CH3COO)2Zn se dovedesc acum mai stabile, probabil datorită faptului că după
desprinderea unor lanțuri polimere din straturile exterioare în baia de coagulare, nu mai are
loc acest proces, miezul matricii fiind mai bine reticulat și deci mai stabil structural.
Valorile transmitanței nu variază foarte mult cu raportul între polimeri. Se poate
observa totuși că proba D2, indiferent de agentul de reticulare utilizat, are o valoare mai
mare a transmitanței decât D1. În cazul probei D3 unde concentrația de caragenan din
amestec este maximă se observă o tendință de scădere a valorii transmitanței în timp
comparativ cu celelalte probe. Creșterea cantității de caragenan în particule este posibil să
influențeze valorile transmitanței obținute deoarece poate determina creșterea porozității
acestora. In consecintă, crește absorbția de apă, ceea ce poate provoca tensiuni mai mari în
rețeaua polimeră, finalizate cu distrugerea sa parțiala și desprinderea unor fragmente de
macromolecule care determină reducerea ușoara a transmitanței.
Se poate aprecia, în concluzie, că valorile mari ale transmitanței atestă stabilitatea în
timp a particulelor fără celule de drojdie, în medii apoase, confirmând astfel rezultatele
anticipate pe baza studiilor anterioare raportate în subcapitolele 5.1-5.4.
6.5.3. Stabilitatea în timp a particulelor cu celule de drojdie imobilizate – evaluarea
concentrației de celule difuzate și a viabilității celulare
Pentru a determina dacă particulele cu celule de drojdie imobilizate sunt stabile în
medii apoase s-a determinat valoarea transmitanței, a concentrației de celule/ml și
viabilitatea celulară în soluția din baia de reticulare sau în apă bidistilată. Aceste
caracteristici au fost detrerminate după 12 ore, respectiv 24 de ore de păstrare a particulelor
în soluția de reticulare și după 12 ore, respectiv 24 ore de păstrare a particulelor în apă
bidistilată. Rezultatele obținute sunt prezentate în Tabelul 37.
200
Tabel 37. Valoarea transmitanței și a viabilității celulare in diferite medii la câteva probe
analizate
Proba
Transmitanța, T%
Concentrația celulelor de
drojdie
(nr. celule/ml x 104)
Viabilitatea celulară, %
în baia de
reticulare
în apă
bidistilată
în baia de
reticulare
în apă
bidistilată
în baia de
reticulare
în apă
bidistilată
12h 24h 12h 24h 12h 24h 12h 24h 24h 12h 24h
D1Y Mg 96.6 93,2 99,1 98,3 6,75 8,5 2,75 5,25 94,44 95,45 93,62
D2Y Mg 96 94 98,8 98,3 14,75 19 7,25 9,5 96,2 95,83 94,64
D3Y Mg 95,9 94,3 98,2 96,9 10 14,7 9,75 14,5 96,72 96,67 96,59
D4Y Mg 96,5 94,7 98,8 97,5 9,75 13 5,25 7 96,3 96,55 92,68
D1Y Ca 98,2 96,5 99,3 98,5 13 17,2
5 4,25 7,5 95,34 95,45 95,24
D2Y Ca 97,3 95,6 99,3 98,4 22 30 3 7,5 96,7 94,74 93
D3Y Ca 93,5 92 98,7 96,8 40 50 25 33,7
5 95,24 94,33 93,1
D4Y Ca 96 94,7 98,9 96,9 13 15 3,25 9,5 95,24 96 94,33
D1Y Zn 98,9 96,5 99,7 98,6 13 17,2
5 1,75 8 95,83 87,5 86,5
D2Y Zn 98,5 98,4 99,5 99 22 30 3 5,75 95,23 92,3 88,46
D3Y Zn 95,7 90,5 95 86,5 25 35 12,5 20 93,3 94,33 90,91
D4Y Zn 98,6 98,5 97,9 95,3 13 15 3,25 11,7 92,3 92,85 92,16
201
O primă constatare este aceea că valoarea transmitanței scade cu timpul de păstrare
în cele două medii apoase, dar se pastrează la valori destul de ridicate. Cea mai ridicată
stabilitate o au, în general, particulele reticulate cu Zn2+, chiar dacă (CH3COO)2Zn este
folosit într-o cantitate mult inferioară comparativ cu ceilalți cationi divalenți. Rezultatul
poate fi considerat o confirmare a ipotezei discutate într-un subcapitol anterior, că Zn2+
participă la formarea rețelei nu doar prin legare ionică, ci și coordinativă, formând structuri
stabile. O excepție o constituie proba D3YZn, care dupa 24 h de păstrare în soluția de
reticulare prezintă cea mai ridicată turbiditate, indicând o difuzie mai intensă a celulelor din
matricea polimeră. Explicația o poate constitui doar faptul că în compoziția acestei probe se
gasește cea mai mare cantitate de caragenan, care determină creșterea porozitătii matricei
polimere. Această ipoteză este confirmată de valorile mai mici ale transmitanței și pentru
celelalte probe D3Y. Particulele reticulate cu Mg evidențiază cele mai mici valori ale
transmitanței, probabil datorită faptului că Mg2+
este un element mai slab electropozitiv
decât Ca, astfel încât angajează legături ionice mai slabe ca tărie.
După 24 de ore de păstrare în apă bidistilată probele D3YZn și D4YZn au cele mai
mici valori ale transmitanței comparativ cu aceleași probe reticulate cu (CH3COO)2Mg sau
(CH3COO)2Ca, probabil tot datorită porozității mai mari induse de caragenan; efectul este
același la probele reticulate cu Ca si Mg, conținând cantități mai ridicate de caragenan.
Dacă transmitanța ar fi influențată doar de creșterea porozității din particule, ar
trebui să varieze în următoarea ordine:
T% : D2Y> T% D1Y>T% D4Y>T% D3Y
Pentru majoritatea probelor analizate, indiferent de agentul de reticulare utilizat,
valorile transmitanței variază în această ordine.
Concentrația de celule de drojdie în mediile apoase în care sunt suspendate
particulele de imobilizat se corelează, în general, cu valorile transmitanței soluțiilor în care
difuzează. Ea crește cu durata de păstrare a imobilizatului în mediul lichid, și prezintă cele
mai ridicate valori la probele care au cantități mai mari de caragenan în compoziție (D3Y,
D4Y).
Probele D2Y conțin cea mai redusă cantitate de caragenan; teoretic ar trebui ca și
concentrația de celule care difuzează din particule să fie cea mai mică. Numărul de grupe
carboxilat este însă cel mai mare datorită cantității ridicate de CMCNa, astfel încât gradul de
reticulare este mai mare iar difuzia celulelor prin martricea polimeră este redusă.
Concentrația de celule în ambele medii apoase crește cu durata, efect absolut normal. Se
202
constată însă că în baia de reticulare regăsim concentrații mai mari de celule decât în apă
bidistilată.
Valorile transmitanței în cazul păstrării particulelor în apă bidistilată, deși variază în
același mod ca și în cazul păstrării în mediul de reticulare, sunt totuși mai coborâte. Efectul
este explicabil prin faptul ca păstrarea în apă se face dupa 24 ore de păstrare în baia de
reticulare, când multe dintre celulele mai slab prinse în rețea au difuzat deja în exterior. De
remarcat însa că și în apă bidistilată trendul de variație a concentrației celulelor difuzate este
același ca în baia de reticulare.
Scopul determinării viabilității celulare în mediile în care particulele au fost
păstrare a fost acela de a determina dacă matricea polimeră poate păstra viabilitatea celulară
o perioadă mai mare de timp. Valorile mari ale viabilității celulare, care variază între 86,5%
și 96,59% atestă faptul că matricea polimeră poate păstra viabilitatea celulară la valori
optime în timp.
6.5.4.Capacitatea particulelor de a reține apa
Comportamentul în apă al particulelor sferice de gelan/i-caragenan/CMCNa cu și
fără celule de drojdie, s-a evaluat prin gradul de umflare (Q %). Acesta poate da informații
asupra densității de reticulare a rețelei, respectiv a capacității matricei polimere de a permite
difuzia substratului și a produșilor de fermentare. În figura 69 este prezentată variația în timp
a gradului de umflare pentru toate probele obținute.
(a) (b)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 5 10 15
Sw
elli
ng
deg
ree,
Q%
Time (h)
D1 MgD2 MgD3 MgD4 Mg
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30
Sw
ell
ing
deg
ree, Q
%
Time (h)
D1D Mg
D2D Mg
D3D Mg
D4D Mg
203
(c) (d)
(e) (f)
Figura 69. Variația în timp a gradului de umflare pentru probele obținute: (a) probe fără
celule de drojdie reticulate cu (CH3COO)2Mg, (b) probe cu celule de drojdie imobilizată
reticulate cu (CH3COO)2Mg, (c) probe fără celule de drojdie reticulate cu (CH3COO)2Ca,
(d) probe cu celule de drojdie imobilizată reticulate cu (CH3COO)2Ca, (e) probe fără celule
de drojdie reticulate cu (CH3COO)2Zn, (f) probe cu celule de drojdie imobilizată reticulate
cu (CH3COO)2Zn.
O primă constatare este aceea că variația gradului de umflare în timp depinde de
cantitatea de caragenan din amestecul de polimeri. Astfel, în majoritatea cazurilor analizate,
cu cât aceasta crește, cu atât valoarea Q crește, efect evident datorat creșterii porozitătii
particulelor, care pot reține cantități de aă nu doar în matricea reticulată ci și în pori. Ordinea
de variație a Q, atât pentru particule cu și fără drojdie, indiferent de agentul de reticulare
utilizat este următoarea:
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 10 20 30
D1Ca
D2Ca
D3Ca
D4Ca
Sw
elli
ng
deg
ree,
Q%
Time (h)
0
100
200
300
400
500
600
0 5 10 15 20
D1D Ca
D2D Ca
D3D Ca
D4D Ca
Sw
elli
ng
deg
ree,
Q%
Time (h)
-100
100
300
500
700
900
1100
0 10 20 30
Sw
elli
ng
deg
ree,
Q %
Time(h)
D1 Zn
D2 Zn
D3 Zn
D4 Zn
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30
Sw
elli
ng
deg
ree,
Q %
Time (h)
D1D Zn
D2D Zn
D3D Zn
D4D Zn
204
QD3>QD1>QD4>QD2
Valoarea gradului de umflare este determinată și de gradul de reticulare al
particulelor, respectiv de numărul de grupe anionice (carboxilat, sulfat) participante la
formarea legăturilor ionice cu metalul. Se explică astfel că proba D2 prezintă, indiferent de
reticulantul folosit, cea mai mică valoare a Q: ea conține cantitatea maximă de CMCNa
(care crește densitatea de reticulare) și minimă de caragenan (care crește porozitatea).
Probele D1, care conțin cantități mai mici de CMCNa dar mai ridicate de caragenan, au
valori ale Q mai ridicate, consecință a două efecte acționând în același sens: grad de
reticulare mai redus și porozitate mai ridicată. Atât la probele fără drojdie cât și la cele care
conțin celule de drojdie valoarea gradului de umflare depinde și de tipul de agent de
reticulare utilizat; considerând acest criteriu, gradul de umflare variază în ordinea:
QMg2+>QZn2+>QCa2+
Este cunoscut faptul că cationii de Ca2+
determină obținerea de geluri mai puternice
decât cele obținute cu Mg2+
[276]. Concentrația utilizată pentru (CH3COO)2Zn în baia de
reticulare a fost mult mai redusă (de ordinul 10-2 M) dar suficientă pentru a asigura un grad
de reticulare comparabil cu cel realizat de ceilalți cationi divalenți, datorită implicării ionului
de Zn2+
și în reacții de complexare; cantități mai mari din acest reticulant pot deveni toxice
pentru celule [32].
Pentru probele care conțin celule de drojdie valoarea gradului de umflare este mai
mică comparativ cu particulele fără celule de drojdie. Se cunoaște faptul că ionii metalici pot
adera la membrana celulară oferind acesteia mai multă rezistență [52, 565] iar prin legăturile
formate cu celulele de drojdie se poate produce o reticulare suplimentară a particulelor,
determinând un grad mai ridicat de reticulare.
6.5.5. Morfologia particulelor
Fotografiile realizate prin microscopie electronică de baleiaj evidențiază morfologia
particulelor cu celule de drojdie. A fost selectată pentru analiză proba D4Y reticulată cu cei
trei cationi, deoarece polimerii constituenți participă în aceeași proporție. În figura 70 sunt
prezentate fotografiile de microscopie electronică.
205
D4Y Mg D4Y Ca D4Y Zn
206
Figura 70. Fotografii efectuate prin microscopie electronică de baleiaj pentru proba D4Y
utilizând ca agenți de reticulare (CH3COO)2Mg, (CH3COO)2Ca și (CH3COO)2Zn.
Fotografiile de microscopie electronică de baleiaj au fost efectuate în secțiune
transversală și evidențiază faptul că celulele se află în număr mare în particule și sunt bine
prinse în rețeaua polimeră. Particulele prezintă o porozitate adecvată care ar permite
schimbul de nutrienți între celule și mediul de fermentare. Cationii metalici utilizați pot
influența gradul de reticulare al particulelor. Morfologia indusă de Ca2+
este mai densă ceea
ce ar putea fi o consecință a unui grad de reticulare mai mare. Particulele reticulate cu Mg2+
prezintă o porozitate mai mare, rețeaua este mai puțin densă determinată și de un grad de
reticulare mai mic în comparație cu proba reticulată cu ioni de calciu. Particulele reticulate
cu ioni de Zn2+
prezintă o densitate comparabilă cu cele reticulate cu Ca2+, chiar dacă
concentrația reticulantului este cu un ordin de mărime mai mic decât în celelalte două
cazuri; efectul a fost explicat anterior.
Morfologia particulelor este în concordanță cu rezultatele prezentate anterior.
6.5.6.Testarea activității fermentative a imobilizatelor
Particulele formate din celulele de drojdie imobilizate în matricea amestecului celor
trei polizaharide, constituind adevărate bioreactoare, au fost testate din punct de vedere al
capacităț de fermentare a glucozei, dar șidin punct de vedere al capacitatii de a menție
viabilitatea celulelor imobilizate sau chiar de a permite proliferarea lor.
Deși nu este considerat un factor critic, care afectează performanța în fermentare,
pH-ul joacă un rol important în asimilarea cationilor metalici de către celule de drojdie în
timpul procesului de fermentare. S-au făcut cercetări asupra influenței pH-ului în procesele
fermentative și s-a observat că are un rol esențial în legarea cationilor metalici în locurile de
absorbție de pe peretele celular. Cercetările anterioare raportează un pH optim pentru mediul
de fermentare ca fiind 4,5-5[57, 563, 566] In consecință, pH-ul soluției de glucoză dizolvată
207
în diferite concentrații de reticulant introdus în baia de fermentare a fost reglat la valoarea
pH=5.
Testarea activității fermentative pentru toate probele a condus la randamente
ridicate, comparabile cu drojdia liberă. Au fost efectuate câte 10 cicluri fermentative pentru
fiecare probă, iar după fiecare ciclu de fermentare, acestea au fost spălate și păstrate la
frigider la temperatura de 4-6˚C până la efectuarea următorului ciclu. Figura 71 prezintă
variația randamentelor de fermentare în timp pentru cele 4 probe D1Y, D2Y, D3Y și D4Y
reticulate cu acetat de magneziu.
(a) (b)
(c) (d)
Figura 71. Variația randamentului de fermentare a glucozei în timp pentru mai multe cicluri
de fermentare diferite (notate de la I la X) pentru probe reticulate cu (CH3COO)2Mg : (a)
D1Y, (b) D2Y, (c) D3Y, (d) D4Y. Randamentele obținute după fiecare ciclu de fermentare
au fost comparate cu randamentul obținut la fermentarea drojdiei libere (notația 0 in figuri).
0
10
20
30
40
50
60
70
0 100 200 300
Yie
ld i
n f
erm
ente
d g
luco
se,
η%
Time (min)
D2Y Mg
I
II
IV
VI
IX
X
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 100 200 300
Yie
ld i
n f
erm
ente
d g
luco
se,
η %
Time (min)
D3Y Mg
I
III
V
VI
VIII
X
00
10
20
30
40
50
60
70
0 100 200 300
Yie
ld i
n f
erm
ente
d g
luco
se,
η %
Time (min)
D4Y Mg
I
III
V
VIII
X
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 100 200 300
Yie
ld i
n f
erm
ente
d g
luco
se,
η%
Time (min)
D1Y Mg
IIIIVVIVIIIX0
208
Este cunoscut faptul că ionul Mg2+
constituie cam 0,3% din întreaga masă de
drojdie uscată și activează peste 300 de enzime. Menținerea integrității celulare, ceea ce
include stabilizarea structurală a acizilor nucleici, a polinucleotidelor, a cromozomilor,
polizaharidelor și lipidelor au fost atribuite magneziului.[12, 22, 27, 33, 48, ]
Se constată că pentru toate cele 4 probe randamentele în fermentare sunt apropiate
între ele și sunt mai mari decât cel obținut la fermentarea drojdiei libere. Valorile cele mai
mari au fost obținute cu probele D3Y și D4Y, care prezintă și valorile cele mai ridicate ale
gradului de umflare. Există deci o legatură directă între capacitatea de umflare a particulelor
în medii apoase și capacitatea de fermentare, explicată prin difuzia mai accentuată a
substratului și a produșilor rezultați prin matricile mai puțin reticulate. Se observă că
eficiența în fermentare scade în timp de la un ciclu la altul dar are totuși o valoare superioară
celei obținute la fermentarea cu drojdie liberă.
Pentru particulele D3Y și D4Y reticulate cu (CH3COO)2Ca s-au putut realiza, de
asemenea, 10 cicluri de fermentare, valoarea randamentelor fiind ridicată, comparabilă în
majoritatea cazurilor cu cele obținute cu particulele reticulate cu Mg2+
.
În schimb, pentru cele reticulate cu (CH3COO)2Zn s-au putut realiza doar 4 cicluri
de fermentare pentru proba D3Y și 8 cicluri de fermentare pentru proba D4Y. Proba pentru
care s-au obținut cele mai puține cicluri fermentative (care conține 0,4% caragenan, 0,2%
gelan și 0,4 % CMCNa) conține mai multe grupe funcționale reticulabile în comparație cu
proba D4Y, ceea ce conduce la o cerință mai mare de ioni de zinc pentru reticulare.
Cercetările efectuate anterior asupra influenței ionilor metalici asupra proceselor
fermentative afirmă faptul că ocazional deficiența unor minerale din mediul de fermentare
poate afecta negativ procesul de fermentare în prezența drojdiei. Zincul este un element
foarte important în procesele fermentative deoarece are rol de activator enzimatic al alcool
dehidrogenazei iar un mediu deficient în zinc poate conduce la încetinirea sau la un proces
incomplet de fermentare [51]. În consecință, chiar dacă gradul de reticulare al particulelor și
stabilitatea lor structurală sunt comparabile cu probele reticulate cu Ca2+ și Mg
2+, cantitatea
de Zn2+
este totuși insuficientă pentru a asigura procese repetate de fermentare.
Figura 72 prezintă o comparație între valoarea maximă a randamentelor în
fermentare obținute pentru probele D3Y și D4Y reticulate cu (CH3COO)2Ca,
(CH3COO)2Mg și (CH3COO)2Zn. În fig.72a sunt comparate doar randamentele de
fermentare pentru proba D3Y obținută prin reticulare cu (CH3COO)2Mg și (CH3COO)2Ca
la care au putut fi realizate 10 cicluri fermentative. Pentru particulele de tip D4Y obținute
209
prin utilizarea celor trei agenți de reticulare sunt prezentate valorile randamentelor de la 8
cicluri de fermentare (Fig.72 b).
(a) (b)
Figura 72. Comparație între valoarea maximă a randamentelor de fermentare a glucozei în
prezența drojdiei libere (0), respectiv a drojdiei imobilizate în particule de tip D3Y și D4Y
reticulate cu diferiți ioni metalici: (a) proba D3Y reticulată cu (CH3COO)2Ca (D3Y Ca) și
(CH3COO)2Mg (D3Y Mg), (b) proba D4Y reticulată cu (CH3COO)2Ca (D4Y Ca),
(CH3COO)2Mg (D4Y Mg) și (CH3COO)2Zn (D4Y Zn).
Se poate constata (fig.72a) că eficiența în fermentare a probelor reticulate cu
(CH3COO)2Mg este comparabilă cu eficiența în fermentare obținută la probele reticulate cu
(CH3COO)2Ca.
Ionii de Ca2+
au rol în protejarea celulelor de drojdie împotriva efectelor toxice ale
etanolului la fel ca și ionii de Zn2+
și Mg2+. Datorită efectului antagonist al magneziului,
efectele pozitive asupra proliferării celulare în momentul suplimentării mediului cu ioni de
Ca2+
pot fi compromise. De aceea suplimentarea cu ioni de Ca2+
trebuie efectuată cu grijă.
Poate fi benefică doar în unele cazuri și anume: dacă ionii de calciu sunt suplimentați în
concentrații mari pot înlocui magneziul într-o serie de căi biochimice, dar aceasta poate duce
în timp la deteriorarea celulei [31, 63, 84, 567].
Randamentele în fermentare obținute pentru probele reticulate cu (CH3COO)2Mg
sunt superioare în comparație cu randamentele obținute pentru aceleași probe reticulate cu
(CH3COO)2Ca. Aceasta poate fi o consecință a faptului că celulele de drojdie au o cerință
mai mare pentru Mg2+
decât pentru Ca2+
așa cum menționează și Elizabeth M. R. Rees and
0
20
40
60
80
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0
Yie
ld i
n f
erm
ente
d g
luco
se,
η %
Number of fermentation cycles
D3Y Mg
D3Y Ca
0
20
40
60
80
1 2 3 4 5 6 7 8 0Y
ield
in
fer
men
ted
glu
cose
,
η %
Number of fermentation cycles
D4Y Mg D4Y Ca D4Y Zn
210
Graham G. Stewart (1997) [48]. Totodată, particulele reticulate cu Mg2+
prezintă capacitate
mai mare de umflare în apă, deci o difuzie mai accentuată a substratului și produșilor de
reacție prin matricea polimeră. Obținerea randamentelor în fermentare comparabile la
fiecare ciclu de fermentare pentru probele D3Y și D4Y reticulate cu Mg2+
si Ca2+
poate fi un
rezultat al schimbului eficient de nutrienți între mediul de fermentare și celulele imobilizate.
Începând cu ciclul 9 de fermentare apare însă o tendință de scădere a randamentelor. După
cum vom prezenta ulterior, ea este determinată de scăderea numărului și a viabilității
celulelor rămase în matricea polimeră după fiecare ciclu de fermentare.
Pentru proba D4YZn, figura 72 b demonstreaza că la primul ciclu de fermentare se
obține un randament maxim care depășește pe cel corespunzatoare probei D4YCa și este
aproape egal cu randamentul obținut de proba D4YMg. Randamentul scade apoi începând
cu ciclul 2 până la ciclul 8 după care fermentarea se oprește; excepție face ciclul 4 unde se
înregistrează, surpinzător, o creștere a acestuia. După cum s-a afirmat anterior, explicația se
poate datora deficienței în ioni de Zn2+. O caracterizare completă a fost efectuată pentru
toate tipurile de particule D4 deoarece analizele anterioare arătat că sunt stabile iar valorile
randamentelor în fermentare obținute sunt superioare celorlalte probe.
În figura 73 este prezentată evoluția în timp a eficienței fermentării pentru probele
D4YMg, D4YCa și D4YZn, pentru primele 8 cicluri de fermentare comparând randamentele
obținute cu randamentul rezultat la fermentarea drojdiei libere.
(a) (b)
0
10
20
30
40
50
60
70
0 100 200 300
Yie
ld i
n f
erm
ente
d g
luco
se,
η %
Time (min)
I D4Y Mg
I D4Y Ca
I D4Y Zn
0 0
10
20
30
40
50
60
70
0 100 200 300
Yie
ld i
n f
erm
ente
d g
luco
se,
η %
Time (min)
II D4Y Mg
II D4Y Ca
II D4Y Zn
0
211
(c) (d)
(e) (f)
(g) (h)
Figura 73. Evoluția în timp a randamentului de transformare a glucozei pentru probele D4Y
Mg, D4Y Ca și D4Y Zn, în diferite cicluri de fermentare: (a) - ciclul 1; (b) – ciclul 2; (c) –
ciclul 3; (d) – ciclul 4; (e) – ciclul 5; (f) – ciclul 6; (g) – ciclul 7; (h) – ciclul 8, comparativ
cu randamentul obținut la fermerntarea cu drojdie liberă (T= 30˚C, durata unui ciclu
fermentativ: 255 min).
Se constată că randamentele în fermentare pentru probele D4YMg și D4YCa au
valori foarte apropiate și variază foarte puțin de la un ciclu la altul. În schimb, pentru proba
0
10
20
30
40
50
60
70
0 100 200 300
Yie
ld i
n f
erm
ente
d
glu
cose
, η
%
Time (min)
III D4Y MgIII D4Y CaIII D4Y Zn0 0
10
20
30
40
50
60
70
0 100 200 300
Yie
ld i
n f
erm
ente
d
glu
cose
, η
%
Time (min)
IV D4Y MgIV D4Y CaIV D4Y Zn0
0
10
20
30
40
50
60
70
0 100 200 300
Yie
ld i
n f
erm
ente
d
glu
cose
, η
%
Time (min)
V D4Y MgV D4Y CaV D4Y Zn
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 100 200 300
Yie
ld i
n f
erm
ente
d
glu
cose
, η
%
Time (min)
VI D4Y Mg
VI D4Y Ca
VI D4Y Zn
0
10
20
30
40
50
60
70
0 100 200 300
Yie
ld i
n f
erm
ente
d g
luco
se,
η %
Time (min)
VII D4Y
MgVII D4Y
Ca 0
10
20
30
40
50
60
70
0 100 200 300
Yie
ld i
n f
erm
ente
d
glu
cose
,
η %
Time (min)
VIII D4Y MgVIII D4Y CaVIII D4Y Zn0
212
D4YZn eficiența fermentării scade cu numărul de cicluri, efect explicat anterior. Valorile
ridicate ale randamentelor în fermentare și faptul că se păstrează aproape constante pentru
multe cicluri de fermentare ne-au condus la concluzia că schimbul dintre mediul de
fermentare și celulele imobilizate se realizează eficient. Matricea D4Y, care conține
proporții egale ale celor 3 polizaharide, este pe de o parte suficient de poroasă datorită
cantității destul de ridicate de caragenan, dar și suficient de stabilă structural datorită
numărului ridicat de grupe carboxilice participante la reticulare. Acest echilibru explică
difuzia mai facilă a diferitelor specii moleculare prin matrice, dar și stabilitatea sa mecanică
ce îi permite utilizarea în cicluri repetate de fermentare fără a se dezintegra.
6.5.7. Evaluarea viabilității celulare și a cantității de celule din particule după
fiecare ciclu de fermentare
Pentru ca procesul de fermentare să poată avea loc în mai multe cicluri fermentative
și pentru a obține o eficiență bună în fermentare, ideal este ca celulele de drojdie să
prolifereze în interiorul matricei polimere. Pentru a stabili dacă se produce acest efect și
pentru a determina influența ionilor metalici asupra proliferării celulare polimere au fost
utilizate particulele de tip D4Y. După fiecare ciclu de fermentare o cantitate de particule cu
celule de drojdie în dispersie apoasă (100 ml) a fost dezintegrată mecanic cu ajutorul unui
ultraturax pană la obținerea unei suspensii omogene. Prin tehnica indicata la „mod de lucru‖
s-a stabilit numărul de celule de drojdie din suspensie, respectiv din particulele ce le-au
conținut. Viabilitatea celulară și numărul de celule dintr-un gram de particule sunt prezentate
în Tabelul 38.
Tabel 38. Viabilitatea celulară și numărul de celule/gram de particule
Numărul
ciclului de
fermentare
Numărul de celule x 10-8
/g
particule
Viabililitatea celulară, Vc
%
D4Y
Mg
D4Y
Ca
D4Y
Zn
D4Y
Mg
D4Y
Ca
D4Y
Zn
0* 4,65 5,14 4,41 95,93 96,51 97,08
I 5,23 5,91 5,47 95,92 94,54 96,48
VI 7,81 8,74 9,44 95 94,7 92,15
VIII 7,35 7,55 8,8 94,32 94,05 91,98
213
X 8,21 6,91 7,54 92,95 88,61 87,79
Viabilitatea celulară la particulele analizate scade ușor de la un ciclu de fermentare
la altul dar se păstrează la valori ridicate ceea ce indică faptul că matricea polimeră
protejează destul de eficient celulele. Raymond și colab. (2004) au imobilizat celule de
drojdie în particule de k-caragenan acoperite cu chitosan, determinând viabilitatea celulară și
numărul de celule din acestea și concluzionând că celulele proliferează în interiorul
particulelor. Callone și colab. (2008) au determinat numărul de celule din particule de
alginat acoperite cu un strat de silice constatând, de asemenea, că celulele proliferează.[14,
415]
Figura 74. prezintă evoluția cantității de celule/g particule funcție de numărul
ciclului de fermentare pentru proba D4Y comparativ cu randamentul maxim obținut după
fiecare ciclu de fermentare.
(a) (b)
(c)
0
30
60
0 20 40 60
Fermentation time (h)
D4Y Mg
Quantity of yeast cellsfrom particles, mgYield obtained aftereach fermentation cyles 0
30
60
0 20 40 60
Fermentation time (h)
D4Y Ca
Yield obtained after eachfermentation cycle
0
30
60
0 10 20 30 40
Fermentation time (h)
D4Y Zn
Quantity of yeast cellsfrom 1 g of particles, mg
214
Figura 74. Evoluția în timp a cantitații de celule din particule funcție de numărul de cicluri
de fermentare pentru proba D4Y reticulată cu: (a) (CH3COO)2Mg, (b) (CH3COO)2Ca și (c)
(CH3COO)2Zn
Este evident că celulele de drojdie proliferează în interiorul particulelor analizate.
Pentru particulele D4YMg cantitatea de celulele de drojdie înainte de fermentare
este de 17,21 mg/g si crește constant de la un ciclu de fermentare la altul până după ciclul 8,
când aceasta atinge 36,55mg/g particule. O scădere apare după ciclul 8 de fermentare,
urmată apoi de o usoară tendință de creștere. Valoarea maximă a randamentului în
fermentare urmează practic aceeași evoluție până la ciclul 8 (când se înregistrează un
maxim), în perfectă concordanța cu evoluția cantității de celule din particule. După ciclul 8
însă, randamentul maxim continuă să scadă ușor, aparent discordant față de modul de
variație a cantității de celule. Analizând însă aceste rezultate în corelare cu tabelul 2,
explicația devine evidentă: chiar dacă numărul total de celule în particule crește după ciclul
8, numărul de celule vii scade, explicând randamentele mai mici de fermentare.
O foarte bună concordanță între cele două mărimi analizate este evidențiată în cazul
D4YCa, la care numărul inițial de celule de drojdie este de 18,98 mg/g particule. Cantitatea
de celule de drojdie crește până după ciclul 6 de (31,4 mg celule/g particule), după ciclul 7
având tendința să scadă. Similar variază randamentul maxim de fermentare.
Pentru proba D4Y Zn rezultatele sunt relativ diferite. Cantitatea de celule crește de
la un ciclu de fermentare la altul devenind practic constantă după ciclul 7. Randamentele de
fermentare scad însă continuu, exceptând ciclul 4 la care se înregistrează un maxim. Pentru
ultimele cicluri de fermentare explicația poate fi datorată, de asemenea, scăderii viabilității
celulare, în ciuda proliferării sau păstrarii constante a cantității de celule. Cercetările asupra
influenței ionului de zinc asupra proceselor fermentative pentru fabricarea berii arată că
suplimentarea cu ioni de zinc a mustului de bere conduce la intensificarea floculării,
determinata probabil de legarea sa de pereții celulari ai celulelor. Taylor și Orton au arătat că
zincul inhibă flocularea doar când se găsește în mediu în concentrații foarte mari [568, 569].
Prin urmare, în interiorul particulelor D4YZn celulele pot crea aglomerate care nu permit un
schimb eficient de nutrienți, ceea ce duce la scăderea productivității în etanol. De altfel,
fotografiile de microscopie electronică de baleiaj din fig. 4 sugerează o tendintă mai mare de
aglomerare a celulelor în cazul matricilor reticulate cu Zn2+. Ionii de zinc pot avea două
efecte contrare: pe de o parte conduc la creșterea numărului de celule de drojdie în interiorul
matricei polimere deoarece zincul are rol de activator enzimatic (efect ce se constată și în
215
cazul nostru), pe de altă parte complexează atât cu grupele funcționale din amestecul de
polimeri cât și cu proteinele care aparțin membranelor celulare. Se formează astfel legături
coordinative foarte puternice iar productivitatea în etanol scade datorită aglomeratelor
celulare formate în timp și a limitării difuziei nutrienților.
Rezultatele din fig. 75 permit a stabili factorii care determină scăderea
randamentului în fermentare, ca și numărul ciclurilor la particulele reticulate cu Zn2+
.
(a) (b)
(c) (d)
Figura 75. Randamentele maxime de fermentare a glucozei în prezența drojdiei libere (0),
respectiv a drojdiei imobilizate în particule de tip (a) D1Y; (b) D2Y; (c) D3Y și (d) D4Y
reticulate cu (CH3COO)2Zn.
Probele D1YZn si D4YZn prezintă cea mai ridicată eficiență în fermentare și pot fi
utilizate până la 8 cicluri fermentative. Explicația este evidentă: conțin cel mai mic număr de
grupe funcționale anionice capabile să participe la reticulare – ceea ce determină rețele cu
densitate mai mică de reticulare , si cantitatea practic maximă de caragenan – ceea ce
0
10
20
30
40
50
60
1 2 3 4 5 6 7 8
Yie
ld i
n f
erm
ente
d g
luco
se,η
%
Number of fermentation cycles
D1Y Zn
0
10
20
30
40
50
60
1 2 3 4 5 0
Yie
ld i
n f
erm
ente
d g
luco
se,
η %
Number of fermentation cycles
D2Y Zn
0
10
20
30
40
50
1 2 3 4 0
Yie
ld i
n f
erm
ente
d g
luco
se,
η %
Number of fermentation cycles
D3Y Zn
0
10
20
30
40
50
60
70
1 2 3 4 5 6 7 8 0
Yie
ld i
n f
erm
ente
d g
luco
se,
η %
Number of fermentation cycles
D4Y Zn
216
determină porozitatea cea mai ridicată. Ambele efecte au ca rezultat creșterea difuziei
tuturor speciilor moleculare spre- și dinspre matricea polimeră, cu consecințe favorabile
asupra procesului de fermentare. Probele D2YZn si D3YZn au performanțe mai reduse,
probabil determinate de gradul mai mare de reticulare indus de numărul mare de grupe
anionice de pe lanțurile polimerilor, confirmat și de studiul capacitații de umflare în medii
apoase. Acesta din urma variază în seria celor 4 probe în ordinea:
D3Y> D2Y> D4Y>D1Y
Pentru a evalua stabilitatea particulelor de imobilizat în mediul de fermentare s-a
determinat numărul, respectiv cantitatea de celule care se găsesc în mediul de fermentare
după fiecare ciclu. Irfana Mariam și colab, 2009 a obținut microbioreactoare de alginat de
sodiu cu celule de drojdie prin reticulare ionică utilizând ca agent de reticulare CaCl2 care au
fost testate din punct de vedere al activității fermentative, iar o creștere maximă a
randamentului de fermentare s-a observat după al 4-lea ciclu de fermentare după care
randamentul scade brusc. Numărul maxim de cicluri de fermentare efectuat cu aceste
microbioreactoare a fost de 6. Explicația dată pentru acest comporament a fost că
microbioreactoarele devin instabile după al 4-lea ciclu de fermentare și își schimbă forma iar
celulele difuzează în număr mare în mediul de fermentare [440]. Prin studiul nostru am dorit
să stabilim daca celulele sunt bine prinse în rețeaua polimeră și nu difuzează în număr mare
în mediul de fermentare chiar și după mai multe cicluri de fermentare.
În tabelul 39 sunt prezentate rezultatele obținute.
Tabelul 39. Cantitatea de celule de drojdie difuzate din particule după fiecare ciclu de
fermentare
Proba
Numărul
total de
cicluri de
fermentare
Numărul total
de celule din
mediul de
fermentare/ml
x 10 4
Cantitatea totală
de celule de
drojdie care
difuzează din
particule, mg
D3Y Mg 10 167,25 2,9052
D4Y Mg 10 128 2,4613
D3Y Ca 10 169,5 3,496
217
Se constată că numărul total de celule care difuzează din particulele reticulate cu
(CH3COO)2Mg și (CH3COO)2Ca crește cu creșterea porozității indusă de caragenan.
Cantitatea de celule care difuzează este mai mare la probele reticulate cu
(CH3COO)2Ca față de cantitatea de celule care difuzează din probele reticulate cu
(CH3COO)2Mg. Putem concluziona că particulele de imobilizat reticulate cu (CH3COO)2Mg
sunt mai stabile decât cele reticulate cu (CH3COO)2Ca. Celulele de drojdie au o cerință mai
mare pentru ionii de Mg2+
iar aceștia pot adera cu mai multă ușurință la membrana
plasmatică a celulelor în comparație cu ionii de Ca2+
. Aceasta poate conduce la structuri mai
stabile având în vedere faptul că biocatalizatorul poate participa, practic, la reacția de
reticulare [28, 31].
La particulele cu acetat de zinc cantitatea de celule care difuzează din particule
crește cu scăderea numărului de grupe funcționale reticulabile, efect constatat și la ceilalți
reticulanți. Diferența constă însă în faptul că numărul de celule difuzate din aceste particule
este mult mai mic comparativ cu cele reticulate cu Ca2+
sau Mg2+. Explicația poate consta în
faptul că ionii de Zn2+
sunt absorbiți eficient de celulele de drojdie de care se leagă mai
puternic, ancorându-le mai eficient în matricea polimeră.
Rezultatele din tabelul 37 demonstrează că din particulele testate în procesul de
fermentare difuzează un număr mic de celule, mult inferior celui rămas în particule. Ele
D4Y Ca 10 139,25 2,85076
D3Y Zn 4 41,75 1,18312
D4Y Zn 8 56 1,24564
218
dovedesc faptul că fermentarea are loc dominant în particule și nu în celulele libere din
supernatant.
Faptul că particulele cu celule de drojdie pot fi recuperate cu ușurință din
fermentator și pot fi reutilizate în mai multe cicluri fermentative arată că matricea polimeră
în care celulele de drojdie sunt imobilizate le protejează de metaboliții toxici produși de
etanol, viabilitatea celulară se păstrează iar celulele de drojdie pot prolifera în interiorul
particulelor obținute.
6.5.8. Productivitatea specifică și viteza de fermentare
Exploatând porțiunea liniară a curbelor cinetice de fermentare s-a calculat viteza cu
care se produce procesul, precum și productivitatea specifică în etanol, rezultatele obținute
pentru fiecare tip de particule, comparativ cu drojdia liberă pentru câteva cicluri de
fermentare, fiind prezentate în Tabelul 40, împreună cu viteza procesului la 45 minute.
Tabel 40. Productivitatea specifică și viteza procesului de fermentare
Viteza de fermentare pentru drojdia liberă este de 0.067 % conversie glucoză/ min iar
productivitatea specifică pentru drojdia liberă este de 0.51 g etanol/g glucoză x g drojdie. Se
D3Y
Mg
D4Y
Mg
D3Y
Ca
D4Y
Ca
D3Y
Zn
D4Y
Zn
D3Y
Mg
D4Y
Mg
D3Y
Ca
D4Y
Ca
D3Y
Zn
D4Y
Zn
I 0,27 0,22 0,24 0,2 0,2 0,2 0,79 0,79 0,79 0,79 0,59 0,79
II 0,27 0,24 0,2 0,27 0,2 0,2 0,7 0,79 0,59 0,79 0,59 0,59
III 0,2 0,2 0,2 0,22 0,16 0,2 0,79 0,77 0,76 0,79 0,4 0,59
IV 0,2 0,27 0,2 0,27 0,2 0,2 0,79 0,79 0,76 0,79 0,4 0,79
V 0,2 0,27 0,22 0,22 - 0,2 0,79 0,79 0,79 0,79 - 0,59
VI 0,2 0,2 0,2 0,27 - 0,2 0,59 0,79 0,59 0,62 - 0,59
VII 0,27 0,24 0,2 0,2 - 0,2 0,79 0,72 0,59 0,59 - 0,4
VIII 0,2 0,24 0,2 0,2 - 0,13 0,59 0,82 0,59 0,79 - 0,4
IX 0,29 0,2 0,2 0,22 - - 0,98 0,79 0,79 0,79 - -
X 0,2 0,2 0,22 0,27 - - 0,59 0,63 0,79 0,79 - -
Specific productivity (g etanol / h x g
yeast cells)
Number of
the
fermentation
cycles
Fermentation rate, % glucose
conversion/min
219
constată că viteza procesului se plasează în aceeași ordine cu valorile randamentului de
fermentare, pentru toate probele analizate. Viteza de fermentare pentru majoritatea ciclurilor
fermentative efectuate este superioară celei obținute la fermentarea cu drojdie libere.
Pentru majoritatea probelor productivitatea specifică în etanol este mai mare decât
productivitatea specifică a drojdiei libere. Cele mai bune productivități au fost obținute cu
proba D4Y reticulată cu acetat de magneziu.
Concluzii
Amestecurile pe baza de gelan, carboximetil celuloza (sare de sodiu) și caragenan, în
diferite proporții, reticulate cu ioni metalici divalenți – Ca2+
, Mg2+
, Zn2+
proveniți din acetați
-, obținute prin extrudere, permit obținerea de particule sferice capabile să fixeze în
matricea polimeră celule de drojdie.
Matricile sferice reticulate, fără drojdie, sunt stabile în medii apoase, stabilitatea
nedepinzand, practic, de compoziția lor în polimeri sau de natura cationului metalic utilizat
ca reticulant; stabilitate ușor mai ridicată o prezintă particulele reticulate cu ioni de Zn2+
,
chiar dacă concentrația sa este cu un ordin de mărime mai mică decât a celorlalți doi cationi.
Toate particulele prezintă caracter de hidrogel, important pentru asigurarea unui
bun transport al substratului, nutrienților și produșilor de fermentare prin matricea polimeră.
Morfologia și proprietațile fizico-chimice ale particulelor depind de compoziția lor
în polimeri și de natura reticulantului; porozitatea particulelor crește cu cantitatea de
caragenan din compoziție.
Capacitatea de a reține apa este funcție de gradul de reticulare, ce depinde la rândul
său de compoziția în polimeri a particulelor – ce determină numarul grupelor reticulabile -,
de cantitatea de reticulant și de porozitatea lor; capacitate mai ridicată de reținere a apei
manifestă particulele reticulate cu Mg2+
ca și cele conținînd cantități mai ridicate de
carageenan.
Particulele de imobilizat manifestă un grad de reticulare mai ridicat datorită
participării celulelor înseși la interacții ionice cu ionii metalici.
Matricea polimeră, indiferent de compoziția sa, păstrează viabilitatea celulară la
valori optime în timp
220
Activitatea fermentativă depinde de raportul între polimeri din particule și de tipul de
reticulant utilizat; eficiența cea mai bună în fermentare a fost se obține cu probe reticulate cu
Mg2+, și cea mai redusa la cele reticulate cu Zn
2+.
Particulele de imobilizat pot fi utilizate repetat în cel puțin 10 cicluri fermentative.
Fermentarea se produce dominant în particulele polimere purtătoare de celule de
drojdie, și nu în supernatantul în care difuzează parțial celulele.
Matricea polimeră obținută păstrează viabilitatea celulară la valori ridicate de peste
82%, chiar după 10 cicluri de fermentare.
Productivitatea specifică în etanol este mai ridicată la particulele de imobilizat
decât la drojdia liberă.
Particulele de gelan/i-caragenan/CMCNa cu celule de drojdie imobilizate obținute
pot fi utilizate cu succes în procese fermentative și ar putea reprezenta o nouă abordare în
rezolvarea problemei deficitului de ioni metalici cu care se confruntă producătorii din
industria băuturilor alcoolice.
CAPITOLUL 7
Imobilizarea -amilazei în particule de gelan reticulat ionic.
Enzimele sunt catalizatori biologici ce reduc energia de activare a unor reacții
chimice. Întregul domeniu biotehnologic depinde de activitatea lor, fie că acestea acţionează
singure sau asociate, în unele cazuri. Cu excepţia ribozimelor, enzimele sunt în majoritate
proteine, putând conţine însă şi componente lipidice sau zaharoase.
Descoperirea primei enzime aparţine lui Payen şi Persoz, care în anul 1833 publică
o lucrare privind separarea dintr-un extract apos de malţ a unui produs care scindează
amidonul la zaharuri mai simple, până la glucoză. Acest produs nu este altul decât
amilaza.[69].
Enzimele sunt catalizatori şi respectă toate legile catalizei:
nu se consumă în timpul reacţiei şi teoretic pot provoca transformarea unui număr
nelimitat de molecule de substrat. Eventuala denaturare a enzimei (pierderea funcţiei
221
biocatalitice datorită modificărilor care apar la nivelul structurii tridimensionale şi care
alterează conformaţia centrului activ) este independentă de actul catalitic;
nu modifică natura reacţiei, echilibrul sau bilanţul ei termodinamic, reacţia fiind
posibilă si in absenţa sa;
accelerează viteza de reacţie, pentru acest parametru cinetic înregistrându-se valori
de aproximativ 10 ori mai mari decăt cele obţinute în absenţa biocatalizatorului.
Cea mai importantă deosebire dintre o enzimă şi un catalizator clasic constă în
înalta specificitate de acțiune a celei dintâi, concretizată prin capacitatea de a cataliza un
singur tip de reacţie biochimică; de cele mai multe ori, ea catalizează transformarea unei
singure substanţe chimice (specificitate absolută), fiind însă posibilă şi acţiunea asupra unui
număr de substanţe, înrudite structural prin aceeaşi grupare sau aceleasi grupe de atomi pe
care biocatalizatorul le recunoaşte (specificitate relativă).
Problema cea mai importantă pe care o ridică utilizarea enzimelor drept catalizatori
in diverse transformări chimice o constituie faptul că, in stare liberă ele nu pot funcţiona
decât într-un ciclu enzimatic, ceea ce conduce la un consum ridicat al unui astfel de compus
deoarece nu poate fi recuperat din produsii de reacţie şi reutilizat, asemănător catalizatorilor
clasici. Totodată, rămânând în produşii de reacție, enzima constitue o impuritate, impunând
îndepărtarea sa prin diferite metode, ceea ce complică tehnologiile ce apelează la astfel de
catalizatori.
Aceste dezavantaje pot fi parţial sau total eliminate prin insolubilizarea enzimei pe
un suport, mineral sau organic, prin legare chimică sau prin interacţiuni fizice. De asemenea,
enzimele imobilizate pot fi ușor separate din produşii de reacţie şi ulterior regenerate prin
tratare cu soluții tampon de pH corespunzător celui de activare maximă a biocatalizatorului,
fiind reutilizate într-un alt ciclu enzimatic, cu avantajele ce decurg de aici.
Prima încercare de a imobiliza o enzimă a fost realizată de Michaelis şi Ehrenreich în
1908 [527] prin adsorbţia invertazei pe cărbune, dar acest preparat precum si altele obţinute
prin imobilizarea altor enzime au dovedit o activitate scazută şi inconstantă.
Rezultate superioare au fost obţinute după cel de-al doilea război mondial, când
tehnicile de imobilizare s-au diversificat, incluzând legarea covalentă la suport, legarea
ionică, includerea în geluri, încapsularea sau simpla reticulare cu alte molecule de enzimă,
pentru a forma particule [528, 529].
Termenul de ―enzimă imobilizată‖ este utilizat pentru a descrie: insolubilizarea
enzimelor prin adsorbţie, legarea covalentă şi includere în matrice polimeră, ca modele ale
enzimelor asociate membranelor biologice funcţionând în organismele vii sau pentru
222
microîncapsularea enzimelor ca modele de celule artificiale, pentru enzimele din mediul
intracelular.
Principiul general al procedeelor de imobilizare a enzimelor constă în legarea sau
fixarea unei enzime sau a unui sistem multienzimatic de suportul insolubil în apă, în
condiţiile păstrării proprietăţilor catalitice, respectiv specificitatea de acţiune şi posibilitatea
de a acţiona la pH şi temperatură asemănătoare enzimelor libere (neimobilizate). În funcţie
de natura legăturilor care se stabilesc între enzime şi suportul de imobilizare, procedeul sau
metodele de imobilizare pot fi fizice sau chimice.
Procedeele fizice se bazează pe imobilizarea enzimelor prin intermediul legăturilor
fizice ca de exemplu, interacţiuni electrostatice, formarea de legaturi ionice, formarea de
legături de hidrogen, interacţiuni proteină-proteină etc.,
Factorii critici ce trebuie luaţi în considerare la folosirea enzimelor imobilizate sunt
următorii:
eficienţa economică a imobilizării determinată de costul enzimei, suportului şi
metoda de imobilizare;
activitatea enzimei imobilizată care este în funcţie de tehnica de imobilizare,
caracteristicile materialului de suport, viteza de difuzie a substratului la enzimă şi a
produsului de transformare;
caracteristicile substratului ce trebuie transformat ;
stabilitatea enzimei care trebuie menţinută un timp cât mai îndelungat ;
contaminarea microbiologică a sistemului enzimă-suport în timpul utilizării
reactorului respectiv [530, 532; 533]
O categorie de enzime cu importante aplicații în industria alimentară o constituie
hidrolazele, care produc scindarea unor legături formate prin eliminarea apei (esterice,
amidice, eterice etc). Printre cei mai importanți reprezentanți ai acestei clase se numără -
amilaza, care produce hidroliza legăturilor α-1,4 glicozidice din polizaharide cu gradul de
polimerizare cel puțin egal cu 3. Amiloza, polizaharidă din compoziția amidonului, este
scindată sub acțiunea - amilazei la oligozaharide cu grad de polimerizare mai mic, numite
dextrine. O hidroliză prelungită continuă scindarea lanțurilor polizaharidice pînă la maltoză
şi maltotrioze. α-Amilazele nu pot scinda legăturile α-1,6-glucozidice din amilopectină, cel
de al doilea component al amidonului.
Literatura raportează multe exemple de imoblizate ale - amilazei pe diferite
suporturi. Reținem spre exemplificare includerea - amilazei produsă de Hylocereus
223
polyhirus într-o matrice formată din gumă arabică și chitosan cu o eficienţă de încapsulare
de 96.2 %. Procesul de încapsulare ajută enzima sa fie stabilă în prezenţa agenţilor de
oxidare şi a surfactanţilor. Studiul probează faptul că această combinaţie de polimeri, cu rol
de agenţi de acoperire, protejează enzima de pierderea activităţii în timpul liofilizării.
Creşterea stabilităţii şi activitatea înaltă a - amilazei încapsulate face ca această abordare
să constituie o alegere atractivă pentru aplicaţii în biotehnologie si enzimologie [84].
Rezultatele raportate în acest capitol se referă la imobilizarea prin includere a -
amilazei într-o matrice sferică de gelan, reticulat ionic cu Mg2+, utilizând ca tehnică
extruderea prin capilară a soluției de polizaharid conținând enzima într-o baie de gelifiere
ionotropă conținând acetat de magneziu, deci aceeași tehnică utilizată la obținerea de
imobilizate de celule de drojdie raportate în capitolele precedente.
După informațiile noastre, în literatură nu există un astfel de studiu, ceea ce atestă
caracterul original al abordării noastre. Particulele de imobilizat sunt caracterizate fizico-
chimic, morfologic și din punct de vedere al activității enzimatice în mai multe cicluri
hidrolitice.
Obţinerea particulelor de gelan reticulat ionic are la baza reacția de schimb ionic
dintre gelan (sare de sodiu) si acetatul de magneziu, prezentată în subcapitolul 5.2..
In principiu, pentru ca o enzimă să poată fi imobilizată în rețele polimerice trebuie
ca moleculele sale să fie suficient de mari pentru a fi păstrate în interiorul matricei de gel, iar
moleculele substratului trebuie să fie suficient de mici pentru a trece prin porii matricei de
gelan. In cazul nostru, aceste condiții sunt îndeplinite, ochiurile rețelei stabilizând -
amilaza în interiorul lor, dar permițând difuzia amidonului (substrat) în interiorul particulei.
Prin metodologia descrisă în capitolul 4, au fost obținute 4 tipuri de particule,
diferind prin concentrația enzimei dizolvată în soluția de gelan supusă apoi extruderii,
conform planului experimental prezentat în tabelul 41.
Tabel 41. Planul experimental de obținere a imobilizatelor de de α-amilază *
Proba Concentrația soluței
de α-amilază (mg/ml)
Eficiența în
imobilizare, Ei %
P1 1 61,9
P2 2 68,27
P3 3 74,63
P4 4 65,5
* -concentrația soluției de gelan: 1%
- concentrația soluției de acetat de magneziu în baia de gelifiere: 2 %
224
- pH-ul soluției tampon acetat utilizată: 5.6.
- temperatura de imobilizare: 60˚C.
Particulele au fost obţinute prin extrudere printr-o capilară (ac de seringă) cu
diametrul interior de 600 microni şi lungimea de 30 mm. Particulele obţinute sunt sferice şi
au diametrul mediu de 2,5 mm.
Eficiența în imobilizare a enzimei s-a determinat pe baza cantității de enzime din
supernatant. Pentru determinarea proteinelor din particule a fost trasată o curbă de calibrare
care corelează cantitatea de albumină cu absorbanța (figura. Cantitatea de proteine s-a
determinat utilizând metoda Lowry.
Culoarea albastră rezulta in urma complexării legăturii peptidice cu sulfatul de
cupru si a reducerii reactivului Folin-Ciocalteu de catre resturile de tirozina si triptofan din
proteina. Waterborg JH, Matthews HR, The lowry method for protein quantitation, Methods
Mol Biol. 1984;1:1-3
Rezultatele privind eficiența în imobilizare a α-amilazei în particule de gelan sunt
redate în tabelul 1. Eficiența maximă în imobilizare a fost obținută utilizând o concentrație
de 3 mg/ml enzime și a fost de 74, 63%. În figura 76 este prezentată curba de calibrare a
albuminei serice bovine pe baza căreia s-a determinat cantitatea de enzimă neimobilizată.
Figura 76: Curba de calibrare a albuminei serice bovine (BSA)
Structura schematizată a particulelor obținute este prezentată în figura 77.
y = 0,0007x R² = 0,9961
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 200 400 600
Ab
sorb
an
ță
Concentrația de albumină, μg/ml
225
Figura 77. Structura schematizată a α-amilazei imobilizate în particule de gelan reticulat
ionic
7.1. Morfologia particulelor cu α-amilază imobilizată
În particulele analizate prin microscopie electronică de baleiaj a fost imobilizată
aceeași cantitate de α-amilază iar probele diferă prin concentrația de agent de reticulare
utilizată în baia de gelifiere, respectiv 1% și 2 % acetat de magneziu. Probele au fost uscate
iar fotografiile de microscopie electronică de baleiaj au fost realizate în secțiune.
Fotografiile obținute sunt prezentate în figura 78.
Morfologia particulelor în secțiune este asemănătoare, relevând formațiuni fibrilare,
evident datorate polizaharidului. Morfologia acestor particule este diferită de a celor
conținând celule de drojdie imobilizate (prezentate în subcapitolele 5.1.-5.5), la care
prezența celulelor sferice de drojdie împiedică realizarea de formațiuni fibrilare.
226
(a) (b)
Figura 78. Fotografii de microscopie electronică de baleiaj pentru particule
conținând - amilază imobilizată, reticulate cu (a) 1% , respectiv (b) 2% acetat de magneziu
în baia de reticulare.
Creșterea cantității de agent de reticulare are ca efect, previzibil, creșterea gradului
de reticulare, probată în fotografii de creșterea dernsității matricii polimere (fig. 78, b).
Rezultatul este în deplină concordanță cu modul de variație a gradului de umflare.
7.2. Capacitatea de umflare în mediu apos
Sferele de gelan obținute prin gelifiere ionotropă prezintă un evident caracter de
hidrogel, astfel încât caracteristicile lor de umflare în apă sunt importante atât pentru
stabilitatea lor, cât și pentru utilizarea ulterioară în procese hidrolitice repetate. O matrice de
tip hidrogel permite, a priori, difuzia substratului în interiorul particulei pentru contactul cu
enzima, dar și difuzia produșilor de hidroliză în afara matricei polimerice. În figura 79 este
prezentată variația gradului de umflare pentru proba P3 obținută cu concentrații diferite în
baia de gelifiere.
0
500
1000
1500
2000
2500
0 5 10 15 20 25 30
Q1%
Q2%
Q3%
Gra
du
l d
e u
mfl
are
, Q
%
Timp (h)
227
Figura 79. Variația gradului de umflare în timp pentru trei tipuri de particule cu α-
amilază imobilizată, obținute cu diferite concentrații de acetat de magneziu în baia de
reticulare (concentrații de 1%, 2% și 3% acetat de magneziu)
Se constată că proba cea mai reticulată (3 % acetat de magneziu) prezintă valorile
cele mai coborâte ale gradului de umflare, efectul fiind determinat de gradul lor mai ridicat
de reticulare. Evoluții apropiate ale acestei proprietați prezintă celelalte trei tipuri de
particule. Gradul de umflare din particule crește cu scăderea gradului de reticulare.
7.3. Caracterizarea enzimei libere
În vederea comparării ulterioare a imobilizatelor de enzimă, cu enzima liberă, s-a
impus mai întâi caracterizarea celei din urmă. Testele pe enzima liberă au fost efectuate
pentru a determina activitatea enzimatică în funcție de concentrația de amidon. În figura 80
sunt prezentate variația vitezei de hidroliză a amidonului și a activității enzimatice a α-
amilazei.
Viteza de hidroliză reprezintă cantitatea de amidon transformată în glucoză/ minut.
Se poate constata din figura 80 (a) că viteza de transformare a amidonului în zaharuri scade
în timp după, iar 10 minute rămâne aproape constantă. Din acest motiv timpul necesar
pentru fiecare ciclu de hidroliză a fost stabilit ca fiind de 10 minute.
(a) (b)
Figura 80. Variația în timp a vitezei de hidroliză a amidonului (a) și a activității enzimatice
a α-amilazei libere
Activitatea enzimatică se exprimă ca raport între cantitatea de substrat hidrolizat
(amidon) consumat și cea de enzimă (liberă sau imobilizată) utilizată pentru hidroliză
=
(9)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 5 10 15
Vit
eza
, m
g a
mid
on
tran
sform
at/m
in
Timp (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Activitatea enzimatică
Concentrația de enzime, mg/ml
228
Pentru determinarea activității enzimatice a α-amilazei libere s-au utilizat mai multe
concentrații de α-amilază cuprinse între 0,03922 mg/ml și 0,3922 mg/ml. Fiecare probă a
fost lăsată în contact cu soluția care conține 1 ml soluție de amidon 0,4 % și 6 ml soluție
tampon acetat pH 5,6 timp de 10 minute. După 10 minute se iau câte 200 μl probă iar
determinarea se efectuează așa cum a fost descrisă anterior. Activitatea enzimatică s-a
exprimat ca raport între cantitatea de amidon consumată și cantitatea de enzimă luată în
lucru.
Din figura 80(b) se constată că activitatea enzimatică scade cu creșterea
concentrației de enzime în mediul de hidroliză.
7.4. Determinarea constantei Michaelis-Menten și a vitezei maxime de hidroliză
Principiile generale ale cineticii reacțiilor chimice se aplică și la reacțiile catalizate
de enzime dar acestea au în plus o trăsătură proprie și anume saturarea cu substrat.
Ecuația Michaelis Menten exprimă relația matematică dintre viteza inițială a unei
reacții catalizată enzimatic, concentrația substratului și anumite caracteristici ale enzimei. În
figura 81 este prezentată cinetica Michaelis Menten pentru α-amilaza liberă și pentru α-
amilaza imobilizată în particule de gelan reticulate ionic iar valorile constantei Km și vitezei
maxime Vmax atât pentru enzima liberă cât și imobilizată sunt redate în tabelul 4.
Figura 81. Cinetica Michaelis-Menten pentru enzima liberă și enzima imobilizată în
particule de gelan reticulate cu acetat de magneziu
Tabel 42. Valorile constantei Km și vitezei maxime Vmax pentru enzima liberă și
imobilizată.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 10 20 30
α-amilaza libera α-amilaza imobilizată
Concentrația de amidon, mg/ml Vit
eza,
mg a
mid
on t
ransf
orm
at/m
in
229
Proba Temperatura, T˚C PH Km, mg/ml Vmax, mg
glucoză/min
α-Amilaza
liberă 60 5,6
1,003 2,02
α-Amilaza
imobilizată 2,45 1,57
Valoarea constantei Km arată afinitatea enzimei pentru substrat. O valoare mare a
constantei Km sugerează o afinitate mai mică a enzimei pentru substrat. În general, valoarea
vitezei maxime este mai mare pentru enzima liberă față de cea imobilizată, iar constanta Km
este mai mică la enzima liberă față de cea imobilizată.
Datele obținute în studiul nostru sunt comparabile cu cele din literatură. În cazul
enzimei imobilizate se observă o scădere a afinității pentru substrat (amidon) ce poate fi
cauzată de schimbările structurale ale enzimei care au loc în timpul imobilizării, apariția
unor fenomene de impiedicare sterică datorate suportului utilizat și a efectelor provocate de
o difuzie mai lentă.
7.5. Influența pH-ului și a temperaturii asupra activității enzimei libere șli
imobilizate
Determinările s-au efectuat în scopul stabilirii valorii optime a celor doi parametri,
care asigură o activitate enzimatică maximă. Cantitatea de α-amilază liberă a fost aceeași cu
cea imobilizată în particule în toate determinările efectuate.
În figura 82 este prezentată influența pH-ului și a temperaturii asupra activității
enzimatice.
230
a b
Figura 82. Influența pH-ului (a) și a temperaturii (b) asupra activității enzimatice
pentru enzima liberă și imobilizată
Determinările s-au efectuat atât pentru enzima liberă cât și pentru cea imobilizată.
Enzima liberă are o activitate enzimatică mai ridicată decât cea liberă, după cum s-a
constatat și din evaluarea constantei Km, dar în ambele cazuri se observă că valoarea
maximă activității enzimatice a fost atinsă la pH 5,6 (fig. 82). Activitatea enzimei libere este
superioară celei imobilizate indiferent de temperatura la care are loc reacția. In cazul
ambelor forme de prezentare ale enzimei însă, optimul de activitate este atins la temperatura
de 60˚C.
7.6. Testarea activității enzimatice a enzimei imobilizate în mai multe cicluri
hidrolitice
Particulele cu α-amilază imobilizată au fost testate în mai multe cicluri de hidroliză
repetate pentru a verifica dacă imobilizatele de acest tip pot fi reutilizate, fără o pierdere
esențială a activității. Proba selectată pentru determinare a fost P3, reticularea ionică fiind
realizată cu o sluție de concentrație 2 % acetat de magneziu. În figura 83 sunt prezentate
rezultatele obținute în urma hidrolizei repetate cu acest imobilizat.
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
4 5 6
α-amilaza liberă α-amilaza imobilizată
PH
Act
ivit
ate
a e
nzi
ma
tică
0
1
2
3
4
5
6
20 30 40 50 60 70 80 90
α-amilaza liberă α-amilaza imobilizată
Act
ivit
ate
a e
nzi
ma
tică
Temperature, T˚C
231
(a)
(b)
Figura 83. Testarea activității enzimatice în cicluri hidrolitice repetate pentru particule cu α-
amilază imobilizată (3 mg/ml), utilizând ca substrat amidonul la (a) pH 5,6 și (b) pH 5,2 și
pH 5,6.
În figura 83(a) sunt prezentate rezultatele obținute în urma testării activității
enzimatice a particulelor cu enzimă imobilizată, în mai multe cicluri hidrolitice. Se constată
că α-amilaza imobilizată în particule își păstrează activitatea enzimatică după mai multe
cicluri hidrolitice, aceasta nesuferind o diminuare importantă până la ciclul 11, după care
începe să scadă. După fiecare ciclu de hidroliză particulele au fost separate prin filtrare și
spălate cu soluție tampon acetat, pH 5,6 și au fost păstrate în această soluție tampon acetat
pentru 5 minute până la următorul ciclu de hidroliză. Durata dintre cicluri a fost de 10
minute.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 2 3 5 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19Act
ivit
atea
en
zim
atic
a
Numarul de cicluri hidrolitice
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Act
ivit
atea
en
zim
atic
a
Numarul ciclurilor hidrolitice
pH 5,2
pH 5,6
232
Pentru a stabili dacă activitatea enzimei nu poate fi adusă în apropierea valorii
inițiale, s-a realiat un test constând în tratarea imobilizatului cu o soluție mai acidă decât cea
la care se manifestă activitate maximă.
Astfel după 2 cicluri de hidroliză utilizând soluția tampon acetat la pH 5,6, probele
cu enzimă imobilizată au fost spălate cu soluția tampon acetat la pH 5,2 și menținute la acest
pH timp de 30 minute. Rezultatele obținute sunt prezentate în figura 83 (b). Se poate observa
că activitatea enzimatică crește după fiecare ciclu de hidroliză catalizat de particulele ce au
fost păstrate în soluția tampon acetat cu un pH de 5,2.
Concluzii
Au fost obținute particule stabile de gelan cu caracter de hidrogel conținând α-
amilază imobilizată, prin gelifiere ionotropă cu ioni de Mg2+;
Valoarea gradului de umflare în medii apoase scade cu cresterea concentratiei de
reticulant, consecință a creșterii gradului de reticulare
Morfologia particulelor relevă formațiuni fibrilare, porozitatea matricii reducându-se
cu creșterea gradului de reticulare
Temperatura și pH-ul la care activitatea enzimei sunt maxime au valorile: T=60˚C,
respectiv pH= 5,6;
Constanta Michaelis-Menten evidențiază în cazul enzimei imobilizate o scădere a
afinității pentru suport (amidon).
-amilaza imobilizată poate fi ușor recuperată din mediul de hidroliză, putând fi
utilizată în 11 cicluri hidrolitice repetate fără scăderea activității enzimatice; aceasta începe
să se reducă treptat pana la ciclul 19
-amilaza imobilizată în particule de gelan poate fi regenerată prin tratare cu un
mediu mai acid.
Rezultatele obținute sunt încurajatoare, imobilizatele astfel obținute constituyid, în
principiu, o alternativă la biotehnologiile care lucrează cu -amilază liberă, avantajele fiind
evidente.
233
CAPITOLUL 8
Imobilizarea curcuminei în particule pe bază de polizaharide complexate
polielectrolitic și reticulate ionic cu acetat de magneziu
Prevenţia bolilor cronice este o problemă pentru ţările dezvoltate. Factori cum ar fi
îmbătrânirea populaţiei şi creşterea costurilor de îngrijire a sănătăţii subliniază necesitatea de
prevenire a bolilor. Terapii nutriţionale, precum alimentele funcţionale şi suplimentele
alimentare reprezintă o abordare pentru prevenirea bolilor cronice. [94]
In 1979, Stephen DeFellce, fondator și președinte al fundatiei pentru inovaţie situată
in Cranford, New Jersey propune termenul de ‖nutraceutic‖ rezultat din combinarea
cuvântului nutriţie cu farmaceutic. Nutraceuticul este astfel definit ca un aliment care oferă
beneficii medicale sau de sănătate, inclusiv în prevenirea şi tratamentul bolilor [93].
Deşi există multe definiţii ale alimentelor funcţionale, o temă comună este faptul că
acestea pot oferi beneficii pentru sănătate ―dincolo de hrana de bază‖ [96] Aceste beneficii
pentru sănătate sunt de obicei asociate cu încorporarea unuia sau mai multor compuşi
bioactivi [95].
O scurtă trecere în revistă a nutraceuticelor şi ingredientelor bioactive permite
evidențierea următoarelor categorii de compuși.
prebiotice: inulina, oligozaharidele –susţin sănătatea intestinului şi ajută la refacerea
microflorei intestinale;
probiotice: lactobacili, bifidobacterii- îmbunătăţesc sănătatea intestinului [97]
substanţe fitochimice: beta-caroten, licopen, flavonoizi, proantocianidine, polifenoli,
alicina: reduc riscul apariţiei bolilor cardiovasculare, cancer, diabet, boli degenerative [98]
lanţuri lungi de acizi graşi omega-3: acid dodecahexaecanoic (DHA), acid
eicosapentaenoic (EPA)- susţin îmbunătăţirea sănătaţii cardiovasculare [99]
peptide bioactive: peptide derivate din lapte-reduc presiunea sangelui [100]
carotenoizii: beta-caroten, licopen, luteina, zeaxantina, astaxantina- reduc riscul
bolilor de ochi şi cancerul [101]
ierburi şi condimente: uleiuri esenţiale, diverse preparate de ierburi-au o gamă largă
de beneficii [571]
Cei mai mulți dintre aceștia sunt dificil de încorporat în produsele alimentare apoase,
şi sunt de multe ori extrem de sensibili la deteriorarea oxidativă [103].
Există de aceea o mare nevoie de a dezvolta sisteme de eliberare pentru industria
alimentară care pot fi utilizate pentru a încapsula şi proteja componenţii bioactivi.
234
Sistemele de eliberare pentru alimente funcţionale cu componenţi bioactivi lipofili trebuie să
posede unele calităţi importante. O calitate esenţială este aceea că trebuie să fie compatibile
atât cu componentul bioactiv cât şi cu produsul în care vor fi încorporate pentru a crea un
aliment funcţional sau o băutură funcţională. Alte atribute includ creşterea stabilităţii sau
eliberarea controlată a componenţilor bioactivi. Sistemele de eliberare pe bază de emulsii
sunt cele mai potrivite pentru a crea sisteme de transport al lipidelor bioactive. [104].
Acestea trebuie să fie astfel create încât să furnizeze atributele reologice dorite pentru un
anumit produs cum ar fi grosimea, structura, sau pot fi elaborate pentru a avea un impact
neglijabil asupra produsului. Factorii care includ concentraţia, mărimea, forma şi compoziţia
acestor particule joacă un rol important în modul cum reologia alimentelor sau băuturilor
este afectată. Pentru orice sistem de eliberare este esenţial ca acesta să rămână stabil pentru
întregul ciclu de viaţă al produsului. Mai mult, particulele de hidrogel nu ar trebui să
influenţeze negativ termenul de valabilitate al produsului în sine.
Curcumina este un compus cu beneficii foarte importante pentru organismul uman.
Efectele sale farmacologice au fost evidențiate de numeroase cercetări, care au subliniat
acțiunea sa în prevenția și tratarea unor boli cronice. [117-121]
Curcumina a fost prima dată izolată din turmeric - Curcuma Longa -, în 1815, fiind
folosită multă vreme în India ca remediu în casă pentru tratarea unor afecțiuni. In timp, s-a
dovedit a prezenta o excelentă acțiune de eliminare a speciilor active de oxigen, ceea ce îi
conferă activitate antioxidantă în celulele normale.
Marele său dezavantaj îl constituie insolubilitatea în apă și biodisponibilitatea
scăzută în celule. Atenuarea sau eliminarea acestor dezavantaje a fost încercată prin
realizarea de formulări pe bază de micele, lipozomi, nanoparticule ș.a.
Tot mai multe cercetări raportează încapsularea/includerea curcumine în
nanoparticule pe bază de polimeri naturali - chitosan, guma ghatti [554] -, sau sintetici -
poli(etilen glicol), poli(acid lactic), poli(vinil pirolidonă), poli(acid lactic-co-acid glicolic)
[556].
Alte tipuri de formulări implică complexarea cu ciclodextrine, complecși cu
fosfatidil-colină, includerea în nanoparticule lipidice sau încapsularea în lipozomi,
micro/nano emulsii, după cum s-a detaliat în capitolul 3, de studiu bibliografic.
Cercetările raportate în acest capitol au ca scop realizarea unor noi formulări prin
imobilizarea curcuminei în particule de polizaharide pentru a-i crește solubilitatea și
biodisponibilitatea.
235
Imobilizarea curcuminei a fost realizată în două tipuri de particule pe bază de
complecși polielectrolitici între polizaharide cu caracter ionic diferit. S-a evaluat capacitatea
particulelor de a se umfla în medii diferite și caracteristicile lor morfologice. Cinetica de
eliberare a curcuminei a fost studiată în două medii de pH diferit, simulând mediile
fiziologice: soluție tampon fosfat la pH 7,4 și o soluție ce simulează fluidul gastric la pH 2.
Primul tip de particule, pe bază de gelan, respectiv amestec de gelan cu caragenan,
au fost obținute în două etape conform procedeului descris în capitolul 5. Soluția apoasă de
gelan, respectiv amestec de polizaharide, în care s-a emulsionat soluția curcuminei în ulei, în
prezența emulsionantului Twin pentru stabilizare, a fost extrusă printr-o capilară în baia de
reticulare conținând acetat de magneziu. Particulele formate instantaneu au constituit miezul
pe care s-a depus ulterior chitosan, care complexează ionic cu grupările anionice rămase
neimplicate în reticulări din cele două polizaharide anionice inițiale. Proporția de i-
caragenan utilizată în amestec cu gelanul este de 30%. O cantitate mai mare de i-caragenan
conduce la formarea unor particule instabile. Cercetările raportate în literatură au demonstrat
că ionii de potasiu sunt eficienți în reticularea caragenanului. Cu toate acestea, concentrațiile
mari de potasiu nu sunt dorite în aplicațiile medicale deoarece pot cauza aritmii și slăbiri
severe ale mușchilor datorită hiperkalemiei așa cum a raportat în cercetările sale Poncelet și
colab. [572]
Așadar, originalitatea abordării noastre constă în utilizarea amestecului celor două
polizaharide anionice pentru crearea miezului particulei finale, și reticularea cu ionii de
Mg2+, bazată și pe experiența anterioară privind imobilizarea celulelor de drojdie și a -
amilazei în particule de gelan obținute prin gelifiere ionotropă.
Schematic, structura particulelor este prezentată în fig. 84
236
Figura 84. Structura particulelor de polizaharide cu curcumină imobilizată obținute
prin metoda emulsionării și a complexării polielectrolitice
Al doilea tip de imobilizat este constituit din microparticule de chitosan în care a
fost inclusă curcumina, dispersată mai întâi sub forma unei suspensii fine în apă, în care apoi
a fost adăugată soluție de chitosan (procedeu descris în capitolul 5). Realizarea încorporării
principiului activ în microparticule este atestată de culoarea galben închis a acestora.
Încapsularea curcuminei în microparticule de chitosan este benefică conducând la
îmbunătățirea solubilității și a biodisponibilității când este administrată pe cale orală.
Dispersarea microparticulelor de chitosan încorporând curcumină, într-o soluție de gelan,
permite complexarea polielectrolitică a celor două polizaharide. Complexul polielectrolitic
rezultat este apoi supus gelifierii ionotrope prin extrudere într-o baie conținând acetat de
magneziu, având ca rezultat obținerea particulelor finale constând în matricea de gelan ce
conține dispersate microparticule de chitosan încărcate cu curcumină. Particulele formate
sunt sferice, stabile și au diametrul mediu de 3 mm când sunt umflate, respectiv 0,5 mm
cand sunt uscate. Schematic, aceste particule sunt prezentate în fig. 85.
Figura 85. Prezentarea schematică a particulelor de gelan ce conțin microparticule
de chitosan cu curcumină imobilizată.
În tabelul 43 este prezentat programul experimental utilizat pentru obținerea celor
două tipuri de particule, iar în figura 86 sunt prezentate fotografii ale acestora.
237
Tabel 43. Programul experimental pentru obținerea particulelor și
eficiența de imobilizare pentru fiecare tip de particule.
Proba Gelan (%) i-caragenan
(%)
Chitosan
(%)
Concentrația
soluției de
acetat de
magneziu
(%)
Eficacitatea
imobilizării
(%)
P1* 100 0 - 2 70,0
P2* 70 30 - 2 67,42
P3**
89 - 11
1 82,94
P4** 2 87,0
P5** 3 87,16
*Extruderea emulsiei de polimer care conține curcumină a fost realizată într-un amestec
compus din 60 ml soluție 1% chitosan și 20 ml soluție acetat de magneziu de concentrație 2
%.
** Particulele au în compoziție 89% gelan și 11% chitosan; volumul soluției de acetat de
magneziu : 100 ml
(a) (b) (c)
Figura 86. Particule cu curcumină imobilizată: (a) proba P3 cu particule umflate, (b) proba
P3 particule uscate și (c) proba P1 particule uscate.
8.1. Morfologia particulelor
Pentru evaluarea morfologiei particulelor s-a procedat la analiza secțiunilor
acestora prin microscopie electronică de baleiaj. Probele alese pentru această analiză au fost
P1, P2 și P3, fotografiile obținute fiind prezentate în fig. 87
238
Figura 87. Fotografii obținute prin microscopie electronică de baleiaj în secțiune, pentru
particule conținând curcumină imobilizată.
Particulele P1 și P2 prezintă o morfologie poroasă, mult accentuată la proba P2,
care conține și i-caragenan. Rezultatul este în concordanță cu studiul efectuat Diana
Guzman-Villanueva și colab. (2013) care au observat creșterea porozității in
microparticulele de alginat/caragenan atunci când cantitatea de caragenan din particule
crește [552], și a fost constatat și în cazul imobilizatelor de cu celule de drojdie de bere care
aveau în compoziția matricii această polizaharidă (subcapitolul 5.5)
Pentru proba P3 se observă că microparticulele de chitosan ce conțin curcumină, în
număr mare, sunt bine prinse în rețeaua polimeră a matricii de gelan. Diametrul lor este de
aproximativ 2-3 μm.
8.2. Capacitatea de umflare în medii apoase
Capacitatea particulelor de a se umfla în medii diferite a fost evaluată prin măsurarea
gradului de umflare. Acesta a fost determinat gravimetric pentru probele P3, P4 și P5 în
soluție tampon fosfat pH = 7,4 precum și în soluție ce simulează fluidul gastric intestinal la
pH 2. Probele diferă prin cantitatea de agent de reticulare din baia de gelifiere.
În figura 88 sunt prezentate curbele de variație în timp ale gradului de umflare
determinat în medii de pH diferit.
P1 P2
P3
239
a b
Figura 88. Variația în timp a gradului de umflare pentru probele P3, P4 și P5. (a) soluție
tampon fosfat pH = 7,4 ; (b) soluție care simulează lichidul gastric pH = 2.
O primă constatare este faptul că valoarea gradului de umflare este mai ridicată în
mediu ușor bazic (fig. 88a). Explicația este legată de faptul că particulele prezintă gelan în
stratul exterior, pH-ul bazic având ca efect formarea de anioni carboxilat din grupele acide
care nu au participat la reticularea cu ionii de Mg2+. Apar astfel respingeri electrostatice între
macromoleculele de polizaharid, care determină relaxarea rețelei și facilitează pătrunderea
unor cantități mai mari de apă. Concluzii similare sunt raportate în literatură [555].
La pH = 2, gradul de umflare mai mic poate fi explicat ca fiind o consecință a
formării legăturilor de hidrogen între grupele carboxilice și grupările –OH din polizaharide,
efect raportat anterior și de către alți cercetători [444, 555].
Indiferent de mediul de umflare folosit, gradul de umflare crește cu reducerea
gradului de reticulare, respectiv a cantității de reticulant ionic folosit.
8.3. Cinetica de eliberare a curcuminei din particule
Cinetica de eliberare a curcuminei a fost studiată, de asemenea, în două medii
diferite de pH: soluție tampon fosfat pH = 7,4 și soluție care simulează fluidul gastric la pH
= 2, la temperatura fiziologică (T=37˚C), până la echilibru. În figura 89 sunt prezentate
curbele de eliberare pentru probele analizate.
0
500
1000
1500
2000
2500
0 5 10 15
Gra
du
l d
e u
mfl
are
. Q%
P3
P4
P5
Timp (h)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15
Gra
du
l d
e u
mfl
are
, Q%
Timp (h)
P3
P4
P5
240
(a) (b)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 500 1000 1500Timp (min)
Can
tita
tea d
e cu
rcu
min
ă
elib
erată
, μ
g
P
1P
2
(c) (d)
Figura 89. Cinetica eliberării curcuminei din diferite particule: (a) P3, P4, P5 în soluție
tampon fosfat pH=7,4; (b) P3, P4, P5 în soluție pH=2; (c) P1, P2 în soluție tampon fosfat
pH= 7.4, (c) P1, P2 în soluție pH 2.
Cantitatea maximă de curcumină eliberată indiferent de probă (respectiv eficiența
de eliberare – tabel 44) este mai mare în soluția tampon fosfat la pH = 7,4 decât în cea care
simulează fluidul gastric la (pH= 2).
0
200
400
600
800
1000
1200
0 2000 4000 6000 8000
Ca
nti
tate
a d
e cu
rcu
min
ă
elib
era
tă, μ
g
Timp (min)
P3
P4
P50
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5000 10000
Ca
nti
tate
a d
e c
urc
um
ină
e
lib
era
tă, μ
g
Timp (min)
P3
P4P5
0
100
200
300
400
500
600
700
0 2000 4000 6000Ca
nti
tate
a d
e c
urc
um
ină
e
lib
era
tă, μ
g
Timp (min)
P1
P2
241
Tabel 44. Eficiența de eliberare a curcuminei
în medii cu pH diferit
Proba
Eficiența de eliberare a
curcuminei din particule,
%
pH 7,4 pH 2
P1 68 60,47
P2 73,96 69,75
P3 83,81 64,72
P4 69,17 61,41
P5 58,62 55,32
Eficiența de eliberare crește cu scăderea gradului de reticulare la particulele de
gelan ce conțin microparticule de chitosan cu curcumină imobilizată indiferent de pH-ul
mediului în care a avut loc eliberarea.
Comparând probele P1 și P2, se constată creșterea cantității de curcumină eliberată
atunci când în compoziția amestecului de polimeri este și o cantitate de i-caragenan. Acest
comportament este determinat de porozitatea mai mare a particulelor care permit o difuzie
mai intensă a curcuminei. Și în acest caz cantitatea de curcumină eliberată la pH = 7,4 este
mai mare decât cantitatea de curcumină eliberată la pH = 2, explicația fiind aceeași ca în
cazul anterior anterior.
Eficiența de eliberare mai ridicată în mediu bazic, pentru toate probele analizate,
este, de asemenea, consecința unei umflări mai intense a matricii care permite creșterea
ochiurilor rețelei și, deci, difuzia facilitată a principiului activ.
În cazul P3, P4, P5 eliberarea curcuminei se efectuează cu o viteză mai mare până
la 720 min după care cantitatea de curcumină eliberată în timp începe să scadă până la un
punct de echilibru la aproximativ 5000 min când cantitatea de curcumină eliberată rămâne
constantă atât la pH =7.4 cât și la pH= 2.
În cazul particulelor P1 și P2 la pH =7.4 cantitatea de curcumină eliberată crește
constant până la 1440 minute după care particulele nu mai eliberează. La pH =2 particulele
eliberează curcumină până la 420 minute după care cantitatea de curcumină rămâne
constantă.
Este important de subliniat faptul că cea mai mare parte din curcumina imobilizată
în particule este eliberată în primele 12-15 ore, timp apropiat de cel de staționare a
alimentelor în tractul digestiv, ceea ce permite aucmularea treptată a, practic, întregii
cantități de compus biologic activ în organism.
242
Se impune a evidenția faptul că în cazul probelor în care curcumina a fost inclusă
după dizolvarea în ulei (P1, P2), chiar și în condițiile unei porozități ridicate indusă de
prezența carageenanului, eficiența de eliberare a principiului activ este mai redusă decât în
cazul celorlalte probe (în care curcumina a fost solubilizată în alcool anterior imobilizării,
alcoolul fiind apoi îndepărtat prin evaporare). Singura expicație plauzibilă o constituie
prezența uleiului, nemiscibil cu mediul apos în care se face eliberarea indiferent de
caracterul său bazic sau acid, ceea ce crează o barieră suplimentară în procesul de eliberare.
Concluzii
Au fost obținute două tipuri de particule sferice pe bază de polizaharide pentru
imobilizarea curcuminei utilizând două metode diferite bazate pe complexarea
polielectrolitică a polizaharidelor constituente și gelifiere ionotropă în prezența ionilor
metalici divalenți.
Eficiența de imobilizare a curcuminei este ridicată atunci când anterior includerii în
particule este dizolvată în alcool, și crește cu creșterea densității de reticulare.
Gradul de umflare și cantitatea de curcumină eliberată din particule cresc atunci
când gradul de reticulare al particulelor scade.
Particulele conținând curcumină dizolvată anterior într-o fază uleioasă manifestă o
eficiență de eliberare mai redusă. Prezența carageenanului în compoziția matricii polimere
determină o morfologie diferită, caracterizată prin porozitate accentuată, ceea ce are ca efect
intensificaprocesului de difuzie.
Indiferent de tipul de particule obținut, curcumina este eliberată conform unor
profiluri cinetice specifice celor două tipuri de imobilizate, atât în mediu acid cât și în mediu
bazic, cu eficiență mai ridicată în cel din urmă.
243
CONCLUZII GENERALE
Cercetările efectuate în cadrul lucrării de doctorat au abordat un domeniu foarte
actual și de mare interes pentru aplicații în industria alimentară, ce pot fi extinse și la alte
industrii care apelează la biotehnologii.
Scopul lucrării l-a constituit obținerea unor noi sisteme formate din compuși biologic
activi de interes pentru aplicații în industria alimentară, imobilizați în matrici sferice cu
caracter de hidrogel pe bază de polizaharide reticulate ionic.
Din categoria compușilor biologic activi au fost selectați pentru studiu trei tipuri:
celule de de drojdie de bere utilizate în procesul de fermentare a glucozei în vederea
obținerii alcoolului etilic, -amilaza folosită ca biocatalizator în prcesul de hidroliză a
amidonului pentru obținerea glucozei, respectiv curcumina, compus natural cu deosebite
beneficii pentru sănătatea umană, din categoria nutraceuticelor.
Domeniul de aplicații ale imobilizatelor obținute a impus selectarea suporturilor
polimere ținând cont de constrângerile pe care le impune un astfel de produs, care fie
lucrează în contact sau în interiorul organismului uman, fie generează produși care sunt
utilizați în aceste condiții: biocompatibilitate, lipsa toxicității și eliminarea riscului de a
forma produși toxici prin biodegradare în timpul proceselor pe care le catalizează sau în
organimul uman.
Realizarea sistemelor polimer - produs biologic activ sub formă de particule
insolubile în mediul în care lucrează pentru a permite utilizarea lor în cicluri repetate fie de
fermentare (în cazul celulelor de drojdie de bere), fie de hidroliză (în cazul -amilazei), a
impus reticularea polimerilor într-o manieră care să permită accesul prin difuzie al
substratului la principiul activ imobilizat precum și difuzia ulterioară a produșilor de reacție
în afara particulei imobilizatului – respectiv realizarea unor suporturi cu caracter de
hidrogel. In consecință, reticulanții selectați au trebuit să îndeplinească obligatoriu condiția
de a fi netoxici.
Având în vedere toate aceste constrângeri s-a optat pentru utilizarea ca suporturi a
unor polizaharide ionice – gelan, carboximetil celuloză sare sodică, caragenan, chitosan -
reticulabile prin gelifiere ionotropă cu ioni ai unor metale divalente – Ca2+
, Mg2+
, Zn2+
-, sau
prin complexare polielectrolitică, metoda de obținere a suportului sub formă de particule
fiind extruderea prin capilară.
S-au conturat trei direcții de cercetare, determinate de natura compusului biologic
activ imobilizat:
244
- obținerea de bioreactoare pentru fermentarea glucozei
- obținerea de bioreactoare pentru hidroliza amidonului
- obținerea de nutraceutice.
La finalul fiecărui capitol care raportează rezultatele cercetărilor obținute în cadrul
celor trei direcții au fost prezentate concluziile rezultate în urma studiului. Acestea au
permis stabilirea concluziilor generale ce vor fi prezentate în cele ce urmează.
1. Polizaharidele ionice constituie candidați ideali pentru obținerea de imobilizate ale
celulelor de drojdie de bere, -amilazei și curcuminei, sub formă de particule cu caracter de
hidrogel, printr-un procedeu simplu de gelifiere ionotropă cu ioni metalici divalenți,
utilizând tehnica extruderii prin capilară.
2. Gelanul - folosit ca materie primă de bază pentru obținerea imobilizatelor în toate
cercetările intreprinse în cadrul tezei -, folosit singur constituie o matrice convenabilă, ușor
de reticulat cu ioni de Ca2+
, Mg2+
, Zn2+
conducând la particule stabile în medii apoase sau
alcoolice, astfel încât pot fi utilizate într-un număr ridicat de cicluri de fermentare.
3. Stabilitatea particulelor de gelan gelifiat ionotrop depinde de natura reticulantului,
cantitatea de agent de reticulare din soluția de prereticulare precum și din baia de gelifiere
(coagulare).
4. Ionul Mg2+
din acetatul de magneziu furnizează structuri mai stabile din punct de
vedere mecanic în condițiile păstrării unei viabilitătți celulare ridicate. Ionul de Zn2+
permite
obținerea de performanțe în reticulare comparabile cu ionii Ca2+
și Mg2+, în condițiile
utilizării unor cantități cu un ordin de mărime mai coborâte ca aceștia, determinată de
capacitatea sa de a participa la reticulare și prin legături coordinative cu polizaharidul.
5. Stabilitatea structurală a particulelor, caracteristicile lor morfologice,
caracteristicle de umflare în medii apoase și în final și performanțele în procese de
fermentare sunt influențate de cantitatea de agent de reticulare utilizat atât în faza de pre-
reticulare cât mai ales în cea de gelifiere ionotropă. Cantități mai mari de agent de reticulare
măresc stabilitatea structurală, reduc gradul de umflare în apă prin creșterea densitătății de
reticulare, reduc ușor randamentul în fermentare al imobilizatelor deoarece determină o
difuzie mai lentă a substratului către celulele imobilizate.
6. Particulele suport, fără principiul activ imobilizat, prezintă o structură mai
poroasă, care devine mai densă în prezența celulelor de drijdie, capabile de a participa ele
însele la legături ionice cu matricea și determinând astfel o reticulare mai avansată. Aceste
legături pot explica, de asemenea, ancorarea puternică a celulelor de drojdie în matricea
245
polimeră responsabilă de faptul că doar o mică parte din acestea difuzează în mediul în care
sunt suspendate particulele.
7. Stabilitatea imobilizatelor este ridicată, indiferent de agentul de reticulare utilizat,
fapt atestat de valoarea ridicată a transmitanței mediilor apose în care sunt suspendate,
precum și de testele reologice efectuate. Această proprietate se păstrează la valori practic
nemodificate în timp.
8. Bioreactoarele pe bază de gelan reticulat cu cele trei tipuri de cationi metalici
manifestă o capacitate ridicată de fermentare a glucozei, superioară chiar utilizării drojdiei
libere.
9. Gelanul poate fi utilizat în amestec cu carboximetil celuloza pentru formarea de
particule prin același procedeu, rezultând structuri interconectate/interpenetrate stabile.
Prezența unui număr mai ridicat de grupe reticulabile în carboximetil celuloză constituie un
avantaj, deoarece permite substituirea unei cantități ridicate de gelan cu un derivat celulozic
mai ieftin.
10. Raportul de combinare a gelanului cu carboximetil celuloza constituie un factor
ce influențează densitatea de reticulare a matricei, și de aici caracteristicile morfologice,
stabilitatea, comportamentul la umflare în medii apoase, capacitatea de fermentare a
imobilizatelor.
11. Amestecuri din trei polizaharide – gelan, carboximetil celuloză sare de sodiu și
caragenan -, în diferite proporții pot fi reticulate cu cei trei cationi metalici, caracteristicile
lor morfologice, structurale și fizico-chimice fiind influențate de raportul polimerilor și de
natura ionului reticulant. Matricile rezultate prezintă o structură complexă, fiind de tip
interconectat/interpenetrat.
12. Prezența caragenanului în compoziția particulelor are ca efect creșterea
porozității acestora cu efecte benefice asupra capacității de difuzie a substratului în miezul
matricei, ce determină final capacitatea de fermentare produsă de acestea.
13. Utilizarea Mg2+
și a Zn2+
ca agenți de reticulare este avantajoasă nu numai prin
caracteristicile pe care le imprimă particulelor, ci și din punct de vedere al beneficiilor aduse
de acești ioni asupra celulelor de drojdie de bere imobilizate: creșterea viabilității și a
capacității de proliferare.
14. Metaboliții din mediul de fermentare, cu caracter toxic, nu au un efect pronunțat
asupra celulelor de drojdie incluse în matricea polimeră; indiferent de compoziția sa, aceasta
păstrează viabilitatea celulară la valori optime în timp.
246
15. pH-ul mediului de fermentare și durata de păstrare a imobilizatelor în baia de
reticulare influențează activitatea bioreactoarelor, indiferent de compoziția lor; valoarea
optimă a pH-ului în soluția de glucoză supusă fermentării este 5, în concordanță cu rezultate
stabilite în alte cercetări, iar timpul optim de păstrare în baia de reticulare este de 2 ore.
16. Toate imobilizatele păstreaza stabilitate structurală/mecanică ridicată în soluții
apoase de alcool etilic, caracteristică importantă pentru posibilitatea reutilizării lor în cicluri
repetate de fermentare.
17. Fermentarea se produce dominant în particulele purtătoare de celule de drojdie de
bere, și nu în mediul lichid din baia de fermentare, în care se găsește un număr foarte redus
de celule de drojdie libere.
18. Celulele de drojdie de bere proliferează în matricea polimeră, indiferent de natura
sa. In matricea polimeră se găsesc în cea mai mare proporție celule vii, dovadă fiind
viabilitatea celulară care se păstrează la valori foarte ridicate, de minim 82 %, chiar după un
număr mare de cicluri de fermentare.
19. Biorectoarele obținute pot fi recuperate cu ușurință din mediul de fermentare și
reutilizate în alt ciclu fermentativ după o durată scurtă de păstrare în apă distilată. In funcție
de natura reticulantului și a matricel polimere, se poate ajunge până la 40 de cicluri
fermentative, cu randamente permanent superioare celui atins cu celule de drojdie libere.
20. Particulele cu drojdie de bere imobilizată în matrici polizaharidice (simple sau în
amestec) reticulate ionic pot reprezenta o nouă abordare în producerea alcoolului etilic de uz
alimentar sau pentru carburanți (biodiesel) datorită avantajelor pe care le manifestă: ușurință
în obținere, folosirea pentru generarea matricii a unor polizaharide ieftine, din surse
regenarabile, utilizarea de agenți de reticulare ieftini, consum redus de biocatalizator
(drojdie de bere) datorită posibilității de utilizare repetată un număr mare de cicluri
fermentative, recuperare facilă din mediul de fermentare, potențiala rezolvare a deficitului
de ioni metalici importanți pentru proliferarea și viabilitatea celulelor de drojdie – problemă
cu care se confruntă producătorii din industria băuturilor alcoolice -, posibilitatea trecerii la
procese de fermentare continui cu avantajele binecunoscute. O potențială utilizare o poate
constitui șampanizarea vinurilor, industrie în care în prezent se utilizează imobilizate pe
bază de alginat, mai puțin stabile structural.
21. Gelanul constituie o matrice adecvată pentru imobilizarea -amilazei, în scopul
obținerii de particule prin gelifiere ionotropă cu ioni de Mg2+, potențial utilizabile în procese
repetate de hidroliză a amidonului.
247
22. Morfologia și proprietățile de umflare în medii apoase ale particulelor sunt și în
acest caz influențate de cantitatea de reticulant. Particulele prezintă în structură o morfologie
fibrilară, tot mai densă cu creșterea cantității de reticulant, cu capacitate de umflare în apă
ce diminuiază cu acest parametru.
23. Particulele de imobilizat manifestă o activitate biocatalitică maximă la
temperatura de 60˚C și pH= 5,6, la fel ca și enzima liberă, ceea ce atestă faptul că prin
imobilizarea enzima nu este denaturată.
24. Valoarea mai ridicată a constantei Michaelis-Menten pentru enzima imobilizată
atestă, după cum era de așteptat, o afinitate ușor mai redusă a acesteia pentru substrat
(amidon), determinată și de gradele mai mici de libertate ale enzimei, și de factori sterici.
25. Imobilizatele de -amilază imobilizată pot fi ușor recuperate din mediul de
hidroliză, având capacitatea de reutilizare până la 11 cicluri hidrolitice repetate fără scăderea
activității enzimatice; activitatea enzimatică se reduce apoi treptat până la cel de al 19-lea
ciclu.
26. Activitatea enzimatică a imobilizatelor poate fi readusă aproape de valoarea
inițială prin regenerare într-un mediu mai acid.
27. Imobilizatele de -amilază în matrici reticulate ionic pe bază de gelan deschid
perspectiva utilizării în procese hidrolitice continui, cu toate avantajele ce decurg din
acestea.
28. Polizaharidele ionice constituie candidați importanți la realizarea de matrici
pentru imobilizarea curcuminei, conducând la noi formulări nutraceutice.
29. Complexarea polielectrolitică a unor perechi de polizaharide cu caracter ionic
diferit – gelan și chitosan – completată de gelifierea ionotropă cu ioni metalici divalenți,
realizată prin două tehnici diferite, permite obținerea de particule capabilă să încorporeze
curcumina.
30. Particulele de imobilizat prezintă morfologii diferite funcție de modul de
obținere: fie de tip ‖miez-manta‖ când miezul este format din gelan gelifiat ionotrop,
conținând curcumină, complexat ulterior polielectrolitic cu chitosan, fie de tip
microparticule de chitosan conținând curcumină, dispersate într-o matrice de gelan gelifiat
ionotrop cu care formează complexul polielectrolitic.
30. Eficiența de imobilizare a curcuminei crește daca aceasta este dizolvată inițial în
alcool etilic ce este ulterior îndepărtat prin evaporare; creșterea gradului de reticulare a
matricii determină creșterea cantității de curcumină incapsulată.
248
31. Caracteristicile de umflare în apă și catntitatea de curcumina eliberată în medii de
pH diferit se îmbunătățesc prin reducerea gradului de reticulare a matricii de gelan.
32. Utilizarea carageenanului în amestec cu gelanul determină o morfologie diferită,
caracterizată prin porozitate accentuată, ceea ce are ca efect intensificarea difuziei
curcuminei în procesul de eliberare.
33. Profilul de eliberare a curcuminei este specific celor două tipuri de imobilizate
obținute, atât în mediu acid simulând pH-ul gastric (acid) cât și cel intestinal (bazic),
procesul decurgând cu eficiență mai ridicată în cel din urmă.
249
Bibliografie:
[1] C. Bro, B. Regenberg, J. Forster, J. Nielsen, ―In silico aided metabolic engineering of Sa
ccharomyces cerevisiae for improved bioethanol production,‖ Metabolic Engineering, vol. 8,
no. 2, pp. 102–111, 2006.
[2] C. A. Cardona, Ó. J. Sánchez, ―Fuel ethanol production: Process design trends and integr
ation opportunities,‖ Bioresource Technology, vol. 98, no. 12, pp. 2415–2457, 2007.
[3] B. C. H. Chu, H. Lee, ―Genetic improvement of Saccharomyces cerevisiae for xylose fer
mentation,‖ Biotechnology Advances, vol. 25, no. 5, pp. 425–441, 2007.
[4] W. K. Bronn, The technology of yeast production-Baker‘s yeast –Technical University,
Berlin (1984/85)
[5] A. J. Dobbs, M. Peleg, R. E. Mudgett, R. Rufner, ―Some physical characteristics of activ
e dry yeast,‖ Powder Technology, vol. 32, no. 1, pp. 63–69, 1982.
[6] G. Reed, T. W. Nagodawithana, ―Baker‘s Yeast Production,‖ Yeast Technology, pp. 261
–314, 1991.
[7] E. Potthoff, O. Guillaume-Gentil, D. Ossola, J. Polesel-Maris, S. LeibundGut-Landmann
, T. Zambelli, J. A. Vorholt, ―Rapid and Serial Quantification of Adhesion Forces of Yeast a
nd Mammalian Cells,‖ PLoS ONE, vol. 7, no. 12, p. e52712, 2012.
[8] F. Randez-Gil, I. Córcoles-Sáez, J. A. Prieto. ‖Genetic and Phenotypic Characteristics
of Baker's Yeast: Relevance to Baking,‖ Annual Review of Food Science and Technology
Vol. 4, pp.191-214, 2013.
[9] F. M. Klis, C. G. de Koster, S. Brul, ―Cell Wall-Related Bionumbers and Bioestimates of
Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans,‖ Eukaryotic Cell, vol. 13, no. 1, pp. 2–9, 2
013.
[10] H. C. Lange, J. J. Heijnen, ―Statistical reconciliation of the elemental and molecular bio
mass composition of Saccharomyces cerevisiae,‖ Biotechnology and Bioengineering, vol. 7
5, no. 3, pp. 334–344, 2001.
250
[11] J. Youatt, ―Calcium and Microorganisms,‖ Critical Reviews in Microbiology, vol. 19, n
o. 2, pp. 83–97, 1993.
[12] G. M. Walker, ―The Roles of Magnesium in Biotechnology,‖ Critical Reviews in Biote
chnology, vol. 14, no. 4, pp. 311–354, 1994.
[13] R. P. Jones, G. M. Gadd, ―Ionic nutrition of yeast—physiological mechanisms involved
and implications for biotechnology,‖ Enzyme and Microbial Technology, vol. 12, no. 6, pp.
402–418, 1990.
[14] B. R. Gibson, ―125th Anniversary Review: Improvement of Higher Gravity Brewery Fe
rmentation via Wort Enrichment and Supplementation,‖ Journal of the Institute of Brewing,
vol. 117, no. 3, pp. 268–284, 2011.
[15] J. J. Rautio, A. Huuskonen, H. Vuokko, V. Vidgren, J. Londesborough, ―Monitoring ye
ast physiology during very high gravity wort fermentations by frequent analysis of gene expr
ession,‖ Yeast, vol. 24, no. 9, pp. 741–760, 2007.
[16] J. Ding, X. Huang, L. Zhang, N. Zhao, D. Yang, K. Zhang, ―Tolerance and stress respo
nse to ethanol in the yeast Saccharomyces cerevisiae,‖ Applied Microbiology and Biotechno
logy, vol. 85, no. 2, pp. 253–263, 2009.
[17] X. Q. Zhao, F. W. Bai, ―Mechanisms of yeast stress tolerance and its manipulation for e
fficient fuel ethanol production,‖ Journal of Biotechnology, vol. 144, no. 1, pp. 23–30, 2009.
[18] D. Briggs, C. Boulton, P. Brookes, R. Stevens, ―Brewing,‖ Brewing Science and Practi
ce. Woodhead, Cambridge, UK, pp. 410-439, 2004
[19] M.K. Somda, A. Savadogo, B. Nicolas, T. Philippe, T.A. Sabadenedyo, „Effect of
mineral salts in fermentation process using mango residues as carbon sources for bioethanol
production‖, Asian J. Ind. Engr.,vol. 3, pp. 29-38, 2011.
[20] F.-Q. Wang, C.-J. Gao, C.-Y. Yang, P. Xu, ―Optimization of an ethanol production med
ium in very high gravity fermentation,‖ Biotechnology Letters, vol. 29, no. 2, pp. 233–236,
2006.
251
[21] B. R. Gibson, ―125th Anniversary Review: Improvement of Higher Gravity Brewery Fe
rmentation via Wort Enrichment and Supplementation,‖ Journal of the Institute of Brewing,
vol. 117, no. 3, pp. 268–284, 2011.
[22] G. M. Walker, R. De Nicola, S. Anthony, R. Learmonth, ―Yeast-metal
interactions:impact on brewing and distilling fermentations‖, J. Inst. Brew Dist. APSC.,
pp.19-24, 2006.
[23] P. Aleksander, A. Piotr, M. Makarewicz, ‖Accumulation and release of metal ions by
brewer‘s yeast during successive fermentations ‖, J InstBrew, vol. 115, no 1, pp. 78-83,
2009.
[24] N. P. Pisat, A. Pandey, C. W. MacDiarmid, ―MNR2 Regulates Intracellular Magnesium
Storage in Saccharomyces cerevisiae,‖ Genetics, vol. 183, no. 3, pp. 873–884, 2009.
[25] R. De Nicola, N. Hall, S.G. Melville, G.M. Walker, ‖Influence of zinc on distiller‘s
yeast: cellular accumulation of zinc and impact on spirit congeners,‖ J Inst. Brew., vol. 115,
no 3, pp. 265-271, 2009.
[26] D. J. Eide, ―Zinc transporters and the cellular trafficking of zinc,‖ Biochimica et Bioph
ysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research, vol. 1763, no. 7, pp. 711–722, 2006.
[27] R. M. Birch, G. M. Walker, ―Influence of magnesium ions on heat shock and ethanol st
ress responses of Saccharomyces cerevisiae,‖ Enzyme and Microbial Technology, vol. 26, n
o. 9–10, pp. 678–687, 2000.
[28] H. O. Udeh, T. E. Kgatla, A. I. O. Jideani, „Effect of mineral ion addition on yeast
performance during very high gravity wort fermentation‖, International Journal of
Biological, Biomolecular, Agricultural, Food and Biotechnological Engineering, vol 8, pp.
1208-1216, 2014
[29] R. J. Elin, ―Magnesium: The Fifth but Forgotten Electrolyte,‖ Am J Clin Pathol, vol. 10
2, no. 5, pp. 616–622, 1994.
[30] A. Hartwig, ―Role of magnesium in genomic stability,‖ Mutation Research/Fundamenta
l and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, vol. 475, no. 1–2, pp. 113–121, 2001.
[31] O. Udeh, T.E Kgatla, ―Role of magnesium ions on yeast performance during very high
gravity fermentation,‖ Journal of Brewing and Distilling, vol. 4, no. 2, pp. 19–45, 2013.
252
[32] G. M. Walker, ―Metals in Yeast Fermentation Processes,‖ Advances in Applied Microb
iology, pp. 197–229, 2004.
[33] J. Bose, O. Babourina, Z. Rengel, ―Role of magnesium in alleviation of aluminium toxi
city in plants,‖ Journal of Experimental Botany, vol. 62, no. 7, pp. 2251–2264, 2011.
[34] S. Blazejak, W. Duszkiewicz-Reinhard, M. Gniewosz, P. Wiatrzyk, ―Impact of magnesi
um and mannose in the cultivation media on the magnesium biosorption, the biomass yield a
nd on the cell wall structure of Candida utilis yeast,‖ European Food Research and Technolo
gy, vol. 227, no. 3, pp. 695–700, 2007.
[35] F. M. Klis, C. G. de Koster, S. Brul, ―Cell Wall-Related Bionumbers and Bioestimates
of Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans,‖ Eukaryotic Cell, vol. 13, no. 1, pp. 2–9,
2013.
[36] J. K. Park, J. W. Lee, J. Y. Jung, ―Cadmium uptake capacity of two strains of Saccharo
myces cerevisiae cells,‖ Enzyme and Microbial Technology, vol. 33, no. 4, pp. 371–378, 20
03.
[37] N. P. Pisat, A. Pandey, C. W. MacDiarmid, ―MNR2 Regulates Intracellular Magnesium
Storage in Saccharomyces cerevisiae,‖ Genetics, vol. 183, no. 3, pp. 873–884, 2009.
[38] M. Gniewosz, W. Duszkiewicz-Reinhard, S. Blazejack, J. Sobiecka, M. Zarzecka,
„Investigations into magnesium biosorption by waste brewery yeast Saccharomyces
uvarum‖, Acta Sci. Pol.Technol. Aliment., vol. 6, no. 1, pp. 57-67, 2007.
[39] K. J. Blackwell, I. Singleton, J. M. Tobin, ―Metal cation uptake by yeast: a review,‖ Ap
plied Microbiology and Biotechnology, vol. 43, no. 4, pp. 579–584, 1995.
[40] S.V. Avery, J. M. Tobin, „Mechanism of strontium uptake by laboratory and
brewingstrains of Saccharomyces cerevisiae‖, Appl. Environ. Microbiol., vol. 58, pp. 3883-
3889, 1992.
[41] A. Graschopf, J. A. Stadler, M. K. Hoellerer, S. Eder, M. Sieghardt, S. D. Kohlwein, R.
J. Schweyen, ―The Yeast Plasma Membrane Protein Alr1 Controls Mg2+ Homeostasis and I
s Subject to Mg2+-dependent Control of Its Synthesis and Degradation,‖ Journal of Biologic
al Chemistry, vol. 276, no. 19, pp. 16216–16222, 2001.
[42] A. L. Maynard, The influence of magnesium ions on the growth and metabolism of
Saccharomyces cerevisiae. Thesis, Dundee Institute of Technology, Dundee, UK, 1993.
253
[43] Maede T, Wurdler-Murphy SM, Saito H (2004). Metabolism of wort by yeast. In:
Brewing Science and Practice Briggs DE, Boulton CA, Brookes PA, Stevens R (2004).
Woodhead Cambridge, UK, pp. 410.
[44] G. M. Walker, „Magnesium as a stress protectant for industrial strains of
Saccharomyces cerevisiae‖, J. Am. Soc. Brew. Chem, vol. 56, pp. 109-113, 1998.
[45] Hu CK, Bai FW, An LJ Enhancing ethanol tolerance of a self-flocculating fusantof
Schizosaccharomyces pombe and Saccharomyces cerevisiae by Mg2+ via reduction in
plasma membrane permeability.Biotechnol. Lett. 25:1191-1194. 2003
[46] Y. Trofimova, G. Walker, A. Rapoport, ―Anhydrobiosis in yeast: influence of calcium a
nd magnesium ions on yeast resistance to dehydration-rehydration,‖ FEMS Microbiology Le
tters, vol. 308, no. 1, pp. 55–61, 2010.
[47] B. S. Levine, J. W. Coburn, ―Magnesium, the Mimic/Antagonist of Calcium,‖ New Eng
land Journal of Medicine, vol. 310, no. 19, pp. 1253–1255, 1984.
[48] E. M. R. Rees, G. G. Stewart, ―Effects of Magnesium, Calcium and Wort Oxygenation
on the Fermentative Performance of Ale and Lager Strains Fermenting Normal and High Gr
avity Worts*,‖ Journal of the Institute of Brewing, vol. 105, no. 4, pp. 211–218, 1999.
[49] P. J. Slininger, B. S. Dien, S. W. Gorsich, Z. L. Liu, ―Nitrogen source and mineral opti
mization enhance d-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124,‖
Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 72, no. 6, pp. 1285–1296, 2006.
[50] R. A. Villen, W. Borzani, A. S. Netto, ―Influence of the accumulation of phosphate and
magnesium ions in the yeast cells on the ethanol productivity in batch ethanol fermentation,‖
Braz. arch. biol. technol., vol. 52, no. 1, pp. 153–155, 2009.
[51] H. Densky, P.J. Gray and A. Buday, „Further studies on the determination of zinc and
its effects on various yeasts‖, Proceedings of the American Society of Brewing Chemists,
93-94, 1966.
[52] R. P. Learmonth and E. Gratton, „Assessment of membrane fluidity in individual yeast
cells by Laurdan Generalised Polarisation and Multi-photon Scanning Fluorescence
Microscopy‖, in: Fluorescence Spectroscopy, Imaging and Probes- New Tools in Chemical,
254
Physical and Life Sciences, Springer Series on Fluorescence: Methods and Applications,
Springer, Heidelberg, pp. 241-252, 2002.
[53] I. Russell and G. G. Stewart, ―Brewing,‖ Biotechnology Set, pp. 419–462.
[54] Nicola, R.D., et al., Influence of zinc on distillers's yeast: cellular accumulation of zinc
and impact on spirit congeners. J. Inst. Brew. 115(3): p. 265-271, 2009.
[55] V. Vidgren, J. Londesborough, ―125th Anniversary Review: Yeast Flocculation and Se
dimentation in Brewing,‖ Journal of the Institute of Brewing, vol. 117, no. 4, pp. 475–487, 2
011.
[56] Y.-L. Jin, R. Alex Speers, ―Flocculation of Saccharomyces cerevisiae,‖ Food Research
International, vol. 31, no. 6–7, pp. 421–440, 1998.
[57] V. Stehlik-Thomas, V.G. Zetic, D. Stanzer, S. Grba, N. Vahcic, ―Zinc, copper and
manganese enrichment in yeast Saccharomyces cerevisiae‖, Food Technol. Biotechnol., vol
42, no 2, pp. 115-120, 2004.
[58] C. Zufall, T. Tyrell, ―The Influence of Heavy Metal Ions on Beer Flavour Stability,‖
Journal of the Institute of Brewing, vol. 114, no. 2, pp. 134–142, 2008.
[59] M. Shakoury-Elizeh, J. Tiedeman, J. Rashford, T. Ferea, J. Demeter, E. Garcia, R. Rolf
es, P. O. Brown, D. Botstein , C. C. Philpott, ―Transcriptional Remodeling in Response to Ir
on Deprivation in Saccharomyces cerevisiae,‖ Molecular Biology of the Cell, vol. 15, no. 3,
pp. 1233–1243, 2003.
[60] F. Gaensly, G. Picheth, D. Brand, T. M. B. Bonfim, ―The uptake of different iron salts b
y the yeast Saccharomyces cerevisiae,‖ Braz. J. Microbiol., vol. 45, no. 2, pp. 491–494, 201
4.
[61] C. A. Martínez-Garay, R. de Llanos, A. M. Romero, M. T. Martínez-Pastor, S. Puig, ―R
esponses of Saccharomyces cerevisiae Strains from Different Origins to Elevated Iron Conc
entrations,‖ Appl. Environ. Microbiol., vol. 82, no. 6, pp. 1906–1916, 2016.
[62] K. A. Gray, L. Zhao, M. Emptage, ―Bioethanol,‖ Current Opinion in Chemical Biology,
vol. 10, no. 2, pp. 141–146, 2006.
255
[63] G. N. Vemuri, M. A. Eiteman, J. E. McEwen, L. Olsson, J. Nielsen, ―Increasing NADH
oxidation reduces overflow metabolism in Saccharomyces cerevisiae,‖ Proceedings of the N
ational Academy of Sciences, vol. 104, no. 7, pp. 2402–2407, 2007.
[64] C. Wittmann, M. Hans, W. A. van Winden, C. Ras, J. J. Heijnen, ―Dynamics of intracel
lular metabolites of glycolysis and TCA cycle during cell-cycle-related oscillation inSacchar
omyces cerevisiae,‖ Biotechnology and Bioengineering, vol. 89, no. 7, pp. 839–847, 2005.
[65] H.A. Krebs, P.D.J. Weitzman (1987). Krebs' citric acid cycle: half a century and still
turning. London: Biochemical Society. ISBN 0-904498-22-0
[66] J. S. Morton, „Glycolysis and Alcoholic Fermentation‖, Acts & Facts., vol. 9, no.12,
1980 http://www.icr.org/article/glycolysis-alcoholic-fermentation/
[67] I. Schomburg, A. Chang, S. Placzek, C. Sohngen, M. Rother, M. Lang, C. Munaretto,
S. Ulas, M. Stelzer, A. Grote, M. Scheer, D. Schomburg, ―BRENDA in 2013: integrated rea
ctions, kinetic data, enzyme function data, improved disease classification: new options and
contents in BRENDA,‖ Nucleic Acids Research, vol. 41, no. D1, pp. D764–D772, 2012.
[68] G.M. Cooper, The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. Sunderland (MA): Sinauer
Associates; The Central Role of Enzymes as Biological Catalysts. 2000.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9921/
[69] I.F. Dumitriu, D. Iordănescu, Introducere în enzimologie, Ed. Medicală, Bucureşti,
1981
[70] N. Gheorghiţă, A. Iacobovici, L. Jerca, I. Popovici,‖ Biochimie medicală- curs‖,
Universitatea de Medicină şi Farmacie ― Gr. T. Popa‖, Iaşi, 1996
[71] P. Tomme, N. R. Gilkes, R. C. Miller, A. J. Warren, D. G. Kilburn, ―An internal cellulo
se-binding domain meidates adsorption of an engineered bifunctional xylanase/cellulase,‖ ―
Protein Engineering, Design and Selection,‖ vol. 7, no. 1, pp. 117–123, 1994.
[72] I.Chibata. Immobilized Enzymes, Research and Development. Halsted Press Book,
New York, 298.1978, AM Kilbanov (ed), Analytical Biochemistry, 93, pp. 1-25.1979
[73] H.-B. Shen, K.-C. Chou, ―EzyPred: A top–down approach for predicting enzyme functi
onal classes and subclasses,‖ Biochemical and Biophysical Research Communications, vol.
364, no. 1, pp. 53–59, 2007.
256
[74] K. O. Soetan, O. O Aiyelaagbe, C. O. Olaiya, A review of the biochemical, biotechnol
ogical and other applications of enzymes, African Journal of Biotechnology, vol. 9, no. 4, p
p. 382-393, 2010.
[75] R. Gupta, P. Gigras, H. Mohapatra, V. K. Goswami, B. Chauhan, ―Microbial α-amylase
s: a biotechnological perspective,‖ Process Biochemistry, vol. 38, no. 11, pp. 1599–1616, 20
03.
[76] M. C. Santa-Maria, C.-J. Chou, G. C. Yencho, C. H. Haigler, W. F. Thompson, R. M. K
elly, B. Sosinski, ―Plant cell calcium-rich environment enhances thermostability of recombin
antly produced α-amylase from the hyperthermophilic bacteriumThermotoga maritime,‖ Bio
technology and Bioengineering, vol. 104, no. 5, pp. 947–956, 2009.
[77] A. Sundarram, T. P. K. Murthy, „α-Amylase Production and Applications: A Review‖,
Journal of Applied & Environmental Microbiology, vol. 2, no. 4, pp.166-175, 2014.
[78] L. Taneja, V. Arya, ―Inhibition of salivary amylase by black tea in high-caries and low-
caries index children: A comparative in vivo study,‖ Ayu, vol. 36, no. 3, pp. 278-282, 2015.
[79] F. A. Scannapieco, G. Torres, M. J. Levine, ‖Salivary a-Amylase: Role in Dental
Plaque and Caries Formation,‖ Critical Reviews in Oral Biology and Medicine, vol. 4(3/4),
pp.301-307, 1993.
[80] U. M. Nater, R. La Marca, K. Erni, U. Ehlert, ―Alpha-Amylase Activity in Blood Increa
ses after Pharmacological, But Not Psychological, Activation of the Adrenergic System,‖ PL
oS ONE, vol. 10, no. 6, p. e0130449, 2015.
[81] W. R. Matull, S.P. Pereira, J.W. O‘Donohue, ―Biochemical markers of acute pancreatiti
s,‖ Journal of Clinical Pathology, vol. 59, no. 4, pp. 340–344, 2006.
[82] P. M. De Souza, P. de Oliveira Magalhães,‖ Application of microbial α-amylase in
industry – A review‖. Brazilian Journal of Microbiology, vol. 41, no. 4, pp. 850-861, 2010.
[83] A. S. Melim Miguel, T. Souza, E. V. da Costa Figueiredo, B. W. Paulo Lobo, G. Maria,
―Enzymes in Bakery: Current and Future Trends,‖ Food Industry, 2013.
[84] A. G. Cunha, A. Gandini, ―Turning polysaccharides into hydrophobic materials: a critic
al review. Part 2. Hemicelluloses, chitin/chitosan, starch, pectin and alginates,‖ Cellulose, vo
l. 17, no. 6, pp. 1045–1065, 2010.
257
[85] M. J. E. . van der Maarel, B. van der Veen, J. C. . Uitdehaag, H. Leemhuis, L. Dijkhuiz
en, ―Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family,‖ Jou
rnal of Biotechnology, vol. 94, no. 2, pp. 137–155, 2002.
[86] R. A. Talja, M. Peura, R. Serimaa, K. Jouppila, ―Effect of Amylose Content on Physica
l and Mechanical Properties of Potato-Starch-Based Edible Films,‖ Biomacromolecules, vol.
9, no. 2, pp. 658–663, 2008.
[87 ca 85] M. J. E. . van der Maarel, B. van der Veen, J. C. . Uitdehaag, H. Leemhuis, L. Dij
khuizen, ―Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family,
‖ Journal of Biotechnology, vol. 94, no. 2, pp. 137–155, 2002.
[88] W. Douglas Crabb, C. Mitchinson, ―Enzymes involved in the processing of starch to su
gars,‖ Trends in Biotechnology, vol. 15, no. 9, pp. 349–352, 1997.
[89] S. Kumar, T. Satyanarayana, ―Purification and Kinetics of a Raw Starch-Hydrolyzing,
Thermostable, and Neutral Glucoamylase of the Thermophilic Mold Thermomucor indicae-s
eudaticae,‖ Biotechnology Progress, vol. 19, no. 3, pp. 936–944, 2003.
[90] P. M. de Souza, P. de Oliveira e Magalhães, Brazilian Journal of Microbiology 41: 850-
861, 2010
[91] Iurciuc Camelia Elena (Tincu)http://www.infoapollonia.ro/sanatate/substantele-
nutraceutice-si-alimentele-functionale-o-noua-abordare-in-preventia-bolilor-cronice/
[92] H. K. Bieselskl, Nutraceuticals: the link between nutrition and medicine. 2nd Edition.
New York: Marcel Deckker. Chapter 3 Nutraceuticals in health and disease prevention: p. 1-
26, 2001
[93] M. A. Augustin, Y. Hemar, ―Nano- and micro-structured assemblies for encapsulation o
f food ingredients,‖ Chem. Soc. Rev., vol. 38, no. 4, pp. 902–912, 2009.
[94] C. J. Henry, ―Functional foods,‖ European Journal of Clinical Nutrition, vol. 64, no. 7,
pp. 657–659, 2010.
[95] F. Yangilar, ―The Application of Dietary Fibre in Food Industry: Structural Features, Ef
fects on Health and Definition, Obtaining and Analysis of Dietary Fibre: A Review‖, J Food
Nutr,. Vol. 1, No. 3, 13-23, 2013.
258
[96] M. De Vresee, J. Schrezenmeier, ―Probiotics, prebiotics, and synbiotics‖, Adv Biochem
Eng Biotechnol. ; 111:1-66, 2008
[97] R. H. Liu, „Health benefits of fruit and vegetables are from additive and synergistic
combinations of phytochemicals‖, Am. J. Clin. Nutr., 5184-5208, 2003.
[98] M. Abeywardena, R. J. Head, ―Longchain n−3 polyunsaturated fatty acids and blood ve
ssel function,‖ Cardiovascular Research, vol. 52, no. 3, pp. 361–371, 2001.
[99] RJ FitzGerald, BA Murray, DJ Walsh, „Hypotensive peptides from milk proteins‖, J
Nutr, vol. 134, no. 4,pp. 980-988, 2004.
[100] N. I. Krinsky, E. J. Johnson, ―Carotenoid actions and their relation to health and diseas
e,‖ Molecular Aspects of Medicine, vol. 26, no. 6, pp. 459–516, 2005.
[101] L.C. Tapsell , I. Hemphill, L. Cobiac, C.S. Patch, D.R. Sullivan,M. Fenech,
S.Roodenrys ,J.B. Keogh, P.M. Clifton, P.G. Williams ,V.A. Fazio, K.E. Inge, „Health
benefits of herbs and spices: the past, the present, the future‖, Med J Aust., 185, pp. 4-24,
2006
[102] C. J. Henry, ―Functional foods,‖ European Journal of Clinical Nutrition, vol. 64, no. 7,
pp. 657–659, 2010.
[103] D. J. McClements, E. A. Decker, J. Weiss, ―Emulsion-Based Delivery Systems for Lip
ophilic Bioactive Components,‖ Journal of Food Science, vol. 72, no. 8, pp. R109–R124, 20
07.
[104] D. B. Genovese, J. E. Lozano, M. A. Rao, ―The Rheology of Colloidal and Noncolloid
al Food Dispersions,‖ Journal of Food Science, vol. 72, no. 2, pp. R11–R20, 2007.
[105] DJ McClements. Food Emulsions: Principles, Practice, and Techniques. (2nd ed ed.).
Boca Raton: CRC Press 2005.
[106] D. J. McClements, E. A. Decker, Y. Park, J. Weiss, ―Designing Food Structure to Con
trol Stability, Digestion, Release and Absorption of Lipophilic Food Components,‖ Food Bi
ophysics, vol. 3, no. 2, pp. 219–228, 2008.
[107] E. Acosta, ―Testing the effectiveness of nutrient delivery systems,‖ Delivery and Cont
rolled Release of Bioactives in Foods and Nutraceuticals, pp. 53–106, 2008.
259
[108] R. M. Faulks, S. Southon, ―Assessing the bioavailability of nutraceuticals,‖ Delivery a
nd Controlled Release of Bioactives in Foods and Nutraceuticals, pp. 3–25, 2008.
[109] D. J. McClements, Y. Li, ―Review of in vitro digestion models for rapid screening of e
mulsion-based systems,‖ Food & Function, vol. 1, no. 1, pp. 32-59, 2010.
[110] C. Chung, L. Sanguansri, M. A. Augustin, ―In vitro lipolysis of fish oil microcapsules
containing protein and resistant starch,‖ Food Chemistry, vol. 124, no. 4, pp. 1480–1489, 20
11.
[111] C. J. Barrow, C. Nolan, B. J. Holub, ―Bioequivalence of encapsulated and microencap
sulated fish-oil supplementation,‖ Journal of Functional Foods, vol. 1, no. 1, pp. 38–43, 200
9.
[112] E. Choe, D. B. Min, ―Chemistry of Deep-Fat Frying Oils,‖ Journal of Food Science, v
ol. 72, no. 5, pp. R77–R86, 2007.
[113 ca 111] C. J. Barrow, C. Nolan, B. J. Holub, ―Bioequivalence of encapsulated and
microencapsulated fish-oil supplementation,‖ Journal of Functional Foods, vol. 1, no. 1, pp.
38–43, 2009.
[114] R. J. Elias, S. S. Kellerby, E. A. Decker, ―Antioxidant Activity of Proteins and Peptide
s,‖ Critical Reviews in Food Science and Nutrition, vol. 48, no. 5, pp. 430–441, 2008.
[115] E. Choe, D. B. Min, ―Mechanisms of Antioxidants in the Oxidation of Foods,‖
Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, vol. 8, no. 4, pp. 345–358, 2009.
[116] W.H. Telfer, D. Kennedy, Biologia organismelor, Editura Ştiinţifică şi Enciclopedică,
Bucureşti, pp 32-55, 1986
[117] Aggarwal B.B., Kumar A., Bharti A.C. Anticancer Res. 2003, 23, 363–398.
[118] R. Wilken, M. S. Veena, M. B. Wang, E. S. Srivatsan, ―Curcumin: A review of anti-ca
ncer properties and therapeutic activity in head and neck squamous cell carcinoma,‖ Mol Ca
ncer, vol. 10, no. 1, p. 12, 2011.
[119] Grykiewicz G., Silfirski P. Acta Biochim. Pol. 2012, 59, 201–212.
[120] T. Esatbeyoglu, P. Huebbe, I. M. A. Ernst, D. Chin, A. E. Wagner, G. Rimbach, ―Curc
umin-From Molecule to Biological Function,‖ Angewandte Chemie International Edition, v
ol. 51, no. 22, pp. 5308–5332, 2012.
260
[121] S. C. Gupta, S. Prasad, J. H. Kim, S. Patchva, L. J. Webb, I. K. Priyadarsini, B. B. Ag
garwal, ―Multitargeting by curcumin as revealed by molecular interaction studies,‖ Natural
Product Reports, vol. 28, no. 12, pp. 1937-1955, 2011.
[122] K. Indira Priyadarsini, ―Chemical and Structural Features Influencing the Biological A
ctivity of Curcumin,‖ Current Pharmaceutical Design, vol. 19, no. 11, pp. 2093–2100, 2013.
[123] Vogel, H.A.; Pelletier. J. Pharma 1815, 2, 50.
[124]S. Singh, B. B. Aggarwal, ―Activation of Transcription Factor NF- B Is Suppressed by
Curcumin (Diferuloylmethane),‖ Journal of Biological Chemistry, vol. 270, no. 42, pp. 2499
5–25000, 1995.
[125] P. S. Ramanjaneyulu, Y. S. Sayi, V. A. Raman, K. L. Ramakumar, ―Spectrophotometr
ic determination of boron in nuclear grade uranium compounds with curcumin and studies o
n effect of HNO3,‖ Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, vol. 274, no. 1, pp. 1
09–114, 2007.
[126] V. P. Paulucci, R. O. Couto, C. C. C. Teixeira, L. A. P. Freitas, ―Optimization of the e
xtraction of curcumin from Curcuma longa rhizomes,‖ Revista Brasileira de Farmacognosia,
vol. 23, no. 1, pp. 94–100, 2013.
[127] Lee, K.J.; Yang, H.J.; Jeong, S.W.; Ma, J.Y. Korean J. Pharmacogn. 2012, 43, 250–
256.
[128] K.-J. Lee, J.-Y. Ma, Y.-S. Kim, D.-S. Kim, Y. Jin, ―High Purity Extraction and Simult
aneous High-performance Liquid Chromatography Analysis of Curcuminoids in Turmeric,‖
Journal of Applied Biological Chemistry, vol. 55, no. 1, pp. 61–65, 2012.
[129] M. Li, M. O. Ngadi, Y. Ma, ―Optimisation of pulsed ultrasonic and microwave-assiste
d extraction for curcuminoids by response surface methodology and kinetic study,‖ Food Ch
emistry, vol. 165, pp. 29–34, 2014.
[130] K. Patel, G. Krishna, E. Sokoloski, Y. Ito, ―Preparative separation of curcuminoids fro
m crude curcumin and turmeric powder by ph-zone-refining countercurrent chromatography
,‖ Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, vol. 23, no. 14, pp. 2209–221
8, 2000.
261
[131] Y.-J. Kim, H. J. Lee, Y. Shin, ―Optimization and Validation of High-Performance Liq
uid Chromatography Method for Individual Curcuminoids in Turmeric by Heat-Refluxed Ex
traction,‖ Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 61, no. 46, pp. 10911–10918, 20
13.
[132] M. Takenaka, T. Ohkubo, H. Okadome, I. Sotome, T. Itoh, S. Isobe, ―Effective Extrac
tion of Curcuminoids by Grinding Turmeric (Curcuma longa) with Medium-chain Triacylgl
ycerols,‖ Food Science and Technology Research, vol. 19, no. 4, pp. 655–659, 2013.
[133] W. Baumann, S. V. Rodrigues, L. M. Viana, ―Pigments and their solubility in and extr
actability by supercritical CO2 - I: the case of curcumin,‖ Brazilian Journal of Chemical Eng
ineering, vol. 17, no. 3, pp. 323–328, 2000.
[134] A. L. Chassagnez-Méndez, N. C. F. Corrêa, L. F. França, N. T. Machado, M. E. Araúj
o, ―A mass transfer model applied to the supercritical extraction with CO2 of curcumins fro
m turmeric rhizomes (Curcuma longa L),‖ Brazilian Journal of Chemical Engineering, vol. 1
7, no. 3, pp. 315–322, 2000.
[135] N. Kurmudle, L. D. Kagliwal, S. B. Bankar, R. S. Singhal, ―Enzyme-assisted extractio
n for enhanced yields of turmeric oleoresin and its constituents,‖ Food Bioscience, vol. 3, pp
. 36–41, 2013.
[136] M. Paramasivam, R. Poi, H. Banerjee, A. Bandyopadhyay, ―High-performance thin la
yer chromatographic method for quantitative determination of curcuminoids in Curcuma lon
ga germplasm,‖ Food Chemistry, vol. 113, no. 2, pp. 640–644, 2009.
[137] I. Ali, A. Haque, K. Saleem, ―Separation and identification of curcuminoids in turmeri
c powder by HPLC using phenyl column,‖ Analytical Methods, vol. 6, no. 8, pp. 2526-2536,
2014.
[138] Lee, K.J.; Kim, Y.S.; Jung, P.M.; Ma, J.Y. Asian J. Chem. 2013, 25, 6306–6310.
[139] Lee, K.J.; Kim, Y.S.; Ma, J.Y. Asian J. Chem. 2013, 25, 909–912.
[140]V. Lampe, J. Milobedzka, ―Studien über Curcumin,‖ Ber. Dtsch. Chem. Ges., vol. 46,
no. 2, pp. 2235–2240, 1913.
262
[141] K. V. D. Babu, K. N. Rajasekharan, ―SIMPLIFIED CONDITION FOR SYNTHESIS
OF CURCUMIN I AND OTHER CURCUMINOIDS,‖ Organic Preparations and Procedure
s International, vol. 26, no. 6, pp. 674–677, 1994.
[142] S. Venkateswarlu, M. S. Ramachandra, G. V. Subbaraju, ―Synthesis and biological ev
aluation of polyhydroxycurcuminoids,‖ Bioorganic & Medicinal Chemistry, vol. 13, no. 23,
pp. 6374–6380, 2005.
[143] Venkata Rao, E.; Sudheer, P. Indian J. Pharm. Sci. 2011, 73, 262–270.
[144] K. Priyadarsini, ―The Chemistry of Curcumin: From Extraction to Therapeutic Agent,
‖ Molecules, vol. 19, no. 12, pp. 20091–20112, 2014.
[145] Priyadarsini, K.I.. J. Photochem. Photobiol. C 2009, 10, 81–96
[146] K. I. Priyadarsini, ―Free Radical Reactions of Curcumin in Membrane Models,‖ Free
Radical Biology and Medicine, vol. 23, no. 6, pp. 838–843, 1997.
[147] K. I. Priyadarsini, D. K. Maity, G. H. Naik, M. S. Kumar, M. K. Unnikrishnan, J. G. S
atav, H. Mohan, ―Role of phenolic O-H and methylene hydrogen on the free radical reaction
s and antioxidant activity of curcumin,‖ Free Radical Biology and Medicine, vol. 35, no. 5, p
p. 475–484, 2003.
[148] B. Mishra, K. Indira Priyadarsini, M. K. Bhide, R. M. Kadam, H. Mohan, ―Reactions
of Superoxide Radicals with Curcumin: Probable Mechanisms by Optical Spectroscopy and
EPR,‖ Free Radical Research, vol. 38, no. 4, pp. 355–362, 2004.
[149] S. V. Jovanovic, C. W. Boone, S. Steenken, M. Trinoga, R. B. Kaskey, ―How Curcum
in Works Preferentially with Water Soluble Antioxidants,‖ Journal of the American Chemic
al Society, vol. 123, no. 13, pp. 3064–3068, 2001.
[150] Y.-M. Sun, H.-Y. Zhang, D.-Z. Chen, C.-B. Liu, ―Theoretical Elucidation on the Antio
xidant Mechanism of Curcumin: A DFT Study,‖ Organic Letters, vol. 4, no. 17, pp. 2909–29
11, 2002.
[151] J. E. Kim, A. R. Kim, H. Y. Chung, S. Y. Han, B. S. Kim, J. S. Choi, ―In vitro peroxy
nitrite scavenging activity of diarylheptanoids fromCurcuma longa,‖ Phytotherapy Research,
vol. 17, no. 5, pp. 481–484, 2003.
[152] Iwunze, M.O.; McEwan, D. Cell. Mol. Biol. 2004, 50, 749–752.
263
[153] M. Borsari, E. Ferrari, R. Grandi, M. Saladini, ―Curcuminoids as potential new iron-ch
elating agents: spectroscopic, polarographic and potentiometric study on their Fe(III) comple
xing ability,‖ Inorganica Chimica Acta, vol. 328, no. 1, pp. 61–68, 2002.
[154] Kim, J.E.; Kim, A.R.; Chung, H.Y.; Han, S.Y.; Kim, B.S.; Choi, J.S.. Cell. Mol. Biol.
2004, 50, 749–752.
[155] L. Shen, H.-F. Ji, ―The pharmacology of curcumin: is it the degradation products?,‖ Tr
ends in Molecular Medicine, vol. 18, no. 3, pp. 138–144, 2012.
[156] L. C. Price, R. W. Buescher, ―Kinetics of Alkaline Degradation of the Food Pigments
Curcumin and Curcuminoids,‖ Journal of Food Science, vol. 62, no. 2, pp. 267–269, 1997.
[157] Y.-J. Wang, M.-H. Pan, A.-L. Cheng, L.-I. Lin, Y.-S. Ho, C.-Y. Hsieh, J.-K. Lin, ―Sta
bility of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products,‖ Jour
nal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol. 15, no. 12, pp. 1867–1876, 1997.
[158] M. V. Cañamares, J. V. Garcia-Ramos, S. Sanchez-Cortes, ―Degradation of Curcumin
Dye in Aqueous Solution and on Ag Nanoparticles Studied by Ultraviolet–Visible Absorptio
n and Surface-Enhanced Raman Spectroscopy,‖ Appl Spectrosc, vol. 60, no. 12, pp. 1386–1
391, 2006.
[159] A. Khurana, C.-T. Ho, ―High Performance Liquid Chromatographic Analysis of Curcu
minoids and Their Photo-oxidative Decomposition Compounds in Curcuma Longa L,‖ Journ
al of Liquid Chromatography, vol. 11, no. 11, pp. 2295–2304, 1988.
[160] H. H. Tønnesen, H. de Vries, J. Karlsen, G. B. Van Henegouwen, ―Studies on Curcum
in and Curcuminoids IX: Investigation of the Photobiological Activity of Curcumin Using B
acterial Indicator Systems,‖ Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 76, no. 5, pp. 371–373,
1987.
[161] U. Singh, S. Verma, H. N. Ghosh, M. C. Rath, K. I. Priyadarsini, A. Sharma, K. K. Pu
shpa, S. K. Sarkar, T. Mukherjee, ―Photo-degradation of curcumin in the presence of TiO2 n
anoparticles: Fundamentals and application,‖ Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, v
ol. 318, no. 1–2, pp. 106–111, 2010.
264
[162] S. Awasthi, U. Pandya, S. S. Singhal, J. T. Lin, V. Thiviyanathan, W. E. Seifert, Y. C.
Awasthi, G. A. S. Ansari, ―Curcumin–glutathione interactions and the role of human glutathi
one S-transferase P1-1,‖ Chemico-Biological Interactions, vol. 128, no. 1, pp. 19–38, 2000.
[163] M. L. P. S. van Iersel, J.-P. H. T. M. Ploemen, I. Struik, C. van Amersfoort, A. E. Key
zer, J. G. Schefferlie, P. J. van Bladeren, ―Inhibition of glutathione S-transferase activity in h
uman melanoma cells by α,β-unsaturated carbonyl derivatives. Effects of acrolein, cinnamal
dehyde, citral, crotonaldehyde, curcumin, ethacrynic acid, and trans-2-hexenal,‖ Chemico-B
iological Interactions, vol. 102, no. 2, pp. 117–132, 1996.
[164] Fang, J.; Jun, L.; Holmegren, A.. J. Biol. Chem. 2005, 280, 25284–25290
[165] Y. Jung, W. Xu, H. Kim, N. Ha, L. Neckers, ―Curcumin-induced degradation of ErbB
2: A role for the E3 ubiquitin ligase CHIP and the Michael reaction acceptor activity of curc
umin,‖ Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research, vol. 1773, no. 3, p
p. 383–390, 2007.
[166] W. Li, W. Wu, F. Yu, H. Huang, X. Liang, J. Ye, ―Catalytic asymmetric Michael addit
ion with curcumin derivative,‖ Organic & Biomolecular Chemistry, vol. 9, no. 7, p. 2505-25
11, 2011.
[167] S. Dutta, S. Padhye, K. I. Priyadarsini, C. Newton, ―Antioxidant and antiproliferative
activity of curcumin semicarbazone,‖ Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 15, n
o. 11, pp. 2738–2744, 2005.
[168] D. Simoni, M. Rizzi, R. Rondanin, R. Baruchello, P. Marchetti, F. P. Invidiata, M. Lab
bozzetta, P. Poma, V. Carina, M. Notarbartolo, A. Alaimo, N. D‘Alessandro, ―Antitumor eff
ects of curcumin and structurally β-diketone modified analogs on multidrug resistant cancer
cells,‖ Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 18, no. 2, pp. 845–849, 2008.
[169] Khalil, M.I.; Al-Zahem, A.M.; Al-Qunaibit, M.H.. Bioinorg. Chem. Appl. 2013,
doi:10.1155/2013/982423.
[170] M. H. M. Leung, T. Harada, T. W. Kee, ―Delivery of Curcumin and Medicinal Effects
of the Copper(II)-Curcumin Complexes,‖ Current Pharmaceutical Design, vol. 19, no. 11, pp
. 2070–2083, 2013.
[171] O. Vajragupta, P. Boonchoong, H. Watanabe, Y. Wongkrajang, N. Kammasud, ―Man
ganese complexes of curcumin and its derivatives: evaluation for the radical scavenging abil
265
ity and neuroprotective activity,‖ Free Radical Biology and Medicine, vol. 35, no. 12, pp. 16
32–1644, 2003.
[172] O. Vajragupta, P. Boonchoong, L. J. Berliner, ―Manganese Complexes of Curcumin A
nalogues: Evaluation of Hydroxyl Radical Scavenging Ability, Superoxide Dismutase Activi
ty and Stability towards Hydrolysis,‖ Free Radical Research, vol. 38, no. 3, pp. 303–314, 20
04.
[173] A. Barik, B. Mishra, L. Shen, H. Mohan, R. M. Kadam, S. Dutta, H.-Y. Zhang, K. I. P
riyadarsini, ―Evaluation of a new copper(II)–curcumin complex as superoxide dismutase mi
mic and its free radical reactions,‖ Free Radical Biology and Medicine, vol. 39, no. 6, pp. 81
1–822, 2005.
[174] A. Barik, B. Mishra, A. Kunwar, R. M. Kadam, L. Shen, S. Dutta, S. Padhye, A. K. Sa
tpati, H.-Y. Zhang, K. Indira Priyadarsini, ―Comparative study of copper(II)–curcumin com
plexes as superoxide dismutase mimics and free radical scavengers,‖ European Journal of M
edicinal Chemistry, vol. 42, no. 4, pp. 431–439, 2007.
[175] A. Kunwar, H. Narang, K. I. Priyadarsini, M. Krishna, R. Pandey, K. B. Sainis, ―Dela
yed activation of PKCδ and NFκB and higher radioprotection in splenic lymphocytes by cop
per (II)–Curcumin (1:1) complex as compared to curcumin,‖ Journal of Cellular Biochemistr
y, vol. 102, no. 5, pp. 1214–1224, 2007.
[176] P. R. KOIRAM, V. P. VEERAPUR, A. KUNWAR, B. MISHRA, A. BARIK, I. K. PR
IYADARSINI, U. K. MAZHUVANCHERRY, ―Effect of Curcumin and Curcumin Copper
Complex (1:1) on Radiation-induced Changes of Anti-oxidant Enzymes Levels in the Livers
of Swiss Albino Mice,‖ Journal of Radiation Research, vol. 48, no. 3, pp. 241–245, 2007.
[177] Baum, L.; Ng, A.. J. Alzheimer‘s Dis. 2004, 6, 367–377.
[178] T. Jiang, X.-L. Zhi, Y.-H. Zhang, L.-F. Pan, P. Zhou, ―Inhibitory effect of curcumin o
n the Al(III)-induced Aβ42 aggregation and neurotoxicity in vitro,‖ Biochimica et Biophysic
a Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease, vol. 1822, no. 8, pp. 1207–1215, 2012.
[179] T. Jiang, L. Wang, S. Zhang, P.-C. Sun, C.-F. Ding, Y.-Q. Chu, P. Zhou, ―Interaction
of curcumin with Al(III) and its complex structures based on experiments and theoretical cal
culations,‖ Journal of Molecular Structure, vol. 1004, no. 1–3, pp. 163–173, 2011.
266
[180] M. Gianluca, F. Erika, L. Gigliola, A. Valentina, F. Francesca, M. Claudio, P. Frances
ca, S. Monica, M. Ledi, ―The role of coordination chemistry in the development of innovativ
e gallium-based bioceramics: the case of curcumin,‖ Journal of Materials Chemistry, vol. 21
, no. 13, pp. 5027-5037, 2011.
[181] D. Pucci, T. Bellini, A. Crispini, I. D‘Agnano, P. F. Liguori, P. Garcia-Orduña, S. Piril
lo, A. Valentini, G. Zanchetta, ―DNA binding and cytotoxicity of fluorescent curcumin-base
d Zn(ii) complexes,‖ MedChemComm, vol. 3, no. 4, pp. 462-468, 2012.
[182] X. Mei, D. Xu, S. Xu, Y. Zheng, S. Xu, ―Gastroprotective and antidepressant effects o
f a new zinc(II)–curcumin complex in rodent models of gastric ulcer and depression induced
by stresses,‖ Pharmacology Biochemistry and Behavior, vol. 99, no. 1, pp. 66–74, 2011.
[183] K. K. Sharma, S. Chandra, D. K. Basu, ―Synthesis and antiarthritic study of a new oral
ly active diferuloyl methane (curcumin) gold complex,‖ Inorganica Chimica Acta, vol. 135,
no. 1, pp. 47–48, 1987.
[184] K. H. Thompson, K. Böhmerle, E. Polishchuk, C. Martins, P. Toleikis, J. Tse, V. Yuen
, J. H. McNeill, C. Orvig, ―Complementary inhibition of synoviocyte, smooth muscle cell or
mouse lymphoma cell proliferation by a vanadyl curcumin complex compared to curcumin a
lone,‖ Journal of Inorganic Biochemistry, vol. 98, no. 12, pp. 2063–2070, 2004.
[185] J. Rennolds, S. Malireddy, F. Hassan, S. Tridandapani, N. Parinandi, P. N. Boyaka, E.
Cormet-Boyaka, ―Curcumin regulates airway epithelial cell cytokine responses to the polluta
nt cadmium,‖ Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 417, no. 1, pp.
256–261, 2012.
[186] H. Oguzturk, O. Ciftci, M. Aydin, N. Timurkaan, A. Beytur, F. Yilmaz, ―Ameliorative
effects of curcumin against acute cadmium toxicity on male reproductive system in rats,‖ An
drologia, vol. 44, no. 4, pp. 243–249, 2012.
[187] R. Agarwal, S. K. Goel, J. R. Behari, ―Detoxification and antioxidant effects of curcu
min in rats experimentally exposed to mercury,‖ Journal of Applied Toxicology, pp. 457–46
8, 2010.
[188] S. Daniel, J. L. Limson, A. Dairam, G. M. Watkins, S. Daya, ―Through metal binding,
curcumin protects against lead- and cadmium-induced lipid peroxidation in rat brain homoge
267
nates and against lead-induced tissue damage in rat brain,‖ Journal of Inorganic Biochemistr
y, vol. 98, no. 2, pp. 266–275, 2004.
[189] V. Eybl, D. Kotyzová, L. Lešetický, M. Bludovská, J. Koutenský, ―The influence of c
urcumin and manganese complex of curcumin on cadmium-induced oxidative damage and tr
ace elements status in tissues of mice,‖ Journal of Applied Toxicology, vol. 26, no. 3, pp. 20
7–212, 2006.
[190] I. Ali, K. Saleem, D. Wesselinova, A. Haque, ―Synthesis, DNA binding, hemolytic, an
d anti-cancer assays of curcumin I-based ligands and their ruthenium(III) complexes,‖ Medi
cinal Chemistry Research, vol. 22, no. 3, pp. 1386–1398, 2012.
[191] A. Valentini, F. Conforti, A. Crispini, A. De Martino, R. Condello, C. Stellitano, G. R
otilio, M. Ghedini, G. Federici, S. Bernardini, D. Pucci, ―Synthesis, Oxidant Properties, and
Antitumoral Effects of a Heteroleptic Palladium(II) Complex of Curcumin on Human Prosta
te Cancer Cells,‖ Journal of Medicinal Chemistry, vol. 52, no. 2, pp. 484–491, 2009.
[192] John, V.D.; Kuttan, G.; Krishnankutty, K.. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2002, 21, 219–
224.
[193] Huang, Q.-M.; Wang, S.; Pan, W.; Deng, P.-X.; Zhou, H.; Pan, Z.-Q.. Chem. J. Chin.
Univ.-Chin. 2012, 33, 732–737.
[194] A. Hussain, K. Somyajit, B. Banik, S. Banerjee, G. Nagaraju, A. R. Chakravarty, ― En
hancing the photocytotoxic potential of curcumin on terpyridyl lanthanide( iii ) complex for
mation ,‖ Dalton Trans., vol. 42, no. 1, pp. 182–195, 2013.
[195] A. Kunwar, A. Barik, R. Pandey, K. I. Priyadarsini, ―Transport of liposomal and albu
min loaded curcumin to living cells: An absorption and fluorescence spectroscopic study,‖ B
iochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1760, no. 10, pp. 1513–1520, 2
006.
[196]L. Li, F. S. Braiteh, R. Kurzrock, ―Liposome-encapsulated curcumin,‖ Cancer, vol. 104
, no. 6, pp. 1322–1331, 2005.
[197] S. Prasad, A. K. Tyagi, B. B. Aggarwal, ―Recent Developments in Delivery, Bioavaila
bility, Absorption and Metabolism of Curcumin: the Golden Pigment from Golden Spice,‖ C
ancer Research and Treatment, vol. 46, no. 1, pp. 2–18, 2014.
268
[198] B. Wahlström, G. Blennow, ―A Study on the Fate of Curcumin in the Rat,‖ Acta Phar
macologica et Toxicologica, vol. 43, no. 2, pp. 86–92, 2009.
[199] G. Shoba, D. Joy, T. Joseph, M. Majeed, R. Rajendran, P. Srinivas, ―Influence of Pipe
rine on the Pharmacokinetics of Curcumin in Animals and Human Volunteers,‖ Planta Medi
ca, vol. 64, no. 04, pp. 353–356, 1998.
[200] Chang MT, Tsai TR, Lee CY, Wei YS, Chen YJ, Chen CR, et al.. J Agric Food Chem.
2013;61:9666-71
[201] Cheng AL, Hsu CH, Lin JK, Hsu MM, Ho YF, Shen TS, et al. Anticancer Res.
2001;21:2895-900.
[202] R. A. Sharma, S.L. Euden Platton, D.N. Cooke, A. Shafayat, H.R. Hewitt, ―Phase I Cli
nical Trial of Oral Curcumin: Biomarkers of Systemic Activity and Compliance,‖ Clinical C
ancer Research, vol. 10, no. 20, pp. 6847–6854, 2004.
[203]K.-Y. Yang, L.-C. Lin, T.-Y. Tseng, S.-C. Wang, T.-H. Tsai, ―Oral bioavailability of c
urcumin in rat and the herbal analysis from Curcuma longa by LC–MS/MS,‖ Journal of Chr
omatography B, vol. 853, no. 1–2, pp. 183–189, 2007.
[204] J. Sun, C. Bi, H. M. Chan, S. Sun, Q. Zhang, Y. Zheng, ―Curcumin-loaded solid lipid
nanoparticles have prolonged in vitro antitumour activity, cellular uptake and improved in vi
vo bioavailability,‖ Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, vol. 111, pp. 367–375, 2013.
[205] V. G. Kadajji, G. V. Betageri, ―Water Soluble Polymers for Pharmaceutical Applicatio
ns,‖ Polymers, vol. 3, no. 4, pp. 1972–2009, 2011.
[206] F.-L. Mi, Y.-M. Lin, Y.-B. Wu, S.-S. Shyu, Y.-H. Tsai, ―Chitin/PLGA blend microsph
eres as a biodegradable drug-delivery system: phase-separation, degradation and release beh
avior,‖ Biomaterials, vol. 23, no. 15, pp. 3257–3267, 2002.
[207] N. K. Sahu, P. S. Gils, D. Ray, P. K. Sahoo,Advances in Polymer Science and Techno
logy: An International Journal, 3, 22 (2013)
[208] Y. Zhang, C.-C. Chu, ―In vitro Release Behavior of Insulin from Biodegradable Hybri
d Hydrogel Networks of Polysaccharide and Synthetic Biodegradable Polyester,‖ Journal of
Biomaterials Applications, vol. 16, no. 4, pp. 305–325, 2002.
269
[209] G. A. Abraham, A. Gallardo, J. San Román, A. Fernández-Mayoralas, M. Zurita, J. Va
quero, ―Polymeric matrices based on graft copolymers of PCL onto acrylic backbones for rel
easing antitumoral drugs,‖ Journal of Biomedical Materials Research Part A, vol. 64A, no. 4
, pp. 638–647, 2003.
[210] J. Liu, Y. Xiao, C. Allen, ―Polymer–drug compatibility: A guide to the development o
f delivery systems for the anticancer agent, ellipticine,‖ Journal of Pharmaceutical Sciences,
vol. 93, no. 1, pp. 132–143, 2004.
[211] B. ‐H. Chen, D. J. Lee, ―Slow Release of Drug through Deformed Coating Film: Effec
ts of Morphology and Drug Diffusivity in the Coating Film,‖ Journal of Pharmaceutical Scie
nces, vol. 90, no. 10, pp. 1478–1496, 2001.
[212] Å. Tunón, J. Gråsjö, G. Alderborn, ―Effect of intragranular porosity on compression b
ehaviour of and drug release from reservoir pellets,‖ European Journal of Pharmaceutical Sc
iences, vol. 19, no. 5, pp. 333–344, 2003.
[213] I. Vroman, L. Tighzert, ―Biodegradable Polymers,‖ Materials, vol. 2, no. 2, pp. 307–3
44, 2009.
[214] Morris C (editor) (1992), Academic Press Dictionary of Science and Technology, San
Diego, Academic, 1742
[215] E. C. Y. Li-Chan, The University of British Columbia, Canada, Properties of proteins
in food systems: an introduction, in Proteins in food processing, R. Y. Yada, ed, Published
by Woodhead Publishing Limited Abington Hall, Abington Cambridge CB1 6AH England
www.woodhead-publishing.com (2004)
[216] J. Nehete, M. Narkhede, R. Bhambar, S. Gawali, ―Natural proteins: Sources, isolation,
characterization and applications,‖ Pharmacognosy Reviews, vol. 7, no. 14, pp. 107-116, 20
13.
[217] J. J. Coon, ―Collisions or Electrons? Protein Sequence Analysis in the 21st Century,‖
Anal. Chem., vol. 81, no. 9, pp. 3208–3215, 2009.
[218]S. Y. Cho, C. Rhee, L. Wiss, ―Mechanical properties and water vapor permeability of e
dible films made from fractionated soy proteins with ultrafiltration,‖ LWT - Food Science a
nd Technology, vol. 37, no. 8, pp. 833–839, 2004.
270
[219] M. Subirade, I. Kelly, J. Guéguen, M. Pézolet, ―Molecular basis of film formation fro
m a soybean protein: comparison between the conformation of glycinin in aqueous solution
and in films,‖ International Journal of Biological Macromolecules, vol. 23, no. 4, pp. 241–2
49, 1998.
[220] J. M. S. Renkema, T. van Vliet, ―Heat-Induced Gel Formation by Soy Proteins at Neut
ral pH,‖ Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 50, no. 6, pp. 1569–1573, 2002.
[221] Haard NF, Chism GW. Characteristics of edible plant tissue. In: Fennema O, editor. F
ood Chemistry.New York, NY: Marcel Dekker; 1996. p. 1067
[222] Kinsella JE. Relationships between structure and functional properties of food proteins
. In: Fon, Codon, editors. Food Proteins. New York: Springer Publishing; 1982. pp. 51–104
[223] K. Dangaran, P. M. Tomasula, P. Qi, ―Structure and Function of Protein-Based Edible
Films and Coatings,‖ Edible Films and Coatings for Food Applications, pp. 25–56, 2009.
[224] R. Shukla, M. Cheryan, ―Zein: the industrial protein from corn,‖ Industrial Crops and
Products, vol. 13, no. 3, pp. 171–192, 2001.
[225] Koyoro H, Powers JR. Functional properties of pea globulin fractions. Cereal Chem. 1
987;64:97–101
[226] A. Nesterenko, I. Alric, F. Silvestre, V. Durrieu, ―Vegetable proteins in microencapsul
ation: A review of recent interventions and their effectiveness,‖ Industrial Crops and Product
s, vol. 42, pp. 469–479, 2013.
[227] J. S. Hamada, ―Characterization and Functional Properties of Rice Bran Proteins Modi
fied by Commercial Exoproteases and Endoproteases,‖ Journal of Food Science, vol. 65, no.
2, pp. 305–310, 2000.
[228] Bienvenido OJ. Rice in human nutrition organization united nations ETL, Agriculture
power, Rome. 1994
[229] K. Kaewka, C. Therakulkait, K. R. Cadwallader, ―Effect of preparation conditions on
composition and sensory aroma characteristics of acid hydrolyzed rice bran protein concentr
ate,‖ Journal of Cereal Science, vol. 50, no. 1, pp. 56–60, 2009.
271
[230] M. Pinciroli, A. A. Vidal, M. C. Añón, E. N. Martínez, ―Comparison between protein
functional properties of two rice cultivars,‖ LWT - Food Science and Technology, vol. 42, n
o. 10, pp. 1605–1610, 2009.
[231] S. Hata, J. Wiboonsirikul, A. Maeda, Y. Kimura, S. Adachi, ―Extraction of defatted ric
e bran by subcritical water treatment,‖ Biochemical Engineering Journal, vol. 40, no. 1, pp.
44–53, 2008.
[232] I. Sereewatthanawut, S. Prapintip, K. Watchiraruji, M. Goto, M. Sasaki, A. Shotipruk,
―Extraction of protein and amino acids from deoiled rice bran by subcritical water hydrolysi
s,‖ Bioresource Technology, vol. 99, no. 3, pp. 555–561, 2008.
[233] S. Agboola, D. Ng, D. Mills, ―Characterisation and functional properties of Australian
rice protein isolates,‖ Journal of Cereal Science, vol. 41, no. 3, pp. 283–290, 2005.
[234] J. S. Hamada, ―Characterization and Functional Properties of Rice Bran Proteins Modi
fied by Commercial Exoproteases and Endoproteases,‖ Journal of Food Science, vol. 65, no.
2, pp. 305–310, 2000.
[235] C. Ordóñez, M. . Asenjo, C. Benitez, J. . González, ―Obtaining a protein concentrate fr
om integral defatted sunflower flour,‖ Bioresource Technology, vol. 78, no. 2, pp. 187–190,
2001.
[236] S. González-Pérez, J. M. Vereijken, ―Sunflower proteins: overview of their physicoch
emical, structural and functional properties,‖ Journal of the Science of Food and Agriculture,
vol. 87, no. 12, pp. 2173–2191, 2007.
[237] Linden GL. Masson, Paris: 1994. Biochimie agro-industrielle: Valorisation
alimentaire de la pro-duction agricole
[238] J.-L. Audic, B. Chaufer, G. Daufin, ―Non-food applications of milk components and d
airy co-products: A review,‖ Le Lait, vol. 83, no. 6, pp. 417–438, 2003.
[239] Swaisgood HE. Review and update of casein chemistry. J Dairy Sci. 1993;76:3054–61
. Swaisgood HE. Characteristics of milk. In: Fennema O, editor. Food chemistry. New York
: Marcel Dekker; 1996. p. 1067
272
[240] Y. D. Livney, ―Milk proteins as vehicles for bioactives,‖ Current Opinion in Colloid
& Interface Science, vol. 15, no. 1–2, pp. 73–83, 2010.
[241] Rosemberg M, Young SL. Whey proteins as microencapsulating agents. Microencaps
ulation of anhydrous milk fat structure evaluation. Food Struct. 1993;12:31–41
[242] J. E. Kinsella, C. V. Morr, ―Milk proteins: Physicochemical and functional properties,
‖ C R C Critical Reviews in Food Science and Nutrition, vol. 21, no. 3, pp. 197–262, 1984.
[243] L. Sawyer, G. Kontopidis, S.-Y. Wu, ―beta-Lactoglobulin - a three-dimensional perspe
ctive,‖ International Journal of Food Science and Technology, vol. 34, no. 5–6, pp. 409–418,
1999.
[244] I. J. Haug, K. I. Draget, O. Smidsrød, ―Physical and rheological properties of fish gelat
in compared to mammalian gelatin,‖ Food Hydrocolloids, vol. 18, no. 2, pp. 203–213, 2004.
[245] F. Badii, N. Howell, ―Fish gelatin: Structure, gelling properties and interaction with eg
g albumen proteins,‖ Food Hydrocolloids, vol. 20, no. 5, pp. 630–640, 2006.
[246] Y. Mine, ―Recent advances in the understanding of egg white protein functionality,‖ T
rends in Food Science & Technology, vol. 6, no. 7, pp. 225–232, 1995.
[247] K. Numata, D. L. Kaplan, ―Silk-based delivery systems of bioactive molecules,‖ Adva
nced Drug Delivery Reviews, vol. 62, no. 15, pp. 1497–1508, 2010.
[248] G. H. Altman, F. Diaz, C. Jakuba, T. Calabro, R. L. Horan, J. Chen, H. Lu, J. Richmon
d, D. L. Kaplan, ―Silk-based biomaterials,‖ Biomaterials, vol. 24, no. 3, pp. 401–416, 2003.
[249] A. O. Elzoghby, W. S. Abo El-Fotoh, N. A. Elgindy, ―Casein-based formulations as pr
omising controlled release drug delivery systems,‖ Journal of Controlled Release, vol. 153,
no. 3, pp. 206–216, 2011.
[250] A. O. Elzoghby, W. M. Samy, N. A. Elgindy, ―Albumin-based nanoparticles as potent
ial controlled release drug delivery systems,‖ Journal of Controlled Release, vol. 157, no. 2,
pp. 168–182, 2012.
273
[251] Y. Yamada, K. Nishizawa, M. Yokoo, H. Zhao, K. Onishi, M. Teraishi, S. Utsumi, M.
Ishimoto, M. Yoshikawa, ―Anti-hypertensive activity of genetically modified soybean seeds
accumulating novokinin,‖ Peptides, vol. 29, no. 3, pp. 331–337, 2008.
[252] M. Esmaili, S. M. Ghaffari, Z. Moosavi-Movahedi, M. S. Atri, A. Sharifizadeh, M. Fa
rhadi, R. Yousefi, J.-M. Chobert, T. Haertlé, A. A. Moosavi-Movahedi, ―Beta casein-micelle
as a nano vehicle for solubility enhancement of curcumin; food industry application,‖ LWT
- Food Science and Technology, vol. 44, no. 10, pp. 2166–2172, 2011.
[253] S. V. Silva, F. X. Malcata, ―Caseins as source of bioactive peptides,‖ International Dai
ry Journal, vol. 15, no. 1, pp. 1–15, 2005.
[254] Z. Persin, K. Stana-Kleinschek, T. J. Foster, J. E. G. van Dam, C. G. Boeriu, P. Navar
d, ―Challenges and opportunities in polysaccharides research and technology: The EPNOE v
iews for the next decade in the areas of materials, food and health care,‖ Carbohydrate Poly
mers, vol. 84, no. 1, pp. 22–32, 2011.
[255] T. Coviello, P. Matricardi, C. Marianecci, F. Alhaique, ―Polysaccharide hydrogels for
modified release formulations,‖ Journal of Controlled Release, vol. 119, no. 1, pp. 5–24, 200
7.
[256] B. Posocco, E. Dreussi, J. de Santa, G. Toffoli, M. Abrami, F. Musiani, M. Grassi, R.
Farra, F. Tonon, G. Grassi, B. Dapas, ―Polysaccharides for the Delivery of Antitumor Drugs,
‖ Materials, vol. 8, no. 5, pp. 2569–2615, 2015.
[257] C. Iurciuc (Tincu), A. Savin, C. Lungu, P. Martin and M. Popa, Gellan. Food
Applications, Cellulose Chem. Technol., 50 (1), 1-13 (2016)
[258] I. W. Sutherland, ―Novel and established applications of microbial polysaccharides,‖
Trends in Biotechnology, vol. 16, no. 1, pp. 41–46, 1998.
[259] A. Sanchez, M.E. Ramirez, L.G. Torres, E. Galindo and W.J. Mob, World J Microbiol
Biotechnol, 13, 443 (1997).
[260] K. Kang, G.T. Veeder, P.J.Mirrasoul, T. Kaneko and I.W. Cottrell,Appl Environ Micr
obiol,43, 1086 (1982).
274
[261] M.J. Miles, V.J. Morris, M.A. O‘Neill, in ―Gums and Stabilizers for Food Industry‖,
Vol. 2, edited by G.O. Phillips, D.J.Wedlock, P.A. Williams, Pergamon Press, Oxford, UK,
1984, pp. 485–497
[262] I.B. Bajaj, S.A. Survase, P.S. Saudagar and R.S. Singhal, Food Technol. Biotechnol.,
45, 341 (2007)
[263] M.K. Kim, I.Y. Lee, J.H. Ko, Y.H. Rhee and Y.H. Park, Biotechnol. Bioeng, 62, 317 (
1999)
[264] K. M. Nampoothiri, R. R. Singhania, C. Sabarinath, A. Pandey, ―Fermentative product
ion of gellan using Sphingomonas paucimobilis,‖ Process Biochemistry, vol. 38, no. 11, pp.
1513–1519, 2003.
[265] M. G. Sosa-Herrera, C. L. A. Berli, L. P. Martínez-Padilla, ―Physicochemical and rheo
logical properties of oil-in-water emulsions prepared with sodium caseinate/gellan gum mixt
ures,‖ Food Hydrocolloids, vol. 22, no. 5, pp. 934–942, 2008.
[266] P.-E. Jansson, B. Lindberg, P. A. Sandford, ―Structural studies of gellan gum, an extra
cellular polysaccharide elaborated by Pseudomonas elodea,‖ Carbohydrate Research, vol. 12
4, no. 1, pp. 135–139, 1983.
[267] M. A. O‘Neill, R. R. Selvendran, V. J. Morris, ―Structure of the acidic extracellular ge
lling polysaccharide produced by Pseudomonas elodea,‖ Carbohydrate Research, vol. 124, n
o. 1, pp. 123–133, 1983.
[268]G. P. Okiror, C. L. Jones, ―Effect of temperature on the dielectric properties of low acy
l gellan gel,‖ Journal of Food Engineering, vol. 113, no. 1, pp. 151–155, 2012.
[269] R. Chandrasekaran, R. P. Millane, S. Arnott, E. D. T. Atkins, ―The crystal structure of
gellan,‖ Carbohydrate Research, vol. 175, no. 1, pp. 1–15, 1988.
[270] Y. Nitta, R. Takahashi, K. Nishinari, ―Viscoelasticity and Phase Separation of Aqueou
s Na-Type Gellan Solution,‖ Biomacromolecules, vol. 11, no. 1, pp. 187–191, 2010.
[271] S.M. Hasheminya and J.Dehghannya, Intl. J. Agri. Crop. Sci., 5, 3016 (2013)
275
[272] K.M. Manjanna, T.M. Pramod Kumar,B. Shivakumar, Int J Chem Tech Res., 2, 509 (2
010)
[273] S. Noda, T. Funami, M. Nakauma, I. Asai, R. Takahashi, S. Al-Assaf, S. Ikeda, K. Nis
hinari, G. O. Phillips, ―Molecular structures of gellan gum imaged with atomic force micros
copy in relation to the rheological behavior in aqueous systems. 1. Gellan gum with various
acyl contents in the presence and absence of potassium,‖ Food Hydrocolloids, vol. 22, no. 6,
pp. 1148–1159, 2008.
[274] F. Mazen, M. Milas, M. Rinaudo, ―Conformational transition of native and modified g
ellan,‖ International Journal of Biological Macromolecules, vol. 26, no. 2–3, pp. 109–118, 1
999.
[275] L. Dai, X. Liu, Z. Tong, ―Critical behavior at sol–gel transition in gellan gum aqueous
solutions with KCl and CaCl2 of different concentrations,‖ Carbohydrate Polymers, vol. 81,
no. 2, pp. 207–212, 2010.
[276] E. R. Morris, K. Nishinari, M. Rinaudo, ―Gelation of gellan – A review,‖ Food Hydro
colloids, vol. 28, no. 2, pp. 373–411, 2012.
[277] S. J. Pérez-Campos, N. Chavarría-Hernández, A. Tecante, M. Ramírez-Gilly, A. I. Ro
dríguez-Hernández, ―Gelation and microstructure of dilute gellan solutions with calcium ion
s,‖ Food Hydrocolloids, vol. 28, no. 2, pp. 291–300, 2012.
[278] H. Grasdalen, O. Smidsrød, ―Gelation of gellan gum,‖ Carbohydrate Polymers, vol. 7,
no. 5, pp. 371–393, 1987.
[279] R. Takahashi, H. Tokunou, K. Kubota, E. Ogawa, T. Oida, T. Kawase, K. Nishinari, ―
Solution Properties of Gellan Gum: Change in Chain Stiffness between Single- and Double-
Stranded Chains,‖ Biomacromolecules, vol. 5, no. 2, pp. 516–523, 2004.
[280] M. T. Nickerson, A. T. Paulson, ―Rheological properties of gellan, κ-carrageenan and
alginate polysaccharides: effect of potassium and calcium ions on macrostructure assemblag
es,‖ Carbohydrate Polymers, vol. 58, no. 1, pp. 15–24, 2004.
276
[281] Y. Huang, P. P. Singh, J. Tang, B. G. Swanson, ―Gelling temperatures of high acyl gel
lan as affected by monovalent and divalent cations with dynamic rheological analysis,‖ Carb
ohydrate Polymers, vol. 56, no. 1, pp. 27–33, 2004.
[282] J. Tang, M. A. Tung, Y. Zeng ―Compression strength and deformation of gellan gels f
ormed with mono- and divalent cations,‖ Carbohydrate Polymers, vol. 29, no. 1, pp. 11–16,
1996.
[283] M. Annaka, J.-I. Honda, T. Nakahira, H. Seki, M. Tokita, ―Multinuclear NMR study o
n the sol-gel transition of gellan gum,‖ Physical Chemistry and Industrial Application of Gel
lan Gum, pp. 25–30, 1999
[284] E. Miyoshi,T. Takaya and K. Nishinari, CarbohydrPolym, 30, 109 (1996)
[285] E. R. Morris, R. K. Richardson, L. E. Whittaker, ―Rheology and gelation of deacylated
gellan polysaccharide with Na+ as the sole counterion,‖ Physical Chemistry and Industrial A
pplication of Gellan Gum, pp. 109–115, 1999.
[286] K. Nishinari and E. Miyoshi, Prog Colloid Polym Sci, 114, 68 (1999)
[287] A.I. Rodr guez-Hernández, S. Durand, C. Garnier, A. Tecante, J. . Doublier, ―Rheolog
y-structure properties of gellan systems: evidence of network formation at low gellan concen
trations,‖ Food Hydrocolloids, vol. 17, no. 5, pp. 621–628, 2003.
[288] E. Manning, and E. R. Morris, in―Food polymers, gels and colloids‖, edited by E.
Dickinson,Cambridge, UK: Royal Society of Chemistry, 1991, pp. 22-33
[289] A. P. Gunning, V. J. Morris, ―Light scattering studies of tetramethyl ammonium gellan
,‖ International Journal of Biological Macromolecules, vol. 12, no. 6, pp. 338–341, 1990.
[290 ca 288] G. Robinson, C. E. Manning, and E. R. Morris, in―Food polymers, gels and
colloids‖, edited by E. Dickinson,Cambridge, UK: Royal Society of Chemistry, 1991, pp.
22-33
[291] Y. Yuguchi, M. Mimura, S. Kitamura, H. Urakawa, K. Kajiwara, ―Structural character
istics of gellan in aqueous solution,‖ Food Hydrocolloids, vol. 7, no. 5, pp. 373–385, 1993.
[292] R. Mao, J. Tang, B. G. Swanson, ―Texture properties of high and low acyl mixed gella
n gels,‖ Carbohydrate Polymers, vol. 41, no. 4, pp. 331–338, 2000.
277
[293] I. Giavasis, L.M. Harvey, B. McNeil, Crit. Rev.Biotechnol., 20, 177 (2000)
[294] G.R. Sanderson and R. C. Clark, in ―Gums and Stabilizers for the food industry‖, edite
d by G.O. Phillips and D.J. Wedlock, Oxford University press, UK, , 1984, pp. 201-210.
[295] M. Papageorgiou, S. Kasapis, ―The effect of added sucrose and corn syrup on the phys
ical properties of gellan—gelatin mixed gels,‖ Food Hydrocolloids, vol. 9, no. 3, pp. 211–22
0, 1995.
[296] J.R. Tang, M. Mao, A. Tung and B.G. Swanson, Food Hydrocoll.,16, 191, 2002
[297] E. Miyoshi, K. Nishinari, ―Effects of sugar on the sol-gel transition in gellan gum aque
ous solutions,‖ Physical Chemistry and Industrial Application of Gellan Gum, pp. 83–91, 19
99.
[298] E. Miyoshi, T. Takaya, K. Nishinari, ―Effects of glucose, mannose and konjac glucom
annan on the gel–sol transition in gellan gum aqueous solutions by rheology and DSC,‖ Poly
mer Gels and Networks, vol. 6, no. 3–4, pp. 273–290, 1998.
[299]S. Bayarri, E. Costell, L. Durán, ―Influence of low sucrose concentrations on the compr
ession resistance of gellan gum gels,‖ Food Hydrocolloids, vol. 16, no. 6, pp. 593–597, 2002
.
[300] G. Sworn, S. Kasapis, ―Effect of conformation and molecular weight of co-solute on t
he mechanical properties of gellan gum gels,‖ Food Hydrocolloids, vol. 12, no. 3, pp. 283–2
90, 1998.
[301] W. Gibson, G. R. Sanderson, ―Gellan gum,‖ Thickening and Gelling Agents for Food,
pp. 119–143, 1997.
[302] M.A. Rao, in ―Rheology of fluids and semisolid foods: Principles and applications‖, e
dited by G.V. Barbarosa-Canovas, Gaithersburg, MD: Aspen Publishers, 1999, 27-59
[303] M. T. Nickerson, A. T. Paulson, F. R. Hallett, ―Pre-gel solution properties of gellan po
lysaccharides: Effect of potassium and calcium ions on chain associations,‖ Food Research I
nternational, vol. 41, no. 5, pp. 462–471, 2008.
278
[304] O.P. Nautiyal,J Food Process Technol, 2, 1 (2011), P.A. Williams and G.O. Phillips, i
n ―Handbook of Hydrocolloids‖, edited by G.O Phillips and P.A Williams,Woodhead Publis
hing Ltd,Cambridge, UK, 2000, pp. 1–19, T. Funami, Food Hydrocoll, 25, 1904 (2011)
[305] J. Milan and G.Maleki, in―Food Industrial Processes – Methods and Equipment‖,
edited by B. Valdez, InTech Europe: Croatia, 2012, pp. 17 – 38
[306] V.J. Morris,in―Food polysaccharides and their applications‖, edited by A.M. Stephen,
G.O. Phillips and P.A. Williams, CRC Press Taylor &Francis Group 6000 Broken Sound Pa
rkway NW, 2006, pp. 413-454
[307] A. B. Norton, P. W. Cox, F. Spyropoulos, ―Acid gelation of low acyl gellan gum relev
ant to self-structuring in the human stomach,‖ Food Hydrocolloids, vol. 25, no. 5, pp. 1105–
1111, 2011.
[308] I. T. Norton, W. J. Frith, S. Ablett, ―Fluid gels, mixed fluid gels and satiety,‖ Food Hy
drocolloids, vol. 20, no. 2–3, pp. 229–239, 2006.
[309] D. A. Garrec, S. Frasch-Melnik, J. V. L. Henry, F. Spyropoulos, I. T. Norton, ―Designi
ng colloidal structures for micro and macro nutrient content and release in foods,‖ Faraday
Discussions, vol. 158, p. 37, 2012.
[310] C. Ramalingam, J. Priya and S. Mundra, Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res., 27, 322 (2014)
[311] I.W.Sutherland, in ―Food Biotechnology‖ 2nd
edition, edited by K. Shetty, G. Paliyath,
A. Pometto and R.E. Levin, Taylor and Francis, Boca Raton, FL, USA, 2005, pp. 193-220
[312] N.W.G. Young in ―Gums and stabilizers for the food industry‖, edited by P.A. Willia
ms, G.O. Phillips, Cambridge: RSC, 2002,pp. 226-23
[313] G. Sworn, G. R. Sanderson, W. Gibson, ―Gellan gum fluid gels,‖ Food Hydrocolloids,
vol. 9, no. 4, pp. 265–271, 1995.
[314] I.I. Norton, D. . Jarvis, T.J. Foster, ―A molecular model for the formation and properti
es of fluid gels,‖ International Journal of Biological Macromolecules, vol. 26, no. 4, pp. 255
–261, 1999.
[315] S.M. Hasheminya, S.M.A. Ebrahimzadeh-Mousavi, M.R. Ehsani and J. Dehghannya,
Food Res, 21, 179 (2011)
279
[316] S.-M. Hasheminya, S.-M.-A. Ebrahimzadeh-Mousavi, M.-R. Ehsani, J. Dehghannya, ―
Production of a fiber-enriched pasteurized and non-pasteurized fermented acidified drink usi
ng gellan,‖ Food Bioscience, vol. 3, pp. 29–35, 2013.
[317] J. F. Bradbeer, R. Hancocks, F. Spyropoulos, I. T. Norton, ―Self-structuring foods bas
ed on acid-sensitive low and high acyl mixed gellan systems to impact on satiety,‖ Food Hy
drocolloids, vol. 35, pp. 522–530, 2014.
[318] S. Banerjee, S. Bhattacharya, ―Compressive textural attributes, opacity and syneresis o
f gels prepared from gellan, agar and their mixtures,‖ Journal of Food Engineering, vol. 102,
no. 3, pp. 287–292, 2011.
[319] A. Kayacier, M. Dogan, ―Rheological properties of some gums-salep mixed solutions,
‖ Journal of Food Engineering, vol. 72, no. 3, pp. 261–265, 2006. A. AGOUB, E. MORRIS,
―Particulate rheology and acid-induced gelation of oxidised cellulose,‖ Carbohydrate Polym
ers, vol. 71, no. 3, pp. 416–427, 2008.
[320] C. Liang, X. Hu, Y. Ni, J. Wu, F. Chen, X. Liao, ―Effect of hydrocolloids on pulp sedi
ment, white sediment, turbidity and viscosity of reconstituted carrot juice,‖ Food Hydrocollo
ids, vol. 20, no. 8, pp. 1190–1197, 2006. S. S. Manjunatha, D. K. Das Gupta, ―Instrumental
Textural Characteristics of Restructured Carrot Cubes,‖ International Journal of Food Proper
ties, vol. 9, no. 3, pp. 453–462, 2006.
[321] S. Banerjee, R. Ravi, S. Bhattacharya, ―Textural characterisation of gellan and agar ba
sed fabricated gels with carrot juice,‖ LWT - Food Science and Technology, vol. 53, no. 1, p
p. 255–261, 2013.
[322] S. Albert, G. S. Mittal, ―Comparative evaluation of edible coatings to reduce fat uptak
e in a deep-fried cereal product,‖ Food Research International, vol. 35, no. 5, pp. 445–458, 2
002. M. . Garc a, C. Ferrero, N. Bértola, M. Martino, N. Zaritzky, ―Edible coatings from cell
ulose derivatives to reduce oil uptake in fried products,‖ Innovative Food Science & Emergi
ng Technologies, vol. 3, no. 4, pp. 391–397, 2002.
[323] I. BAJAJ, R. SINGHAL, ―Gellan gum for reducing oil uptake in sev, a legume based
product during deep-fat frying,‖ Food Chemistry, vol. 104, no. 4, pp. 1472–1477, 2007.
280
[324] E. Durán, E. Costell, L. Izquierdo, L. Durán, ―Low sugar bakery jams with gellan gum
—guar gum mixtures. Influence of composition on texture,‖ Food Hydrocolloids, vol. 8, no.
3–4, pp. 373–381, 1994.
[325] M. J. Martin, F. Lara-Villoslada, M. A. Ruiz, M. E. Morales, ―Effect of unmodified st
arch on viability of alginate-encapsulated Lactobacillus fermentum CECT5716,‖ LWT - Foo
d Science and Technology, vol. 53, no. 2, pp. 480–486, 2013.
[326] G. K. Gbassi, T. Vandamme, ―Probiotic Encapsulation Technology: From Microencap
sulation to Release into the Gut,‖ Pharmaceutics, vol. 4, no. 4, pp. 149–163, 2012.
[327] L.-E. Shi, Z.-H. Li, D.-T. Li, M. Xu, H.-Y. Chen, Z.-L. Zhang, Z.-X. Tang, ―Encapsul
ation of probiotic Lactobacillus bulgaricus in alginate–milk microspheres and evaluation of t
he survival in simulated gastrointestinal conditions,‖ Journal of Food Engineering, vol. 117,
no. 1, pp. 99–104, 2013.
[328] R. Rajam, P. Karthik, S. Parthasarathi, G. S. Joseph, C. Anandharamakrishnan, ―Effect
of whey protein – alginate wall systems on survival of microencapsulated Lactobacillus plan
tarum in simulated gastrointestinal conditions,‖ Journal of Functional Foods, vol. 4, no. 4, p
p. 891–898, 2012.
[329] W. Sun, M. W. Griffiths, ―Survival of bifidobacteria in yogurt and simulated gastric ju
ice following immobilization in gellan–xanthan beads,‖ International Journal of Food Micro
biology, vol. 61, no. 1, pp. 17–25, 2000.
[330] A. Nag, K.-S. Han, H. Singh, ―Microencapsulation of probiotic bacteria using pH-indu
ced gelation of sodium caseinate and gellan gum,‖ International Dairy Journal, vol. 21, no. 4
, pp. 247–253, 2011.
[331] A.Mantaluta, D.Cojocaru, C. Savin and R. Pasa. Annnals of the „AlexandruIoanCuza‖
University, Genetics and Molecular Biology, 12, 81 (2012)
[332] S. M. Tan, P. W. S. Heng, L. W. Chan, ―Development of Re-Usable Yeast-Gellan Gu
m Micro-Bioreactors for Potential Application in Continuous Fermentation to Produce Bio-
Ethanol,‖ Pharmaceutics, vol. 3, no. 4, pp. 731–744, 2011.
281
[333] Y.-H. Lin, H.-F. Liang, C.-K. Chung, M.-C. Chen, H.-W. Sung, ―Physically crosslinke
d alginate/N,O-carboxymethyl chitosan hydrogels with calcium for oral delivery of protein d
rugs,‖ Biomaterials, vol. 26, no. 14, pp. 2105–2113, 2005.
[334] V. R. Sinha R. Kumria, ―Polysaccharides in colon-specific drug delivery,‖ Internation
al Journal of Pharmaceutics, vol. 224, no. 1–2, pp. 19–38, 2001.
[335] O. Chambin, G. Dupuis, D. Champion, A. Voilley, Y. Pourcelot, ―Colon-specific drug
delivery: Influence of solution reticulation properties upon pectin beads performance,‖ Inter
national Journal of Pharmaceutics, vol. 321, no. 1–2, pp. 86–93, 2006.
[336] P. Moslemy, R. J. Neufeld, D. Millette, S. R. Guiot, ―Transport of gellan gum microbe
ads through sand: an experimental evaluation for encapsulated cell bioaugmentation,‖ Journ
al of Environmental Management, vol. 69, no. 3, pp. 249–259, 2003.
[337] B. N. Singh, L. D. Trombetta, K. H. Kim, ―Biodegradation Behavior of Gellan Gum in
Simulated Colonic Media,‖ Pharmaceutical Development and Technology, vol. 9, no. 4, pp.
399–407, 2004.
[338] F. Yang, S. Xia, C. Tan, X. Zhang, ―Preparation and evaluation of chitosan-calcium-g
ellan gum beads for controlled release of protein,‖ European Food Research and Technology
, vol. 237, no. 4, pp. 467–479, 2013.
[339] R. P. Swatloski, S. K. Spear, J. D. Holbrey, R. D. Rogers, ―Dissolution of Cellose with
Ionic Liquids,‖ Journal of the American Chemical Society, vol. 124, no. 18, pp. 4974–4975,
2002.
[340] T. Heinze, Volume of the series Advances in Polymer Science 271, 1, 2005.
[341] J. Shokri, K. Adibki, ―Application of Cellulose and Cellulose Derivatives in Pharmace
utical Industries,‖ Cellulose - Medical, Pharmaceutical and Electronic Applications, 2013.
[342] J. Zhou, L. Zhang, Q. Deng, X. Wu, ―Synthesis and characterization of cellulose deriv
atives prepared in NaOH/urea aqueous solutions,‖ Journal of Polymer Science Part A: Poly
mer Chemistry, vol. 42, no. 23, pp. 5911–5920, 2004.
282
[343] D. Klemm, B. Heublein, H.-P. Fink, A. Bohn, ―Cellulose: Fascinating Biopolymer and
Sustainable Raw Material,‖ Angewandte Chemie International Edition, vol. 44, no. 22, pp. 3
358–3393, 2005.
[344] Naveen Chella, Kiran Kumar Yada, Rashmi Vempati, Preparation and Evaluation of
Ethyl Cellulose Microspheres Containing Diclofenac Sodium by Novel W/O/O Emulsion
Method, J. Pharm. Sci. & Res. Vol.2 (12), 2010,884-888
[345] T. Heinze, A. Koschella, ―Carboxymethyl Ethers of Cellulose and Starch - A Review,
‖ Macromolecular Symposia, vol. 223, no. 1, pp. 13–40, 2005.
[346] E. Doelker, in Hydrogels in medicine and pharmacy, vol II Polymers, CRC Press. Inc.,
2000.
[347] P. Mischnick, D. Momcilovic, ―Chemical Structure Analysis of Starch and Cellulose
Derivatives,‖ Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, pp. 117–210, 2010.
[348] M. Gökgöz, M. Yiğitoğlu, ―Immobilization of Saccharomyces cerevisiae on to modifi
ed carboxymethylcellulose for production of ethanol,‖ Bioprocess and Biosystems Engineeri
ng, vol. 34, no. 7, pp. 849–857, 2011.
[349] M. Yiğitoğlu, N. Iş klan, R. Özmen, ―Graft copolymerization ofN-vinyl-2-pyrrolidone
onto sodium carboxymethylcellulose with azobisisobutyronitrile as the initiator,‖ Journal of
Applied Polymer Science, vol. 104, no. 2, pp. 936–943, 2007.
[350] A. Usman, K. M. Zia, M. Zuber, S. Tabasum, S. Rehman, F. Zia, ―Chitin and chitosan
based polyurethanes: A review of recent advances and prospective biomedical applications,‖
International Journal of Biological Macromolecules, vol. 86, pp. 630–645, 2016.
[351] V. Zargar, M. Asghari, A. Dashti, ―A Review on Chitin and Chitosan Polymers: Struct
ure, Chemistry, Solubility, Derivatives, and Applications,‖ ChemBioEng Reviews, vol. 2, no
. 3, pp. 204–226, 2015.
[352] Dutta, P.K., Duta, J.,Tripathi, V.S., Chitin and Chitosan: Chemistry, properties and
applications, Journal of Scientific and Industrial Research, Volume 63, Issue 1, January
2004, Pages 20-31
283
[353] Yang, A., & Wu, R. (2001). Mechanical properties and interfacial interaction of a nov
el bioabsorbable chitin fiber reinforced poly(∈-caprolactone) compositeJournal of Materials
Science Letters, 20(11), 977–979
[354] H. Honarkar, M. Barikani, ―Applications of biopolymers I: chitosan,‖ Monatshefte für
Chemie - Chemical Monthly, vol. 140, no. 12, pp. 1403–1420, 2009.
[355] M. Rinaudo, ―Chitin and chitosan: Properties and applications,‖ Progress in Polymer S
cience, vol. 31, no. 7, pp. 603–632, 2006.
[356] A. M. de Campos, Y. Diebold, E. L. S. Carvalho, A. Sánchez, M. José Alonso, ―Chito
san Nanoparticles as New Ocular Drug Delivery Systems: in Vitro Stability, in Vivo Fate, a
nd Cellular Toxicity,‖ Pharmaceutical Research, vol. 21, no. 5, pp. 803–810, 2004.
[357] P.K. Dutta, J. Dutta, V.S. Tripathi, Journal of Scientific & Industrial Research, 63, 20
(2004)
[358] N. Acosta, C. Jiménez, V. Borau, A. Heras, ―Extraction and characterization of chitin
from crustaceans,‖ Biomass and Bioenergy, vol. 5, no. 2, pp. 145–153, 1993.
[359] S. V. Madihally, H. W. T. Matthew, ―Porous chitosan scaffolds for tissue engineering,
‖ Biomaterials, vol. 20, no. 12, pp. 1133–1142, 1999.
[360] L. L. Hench, ―Biomaterials: a forecast for the future,‖ Biomaterials, vol. 19, no. 16, pp
. 1419–1423, 1998.
[361] S. S. Koide, ―Chitin-chitosan: Properties, benefits and risks,‖ Nutrition Research, vol.
18, no. 6, pp. 1091–1101, 1998.
[362] S. M. Hudson and D. W. Jenkins, ―Chitin and Chitosan,‖ Encyclopedia of Polymer Sci
ence and Technology, 2001.
[363] I. Aranaz, M. Mengibar, R. Harris, I. Panos, B. Miralles, N. Acosta, G. Galed, A. Hera
s, ―Functional Characterization of Chitin and Chitosan,‖ CCB, vol. 3, no. 2, pp. 203–230, 20
09.
284
[364] M. Dash, F. Chiellini, R. M. Ottenbrite, E. Chiellini, ―Chitosan—A versatile semi-synt
hetic polymer in biomedical applications,‖ Progress in Polymer Science, vol. 36, no. 8, pp. 9
81–1014, 2011.
[365] M. Amidi, E. Mastrobattista, W. Jiskoot, W. E. Hennink, ―Chitosan-based delivery sys
tems for protein therapeutics and antigens,‖ Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 62, no.
1, pp. 59–82, 2010.
[366] P. Agrawal, G. J. Strijkers, K. Nicolay, ―Chitosan-based systems for molecular imagin
g,‖ Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 62, no. 1, pp. 42–58, 2010.
[367] H. Wang, H., W. Li, Y. Lu, Z. Wang, W. Zhong, ―Studies on chitosan and poly(acryl
ic acid) interpolymer complex. II. Solution behaviors of the mixture of water-soluble chitosa
n and poly(acrylic acid),‖ J. Appl. Polym. Sci., vol. 61, pp. 2221–2224, 1996.
[368] M. Prabaharan, ―Review Paper: Chitosan Derivatives as Promising Materials for Contr
olled Drug Delivery,‖ Journal of Biomaterials Applications, vol. 23, no. 1, pp. 5–36, 2008.
[369] M.-H. Ho, D.-M. Wang, H.-J. Hsieh, H.-C. Liu, T.-Y. Hsien, J.-Y. Lai, L.-T. Hou, ―Pr
eparation and characterization of RGD-immobilized chitosan scaffolds,‖ Biomaterials, vol. 2
6, no. 16, pp. 3197–3206, 2005.
[370] B. Krajewska, ―Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immob
ilizations: a review,‖ Enzyme and Microbial Technology, vol. 35, no. 2–3, pp. 126–139, 200
4.
[371] N. L. B. M. Yusof, A. Wee, L. Y. Lim, E. Khor, ―Flexible chitin films as potential wo
und-dressing materials: Wound model studies,‖ Journal of Biomedical Materials Research, v
ol. 66A, no. 2, pp. 224–232, 2003.
[372] T. Minagawa, Y. Okamura, Y. Shigemasa, S. Minami, Y. Okamoto, ―Effects of molec
ular weight and deacetylation degree of chitin/chitosan on wound healing,‖ Carbohydrate Po
lymers, vol. 67, no. 4, pp. 640–644, 2007.
[373] Y. Kato, H. Onishi, Y. Machida, ―Application of Chitin and Chitosan Derivatives in th
e Pharmaceutical Field,‖ CPB, vol. 4, no. 5, pp. 303–309, 2003.
285
[374] A. M. Papineau, D. G. Hoover, D. Knorr, D. F. Farkas, ―Antimicrobial effect of water‐
soluble chitosans with high hydrostatic pressure,‖ Food Biotechnology, vol. 5, no. 1, pp. 45–
57, 1991.
[375] N. R. Sudarshan, D. G. Hoover, D. Knorr, ―Antibacterial action of chitosan,‖ Food Bi
otechnology, vol. 6, no. 3, pp. 257–272, 1992.
[376] A. G. Imeri, D. Knorr, ―Effects of Chitosan on Yield and Compositional Data of Carro
t and Apple Juice,‖ J Food Science, vol. 53, no. 6, pp. 1707–1709, 1988.
[377] N. V. SOTO-PERALTA, H. MÜLLER, D. KNORR, ―Effects of Chitosan Treatments
on the Clarity and Color of Apple Juice,‖ J Food Science, vol. 54, no. 2, pp. 495–496, 1989.
[378] D. W. S. Wong, F. A. Gastineau, K. S. Gregorski, S. J. Tillin, A. E. Pavlath, ―Chitosan
-lipid films: microstructure and surface energy,‖ Journal of Agricultural and Food Chemistry
, vol. 40, no. 4, pp. 540–544, 1992.
[379] B. L. BUTLER, P. J. VERGANO, R. F. TESTIN, J. M. BUNN, J. L. WILES, ―Mecha
nical and Barrier Properties of Edible Chitosan Films as affected by Composition and Storag
e,‖ Journal of Food Science, vol. 61, no. 5, pp. 953–956, 1996.
[380] P. D. Hoagland, N. Parris, ―Chitosan/Pectin Laminated Films,‖ Journal of Agricultura
l and Food Chemistry, vol. 44, no. 7, pp. 1915–1919, 1996.
[381] F. S. Kittur, K. R. Kumar, R. N. Tharanathan, ―Functional packaging properties of chit
osan films,‖ Zeitschrift f�r Lebensmitteluntersuchung und -Forschung A, vol. 206, no. 1, p
p. 44–47, 1998.
[382] C. Jeuniaux, K. A. Almas, A. Baradarajan, H. Blair, P. Decock, S. Deiana, A. Dessi, B
. Dubois, A. Findon, H. Kozlowski, J. Mckay, G. Micera, C. A. Sastry, C. Senstad, J. P. Tho
me, J. V. Daele, B. Venkatrao, ―Chitosan as a Tool for the Purification of Waters,‖ Chitin in
Nature and Technology, pp. 551–570, 1986.
[383] M. Potara, E. Jakab, A. Damert, O. Popescu, V. Canpean, S. Astilean, ― Synergistic an
tibacterial activity of chitosan–silver nanocomposites on Staphylococcus aureus ,‖ Nanotech
nology, vol. 22, no. 13, p. 135101, 2011.
286
[384] C. Anchisi, M. C. Meloni, A. M. Maccioni, ―Chitosan beads loaded with essential oils
in cosmetic formulations,‖ International Journal of Cosmetic Science, vol. 29, no. 6, pp. 485
–485, 2007.
[385] S. Gautier, E. Xhauflaire-Uhoda, P. Gonry, G. E. Piérard, ―Chitin-glucan, a natural cel
l scaffold for skin moisturization and rejuvenation,‖ International Journal of Cosmetic Scien
ce, vol. 30, no. 6, pp. 459–469, 2008.
[386] J.-F. Revol, R. H. Marchessault, ―In vitro chiral nematic ordering of chitin crystallites,
‖ International Journal of Biological Macromolecules, vol. 15, no. 6, pp. 329–335, 1993.
[387] R. A. A. Muzzarelli, ―CHITIN CHEMISTRY,‖ Chitin, pp. 87–154, 1977.
[388] G. Crini, G. Torri, M. Guerrini, M. Morcellet, M. Weltrowski, B. Martel, ―NMR chara
cterization of N-benzyl sulfonated derivatives of chitosan,‖ Carbohydrate Polymers, vol. 33,
no. 2–3, pp. 145–151, 1997.
[389] C.-B. Ahn, J.-Y. Je, ―Chitosan and Its Derivatives as Potential Cosmetic Agents : A re
view,‖ J. Chitin Chitosan, vol. 20, no. 4, pp. 287–296, 2015.
[390] P. K. Dutta, M. N. V. Ravikumar, J. Dutta, ―CHITIN AND CHITOSAN FOR VERSA
TILE APPLICATIONS,‖ Journal of Macromolecular Science, Part C: Polymer Reviews, vol
. 42, no. 3, pp. 307–354, 2002.
[391] F. Akhtar, M. M. A. Rizvi, S. K. Kar, ―Oral delivery of curcumin bound to chitosan na
noparticles cured Plasmodium yoelii infected mice,‖ Biotechnology Advances, vol. 30, no. 1
, pp. 310–320, 2012.
[392] M. P. Souza, A. F. M. Vaz, M. T. S. Correia, M. A. Cerqueira, A. A. Vicente, M. G. C
arneiro-da-Cunha, ―Quercetin-Loaded Lecithin/Chitosan Nanoparticles for Functional Food
Applications,‖ Food and Bioprocess Technology, vol. 7, no. 4, pp. 1149–1159, 2013.
[393] D. Kurukji, I. Norton, F. Spyropoulos, ―Fabrication of sub-micron protein-chitosan ele
ctrostatic complexes for encapsulation and pH-Modulated delivery of model hydrophilic acti
ve compounds,‖ Food Hydrocolloids, vol. 53, pp. 249–260, 2016.
287
[394] X.F. ZHENG, Q. LIAN, S.T. SONG Chitosan-Gelatin-Pectin Composite Films from
Polyion-Complex Hydrogels, Asian Journal of Chemistry; Vol. 25, No. 10 (2013), 5363-
5366
[395] J. M. Souza, A. L. Caldas, S. D. Tohidi, J. Molina, A. P. Souto, R. Fangueiro, A. Zille,
―Properties and controlled release of chitosan microencapsulated limonene oil,‖ Revista Bra
sileira de Farmacognosia, vol. 24, no. 6, pp. 691–698, 2014.
[396] V. NAYDENOVA, S. VASSILEV, M. KANEVA , G. KOSTOV, ENCAPSULATIO
N OF BREWING YEAST IN ALGINATE/CHITOSAN MATRIX: COMPARATIVE STU
DY OF BEER FERMENTATION WITH IMMOBILIZED AND FREE CELLS, Bulgarian J
ournal of Agricultural Science, 19 (2) 2013, 123–127
[397] D. F. Silva, H. Rosa, A. F. A. Carvalho, P. Oliva-Neto, ―Immobilization of Papain on
Chitin and Chitosan and Recycling of Soluble Enzyme for Deflocculation ofSaccharomyces
cerevisiaefrom Bioethanol Distilleries,‖ Enzyme Research, vol. 2015, pp. 1–10, 2015.
[398] J. Duan, Y. Zhang, S. Han, Y. Chen, B. Li, M. Liao, W. Chen, X. Deng, J. Zhao, B. H
uang, ―Synthesis and in vitro/in vivo anti-cancer evaluation of curcumin-loaded chitosan/pol
y(butyl cyanoacrylate) nanoparticles,‖ International Journal of Pharmaceutics, vol. 400, no.
1–2, pp. 211–220, 2010.
[399] J. Necas, L. Bartosikova, ―Carrageenan: a review‖, Veterinarni Medicina, vol. 58, no.
4, pp. 187-205, 2013.
[400] V. L. Campo, D. F. Kawano, D. B. da Silva, I. Carvalho, ―Carrageenans: Biological pr
operties, chemical modifications and structural analysis – A review,‖ Carbohydrate Polymer
s, vol. 77, no. 2, pp. 167–180, 2009.
[401] V. D. Prajapati, P. M. Maheriya, G. K. Jani, H. K. Solanki, ―RETRACTED: Carragee
nan: A natural seaweed polysaccharide and its applications,‖ Carbohydrate Polymers, vol. 1
05, pp. 97–112, 2014.
[402] K. Nakagawa, N. Sowasod, T. Charinpanitkul, A. Soottitantawat, W. Tanthapanichako
on, ―Encapsulation of Curcumin Loaded Oil Droplets By Cryotropic Gel Formation from O/
W Emulsion,‖ Procedia Food Science, vol. 1, pp. 1973–1979, 2011.
288
[403] S. Janaswamy, S. R. Youngren, ―Hydrocolloid-based nutraceutical delivery systems,‖
Food & Function, vol. 3, no. 5, p. 503, 2012.
[404] D. Guzman-Villanueva, I. M. El-Sherbiny, D. Herrera-Ruiz, H. D. C. Smyth, ―Design
andIn VitroEvaluation of a New Nano-Microparticulate System for Enhanced Aqueous-Phas
e Solubility of Curcumin,‖ BioMed Research International, vol. 2013, pp. 1–9, 2013.
[405] H. Y. Wang, D. J. Hettwer, ―Cell immobilization ink-carrageenan with tricalcium pho
sphate,‖ Biotechnology and Bioengineering, vol. 24, no. 8, pp. 1827–1838, 1982.
[406] Martinez A., Vivas G., Quicazan M., 2016, Evaluation of alcoholic fermentation durin
g the production of mead using immobilized cells in kappa-carrageenan, Chemical Engineeri
ng Transactions, 49, 19-24
[407] F. Godia, C. Casas, B. Castellano, C. Sold, ―Immobilized cells: behaviour of carrageen
an entrapped yeast during continuous ethanol fermentation,‖ Applied Microbiology and Biot
echnology, vol. 26, no. 4, 1987.
[408] S. W. Chan, H. Mirhosseini, F. S. Taip, T. C. Ling, I. A. Nehdi, C. P. Tan, ―Emulsion
formulation optimization and characterization of spray-dried κ-carrageenan microparticles f
or the encapsulation of CoQ10,‖ Food Science and Biotechnology, vol. 25, no. S1, pp. 53–6
2, 2016.
[409] S. Yamazaki, T. Mori, I. Ogino, S. R. Mukai, ―Flexible film-type catalysts encapsulati
ng urease within κ-carrageenan hydrogel network,‖ Chemical Engineering Journal, vol. 278,
pp. 122–128, 2015.
[410] F. G. Fischer, H. Dörfel, ―Die Polyuronsäuren der Braunalgen (Kohlenhydrate der Alg
en I),‖ Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie, vol. 302, no. Jahresband, pp.
186–203, 1955.
[411] K. Y. Lee, D. J. Mooney, ―Alginate: Properties and biomedical applications,‖ Progress
in Polymer Science, vol. 37, no. 1, pp. 106–126, 2012.
[412] Pratibha Chaturvedi, Sandeepan Mukherjee, Shraddha Mehta, Pialy Chatterjee and Ab
hay Chowdhary, MEDIA STANDARDIZATION FOR CURCUMIN ENHANCEMENT IN
CURCUMA LONGA TISSUE CULTURE AND PROTEIN PROFILE OF TREATED SA
289
MPLES, WORLD JOURNAL OF PHARMACY AND PHARMACEUTICAL SCIENCES,
Volume 3, Issue 10, 965-975
[413] Călinescu, I., Chipurici, P., Trifan, A., Bădoiu, C., 2012. Immobilisation of
Saccharomyces cerevisiae for the production of bioethanol. U.P.B. Sci. Bull. 74, 33-40
[414] S. H. Hong, M. Shin, J. Lee, J. H. Ryu, S. Lee, J. W. Yang, W. D. Kim, H. Lee, ―STA
PLE: Stable Alginate Gel Prepared by Linkage Exchange from Ionic to Covalent Bonds,‖ A
dv. Healthcare Mater., vol. 5, no. 1, pp. 75–79, 2015.
[415] E. Callone, R. Campostrini, G. Carturan, A. Cavazza, R. Guzzon, ―Immobilization of
yeast and bacteria cells in alginate microbeads coated with silica membranes: procedures, ph
ysico-chemical features and bioactivity,‖ Journal of Materials Chemistry, vol. 18, no. 40, p.
4839, 2008.
[416] B. L. Tee, G. Kaletunç, ―Immobilization of a thermostable α-amylase by covalent bind
ing to an alginate matrix increases high temperature usability,‖ Biotechnology Progress, vol.
25, no. 2, pp. 436–445, 2009.
[417] A. D. Baldwin, K. L. Kiick, ―Polysaccharide-modified synthetic polymeric biomateria
ls,‖ Biopolymers, vol. 94, no. 1, pp. 128–140, 2010.
[418] M. F. Maitz, ―Applications of synthetic polymers in clinical medicine,‖ Biosurface an
d Biotribology, vol. 1, no. 3, pp. 161–176, 2015.
[419] T. R. Hoare, D. S. Kohane, ―Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges,‖ Pol
ymer, vol. 49, no. 8, pp. 1993–2007, 2008.
[420] K. S. Soppimath, T. M. Aminabhavi, A. M. Dave, S. G. Kumbar, W. E. Rudzinski, ―St
imulus-Responsive ‗Smart‘ Hydrogels as Novel Drug Delivery Systems,‖ Drug Developmen
t and Industrial Pharmacy, vol. 28, no. 8, pp. 957–974, 2002.
[421]Y. Qiu, K. Park, ―Environment-sensitive hydrogels for drug delivery,‖ Advanced Drug
Delivery Reviews, vol. 53, no. 3, pp. 321–339, 2001.
[422] James S, Encylopedia of Pharmaceutical Techonology, 3rd edition, Vol-1325-1333
290
[423] K.Shekhar, M.Naga Madhu, B.Pradeep, David Banji, A review on microencapsulation
, International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, Volume 5, Issue 2,
November – December 2010; Article-012, 58-62
[424] D. J. McClements, E. A. Decker, Y. Park, J. Weiss, ―Structural Design Principles for
Delivery of Bioactive Components in Nutraceuticals and Functional Foods,‖ Critical Review
s in Food Science and Nutrition, vol. 49, no. 6, pp. 577–606, 2009.
[425] L. Chen, G. E. Remondetto, M. Subirade, ―Food protein-based materials as nutraceutic
al delivery systems,‖ Trends in Food Science & Technology, vol. 17, no. 5, pp. 272–283, 20
06.
[426] P. Burey, B. R. Bhandari, T. Howes, and M. J. Gidley, ―Hydrocolloid Gel Particles: F
ormation, Characterization, and Application,‖ Critical Reviews in Food Science and Nutritio
n, vol. 48, no. 5, pp. 361–377, 2008.
[427] D. J. McClements, ―Emulsion Design to Improve the Delivery of Functional Lipophili
c Components,‖ Annu. Rev. Food Sci. Technol., vol. 1, no. 1, pp. 241–269, 2010.
[428] K. Koyama, M. Seki, ―Cultivation of Yeast and Plant Cells Entrapped in the Low-Vis
cous Liquid-Core of an Alginate Membrane Capsule Prepared Using Polyethylene Glycol,‖
Journal of Bioscience and Bioengineering, vol. 97, no. 2, pp. 111–118, 2004.
[429] V. A. Nedović, B. Obradović, I. Leskošek-Čukalović, O. Trifunović, R. Pešić, B. Bug
arski, ―Electrostatic generation of alginate microbeads loaded with brewing yeast,‖ Process
Biochemistry, vol. 37, no. 1, pp. 17–22, 2001.
[430] J. K. Park, H.N . Chang, ―Microencapsulation of microbial cells,‖ Biotechnology Adv
ances, vol. 18, no. 4, pp. 303–319, 2000.
[431] L.S.C. Wan, P.W.S. Heng, L.W. Chan, International Journal of Pharmaceutics. 103, 2
67 (1994)
[432] J. S. Patil, M. V. Kamalapur, S. C. Marapur, D. V. Kadam, ―Ionotropic gelation and p
olyelectrolyte complexation: the novel techniques to design hydrogel particule sustained, mo
dulated drug delivery system. A review‖, Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures
, Vol. 5, No 1, pp. 241 – 248, 2010.
291
[433] C.P. Champagne, N. Blahuta, F. Brion, C. Gagnon, Biotechnology and Bioengineering
, 68, 681 (2000). N. Blahuta, F. Brion and C. Gagnon, Biotechnology and Bioengineering, 6
8, 681 (2000)
[434] G. Fundueanu, C. Nastruzzi, A. Carpov, J. Desbrieres, M. Rinaudo, ―Physico-chemica
l characterization of Ca-alginate microparticles produced with different methods,‖ Biomateri
als, vol. 20, no. 15, pp. 1427–1435, 1999.
[435] L. S. C. Wan, P. W. S. Heng, L. W. Chan, ―Drug encapsulation in alginate microspher
es by emulsification,‖ Journal of Microencapsulation, vol. 9, no. 3, pp. 309–316, 1992.
[436] K.D. Green, I.S. Gill, J.A. Khan and E.N. Vulfson, Biotechnology and Bioengineering
. 49, 535 (1996)
[437] G. Fundueanu, E. Esposito, D. Mihai, A. Carpov, J. Desbrieres, M. Rinaudo, C. Nastru
zzi, ―Preparation and characterization of Ca-alginate microspheres by a new emulsification
method,‖ International Journal of Pharmaceutics, vol. 170, no. 1, pp. 11–21, 1998.
[438] L. W. Chanp, W. S. Heng, L. S. C. Wan, ―Effect of cellulose derivatives on alginate m
icro spheresprepared by emulsification,‖ Journal of Microencapsulation, vol. 14, no. 5, pp. 5
45–555, 1997.
[439] I. Călinescu, P. Chipurici, A. Trifan, C. Bădoiu, ―Immobilisation of Saccharomyces ce
revisiae for the production of bioethanol‖, U.P.B. Sci. Bull., vol. 74, pp. 33-40, 2012.
[440] I. Mariam, K. Manzoor, S. Ali, Ikram-Ul-Haq, ―Enhanced production of ethanol from
free and immobilized Saccharomyces cerevisiae under stationary culture‖, Pak. J. Bot., vol,
41, no. 2, pp. 821-833, 2009
[441] E. Callone, R. Campostrini, G. Carturan, A. Cavazza, R. Guzzon, ―Immobilization of
yeast and bacteria cells in alginate microbeads coated with silica membranes: procedures, ph
ysico-chemical features and bioactivity,‖ Journal of Materials Chemistry, vol. 18, no. 40, p.
4839, 2008.
[442] Mantaluta, A., Cojocaru, D. Savin, C., Pasa, R., 2012. The testing of some organic sup
ports for yeasts immobilization technology used in sparkling wine production. Annnals of th
e „AlexandruIoanCuza‖ University, Genet. Biol. Mol. 12, 81-85
292
[443] C. E. Iurciuc (Tincu), L. Alupei, A. Savin, C. Ibănescu, P. Martin, M. Popa, ―Yeast cel
ls immobilized in spherical gellan particles cross-linked with magnesium acetate,‖ Journal o
f Biotechnology, vol. 236, pp. 45–56, 2016.
[444] H. Y. Wang, D. J. Hettwer, ―Cell immobilization ink-carrageenan with tricalcium pho
sphate,‖ Biotechnology and Bioengineering, vol. 24, no. 8, pp. 1827–1838, 1982.
[445 la fel cu 406] Martinez A., Vivas G., Quicazan M., 2016, Evaluation of alcoholic ferme
ntation during the production of mead using immobilized cells in kappa-carrageenan, Chemi
cal Engineering Transactions, 49, 19-24
[446] F. Godia, C. Casas, B. Castellano, C. Sold, ―Immobilized cells: behaviour of carrageen
an entrapped yeast during continuous ethanol fermentation,‖ Applied Microbiology and Biot
echnology, vol. 26, no. 4, 1987.
[447] M. Gökgöz, M. Yiğitoğlu, ―Immobilization of Saccharomyces cerevisiae on to modifi
ed carboxymethylcellulose for production of ethanol,‖ Bioprocess and Biosystems Engineeri
ng, vol. 34, no. 7, pp. 849–857, 2011.
[448] M. Yiğitoğlu, N. Iş klan, R. Özmen, ―Graft copolymerization ofN-vinyl-2-pyrrolidone
onto sodium carboxymethylcellulose with azobisisobutyronitrile as the initiator,‖ Journal of
Applied Polymer Science, vol. 104, no. 2, pp. 936–943, 2007.
[449] J.-S. Lee, G.-H. Kim, H. G. Lee, ―Characteristics and Antioxidant Activity of Elsholtz
ia splendens Extract-Loaded Nanoparticles,‖ Journal of Agricultural and Food Chemistry, v
ol. 58, no. 6, pp. 3316–3321, 2010.
[450] G. Dey, S. Bhupinder, R. Banerjee, ―Immobilization of alpha-amylase produced by Ba
cillus circulans GRS 313,‖ Braz. arch. biol. technol., vol. 46, no. 2, 2003.
[451] A. P. Mörschbächer, G. Volpato, C. F. V. de Souza, ―Kluyveromyces lactis β-ga
lactosidase immobilization in calcium alginate spheres and gelatin for hydrolysis of cheese
whey lactose,‖ Ciência Rural, vol. 46, no. 5, pp. 921–926, 2016.
[452] M. A. Azevedo, A. I. Bourbon, A. A. Vicente, M. A. Cerqueira, ―Alginate/chitosan na
noparticles for encapsulation and controlled release of vitamin B2,‖ International Journal of
Biological Macromolecules, vol. 71, pp. 141–146, 2014.
293
[453] B. SARMENTO, D. FERREIRA, F. VEIGA, A. RIBEIRO, ―Characterization of insuli
n-loaded alginate nanoparticles produced by ionotropic pre-gelation through DSC and FTIR
studies,‖ Carbohydrate Polymers, vol. 66, no. 1, pp. 1–7, 2006.
[454] P. W. S. Heng, L. W. Chan, T. W. Wong, ―Formation of alginate microspheres produc
ed using emulsification technique,‖ Journal of Microencapsulation, vol. 20, no. 3, pp. 401–4
13, 2003.
[455] E. Belyaeva, D. D. Valle, R. J. Neufeld, D. Poncelet, ―New approach to the formulatio
n of hydrogel beads by emulsification/thermal gelation using a static mixer,‖ Chemical Engi
neering Science, vol. 59, no. 14, pp. 2913–2920, 2004.
[456] S. Iwamoto, K. Nakagawa, S. Sugiura, M. Nakajima, ―Preparation of Gelatin Microbe
ads With a Narrow Size Distribution Using Microchannel Emulsification,‖ AAPS PharmSci
Tech, vol. 03, no. 03, p. e25, 2002.
[457] S. Sajjadi, ―Effect of mixing protocol on formation of fine emulsions,‖ Chemical Engi
neering Science, vol. 61, no. 9, pp. 3009–3017, 2006.
[458] N. V. N. Jyothi, P. M. Prasanna, S. N. Sakarkar, K. S. Prabha, P. S. Ramaiah, G. Y. Sr
awan, ―Microencapsulation techniques, factors influencing encapsulation efficiency,‖ Journa
l of Microencapsulation, vol. 27, no. 3, pp. 187–197, 2010.
[459] M.-C. Raymond, R. J. Neufeld, D. Poncelet, ―Encapsulation of Brewers Yeast in Chito
san Coated Carrageenan Microspheres by Emulsification/Thermal Gelation,‖ Artificial Cells
, Blood Substitutes, and Biotechnology, vol. 32, no. 2, pp. 275–291, 2004.
[460] T. Wang N. He, ―Preparation, characterization and applications of low-molecular-wei
ght alginate–oligochitosan nanocapsules,‖ Nanoscale, vol. 2, no. 2, pp. 230–239, 2010.
[461] Z. Zhang, R. Zhang, L. Zou, L. Chen, Y. Ahmed, W. Al Bishri, K. Balamash, D. J. Mc
Clements, ―Encapsulation of curcumin in polysaccharide-based hydrogel beads: Impact of b
ead type on lipid digestion and curcumin bioaccessibility,‖ Food Hydrocolloids, vol. 58, pp.
160–170, 2016.
294
[462] Srinidhi M, Manjugowda MR, Jayanthi C and Srikanth A, Coacervation method for pr
eparation of curcumin micro particles using natural polymer casein, World Journal of Pharm
acy and Pharmaceutical Sciences, Volume 4, Issue 06, 293-304, 2015
[463] B.Gander, M.J. Blanco-Príeto, C.Thomasin, Ch.Wandrey, D.Hunkeler, Coacervation
and Phase Separation, Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Third Edition, 2013
[464] C. G. de Kruif, F. Weinbreck, R. de Vries, ―Complex coacervation of proteins and ani
onic polysaccharides,‖ Current Opinion in Colloid & Interface Science, vol. 9, no. 5, pp. 340
–349, 2004.
[465] C. L. Cooper, P. L. Dubin, A. B. Kayitmazer, S. Turksen, ―Polyelectrolyte–protein co
mplexes,‖ Current Opinion in Colloid & Interface Science, vol. 10, no. 1–2, pp. 52–78, 2005
.
[466] H. A. Aziz, K. K. Peh, Y. T. F. Tan, ―Solubility of Core Materials in Aqueous Polyme
ric Solution Effect on Microencapsulation of Curcumin,‖ Drug Development and Industrial
Pharmacy, vol. 33, no. 11, pp. 1263–1272, 2007.
[467]T. M. S. Chang, ―Semipermeable Microcapsules,‖ Science, vol. 146, no. 3643, pp. 524
–525, 1964.
[468] I. D. Alvim, C. R. F. Grosso, ―Microparticles obtained by complex coacervation: influ
ence of the type of reticulation and the drying process on the release of the core material,‖ C
iênc. Tecnol. Aliment., vol. 30, no. 4, pp. 1069–1076, 2010.
[469] G. A. Rocha-Selmi, C. S. Favaro-Trindade, C. R. F. Grosso, ―Morphology, Stability, a
nd Application of Lycopene Microcapsules Produced by Complex Coacervation,‖ Journal of
Chemistry, vol. 2013, pp. 1–7, 2013.
[470] N. Al-Zoubi, H. S. AlKhatib, Y. Bustanji, K. Aiedeh, S. Malamataris, ―Sustained-relea
se of buspirone HCl by co spray-drying with aqueous polymeric dispersions,‖ European Jour
nal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, vol. 69, no. 2, pp. 735–742, 2008.
[471] J. Elversson, A. Millqvist-Fureby, ―In situ coating—An approach for particle modifica
tion and encapsulation of proteins during spray-drying,‖ International Journal of Pharmaceut
ics, vol. 323, no. 1–2, pp. 52–63, 2006.
295
[472] G. Luna-Solano, M. A. Salgado-Cervantes, G. C. Rodríguez-Jimenes, M. A. García-Al
varado, ―Optimization of brewer‘s yeast spray drying process,‖ Journal of Food Engineering
, vol. 68, no. 1, pp. 9–18, 2005.
[473] K. Donadel, M. D. V. Felisberto, V. T. Fávere, M. Rigoni, N. J. Batistela, M. C. M. La
ranjeira, ―Synthesis and characterization of the iron oxide magnetic particles coated with chi
tosan biopolymer,‖ Materials Science and Engineering: C, vol. 28, no. 4, pp. 509–514, 2008.
[474] I. M. El-Sherbiny, H. D. C. Smyth, ―Controlled Release Pulmonary Administration of
Curcumin Using Swellable Biocompatible Microparticles,‖ Molecular Pharmaceutics, vol. 9
, no. 2, pp. 269–280, 2012.
[475] J. Gómez-Estaca, R. Gavara, P. Hernández-Muñoz, ―Encapsulation of curcumin in ele
ctrosprayed gelatin microspheres enhances its bioaccessibility and widens its uses in food ap
plications,‖ Innovative Food Science & Emerging Technologies, vol. 29, pp. 302–307, 2015.
[476] Y. Wang, Z. Lu, F. Lv, X. Bie, ―Study on microencapsulation of curcumin pigments b
y spray drying,‖ European Food Research and Technology, vol. 229, no. 3, pp. 391–396, 20
09.
[477] A. Nag, K.-S. Han, H. Singh, ―Microencapsulation of probiotic bacteria using pH-indu
ced gelation of sodium caseinate and gellan gum,‖ International Dairy Journal, vol. 21, no. 4
, pp. 247–253, 2011.
[478] M. T. Gokmen, F. E. Du Prez, ―Porous polymer particles—A comprehensive guide to
synthesis, characterization, functionalization and applications,‖ Progress in Polymer Science
, vol. 37, no. 3, pp. 365–405, 2012.
[479] I. Orienti, K. Aiedeh, E. Gianasi, C. Ponti, V. Zecchi, ―Chitosan-Indomethacin Conjug
ates. Effect of Different Substituents on the Polysaccharide Molecule on Drug Release,‖ Arc
hiv der Pharmazie, vol. 329, no. 5, pp. 245–250, 1996.
[480] M. A. Malik, M. Y. Wani, M. A. Hashim, ―Microemulsion method: A novel route to s
ynthesize organic and inorganic nanomaterials,‖ Arabian Journal of Chemistry, vol. 5, no. 4,
pp. 397–417, 2012.
296
[481]B. N. Singh, L. D. Trombetta, K. H. Kim, ―Biodegradation Behavior of Gellan Gum in
Simulated Colonic Media,‖ Pharmaceutical Development and Technology, vol. 9, no. 4, pp.
399–407, 2004.
[482] Tokumitsu H, Ichikawa H, Fukumori Y. Chitosan–gadopentetic acid complexnanopart
icles for gadolinium neutron capture therapy of cancer: Preparation by novel emulsion-dropl
et coalescence technique and characterization. Pharm Res.;16:1830–5, (1999)
[483] B. F. Gibbs, Selim Kermasha, Inteaz Al, ―Encapsulation in the food industry: a review
,‖ International Journal of Food Sciences and Nutrition, vol. 50, no. 3, pp. 213–224, 1999.
[484] Analava Mitra and Baishakhi Dey, Chitosan Microspheres in Novel Drug Delivery
Systems, Indian J Pharm Sci. Jul-Aug; 73(4), 355–366, (2011)
[485] Shashank Tiwari and Prerana Verma, Microencapsulation technique by solvent
evaporation method(Study of effect of process variables), INTERNATIONAL JOURNAL
OF PHARMACY & LIFE SCIENCES, 2(8): Aug., 2011, 998-1005
[486] S. A. Agnihotri, T. M. Aminabhavi, ―Controlled release of clozapine through chitosan
microparticles prepared by a novel method,‖ Journal of Controlled Release, vol. 96, no. 2, p
p. 245–259, 2004.
[487] G. B. Sukhorukov, E. Donath, H. Lichtenfeld, E. Knippel, M. Knippel, A. Budde, H.
Möhwald, ―Layer-by-layer self assembly of polyelectrolytes on colloidal particles,‖ Colloids
and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, vol. 137, no. 1–3, pp. 253–266,
1998.
[488] I. L. Radtchenko, G. B. Sukhorukov, H. Möhwald, ―Incorporation of macromolecules
into polyelectrolyte micro- and nanocapsules via surface controlled precipitation on colloida
l particles,‖ Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, vol. 202, n
o. 2–3, pp. 127–133, 2002.
[489] F. W. Bai, W. A. Anderson, M. Moo-Young, ―Ethanol fermentation technologies from
sugar and starch feedstocks,‖ Biotechnology Advances, vol. 26, no. 1, pp. 89–105, 2008.
[490] F.W. Bai, L.J. Chen, Z. Zhang, W.A. Anderson, M. Moo-Young, ―Continuous ethanol
production and evaluation of yeast cell lysis and viability loss under very high gravity mediu
m conditions,‖ Journal of Biotechnology, vol. 110, no. 3, pp. 287–293, 2004.
297
[491] J. Hill, E. Nelson, D. Tilman, S. Polasky, D. Tiffany, ―Environmental, economic, and
energetic costs and benefits of biodiesel and ethanol biofuels,‖ Proceedings of the National
Academy of Sciences, vol. 103, no. 30, pp. 11206–11210, 2006.
[492] Blieck L, Toye G, Dumortier F, Vertrepen KJ, Delvaux FD, Thevelein JM, Vandijck P
(2007). Isolation and characterization of brewer‘s yeast variants with improvedfermentation
performance under high-gravity conditions. Appl. Environ. Microbiol.73:815-824
[493] D. Silva, T. Brányik, G. Dragone, A. Vicente, J. Teixeira, J. Almeida e Silva, ―High gr
avity batch and continuous processes for beer production: Evaluation of fermentation perfor
mance and beer quality,‖ Chemical Papers, vol. 62, no. 1, 2008.
[494] Y. Kourkoutas, M. Kanellaki, A. A. Koutinas, C. Tzia, ―Effect of fermentation conditi
ons and immobilization supports on the wine making,‖ Journal of Food Engineering, vol. 69,
no. 1, pp. 115–123, 2005.
[495] J. O. Westman, C. J. Franzén, ―Current progress in high cell density yeast bioprocesse
s for bioethanol production,‖ Biotechnology Journal, vol. 10, no. 8, pp. 1185–1195, 2015.
[496] Ivanova, V., Petrova, P., Hristov, J., 2011. Application in the Ethanol Fermentation of
Immobilized Yeast Cells in Matrix of Alginate/Magnetic nanoparticles, on Chitosan-Magnet
ite Microparticles and Cellulose-coated Magnetic nanoparticles. Int. Rev. Chem. Eng. 3, 289
–299
[497] A. Groboillot, D. K. Boadi, D. Poncelet, R. J. Neufeld, ―Immobilization of Cells for A
pplication in the Food Industry,‖ Critical Reviews in Biotechnology, vol. 14, no. 2, pp. 75–1
07, 1994.
[498] P. J. Verbelen, D. P. De Schutter, F. Delvaux, K. J. Verstrepen, F. R. Delvaux, ―Immo
bilized yeast cell systems for continuous fermentation applications,‖ Biotechnol Lett, vol. 28
, no. 19, pp. 1515–1525, 2006.
[499] T. Brányik, A. A. Vicente, J. M. Machado Cruz, J. A. Teixeira, Biotechnology Letters,
vol. 23, no. 13, pp. 1073–1078, 2001.
298
[500] J. C. Duarte, J. A. R. Rodrigues, P. J. S. Moran, G. P. Valença, J. R. Nunhez, ―Effect o
f immobilized cells in calcium alginate beads in alcoholic fermentation,‖ AMB Express, vol.
3, no. 1, p. 31, 2013.
[501] S. Rathore, P. M. Desai, C. V. Liew, L. W. Chan, P. W. S. Heng, ―Microencapsulation
of microbial cells,‖ Journal of Food Engineering, vol. 116, no. 2, pp. 369–381, 2013.
[502] R. P. John, R. D. Tyagi, S. K. Brar, R. Y. Surampalli, D. Prévost, ―Bio-encapsulation
of microbial cells for targeted agricultural delivery,‖ Critical Reviews in Biotechnology, vol.
31, no. 3, pp. 211–226, 2010.
[503] D. Sarayd n, H. N. Öztop, E. Karadağ, A. Y. Öztop, Y. Iş kver, O. Güven, ―The use of
immobilized Saccharomyces cerevisiae on radiation crosslinked acrylamide–maleic acid hyd
rogel carriers for production of ethyl alcohol,‖ Process Biochemistry, vol. 37, no. 12, pp. 13
51–1357, 2002.
[504] G.M.S.G. Baptista, J.M.A. Cóias, A.C.M. Oliveira and J.M.S. Rocha, Immobilisation
of yeasts for continuous fermentation, Communicating Current Research and Educational
Topics and Trends in Applied Microbiology A. Méndez-Vilas (Ed.) pages 418-425, 2004
[505] M. Daria Fumi, G. Trioli, O. Colagrande, ―Preliminary assessment on the use of immo
bilized yeast cells in sodium alginate for sparkling wine processes,‖ Biotechnology Letters,
vol. 9, no. 5, pp. 339–342, 1987.
[506] I.-K. Yoo, G. H. Seong, H. N. Chang, J. K. Park, ―Encapsulation of Lactobacillus case
i cells in liquid-core alginate capsules for lactic acid production,‖ Enzyme and Microbial Te
chnology, vol. 19, no. 6, pp. 428–433, 1996.
[507] E. Corton, M. Piuri, F. Battaglini, S. M. Ruzal, ―Characterization of Lactobacillus Car
bohydrate Fermentation Activity Using Immobilized Cell Technique,‖ Biotechnology Progr
ess, vol. 16, no. 1, pp. 59–63, 2000.
[508] A. Idris, W. Suzana, ―Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial p
H and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized Lacto
bacillus delbrueckii,‖ Process Biochemistry, vol. 41, no. 5, pp. 1117–1123, 2006.
299
[509] L. M. D. Goncalves, M. T. O. Barreto, A. M. B. R. Xavier, M. J. T. Carrondo, J. Klein
, ―Inert supports for lactic acid fermentation. A technological assessment,‖ Applied Microbi
ology and Biotechnology, vol. 38, no. 3, 1992.
[510] E. P. Bardi, A. A. Koutinas, ―Immobilization of yeast on delignified cellulosic materia
l for room temperature and low-temperature wine making,‖ Journal of Agricultural and Food
Chemistry, vol. 42, no. 1, pp. 221–226, 1994.
[511] P. Loukatos, M. Kiaris, I. Ligas, G. Bourgos, M. Kanellaki, M. Komaitis, A. A. Kouti
nas, ―Continuous Wine Making by γ-Alumina-Supported Biocatalyst,‖ Applied Biochemistr
y and Biotechnology, vol. 89, no. 1, pp. 1–14, 2000.
[512] L. Inama, S. Diré, G. Carturan, A. Cavazza, ―Entrapment of viable microorganisms by
SiO2 sol-gel layers on glass surfaces: Trapping, catalytic performance and immobilization d
urability of Saccharomyces cerevisiae,‖ Journal of Biotechnology, vol. 30, no. 2, pp. 197–21
0, 1993.
[513] G. Aykut, V. N. Hasirci, G. Alaeddinoglu, ―Immobilization of yeast cells in acrylamid
e gel matrix,‖ Biomaterials, vol. 9, no. 2, pp. 168–172, 1988.
[514] R. A. Peinado, J. J. Moreno, J. M. Villalba, J. A. González-Reyes, J. M. Ortega, J. C.
Mauricio, ―Yeast biocapsules: A new immobilization method and their applications,‖ Enzy
me and Microbial Technology, vol. 40, no. 1, pp. 79–84, 2006.
[515]A. Deshpande, S. F. D‘souza, G. B. Nadkarni, ―Coimmobilization of D-amino acid oxi
dase and catalase by entrapment ofTrigonopsis variabilis in radiation polymerised Polyacryl
amide beads,‖ Journal of Biosciences, vol. 11, no. 1–4, pp. 137–144, 1987.
[516] Obzturk B. Immobilization of lipase from Candida rugosa on hydrophobic and
hydrophilic supports. MSc dissertation. İzmir (Turkey): Izmir Institute of Technology; 2001.
p. 40
[517] D.E.El-Hadedy, Moataza M. Saad and Hassan H.M, 2014.Protease Inhibitor
Expression with Immobilized Cells of Egyptian Streptomyces lavendulae on Different
Radiated Matrices Using Gamma Radiation. World Journal of Pharmaceutical Sciences
ISSN (Print): 2321-3310; ISSN (Online): 2321-3086
300
[518] Nedovic VA, Cukalovic IL, Bezbradica D, Obradovic B, Bugarski B (2005) New
porous matrices and procedures for yeast cell immobilisation for primary beer fermentation.
In: Proceedings of the 30th European Brewery Convention. Prague, pp 401–413, ISBN 90-
70143-23-2.
[519] N. Gerbsch and R. Buchholz, The Role of Polymers for the delivery of live cells,
FEMS Microbiol. Rev., 1995, 16, 259–269
[250] S. Maicas, ―The use of alternative technologies to develop malolactic fermentation in
wine,‖ Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 56, no. 1–2, pp. 35–39, 2001.
[521] M. V. Dinu, M. M. Ozmen, E. S. Dragan, O. Okay, ―Freezing as a path to build macro
porous structures: Superfast responsive polyacrylamide hydrogels,‖ Polymer, vol. 48, no. 1,
pp. 195–204, 2007.
[522] A. Rosevear, ―Immobilised biocatalysts-a critical review,‖ J. Chem. Technol. Biotech
nol., vol. 34, no. 3, pp. 127–150, 2008.
[523] S. H. Hong, M. Shin, J. Lee, J. H. Ryu, S. Lee, J. W. Yang, W. D. Kim, H. Lee, ―STA
PLE: Stable Alginate Gel Prepared by Linkage Exchange from Ionic to Covalent Bonds,‖ A
dv. Healthcare Mater., vol. 5, no. 1, pp. 75–79, 2015.
[524] P. Tomme, N. R. Gilkes, R. C. Miller, A. J. Warren, D. G. Kilburn, ―An internal cellul
ose-binding domain meidates adsorption of an engineered bifunctional xylanase/cellulase,‖ ―
Protein Engineering, Design and Selection,‖ vol. 7, no. 1, pp. 117–123, 1994.
[525] T. Tatsuma, H. Tsuzuki, Y. Okawa, S. Yoshida, T. Watanabe, ―Bifunctional Langmuir
-Blodgett film for enzyme immobilization and amperometric biosensor sensitization,‖ Thin
Solid Films, vol. 202, no. 1, pp. 145–150, 1991.
[526] L.Michaelis., M.Ehrenreich, Biochem. J. 10: 283–290.1908
[527] K. Mosbach, ―Preface,‖ Immobilized Enzymes and Cells Part B, pp. 13–15, 1987.
[528] K. D. Le, N. R. Gilkes, D. G. Kilburn, R. C. Miller, J. N. Saddler, R. A. J. Warren, ―A
streptavidin-cellulose-binding domain fusion protein that binds biotinylated proteins to cellu
lose,‖ Enzyme and Microbial Technology, vol. 16, no. 6, pp. 496–500, 1994.
301
[529] T. R. Jack and J. E. Zajic, ―The immobilization of whole cells,‖ Advances in Biochem
ical Engineering, pp. 125–145, 1977.
[530] Banu, C., „Biotehnologii in industria alimentară‖, Editura Tehnică,
Bucureşti,2000
[531] B. M. Brena, F. Batista-Viera, ―Immobilization of Enzymes,‖ Methods in Biotechnolo
gy™, pp. 15–30, 2006.
[532] S.Nisha,S. Arun Karthick and Gobi, Chemical Science Review and Letters, 1(3), 148-
155, 2012
[533] M. Amid, Y. Manap, N. Zohdi, ―Microencapsulation of Purified Amylase Enzyme fro
m Pitaya (Hylocereus polyrhizus) Peel in Arabic Gum-Chitosan using Freeze Drying,‖ Mole
cules, vol. 19, no. 3, pp. 3731–3743, 2014.
[534] Sunita Singh, A comparitive study on immobilization of alpha amylase enzyme on
different matrices, International Journal of Plant, Animal and Environmental Sciences, 2014
IJPAES ISSN 2231-4490, 192-198
[535] Lily N. Meyer, Effect of Immobilization Method on Activity of Alpha-Amylase, A
Thesis, The Ohio State University The Ohio State University May 18, 2007
[536] A. Kumar, A. Ahuja, J. Ali, S. Baboota, ―Curcumin Loaded Nano Globules for Solubil
ity Enhancement: Preparation, Characterization and <I>Ex Vivo</I> Release Study,‖ Journa
l of Nanoscience and Nanotechnology, vol. 12, no. 11, pp. 8293–8302, 2012.
[537] H.-Z. Ouyang, L. Fang, L. Zhu, L. Zhang, X.-L. Ren, J. He, A.-D. Qi, ―Effect of exter
nal factors on the curcumin/2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin: in vitro and in vivo study,‖ Jou
rnal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, vol. 73, no. 1–4, pp. 423–433, 201
1.
[538] Wacker Chemie AG: Info sheet of CAVAMAX® W8 CURCUMIN
[539] K. Maiti, K. Mukherjee, A. Gantait, B. P. Saha, P. K. Mukherjee, ―Curcumin–phospho
lipid complex: Preparation, therapeutic evaluation and pharmacokinetic study in rats,‖ Intern
ational Journal of Pharmaceutics, vol. 330, no. 1–2, pp. 155–163, 2007.
[540] N. K. Gupta, V. K. Dixit, ―Bioavailability Enhancement of Curcumin by Complexatio
n with Phosphatidyl Choline,‖ Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 100, no. 5, pp. 1987
–1995, 2011.
302
[541] J. Cuomo, G. Appendino, A. S. Dern, E. Schneider, T. P. McKinnon, M. J. Brown, S.
Togni, B. M. Dixon, ―Comparative Absorption of a Standardized Curcuminoid Mixture and
Its Lecithin Formulation,‖ Journal of Natural Products, vol. 74, no. 4, pp. 664–669, 2011.
[542] V. Kakkar, S. Singh, D. Singla, I. P. Kaur, ―Exploring solid lipid nanoparticles to enha
nce the oral bioavailability of curcumin,‖ Molecular Nutrition & Food Research, vol. 55, no.
3, pp. 495–503, 2010.
[543] M. Fang, Jin, Bao, Gao, Xu, Wang, Wang, Yao, Liu, ―In vitro characterization and in
vivo evaluation of nanostructured lipid curcumin carriers for intragastric administration,‖ IJ
N, p. 5395, 2012.
[544] D. Matabudul, K. Pucaj, G. Bolger, B. Vcelar, M. Majeed, L. Helson, Anticancer Res,
32, 4359 (2012)
[545] L. Helson, G. Bolger, M. Majeed, B. Vcelar, K. Pucaj, D. Matabudul, Anticancer
Res,32, 4365 (2012)
[546] M. Takahashi, S. Uechi, K. Takara, Y. Asikin, K. Wada, ―Evaluation of an Oral Carrie
r System in Rats: Bioavailability and Antioxidant Properties of Liposome-Encapsulated Cur
cumin,‖ Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 57, no. 19, pp. 9141–9146, 2009.
[547] C. Li, Zhang, Su, Feng, Long, Chen, ―Silica-coated flexible liposomes as a nanohybrid
delivery system for enhanced oral bioavailability of curcumin,‖ IJN, p. 5995, 2012.
[548] L. Hu, Y. Jia, F. Niu, Z. Jia, X. Yang, K. Jiao, ―Preparation and Enhancement of Oral
Bioavailability of Curcumin Using Microemulsions Vehicle,‖ Journal of Agricultural and Fo
od Chemistry, vol. 60, no. 29, pp. 7137–7141, 2012.
[549] H. Yu, Q. Huang, ―Improving the Oral Bioavailability of Curcumin Using Novel Orga
nogel-Based Nanoemulsions,‖ Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 60, no. 21,
pp. 5373–5379, 2012.
[550] L. Zhongfa, M. Chiu, J. Wang, W. Chen, W. Yen, P. Fan-Havard, L. D. Yee, K. K. Ch
an, ―Enhancement of curcumin oral absorption and pharmacokinetics of curcuminoids and c
urcumin metabolites in mice,‖ Cancer Chemotherapy and Pharmacology, vol. 69, no. 3, pp.
679–689, 2011
303
[551] D. Guzman-Villanueva, I. M. El-Sherbiny, D. Herrera-Ruiz, H. D. C. Smyth, ―Design
andIn VitroEvaluation of a New Nano-Microparticulate System for Enhanced Aqueous-Phas
e Solubility of Curcumin,‖ BioMed Research International, vol. 2013, pp. 1–9, 2013.
[552] U. Gandapu, R. K. Chaitanya, G. Kishore, R. C. Reddy, A. K. Kondapi, ―Curcumin-L
oaded Apotransferrin Nanoparticles Provide Efficient Cellular Uptake and Effectively Inhibi
t HIV-1 Replication In Vitro,‖ PLoS ONE, vol. 6, no. 8, p. e23388, 2011.
[553] H. Sasaki, Y. Sunagawa, K. Takahashi, A. Imaizumi, H. Fukuda, T. Hashimoto, H. W
ada, Y. Katanasaka, H. Kakeya, M. Fujita, K. Hasegawa, T. Morimoto, ―Innovative Preparat
ion of Curcumin for Improved Oral Bioavailability,‖ Biological & Pharmaceutical Bulletin,
vol. 34, no. 5, pp. 660–665, 2011.
[554] Makino Y, Kurita T, Imaizumi A, Hashimoto T: Novel curcumin nano-suspensions
with enhanced oral bioavailability and stability. Presented to 10th France-Japan DDS
Symposium, October 13, 2012 (Bordeau, France)
[555] K. K. Cheng, C. F. Yeung, S. W. Ho, S. F. Chow, A. H. L. Chow, L. Baum, ―Highly S
tabilized Curcumin Nanoparticles Tested in an In Vitro Blood–Brain Barrier Model and in A
lzheimer‘s Disease Tg2576 Mice,‖ The AAPS Journal, vol. 15, no. 2, pp. 324–336, 2012.
[556] X. Xie, Q. Tao, Y. Zou, F. Zhang, M. Guo, Y. Wang, H. Wang, Q. Zhou, S. Yu, ―PLG
A Nanoparticles Improve the Oral Bioavailability of Curcumin in Rats: Characterizations an
d Mechanisms,‖ Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 59, no. 17, pp. 9280–9289
, 2011.
[557] J. Sun, C. Bi, H. M. Chan, S. Sun, Q. Zhang, Y. Zheng, ―Curcumin-loaded solid lipid
nanoparticles have prolonged in vitro antitumour activity, cellular uptake and improved in vi
vo bioavailability,‖ Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, vol. 111, pp. 367–375, 2013.
[558] T. Kurita, Y. Makino, „Novel Curcumin Oral Delivery Systems‖, Anticancer
Research, vol. 33 no. 7, pp. 2807-2821, 2013
[559] S. A. Haddad, C. C. Lindegren, „A Method for Determining the Weight of an
Individual Yeast Cell‖, Appl. Microbiol., vol. 1, pp. 153–156, 1953.
[560] P. Kandylis , D. Dimitrellou, A. A. Koutinas, „Winemaking by barley supported yeast
cells‖, Food Chemistry, vol. 130, pp. 425–431, 2012
304
[561] S. Torresi, M. T. Frangipane, G. Anelli, „Biotechnologies in sparkling wine
production. Interesting approaches for quality improvement: A review‖, Food Chemistry,
vol. 129, 1232–1241, 2011.
[561] A. A. Eddy, A. D. Rudin, „The Structure of the Yeast Cell Wall. I. Identification of
Charged Groups at the Surface‖, Proceedings of the Royal Society of London. Series B,
Biological Sciences, vol. 148, no. 932 (Mar. 18,), pp. 419-432, 1958.
[562] M. Malm, Changes in the Electrical Charge of Yeast Cells Treated with Sodium
Fluoride, Nature, vol 157, pp. 731-732, 1946.
[563] T. Tuszynski, A. Pasternakiewicz, ―Interaction of metal ions on the yeast growth
Saccharomyces cerevisiae in depending of medium pH‖, Chem. Inz. Ekol. vol. 6, no 5-6, pp.
720-728, 1999
[564] X. H. Yang, W. L. Zhu, ― Viscosity properties of sodium carboxymethylcellulose
solutions―, Cellulose, vol.14, pp. 409–417, 2007.
[565] P. N. Lipke and R. Ovalle, ―Cell Wall Architecture in Yeast: New Structure and New
Challenges‖, J. Bacteriol., vol. 180, no. 15, pp. 3735-3740, 1998.
[566] C. Zufall, T. Tyrell, ―The Influence of Heavy Metal Ions on Beer Flavour Stability,‖
Journal of the Institute of Brewing, vol. 114, no. 2, pp. 134–142, 2008.
[567] S. Liu, Y. Hou, W. Liu, C. Lu, W. Wang, S. Sun, „Components of the calcium-
calcineurin signaling pathway in fungal cells and their potential as antifungal targets‖,
Eukaryot Cell , vol.14, pp. 324 –334, 2015.
[568] N. W. Taylor, W. L. Orton, „Calcium in flocculence of Saccharomyces cerevisiae‖, J.
Inst. Brew, vol. 81, pp. 53-57, 1975.
[569] N. W. Taylor, W. L. Orton, Effect of alkaline-earth metal salts on flocculence in
Saccharomyces cerevisiae, J. Inst. Brew, vol. 79, pp. 294-297, 1973.
[570] H. Ruttloff, ―L. B. WINGARD, JR., E. KATCHALSKI-KATZIR und L.
GOLDSTEIN: Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol. 1: Immobilized Enzyme
Principles. 364 Seiten, 22 Abb., 111 Tab. Academic Press, New York, San Francisco,
London 1976. Preis: 29,50 $,‖ Nahrung, vol. 22, no. 5, pp. 521–521, 1978.
[571] P. de Vos, M. M. Faas, M. Spasojevic, J. Sikkema,‖ Encapsulation for preservation
of functionality and targeted delivery of bioactive food components‖, Int Dairy J, vol. 20,
no. 4, pp. 292-302, 2010.
[572] D. Poncelet, R. Lencki, C. Beaulieu, J. P. Halle, R. J. Neufeld, and A. Fournier,
―Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. I. Methodology,‖ Applied
Microbiology and Biotechnology, vol. 38, no. 1, Oct. 1992.
305