CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

306
UNIVERSITATEA TEHNICĂ ,, GHEORGHE ASACHI ” IAȘI FACULTATEA DE INGINERIE CHIMICĂ ȘI PROTECȚIA MEDIULUI CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE BIOPOLIMERI CU APLICAȚII ÎN INDUSTRIA ALIMENTARĂ -Teză de doctorat - Inginer chimist Camelia-Elene Iurciuc ( casatorita Tincu) Conducător științific Prof. em. dr. ing. dr.h.c. Marcel Popa Iași - 2016

Transcript of CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

Page 1: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

UNIVERSITATEA TEHNICĂ ,, GHEORGHE ASACHI ” IAȘI

FACULTATEA DE INGINERIE CHIMICĂ ȘI PROTECȚIA

MEDIULUI

CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE

HIDROGEL PE BAZĂ DE BIOPOLIMERI CU

APLICAȚII ÎN INDUSTRIA ALIMENTARĂ

-Teză de doctorat -

Inginer chimist Camelia-Elene Iurciuc ( casatorita Tincu)

Conducător științific

Prof. em. dr. ing. dr.h.c. Marcel Popa

Iași - 2016

Page 2: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

1

CUPRINS

Pg.

Introducere 6

CERCETARE BIBLIOGRAFICA 9

CAPITOLUL 1.Tipuri de compuși biologic activi utilizați în industria

alimentară

9

1.1.Celule de drojdie 9

1.1.1.Influența ionilor metalici asupra celulelor de drojdie și asupra eficienței

proceselor fermentative.

10

1.1.1.1 Magneziul 11

1.1.1.2. Zincul 15

1.1.1.3. Calciul 17

1.1.1.4. Manganul 18

1.1.1.5. Fierul 18

1.1.2. Procese fermentative 19

1.2. Enzime 20

1.2.1. Structura chimică a enzimelor 22

1.2.2. Tipuri de enzime 22

1.2.3. -Amilaza 23

1.2.3.1. Aplicații ale α-amilazei în medicină 25

1.2.3.2. Aplicații ale α-amilazei în industria alimentară 25

1.2.3.3. Amidonul-substrat pentru hidroliză 26

1.3. Substanțe nutraceutice 28

1.3.1 Tipuri de substanțe nutraceutice utilizate în industria alimentară 28

1.3.2 Curcumina: structură, proprietăți, aplicații 31

1.3.2.1.Separarea curcuminei 32

1.3.2.2. Caracteristici structurale ale curcuminei 33

1.3.2.3. Reactivitatea curcuminei 34

1.3.2.4. Studii farmacologice efectuate pe curcumină 38

CAPITOLUL 2. Polimeri utilizați pentru imobilizarea principiilor active în

industria alimentară

40

2.1. Polimeri naturali 40

2.1.1.Proteine 40

2.1.1.1. Proteine din plante 41

2.1.1.2. Proteine de origine animală 43

2.1.2. Polizaharide 44

Page 3: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

2

2.1.2.1. Gelanul 45

2.1.2.2. Derivați celulozici 57

2.1.2.3. Chitina/Chitosanul 61

2.1.2.4. Caragenanul 66

2.1.2.5. Alginații 68

2.1.2.6. Polimeri sintetici 69

CAPITOLUL 3. Metode de imobilizare 71

3.1. Metoda extruderii sau a gelifierii ionice 72

3.2. Metoda emulsiei 75

3.3. Coacervarea 76

3.4. Uscarea prin pulverizare 78

3.5. Alte metode de formare a micro/nanoparticulelor 80

3.5.1. Obţinerea particulelor din polimeri preformaţi 80

3.5.2. Obţinerea micro/nanoparticulelor prin reticularea polimerilor în soluţie

/suspensie

80

3.5.3. Metoda reticulării termice 80

3.5.4. Metoda micelelor inverse 81

3.5.5. Chelatizarea 81

3.5.6. Coalescenţa picăturilor de emulsie 81

3.5.7. Procedeul spray – chilling (pulverizare-congelare) 82

3.5.8. Procedeul spray - cooling (pulverizare – răcire) 82

3.5.9. Procedeul în pat fluidizat – (bed coating) 82

3.5.10. Extruderea centrifugală 83

3.5.11. Procedeul de extracţie /evaporare a solventului 83

3.5.12. Procedeul sitării/sortării 83

3.5.13. Procedeul de depunere strat cu strat (layer by layer) 83

CAPITOLUL 4. Metode de imobilizare a principiilor active cu utilizări în

industria alimentară

84

4.1. Imobilizarea celulelor de drojdie de bere 84

4.2. Metode de imobilizare a -amilazei 87

4.3. Metode de imobilizare a curcuminei 90

4.3.1. Complecși cu ciclodextrine 90

4.3.2. Complecși cu fosfatidilcolină 90

4.3.3. Nanoparticule lipidice 91

4.3.4. Lipozomi 91

4.3.5. Micro/nanoemulsii 92

4.3.6. Imobilizarea în particule de polimer 92

Page 4: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

3

REZULTATE PROPRII 94

Obiectivele lucrării 96

CAPITOLUL 5. Materiale, tehnici experimentale, metode de caracterizare 97

5.1. Materiale 96

5.2. Tehnici experimentale 99

5.2.1. Prepararea particulelor conținând celule de drojdie de bere imobilizate în

matrici polimere (polizaharide).

99

5.2.2. Prepararea particulelor conținând α-amilază imobilizată în matrice de

gelan.

101

5.2.3. Prepararea particulelor conținând cucrcumină imobilizată în matrici de

polizaharide

103

5.3. Tehnici de caracterizare 105

5.3.1. Spectroscopia FTIR-ATR 105

5.3.2. Morfologia particulelor (microscopie electronică de baleiaj) 105

5.3.3. Stabilitatea structurală a particulelor conținând drojdie de bere 106

5.3.4. Stabilitatea în diferite medii a sistemelor particulate conținând drojdie

de bere

107

5.3.5.Gradul de umflare 108

5.3.6.Viabilitatea celulară şi concentraţia celulelor de drojdie din medii apoase

și din particulele de imobilizat

109

5.3.7. Testarea activității fermentative a particulelor ce conțin celule de

drojdie.

112

5.3.8. Determinarea activității -amilazei libere și imobilizate 114

5.3.9.Determinarea constantei Michaelis-Menten și a vitezei maxime de

hidroliză -amilaza liberă și imobilizată

115

5.3.10. Influența pH-ului și a temperaturii asupra activității enzimatice 116

5.3.11.Testarea activității enzimatice a particulelor conținând enzimă

imobilizată, în mai multe cicluri hidrolitice

116

5.3.12.Cinetica eliberării curcuminei din particulele de imobilizat 117

CAPITOLUL 6. Obținerea de sisteme particulate pe bază de polizaharide

reticulate

ionic conținând celule de drojdie de bere imobilizate

118

6.1. Particule pe bază de gelan reticulat cu clorura de calciu conținând celule

de drojdie de bere imobilizate

119

6.1.1. Teste preliminare de obținere a particulelor de hidrogel 121

6.1.2.Stabilitatea particulelor și viabilitatea celulară 123

6.1.3. Gradul de umflare 126

6.1.4. Morfologia particulelor 127

6.1.5. Activitatea fermentativă a biorectoarelor 128

Page 5: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

4

6.1.6.Evaluarea viabilității celulare și a cantității de celule din particule după

fiecare ciclu de fermentare

133

6.1.7. Productivitatea specifică și viteza de fermentare 134

Concluzii 135

6.2. Particule pe bază de gelan reticulat cu acetat de magneziu conținând celule

de drojdie de bere imobilizate

135

6.2.1. Morfologia particulelor 139

6.2.2. Stabilitatea în apă şi viabilitatea celulară 140

6.2.3. Stabilitatea în soluții alcoolice și viabilitatea celulară 143

6.2.4. Caracteristicile de umflare în apă 143

6.2.5. Stabilitatea mecanică a particulelor evaluată prin teste reologice 145

6.2.6. Testarea activităţii fermentative a imobilizatelor 148

Concluzii 154

6.3. Particule pe bază de gelan reticulat cu acetat de zinc conținând celule de

drojdie de bere imobilizate

155

6.3.1. Stabilitatea particulelor și viabilitatea celulară 158

6.3.2. Stabilitatea mecanică a particulelor 161

6.3.3. Gradul de umflare 163

6.3.4. Morfologia particulelor 163

6.3.5. Activitatea fermentativă a particulelor ce conțin celule de drojdie 165

6.3.5.1. Influența concentrației de agent de reticulare din preextrudat. 165

6.3.5.2. Influența concentrației de acetat de zinc din baia de extrudere 167

6.3.5.3. Influența timpului de păstrare a particulelor în baia de extrudere 168

6.3.5.4. Influența pH-ului din baia de fermentare 170

6.3.5.5. Influența concentrației de acetat de zinc din baia de fermentare 171

6.3.6. Productivitatea specifică și viteza de fermentare 176

Concluzii 178

6.4. Particule pe bază de amestecuri de gelan și carboximetil celuloză

reticulate cu acetat de zinc, conținând celule de drojdie de bere imobilizate

179

6.4.1. Evaluarea stabilității și a viabilității celulare 181

6.4.2. Gradul de umflare în apă 185

6.4.3. Morfologia particulelor 186

6.4.4. Evaluarea capacității de fermentare a glucozei în prezența imobilizatelor

obținute în diferite condiții

187

6.4.5. Productivitatea specifică și viteza de fermentare 190

Concluzii 191

6.5. Particule pe bază de amestecuri de gelan, carboximetil celuloză și

caragenan reticulate cu acetat de zinc, conținând celule de drojdie de bere

191

Page 6: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

5

imobilizate

6.5.1. Caracterizarea particulelor prin spectroscopie FTIR-ATR 195

6.5.2. Stabilitatea în timp a particulelor fără celule de drojdie în diferite medii

(apoase)

196

6.5.3. Stabilitatea în timp a particulelor cu celule de drojdie imobilizate –

evaluarea concentrației de celule difuzate și a viabilității celulare

199

6.5.4. Capacitatea particulelor de a reține apa 201

6.5.5. Morfologia particulelor 203

6.5.6.Testarea activității fermentative a particulelelor ce conțin celule de

drojdie

205

6.5.7. Evaluarea viabilității celulare și a cantității de celule din particule după

fiecare ciclu de fermentare

211

6.5.8. Productivitatea specifică și viteza de fermentare 216

Concluzii 217

CAPITOLUL 7. Imobilizarea -amilazei în particule de gelan reticulat ionic. 219

7.1. Morfologia particulelor cu α-amilază imobilizată 223

7.2. Capacitatea de umflare în mediu apos 224

7.3. Caracterizarea enzimei libere 225

7.4. Determinarea constantei Michaelis-Menten și a vitezei maxime de

hidroliză

226

7.5. Influența pH-ului și a temperaturii asupra activității enzimei libere și

imobilizate

228

7.6. Testarea activității enzimatice a enzimei imobilizate în mai multe cicluri

hidrolitice

229

Concluzii 230

CAPITOLUL 8. Imobilizarea curcuminei în particule pe bază de polizaharide

complexate polielectrolitic și reticulate ionic cu acetat de magneziu

231

8.1. Morfologia particulelor 236

8.2. Capacitatea de umflare în medii apoase 236

8.3. Cinetica de eliberare a curcuminei din particule 237

Concluzii 240

CONCLUZII GENERALE 241

Bibliografie 247

Page 7: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

6

Introducere

Procesele biocatalitice stau la baza a numeroase tehnologii utilizate în prezent nu

doar în industria alimentară, ci și cea farmaceutică, cosmetică sau chiar chimică determinând

o preocupare continuă a cercetătorilor din domeniu.

Biotehnologiile utilizate în industria alimentară apelează frecvent la compuși

biologic activi ce catalizează fermentarea sau hidroliza unor substraturi prin a căror

transformare se obțin produși de mare interes și utilitate. De cele mai multe ori, procesele

tehnologice la care se apelează sunt discontinui, iar biocatalizatorul – fie microorganism,

celulă, enzimă – este greu de îndepărtat din mediul de reacție, nu mai poate fi reutilizat ca

orice alt catalizator clasic, complică operațiile de purificare pentru obținerea unui produs

pur, așa cum impune utilizarea sa ca aliment.

Aceste câteva aspecte explică cercetările continui care se fac în domeniu, ce se referă

în esență la imobilizarea diferitelor tipuri de biocatalizatori pe suporturi netoxice, conducând

la realizarea de noi formulări ușor de recuperat din mediile în care lucrează, capabile de a fi

reutilizate de un număr mare de ori în procese discontinui, sau de utilizare o durată mai mare

de timp în procese continui.

O categorie importantă de produse de interes nu doar din punct de vedere alimentar

ci și prin beneficiile aduse sănătății sunt nutraceuticele – îmbinare originală a doi termeni:

‖nutriție‖ și ‖farmaceutic‖. Solubilitatea și biodisponibiitatea adeseori reduse ale acestora

impun adeseori realizarea de formulări care să le îmbunătățească aceste caracteristici.

Pornind de la aceste premize, teza de doctorat își propune să aducă contribuții

originale pe trei direcții:

- obținerea de particule pe bază de polizaharide ionice gelifiate ionotrop, conținând

celule de drojdie de bere imobilizate, caracterizarea și testarea lor în procese de fermentare

a glucozei;

- obținerea de particule pe bază de gelan, reticulat ionic, conținând -amilază

imobilizată, caracterizarea lor și testarea în procesul de hidroliză a amidonului;

- realizarea unei noi formulări nutraceutice prin încapsularea curcuminei în porticule

pe bază de polizaharide ionice cu caracter diferit, complexate polielectrolitic și prin gelifiere

ionotropă, caracterizarea lor și testarea din punct de vedere al capacității de eliberare

controlată/susținută a principiului activ.

Teza este structurată în două părți, prima constituind-o un studiu bibliografic extins

asupra problemelor abordate în cea de a doua parte a lucrării, care prezintă rezutale proprii

obținute în urma cercetărilor efectuate. Lucrarea se întinde pe 305 pagini, conține un număr

Page 8: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

7

de 89 figuri, 44 tabele...scheme de reacție, 9 relații de calcul, încheindu-se cu concluziile

generale și cu lista referințelor bibliografice.

Studiul bibliografic este prezentat pe parcursul a 4 capitole ce tratează probleme

privind compușii biologic activi de interes pentru industria alimentară (cap. 1), polimerii

utilizați ca suport pentru imobilizarea acestora (cap. 2), tipurile de particule utilizabile

pentru încapsularea/includerea lor (cap. 3) și metodele generale de imobilizare a compușilor

biologic activi cu aplicații în industria alimentară (cap. 4).

Capitolul 5 prezintă materialele, tehnicile de lucru și de ceracterizare utilizate.

Capitolul 6 deschide seria celor 3 capitole care raportează rezultatele originale

obținute în cadrul lucrării. Având o extindere mai matre, el tratează pe parcursul a 5

subcapitole diferite tipuri de imobilizate pentru celule de drojdie de bere, obținute utilizând

polizaharide ionice și diferiți agenți reticulanți de tipul cationilor metalici divalenți. Primele

trei subcapitole prezintă imobilizate pe bază de gelan reticulat cu cationi de Ca2+

, Mg2+

, Zn2+

relevând caracteristicile morfologice, fizico-chimice și biochimice ale acestora.

Următoarele subcapitole discută obțierea de particule pe bază de amestecuri de polizaharide

(binar, ternar) – gelan, carboximetil celuloză sare de sodiu, caregenan -, relevând ca și

anterior proprietățile imobilizatelor cu accent pe capacitatea de a cataliza fermentarea

glucozei.

Capitolul 7 prezintă obținerea prin procedeul amintit anterior și caracterizarea fizico-

chimică și din punct de vedere al acțiunii biocatalitice, a unor particule pe bază de gelan

conținând imobilizată -amilaza.

Ultimul capitol (8) se referă la obținerea unei noi formulări nutraceutice conținând

curcumină, având comun cu cele precedente suportul polimeric pentru imobilizare

(polizaharide ionice) și parțial metode de obținere care implică însă nu doar gelifierea

ionotropă ci și complexarea polielectrolitică. Particulele obținute sunt catracterizate

morfologic, fizico-chimic și din punct de vedere al capacității de includere dar îndeosebi de

eliberare a curcuminei.

La finalul lucrării sunt prezentate concluziile generale și lista bibliografică.

Rezultatele cercetărilor efectuate au fost valorificate prin elaborarea a 10 lucrări

științifice care se află în următoarele stadii:

- 3 lucrări publicate (2 în reviste cu coeficient de impact)

- 2 lucrări acceptate pentru publicare (1 în revistă cu coeficient de impact)

- 7 lucrări redactate, trimise la reviste cu coeficient de impact

Page 9: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

8

- 13 comunicări la manifestări științifice interne (2) și internaționale (11) între care

7 comunicări orale.

Page 10: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

9

CAPITOLUL 1

Tipuri de compuși biologic activi utilizați în industria alimentară

Industria farmaceutică utilizează predominant compuși naturali și biotehnologii

pentru procesarea acestora. O categorie importrantă o constituie compușii cu activitate

biologică, ce au acțiune fie în biotehnologiile de procesare, fie în produsul rezultat.

In cele ce urmează va fi efectuată o prezentare a 3 tipuri de compuși biologic activi,

selectați pentru cercetările întreprinse în cadrul tezei de doctorat.

1.1. Celule de drojdie

Saccharomyces cerevisiae sunt microorganisme eucariote clasificate în domeniul

fungilor. Sunt cunoscute ca drojdii de bere sau de panificație și sunt utilizate în industria de

panificație sau pentru producerea berii. Celulele se reproduc asexuat prin înmugurire iar

diametrul lor este cuprinsă între 3-4 μm. Drojdiile Saccharomyces cerevisiae sunt facultativ

anaerobe, dar pot supraviețui atât în condiții anaerobe cât și aerobe.

Drojdia de panificație reprezintă o masă de celule vii Saccharomyces cerevisiae. În

prezența glucozei utilizată ca sursă de carbon, în condiții anaerobe, se produce etanol ca un

rezultat al procesului de fermentare a glucozei. Atunci când celule de drojdie sunt cultivate

cu melasă în condiții aerobe, se produc cantități mari de drojdie, cunoscută și comercializată

ca drojdie de panificație [1-3].

Istoria drojdiei este foarte veche, prima înregistrare a existenței pâinii a fost în anul

266 Î.H., în Babilonia. Se crede că egiptenii antici au fost primii care au descoperit pâinea

dospită, preparată pentru prima dată prin amestecarea berii în fermentație cu făină de grâu.

În anul 1780 drojdia era produsă prin utilizarea a 70% secară și 30% malț urmând procesul

de fermentare iar apoi separarea drojdiei. Randamentul de producție a drojdiei a crescut

atunci după anul 1840, când în Austria a început să fie utilizat porumbul în scopul producerii

sale.

Primele studii ale proceselor fermentative au început cu Pasteur în 1860. După

1870 a fost fondat la Berlin primul laborator experimental. Descoperirea aerării a fost

eficientă pentru fermentarea drojdiei și prima drojdie uscată a fost obținută în 1890. Melasa

a fost introdusă în procesul de producere a drojdiei de panificație în 1915, în Germania.

Modificări ale procedeului de producere a drojdie de panificație sunt aduse ți în zilele

noastre.

Materia primă utilizată pentru producția drojdiei de panificație este melasa, bogată

în surse de carbon și ioni importanți pentru metabolismul drojdiei, cu un conținut de 40-55%

Page 11: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

10

în greutate zaharuri, în formă de zaharoză. Nutrienții și mineralele necesare în producția de

drojdie se găsesc în melasă și cei mai importanți sunt: azot, potasiu, fosfați, magneziu, calciu

și urme de fier, zinc, mangan și molibden [4].

Pentru cercetările efectuate în cadrul tezei a fost selectată o tulpină de drojdie

comercială, de panificatie, care se găsește sub formă comprimată și are un conținut de apă de

70%. Ea reprezintă o biomasă de celule din specia Saccharomyces cerevisiae (drojdie de

fermentație superioară), formată de celule vii, capabile să producă fermentarea zaharurilor

cu formarea de alcool etilic și dioxid de carbon. [4-9]. Caracteristicile celulei sunt: diametrul

-2-8 μm; volumul: 0,8-2 x10-3

cm3; greutatea: 0,2-0,4x 10

-10 g, numărul de celule/g: 8-14

x109; suprafața per g: 8-14 x10

9. Aceste celule absorb cel mai ușor hexozele (glucoza), apoi

zaharoza și maltoza. Celula de drojdie este constituită dintr-o varietate de biopolimeri și

macromolecule [5-9].

Cunoașterea compoziției lor și a cantității este esențială pentru metabolism și pentru

analiza creșterii biomasei. Biomasa de celule Saccharomyces cerevisiae este constituită din

cinci grupe de macromolecule: proteine, carbohidrați, lipide, ARN și ADN [10].

1.1.1. Influența ionilor metalici asupra celulelor de drojdie și asupra eficienței

proceselor fermentative.

Celulele de drojdie necesită o gamă largă de metale pentru creșterea lor și pentru

metabolism. Cercetările efectuate au evidențiat faptul că ionii metalici pot avea un impact

major asupra progresului, creșterii eficienței proceselor fermentative industriale și asupra

unor parametri importanți, inclusiv în viteza de conversie a zahărului în etanol, în

randamentul final în etanol, în creșterea și multiplicarea drojdiei, asupra viabilității celulare,

asupra factorilor de stres și asupra comportamentului de floculare a drojdiei.

Metale cum ar fi magneziul și potasiul sunt necesare, în general, pentru creșterea

celulelor de drojdie și se utilizează în concentrații milimolare în timp ce altele precum

calciul și zincul în cantități micromolare sunt necesare celulei pentru a-și îndeplini funcțiile

fiziologice [11,12]. Metalele grele însă pot fi toxice pentru celulele de drojdie [13].

În procesele fermentative pentru obținerea berii, ionii metalici principali sunt

reprezentați de către magneziu și zinc, care acționează ca și cofactori pentru multe enzime

glicolitice importante și, de asemenea, ca modulatori la factorii de stres pentru drojdie.

În cazul proceselor industriale factorii de stres care pot afecta celulele de drojdie

rezultă din produsele secundare produse de etanol (metaboliții) și de natura sistemului în

Page 12: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

11

care sunt utilizate. Un alt factor de stres pentru celulele de drojdie poate fi un mediu

deficient în nutrienți. [14, 15]

Condițiile de mediu care duc la apariția factorilor de stres pot fi fluctuații rapide de

temperatură, presiune osmotică ridicată, concentrația crescută în etanol și lipsa nutrienților

care afectează în mod negativ metabolismul celulelor de drojdie detrminând astfel un proces

de fermentare ineficient. [16,17]

Celulele de drojdie afectate de factorii de stres sunt identificate printr-o creștere a

capacității lor de acidifiere odată cu transferul într-un mediu bogat nutritiv. [18] Cercetările

efectuate au constatat faptul că performantele celulelor de drojdie sunt afectate diferit de

factorii de stres menționați anterior și rezistența lor la acești factori depinde de tulpina

drojdiei, starea fiziologică a celulei, natura fizico-chimică a mediului de fermentare și de

prezența altor microorganisme cum ar fi drojdia sălbatică și bacteriile. [19]

Rezultatele cercetărilor au evidențiat faptul că toleranța la factorii de stres a

celulelor este dependentă de compoziția nutrițională a mediului de fermentare. [20, 21]

Compoziția mediului include surse de carbon, azot și câțiva ioni metalici care ajută la

creșterea performanței fermentării. Ionii metalici mențin integritatea structurală și

funcționalitatea organitelor intracelulare, induse de interacțiunile celulă-celulă cum ar fi

flocularea, reglarea expresiei genelor, mecanismul de absorbție a nutrienților, activarea

enzimelor implicate în metabolism și de asemenea acționează ca protectori la factorii de

stres. [22-27]

Drojdiile au capacitatea de a absorbi foarte eficient mineralele esențiale din mediu

și să le excludă pe cele neesențiale. Magneziul și zincul sunt absorbite în mod activ din

mustul de bere pentru a-și îndeplini rolurile fiziologice esențiale. Biodisponibilitatea ionilor

metalici în mediul de fermentare este un factor important care influențează fiziologia celulei

de drojdie și obținerea produșilor de fermentație a drojdiei. [28]

1.1.1.1 Magneziul

Ionul divalent de magneziu este cel mai abundent, implicat într-o gamă largă de

procese biologice. [29-31] El constituie cam 0,3% din întreaga masă de drojdie uscată [32]

și activează peste 300 de enzime [22,33]. Menținerea integrității celulare, ceea ce include

stabilizarea structurală a acizilor nucleici, a plinucleotidelor, a cromozomilor,

polizaharidelor și lipidelor au fost atribuite magneziului. [27]. Mg2+

este un cofactor esențial

pentru enzime și componentul structural cheie în cele mai multe molecule biologice dar

identitatea moleculară a reglării sale în celula de drojdie este încă slab elucidată. [31]

Membranele periplasmatice ale drojdiei mitocondriale și cele mai importante, vacuolare,

Page 13: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

12

sunt identificate a fi canale și depozite ale ionilor metalici prin care aportul ionilor Mg2+

este

reglat prin medierea proteinelor de transport, de care se leagă. Reglarea aportului de

magneziu în celulele de drojdie are loc în două faze: chemosorbția și bioacumularea. [31,

34]

Chemosorbția este prima fază a absorbției pentru transport, fiind dependentă de

structura (permeabilitatea) peretelui celular al drojdiei. Acesta este constituit în mare parte

din β-1,3-glucan (până la 50% din compozitia peretelui celular), manoproteine (40%) și β-

1,6-glucan (10 %).[35] Servește ca loc de legare pentru magneziu datorită prezenței grupelor

anionice încărcate negativ (fosfonat, carboxil, hidroxil și amine) prezente pe stratul exterior

al peretelui celular [12, 31]. Dinamismul magneziului la nivelul peretelui celular a fost

raportat a fi afectat în mod semnificat de temperatură, pH, numărul celulelor viabile și nu în

ultimul rând de prezența altor ioni. [36] Cercetările efectuate au recomandat temperatura

optimă și variația pH-ului între anumite limite, respectiv T=25-35˚C și pH=4-8 pentru

creșterea absorbției ionilor metalici. [37, 38]

Au fost stabilite corelații antagoniste ale ionului Mg2+

cu alți ioni metalici cum ar fi

stronțiul, pe care îl elimină parțial din vacuolele celulare în cadrul activității celulelor

consolidate (Avery si Tolin, 1992). Cadmiul afectează negativ procesul de legare a

cationului Mg2+

, iar magneziul scade capacitatea celulei de drojdie de a absorbi zincul. [36,

39, 40]

Un alt factor important pentru absorbția magneziului este vitalitatea celulară. Un

efect inhibitor în procesul de legare al ionului metalic în celule cu volume mari a fost

raportat de Park și colab. (2003) [36], deși celulele foarte viabile s-au dovedit a se lega în

mod activ la magneziu.[31, 39]

Influența diferitelor condiții de mediu, a surselor de carbon și azot asupra creșterii

celulare și asupra biodisponibilității magneziului au fost arătate în cercetările privind

procesele de obținere a berii și a fost dovedit faptul ca ionul Mg2+ este esențial pentru

creșterea celulelor de drojdie.[28]

Bioacumularea este a 2-a fază în procesul de transport al ionului de Mg2+

și implică

absorbția magneziului din peretele celular și membrana citoplasmatică în citoplasma

celulelor de drojdie. Acumularea intracelulară de magneziu este mediată de către principalul

transportor al proteinelor de care magneziul este legat și anume Alr1p și Alr2p (aluminium –

resistance permeases) și sunt codate ca și gene ALR1 și ALR2. [31, 32, 34]. Ambele

proteine de transport fac parte din proteinele membranare integrate, numite și transportori de

ioni metalici (TIM). Acestea au asemănări în ceea ce privește structura, masa moleculară și

Page 14: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

13

punctul izoelectric [31, 32] și se presupune că împart aceeași linie de activitate. Inactivarea

ambelor proteine de transport opresc creșterea dependentă de magneziu a celulelor dar și

afectarea absorbției de magneziu în drojdie. [31, 41]

Procesu de bioacumulare are un ritm mai lent în comparație cu procesul de

chemosorbție.[34] Ionul de magneziu eliberat este ulterior sechestrat de polifosfații

intracelulari, ARN și ATP, lăsând o cantitate mică de magneziu liberă,disponibilă pentru

procese biochimice cum ar fi activarea enzimelor, reglarea pH-ului intracelular,

osmoreglarea, stabilizarea proteinelor și a membranelor și semnalizarea căii de transducție.

[32]

Magneziul poate restabili creșterea celulară în Schizosaccharomyces pombe, a cărui

diviziune celulară a fost inițial inhibată cu un metal chelator ionofor A23187. [32] Maynard

(1993) afirmă că celulele intră în fază staționară pentru producția maximă de etanol la o

concentrație minimă de zahăr atunci când concentrația ionilor de magneziu din mediul de

creștere este maximă. [31, 42]

Ionii de Mg2+ sunt esențiali pentru duplicarea ADN-ului, iar polimerazele și lipazele

au arătat o cerință pentru acest metal. Producerea de specii reactive de oxigen care sunt

cunoscute de a provoca daune ADN-ului s-a dovedit a fi redusă în mod semnificativ prin

creșterea concentrației de magneziu atât în celulele de drojdie cât și în organismul uman.

[42,43]

Walker (1998) [44] a raportat o îmbunătățire a viabilității celulelor de la 0 la 5 %

pentru drojdia de vin care a fost supusă unui șoc de etanol de 10-20% timp de 24 ore sub

concentrații de magneziu între 50-500 ppm.[44] Hu și colab. (2003) [45] au arătat că o

expunere a celulelor de drojdie la 20 % etanol conduce la moartea totală a celulelor, spre

deosebire de mediile unde a fost adăugat magneziu (85 ppm), unde viabilitatea celulară a

avut valori între 25-55% utilizând același mediu. [45]

De o importanță majoră a ionilor de magneziu este proprietatea acestora de a reduce

stresul în celulele de drojdie. Studiul lui Birch și Walker (2000) [27] demonstreză efectul

protector al ionilor de magneziu atât la temperatură cât și la metaboliții toxici din etanol

pentru celulele de drojdie. [27, 31]

Spre deosebire de relația antagonistă de bază Mg2+ și Ca

2+, studiile efectuate de

Trofimova și colab. (2010) [46] relevă faptul că aceste două metale pot reface complet

creșterea celulară și oferă stabilitate membranei pentru Blastomyces dermatidis și

Saccharomyces cerevisiae. [31, 46] S-a emis ipoteza că ambele metale cooperează,

Page 15: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

14

stabilizează și reduc fluctuațiile în fluiditatea membranei care a fost găsită a avea o funcție

importantă în rata de supraviețuire a drojdiilor. [31]

Cu toate acestea, s-a arătat că ionii de magneziu modelează cinetica calciului,

deoarece destabilizează complexele de calciu și contracarează în mod activ acțiunea de

legare a ionilor de calciu la liganzii intracelulari și extracelulari [47]. Alți cercetători au

identificat calciul ca și metal dominant în relația antagonistă, ca un rezultat al afinității

calciului pentru locurile de legare pe liganzi cum ar fi ATP și acizii nucleici [12, 14].

Ultimele cercetări demonstrează o corelație inversă între magneziu și calciu. Este

evident că competiția de dominare între cele două metale depinde enorm de concentrația lor;

un raport Mg:Ca în care magneziu are o concentrație mai mare are cel mai bun impact

asupra fiziologiei drojdiei și în procesele fermentative.[27, 31, 48]

Procesele fermentative în biotehnologie au un rol foarte important iar magneziul

influențează numeroase procese metabolice ale tulpinilor de drojdie comerciale. Piruvat

kinaza, hexokinaza, fosfofructokinaza, fosfoglicerat kinaza și enolaza necesită pentru

activitatea lor ionii de magneziu. S-a emis ipoteza că aceștia prezintă un rol care dictează

metabolismul piruvatului, astfel încât biodisponibilitatea sa în controlul metabolic al fluxului

de carbon, fie în dehidrogenaza piruvat sau în piruvat decarboxilaza este foarte importantă.

Ionii de magneziu controlează astfel procesele de respirație și pe cele fermentative în

celulele de drojdie.[22]

Villen și colab. (2009) au arătat că celule de drojdie ar necesita o cantitate mică

constantă de ioni de magneziu pentru a susține o productivitate ridicată în etanol, deoarece o

cantitate mai mare ar conduce la o acumulare excesivă de ioni de magneziu care nu

determină neapărat o eficiență mărită în fermentare. [50] O acumulare constantă de biomasă

de celule în prezența magneziului a fost raportată de Alexander și colab. (2009) [23] care

indică, de asemenea, importanța ionilor de magneziu în creșterea celulară și în faza activă în

formarea etanolului.[23]

S-a demonstrat că biodisponibilitatea magneziului exercită o influență pozitivă

asupra substratului de fermentare deoarece ameliorează impactul presiunii osmotice asupra

celulelor de drojdie. Comportamentul ordonat de floculare al celulelor de drojdie în timpul

procesului de fermentare a fost demostrat în timpul procesului de fermentare la o

concentrație de aproximativ 10 ppm ioni de Mg ce substitue Ca în condiții experimentale.

[14, 31]

Din aceste cercetări reiese deci faptul că biodisponibilitatea magneziului este un

indiciu de performanță fermentativă a drojdiei, dar suplimentarea mediului de fermentare cu

Page 16: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

15

ioni de magneziu trebuie efectuată cu precizie luând în considerare și alți parametri care ar

putea afecta biodisponibilitatea.[31]

1.1.1.2. Zincul

În procesele fermentative pentru obținerea berii ionii metalici cheie sunt

reprezentați de către magneziu și zinc, care acționează ca și cofactori pentru enzimele

glicolitice importante și, de asemenea, ajută la reducerea efectelor determinate de factorii de

stres asupra celulelor de drojdie. Zincul se utilizează în concentrații foarte mici, ca urme, cea

minimă fiind de 0,3 ppm. Este un cofactor pentru numeroase enzime biosintetice și

metabolice incluzând aici enzimele glicolitice și alcool dehidrogenaza. În plus, joacă un rol

important prin acțiunea sa asupra ADN-ului din proteinele de legare și afectează flocularea

celulelor de drojdie. Ionii de zinc au fost implicați în funcția activării alcool dehidrogenazei

care este esențială pentru formarea etanolului și este foarte important ca element structural

cheie. [28, 32] . Privarea drojdiei de ioni de zinc se utilizează pentru a preveni înmugurirea

sau creșterea celulelei Saccharomyces cerevisiae și rezultă adesea o fermentație lentă. [13]

Concentrația de zinc poate scade în timpul zdrobirii și în timpul fermentării

mustului deoarece ionul metalic creează complecși în borhotul precipitat. În consecință

nivele de zinc pot deveni compromise ceea ce conduce la o performanță scăzută în

fermentare. Un mediu deficient în zinc poate conduce la încetinire sau la o fermentație

incompletă. În plus față de impactul asupra enzimelor metabolice importante, zincul poate

avea un rol benefic asupra stabilității și dinamicii membranelor celulare. [51, 52]

Zincul este absorbit în mod activ de către celulele de drojdie din mediul de

fermentare pentru a îndeplini roluri fiziologice esențiale, fiind apoi transferat în vacuolele

din drojdie.[28]

Stewart și Russel(1998) au studiat rolul ionilor metalici în ceea ce privește

procesele fermentative din industria berii. Cele mai multe cercetări s-au concentrat până în

prezent pe rolul ionilor de Zn și Ca asupra influenței fermentării mustului și asupra

procesului de floculare a drojdiei. [53] Este demn de remarcat faptul că zincul este un

micronutrient esențial pentru drojdie și ocazional mustul de bere poate fi deficient în zinc,

având ca rezultat o eficiență scăzută în fermentare. [28, 53] Acest fenomen care poate duce

la încetinirea procesului de fermentare la obținerea berii și este dependent de tulpina de

drojdie dar poate surveni și atunci când concentrația de zinc din must este mai mică de 0,1

ppm. Zincul joacă un rol major în metabolismul fermentativ al drojdiei și pentru că poate

stimula absorbția de maltoză și maltotrioză de către celulele de drojdie, sporind astfel

vitezele de fermentare. [28]

Page 17: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

16

Elucidarea posibilelor efecte ale zincului asupra stabilității și dinamicii membranei

celulare pot determina în continuare îmbunătățiri ale fermentării. Zincul este preluat complet

și rapid de celulele de drojdie în timpul fermentării ceea ce conduce la concentrații scăzute și

variabile de zinc. Concentrațiile optime pentru o fermentare optimă sunt cuprinse între 0,5-

1ppm (0,25-0,5 mg/ml). Cu toate acestea, în procesele de fabricare a berii și în cele de

distilare, este important să se determine în fiecare situație concentrația optimă a ionilor de

zinc pentru a obține un randament crescut în etanol, deoarece concentrația de zinc depinde

de tulpinile de drojdie alese și de modul de preparare al mustului.

Adăugarea de zinc în timpul fermentării conduce la o creștere în producția de

alcooli și esteri dar reduce formarea aldehidei acetice. Concentrații mari ale compușilor

organici volatili în mediu pot determina creșterea numărului de acizi grași responsabili

pentru gustul nedorit de săpun, gras sau rânced. În general, când concentrațiile scad sub

0,1mg/l procesul de fermentare se oprește. [54]

În procesul de fabricare al berii mustul de fermentare al malțului reduce

biodisponibilitatea zincului deoarece metalul poate forma complecși și precipitate cu

proteinele, cum ar fi grupele cisteinei din peptide și aminoacizii. [14]

Suplimentarea cu ioni de zinc a mediului de fermentare duce la îmbunătățirea

flocurării și descrește dimensiunea medie a aglomeratelor de drojdie [53], probabil pe de o

parte datorită schimbului cu ionii de calciu în celulele de drojdie dar și datorită legării

zincului de pereții celulari. Taylor și Orton au arătat că zincul poate inhiba flocularea dar

doar în concentrații foarte mari (65,4 ppm). [14]

Udeh 2014 a urmărit influența ionilor metalici asupra proceselor fermentative. El a

adăugat diferite concentrații de zinc în must, respectiv 8, 10 și 12 ppm. Ipotetic, efectul

mustului de vin în fermentare la o concentrație de 10 ppm ioni de zinc ar putea fi atribuit

efectului său represiv asupra sistemelor de absorție a zincului la concentrația stabilită.

Această observație a fost făcută și în [28], unde se spune că nivele mari de zinc ar inhiba

funcția genei ZAP1(gena care reglează aportul de zinc). Aceste cercetări sunt în acord cu

alte studii, unde nivele de zinc care au variat între 0.05 -1.07 ppm Zn2+în must au adus o

creștere mai mare a randamentului în fermentare la unele tulpini de Sacharomices cerevisiae

decât utilizarea a 10 ppm Zn2+. Totușu, alte cercetări au afirmat că la concentrații destul de

mari de zinc (65,5, 327,5 și 1300 ppm) randamentul în fermentare este îmbunătățit.[28]

Îmbunătățirea producției în etanol odată cu creșterea concentrației de zinc poate

sugera faptul că ionii de zinc ajută la protecția celulelor împotriva metaboliților toxici din

etanol. Celulele de drojdie au arătat o rezistență mai mare cu 18 %, la șocul produs de etanol

Page 18: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

17

atunci când în mediul de fermentare s-a adăugat o concentrație de ioni de zinc de 8 ppm. Ea

este datorată creșterii producției de trehaloză și ergosteroli, cunoscuți pentru faptul că

protejează membranele împotriva distrugerilor produse de etanol [14].

Deficiența în ioni de zinc în celulele de drojdie conduce la creșterea stresului

oxidativ prin producerea speciilor reactive de oxigen intracelulare, rezultând distrugeri ale

ADN-ului iar pentru a preveni aceste distrugeri este necesară utilizarea unui antioxidant.

Pentru a păstra biodisponibilitatea zincului acesta ar trebui adăugat la începutul

fermentării, odată cu drojdia. Ionii de zinc nu vor avea un efect direct asupra aromei berii

deoarece se utilizează în cantități foarte mici.[14,28]

1.1.1.3. Calciul

Calciul este cel mai mult implicat în procesul de floculare, proprietate importantă a

drojdiei care depinde de mai mulți factori cum ar fi: sarcina electrică a celulei, o proliferare

scăzută a celulelor, o fermentare înceată, prezența diferiților ioni metalici (bi și trivalenți),

acțiunea metaboliților produși de etanol, influența diferitelor bacterii (dacă mediul nu este

steril) și vârsta celulei.

La punctul izoelectric, drojdiile sedimentează sub formă de fulgi. Flocularea are loc

prin atracția reciprocă dintre celulele de drojdie și albuminele din mediu. Punctul izoelectric

pentru drojdii și albumine este la un pH cu valoarea de 4,4, când se produce flocularea[55,

56]

S-a emis o ipoteză - „ipoteza legăturii de calciu‖ -, conform căreia ionii de calciu se

pot lega de proteine și le oferă acestora structura corectă pentru a forma legături

carbohidrate. [55] Procesul de floculare utilizând ionii de calciu este un fenomen reversibil.

Celulele floculate pot fi din nou disociate prin adăugarea unui agent de chelatizare care

îndepărtează ionii de calciu, prin adăugarea de manoză care înlocuiește continuu resturile de

manoză de pe peretele celular din locurile de legare ale calciului sau prin aducerea celulelor

de drojdie floculate într-un mediu de cultură nou, prin inoculare [55].

Ionii de calciu pot avea un rol în protejarea celulelor de drojdie împotriva efectelor

toxice produse de etanol la fel ca și ionii de magneziu sau zinc. Datorită efectului antagonist

al magneziului, efectele pozitive asupra proliferării celulare în momentul suplimentării

mediului cu ioni de calciu sunt compromise. Cererea celulelor de drojdie pentru ionii de

magneziu este mai mare decît cea pentru calciu și o concentrație mărită de calciu în must

este posibil să înrăutățească deficitul de magneziu prin interacțiuni antagoniste [14]. De

aceea suplimentarea cu ioni de calciu trebuie efectuată cu grijă. Poate fi benefică doar în

unele cazuri: dacă ionii de calciu sunt suplimentați în concentrații mari pot înlocui

Page 19: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

18

magneziul într-o serie de căi biochimice, dar aceasta poate duce în timp la deteriorarea

celulei. Trebuie remarcat faptul că suplimentarea calciului în must sau prin barbotare are un

efect tampon ce împiedică creșterea pH-ului în mediu. Efectul potențial negativ în creșterea

celulară și în procesele fermentative trebuie luat în considerare [14].

1.1.1.4.Manganul

Celulele de drojdie necesită ionul de mangan în concentrații foarte mici, ca urme de

element esențial, la o concentrație de 2-10 ppm pentru o creștere optimă a drojdiei. El este

esențial pentru creșterea mugurilor de drojdie, ajutând la proliferarea celulelor, în special în

condiții aerobe. Manganul este de asemenea prezent în aparatul Golgi și activează glicozil

transferaza, care este implicată în procesele biochimice având funcția de a secreta proteinele.

[57]. Prezența ionilor de mangan a fost raportată a fi necesară în celulele de drojdie pentru a

tolera nivelele de zinc de peste 2 ppm [22]. Toleranța la zinc depinde mult de tulpina de

drojdie astfel încât concentrația de mangan este dificil de estimat. Ionul metalic a fost

raportat a avea un rol important în protecția celulelor împotriva toxicității etanolului [14].

Manganul are o influență decisivă asupra îmbătrânirii drojdiei. La fel ca fierul și

cuprul, manganul poate cataliza formarea radicalilor liberi în bere fără influența oxigenului

(ex: formarea raicalilor liberi de acizi grași), proces care produce deteriorarea aromei în

timpul păstrării (depozitării). În contrast cu fierul și cuprul, ionii de mangan nu sunt

îndepărtați din must sau bere în nici un moment în timpul procesului de fermentare [57].

1.1.1.5. Fierul

Fierul pare să fie important pentru creșterea celulelor. Shakoury-Elizeh și colab.

2004, au arătat că proliferarea celulară într-un mediu cu o concentrație mică de fier prezintă

o creștere mai scăzută, fierul fiind un factor limitativ de creștere. Proliferarea celulară într-

un mediu cu concentrații mari de fier arată o creștere scăzută; atunci când timpul a fost

dublat s-a observat o creștere celulară mai mare cu 40 % față de cazul anterior. Acest

comportament confirmă faptul că celulele bogate în fier sunt expuse la o anumită toxicitate

[59, 60].

Pentru ca metabolismul în respirație să se realizeze într-un mod adecvat, celulele de

drojdie au nevoie de multă energie și necesită cantități mari de fier, care se găsesc în celule

sub formă de complecși respiratorii ce contin fier legat de diferite enzime. Drojdia poate

utiliza doar sursele de carbon pentru creștere iar acestea pot fi metabolizate doar prin

respirație. Respirația în celulele de drojdie nu se poate realiza dacă mediul este deficient în

fier [60, 61].

Page 20: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

19

1.1.2. Procese fermentative

Etanolul, metanolul, propanolul sunt bio-alcooli produți sub acțiunea

microorganismelor. Etanolul (alcoolul etilic) este biodegradabil, slab toxic și nepoluant.

Producția de etanol implică fermentarea zaharozei sau a zahărului simplu

biocatalizată de drojdie, de obicei Saccharomyces cerevisiae. Celulele de drojdie produc o

enzime, invertaza, care catalizează hidroliza zaharozei pentru a produce glucoză și fructoză.

Acestea sunt apoi convertite în bioetanol prin acțiunea altei enzime, zimaza, produsă de

celulele de drojdie.

Reacțiile care au loc sunt prezentate mai jos.

C12H22O11 Invertaza C6H12O6 + C6H12O6

Zaharoză Glucoză Fructoză

C6H12O6 Zimaza C2H5OH + 2CO2

Glucoză/Fructoză Etanol Dioxid de carbon

Aceste zaharuri (glucoza/fructoza) conțin o singură grupă de hexoză care este

compusă din 6 atomi de carbon în formula chimică C6H12O6. [1, 62]

În mustul de fermentare al berii se găsesc monozaharide, dizaharide, trizaharide

(maltotrioza) și dextrine. Dextrinele conțin patru unități de monozaharid legate între ele prin

legături glicozidice și nu sunt fermentate de către drojdie. Pentru ca dizaharidele și

trizaharidele să poată fi fermentate, trebuie să fie scindate la monozaharide. Celulele de

drojdie fac acest lucru prin utilizarea diferitelor enzime atât din interiorul cât și din

exteriorul celulei.

Invertaza catalizează hidroliza zaharozei prin scindarea legăturii glicozidice -C-O-.

Alte enzime sunt maltaze care scindează maltoza și maltotrioza în glucoză în interiorul

celulei.

După ce zaharurile sunt transformate în monozaharide, celulele de drojdie le pot

utiliza pentru a produce alcool etilic, în mai multor etape.

Prima etapă este denumită glicoliză, când glucoza este transformată în piruvat, două

unități de energie, și două unități de NADH. Glicoliza are loc în absența oxigenului la fel ca

și toate procesele fermentative utilizate în obținerea alcoolului. [66]

După glicoliză piruvatul poate fi utilizat fie în ciclul Krebs (respirație aerobă) sau în

respirație anaerobă. Respirația aerobă are loc în mitocondriile din drojdie. Energia din

piruvat este extrasă când trece prin procese metabolice cum este ciclul Krebs.

Ciclul Krebs, de asemenea cunoscut ca și ciclul acidului tricarboxilic, este un set de

reacții în cerc, ce se repetă, care au nevoie de oxigen. În procesele de producere a berii,

Page 21: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

20

ciclul Krebs apare în prima etapă a fermentării, când drojdia este adăugată într-un mediu de

fermentare bine aerat (must) și are loc până când tot oxigenul este utilizat.

Piruvatul este convertit la acetil_CoA prin următoarea reacție:

Piruvat + 2NAD++ CoA-SH → acetil-CoA + CO2+ NAD

cu ajutorul complexului de enzime piruvat dehidrogenază.[65]

Acetil-CoA intră apoi în ciclul de reacții și conduce la formarea a două molecule de

CO2, una de GTP (trifosfat guanozină, o altă unitate de energie echivalentă cu ATP, trei

unități de NADH și una de FADH2 (flavin adenin dinucleotidă care funcționează similar cu

NAHD). După completarea ciclului o altă moleculă de acetil-CoA intră în reacție și ciclul se

repetă.

Se formează cantități tot mai mari de NADH, reacția este reversibilă, iar NAD+

trebuie regenerată pentru ca glicoliza să continue. NADH și FADH2 își donează electronii

unui proces denumit transportator de lanturi de electroni/ fosforilare oxidativă.Rezultatul

este o revenire a NAD la starea NAD +

și rezultă o cantitate mare de energie celulară ATP.

Deoarece ciclul Krebs este eficient în producerea unităților de energie ATP aceasta

este calea metabolică preferată de celulele de drojdie, dar nu se formează etanol. Etanolul se

formează doar în absența oxigenului [63, 64].

Fermentarea anaerobă este mult mai simplă comparativ cu ciclul Krebs.

Fermentarea alcoolică începe cu cele două grupări piruvat obținute din glicoliză. O

enzimă, piruvat decarboxilaza transformă cele două grupări piruvat în acetaldehidă (toxic) și

CO2. Sub acțiunea alcool dehidrogenazei, la oameni, alcoolul este transformat în

acetaldehidă dar în cazul drojdiilor are loc un proces invers iar acetaldehida este

transformată în etanol.

Etapa finală este reprezentată de adăugarea (reducerea) unui ion de hidrogen la

aldehidă pentru a forma etanolul. Acest ion de hidrogen provine de la NADH, obținut în

urma reacției de glicoliză, și este transformat înapoi la NAD+. Etanolul este toxic pentru

celulele de drojdie dar reprezintă și o formă de apărare pentru celule deoarece bacteriile nu

cresc în acest mediu [66].

1.2. Enzime

Implicaţiile enzimelor în biotehnologie sunt evidente şi binecunoscute [67].

Enzimele sunt catalizatori biologici ce reduc energia de activare a unor reacții

chimice iar domeniul biotehnologic depinde de activitatea enzimelor. Ele respectă toate

legile catalizei:

Page 22: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

21

• nu se consumă în timpul reacţiei şi teoretic pot provoca transformarea unui

număr nelimitat de molecule de substrat.

• nu modifică natura reacţiei, echilibrul sau bilanţul ei termodinamic, reacţia

fiind posibilă si in absenţa sa;

• accelerează viteza de reacţie, pentru acest parametru cinetic înregistrându-se

valori de aproximativ 10 ori mai mari decăt cele obţinute în absenţa biocatalizatorului [68].

Cu excepţia ribozimelor, enzimele sunt în majoritate proteine, putând conţine şi

componente lipidice sau zaharoase.

Descoperirea primei enzime aparţine lui Payen şi Persoz, care in anul 1833 publică

o lucrare privind separarea dintr-un extract apos de malţ a unui produs care scindează

amidonul la zaharuri mai simple – amilaza [69].

Avantajele folosirii enzimelor includ: o posibilă viteză catalitică mare, funcționează

în condiţii moderate de mediu, realizează o cataliză nepoluantă, optimizarea uneia sau a

două reacţii catalizate de enzime uşurează optimizarea întregului proces ce are loc într-o

celulă, enzimele catalizează o gama largă de reacţii, unele cu stereospecificitate înaltă

(reacţii de oxidare, reducere, dehidrogenare, dehalogenare, hidratare si deshidratare) [68].

În ciuda acestor caracteristici, enzimele nu au fost folosite intens, deoarece există şi

unele neajunsuri:

majoritatea enzimelor izolate nu sunt suficient de stabile pentru utilizarea în condiţii

industriale (slabă stabilitate la temperatură, pH sau prezenţa ionilor metalici).

în celule, toate enzimele sunt supuse ―turn-over‖-ului celular: cele îmbatrânite sunt

înlocuite de altele noi, ceea ce face dificilă izolarea in vitro.

majoritatea enzimelor sunt hidrosolubile şi, de aceea, dificil de separat din reactanți sau

din produșii de reacție și nu pot fi utilizate decât într-un singur ciclu enzimatic.

rămânând în produşii de reacție, enzima constitue o impuritate, impunând îndepărtarea sa

prin diferite metode, ceea ce complică tehnologiile ce apelează la astfel de catalizatori.

multe enzime utile se găsesc intracelular şi de aceea sunt dificil de izolat [70].

Aceste dezavantaje pot fi parţial sau total eliminate prin insolubilizare pe un suport

mineral sau organic, prin legare chimică sau prin interacţiuni fizice. Enzimele imobilizate

pot fi ușor separate din produşii de reacţie şi ulterior regenerate prin tratare cu soluții tampon

de pH corespunzător celui de activare maximă a biocatalizatorului, fiind reutilizate într-un

alt ciclu enzimatic, cu avantajele ce decurg de aici [71, 72].

Page 23: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

22

1.2.1. Structura chimică a unei enzime

Natura chimică a enzimelor a fost mult timp necunoscută. Caracterul proteic al

enzimelor este bine dovedit, stabilindu-se că ele sunt formate fie din catene polipeptidice ale

căror unităţi de bază sunt resturi de aminoacizi şi din punct de vedere chimic proteine simple

(sau homoproteine), fie din două componente (una de natură proteică si alta de natură

neproteică) definite ca heteroproteine. Partea neproteică poate fi o coenzimă, atunci cand se

leagă de partea proteică prin legături necovalente, sau o grupare prostetică când este legată

prin legături de tip covalent.

Partea proteică, numită apoenzimă poate fi constituită din una sau mai multe catene

polipeptidice. Fiecare enzimă conţine o secvenţă unică din aproximativ 20 de L-aminoacizi,

legați prin legături peptidice. Conformaţiile catenei polipeptidice condiţionează manifestarea

anumitor funcţii biologice prin centrul catalitic activ al enzimei. Rolul acestuia este de a

―recunoaşte‖ structura chimică a substratului şi de a-l lega de enzimă prin formarea unui

complex enzimă-substrat, deosebit de reactiv, care scindează spontan punând în libertate

produşii de reacţie şi enzima, aceasta din urmă nemodificată din punct de vedere chimic

[70].

1.2.2. Tipuri de enzime

Enzimele catalizează transformarea unei singure substanţe chimice având

specificitate absolută, fiind însă posibilă şi acţiunea asupra unui număr de substanţe, înrudite

structural prin aceeaşi grupare sau aceleasi grupe de atomi pe care biocatalizatorul le

recunoaşte (specificitate relativă).

În funcţie de tipul de reacţie pe care îl catalizează enzimele sunt clasificate in şase

mari clase: oxidoreductaze (catalizează reacţiile redox), transferaze (catalizează reacţii de

transfer a unor grupări chimice), hidrolaze (catalizează scindarea hidrolitică a unor legături

sau grupări chimice), liaze (catalizează reacţii de eliminare sau de adiţie a unor grupari

din/sau la molecula substratului fără participarea apei cu formarea unei duble legături),

izomeraze şi ligaze sau sintetaze (catalizează reacţii de sinteză prin condensarea a două

molecule) [73].

Preparatele enzimatice sunt utilizate în numeroase domenii, detaşându-se în primul

rând cel al producerii alimentelor, dar şi alte procese industriale ce apelează la biotehnologii.

Numeroase enzime se utilizează în industria berii, vinului, zahărului, băuturilor alcoolice a

laptelui, ş.a. [74] (Tabel 1)

Tabel 1. Utilizarea enzimelor în analiza biochimică şi obţinerea unor produşi [74]

Page 24: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

23

Enzima insolubilă Utilizări

Amilaze Producţia continuă a glucozei

Invertază Hidroliza continuă a zahărului

Aminoacilază Separarea continuă a acil-D-L-aminoacilazelor

Urează Determinarea continuă a ureei din lichide

biologice

Galactozidază Conversia continuă a β-D-galactozidelor

Asparaginază Dozarea continuă a D-L-asparaginei; tratamentul

limfosarcomelor

Steroid esteraze Sinteze de steroizi

Penicilinamidaze Hidroliza continua a penicilinei

Glucozizomerază Obținerea fructozei

Catalază Conservarea alimentelor

Amiloglucozidază Transformarea continuă a maltozei la glucoză

Glucozoxidază Electrod de detecţie continuă a glucozei.

Transformarea continuă a glucozei în acid

glucuronic

Celulază Transformarea continuă a celulozei în produse

solubile în apă

Lipaze Hidroliza continuă a grăsimilor

Pectinaze Clarificarea sucurilor de fructe

1.2.3. -Amilaza

Hidrolazele sunt enzime care catalizează reacţii de scindare hidrolitică a unor

legături chimice formate prin reacţii în urma cărora se elimină apa [69].

α-Amilaza există în plante, microorganisme și animale. Este produsă comercial prin

fermentare microbiană [75]. α-Amilaza hidrolizează intern legăturile α-1,4 glicozidice în

polizaharide în care gradul de polimerizare este mai mare sau egal cu 3. Sub acţiunea lor,

amiloza si amilopectina sunt fragmentate la oligozaharide cu grad de polimerizare mai mic,

numite dextrine. Ea realizează o solubilizare a amidonului şi o hidroliză prelungită la

maltoză şi maltotrioze. α-Amilazele nu pot scinda legăturile α-1,6-glucozidice din

amilopectină.

Page 25: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

24

Reacțiile de hidroliză au loc la un pH optim și temperatură ce variază în funcție de

tipul de α-amilază utilizat. În general cerința de calciu pentru α-amilază este de 1-20 ppm ca

și cofactor pentru activitate și stabilitate. Scăzând dependența de calciu pentru α-amilază

costul produsului final se poate reduce. [76] Alți ioni metalici cum sunt Mg2+ și Mn

2+ sunt

raportați ca și cofactori care stimulează activitatea.

Structura supramoleculară schematizată a α-amilazei este prezentată în figura 1.

Fig.1 Structura supramoleculară a α-amilazei

Amilazele pot fi clasificate în trei grupe principale pe baza modului lor de acțiune:

endoamilaze, exoamilaze și amilaze care ajută la ruperea ramificațiilor.

Endoamilazele sunt cunoscute ca enzime care lichefiază. Aceste enzime

hidrolizează legăturile α-1,4 glicozidice în amiloză, amilopectină și polizaharide cum ar fi

glicogenul, rezultând o descreștere rapidă a vâscozității soluțiilor de amidon precum;

puterea de colorare a soluției de iod scade. Produșii de hidroliză sunt oligozaharide cu

lungimi ale lanțului ce variază.

Exoamilazele sunt cunoscute ca enzime care zaharifică. Aceste enzime scindează

legăturile α-1,4 glicozidice în amiloză, amilopectină și glicogen de la capetele nereducătoare

prin îndepărtarea succesivă a maltozei și glucozei, în etape. Din această categorie fac parte -

amilaza din cereale și glucoamilaza fungică.[77]

α-Amilazele pot fi de origine animală (amilaza produsă de glanda salivară şi

pancreas) sunt, de origine vegetală (cereale încolţite, în special malţ) având aplicații în

industria alimentară şi de origine microbiană (bacterii, mucegaiuri şi drojdii) care au

aplicativitate în industria farmaceutică și în domeniul biotehnologiei.

Amilazele de origine bacteriană sunt mai stabile la temperatură decât cele de

origine fungică. α-Amilaza din Bacillus subtillis are o stabilitate termică remarcabilă în

prezenţa ionilor de Ca2+ fiind o metaloenzimă. Dupa 45 de minute la 70˚C, α-amilaza reţine

81% din activitatea iniţială, pe când proteaza alcalină doar 1% și proteaza neutră 0%. Are un

Page 26: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

25

domeniu larg de stabilitate la pH în prezenţa ionilor de Ca2+

și își păstrează practic întreaga

activitate de la pH 5,5 la pH 9,5 indiferent de soluția tampon utilizată. pH-ul optim de

activitate este 6.0 iar temperatura optimă de activitate este 60˚C. [77]

1.2.3.1.Aplicații ale α-amilazei în medicină

α-Amilaza este prezentă în smalţul dinţilor și poate duce la formarea legăturilor α-

amilază – bacterie, aceasta având un grad crescut de afinitatea cu anumiți streptococi orali.

Acest contact între legătura α-amilază – bacterie şi dinţi poate conduce la apariţia plăcii

dentare şi a cariilor. Carbohidrații din alimente sunt supuși hidrolizei sub acțiunea α-

amilazei din cavitatea bucală transformându-se în acid lactic care în final determină

demineralizarea dinților. De asemenea, α-amilaza reprezintă un agent antiinflamator. [78,79]

α-Amilaza este secretată de glandele salivare şi de pancreas. În funcție de valorile

α-amilazei serice detectate la analize se pot diagnostica diferite afecțiuni. De exemplu în

pancreatita acută apare hiperamilazemia iar valorile α-amilazei sunt de 6-8 ori mai mari dar

este tranzitorie (în 3-5 zile revin la valorile normale). Dacă valorile serice ale α-amilazei

serice sunt de 3 ori mai mari decât cele normale indică o inflamație a pancreasului iar o

creștere de 40 de ori mai mare indică necroza pancreasului. Valori crescute moderate ale

amilazemiei apar în diferite afecțiuni cum ar fi: cancer de pancreas, afecțiuni abdominale

acute, parotidă acută epidemică, hepatită acută, după intervenții chirurgicale, după

administrarea unor medicamente (morfină, corticosteroizi), cancer pulmonar, în unele

afecțiuni renale. Valori scăzute se constată în atrofiile pancreatice, afectarea acută sau

cronică hepatocelulară [80, 81].

1.2.3.2. Aplicațiile α-amilazei în industria alimentară:

α-Amilaza se utilizează în industria de panificație.

Suplimentarea făinii cu α-amilază are ca efect intensificarea amilolazei şi creşterea

cantităţii de zaharuri fermentescibile în aluat, capabile să susţină procesul de fermentare şi

deci formarea de gaze pe toată durata procesului tehnologic, la un nivel care să asigure pâine

de calitate. Acţiunea de zaharificare cea mai puternică o are α-amilaza bacteriană, urmată de

cea din malţ şi cea de origine fungică. Proprietăţile fizice ale aluatului și activitatea

microflorei sunt influențate de adăugarea α-amilazei aceasta ajutând la proliferarea celulelor

de drojdie şi se intensifică activitatea fermentativă a drojdiei şi a microflorei bacteriene. Ca

urmare durata de fermentare a aluatului este dimunuată. Asupra calităţii pâinii, adaosul de α-

amilază are influenţe multiple și determină: creşterea volumului (prin formarea unor cantităţi

mai mari de dextrine), inchiderea culorii cojii de pâine (datorită zaharurilor de pe suprafața

pâinii ce conduc la un proces de caramelizare sau la reacţii Maillard prin formarea de

Page 27: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

26

melanoidine), intensificarea aromei, prelungirea prospeţimii (datorită creşterii cantităţii de

amidon hidrolizat sau a scăderii cantităţii de amidon care gelifică), creșterea elasticității

miezului.

Utilizarea α-amilazelor bacteriene pentru fluidificarea plămezii de cereale

nemalţificate evită apariţia unui gust nedorit iar prin utilizarea enzimei în etapa de brasaj se

realizează o ‖lichefiere‖ a amidonului cu obţinerea de zaharuri ce pot fermenta; prin

utilizarea α-amilazei fungice se realizează o zaharificare a dextrinelor, ducând la creșterea

fermentescibilităţii.

Utilizarea α-amilazei în procesul de fabricare a berii în diferite etape de fabricare

determină obținerea unor proprietăți necesare obținerii unei beri de calitate.

α-Amilaza a fost utilizată în procesele fermentative de obținere a etanolului [82,

83].

1.2.3.3. Amidonul-substrat pentru hidroliză

Amidonul este o polizaharidă contituită din monomeri ai glucozei legați prin

legături glicozidice, având rolul de a depozita glucoza în plante. Este compus din doi

polimeri ai glucozei: amiloza și amilopectina. Amiloza este un polimer liniar cu legături α-

1,4 glicozidice și lanțurile sale sunt formate dintr-un helix simplu sau dublu cu 6 unități de

glucoză/rotație spiră [84]. Cea din amidon din cartofi sau tapioca are un grad de

polimerizare ce variază între 1000 și 6000, cu un conținut de amiloză de 10-20 % [85, 86].

Amilopectina este un polimer ramificat, cu un grad mediu de polimerizare de aprox.

2000000. Prezintă o structură constituită dintr-o catenă principală pe care se găsesc legături

1,4-glicozidice și ramificații cu legături α-1,6 glicozidice ce conțin 15-45 unități de glucoză

[87]. Ramificarea catenei principale se găsește produce la fiecare 22-70 unități de glucoză

[84]. Aproape 95% din legăturile glicozidice din amilopectină sunt legături α-1,4 glicozidice

și 5 % sunt restul fiind legături α-1,6 glicozidice.

Structura este reprezentată în figura 2.

Page 28: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

27

Figura 2. Structura chimică a amilozei (a) și (b) amilopectinei.

Hidroliza amidonului poate fi indusă de enzime, acid sau tratament alcalin. In

aceste condiții, legăturile glicozidice scindează conducând la oligozaharide sau zaharuri cum

ar fi maltotrioza, maltoza și glucoza. Mai multe enzime pot produce hidroliza amidonului.

α-Amilaza este o endoamilază, scindează legătura α-1,4 glicozidică în mod

aleatoriu și produce oligozaharide. Glucoamilaza este o exoenzimă ce produce secvențial

glucoza din capetele nereducătoare și scindează legăturile α-1,6 glicozidice. O enzimă care

acționează asupra legăturilor α-1,6 glicozidice este pululanaza și produce glucoza.

În industria alimentară glucoza este transformată în fructoză de către

glucozoizomeraza deoarece fructoza este cea mai dulce dintre zaharuri. Această enzimă este

utilizată în formă imobilizată iar magneziul este adăugat ca și cofactor. Calciul are un efect

inhibitor asupra glucozo-izomerazei [75, 88, 89].

Principalele obiective biotehnologice care se pot realiza cu ajutorul enzimelor

amilolitice (care conţin şi α-amilază) de origine microbiană în etapa de zaharificare a

materiilor prime pe bază de amidon din cadrul procesului de fabricare a etanolului sunt:

îmbunătățirea parametrilor de fermentare (scăderea presiunii și a temperaturii din proces),

înlocuirea parţiala a malţului (enzima poate fi folosită în scopul lichefierii, a zaharificării

amidonului, sau pentru amândouă), înlocuirea totală a malţului (care necesită pe lângă

prezenţa α-amilazei şi prezenţa amiloglucozidazei fungice pentru zaharificare) [90].

În acest raport ne-am propus realizarea imobilizării unor hidrolaze în particule de

polizaharide - gelan reticulat -şi caracterizarea imobilizatelor astfel obţinute. Pentru studiu a

fost aleasă o enzimă binecunoscută, α-amilaza.

Page 29: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

28

1.3. Substanțe nutraceutice

Termenul de nutraceutic a fost inventat de către Stephen DeFellce în 1979, fondator

şi preşedinte al fundatiei pentru inovaţie din Cranford, New Jersey; el combină cuvântul

nutriţie cu farmaceutic. Este definit ca un aliment care oferă beneficii medicale sau de

sănătate, inclusiv în prevenirea şi tratamentul bolilor [91,92].

Prevenţia bolilor cronice este o problemă pentru ţările dezvoltate. Factori cum ar fi

îmbătrânirea populaţiei şi creşterea costurilor de îngrijire a sănătăţii subliniază necesitatea de

prevenire a bolilor în lumea dezvoltată. Terapii nutriţionale, cum ar fi alimentele funcţionale

şi suplimentele alimentare reprezintă o abordare pentru prevenirea bolilor cronice [93].

1.3.1 Tipuri de substanțe nutraceutice utilizate în industria alimentară

Deşi există multe definiţii ale alimentelor funcţionale, o temă comună este faptul că

alimentele funcţionale pot oferi beneficii pentru sănătate ―dincolo de hrana de bază‖ [94].

Aceste beneficii pentru sănătate sunt de obicei asociate cu încorporarea unuia sau mai

multor compuşi bioactivi [95].

Nutraceutice şi ingrediente bioactive:

prebiotice: inulina, oligozaharidele –susţin sănătatea intestinului şi ajută la refacerea

microflorei intestinale;

probiotice: lactobacili, bifidobacterii- îmbunătăţesc sănătatea intestinului[96];

substanţe fitochimice: beta-caroten, licopen, flavonoizi, proantocianidine, polifenoli,

alicina: reduc riscul apariţiei bolilor cardiovasculare, cancer, diabet, boli degenerative

[97];

lanţuri lungi de acizi graşi omega-3: acid dodecahexaecanoic (DHA), acid

eicosapentaenoic (EPA)- susţin îmbunătăţirea sănătaţii cardiovasculare [98];

peptide bioactive: peptide derivate din lapte-reduc presiunea sangelui [99];

carotenoizii: beta-caroten, licopen, luteina, zeaxantina, astaxantina- reduc riscul bolilor

de ochi şi cancerul [100];

ierburi şi condimente: uleiuri esenţiale, diverse preparate de ierburi-au o gamă largă de

beneficii [101];

Cei mai mulţi compuşi activi se încadrează în una din cele trei clasificări si anume:

lipide, proteine sau carbohidraţi. Dintre aceste categorii, compuşii bioactivi lipofili ridică o

serie de provocări în ceea ce priveşte încorporarea lor în produsele alimentare deoarece sunt

dificil de încorporat în cele apoase şi sunt sensibili la deteriorarea oxidativă [102].

Page 30: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

29

Există de aceea o mare nevoie de a dezvolta sisteme de eliberare pentru industria

alimentară care pot fi utilizate pentru a încapsula şi proteja componenţii bioactivi. Sistemele

de eliberare pentru alimente funcţionale cu componenţi bioactivi lipofili trebuie să posede

unele calităţi importante, esențială fiind compatibilitatea atât cu componentul bioactiv cât şi

cu produsul în care vor fi încorporate pentru a crea un aliment sau o băutură funcţională.

Alte atribute ale sistemelor includ creşterea stabilităţii sau eliberarea controlată a

componenţilor bioactivi. Sistemele de eliberare pe bază de emulsii sunt cele mai potrivite

pentru a crea sisteme de transport al lipidelor bioactive [103].

Reologia sau textura alimentelor poate fi afectată pozitiv sau negativ prin

încorporarea în particule de hidrogel. În general, reologia unei suspensii coloidale depinde

efectiv de concentraţia particulelor, de forma lor şi de orice interacţiune între ele.

Comportamentul de curgere a dispersiei este controlat prin trei forţe: hidrodinamică,

browniană si coloidală. Pentru dispersii ce constau din particule mari (> 10 μm) forţele

hidrodinamice domină. Pentru dispersii ce constau din particule între 1 nm-10μm (referindu-

ne la dispersiile coloidale) mişcarea bowniană şi forţele interparticulare domină la viteze

scăzute de forfecare, în timp ce în viteze mari de forfecare forţele hidrodinamice sunt cele

mai importante [104].

Particulele de hidrogel pot fi create pentru a furniza atributele reologice dorite

pentru un anumit produs cum ar fi grosimea, structura, sau pot fi elaborate pentru a avea un

impact neglijabil asupra produsului. Factorii care influențează reologia alimentelor sunt

concentraţia, mărimea, forma şi compoziţia acestor particule Pentru orice sistem de eliberare

este esenţial ca acesta să rămână stabil pentru întregul ciclu de viaţă al produsului și nu

trebuie să influențeze termenul de valabilitate al produsului în sine. Este absolut necesar ca

mecanismele fizico-chimice majore care promovează instabilitatea particulelor, cum ar fi

separarea gravitaţională, agregarea, schimbări volumetrice (umflare și contractare) și

disocierea (eroziunea sau dezintegrarea), să fie identificate, inhibate sau prevenite cu succes

[105].

Multe din abordările pentru eliberarea medicamentului la ţintă din industria

farmaceutică pot fi aplicate şi în industria alimentară pentru elaborarea de alimente

funcţionale şi suplimente alimentare cu proprietăţi superioare cum ar fi îmbunătăţirea

eliberării şi a absorbţiei [106].

Există o mare necesitate în industria alimentară de a elabora sisteme noi de

transport pentru componenţi bioactivi. Mulţi dintre aceştia, cum sunt acizii graşi omega 3,

carotenoizii, vitaminele liposolubile în grăsimi şi fitosterolii, sunt lipofili, făcând ca

Page 31: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

30

încorporarea lor în alimentele apoase şi băuturi să fie o provocare. În plus, multe dintre

aceste componente lipofile sunt chimic instabile şi tind să se degradeze în timpul depozitării

când sunt încorporate în alimente [103, 106].

Teste in vitro şi in vivo au fost des utilizate pentru a testa biodisponibilitatea.

Evaluarea in vitro poate include teste de dizolvare prin simularea conditțiilor

gastrointestinale, teste de culturi celulare pentru a evalua permeabilitatea şi fluxul, teste

pentru evaluarea adeziunii sistemului de eliberare la ţesutul intestinal și permit înțelegerea

mecanismelor, viteza şi gradul de eliberare a componentelor bioactive. Există însă şi limitări

deoarece testele nu ţin cont de schimbările biologice, asimilarea activă, răspunsul metabolic

şi de influenţa altor alimente în timpul consumului, iar pentru o validare ulterioară a

eficienţei sistemului de eliberare, testele in vivo sunt necesare pentru a identifica locul şi

profilul de eliberare a componenţilor bioactivi, asimilarea, biodistribuţia în ţesut şi

răspunsurile fiziologice [107, 108].

Studiile in vitro şi in vivo au fost efectuate pentru a investiga modul în care

încapsularea lipidelor afectează digestia [109, 110].

Testele in vivo au arătat că biodisponibilitatea unui ingredient activ este dependentă

de tipul sistemului de încapsulare, de mărimea particulei şi de structura alimentelor [111].

Studiile clinice la om sunt necesare pentru a stabili eficienţa in vivo a ingredientelor active

transportate cu diverse sisteme de eliberare și pentru a stabili dacă sistemul ce conţine

ingredientul activ încapsulat furnizează beneficiul pentru sănătate final la populaţia ţintă

[112].

Pentru a preveni deteriorarea oxidativă au fost dezvoltate diferite strategii cum ar fi

reducerea nivelului de oxigen, modificarea proprietăţilor interfaciale sau adăugarea unui

chelator de metal util pentru controlul oxidării lipidelor în alimentele îmbogăţite cu omega

3. Cercetările au arătat că proteinele alimentare pot inhiba oxidarea în emulsiile alimentare

[113, 114]. O gamă largă de mecanisme sunt asociate cu proprietăţile antioxidante ale

proteinelor incluzând inactivarea de specii reactive, reducerea hidroperoxidarii, îndepărtarea

enzimatică a oxidanţilor şi crearea unei bariere fizice între reactanţi. Antioxidanţii sunt

substanţele din alimente care sunt proiectate pentru a inhiba sau întârzia oxidarea lipidelor în

acestea. Depinzând de mecanismul lor de acţiune antioxidanţii pot fi divizaţi în două

categorii:

antioxidanţi primari - lucrează prin acceptarea directă a radicalilor liberi

pentru a-i transforma în produse mai stabile (ex. Tocoferolii).

Page 32: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

31

antioxidanţi secundari - nu au capacitatea de a reacţiona direct cu radicalii

liberi, în schimb inhibă indirect oxidarea prin mecanisme cum ar fi chelatarea

metalelor de tranziţie, regenerarea antioxidanţilor şi oprirea oxigenului. (ex.: EDTA

si acidul citric) [115].

Majoritatea claselor de antioxidanţi alimentari naturali includ carotenoizii,

componenţii fenolici, acidul ascorbic, proteinele şi derivatele lor, produşii de reacţie

Maillard, fosfolipidele şi sterolii. [116]. Cercetările recente au arătat, de asemenea, că

polizaharidele sunt capabile de a inhiba oxidarea emulsiei ulei în apă.

Din moment ce particulele de hidrogel cu componenţi bioactivi încapsulaţi sunt

obținute din polizaharide, ar putea fi posibil să luăm ca un avantaj proprietăţile naturale

antioxidante ale acestor biopolimeri pentru a proteja lipidele bioactive. Integrarea picăturilor

de lipide emulsionate în interiorul unei particule de hidrogel pe bază de polizaharide ar fi o

cale de a crea un mediu care, teoretic, ar inhiba oxidarea lipidelor.[91]

1.3.2 Curcumina: structură, proprietăți, aplicații.

Cercetările științifice au confirmat efectele farmacologice ale curcuminei și au

stabilit capacitatea sa de a acționa în prevenția și tratarea unor boli cronice [117-121].

Curcumina a fost prima dată izolată din turmeric în 1815, dar până în 1970 există

puține rapoarte care prezintă structura chimică, sinteza, activitatea sa chimică și biochimică.

[122,123]. După raportarea de către Aggarwal și colab. în 1990 a potențialului său efect

anticancer, ritmul cercetărilor asupra curcuminei a început să crească rapid [124]. În timp ce

majoritatea cercetărilor au urmărit aspectele biologice, doar câțiva cercetători au fost

interesați de înțelegerea importanței structurii chimice a curcuminei pe lângă activitatea

biologică.

În chimia organică extragerea și sinteza curcuminei și a noilor derivați sintetici a

fost principalul scop al cercetărilor. Chimia anorganică a utilizat abilitatea sa de chelator

metalic prin gruparea α, β-diceto pentru a forma noi entități structurale cu modificarea

activității biochimice. Fizico-chimia s-a concentrat pe proprietățile spectroscopice foarte

sensibile ale curcuminei pentru a studia interacțiunile sale cu structurile microeterogene și

biomolecule. Chimia analitică a fost implicată în proprietățile sale unice spectroscopice de

absorbție pentru a identifica și estima urmele de elemente [125]. Alte studii chimice

folositoare în întelegerea activității biologice a curcuminei sunt reactivitatea sa chimică cu

specii reactive de oxigen, reacții de adiție, reacții de degradare și formarea nanoconjugatelor

și a formulării lor.

Page 33: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

32

Curcuma Longa (turmeric) este cultivat în regiunile tropicale și subtropicale. Cea

mai mare producătoare de turmeric este India, unde a fost utilizat de foarte mult timp ca

remediu în casă pentru câteva afecțiuni. Depinzând de originea sa și de condițiile solului

unde a crescut, turmeric conține între 2-9 % curcuminoizi. Cuvântul „curcuminoid‖ indică

un grup de compuși cum ar fi curcumina, demetoxicurcumina, bis-demetoxicurcumina și

curcumina ciclică. Dintre acestea curcumina este componentul major iar curcumina ciclică

este componentul minor [117-120]. Structura chimică a curcuminei este redată în figura 3.

Fig. 3 Structura principalilor curcuminoizi din turmeric

1.3.2.1.Separarea curcuminei

Cu toate că extracția și separarea curcuminei din pudră de turmeric a fost raportată

încă din 1815, metode îmbunătățite și avansate de extracție sunt încă raportate chiar și după

două secole [126-134]. Extracția cu solvent urmată de cromatografia pe coloană au fost

metodele cele mai des raportate pentru separarea curcuminei din turmeric; aceasta implică o

serie de solvenți organici polari și nepolari incluzând hexan, etilacetat, acetonă, metanol, etc.

Dintre toți solvenții organici etanolul este prefera. Pe de altă parte, extracția curcuminei cu

solvenți clorurați este foarte eficientă, dar industria alimentară nu acceptă utilizarea lor. Cele

mai eficiente metode de extracție identificate au fost extracțiile la Soxhlet, cu ultrasunete și

cu microunde [126-131].

Odată cu creșterea utilizării sale în suplimente alimentare, cercetătorii au dezvoltat

metode de extracție care implică solvenți utilizați în industria alimentară cum ar fi

triglicerolii, pentru a obține un randament mai bun [132]. O altă metodă comercială viabilă

și eficientă este folosirea CO2 supercritic [133, 134]. Condițiile normale de operare sunt:

presiune 25-30 Mpa și temperatură de 318 K.

Există puține rapoarte privind extracția curcuminei pe bază de enzime. Procedeul

presupune un pretratament al turmericului cu enzime cum ar fi α-amilază și glucoamilază iar

Page 34: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

33

randamentul în curcumină obținut este foarte bun. Oricum, datorită costului această metodă

nu este momentan viabilă [135].

Curcumina poate fi separată din amestecul de curcuminoizi (un amestec de

curcumină, demetoxicurcumină și bis-demetoxicurcumină) prin cromatografie pe coloană,

prin adsorbția amestecului pe gel de silice utilizând un amestec de solvenți cum ar fi

diclormetan/acid acetic sau metanol/cloroform pentru a obține trei fracții diferite. Fracția de

curcumină este purificată în continuare pe gel de silice utilizând un amestec de solvenți

obținut din cloroform/diclormetan și etanol/metanol [119, 120, 136-139].

Metodele de detectare și estimare a curcuminei au fost implicat

cromatografialichidă de înaltă performanță (HPLC). În general, ca fază mobilă s-a utilizat

amestec acetonitril/apă sau cloroform/metanol. Detectarea curcuminei se face la lungimi de

undă cuprinse între 350-450 nm sau în regiunea UV între 250-270 nm [136-139].

Cromatografia lichidă cuplată cu spectrometria de masă este o altă metodă pentru a detecta

curcumina. Metoda cea mai sensibilă (până la 1 ng/ml) este însă fluorescența, în regiunea

400-450 nm.

La un secol după izolarea din turmeric, prima lucrare privind sinteza curcuminei a

fost raportată de Lampe în 1913 [140]. Metoda implică 5 etape începând cu clorura de

carboximetil feruloil și acetoacetil etil. Mai târziu Pabon (1964) [141] a raportat o metodă

simplă de sinteză cu randamente mai mari utilizând acetil acetonă și a substituit aldehidele

aromatice în prezența trioxidului de bor, trialchil borat și n-butil amină; metoda a fost

adoptată de câteva grupe de cercetatori în sinteze ulterioare [119, 120, 141-143].

Pentru a produce curcuminoizi trifluoroborați a fost propusă utilizarea

trifluoroboratului, ce poate fi hidrolizat într-o soluție de metanol la pH 5,8. Etapa primară

este formarea de 2,4 dicetone cu un substituent de aldehidă aromatică. Pentru a preveni

participarea dicetonelor la condensarea Knoevenagel se efectuează complexarea cu bor.

Complexul de bor disociază și eliberează curcumina în condiții slab acide. Curcumina din

acest amestec de reacție poate fi separat prin spălări și precipitări repetate, urmată de

cromatografia pe coloană [144].

1.3.2.2. Caracteristici structurale ale curcuminei

Curcumina este o moleculă simetrică, cunoscută sub denumirea de diferuloil metan.

Termenul IUPAC al curcuminei este (1E, 6E)-1,7-bis-(4-hidroxi-3-metoxi fenil)-1,6-

heptadienă-3,5 dionă, având formula chimică C21H20O6 și masa moleculară 368,38. Conține

trei entități ciclice în structură: două sisteme ciclice aromatice conținând grupe fenolice o-

Page 35: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

34

metoxi, conectate printr-un element de legătură la C7 constând dintr-o grupare nesaturată

α,β-dicetonă. Gruparea diceto prezintă tautomerie ceto-enol, care poate exista în diferite

tipuri de conformeri, în funcție de mediu [145]. În majoritatea solvenților nepolari și

moderat polari forma enol este în general mai stabilă decât forma ceto cu 5 până la 8

kcal/mol, în funcție de natura solventului.

Datorită conjugării extinse, norul de electroni π este delocalizat de-a lungul

moleculei. În soluție curcumina manifestă izomerie cis-trans. Valoarea momentului de dipol

este de 10.77 D.

Este aproape insolubilă în apă și ușor solubilă în solvenți polari cum ar fi DMSO,

metanol, etanol, acetonitril, cloroform, acetat de etil, etc. Este greu solubilă în solvenți

hidrocarbonați cum ar fi ciclohexan și hexan. Este un acid Bronsted slab cu 3 protoni labili

și în consecință 3 pKa-uri corespunzând la trei echilibre prototropice. Reactivitatea chimică

și solubilitatea cresc la pH bazic.

Soluțiile apoase de curcumină pot fi preparate prin adăugarea surfactanților,

lipidelor, albuminei, ciclodextrinelor, biopolimerilor, etc. Soluțiile micelare care utilizează

surfactanți sunt mai potrivite în prepararea soluțiilor apoase de curcumină la o concentrație

ridicată. Când se utilizează soluții apoase cu surfactanți în sisteme biologice, este necesară o

grijă suplimentară la efectuarea experimentelor, deoarece surfactanții pot interfera în studiile

biologice [144, 145].

1.3.2.3. Reactivitatea curcuminei

Curcumina are 3 grupe funcționale reactive: o grupare dicetonă și două grupări

fenolice. Reacții chimice importante asociate cu activitatea biologică a curcuminei sunt cele

de cedare a hidrogenului care conduc la oxidarea curcuminei, adiție reversibilă sau

ireversibilă (reacții Michael), hidroliza, degradarea și reacții enzimatice.

1.3.2.3.1 Reacții cu specii reactive de oxigen

Curcumina s-a dovedit a fi un compus de eliminare excelent al speciilor reactive de

oxigen, proprietate care îi conferă activitate antioxidantă în celulele normale. Speciile

reactive de oxigen sunt formate din ambii radicali liberi oxidanți și oxidanți moleculari [145-

152]. Toate cele trei locuri active ale curcuminei pot fi supuse oxidării prin transferul de

electroni și captarea oxigenului. Investigații detaliate au confirmat că în timpul reacțiilor cu

radicali liberi cel mai ușor se detașează hidrogenul de la gruparea fenol cu formarea

Page 36: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

35

radicalilor fenoxil, care sunt stabilizați prin rezonanță de-a lungul structurii ceto-enol. Ca

exemplu reacția radicalilor peroxil cu curcumina produce radicali fenoxil care sunt mai puțin

reactivi decât radicalii peroxil și prin aceasta comportare determină o protecție față de

speciile reactive de oxigen. [146, 149, 153]. Reacțiile sunt reversibile iar compusul poate

reveni la structura chimică inițială prin intermediul antioxidanților solubili în apă cum ar fi

acidul ascorbic [149].

Literatura menționează reacțiile de eliminare ale altor radicali liberi din speciile

reactive de oxigen: radicalii hidroxil, radicalii superoxid, radicalii alcoxi [147-150].

Dintre oxidanții moleculari, reacțiile cu peroxinitril, peroxid de hidrogen sunt cele

mai comune. În multe modele biologice, curcumina poate proteja celulele în condiții în care

există o producere excesivă a acestor oxidanți moleculari.

Există puține rapoarte în literatura de specialitate privind reacția directă a

curcuminei cu peroxinitril [154]. Constantele de viteză și concentrațiile de inhibare a

curcuminei pentru a preveni formarea de nitrotirozină indică faptul că aceasta este un

antioxidant puternic împotriva stresului oxidativ [144].

1.3.2.3.2. Degradarea chimică și metabolism

Curcumina suferă o degradare chimică în soluții apoase-organice, ce se intensifică

cu creșterea pH-ului, ceea ce reprezintă o problemă serioasă în aplicațiile sale [122, 145,

155-158]. Degradarea curcuminei au loc prin gruparea nesaturată α, β-diceto, fiind mai puțin

intensă în soluții concentrate, când produșii rezultați sunt 6-trans-(4‘hidroxi-3‘-metoxifenil)-

2,4-dioxo-5 hexanal, aldehida felurică, feruloil metan și vanilină.

Deși nu este pe deplin înțeleasă se crede că degradarea se efectuează prin

intermediul fragmentului diceto. Cu toate acestea, degradarea este redusă în mod

semnificativ atunci când curcumina este atașată la lipide: lipozomi, albumină, ciclodextrină,

curcubituril, surfactanți, polimeri și alte macromoleculare și microeterogene [145, 146].

Astfel s-a dovedit a fi de mare folos faptul că soluții stabile de curcumină ar putea fi

preparate într-un mediu de cultură ce conține 10 % ser fetal bovin, precum și sânge uman.

Curcumina suferă o degradare mult mai rapidă atunci când este expusă la lumina

soarelui [144, 145, 159]. Produsele identificate în timpul fotodegradării sunt: vanilina, acidul

feluric și alți fenoli mai mici indicând o distribuție a produșilor de degradare fotochimică

similară cu degradarea chimică în soluție. Unele rapoarte indică faptul că curcumina

generează oxigen singlet și alte specii reactive de oxigen în momentul

fotodegradării,reponsabile pentru activitatea sa fotobiologică și fotodinamică [160].

Page 37: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

36

Fotodegradarea este accelerată în prezența nanoparticulelor de TiO2, iar această metodă

poate fi utilizată pentru a îndepărta petele de turmeric din țesuturile de bumbac [161].

Metabolizarea curcuminei la șobolani și oameni produce diferite produse. Două căi

biologice majore au fost identificate pentru metabolizarea curcuminei cum ar fi cea de

conjugare cu oxigen și de reducere. Produșii de conjugare cu oxigen sunt glucuronid

curcumina și sulfat de curcumină iar cei de reducere sunt tetrahidrocurcumin,

hexahidrocurcumin și octahidrocurcumin. Alți produși pot fi: dihidrocurcumin glucuronid,

tetrahidrocurcumin glucuronid, acid ferulic și acid dihidroferulic. [144]

Deși s-a raportat că procesele au loc pe cale enzimatică, enzimele implicate în toate

aceste produse de reacție specifice sunt încă un subiect de dezbatere. Reacțiile enzimatice

specifice sunt probabil, mult mai rapide și nu permit degradarea hidrolitică lentă, prin

urmare, procesul hidrolitic nu poate concura cu reacțiile enzimatice. [121, 122]

1.3.2.3.3. Reacții de adiție nucleofilă

Gruparea nesaturată α, β-diceto din curcumină participă la reacția de adiție

nucleofilă (adiția Michael), cu anioni de –OH, -SH, -SeH ca donori. Această reacție a fost

raportată ca fiind utilă pentru a explica chimia și activitatea biologică a curcuminei în

celulele vii. [119, 121, 122, 162-165].

Un interes deosebit a primit reacția tiolilor biologici, cum ar fi glutation ce conține

grupări –SH [162, 163]. Conjugatele curcumină-glutation au fost izolate din diferite sisteme

biologice. Formarea acestui produs de adiție ar conduce la epuizarea nivelurilor de glutation

în celule, conducând astfel la reducerea apărării antioxidante. Cu toate că unele rapoarte

sugerează că acestă reacție este reversibilă, teoria nu este încă confirmată încă în celulele vii.

O reacție similară a fost observată în timpul inhibării tioredoxin reductazei, de către

curcumină [164]. Centrul activ al acestei enzime este selenocisteina. Selenol din

selenocisteină fiind puternic nucleofil la pH fiziologic este supus ușor reacției de adiție 1,4

cu curcumina, formând diferite specii legate covalent. Se speculează că această reacție este

responsabilă pentru inhibarea enzimei tioredoxin reductaza de către curcumină.

Hidrogenul metilenic al fragmentului diceto/enol a curcuminei poate acționa ca și

un nucleofil și să participe la reacții de adiție Michael cu electrofilie puternică, dar acestea

nu pot avea o semnificație în sisteme biologice [166]. Derivații de curcumină obținuți prin

modificare chimică au fost preparați prin reacții de condensare și adiție, cum ar fi, de

exemplu, derivații de semicarbazonă și derivații oximă ai curcuminei. Aceste produse

stabile, preparate independent au fost examinate pentru activitatea anticancer. În cele mai

Page 38: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

37

multe dintre studii s-a raportat că acești derivați sunt mai citotoxici pentru celulele

canceroase decât curcumina liberă [167, 168].

1.3.2.3.4. Interacțiune cu ioni metalici

Curcumina formează complecși puternici cu majoritatea ionilor metalici cunoscuți.

Gruparea nesaturată α, β-diceto a curcuminei este un agent de chelare excelent.

Curcumina este considerat un ligand monobazic bidentat și formează complecși

stabili cu aproape toate metalele și non-metalele, obținându-se structuri stabile la un raport

stoechiometric curcumină: ion metalic de 2:1. Există foarte puține studii pentru raportul 3:1.

A fost raportat un complex octaedral cu Fe3+

[169]. Coordinarea curcuminei cu metalul are

loc prin gruparea enolică.

Există mai multe lucrări privind complecșii de curcumină cu metale tranziționale

cum ar fi Fe3+

, Mn2+

, Ni2+

, Cu2+

, Zn2+

, Pb2+

, Cd2+

, Ru3+

, Re3+

și multe altele. Există

complecși cu metale netranziționale și ioni rari cum ar fi: Al3+

, Ga3+

, Sm3+

, Eu3+

, Dy3+

, Y3+

,

Se2+

, precum și oxizi metalici cum ar fi VO2+. Structura și proprietățile fizice ale acestor

complecși depind de natura ionului metalic precum și de stoechiometria condițiilor de

reacție care la rândul lor decid stabilitatea și reactivitatea lor.

Complecșii metalici nu modifică numai proprietățile fizice ale curcuminei dar

afectează și reactivitatea biologică a metalelor. În general s-a observat că complexarea cu

curcumină reduce toxicitatea metalelor și unele complexe de curcumină cu metale cum ar fi

Cu2+

, Mn2+ acționează ca antioxidanți [170-177].

Datorită reacției reversibile de transfer de electroni cu ionul superoxid, complecșii

de Cu2+

, Mn2+

ale curcuminei acționează ca o enzimă ce mimează superoxid dismutaza.

Complecșii metalici ai curcuminei au o mare semnificație în ceea ce privește

patologia bolii Alzheimer, în cazul căreia s-a constatat că datorită naturii lipofile, curcumina

poate trece de bariera hemato-encefalică și ionii metalici chelați sunt toxici pentru neuroni.

S-a observat, de asemenea, că incidența bolii Alzheimer este redusă în mod semnificativ în

rândul persoanelor care sunt cunoscute a consuma în mod frecvent curcumină. Curcumina

formează complecși stabili cu toate metalele implicate în boala Alzheimer [177-179].

Interacțiunea Al3+

cu curcumina, anterior considerată a fi responsabilă pentru

apariția bolii a fost studiată extensiv. Curcumina formează trei tipuri diferite de complecși

cu Al3+, în funcție de stoechiometria reacției. Raportul stoechiometric curcumină: Al

3+ de

1:1 a prezentat o afinitate mai mică la legarea ADN-ului decât Al3+ liber, care a fost atribuită

abilității sale de reducere a incidenței bolii Alzheimer [178, 179].

Page 39: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

38

Au fost raportate numeroase alte aplicații ale complecșilor metalici cu curcumina.

Complexele de Ga3+

cu curcumină au fost concepute pentru materiale bioceramice inovative

[180]. Complexul de curcumină cu zinc a prezentat efecte anticancer, gastroprotective și

antidepresive la șobolani [181, 182]. Complecșii de curcumină cu aur au arătat o activitate

antiartritică la testele in vivo [183]. Complecții vanadil-curcumină au prezentat activitate

antioxidantă și antireumatică [184]. Prin formarea complecșilor metalici cu curcumină se

reduce toxicitatea metalelor grele cum ar fi Hg2+

, Cd2+

, Pb2+

unde stresul oxidativ indus de

metalele grele este redus semnificativ prin formarea complexului [185-189].

Datorită sarcinii pozitive complecșii metalici ai curcuminei se pot leaga de ADN

[174, 190]. Unele rapoarte afirmă faptul că aceștia induc deteriorarea ADN-ului și prin

urmare prezintă un efect pro-oxidant. Ca urmare, ei sunt explorați ca agenți antitumorali mai

buni decât curcumina în sine [191, 192]. Evaluarea biologică a acestor complecși este mai

dificil de efectuat in vivo, deoarece biodisponibilitatea lor este foarte scăzută iar

experimentele sunt dificil de efectuat datorită solubilității scăzute în solvenți organici cum

sunt DMSO sau în fluidele biologice. Cu toate acestea fără nici o îndoială această

complexare in vivo a curcuminei cu metalele joacă un rol semnificativ în reducerea

toxicității induse de metale.

Curcumina poate complexa cu diferiți liganzi. Complecșii cu punți de porfirină cu

Cu2+

, Ni2+

și Zn2+ prezintă o îmbunătățire a activității fotodinamice în modele de ADN

plasmidic [193]. Complecșii cu 4,4 bipiridină și Zn2+

sunt mai eficienți decât curcumina

pentru a distruge celulele de neuroblastom. Cei cu terpiridin lantanida (La3+) au arătat o

creștere în fototoxicitate în celulele HeLa [194]. Complecșii de bipirdin-curcumină cu Pd2+

inhibă formarea celulelor canceroase de prostată [191].

1.3.2.4. Studii farmacologice efectuate pe curcumină

Insolubilitatea în apă și biodisponibilitatea scăzută a curcuminei în celule au

determinat dezvoltarea de noi formulări pe bază de substanțe organice biocompatibile:

lipozomi, biopolimeri, hidrogeluri [195-197]. Pentru a crește biodisponibilitatea și a obține o

circulație mai eficientă, o permeabilitate mai bună și rezistență la procesele metabolice au

fost preparate mai multe formulări ce includ nanoparticule, lipozomi, micele și complexe

fosfolipidice. Studiile farmacologice relevă faptul că curcumina este sigură și eficientă, ceea

ce a determinat să fie utilizată în tratamentul și prevenirea unei game largi de boli umane.

Cu toate acestea, datele acumulate au arătat că curcumina are o biodisponibilitate relativ

scăzută și o slabă solubilitate în soluții apoase.

Page 40: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

39

Pentru prima dată Wahlstrom și Blennow (1978) au raportat faptul că după

administrarea orală a 1 g curcumină/kg la șobolani concentrațiile de curcumină care s-au

găsit în plasmă au fost neglijabile, fapt care se poate datora slabei absorbții din intestin

[198]. Într-un studiu în care curcumina a fost administrată oral la o doză de 2 g/kg la

șobolani, o concentrație serică maximă de 1,35 μg/ml a fost observată la un interval

de timp de 83 h, în timp ce la oameni la aceeași doză, cantitatea de curcumină este

nedectabilă sau foarte redusă în concentrațiile serice (0,006 ) [199].

Un alt studiu efectuat pe șobolani a arătat că administrarea per os a curcuminei 500

mg/kg a condus la o biodisponibilitate de 1% în plasmă; s-a observat faptul că administrarea

orală a curcuminei (1000 mg/kg) la șobolani a prezentat o concentrație plasmatică de 15

ng/ml după 50 min [200]. Spre deosebire de administrarea la rozătoare, administrarea a 4-8

g de curcumină la om au arătat nivele plasmatice maxime de 0,41-1,75 μM după o oră de la

administrare [201].

Într-un alt studiu efectuat pe voluntari umani sănătoși, 3,6 g curcumină administrată

oral a fost regăsită la nivel plasmatic într-o concentrație de 11,1 μmol/l, după o oră de la

administrare [202].

S-a constatat că 10 mg/kg curcumină administrată intravenos la șobolani a atins

nivelul seric maxim în curcumină de 0,36 μg/ml, în timp ce o doză de 50 de ori mai mare

administrată pe cale orală a dat o concentrație doar de 0,06 0,01 μg/ml în nivelele serice ale

șobolanilor [203]. Sun și colab. au arătat că administrarea intravenoasă a curcuminei libere

la șobolani prezintă o mai bună biodisponibilate in plasma sangvină. Concentrația a fost de

6,6 μg/ml în sânge cand s-au administrat 2 mg/kg curcumină intravenos [204].

Aceste studii sugerează rolul căii de administrare pentru atingerea nivelelor serice ale

curcuminei și, de asemenea, comparația între nivelele serice la rozătoare și oameni.

Page 41: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

40

CAPITOLUL 2

Polimeri utilizați pentru imobilizarea principiilor active în industria alimentară

Progresele in domeniul științei polimerilor au condus la numeroase apicații și în

domeniul industriei alimentare, îndeosebi a celor care apelează la biotehnologii. Inițial

polimerii au fost utilizați pentru solubilizarea sau stabilizarea principiilor biologic active, dar

treptat au fost dezvoltate sisteme noi de eliberare a acestora. Dezvoltarea continuă a științei

polimerilor a determinat obținerea de materiale performante pe bază de polimeri naturali și

sintetici cu proprietăți unice remarcabile pentru bioaplcații.

Polimerii pot fi clasificați în funcție de sursa de proveniență (naturali, semisintetici

și sintetici), geometria moleculei (liniari, ramificați, reticulați), procedeul de sinteză

(polimerizare înlănțuită sau treptiformă, policondensare), comportare termică (elastomeri,

termoplaste, fibre), biodegradabilitat (biodegradabil, nebiodegradabil).

În cele ce urmeazxă se va face o trecere în revistă a polimerilor utilizabili în diferite

aplicații din industria alimentară, în corelare și cu strctura lor [205].

2.1. Polimeri naturali

Polimerii naturali sunt biodegradabili, capabili să se descompună prin hidroliză

chimică sau catalizată de enzime în produse secundare biocompatibile. Această proprietate

face posibil ca ei să poată fi implantaţi în corpul uman fără a fi nevoie de îndepărtarea lor

ulterioară prin operaţii chirurgicale. Medicamentele și principiile active încorporate în aceşti

biopolimeri diferit formulați se eliberează controlat pe o perioadă prelungită de timp,

concentrația lor la locul ţintă din corp menținându-se în domeniul terapeutic [206, 207].

Viteza de eliberare a medicamentelor din biopolimeri poate fi controlata de un număr de

factori cum ar fi: cinetica de biodegradare a polimerilor [208], proprietăţile fizico-chimice

ale polimerilor şi ale medicamentelor [209] compatibilitatea termodinamică între polimeri şi

medicament [210], forma dispozitivelor [211, 212]. Faptul că pot fi utilizați în domeniul

medical îi recomandă cu prisosință și pentru aplicații în industrria alimentară, pentru

imobilizarea altor principii bioactive precum celule, microorganisme, enzime etc.

Polimerii naturali sunt reprezentați de proteine și polizaharide. Pentru îmbunătățirea

proprietăților mecanice sau pentru modificarea vitezei de degradare polimerii naturali sunt

deseori modificați chimic [213].

2.1.1.Proteine

Cuvântul „proteină‖ este definit ca oricare grupare de compuși organici complecși

având în compoziție, în principal, combinații de aminoacizi princși în legături peptidice,

Page 42: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

41

care conțin de obicei carbon, hidrogen, oxigen, azot și sulf. Se găsesc în plante și animale,

reprezentând principalul component al protoplasmei tuturor celulelor și sunt esențiale

pentru viață. Cuvântul „proteine‖ provine din limba greacă și înseamnă „prima‖ sau

„primară‖ datorită rolului esențial al proteinelor în susținerea vieții [214, 215].

Proteinele joacă in rol fundamental nu numai în susținerea vieții, dar și în produsele

alimentare provenite din plante și animale. Produsele alimentare variază prin conținutul lor

de proteine iar proprietățile proteinelor diferă în funcție de tipul lor. În plus față de

contribuția lor la proprietățile nutritive ale alimentelor, prin furnizarea aminoacizilor

esențiali pentru menținerea și creșterea sănătății umane, proteinele conferă și o bază

structurală pentru diferite proprietăți funcționale ale produselor alimentare.

Produsele animale, carnea, laptele, produsele din lapte, ouă, carnea de pui și

peștele sunt surse bogate în proteine conținând un nivel echilibrat de aminoacizi. Alimentele

pe bază de plante, legumele și nucile (oleaginoasele) sunt și ele surse de proteine. Proteinele

animale și cele din plante sunt diferențiate prin:

- Proteinele animale sunt în general asociate cu un conținut mare de grăsimi și datorită

acestui fapt, dacă sunt consumate în cantități mari există riscul de îmbolnăvire

conducând la declanșarea hipertensiunii arteriale și alte boli de inimă.

- Proteinele animale dispun de o combinație echilibrată a aminoacizilor, prin urmare

sunt numite și proteine complete. În schimb, proteinele vegetale sunt proteine

incomplete, singura excepție constituind-o proteina din soia [216].

2.1.1.1. Proteine din plante

Legumele și fructele sunt o sursă bună de proteine. Leguminoasele au un conținut

mai mare de proteine decât legume și fructe [217].

Câteva proteine mai importante, precum și caracteristicile și utilizările lor sunt

prezentate mai jos.

Proteine din soia reprezintă un amestec de proteine globulare pe bază de

conglicinine și sunt obținute din specia de plante Glycine max, familia Fabaceae [218]. În

funcție de masa moleculară și coeficientul de sedimentare proteinele acestea pot fi separate

în diferite fracții: 2S, 7S, 11S sau 15 S [219]. Fracțiile de globulină 7S și 11S au un conținut

de 37% și 31% proteinele din soia. În combinație cu alte proteine acestea pot forma filme;

glicinina este cunoscută ca agent de gelifiere, emulsifiere și agent de spumare [220]. β-

Conglicinina este mai puțin rezistentă la temperatură decât glicinina și este denaturată la

temperaturi cuprinse între 70-80˚C [221]

Page 43: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

42

Proteine din grâu

În funcție de solubilitate, proteinelor din grâu sunt clasificate în albumine (solubile

în apă), globuline (solubile în soluții diluate de săruri), gliadine (solubile în 70-90% etanol,

cuprind 34% din totalul de proteine) și glutenina (insolubilă în toți solvenții menționați

anterior, cuprind 47% din totalul de proteine) [222,223].

Gliadina joacă un rol important în formarea filmelor, cărora le conferă rezistență și

elasticitate [223]. Glutenina reprezintă un amestec de proteinecu diferite valori ale masei

moleculare. Legăturile disulfidice prezente în glutenină și gliadină determină rezistența

matricei de proteine [224].

Zeina din porumb

Zeina conține un procentaj mare de aminoacizi nepolari, în special glutamina (26

%), leucină (20%) și prolină (10%) și aminoacizi bazici și acizi în proporții scăzute. Este

insolubilă în apă [225]. Cele două fracții majore ale zeinei sunt: α-zeina, solubilă în 95%

etanol și β-zeina solubilă în 60% etanol. Comercial este utilizată ca strat de acoperire a

tabletelor și în ambalaje biodegradabile [224].

Proteinele din mazăre reprezintă un procent de 20-30% extrase din semințele de

mazăre și includ în principal din globuline (65-80%) și două fracții minore de albumină și

glutelină. Globulinele sunt compuse din trei proteine diferite: legumina, vicilina și

convicilina [226]. Fracția 11S de globulină este reprezentată de către legumină, în timp ce

fracția 7S de globulină este reprezentată de vicilină și convicilină [227].

Proteinele din orez

În timpul procesării orezului alb, se obține tărâțea care reprezintă o sursă de

proteine de înaltă calitat, ieftină, rezultând în urma procesului de măcinare [228]. În tărâțea

de orez se găsește o cantitate mai mare de proteine decât în boabele de orez și variază între

6% și 15% [229]. Sunt separate în general prin extracție cu alcali urmată de precipitare cu

alcali[230, 231] și prin tratament subcritic al apei [232]. După extracția succesivă conțin:

glutenina 75%, globulină 15%, albumină 6% și 3% prolamina [233]. Conținutul principal de

aminoacizi din proteinele de orez este similar cu cel din proteinele de cazeină și soia [234].

Proteinele din floarea soarelui

Proteinele sunt constituenți majoritari în turtele de ulei din floarea soarelui. Făina

de floarea soarelui degresată conține proteine în proporție de 2% din greutatea uscată [235],

sub forma a 4 fracții [236]: globuline 55-60 %, albumine 17-23% gluteline și prolamine (în

mai mică proporție. Sunt prezentate două fracții majore: globuline 11S (de asemenea

denumite heliantinine) și albumine 2S [216, 237].

Page 44: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

43

2.1.1.2. Proteine de origine animală

Proteinele care provin din surse animale conțin aminoacizi esențiali necesari pentru

o dietă la adulți.

Cazeina

Cazeina are o proprietate unică de a forma filme [216, 238, 239]. Se găsește în

lapte și produsele lactate. Sensibilitatea la ionii de Ca2+ determină agregarea și precipitarea

la concentrații mici ale ionului. Nu participă la formarea legăturilor de disulfide și la

reticulare datorită absenței grupărilor de cisteină libere. Cazeina este stabilă la temperatură

deoarece este bogată în prolină dar scindeazăp proteolitic. Această caracteristică împreună

cu punțile fosfat-calciu care scindează ușor în mediu acid le conferă posibilitatea de a fi

utilizate ca suporturi pentru transport și eliberare la tintă a unor medicamente în tractul

gastrointestinal [240, 241].

Proteinele din zer

Proteinele din zer sunt cele care rămân în lapte după coagularea cazeinei la pH 4.6

și 20˚C. Conțin β-lactoglobuline (M=66 kDa, conținând 160 de aminoacizi), α-lactalbumina

(M=14,2 kDa), BSA (M=66 kDa) și imunoglobine (un amestec de proteine termolabile)

[216, 242, 243].

Proteinele din carne

Tipurile de proteine din carne sunt: sarcoplasmice, stromale miofibrilare.

Colagenul și elastina fac parte din conținutul proteinelor stromale în timp ce miozina, actina

tropomizina și troponinele fac parte din conținutul proteinelor miofibrilare. Proteinele

stromale și miofibrilare sunt solubile în solutie de diferite săruri și sunt utilizate pentru

obținerea de filme și pentru acoperiri. Colagenul este o proteină stromală fibroasă, extrasă

din țesutul conjunctiv, tendoane, piele, oase și din sistemul vascular. La temperatură medie

și în condiții acide sau alcaline formează gelatina [244, 245].

Albumina din ouă

Fracțiile de proteină sunt: ovalbumina, ovotransferina, ovomucoid, ovomucina și

lizozima (un agent antimicrobian gram negativ prezent în albumină) [246].

Proteinele ovalbumina, ovotransferinași lizozima la denaturare formează structuri

puternice intermoleculare, de exemplu formează geluri la temperatură deoarece sunt

sensibile la temperatură [216].

Page 45: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

44

Proteinele de mătase

Viermii de mătase Bombyx mori produc mătase pe care o țes în coconul lor.

Biocompatibilitatea, biodegradabilitatea lentă, autoasamblarea, proprietățile mecanice

excelente, structura și morfologia controlabilă conduc la obținerea unor materiale

promițătoare pentru eliberarea medicamentelor și pentru ingineria tisulară [247].

Componentele proteice majoritare din mătase sunt fibroina (o proteină fibroasă) și

sericina care acoperă fibroina în coconul format [248].

Proteinele sunt utilizate pentru elaborarea de sisteme de eliberare controlat[ a

medicamentelor sau a genelor, sub formă de film pentru a acoperi diferite suprafețe,

hidrogeluri, nano/microparticule [249, 250].

Unele exemple sunt:

-Proteinele din grâu sunt utilizate ca și hidrogeluri, sisteme nanoparticulate pentru

încapsulare și eliberare controlată a compușilor bioactivi [216].

-Semințele de soia modificate genetic acumulează novochinină și pot fi utilizate în

tratamentul bolii HTA (hipertensiune arterială) [251].

-Pot crește solubilitatea curcuminei și sunt utilizate în industria alimentară sub

formă de micele (β-cazeina) [252].

-Proteinele din lapte pot fi utilizate ca vehicule pentru transportul componenților

bioactivi. Cazeina care provine din 4 peptide bioactive principale acționează asupra

sistemului cardiovascular, asupra sistemului nervos, asupra sistemului imunitar și asupra

sistemului nutrițional [253].

-Proteine vegetale cum ar fi proteinele din soia, mazăre, grâu, orez și floarea

soarelui, sunt utilizate pentru microîncapsulare [216].

2.1.2. Polizaharide

Polizaharidele joacă un rol central în toate organismele vii pentru suplimentarea și

depozitarea energiei și pentru integritatea structurală și protecția celulelor, permițând și

obținerea de noi materiale cu aplicații în domeniul medical, cosmetic, alimentar.

Polizaharidele prezintă multe interacțiuni moleculare: cu alte polizaharide, cu alte

tipuri de polimer (proteine, lignine, polifenoli, polimeri sintetici) și cu molecule mai mici

(apă, solvenți (ionici) care conduc la dizolvarea polizaharidelor) [254].

În ultimii ani un număr mare de studii au contribuit la înțelegerea rețelelor de

hidrogel pe bază de polizaharide. Gelurile obținute prin reticulare fizică sunt de mare interes,

Page 46: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

45

în special datorită faptului că formarea gelului poate avea loc în condiții blânde în absența

solvenților organici.

Pentru aplicații în industria alimentară se utlizează polizaharidele microbiene

utilizate: xantan, xililan, gelan, curdlan, pululan, dextran, scleroglucan, schizofilan și

polizaharide cianobacteriene, chitosan [255].

Clasificarea polizaharidelor se poate efectua după mai multe criterii:

după sarcina electrică:

- anionice: gelan, agar, pectină, caragenan.

- cationice: chitina și chitosanul.

- neionice: gumă guar, tamarind, xantan, celuloză.

după origine:

-marină: alginați, agar, caragenan.

-animală: chitosan, condroidin sulfat, acid hialuronic;

-vegetală: gumă guar, amidon, celuloză, pectină.

-microbiană: glicani, pululan, dextran, xantan, gelan.

după geometria macromoleculei:

-liniare: amiloza, pectina, celuloza

-ramificate: gumă guar, gumă arabică.

Polizaharidele îndeplinesc condiţiile cerute pentru imobilizarea unui principiu

biologic activ: sunt lipsite de toxicitate, inerte farmacologic, nu conţin impurităţi sau aditivi

şi compuşi reziduali ai proceselor de reticulare sau polimerizare, prezintă structură chimică

bine precizată. Abilitatea polizaharidelor de a forma geluri chiar şi la concentraţii foarte mici

reprezintă una dintre cele mai importante proprietaţi funcţionale ale acestora. Formarea

structurilor tridimensionale oferă o cale de creştere a stabilitaţii chimice şi mecanice a

sistemului [256].

Numărul polizaharidelor care au fost investigate pentru prepararea particulelor de

hidrogel potrivite pentru sistemele de eliberarea a compușilor biologic activi este foarte

variat iar în cele ce urmează vom trece în revistă aspecte privind structura, proprietățile și

aplicațiile unor pentru polizaharidele selectate în vederea realizării părții experimentale a

tezei.

2.1.2.1. Gelanul

Polizaharidele microbiene sunt polimeri solubili în apă şi pot fi ionice sau neionice.

Exopolizaharidele sunt sintetizate din microorganisme care se găsesc ataşate de suprafaţa

Page 47: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

46

celulei sau în mediul extracelular într-un amestec amorf. Unităţile din exopolizaharide se

repetă regulat, fiind ramificate sau neramificate şi sunt conectate prin legături glicozidice.

Primul glicopolimer sintetizat prin fermentare microbiană a fost dextranul în 1880. Xantanul

fost obtinut in urma cercetarilor efectuate în 1960 în mai multe laboratoare [257-259].

Kaneko si Kang au descoperit, în laboratorul Kelco de Merck & Co, California,

USA în 1978 un polimer solubil în apă – gelanul -, care a căpătat o importanţă majoră în

industria alimentară, farmaceutică şi chimică datorită proprietăţilor funcţionale pe care le

posedă. Succesul producției de gelan la nivel de laborator a fost raportat pentru prima dată în

1982 [260].

Gelanul este o polizaharidă anionică cu masă moleculară mare, produsă prin

fermentare microbiană, în condiţii aerobe din bacteria Auromonas (Pseudomonas) Elodea,

redenumită Sphingomonas paucimobilis. În 1988, după efectuarea studiilor de toxicitate,

Japonia aprobă guma gelan pentru utilizare în produsele alimentare. De asemenea, FDA

aprobă utilizarea gumei gelan ca aditiv în 1992 [261]. In prezent gelanul este obținut la scară

industrială, fiind cunoscute mai multe varietăți de tulpini tulpini Sphingomonas paucimobilis

capabile sa il produca: ATCC31461 , E2-DSM6314, NK 2000 si GS1 – cel mai bun

randament obtinându-se cu prima dintre acestea.

Gelanul este comercializat cu patru

denumiri diferite: Kelcogel, Gelrite, Phytagel şi Gel-Gro. Kelcogel este utilizat pe scară

largă în industria alimentară ca agent de îngroşare şi agent de gelifiere, în timp ce Gelrite,

Phytagel şi Gel-Gro sunt utilizați ca agenţi de solidifiere, ca substituenţi pentru agar, ca

medii pentru creşterea microbiană şi culturi de ţesuturi de plante [262-264].

În industria alimentară, gelanul este utilizat ca stabilizator, gelifiant, filmogen si ca

agent de încapsulare. În tehnologia farmaceutică, este adaptat la scară largă ca şi vehicul de

transport al medicamentelor. Aceste proprietăţi derivă din reactivitatea cu cationii şi din

abilitatea sa de a forma un gel la concentraţii remarcabil de mici în comparaţie cu alţi

hidrocoloizi cum ar fi carageenan, alginat, pectina sau gelatina [265].

Din punct de vedere structural este un polimer anionic, liniar cu secvenţe de

tetrazaharide care se repetă şi sunt constituite din două reziduuri de de β-D-glucoză, unul de

acid β-D-glucuronat şi unul de α-L-ramnoză (fig. 1) într-un raport 2:1:1 [266, 267]. În figura

4 este prezentată structura gelanului.

Page 48: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

47

Figura 4. Unitatea structurală a gelanului deacetilat (sunt indicate locurile unde substituenţii

gliceril si acetil sunt ataşati în gelanul bogat in grupe acil) [266, 267].

Polizaharida nativă are un substituent L-gliceril pe O(2) de la al 3-lea reziduu de

glucoză legat de secvenţa de tetrazaharide şi, în cel puţin câteva unităţi care se repetă o

grupă acetil la O(6) al aceluiasi reziduu [268].

În producţia comercială obişnuită ambele tipuri de substituenţi sunt îndepărtaţi prin

tratarea masei de fermentaţie cu alcali fierbinţi. Polimerul deacetilat rezultat este cunoscut ca

şi ―gumă gelan‖ sau prin numele comercial Kelcogel (pentru aplicaţii alimentare) sau Gelrite

(pentru aplicaţii nealimentare). Este comercializat şi gelanul bogat în grupe acil. Grupările

acil pot fi păstrate prin utilizarea procedurilor de extracţie mai blânde.

Macromoleculele de gelan se asociază câte două, într-o structură de dublu helix

(figura 5). Cele două lanţuri polimerice sunt paralele unul faţă de celălalt şi sunt imbinate

exact la jumătate (cu o rotaţie a lanţului de 180º), în aşa fel încât distanţa care se repetă a

helixului este jumătate din catena individuală, un aranjament similar cu cel observat pentru

caragenan. [269, 270].

(a) (b)

Figura 5: Structura de dublu helix a gelanului deacetilat vizualizat (a) perpendicular

pe axa helix şi (b) de-a lungul axei helix (locurile unde sunt ataşati substituenţii gliceril şi

acetil în gelanul bogat în grupe acil, în raport cu poziţia grupelor carboxil din vecinătatea

rezidului glucuronat, sunt indicate in (b) [269].

Proprietăți de gelifiere ale gelanului

Gelanul este exopolizaharidă microbiană anionică, solubilă în apă, cu masa

moleculară cuprinsă între 1-2x 106 Da pentru gelanul bogat în grupe acil şi 2-3 x10

5 Da

pentru gelanul deacetilat [270]. Gelanul acetilat este solubil în apă caldă în timp ce gelanul

Page 49: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

48

deacetilat sau cel care conţine puţine grupe acil (deacetilat) este solubil atât în apă caldă cât

şi în apă rece. Solubilitatea depinde de numărul de grupe acil/mol [271, 272]. Încălzirea la

85-95ºC a gelanului bogat în grupe acil este suficientă pentru solubilizarea sa în apă [273].

În cazul gelanului deacetilat sau cu puţine grupe acil hidratarea depinde de tipul şi

concentraţia ionilor, el fiind solubil în apă deionizată la temperatura camerei, la fel ca şi

sarea sa de sodiu. Prin adăugarea unei concentraţii foarte mici de ioni în soluţia de gelan

aceasta se schimbă în hidrogel la modificarea temperaturii. În comparaţie cu alte geluri de

polizaharide gelul de gelan este mai rezistent la temperatură şi mai puţin sensibil la pH [274,

275].

Gelifierea gelanului a fost investigată de mulţi cercetători, constatându-se ca este

un proces în două etape. În prima etapă are loc o schimbare conformaţională de la o

conformație dezordonată la una ordonată de dublu helix şi în a doua are loc agregarea dublu

helixului şi formare punctelor de joncţiune [276, 277]. Gelifierea depinde de concentraţia

soluției, temperatură şi de prezenţa în soluţie a cationilor monovalenţi sau bivalenţi. Gelanul

formează un helix ordonat din catene duble la temperaturi scăzute, în timp ce la temperaturi

înalte apare o singură catenă de polizaharidă, ceea ce reduce semnificativ vâscozitatea

soluţiei. Temperatura de tranziţie pentru transformarea de fază sol-gel este de 35ºC dar poate

varia între 30-50 ºC. Sub această temperatură se formează gelul de gelan. Mecanismul de

gelifiere constă în formarea unor zone de joncţiune dublu elicoidale, urmată de agregarea

segmentelor dublu elicodale pentru a forma o reţea tridimensională prin complexare cu

cationi şi prin legături de hidrogen cu apa [278, 279].

S-a sugerat că mecanismul de gelifiere a gelanului deacetilat în prezenţa ionilor

bivalenţi este diferit de mecanismul de gelifiere care are loc în prezenţa ionilor monovalenţi

[270]. În prezenţa cationilor monovalenţi, gelifierea apare cu agregarea ulterioară a dublu

helixului şi la o temperatură mai scăzută decât cea la care apare tranziţia de la o structură

neregulată la structura ordonată de dublu helix. În schimb, se presupune ca în cazul

cationilor bivalenţi aceştia ar interacţiona imediat cu segmentele de lanţ din gelan atunci

când are loc răcirea, formând o structură ordonată specifică la o temperatură mai ridicată

decât temperatura de tranziţie. Reţelele de gel astfel formate devin foarte stabile la

temperatură după adăugarea progresivă de cationi [280, 281].

Cationii monovalenţi scad repulsia electrostatică prin legarea lor la structura

elicoidală în locurile specifice din jurul grupelor carboxilice ale polimerului. Puterea

legăturii creşte cu creşterea razei ionice (Li+< Na

+< K

+< Rb

+< Cs

+). Sunt necesare

concentraţii mai mari de cationi monovalenţi pentru obţinerea unor geluri de gelan cu o tărie

Page 50: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

49

optimă în timp ce sunt necesare concentraţii de cationi bivalenţi mult mai mici pentru

obţinerea unui gel cu aceeasi tărie [269, 276]. Agregare şi gelifierea cu cationii bivalenţi

apare direct în zonele de legare din helixul dublu al ionilor bivalenţi. Concentraţii mari de

sare sau de acid cauzează agregarea excesivă și în consecinţă scade tăria gelului.

Aceste structuri ordonate devin extrem de stabile la temperatură prin adăugarea

progresivă de cationi bivalenţi, mai eficienţi decât cei monovalenţi. Cationii bivalenţi ai

metalelor tranziţionale (Zn2+

, Cu2+ şi Pb

2+) dau geluri mai puternice decât metalele din grupa

II [282]. Gelurile care conţin cationii Ca2+

sunt de 1.1-1.4 ori mai puternice decât cele care

conţin cationii Mg2+

la aceeaşi concentraţie de sare [276].

Potenţialul de gelifiere a gelanului este îmbunătăţit prin adăugarea de cationi

monovalenţi sau bivalenţi în timpul procesului de răcire ceea ce duce la creşterea numărului

de punţi de sare din zona de joncţiune [283].

Metodele reologice reprezintă o cale de monitorizare a procesului de gelifiere a

fluidului vâscoelastic, deoarece vâscoelasticitatea soluţiei de polimer se schimbă mult la

punctul de gel. Temperatura de gelifiere crește cu creșterea concentraţiei de cationi [284-

286].

Studiile reologice şi de microscopie confocală laser de baleiaj demonstrează că

soluţiile cu concentraţii de gelan între 0.005-0.05 %, în prezenţa a 10 mM CaCl2 duc la

formarea unei reţele de gel. La concentraţii mai mici de gelan, spectrul mecanic arată un

comportament de gel iar observaţiile microscopice indică formarea unei reţele

tridimensionale chiar dacă vâscozitatea soluţiei este redusă semnificativ. Creşterea

progresivă a concentraţiei de gelan determină un caracter elastic al sistemelor de gel obţinute

dar îmbunătăţirea proprietăţilor gelului depinde de concentraţia de cationi [275, 287].

Figura 6 prezintă două modele de mecanism de gelifiere, propuse de Robinson [288]

respectiv de Grunning [289].

=

Page 51: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

50

Fig 6. Modele de gelifiere propuse de a) Robinson şi colab.(1991)şi b) Gunning şi Morris

(1990). Cationii care promovează agregarea structurii dublu elicoidale sunt reprezentaţi prin

prin cerculeţe umplute [289, 290].

Au fost efectuate diverse studii asupra factorilor care influenţează tăria gelului, cei

mai importanţi dovedindu-se următorii:

Conţinutul de grupe acil

Cercetările au evidentiat faptul că acesta este cel mai important factor care

influenţează proprietăţile şi tăria gelului. Gelanul nativ, bogat în grupe acil formează geluri

moi, elastice, termoreversibile şi foarte slabe. Grupările acetil şi gliceril împiedică asocierea

strânsă între lanţurile polimerice pentru formarea structurii elicoidale şi, de asemenea,

împiedică împachetarea compactă în dublu helix. Gelanul deacetilat formează geluri ferme,

fragile (casante) şi termoreversibile datorită absenţei grupelor acetil şi gliceril [291].

Tipul şi concentraţia ionilor

Ionii au impact asupra tăriei gelului şi asupra fragilităţii acestuia. Gelanul nu

formează geluri în apă deionizată, dar prin adăugarea de săruri de calciu, potasiu, sodiu şi

magneziu se observă o imbunătățire a acestor două proprietăţi. Cationii bivalenţi sunt mult

mai eficienţi în realizarea acestei proprietăţi. Chiar şi la concentraţie foarte mică de gelan

(0,2% m/v) a fost realizat un gel cu o rezistenţă ridicată, cu o concentraţie de 0.004 % (m/v)

ioni de calciu şi 0.005 % (m/v) ioni de magneziu. Un gel la fel de puternic poate fi obţinut

utilizând o concentraţie de 0,16 % ioni de sodiu şi 0,12 % (m/v) ioni de potasiu. O

concentraţie de 0.1- 0.2 % de gelan este potrivită pentru multe sisteme alimentare. Din punct

de vedere economic este important să se obțină geluri puternice la o concentraţie cât mai

mică de gelan, cu încorporarea unei cantităţi infime de sare [281, 292].

PH-ul

Sanderson şi Clark au arătat că tăria gelului poate fi îmbunătăţită în domeniul de pH

3.5-8, care corespunde domeniului de pH natural din majoritatea alimentelor. Modificarea

pH-ului nu modifică punctul de formare a gelului, dar afectează în unele cazuri temperatura

de topire. De exemplu, geluri preparate cu concentraţii foarte scăzute de ioni monovalenţi se

topesc la 70ºC, la un pH neutru, dar la un pH=3,5 temperatura de topire este uşor crescută.

Această tendinţă nu a fost observată pentru ionii bivalenţi [293, 294].

Prezenţa ingredientelor hidrofile

Adăugarea de ingrediente hidrofile, cum ar fi zaharoza (cu o concentraţie de

aproximativ 10% m/v) tinde să scadă concentraţia de ioni necesari pentru crearea unui gel

rezistent. Au fost preparate şi studiate amestecuri formate din gelan deacetilat (< 1 % ) cu

Page 52: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

51

zahăr în concentraţii mici (0 - 20 %) şi mari (80-85 %). Micrografiile gelurilor de gelan cu

conţinut ridicat de zahăr dovedesc reducerea reticulării în reţeaua de polizaharide, care după

răcire prezintă o tranziție de la o consistenţă elastica la una sticloasă [295].

Tang şi colaboratorii au studiat efectul fructozei şi zaharozei asupra proprietăţilor

gelurilor de gelan reticulate cu ioni de calciu sau sodiu (temperatura de gelifiere, claritatea

gelurilor şi textura). Au raportat faptul că creşterea concentraţiei de zaharoză şi fructoză în

geluri cu până la 35% nu a avut nici un efect peste temperatura de gelificare.

Încorporarea de fructoză şi zaharoză în geluri a dus la creşterea clarităţii acestora.

Efectul zaharozei asupra tăriei gelului s-a găsit a fi dependent de concentraţia de cationi. La

o concentraţie scăzută de cationi zaharoza consolidează (întăreşte) gelurile, dar la

concentraţii mari aceasta face ca gelurile sa fie mai slabe [296].

Influenţa zahărului în soluţia de gelan a fost investigată de Miyoshi şi Nishinari

(1999) [297], respectiv de Miyoshi şi colab.(1998) utilizând ca metode de caracterizare DSC

şi testele reologice [298]. Concentrația de zahăr a variat de la 0 la 72%. Bayarri şi colab.,

2002, studiază efectul zaharozei (0-25%) pentru trei probe de gelan de concentraţii diferite

0.3, 0,75 şi 1.2%, utilizînd teste de compresiune. Crescând cantitatea de zaharoză gelurile

devin mai puternice şi mai puţin fragile. Modificările s-au putut distinge mai bine atunci

când au fost utilizate concentrații mai mari de gelan [299].

Sworn şi Kasapis (1998) au făcut studii privind influenţa zaharozei asupra tăriei

gelului, utilizand concentraţii de peste 40% zaharoză; ei observă o creştere a tăriei gelului în

aceste condiții [300]. Adăugarea unor cantităţi de glucoză sau fructoză împreună cu o

cantitate de zaharoză până la o concentraţie totală de 60% zaharuri a dus la obţinerea unui

gel mai puternic decât dacă s-a utilizat doar zaharoza. Valoarea modulului la rupere a fost

mai mare pentru gelurile de gelan în care s-a adăugat fructoza decât pentru gelurile de gelan

în care s-a adăugat doar zaharoza în aceeaşi concentraţie [301]. După cercetările efectuate de

Gibson (1997) eficienţa zaharurilor pentru obţinerea unor geluri de gelan cu o tărie optimă

este următoarea:

fructoză> glucoză> zaharoză.

Miyoshi şi Nishinari (1999) [297] afirmă exact opusul celor spuse de Gibson,

ordinea eficienţei fiind după aceşti cercetători

zaharoză> glucoză> fructoză.

Morris şi colaboratorii (2012) afirmă că această diferenţă se datorează tipurilor

diferite de gelan utilizate în cercetare, gelanul comercial având cantităţi mai mari de cationi

bivalenţi decat gelanul cu conţinut mare în ioni de sodiu utilizat de către Miyoshi şi

Page 53: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

52

Nishinari (1999). Gelanul comercial cu un conţinut mai mare în cationi bivalenţi utilizat

pentru obţinerea de geluri, în prezenţa zahărului manifestă o agregare excesivă. Aceasta

determină o scădere în tăria gelului conducând la următoarea ordine a eficienţei zaharurilor

pentru obţinerea unor geluri de gelan mai puternice :

fructoză> glucoză> zaharoză [276]

Temperatura şi punctul de topire

Gelanul este stabil la temperaturi mari şi îşi menţine rezistenţa până la 90ºC.

Potrivit celor spuse de Sanderson şi colaboratori, temperatura de topire poate fi mai mică sau

mai mare de 100 ºC, în funcţie de condiţiile de formare a gelului. Cel mai important factor

responsabil pentru modificarea punctului de topire este concentraţia cationilor din geluri

deoarece cationii monovalenţi şi bivalenţi cresc semnificativ numărul de zone de joncţiune

în geluri şi le face mai rezistente la temperatură. Prin posibilitatea de modificare a punctului

de topire se pot înlocui cu succes alţi agenţi de îngroşare/stabilizatori convenţionali,

utilizând în acelaşi timp o concentraţie mult mai mică de polimer [272].

Absorbţia de apă

Capacitatea de absorbţie a apei este un parametru important pentru materialele care

urmează să fie utilizate în diverse aplicaţii alimentare şi biomedicale. Absorbţia de apă a

hidrogelurilor fizice şi chimice de gelan a fost evaluată în diverse medii. Hidrogelurile fizice

au arătat un comportament similar în diferite medii, ceea ce înseamnă că absorbţia de apă nu

este influenţată de compoziţia hidrogelurilor de gelan. Doar hidrogelul fizic cu o

concentraţie de 2% gelan arată valori mai scăzute ale proprietăților de umflare, în special în

soluţia care simulează fluidul gastric (HCl 0.1 M; pH=1), cînd se formează zone de

joncţiune mai stabile. De fapt, la pH=1, apare o suprimare a comportamentului

polielectrolitic în lanţurile de gelan, deoarece grupele carboxilat sunt în forma lor acidă. În

aceste condiţii lanţurile polimerice pot fi mai apropiate între ele ceea ce duce la diminuarea

macroscopică a gelului. Pentru probele reticulate chimic absorbţia de apă este puternic

dependentă atât de compoziţia hidrogelului cât şi de cea a soluţiei. Absorbţia de apă este

invers proporţională cu gradul de reticulare al probei. Când hidrogelurile sunt umflate în

apă, comportamentul lor este similar cu cel al materialelor superabsorbante, arătând valori

foarte mari ale parametrilor de umflare [292].

În soluţie de ser fiziologic (0,9 % g/v) şi în soluţia care simulează fluidul intestinal

(tampon fosfat; pH=7.4) hidrogelurile reticulate şi cele fizice arată valori scăzute ale

gradului de umflare, datorită prezenţei ionilor de sodiu în cantități mari, contraioni care

reduc repulsiile electrostatice între grupările carboxilice ale lanturilor polimerice şi crează

Page 54: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

53

astfel o structură mai compactă. Proba cu o concentraţie în gelan de 2% reticulat chimic cu

lizină 0.1 % reprezintă o excepţie de la acest comportament. În acest caz absorbţia de apă

este mai mare datorită faptului că lanţurile polimerului sunt în conformaţie de helix şi

reţeaua, cu un grad de reticulare destul de redus, este capabilă să absoarbă cantităţi mari de

apă. Din nou, în fluidul gastric simulat se observă o absorbţie redusă de apă [292].

Pe lângă parametri cum ar fi masa moleculară, structura chimică şi grupele

funcţionale care determină proprietăţile soluţiilor de gelan, vâscozitatea intrinsecă este o altă

proprietate importantă [302], ce depinde de masa moleculară, structură moleculară, pH, tăria

ionică a soluţiei şi temperatura. Ea scade cu creşterea concentraţiei de sare şi a temperaturii

[303].

Aplicaţii alimentare ale gelanului

Hidrocoloizii sau gumele aparţin unor clase de polimeri naturali iar atunci când sunt

dispersaţi în apă formează dispersii apoase sau geluri. Datorită numeroaselor grupări

hidroxil pe care le pospermit utilizarea lor în industria alimentară ca agenţi de îngroşare,

gelifiere, emulsifiere, stabilizare, sunt utilizaţi pentru acoperiri (filme alimentare) etc.

Motivul principal pentru care sunt utilizaţi în alimente este reprezentat de proprietatea lor de

a modifica din punct de vedere reologic alimentele – modifică vâscozitatea şi textura

alimentelor [304]

În ultimii ani au apărut tot mai multe cazuri de obezitate şi boli cronice datorate

unui mod de viaţă nesănătos şi a unei alimentaţii ce conţine puţine substanţe nutritive, cu

alimente bogate în grăsimi ce pot dăuna sănătăţii. Terapiile alternative şi alimentele

funcţionale sunt o alternativă în prevenirea şi tratarea acestor boli. Numeroase produse pe

bază de hidrocoloizi au fost elaborate pentru înlocuirea grăsimilor din alimente [305].

Datorită proprietăţilor sale funcţionale gelanul a devenit un polimer mult utilizat în

industria farmaceutică, cosmetică, alimentară. Astfel, este folosit pentru producerea de

geluri lichide, filme alimentare, deserturi gelatinoase, gemuri şi este utilizat şi ca sistem

polimeric pentru încapsularea a numeroşi componenţi bioactivi [306]. El poate fi utilizat și

pentru înlocuirea ingredientelor nedorite, în mod special a grăsimilor,obţinând în acest mod

alimente cu un conţinut scăzut în calorii sau produse care pot creşte senzația de saţietate

[307-309].

Poate fi utilizat ca suport biopolimeric pentru încapsularea diverselor ingrediente

bioactive, pentru protecţia şi eliberarea lor controlată şi pentru obţinerea de alimente

funcţionale care au numeroase beneficii în prevenţia şi tratarea bolilor cronice [103].

Page 55: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

54

Fiind un înlocuitor al gelatinei asigură structura, textura şi gustul în multe alimente

mai bine decât aceasta. Este utilizat în cofetărie, înlocuieşte jeleurile produse din amidon,

deoarece are timpul de gelifiere mai mic, oferă o structură optimă şi o altă senzaţie la

gustarea acestor alimente, previne pierderea umidităţii în alimentele dulci. În deserturile

gelatinoase este utilizat deoarece conferă acestora o mai mare claritate şi temperatura de

topire a gelului de gelan poate fi crescută, păstrând în acest mod alimentele moi şi suculente

[261].

În produsele alimentare pe bază de amidon modificat este utilizat pentru a le creşte

stabilitatea, fiind şi un agent de legare cu apa; previne efectul amidonului asupra aromei

alimentelor; poate fi utilizat în multe produse alimentare pentru a oferi o formă şi o structură

după procesele de încălzire-răcire. Alimentele fabricate din carne, fructe, produse zaharoase

se încadrează în această categorie [309-311].

Geluri lichide

Gelurile lichide sunt soluţii vâscoase care la viteze mici de forfecare au un

comportament similar cu al gelurilor cu o tărie mai mare, iar la viteze mari de forfecare

acţionează ca fluide. Datorită posibilităţii de creare a anumitor texturi şi proprietăţilor

reologice unice ale gelanului au fost realizate geluri lichide cu aplicaţii în industria

alimentară. Gelurile de gelan împiedică sedimentarea particulelor şi de aceea sunt utilizate în

sucuri cu pulpă de fructe sau în alimente cu textură lichidă ce conţin cacao, fibre sau

minerale insolubile. Particulele sunt prinse în structura de gel [312].

Factorii care influenţează formarea gelului sunt: temperatura, concentraţia

gelanului, tipul și concentraţia cationilor, de cationi, agitarea şi tensiunea de forfecare

aplicată. O schimbare a acestora conduce la comportamente reologice diferite pentru un

produs ce are o compoziţie constantă, rezultând geluri elastice sau fluide [313, 314].

Gelurile amintite fac parte din categoria gelurilor fizice deoarece punctele de

legătură sunt formate prin legături fizice precum: legături de hidrogen, legaturi hidrofobe şi

îmbinările transversale cu ajutorul cationilor. Bazat pe aceastăp proprietate, gelanul a fost

utilizat pentru a stabiliza Doogh, o băutură produsă prin fermentarea laptelui care conţine

particule de mentă sau fibre de grâu insolubile. În ambele studii utilizarea gelului lichid de

gelan împiedică separarea fazelor în Doogh, ceea ce conduce la schimbarea

comportamentului reologic şi ajută la formarea unei texturi adecvate în băutura tradiţională

iraniană. Proprietăţile reologice ale Doogh au fost schimbate prin adăugarea de fibre şi gelan

de la un comportament Newtonian la un comportament pseudoplastic [315, 316].

Page 56: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

55

Au fost obținut un ingredient alimentar format dintr-un amestec de gelan deacetilat

şi gelan acetilat care să ajute la structurarea conţinului din stomac şi astfel să aibă efect

asupra saţietăţii. PH-ul acid afectează gelifierea şi structura amestecului devine cea de rețea

semi-interpenetrată. Obţinerea unui astfel de gel depinde de raportul cantităţilor de

biopolimeri. Gelanul acetilat este utilizat într-o proporţie de aproximativ 60 % [317].

S-au făcut cercetări pentru producerea de geluri mixte fabricate din mai mulţi

hidrocoloizi cu aplicaţii în industria alimentară. Gelurile mixte oferă caracteristici superioare

produsului alimentar fiind mai eficiente decât cele în care se utilizează un singur hidrocoloid

[318]; totodataă, ele oferă avantaje economice şi beneficii pentru sănătate deoarece ajută la

fabricarea alimentelor funcţionale [319].

Studiile pentru prepararea gelurilor nutriţionale cu suc/pulpă de morcov au

demonstrat că pot fi elaborate în mod particular cu gelan [320]. Soumya Banerjee şi

colaboratorii [321] au făcut cercetări pentru determinarea proprietăţilor texturale ale gelului

nutriţional mixt format din agar, gelan şi suc de morcov. Pentru prepararea gelului s-au

utilizat cantităţi egale de soluţie de hidrocoloid (1%) şi suc de morcov şi o cantitate de

zaharoză care a variat de la 7.5% până la 15 % [321]. Datorită pectinei din sucul de morcov,

tensiunea de rupere, energia de comprimare şi sinereza cresc în gelul de gelan. Zaharoza

îmbunătăţeşte coeziunea gelului format. Aceste geluri fiind bogate în β-caroten aduc

beneficii pentru sănatate şi se arată promiţătoare pentru comercializare [321].

Filme alimentare

Filmele alimentare reprezintă un strat subţire de biopolimeri care acoperă produsele

alimentare.

Biopolimerii au un rol semnificativ în reducerea absorbţiei de ulei în alimentele

prăjite. Studii privind privind aplicaţii ale biopolimerilor pentru prelucrarea alimentelor

prăjite au luat amploare în ultimii ani [322]. Gelanul are proprietatea de gelifiere termică

ceea ce explică capacitatea sa de a reduce absorbţia de ulei. El reduce deshidratarea şi oferă

mai puţin spaţiu pentru absorbţia uleiului în textura alimentelor în timpul prăjirii [323].

Deserturi gelatinoase şi gemuri

Gelanul este un biopolimer potrivit pentru producerea deserturilor gelatinoase şi

gemurilor, din moment ce poate fi uşor gelifiat şi umiditatea poate fi controlată. Deserturile

gelatinoase obţinute prin utilizarea gelanului au o mare claritate (transparenţă) similară cu

cea dată de gelatină. Punctul de topire ridicat al gelurilor de gelan duce la păstrarea

proprietăţilor deserturilor la temperatura camerei. Pentru a prepara astfel de produse gelanul

este în mod normal utilizat la o concentraţie de 0.3% [262].

Page 57: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

56

În producţia de gemuri, pectina poate fi înlocuită de gelan.Gelanul oferă produse cu

o sinereză inferioară, cu proprietăţi senzoriale dorite şi cu mai puţine calorii în comparaţie

cu pectina [324].

Microîncapsularea

Incapsularea şi proteja componenţilor bioactivi este de mare interes pentru

industria alimentară. O cerință esenţială a acestora este compatibilitatea atât cu componentul

bioactiv cât şi cu produsul în care vor fi încorporate pentru a crea un aliment funcţional sau

o băutură funcţională. Alte atribute ale sistemelor includ creşterea stabilităţii sau eliberarea

controlată a componenţilor bioactivi [103].

Probioticele sunt microorganisme ce pot oferi beneficii pentru sănătate

organismului uman, prin menţinerea echilibrului microbian în tractul digestiv [325].

Beneficiile pe care le furnizează sunt: menţin flora intestinală sănătoasă, inhibă creşterea

bacteriilor patogene, ajută la stimularea creşterii sistemului imunitar, ajută sinteza

vitaminelor, sunt agenţi antimicrobieni şi ajută la îmbunătăţirea absorbţiei de calciu atunci

când există suficiente probiotice în colon. Speciile bifidobacteria şi lactobacillus sunt cele

mai cunoscute şi mai importante probiotice ce ajută la menţinerea sănătăţii tractului

gastrointestinal [326, 327]. Viabilitatea celulelor probiotice din alimente depinde de o serie

de factori cum ar fi: pH-ul, acidifierea în timpul proceselor fermentative ale alimentelor,

producerea peroxidului de oxigen şi temperatura de depozitare. Prin metoda

microîncapsulării, supravieţuirea şi stabilitatea celulelor creşte în mediile neprielnice iar

eliberarea se face controlat într-un anumit loc ţintă din tractul gastrointestinal. Alimentele în

care probioticele au fost încorporate sunt, în general, produse lactate: iaurt, brânză,

îngheţată, deserturi lactate dar şi alte alimente: ciocolată, cereale, sucuri [328].

Cercetările au demonstrat că gelanul este un biopolimer adecvat pentru

încapsularea probioticelor. El nu numai că poate rezista în condiţii acide, dar, de asemenea,

este stabilizat cu ajutorul ionilor de calciu şi devine capabil de a proteja celulele de mediul

acid. Gelanul în combinaţie cu xantanul a fost utilizat cu succes pentru acoperirea speciilor

de bifidobacterii [329]. Celule de Lactobacillus casei au fost incluse într-o matrice de gel

formată dintr-un amestec de cazeinat de sodiu şi gelan, utilizând ca metodă de obţinere

emulsia apă în ulei. Gelifierea amestecului de biopolimeri s-a realizat prin scăderea treptată

a pH-ului cu glucocono-δ-lactonă. S-a obţinut o eficienţă de încapsulare de 89,5%. Testele

in vitro efectuate pentru a observa rata de supravieţuire a celulelor au constatat că

viabilitatea celulelor încapsulate este mai mare decât cea a celulelor libere [330].

Page 58: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

57

Suporturi şi tehnici de imobilizare variate au fost propuse şi testate în aplicaţii

pentru producţia de băuturi alcoolice. S-a propus spre elaborare un biocatalizator cu

perspective reale de a fi utilizat în tehnologia de producere a vinurilor spumante format din

particule sferice de gelan în care au fost imobilizate celule de drojdie. Bilele s-au format prin

extruderea soluției de gelan printr-o capilară într-o baie de soluţie de 2% CaCl2 (reticulant

ionic) [331].

Tan si colab., au investigat fezabilitatea încapsulării celulelor de drojdie utilizând

ca suport gelanul, printr-o metodă de emulsifiere; microbioreactoarelor rezultate pot fi

reutilizate. Producţia de etanol în primele trei cicluri a fost comparabilă cu cea care

utilizează drojdia liberă. Microbioreactoarele sunt stabile şi au fost uşor de recuperat din

mediul de fermentaţie prin filtrare, putand fi reutilizate pentru cel puţin 10 cicluri cu un

randament relativ mare de etanol [332].

Administrarea ingredientelor pe bază de proteine se face pe cale orală. Acestea au

o capacitate redusă de a trece peste bariera intestinală epitelială deoarece sunt sensibile la

enzimele din tractul gastrointestinal [333, 334]. Sistemele polimerice pot proteja proteinele

de aceste enzime. Astfel, absorbţia proteinelor şi a peptidelor are loc în colon și nu în

segmentele anterioare ale tractului digestiv [335].

Gelanul este rezistent la enzime cum sunt pectinaza, amilaza, celulaza, papaina şi

lipaza [336]. O degradare semnificativă se produce în prezenţa galactomanazei, ceea ce

facilitează eliberarea componenţilor bioactivi din sistemul polimeric în fluidele din colon

[337].

Fei Yang şi colab. (2013) au preparat şi evaluat particulele sferice obţinute din

chitosan şi gelan prin gelifiere ionotropică şi complexare polielectrolitică pentru

încapsularea şi eliberarea controlată a proteinelor, utilizând ionii de calciu. Albumina a fost

încorporată în paticulele obținute cu o eficienţă ce variază între 65-85%. Eficienţa în

încapsulare şi viteza de eliberare a proteinei depind de concentraţiile de chitosan, calciu şi

gelan. Concentraţii mai mari de gelan combinate cu uscarea la vid încetinesc eliberarea

rapidă a proteinei la pH=1.2, dar se obţine o eliberare susţinută la pH= 6.8; o eliberare

eficientă este observată la pH=7 [338].

2.1.2.2. Derivați celulozici

Sunt compuși rezultați prin modificarea chimică a celulozei.

Celuloza este un polimer natural produs de plante. Este o polizaharidă structurală și

cel mai abundent polimer produs de plante. Gradul de polimerizare variază funcție de sursă.

Este solubilă doar în unii solvenți agresivi cum ar fi lichidele ionice și nu poate fi procesată

Page 59: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

58

termic deoarece se degradează înainte de punctul de topire [339]. Este importantă în

domeniul aplicațiilor alimentare îndeosebi prin derivații săi, care vor fi discutați în cele ce

urmează.[340].

Majoritatea derivaților celulozici aparțin categoriei eterilor, cuprinzând alchil,

hidroxialchil și alchilhidroxialchil celuloze. Prezența grupelor hidroxil în catena principală a

celulozei condiționează realizarea diverselor reacții de eterificare (substituirea hidrogenului

din grupa OH cu un rest alchil sau aril) sau esterificare (substituirea hidrogenului din grupa

OH cu un rest acil) a celulozei, prin care polimerul îsi modifică esențial proprietățile fizico-

chimice și în particular solubilitatea, putându-se obține polimeri solubili în apă sau în soluții

diluate alcaline, în solvenți organici (alcool, acetonă, etc).

Proprietățile chimice și fizice ale derivaților celulozici sunt influențate de tipul

substituentului, gradul de substituţie, uniformitatea distribuirii substituentului din catenă,

gradul de polimerizare şi distribuţia maselor moleculare. Agregarea unor porţiuni de lanţ

nesubstituit sau slab substituit duce la formarea de macrogeluri, utilizate în realizarea unor

produse farmaceutice cu proprietăţi reologice tixotrope [341].

Eterii celulozei posedă stabilitate chimică, capacitate slabă de ardere, o bună

fotostabilitate, termostabilitate (la căldură şi la frig) şi solubilitate în solvenţii obişnuiţi.

Proprietăţile eterilor celulozici depind de natura radicalului introdus prin O-alchilare, de

gradul de polimerizare şi de polidispersitatea eterului rezultat. Cu creşterea dimensiunilor

restului alchilic introdus se micşorează interacţiunea dintre lanţurile compusului, scade

temperatura de înmuiere şi se reduce rezistenţa mecanică a preparatelor.

Sinteza eterilor celulozici se realizează prin O-alchilarea celulozei cu halogenuri

alchilice sau cu alchilsulfaţi în prezenţa alcalilor. (Schema1)

[C6H7O2(OH)3]n + nRHal + nxNaOH [C6H7O2(OH)3-x(OR)x]n + nxNaOH + nx H2O

[C6H7O2(OH)3]n + nx(CH3)2SO4 + nx NaOH [C6H7O2(OH)3-x(OCH3)x]n+ nx

(CH3)NaSO4 + nx H2O

Schema 1: Reacție schematică a obținerii eterilor celulozici.

Cu ajutorul dialchilsulfaţilor se prepară numai metil celuloza şi etilceluloza. Pentru

eterii superiori se folosesc exclusiv alchilhalogenurile [342].

Dintre eterii celulozei cu utilizare largă în domeniul medical, farmaceutic şi

cosmetic se remarcă: metilceluloza, etilceluloza, hidroxietilceluloza, şi carboximetilceluloza.

Materialele pentru uz farmaceutic au început să se comercializeze la sfârșitul anilor ‘40 în

scopul înlocuirii gumelor naturale, cât şi datorită înaltei purităţi, bunei stabilităţi şi

posibilităţilor de manipulare a proprietăţilor acestora.

Page 60: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

59

Derivaţii celulozici folosiţi astăzi în tehnologiile farmaceutice sunt, în general,

metilceluloza şi produşii foarte asemănători substituiţi cu grupe hidroxialchil [343]:

- hidroxietilmetilceluloza-HEMC

- hidroxipropilmetilceluloza-HPMC

- etilhidroxietilceluloza-EHEC

- hidroxietilceluloza-HEC

- hidroxipropilceluloza-HPC

- carboximetilceluloza sodică-CMCNa

Câțiva derivați cu importanță deosebită în aplicațiile alimentare sunt discutați în

cele ce urmează:

Etilceluloza

Derivat cu rezistenţă mecanică superioară şi o bună stabilitate chimică [344].

Carboximetilceluloza sodică (CMCNa)

Este sarea de sodiu a eterului hidroxiacetic al celulozei. În figura 7 este prezentată

structura celulozei și a carboximetil celulozei de sodiu.

(a) (b)

Figura 7. Structura celulozei (a) și a carboximetil celulozei (b)

Cel-ONa + Cl-CH2-COOH Cel-O-CH2-COOH + NaCl

Principalele caracteristici şi denumirile comerciale ale produsului sunt prezentate în

următorul tabel.

Tabel 2. Principalele caracteristici ale carboximetil celulozei.

Structura chimică Carboximetilceluloza sodică

Denumiri comerciale Cellulose Gum, Cellosid CMC, Tylose C., Coulose,

Edifas B., Herkules CMC, Polyfibrom Spezial,

Dehidazol, Ultraquellstoff.

Masa moleculară 21000-500000

Grad de polimerizare 100-2000

Grad de substituţie 0.6-1.0

Aspect Pulbere, granule sau fibre higroscopice

Page 61: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

60

Proprietăţi fizice Substanţă inodoră şi insipidă;

Solubilă în apă rece şi la cald, cu formarea unei

soluţii vâscoase;

Solubilă în amestecuri de apă cu alcool etilic sau

acetonă,

pH-ul soluţiei apoase:6.5-8;

Soluţia apoasă este solubilă la încălzire.

Aplicaţii Agent de aglutinare pentru comprimate;

Stabilizator pentru emulsii;

Agent de îngroşare pentru siropuri.

Dizolvarea CMCNa în apă conduce la formarea unor soluţii coloidale, care conţin,

la concentraţii mici, macromolecule filiforme, iar la concentraţii mari geluri. Soluţiile de

CMCNa sunt pseudoplastice, iar gelurile tixotrope. CMCNa are comportare de electrolit

coloid, fiind susceptibilă să participe la reacţii ionice. Grupele hidroxil neeterificate pot

participa la reacţii chimice.

Mucilagiul de CMCNa 2% este un gel vâscos, slab gălbui, translucid sau uşor

opalescent, fără miros şi gust; soluţia 10% este neutră. Se amestecă în orice proporţie cu apa

sau glicerina. Vâscozitatea soluţiilor de CMCNa este influenţată de concentraţie, pH,

temperatură, prezenţa electroliţilor, prezenţa altor polimeri hidrosolubili, solvenţi organici,

bacterii. Soluţiile de CMCNa sunt vâscoase între pH 6-9; sub pH 6 are loc o scădere

accentuată a acesteia până la pH 2; rar peste pH 9 valorile de vâscozitate scad mai lent. Este

un agent de suspensie pseudoplastic şi tixotrop a cărui vâscozitate scade cu temperatura, dar

revine la valorile iniţiale după răcire.

Electroliţii precipită CMCNa din soluţie. CMC este compatibilă cu acidul tanic, cu

zahărul şi poliolii. În prezenţa poliolilor puternic higroscopici are loc o deshidratare.

Prezintă tendinţa de a forma complecşi cu unele substanţe medicamentoase pe care le

floculează sau le precipită sau cu agenţi microbieni cărora le micşorează activitatea. Se

obţine rezistenţă maximă faţă de sedimentare în stare de repaus conferită de agentul tixotrop

şi o curgere uşoară după agitare datorită CMC care funcţionează ca agent pseudoplastic

[345]. CMCNa poate fi utilizat ca agent de îngroșare, agent de stabilizare a diferitelor

emulsii și poate forma filme. Datorită numărului mare de grupe funcționale hidrofile cum ar

fi grupele OH și COONa prezintă o hidrofilie mai bună decât celuloza și poate și ajută

alimentele să-și păstreze o anumită umiditate, formă și structură. Se utilizează în înghețată,

Page 62: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

61

în diferite produse de patiserie, în diferite băuturi care conțin suspensii cum sunt sucurile

nectar care conțin pulpă de fructe.

Modificată prin grefare cu N-vinil-2-pirolidona (CMC-g-PVP), în amestec cu

polimerul inițial s-a utilizat pentru imobilizarea drojdiei de panificație Saccharomyces

cerevisiae prin metoda extruderii utilizând ca agent de reticulare AlCl3. Particulele sferice

obținute, supuse testării activității fermentative pentru 27 de ore, au condus la un randament

în etanol de 57 g/L. Randamentul în etanol crește atunci când gradul de reticulare al

particulelor formate scade [348, 349].

Hidroxipropilmetilceluloza

HPMC prezintă o bună activitate de suprafaţă dar nu formează geluri. Este cel mai

utilizat polimer de acoperire obţinut în urma reacţiei dintre clorura de metil şi oxid de

propilen cu celuloza sodică. Are excelente proprietăţi filmogene, rezultând filme flexibile,

rezistente, stabile şi care nu influenţează dezagregarea. Se pretează la acoperirea în pat

fluidizat sau prin atomizare (aerosolizare). Este solubil în sucul gastrointestinal şi în sisteme

de solvenţi organici, ceea ce permite folosirea sa fără ca să interfereze cu dezintegrarea

comprimatelor şi biodisponibilitatea medicamentelor. Învelişul format de HPMC este stabil

la lumină, căldură, aer şi la un anumit grad de umiditate. Se dizolvă atât în soluţii apoase

acide sau alcaline cât şi în solvenţi organici.

HPMC se fabrică în diferite tipuri: Methocel E, F şi K Premium, prezentând

diferite grade de substituţie cu hidroxipropoxi şi cu metoxi [346, 347].

2.1.2.3. Chitina/Chitosanul

Chitina este o polizaharidă naturală de mare importanță, fiind prima dată

identificată în 1884. Acest biopolimer este sintetizat de un număr mare de organisme vii iar

după celuloză este cel mai abundent polimer natural. Este constitută din unități structurale de

2-acetamido-2-deoxi-D-glucoză fiind unite între ele prin legături β(1-4). Chitina se obține

din natură din microfibrile cristaline ordonate componente ale scheletului exterior ale

artropodelor sau în peretele celular al fungilor și a drojdiei. Chitina se găsește în două forme

α-chitina și β-chitina. α-Chitina izomorfă este forma cea mai abundentă.

Ambii polimeri au potențialul de a forma diverse matrici polimere cu o gamă largă

de aplicații în diferite domenii datorită biocompatibilității (sunt netoxice și au o

imunogenitate scăzută), biodegradabilității, proprietăților antimicrobiene [350, 351].

Chitina, datorită grupelor de acetamidă din unitatea structurală, poate fi modificată chimic

Page 63: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

62

mai ușor decât celuloza. Insolubilitatea chitinei în aproape toți solvenții comuni determinată

de legăturile de hidrogen numeroase, reprezintă un obstacol în utilizarea sa [350, 352].

Fibrele de chitină sunt indicate pentru utilizare la suturile chirurgicale. Studiile in

vivo au arătat că suturile efectuate cu fibre de chitină au fost absorbite în mușchii

șobolanilor în aproape 4 luni [351, 353].

Chitosanul reprezintă produsul principalul obținut prin procedeul de deacetilare

alcalină a chitinei și este un polimer liniar natural semi-cristalin, policationic, cu structură

liniară, compus din unități (1→4)-2-acetamido-2-deoxi-β-D-glucan (N-acetil-D-

glucozamină) și (1→4)-2-amino-2-deoxi-β-D-glucan (D-glucozamină) [354]. S-au efectuat

multe studii referitoare la posibilitatea de a fi utilizat în diferite domenii, [350, 351, 355]

datorită proprietăților sale excelente cum ar fi: biodegradabilitate, biocompatibilitate,

netoxicitate, mucoadezivitate și datorită prezenței grupelor funcționale amino și hidroxilice

ce determină posibilitatea de modificare chimică facilă [356, 357].

Denumirea de chitosan este atribuită chitinei care are peste 60% resturi D-

glucozaminice, ceea ce corespunde unui grad de deacetilare de 60% [358, 359].

Chitina și chitosanul sunt polizaharide foarte reactive în comparație cu alte

polizaharide naturale cum sunt celuloza, dextrina, pectina acidul alginic etc. deoarece

proprietățile lor antioxidante, hemostatice, caracteristicile de solubilitate și cele structurale

sunt diferite în multe medii [360-362].

Datorită proprietăților atractive biologice au fost efectuate multe studii pentru

utilizarea chitinei și chitosanului în aplicații din domeniul farmaceutic și medical [363-366].

În general, chitina este mai potrivită pentru a fi utilizată ca biomaterial comparativ

cu chitosanul datorită prezenței grupelor de acetamidă (NHCOCH3) care sunt prezente într-

o cantitate mai mare în lanțul polimeric decât în chitosan. Această grupare este similară cu

gruparea amidică a proteinei din țesutul viu, de aceea are diferite aplicații în ingineria

tisulară [367]. La chitosan, grupele amino se găsesc într-un procentaj mai mare la poziția de

la C2 ceea ce conferă caractereristici hemostatice dispozitivelor implantate [368].

În figura 8 este prezentată structura chitinei și a chitosanului.

Page 64: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

63

(a) (b)

Fig.8 Structura chimică a chitinei (a) și chitosanului (b)

Aplicații avantaje și limitări:

Chitina și chitosanul au o varietate de aplicații în domeniul biomedical în

vindecarea rănilor, în obținerea unor pansamente, pentru acoperiri antibacteriene, în

ingineria tisulară, obținerea de membrane de separare, senzori și sisteme de eliberare

controlată a medicamentelor [369, 370]. Sunt utilizați pentru imobilizarea de enzime în

industria alimentară și de celule cum ar fi cele implicate în prelucrarea laptelui; amilazele

pot fi grefate pe chitină [370]. Recent chitina a fost studiată pentru aplicații în domeniul

farmaceutic și medical deoarece poate forma filme, fibre și poate fi utilizată pentru

vindecarea rănilor [371, 372] și ca suport pentru eliberarea controlată a medicamentelor.

[351, 373].

Chitina și chitosanul au un spectru larg de aplicații alimentare cum ar fi conservarea

alimentelor, deoarece previne deteriorarea microbiană (are efect antimicrobian).[374,

375].Oferă claritate sucurilor de fructe și împiedică acidifierea lor [376, 377], formează

filme biodegradabile [378-381] și ajută la purificarea apei [382].

Cei doi polimeri pot fi utilizați ca adjuvanți farmaceutici [383], aditivi în cosmetică

[384, 385], finisaje textile, agent chelator de metale grele, membrane, cimenturi, fibre

tubulare și în producția de hârtie [386, 387].

Au fost raportate studii în care au fost preparați derivați funcționali de chitosan prin

modificări chimice [351, 385]. Mulți cercetători au raportat faptul că chitina și chitosanul

Chitina este de natură hidrofobă și este insolubilă în apă și în mulți solvenți organici. Este

solubilă în solvenți specifici precum: hexafluoroacetonă, hexafluoro-2-propanol sau N, N-

dimetilacetamidă [349, 390].

Unele utilizări ale chitosanului sunt redate în talelul 3

Page 65: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

64

Tabel.3 Utilizări ale chitosanului în industria alimentară

Compozitia suportului utilizat

Compusul

biologic activ

imobilizat

Tipul de

formulare Obiectivul urmarit

Biblio

grafie

Chitosan 0,05% reticulat ionic

cu 0,1% TPP Curcumină Nanoparticule

Cresterea biodisponibilității

și a stabilității curcuminei-

administrare orală

[391]

Lecitină/Chitosan Quercetină Nanoparticule Utilizarea în alimente

funcționale [392]

Cazeină(sau BSA)/Chitosan

(complex electrostatic)

Fluoresceina,

rodamina B și

riboflavină

Nanoparticule Încapsularea și eliberarea

substanțelor nutraceutice [393]

Chitosan/ Gelatină /Pectină-

aldehida glutarică utilizată

pentru reticulare

BSA Film încapsularea și eliberarea

compușilor bioactivi [394]

Chitosan (tehnica coacervării) Ulei esențial

limonena Microcapsule

Încapsularea și eliberarea

compușilor bioactivi [395]

Alginat de

sodiu/Chitosan/CaCl2

(reticulare ionică, complexare

polielectrolitică)

Celule de

drojdie de bere Particule

Influența imobilizării

celulelor asupra procesului

de fermentare pentru

producerea berii

[396]

Chitosan/TPP/Aldehidă

glutarică (metoda reticulării) Papaină Microparticule

Influența imobilizării

enzimei asupra activității

enzimatice, recuperarea și

posibilitatea de reutilizare a

enzimei proteolitice.

[397]

Polibutilcianoacrilat(polimeriz

are în emulsie), chitosan

(pentru acoperirea

nanoparticulelor)

Curcumină Nanoparticule Activitatea antitumorală-

administrare parenterală [398]

Page 66: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

65

2.1.2.4. Caragenanul

Caragenanul aparține familiei de galactani hidrofili liniari sulfatați cu o masă

moleculară mare, fiind format din unități alternante de D-galactopiranoză și 3,6-anhidro-

galactoză (3,6-AG) unite prin legături alternative alternante de α-1,3 și β-1,4- glicozidice.

Tipurile de caragenan cum ar fi λ, κ, ι, ε, μ, θ au un conținut de 22-35 % grupe sulfat,

clasificare realizată în funcție de solubilitatea acestora în clorură de potasiu[399].

În procesul de obținere a caragenanilor, pe lîngă galactoză și sulfat, pot exista și alte

reziduuri de carbohidrați: xiloza, glucoza, acizi uronici și substituienți cum ar fi grupe de

metil eteri și piruvat [400]. Proprietățile caragenanilor sunt influențate în principal de

numărul și poziția grupelor de ester sulfat și de asemenea de conținutul de 3,6-anhidro-

galactoză (3,6-AG). Conținutul de grupe ester-sulfat pentru kappa-caragenan este în jur de

25-30% și 28-35 % grupe 3,6-anhidro-galactoză, iotta-caragenan conține grupe sulfat în jur

de 28-30% și 25-30 % grupe 3,6-anhidro-galactoză, iar lambda-caragenan conține grupe

ester-sulfat în jur de 32-39 % și nu conține nici o grupă 3,6-anhidro-galactoză.

Structura chimică a principalelor tipuri de caragenani este redată în figura 9

Fig.9 Structura principalelor tipuri de caragenan utilizate pentru aplicații în industria

alimentară: (a) kappa (k), (b) iota (i) și (c) lambda (λ)

Masa moleculară medie a caragenanilor diferă în funcție de natura sa; spre exemplu

caragenanul nativ ar avea o valoare a masei moleculare medii de la 1.5 × 106 la 2 × 10

7, iar

cel de calitate alimentară o valoare de 100.000–800.000 sau 200.000– 400.000, pe când

caragenanul degradat (poligeenan) are o masă moleculară medie de 20.000–30.000.

Domeniul de toleranță a pH-ului pentru caragenani este cuprins în intervalul 4-10,

în mediu acid acestia având o stabilitate slabă. Caragenanii sunt sensibili la depolimerizarea

realizată prin hidroliză acidă, pentru că o temperatură ridicată și un pH scăzut conduc la

pierderea completă a funcționalității lor. Studiile au relevat că acesta este netoxic și neiritant,

este sigur de utilizat în industria alimentară nefiind stocat în organele animalelor testate

Page 67: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

66

(șoareci, maimuțe, iepuri, porcușori), și nu este nici cancerigen; de asemenea toxicitatea

depinde de masa moleculară și nu de grupele sulfat [399].

Soluțiile de caragenan sunt destul de stabile la pH neutru sau alcalin. La pH mic

stabilitatea soluțiilor scade, în special la temperaturi ridicate, datorită hidrolizei care conduce

la pierderea capacității de vâscozitate și de gelifiere; în cazul în care gelul este deja format

nu mai intervine procesul de hidroliză acesta fiind stabil chiar și la pH 3,5 – 4. Datorită

limitărilor caragenanului în condiții acide pentru aplicațiile practice este de dorit evitarea

prelucrării soluțiilor lor la pH mai puternic acid și temeraturi ridicate pe o perioadă mai

îndelungată de timp [401]. În tabelul 4 sunt redate câteva suporturi pentru imobilizarea

compușilor biologic activi pe bază de caragenan cu posibile aplicații în domeniul alimentar.

Page 68: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

67

Tabel 4: Utilizarea caragenanului în industria alimentară

Compozitia suportului

utilizat

Compusul

biologic

activ

imobilizat

Tipul de

formulare Obiectivul urmarit Bibliografie

Chitosan/k-

Caragenan/CMCNa-

metoda emulsiei duble

O/W/W și înghețare

(criogenare)

Curcumină Gel criotropic

Imobilizarea și

eliberarea controlată a

curcuminei

[402]

I-Caragenan (reticulare

ionică cu ioni de

potasiu, calciu și fier

3+)

Curcumina Fibre

Imobilizarea și

eliberarea controlată a

curcuminei

[403]

Chitosan(np)/k-

Caragenan/Alginat de

sodiu (reticulare ionică)

Curcumina

Nanoparticule

de chitosan în

microparticule

de polizaharide

Creșterea solubilității și

a biodisponibilității

curcuminei și eliberarea

controlată

[404]

k-Caragenan (reticulare

ionică cu KCl)

Celule de

drojdie Particule

Creșterea

randamentului în etanol

în procese fermentative

[405-407]

k-Caragenan (metoda

emulsiei/uscare prin

pulverizare)

Coenzima

Q10 Microparticule

Imobilizarea coenzimei

Q10 și creșterea

solubilității și a

biodisponibilității

[408]

k-Caragenan reticulat

ionic cu KCl pe o

membrana filtrantă

Urează Film

Păstrarea activității

catalitice a enzimei

imobilizate și

reutilizarea enzimei

imobilizate în mai

multe cicluri hidrolitice

[409]

Page 69: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

68

2.1.2.5. Alginații

Acidul alginic este o polizaharidă coloidală hidrofilă naturală obținută din specii

variate de alge maro (Phaeophyceae). A fost investigat extensiv și utilizat pentru multe

aplicații biomedicale, datorită biocompatibilității sale, toxicității reduse, a costului relativ

scăzut și formează ușor geluri prin adăugarea de cationi bivalenți, cum ar fi Ca2+

.

Fisher și Dörfel au fost primii care au identificat restul de L-guluronat [410] iar

reziduul de D-manuronat a fost considerat component major al alginaților. Alginații sunt

acum cunoscuți ca fiind bloc copolimeri naturali conținând reziduuri legate 1,4 de β-D-

manuronat (M) și α-L-guluronat (G). Conținutul în resturile din alginați de D-manuronat și

α-L-guluronat și lungimea fiecărui bloc poate diferi în funcție de specia de alge care se

utilizează pentru extracția lor.

Se crede că doar blocurile de α-L-guluronat participă la reticularea intermoleculară

cu cationi bivalenți pentru a forma hidrogeluri. Raportul dintre β-D-manuronat și α-L-

guluronat, lungimea blocului de guluronat și masa moleculară reprezintă factori importanți

care pot afecta proprietățile fizice ale alginaților și a hidrogelurilor obținute.

Structura acidului alginic este prezentată în figura 10.

Figura 10: Structura acidului alginic

Masa moleculară a tipului de alginat care este comercializat este cuprinsă între

32.000 și 400.000 g/mol. Vâscozitatea soluțiilor de alginat crește atunci când pH-ul scade și

atinge o valoare maximă la pH 3-3.5, când grupările carboxilat din catena principală a

alginaților se protonează și formează legături de hidrogen.

Alginații sunt în general utilizați sub formă de hidrogel în multe domenii cum sunt

cele biomedicale. Hidrogelurile sunt de multe ori biocompatibile și pot fi utilizate ca

suporturi pentru eliberarea controlată a compușilor bioactivi. Reticularea chimică și/sau

fizică a polimerilor hidrofili reprezintă abordări tipice pentru a obține hidrogeluri.iar

proprietățile lor fizico-chimice sunt dependente de tipul de reticulare și de densitatea de

reticulare, în plus față de masa moleculară și compoziția chimică [411]. Câteva aplicații ale

alginaților în industria alimentară sunt exemplificate în tabelul 5.

Page 70: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

69

Tabel 5. Aplicații ale suporturilor polimerice pe bază de alginați în industria

alimentară

Compozitia

suportului

utilizat

Compusul

biologic activ

imobilizat

Tipul de

formulare Obiectivul urmarit Bibliografie

Alginat de

sodiu reticulat

cu CaCl2

Țesut din

rizomi de

turmeric

Particule

Extragerea curcuminei

și a proteinelor din

rizomii de turmeric

[412]

Alginat de

sodiu reticulat

cu CaCl2

Celule de

drojdie Particule

Creșterea

randamentului în

etanol în procese

fermentative continue

sau repetate

[413-415]

Alginat de

sodiu reticulat

covalent cu 1-

etil-3-(3-

dimetilamino-

propil)

carbodiimide

(EDAC) și

reticulat ionic

cu CaCl2

α-Amilază Particule

Utilizarea particulelor

obținute în cicluri de

hidroliză repetate

utilizând ca substrat

amidonul

[416]

2.2. Polimeri sintetici

În funcție de proprietățile lor de degradare polimerii sintetici pot fi clasificați în

biodegradabili și nebiodegradabili. În ultimii ani dezvoltarea ingineriei tisulare, a medicinei

regenerative, a eliberării controlate din diferite suporturi polimerice a medicamentelor și a

compușilor biologic activi au determinat obținerea de noi biomateriale cu proprietăți

îmbunătățite de biodegradabilitate. Polizaharidele și proteinele sunt polimeri tipici biologici

biodegradabili, în timp ce poliesterii alifatici și polifosfoesterii sunt biopolimeri tipici

sintetici biodegradabili.[205]

Polimerii sintetici biodegradabili au devenit o alternativă atractivă pentru aplicațiile

biomedicale determinată de următoarele considerente:

Page 71: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

70

Deși polimerii biodegradabili naturali au o mai bună compatibilitate, există posibilitatea

ca să se declanșeze un răspuns imun în corpul uman, ceea ce ar putea fi evitat prin

utilizarea unui polimer sintetic biodegradabil.

Modificările chimice ale biopolimerilor naturali biodegradabili sunt dificil de efectuat.

Modificările chimice pot provoca alterarea proprietăților polimerilor naturali. [417].

Proprietățile fizice și chimice ale polimerilor sintetici pot fi controlate prin reacțiile de

polimerizare, prin alegerea monomerilor, iar concentrațiile acestora condițiile de reacție

pot fi reglate pentru a obține copolimeri

Pot fi menținuți în organism un anumit interval de timp iar apoi pot fi eliminați fără a fi

nevoie de intervenții chirurgicale.[418]

În funcție de domeniul în care sunt utilizați sunt cerute unele proprietăți specifice

pentru a putea fi utilizați ca materiale utilizate în domeniul biomedical. Ca exemplu, diferite

materiale pentru ingineria tisulară trebuie să dețină proprietăți de biocompatibilitate,

proprietăți de adeziune celulară și în plus trebuie să fie biodegradabile. Sistemele de

eliberare controlată a medicamentelor trebuie să fie dotate cu proprietăți ce răspund la

diferiți stimuli pentru eliberarea controlată. Funcționalizarea polimerilor sintetici

biodegradabili pentru a obține și îmbunătăți proprietățile este inevitabilă. Există două

strategii comune utilizate în funcționalizare: grupele funcționale sunt întroduse în reacție

odată cu monomerul, înainte de polimerizare, grupele funcționale sunt întroduse pe lanțurile

polimerului după ce acesta a fost obținut.[213, 417]

Câteva exemple de polimeri sintetici biodegradabili, ce prezintă în structura lor

grupări esterice, ortoesterice, amidice, ureice sau uretanice sunt enumerate mai jos.

Poliesteri: poli(acidul lactic), poli (acidul glicolic), poli(caprolactona), poli(acidul

lactic-co-glicolic).

Polianhidride: poli(acid adipic), poli(acid sebacic), poli(acid tereftalic)

Poliacetali

Poliamide: poliaminoacizi, poliaminocarbonați

Derivați pe bază de fosfor: polifosfați, polifosfonați, polifosfazene

Poli(alchil cianoacrilați)

Poliuretani.

Deoarece în prezenta lucrare nu am utilizat polimeri sintetici ca suporturi pentru

imobilizarea compușilor biologic activi cu care am lucrat, nu am extins studiul bibliografic

și asupra lor, limitându-ne doar la cele prezentate mai sus.

Page 72: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

71

CAPITOLUL 3

Metode de imobilizare

Metodele de obţinere a hidrogelurilor de polizaharide se bazează pe reticularea

fizică sau chimică. Hidrogelurile reprezintă reţele tridimensionale, capabile să absoarbă

cantităţi mari de apă sau fluide biologice. Proprietăţile funcţionale ale hidrogelurilor au dus

la utilizarea lor în aplicaţii de transport și eliberare a principiilor active determinând

utilizarea atât în domeniul farmaceutic și medical cât și în industria alimentară.

Hidrogelurile au, in general, o structură poroasă ce poate fi reglată prin controlul densităţii

de reticulare în matricea de gel [419]. Se aseamănă cu ţesutul viu natural mai mult decât cu

orice alt biomaterial iar conţinutul mare de apă contribuie la buna lor biocompatibilitate.

Modificarea de fază a polimerilor utilizaţi ca sisteme de transport poate declanşa eliberarea

primcipiului activ imobilizat, ca un răspuns la stimulii externi. Hidrogelurile pe bază de

astfel de polimeri pot suferi tranziţii de fază, de volum sau transformări de fază sol-gel în

funcţie de condiţiile de mediu. In consecinta, ele joacă un rol important deoarece pot

determina unde și cum să fie eliberat medicamentul, dar şi când, respectiv în ce interval de

timp să se produca acest proces. [420, 421].

Există diferite considerente pentru care se preferă încapsularea în particule de

diferite dimensiuni a componenților bioactivi și a medicamentelor. O parte din aceste motive

sunt redate în cele ce urmează:

-principalul motiv pentru încapsulare este de a elibera susținut sau prelungit

principiile active iar concentrația terapeutică în plasmă să fie menținută constantă o perioadă

mai mare de timp;

-această tehnică a fost utilizată mult pentru a masca gustul și mirosul multor

medicamente și de a îmbunătăți complianța pacienților;

-această tehnică a fost utilizată pentru a transforma medicamentele din stare lichidă

în pudră;

-principiile active care sunt sensibile la oxigen, umiditate sau lumină, pot fi

stabilizate prin încapsulare;

-incompatibilitatea între diverse medicamente poate fi prevenită prin încapsulare;

-vaporizarea multor substanțe active volatile (ca exemplu salicilat de metil, ulei de

mentă) poate fi prevenită prin oîncapsulare;

-multe medicamente au fost immobilizate pentru a le reduce efectele adverse cum

ar fi toxicitatea și iritarea gastro-intestinală;

-prin încapsulare, biodisponibilitatea principiului activ poate fi crescută [422, 423].

Page 73: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

72

Sistemele de încapsulare care sunt utilizate în alimente includ lipozomi, coacervate,

particule, geluri si complecşi de incluziune moleculară [93, 424].

Deşi polimerii sunt des utilizaţi pentru a crea hidrogeluri pentru aplicaţii

farmaceutice şi biomedicale, mulţi nu sunt permişi în alimente şi băuturi [425].

În locul polimerilor sintetici, polizaharidele şi unele proteine alimentare pot fi

utilizate pentru a crea hidrogeluri de tip alimentar. Există mai multe tehnici pentru a forma

particule de hidrogel. Multe se bazează fie pe ruperea matricei continue de gel pentru a

forma particule de hidrogel sau formarea picăturilor dispersate care apoi sunt gelifiate printr-

un mecanism specific cum ar fi schimbarea temperaturii (gelifierea prin încălzire sau la rece

), prin adăugarea unei enzime sau prin adăugarea de ioni, cum ar fi calciul [426, 427].

În acord cu McClements principalele metode pentru a crea particule de hidrogel cu

aplicații pentru industria alimentară sunt următoarele: ruperea gelului macroscopic,

coacervarea simplă, injecția și emulsionarea. În scopul de a elabora sisteme de eliberare

potrivite, nutraceuticele şi suplimentele nutritive pot fi clasificate în componente hidrofile,

lipofile şi amfifile şi componente care nu sunt solubile nici în ulei nici în apă (ex.

probiotice). Cele hidrofile pot fi transportate într-o matrice formată din biopolimeri, în timp

ce componentele lipofile sunt în general transportate într-un sistem pe bază de emulsie

[427].

Cele mai utilizate metode pentru obținerea de microparticule cu aplicații în

industria alimentară sunt discutate în cele ce urmerază.

3.1. Metoda extruderii sau a gelifierii ionice

Este cea mai utilizată pentru imobilizarea celulelor microbiene și a principiilor active

[428-430]. Ea are loc în condiţii blânde care permit ca încapsularea să se producă fără a

distruge microorganismele [431].

Metoda a fost folosită foarte des deoarece este o metodă simplă. Gelifierea ionică

este bazată pe abilitatea polielectroliţilor de a gelifia în prezenţa contraionilor pentru a forma

hidrogeluri. Tehnica de gelifiere ionotropică a fost utilizată la scară largă pentru

încapsularea componenţilor bioactivi în alginaţi, gelan şi carboximetil celuloză. Particulele

de hidrogel sunt produse prin picurarea soluţiei de polimer în care componenţii bioactivi

sunt încorporaţi, într-o soluţie apoasă ce conţine cationi. Cationii difuzează în picăturile

polimerice încărcate cu componenţii bioactivi şi formează o reţea tridimensională reticulată

ionic [432].

Page 74: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

73

Producţia la scară industrială prin această metodă este dificil de realizat şi

nepractică chiar dacă s-a încercat îmbunătăţirea ei prin introducerea unor dispozitive cu jet

de aer şi dispozitive vibraţionale, deoarece apar probleme operaţionale prin blocarea

capilarei, apar dificultăţi la curăţare şi probleme sanitare [433]. Particulele obţinute prin

această metodă sunt de dimensiuni mari, de aproximativ 1 mm în diametru [434, 435].

Microsferele sunt în general preferate pentru încapsularea celulelor microbiene

pentru a forma microbioreactoare datorită dimensiunii mici şi suprafeţei mari raportată la

unitatea de volum pentru un transfer de masă eficient [436].

Dispozitive de extrudere cu capilare mai fine pot produce particule mici, dar

înfundarea orificiilor este des întâlnită mai ales atunci când se produc particule mai mici de

100 μm. [437, 438]. În tabelul 6 sunt prezentate câteva tipuri de particule obținute prin

gelifiere ionotropă .

Page 75: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

74

Tabel 6: Exemple de suporturi polimerice obținute prin gelifiere ionică

Compoziția suportului Tipul de suport

Compusul

biologic activ

imobilizat

Obiectivul urmărit Bibliografie

Alginat de sodiu/CaCl2 Particule Celule de drojdie Creșterea productivității în

etanol [439-441]

Gelan/CaCl2 Particule Celule de drojdie Creșterea productivității în

etanol [442]

Gelan/Acetat de magneziu Particule Celule de drojdie Creșterea productivității în

etanol [443]

k-Caragenan/KCl/CaCl2 Particule Celule de drojdie Creșterea productivității în

etanol [444-446]

CMC-g-PVP/AlCl3 Particule Celule de drojdie Creșterea productivității în

etanol [447, 448]

Chitosan/TPP Nanoparticule

polifenoli din

extract E.

splendens extract

Imbunătățirea

caracteristicilor și a

activității antioxidante

[449]

Chitosan/TPP și Alginat/k-

Caragenan/KCl/CaCl2

Nanoparticule

de chitosan în

microparticule

de polizaharide

Curcumină

Creșterea solubilității și a

biodisponibilității

curcuminei

[404]

Alginat de sodiu/CaCl2 Particule α-Amilază

Utilizarea în cicluri de

hidroliză repetate utilizând

ca substrat amidonul

[450]

Alginat de

sodiu/Gelatină/CaCl2 Particule β-galactozidază

Utilizarea în cicluri de

hidroliză repetate utilizând

ca substrat lactoza

[451]

Alginat/Chitosan /CaCl2 Nanoparticule Vitamina B2

Incorporarea în alimente a

nanoparticulelor încărcate

cu vitamina B2

[452]

Alginat–chitosan Nanoparticule Insulina Imobilizarea și eliberarea

controlată a insulinei [453]

Page 76: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

75

3.2. Metoda emulsiei

O tehnică de încapsulare alternativă este procesul de emulsifiere care a fost

dezvoltată pentru a preîntâmpina problemele care apar în tehnica gelifierii ionice descrisă

anterior [454].

Multe studii au pornit de la imobilizarea medicamentelor prin emulsifierea unei

soluţii apoase ce formează un gel într-o fază nemiscibilă compusă dintr-un solvent organic

sau ulei [455]. Prin metoda emulsifierii se obţin particule de dimensiuni mici, cu un

diametru ce variază de la câţiva microni la aproape 1 mm. Polidispersitatea dimensională

este largă în comparaţie cu a particulelor produse prin metoda extruderii [456].

Emulsionarea se realizează, de regulă, într-un vas unde soluţia cu materialul de

încapsulat şi polimerul sunt dispersate într-o fază organică nemiscibilă, prin utilizarea unui

rotor de viteză mare [455]. Picăturile dispersate sunt stabilizate prin adăugarea unui amestec

de surfactanţi [457].

Microsferele sunt formate prin gelifierea picăturilor folosind diferite metode care

depind de natura polimerului. Microîncapsularea prin emulsionare necesită un control strict

al unor parametri cum ar fi concentraţia de polimer, tipul şi cantitatea de surfactanţi [458].

Dimensiunea picăturilor dispersate prin emulsionare va determina dimensiunea

microsferelor produse. Pe lângă surfactanţi, dimensiunea particulelor este influenţată de

viteza de agitare şi de vâscozitatea soluției de polimer [455]. Caracteristicile microsferelor

sunt influenţate de structura chimică şi de masa moleculară a polimerului utilizat pentru

imobilizarea celulelor microbiene. În tabelul 7 sunt prezentate câteva exemple de suporturi

polimerice pentru imobilizarea compușilor biologic activi obținute prin tehnica emulsionării.

Page 77: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

76

Tabel 7. Exemple de suporturi obținute prin metoda emulsifierii

Compoziția

suportului

Tipul de

suport

Compusul

biologic

activ

imobilizat

Obiectivul urmărit Bibliografie

Gellan/CaCl2 Microparticule Celule de

drojdie

Creșterea producției

de etanol [332]

k-Caragenan/

Chitosan/KCl Microparticule

Celule de

drojdie

Creșterea producției

de etanol [459]

Chitosan/k-

Caragenan/CMCNa Criogel Curcumină

Imobilizarea și

eliberarea controlată

a curcuminei

[402]

Alginat/Oligochitosan Microemulsie BSA

Imobilizarea și

eliberarea controlată

a BSA

[460]

Alginat/k-

Caragenan/CaCl2 Particule Curcumină

Imobilizarea și

eliberarea

curcuminei în

diverse modele de

digestie in vitro

[461]

3.3. Coacervarea

Coacervarea este o metodă fizico-chimică de microîncapsulare. Termenul de

coacervare provine de la cuvântul latin cuacervus care înseamnă gramadă sau teanc.

Coacervarea reprezintă procesul de formare a unor agregate macromoleculare ca urmare a

separării de fază ce are loc într-o soluţie omogenă de polimer, la adăugarea unui nesolvent.

În acest proces atât medicamentul cât și polimerul ar trebui să fie insolubile în apă.

Coacervatul reprezintă un ansamblu de molecule mari, cum ar fi proteinele,

lipidele, acizii nucleici care formează o unitate coloidală stabilă cu proprietaţi care seamănă

cu materia vie. Multe sunt acoperite cu o membrană lipidică şi conţin enzime care sunt

capabile de conversie pentru substanţe ca glucoza, în molecule mai complexe, cum ar fi

amidonul. Coacervatele au mărimi cuprinse între 1 şi peste 100 micrometri, au proprietăţi

osmotice şi se formează în mod spontan de la anumite soluţii organice diluate [462, 463].

Page 78: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

77

Complexul de coacervare implică separarea unei soluţii compusă din cel puţin două

macromolecule în două faze nemiscibile: o fază bogată în ambele macromolecule şi o altă

fază constând într-o fază de echilibru. Cele două macromolecule implicate în complexul de

coacervare sunt în general de sarcini opuse ( spre exemplu o proteină şi o polizaharidă). În

funcţie de puterea de interacţiune dintre cele două macromolecule ar putea apare

coacervarea Precipitatele sunt complecși destul de denși, care tind să se separe din soluţie

sub formă solidă [464, 465].

Structura coacervatelor în comparaţie cu precipitatele este mai ordonată şi sunt mai

puţin predispuse la agregare şi sedimentare. Pentru aceste motive, coacervarea este de obicei

preferată în locul precipitării pentru încapsularea ingredientelor bioactive. Pentru

încapsularea substanţelor active uleioase în interiorul coacervatelor şi pentru a forma

particule de biopolimeri care conţin componenți bioactivi lipidici, în primul rând uleiul este

dispersat într-o soluţie de doi polielectroliţi care au abilitatea de a forma coacervate.

Condiţiile ( temperatură, pH, viteză de agitare etc) sunt ajustate astfel încât coacervarea să

fie favorizată şi uleiul dispersat să fie încapsulat în interiorul noilor complexe formate.

Pentru a obţine o încapsulare maximă pH-ul trebuie ajustat la o valoare optimă.

Coacervatele disociază şi se rup în momentul ajustării pH-ului sau atunci când tăria

ionică este reglată; coacervatele sunt, de asemenea, susceptbile la fuziune. Pentru a

îmbunătăţi stabilitatea coacervatelor, unul sau ambii polielectroliţi prezenţi trebuie să fie

reticulați chimic, enzimatic sau printr-un tratament termic [427, 465].

Utilizând tehnica coacervării, microparticulele pot fi preparate sub agitare continuă

utilizând următoarele etape:

Prima etapă constă în formarea a trei faze nemiscibile. În această etapă miezul

de material este dispersat în soluția de polimer pentru acoperire. Parametrii care influențează

dimensiunea particulelor sunt: viteza de agitare, forma agitatorului, tensiunea superficială și

vâscozitatea. Dimensiunea microparticulelor variază între 2 și 1200 μm. Coacervarea începe

cu schimbarea pH-ului dispersiei (prin adăugarea de H2SO4, HCl sau acizi organici).

Rezultatul este reducerea solubilității fazei dispersate (a materialului de acoperire).

Materialul de acoperire (coacervatul) începe să precipite din soluție

Coacervatele sunt apoi răcite la o temperatură scăzută pentru a se stabiliza și

întări și astfel se formează capsulele finale. Pentru formarea peretelui microcapsulei se

adaugă un agent de reticulare (aldehida glutarica, taninuri, etc). Prin coacervare simplă se

pot încapsula substanţe medicamentoase solide, insolubile în apa (sulfanilamide, antibiotice

etc).

Page 79: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

78

Materialul de acoperire formează un perete în jurul picăturilor dispersate în

soluție [423, 462].

În tabelul 8 sunt prezentate câteva tipuri de particule ce pot imobiliza compuși

biologic activi obținute prin petoda coacervării.

Tabel 8. Exemple de suporturi obținute prin metoda coacervării

Compoziția suportului Tipul de suport

Compusul

biologic activ

imobilizat

Obiectivul

urmărit Bibliografie

Cazeina Microparticule Curcumină

Imobilizarea și

eliberarea

curcuminei

[462]

Gelatina/formaldehidă Microcapsule Curcumină

Imobilizarea și

eliberarea

curcuminei

[466]

Colodion Capsule Eritrocite

hemolizate

Imobilizarea și

testarea

activității

[467]

Gelatină/ gumă

arabică/aldehidă

glutarică (pentru

reticulare)

Microparticule

Rășini

uleioase din

ardei

(paprika)

Imobilizare și

eliberarea

controlată

[468]

Gelatină/ Gumă arabică Microcapsule Licopen

Creșterea

stabilității

carotenoidului

și utilizarea sa

în alimente

[469]

3.4. Uscarea prin pulverizare

Este cea mai utilizată metodă folosită la nivel industrial pentru formarea particulelor.

Este un proces rapid într-un singur pas utilizând un pulverizator pentru uscare. Este o

metodă potrivită pentru o gamă largă de aplicaţii în diferite industrii cum ar fi cele

biomedicale, alimentare şi farmaceutice [470].

Page 80: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

79

Studiile au arătat că metoda de uscare prin pulverizare poate fi aplicată pentru a

încapsula medicamente [470], proteine [471], celule de drojdie şi alte microorganisme [472].

Uscarea prin pulverizare a fost, de asemenea, utilizată pentru acoperirea

materialelor magnetice utilizate în aplicaţii terapeutice [473] şi obținerea de microparticule

încărcate cu medicament pentru eliberare controlată.

Procesul de uscare prin pulverizare începe cu atomizarea lichidului de alimentare

pentru a forma picături fine în camera de uscare. Picăturile pot fi produse prin utilizarea

diferitelor tipuri de atomizoare rotative sau tip duză. Picăturile sunt uscate prin evaporarea

umidităţii, prin adăugarea de aer fierbinte în camera de uscare cu controlul temperaturii şi al

debitului de aer. Picăturile fine au o suprafaţă specifică mare care facilitează uscarea rapidă.

Particulele fine produse sunt evacuate continuu din camera de uscare şi colectate prin

intermediul unui ciclon sau al unui sac de filtrare.[423] Câteva exemple de particule obținute

prin această metodă cu aplicații în domeniul alimentar sunt redate în tabelul 9.

Tabel 9. Exemple de suporturi pentru încapsulare obținute prin tehnica uscării-

pulverizării

Compoziția

suportului

Tipul de

suport

Compusul

biologic

activ

imobilizat

Obiectivul

urmărit Bibliografie

Poli( acid D-

lactic-co-

glicolic)

(PLGA)

/PEG-g-

chitosan

Nanoparticule

de PLGA in

microparticule

de PEG-g-

chitosan

Curcumină

Eliberarea

controlată a

curcuminei în

plămâni

[474]

Gelatină Microparticule Curcumină

Microparticule

pentru diferite

aplicații

alimentare

[475]

Gelatină Microparticule Curcumină

Microparticule

pentru diferite

aplicații

alimentare

[476]

Page 81: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

80

3.5. Alte metode de formare a micro/nanoparticulelor:

3.5.1. Obţinerea particulelor din polimeri preformaţi

Prezintă avantaje economice datorită timpului diminuat al procesului tehnologic, dar,

nu în ultimul rând şi faptului că polimeri de calitate superioară pot fi achiziționați ușor fiind

disponibili comercial şi caracterizarea lor poate fi mai uşor efectuată şi cu precizie.

3.5.2. Obţinerea micro/nanoparticulelor prin reticularea polimerilor în soluţie

/suspensie

Procedeul presupune prepararea unei emulsii sau suspensii cu bună stabilitate în care

soluţia de polimer sub formă de picături este dispersată într-un lichid nemiscibil.

Stabilitatea picăturilor este asigurată de agentul reticulant, în final particulele formate fiind

recuperate. Particularitatea procesului de reticulare în soluţie/suspensie este dată de

transformarea picăturilor de soluţie de polimer în particule cu dimensiune identică. Acest

efect este realizat prin reacţia intermoleculară a grupelor funcţionale sau între grupele

funcţionale ale polimerului şi cele ale agentului reticulant care rigidizează picăturile de

polimer, transformându-le în particule stabile. Ca agenţi de reticulare pot fi utilizaţi

reticulanţi covalenţi reprezentaţi de aldehida glutarică, glioxalul, epiclorhidrina etc. Pe

parcursul procesului, sistemul este menţinut sub agitare mecanică, sonicare, ultraturaxare.

Intensitatea şi durata acestora influenţează dimensiunea particulelor. Pentru a împiedica

coalescenţa particulelor se foloseşte în procesul de preparare a emulsiei/suspensiei un

stabilizator. Acesta trebuie să fie insolubil în faza de formare a picăturilor şi doar uşor

solubil în faza continuă. El conduce la creşterea vâscozităţii mediului de reacţie, cu scăderea

dimensiunii particulelor.

Un factor important cu influenţă asupra intensităţii procesului de reticulare îl

constitue masa moleculară a polimerului. Dacă aceasta este mică şi concentraţia este

scăzută, reticularea va fi diminuată, fapt răsfrânt într-o reţea mai puţin densă ce va avea

capacitate de umflare mai mare. Acest aspect favorizează o capacitate de încapsulare mai

mare cu compuşi bioactivi a produsului astfel preparat [477, 478]

3.5.3. Metoda reticulării termice

O astfel de metodă, dezvoltată de Orienti şi colab. presupune emulsionarea fazelor la

diferite temperaturi; s-a folosit pentru reticulare chimică acidul citric. Soluţia polimerică a

fost menţinută sub agitare, răcită la 0º C, când i s-a adăugat ulei de porumb şi sub agitare

continuă s-a format o emulsie apă-în-ulei care apoi a fost picurată într-un volum de ulei de

porumb care, de data aceasta a fost încălzit la 120 ºC. Dimensiunea particulelor a fost

Page 82: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

81

controlată şi prin continuarea energică a agitării la 1000 rpm, timp de 40 minute.

Microsferele astfel obţinute au fost purificate prin spălări cu dietil eter, uscate şi sortate

[479].

3.5.4. Metoda micelelor inverse

Micelele inverse sunt lichide stabile termodinamic bazate pe apă, ulei şi un strat de

agent tensioactiv care este dizolvat în faza uleioasă. Comportamentul dinamic al acestora

oferă caracteristici foarte importante. Dacă în polimerizarea în emulsie convenţională se

obţin nanoparticule cu dimensiuni mai mari de 200 nm, prin folosirea mediului micelar

invers se obţin entităţi particulate ultrafine. Faza apoasă a polimerului trebuie să se menţină

optic transparentă. Polimerul şi medicamentul sunt amestecați în rapoarte diferite; treptat

microemulsia transparentă se transformă într-una translucidă. Este momentul în care se

adaugă agentul de reticulare; emulsia este menţinută sub agitare pe timpul nopţii.

Evaporarea solventului organic se efectuează pentru a obţine particule transparente uscate.

Produsul este dispersat în apă, apoi, prin adăugarea unei sări, are loc precipitarea

particulelor cu eliminarea tensioactivului. Amestecul este centrifugat şi supernatantul ce

conţine particule încărcate cu medicament este dializat timp de o oră, lichidul este liofilizat

şi se obţine pulberea uscată de polimer încărcat cu principiul activ [480, 481].

3.5.5. Chelatizare

Tehnica este asemănătoare reticulării suspensiilor de polimeri preformaţi, tip

polielectroliţi anionici. Agentul de reticulare este un ion bi- sau polivalent. Avantajul pe care

îl aduce metoda este dat de utilizarea ionilor de metale tranziționale ca agent de reticulare în

locul celor clasici (formaldehidă, epiclorhidrină, diizocianaţi) despre care se cunoaşte că pot

da împreună toxicitate produşilor de reacţie.

3.5.6. Coalescenţa picăturilor din emulsie

Tokumitsu şi colab. au dezvoltat această tehnică prin combinarea principiilor

reticulării în emulsie cu cele ale precipitării. Reticularea picăturilor stabile este înlocuită cu

precipitarea care este indusă când are loc coalescenţa picăturilor de chitosan cu NaOH.

Pentru aceasta se prepară mai întâi emulsiile: cea care conţine soluţie de chitosan și

medicament în ulei de parafină lichidă, apoi o alta stabilă, cu soluție apoasă de NaOH. Celor

două emulsii, puse în contact, dacă li se aplică o agitare de mare viteză, are loc ciocnirea

picăturilor, cu coalgularea acestora în dimensiuni foarte mici. Metoda a stat la baza

preparării nanoparticulelor de chitosan încărcate cu acid gadopentetic pentru terapia capturii

neutronilor gadolinium. S-a constatat o capacitate mare de încărcare cu medicament (45%),

Page 83: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

82

în particule care au diametrul în jurul valorii de 452 nm, comparativ cu metoda reticulării în

emulsie simplă [482].

3.5.7. Procedeul spray – chilling (pulverizare-congelare)

Această tehnică este un procedeu opus procedeului de pulverizare-uscare.

Particulele se formează prin răcire, nu prin uscare. Învelişul acestora este realizat din ceară

sau grăsimi care sunt topite într-un lichid în care se află dispersat şi materialul care asigură

miezul particulei. Amestecul este pulverizat într-o cameră cu aer rece pentru ca învelişul să

se întărească în jurul miezului, formând capsula. Procedeul este preferat când se doreşte

protejarea de umezeală a principiului activ aflat în miez, eliberarea lui realizându-se la o

temperatură specifică [483].

3.5.8. Procedeul spray - cooling (pulverizare – răcire)

Prin această tehnică se pot încapsula materiale solide sau insolubile în solvenţi

obişnuiţi precum şi lichide transformate în solide în urma congelării. Produsul final este

insolubil în apă dar eliberarea principiului activ este efectuată sub punctul de topire al

materialului învelişului [483].

3.5.9. Procedeul în pat fluidizat – (bed coating)

Cunoscut şi sub numele de procedeul Wurster - metoda de obţinere a particulelor în

pat fluidizat -, tehnica este utilizată pentru acoperirea particulelor foarte mici, iar materialul

miezului este constituit din particule solide. Principiul metodei presupune ca particulele să

circule într-o cameră unde există un curent de aer ascendent. Acestea sunt antrenate ciclic şi

ridicate în zona superioară a camerei, când sunt acoperite cu material de înveliş prin

pulverizare cu straturi fine, succesive. Odată cu creşterea numărului de straturi se va asigura

o protecţie mai bună a principiului. Specialiştii aplică această variantă de obţinere a

sistemelor particulate când straturile ce învelesc principiul activ sunt din materiale diferite.

Procedeul se derulează în următoarea ordine: uscare, răcire, aglomerare, granulare,

acoperire. Ultima etapă, realizată în curent de aer, altfel numit „pat fluidizat‖, presupune

suspendarea particulelor solide ce au înglobate principii active într-un ciclon de aer cald sau

rece. Materialul de acoperire (derivaţi ai celulozei, dextrine, lipide, proteine) topit sau

dizolvat într-un solvent volatil este pulverizat în camera cu aer cald şi se va depune în

straturi la suprafaţa particulelor. Definitivarea acoperirii particulelor poate dura de la 2-12

ore, când se obţin particule cu dimensiuni cuprinse între 50 – 500 µm [483, 484].

Page 84: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

83

.5.10. Extruderea centrifugală

Presupune formarea unor tuburi concentrice de miez şi înveliş, care amestecate în

extruder duc la forme sferice la ieşirea prin capul de profilare. Acestea pot fi acoperite cu

ceruri sau grăsimi care la rece se solidifică.

3.5.11. Procedeul de extracţie /evaporare a solventului

Metoda elimină tratamentele termice care pot degrada polimerul sau agenţii chimici

de reticulare, ce pot fi toxici dacă nu există un control fin al concentraţiei acestora în sistem.

Prin această tehnică particulele se prepară parcurgând succesiv anumiţi paşi redaţi mai jos:

- dizolvarea polimerului în solvenţi cu puncte de fierbere scăzute în care se dizolvă şi

medicamentul;

- dispersarea soluţiei polimerului sub formă de picături într-un lichid nemiscibil,

reprezentând faza continuă;

- evaporarea solventului din picături care se transformă în particule [485];

3.5.12. Procedeul sitării/sortării

Metoda presupune formarea gelului, care prin sortare pe site lasă să treacă

micro/nanoparticule încărcate cu principiul activ. Microparticule polimerice pot fi preparate

prin această tehnică deoarece este uşor de abordat şi a fost dezvoltată de Agnihotri şi

Aminabhavi. Reticulat în prealabil, gelul polimeric este încărcat cu un principiu activ,

respectiv Clozapină. Microparticulele preparate au prezentat dimensiuni cuprinse în

intervalul 540 - 700 nm, după trecerea gelului sticlos pritr-o sită foarte fină. Cu o eficienţă

de încapsulare înregistrând o valoare de 99%, clozarina a prezentat o cinetică de eliberare

controlată / lentă [486].

3.5.13. Procedeul de depunere strat cu strat (layer by layer)

Prin această tehnică se obţin nanocapsule cu largi aplicaţii în domeniul biomedical.

Tehnica a fost pusă la punct prima dată în 1998 de Sukhorukov. La baza preparării

nanocapsulelor stă procesul de atracţie electrostatică ireversibilă a polielectroliţilor încărcaţi

contrar, la suprafaţa particulei. Pe suport coloidal se depune un strat de polimer, prin

incubare în soluţia de polimer urmată de spălare, sau prin scăderea solubilităţii polimerului

asigurată prin adăugarea în picături a solventului miscibil. Depunerea în straturi continuă cu

alţi polimeri, care alternează din punct de vedere al naturii ionilor substituienţi formându-se

straturile depuse consecutiv [487, 488].

Page 85: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

84

CAPITOLUL 4

Metode de imobilizare a principiilor active cu utilizări în industria alimentară

4.1. Imobilizarea celulelor de drojdie

În prezent există un interes general pentru eficientizarea producției de etanol, pentru

industria bauturilor alcoolice și pentru utilizarea sa ca biocombustibil. Costurile producției,

problemele de mediu, diminuarea rezervelor de combustibil fosili și creșterea prețului

gazelor naturale au fost identificați ca factori majori ce au condus la cercetări pentru găsirea

unor metode eficiente de fermentare [489-493].

Imobilizarea celulară în fermentarea alcoolului este un domeniu de cercetare ce s-a

extins mult datorită tehnicii sale atractive și avantajelor economice pe care le prezintă.

Procesele continui sunt preferate deoarece determină o eficiență substanțial îmbunătățită,o

productivitate mai mare și un cost de operare mai mic [494]. De asemenea, producerea de

etanol pentru utilizarea sa ca și combustibil a câștigat în ultimii ani un mare interes.

Producerea de combustibil din etanol diferă de cea pentru băuturi datorită faptului că nu este

necesar un proces lent pentru calitatea produsului final. Este de dorit un proces rapid și

complet de fermentare pentru a asigura o profitabilitate maximă a procesului [495].

Drojdiile, în special speciile Saccharomyces sunt preferate datorită capacității mari

de fermentare, a toleranței la etanol și la alți inhibitori, a capacității de creștere rapidă în

condiții anaerobe, care sunt caracteristice proceselor fermentative [496, 497].

Avantajele imobilizării celulelor de drojdie în diferite suporturi sunt multiple:

productivitatea volumetrică mare ca un rezultat a densității mari de celule, toleranța

crescută la diferiți factori de stres (cum ar fi concentrații mai mari de etanol și la metaboliții

toxici produși prin fermentare, temperatură crescută și pH), stabilitate mecanică și chimică

îmbunătățită, reducerea riscului de contaminare și inhibare, păstrarea viabilității celulare,

scăderea costului procesului datorită faptului că microbioreactoarele pot fi recuperate cu

ușurință din mediul de reacție și reutilizate în alte procese fermentative, posibilitatea

utilizării microbioreactoarelor în procese fermentative continui [498-500].

S-au dezvoltat numeroase tehnici de imobilizare prin legare fizică (adsorbţie) sau

chimică (legare covalentă) a celulelor de o matrice suport organică sau anorganică, prin

floculare (agregarea biomasei) şi prin includerea în particule polimere mai mult sau mai

puțin poroase sau în microcapsule [501]. Metodele implicate în imobilizarea celulelor

microbiene cel mai frecvent utilizate în industria alimentară sunt emulsifierea [332, 438]

Page 86: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

85

extruderea [431], coacervarea complexă [502], uscarea prin pulverizare (spray drying) [472],

includerea în matricea de gel (gel entrapment) şi polimerizarea prin radiaţii [503].

Metoda de imobilizare trebuie să fie simplă, ieftină iar produsul cu celule de drojdie

imobilizate trebuie să aibă o activitate fermentativă adecvată, să fie stabil în mediul de

operare, fiind esențial să păstreze viabilitatea microorganismelor [504]. Pentru celulele

microbiene metoda extruderii este cel mai des utilizată datorită condiţiilor blânde de

procesare ce permit o încapsulare optimă iar viabilitatea microorganismelor nu este afectată.

Această metodă a fost utilizată des în cazul alginaţilor şi a caragenanului şi presupune

extruderea în picături mici a unei soluţii de biopolimer ce conţine o suspensie cu celule într-

o soluție ce conține agentul de reticulare [501].

Materialele cel mai des utilizate pentru imobilizare sunt alginații [505-508],

suporturi de sticlă sau de ceramică [509], materialele celulozice [510], γ-alumina [511],

filme sol-gel de siliciu [512] , geluri de poliacrilamidă [513] și combinații de diverse

materiale [514].

Celulele microbiene au fost imobilizate în geluri de poliacrilamidă utilizând

polimerizarea prin radiații gamma [515, 516], care comparativ cu polimerizarea inițiată

chimic prezintă avantajul ca poate avea loc la temperaturi joase, de până la -75˚C. Această

tehnică nu numai că previne inactivarea provocată de temperatură dar probele pot fi

înghețate în orice formă ajutând la obținerea de celule imobilizate sub formă de particule,

tuburi sau membrane. Tehnica polimerizării prin radiație a fost extinsă la imobilizarea

celulelor în gelatină [517].

Metoda includerii celulelor în alginați prin gelifiere ionotropă prezintă o serie de

dezavantaje cum ar fi limitarea difuziei nutrienților, a metaboliților și oxigenului datorită

matricei de gel și a densității mari de celule prinse în particule [518]. Gelurile de alginat

dețin o stabilitate mecanică joasă, stabilitate redusă la compuși chimici, ceea ce poate

conduce la difuzia unui număr mare de celule în afara matricei odată cu proliferarea lor

[508, 519, 520].

Călinescu (2012) [439]a preparat două suporturi pentru imobilizarea celulelor de

drojdie, utilizând alginații și poliacrilamida. Gelul de poliacrilamidă a fost utilizat la scară

largă pentru imobilizarea mai multor tipuri de celule microbiene [521]. Matricele cu celule

de drojdie imobilizate preparate au fost testate din punct de vedere al activității fermentative

și s-a constatat că manifestă o activitate fermentativă comparabilă cu particulele de alginați,

dar o stabilitate superioară [439].

Page 87: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

86

Unele abordări pentru stabilizarea gelurilor de alginat includ reticularea covalentă

directă și grefarea alginaților cu polimeri sintetici. Densitatea și rezistența mecanică a

acestora poate fi crescută, de asemenea, prin încorporarea materialelor anorganice cum ar fi

siliciul, nisip și aliminiul [522, 523].

Materialele pe bază de siliciu au atras atenția cercetătorilor fiind determinată de

unele proprietăți fizice și chimice ale silicei, cum este tăria legăturii Si-O (425 J.mol-1) care

oferă o mare stabilitate materialului. S-au preparat particule de hidrogel pe bază de alginați

prin reticulare ionică utilizând diferiți cationi cum ar fi calciu și bariu, care au fost acoperite

ulterior cu un strat de gel de siliciu. Astfel celulele de drojdie sunt protejate de matricea de

alginat, iar stratul de siliciu de la suprafața celulelor le oferă stabilitate și posibilitatea de a fi

utilizate în procese fermentative continue [441].

Alegerea adecvată a suporturilor pentru imobilizare este esențială. Caracterăsticile

pe care trebuie să le dețină sunt: stabilitate mecanică și chimică bună, trebuie să fie netoxice

și biocompatibile cu celulele și trebuie să dețină un coeficient mare de difuzie atât pentru

substraturi cat și pentru produșii de fermentare [501].

Gelanul a fost utilizat pentru imobilizarea celulelor de drojdie permițând obținerea

unui biocatalizator cu perspective reale de a fi utilizat în tehnologia de producere a vinurilor

spumante, sub formă de particule sferice. Acestea s-au format prin extruderea gelului ce

conține o suspensie de celule de drojdie printr-o capilară într-o baie de soluţie de 2% CaCl2

(utilizat ca agent de reticulare ionic) [442]. Tan si colab.(2011), au imobilizat celulele de

drojdie utilizând ca suport gelanul printr-o metodă de emulsifiere şi au semnalat posibilitatea

reutilizării microbioreactoarelor rezultate. Producţia de etanol în primele trei cicluri a fost

comparabilă cu cea care utilizează drojdia liberă. Microbioreactoarele sunt stabile şi uşor de

recuperat din mediul de fermentare prin filtrare şi pot fi reutilizate pentru cel puţin 10

cicluri, cu un randament relativ mare de etanol [332].

CMCNa a fost modificată prin reacția de copolimerizare prin grefare cu N-vinil-2-

pirolidona (PVP) utilizând ca inițiator AIBN(azo-bis-izobutironitril). CMCNa și copolimerul

CMC-g-PVP au fost utilizați pentru imobilizarea drojdiei de panificație Saccharomyces

cerevisiae prin metoda extruderii utilizând ca agent de reticulare AlCl3. S-au obținut

particule sferice care testate în fermentare timp de 27 ore au permis obținerea unei

concentrații de etanol de 57 g/L. Randamentul în etanol crește atunci când gradul de

reticulare al particulelor formate scade [447, 448].

K-caragenan a fost cu succes utilizat ca matrice pentru imobilizarea celulelor de

drojdie și pentru a obține o productivitate crescută în etanol. H.Y. Wang and D. Hettwer

Page 88: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

87

(1982) au adăugat în matricea de gel pe bază de k-caragenan hidroxiapatită sau fosfat

tricalcic. Pentru a dizolva fosfatul tricalcic și pentru a crește porozitatea matricei, particulele

care il conțin au fost introduse într-o soluție acidă ce conține 1 % KCl. Fosfatul tricalcic

inclus în matrice poate menține pH-ul la un nivel optim, poate susține viabilitatea celulară,

poate să crească densitatea gelului și productivitatea în etanol. Aceasta a devenit mai mare

decât la drojdia liberă (1,7 mg/108celule x h) și anume: 1,8 mg/10

8celule x h pentru

particulele fără fosfat tricalcic și 2,5 mg/108celule x h pentru particulele în care s-a utilizat

fosfatul tricalcic [444]. Particule de k-caragenan cu celule de drojdie imobilizată prin

metoda extruderii utilizând ca agent de reticulare KCl au fost obținute și de către A.M.

Martinez et al.,(2016) și Francesc Godia et al.(1987) [445, 446].

O altă tehnică utilizată pentru imobilizarea celulelor este cea a emulsifierii, fiind

indicată în cazul în care se dorește obținerea unor cantități mari de microsfere. Tehnica

emulsifierii presupune dispersia fazei apoase ce conține K-caragenanul dizolvat, într-o fază

organică nemiscibilă urmată de gelifierea și separarea microparticulelor. Deoarece

particulele de k-caragenan nu sunt foarte stabile ele pot fi acoperite cu un strat de chitosan

care reduce mărimea porilor iar stabilitatea mecanică și chimică a gelului crește [459].

4.2. Metode de imobilizare a -amilazei

Imobilizarea enzimelor este considerată o tehnică avansată în tehnologia enzimelor.

La ora actuală există un volum mare de informaţii asupra imobilizării enzimelor în ceea ce

priveşte noile metode de imobilizare şi suporturile pentru imobilizare [524].

Prin imobilizare enzimele își îmbunătăţesc stabilitatea, activitatea enzimatică se

păstrează şi pot fi reutilizate și se previne dezactivarea enzimei [72]. Este necesar ca

enzimele imobilizate să dețină o stabilitate înaltă şi să poată fi reutilizate în scopuri analitice

şi ca biosenzori [525].

Prima încercare de a imobiliza o enzimă a fost realizată de Michaelis şi Ehrenreich

în 1908 [526] prin adsorbţia invertazei pe cărbune, dar acest preparat precum si altele

obţinute prin imobilizarea altor enzime au dovedit o activitate scazută şi inconstantă.

Rezultate superioare au fost obţinute după cel de-al doilea război mondial, când

tehnicile de imobilizare s-au diversificat, incluzând legarea covalentă la suport, legarea

ionică, includerea în geluri, încapsularea sau simpla reticulare cu alte molecule de enzimă,

pentru a forma particule [527, 528]. În aceeaşi perioadă s-au utilizat şi tehnici de includere

pentru imobilizarea celulelor microbiene, dar comparativ cu studiile de imobilizare a

enzimelor acestea sunt mai puţin numeroase [529].

Page 89: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

88

Purificarea şi imobilizarea proteinelor biologic active, enzimelor şi antigenelor,

prezintă o importanţă majoră atât pentru industrie cât şi pentru cercetare. La ora actuală

simplitatea utilizării şi costurile cât mai reduse sunt preocupările dominante ale acestor

procese.

Principiul general al procedeelor de imobilizare a enzimelor constă în legarea sau

fixarea unei enzime sau a unui sistem multienzimatic de suportul insolubil în apă, în

condiţiile păstrării proprietăţilor catalitice, respectiv specificitatea de acţiune şi posibilitatea

de a acţiona la pH şi temperatură asemănătoare enzimelor libere (neimobilizate).

Suporturile sau matricile utilizate în imobilizarea enzimelor pot fi de natură

anorganică: silicea coloidală, caolinita, particule sau perle de sticlă cu grad de porozitate

controlat, oxizi metalici (alumina, oxid de zirconiu, oxid de titan, cărbune etc.), şi de natură

organică: celuloza şi derivaţii acesteia, agaroză, amidon, dextran, colagen, polimeri obţinuţi

prin polimerizarea unor monomeri de tipul acrilamidă, acid metacrilic ş.a., răşini

formaldehidice etc. [530].

La imobilizarea enzimelor trebuie să se aibă în vedere următorul aspect:

conformaţia spaţială a moleculelor de enzimă în sistemul imobilizat este diferită de cea a

mediului natural din care s-a extras enzima. Pe de altă parte, conformația tridimensională a

moleculei de enzimă este distorsionată de legăturile sale cu suportul; micromediul moleculei

de enzimă imobilizat este diferit de cel al enzimei aflate în soluţie, fiind afectată viteza de

difuzie a substratului şi a produşilor de reacţie. Inhibiţia de substrat şi de produs pot, de

asemenea, juca un rol important; procesul de transport al substanţelor este un proces pasiv,

în comparaţie cu situaţia enzimei din celula vie, iar aceasta va avea desigur influenţă şi

asupra vitezei de reacţie.

Utilizarea enzimelor imobilizate permite rezolvarea unor probleme importante cum

ar fi:

Folosirea multiplă, repetată, a unui singur grup de enzime.

Posibilitatea întreruperii reacției prin îndepărtarea enzimei din mediul de reacție (sau

invers).

Enzimele sunt în general stabilizate prin legări la substrat;

Separarea produşilor puri prin descompunerea enzimatică a substratului, produsul

final nefiind contaminat cu enzimă;

Activarea enzimei cu îndepărtarea ulterioară a agentului de activare;

Page 90: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

89

Sorbţia selectivă şi studiul inhibitorilor enzimei cu îndepărtarea ulterioară a agentului

de activare.

Are loc o creştere a vitezei de lucru, prin controlul riguros al vitezei fluxului de

substrat şi al concentraţiei acestuia [530-532].

Amilaza produsă de Hylocereus polyhirus a fost încapsulată într-o matrice formată

din gumă arabică si chitosan cu o eficienţă în încapsulare de 96,2 %. Procesul de încapsulare

ajută enzima sa fie stabilă în prezenţa agenţilor de oxidare şi a surfactanţilor. Studiul

demonstrează că această combinaţie de polimeri ca agenţi de acoperire protejează enzima de

pierderea activităţii în timpul liofilizării. Creşterea stabilităţii şi activitatea înaltă a amilazei

încapsulate ar putea face ca această abordare să constituie o alegere atractivă pentru aplicaţii

în biotehnologie si enzimologie [533].

Au fost efectuat câteva cercetări pentru a imobiliza α-amilaza prin adsorbție pe

suporturi solide. Imobilizarea enzimei se realizează pe baza a trei tehnici principale și

anume: încapsularea enzimei, adsorbția pe suport solid și legarea ionică sau covalentă.

Enzimele imobilizate au fost utilizate în multe procese industriale. Metoda includerii este

preferată deoarece previne pierderea activității enzimei după imobilizare; prin imobilizare

crește stabilitatea enzimei și este protejată enzima de contaminarea microbiană.

Includerea fizică a α-amilazei în particule de alginat reticulate cu ioni de Ca2+

a fost

prezentată ca fiind o tehnică ușoară de imobilizare, rapidă și sigură în comparație cu alte

metode. Metoda de imobilizare trebuie aleasă astfel încât structura enzimei să necesite cât

mai puține schimbări conformaționale. Natura suportului solid sau a matricei joacă un rol

important în menținerea conformației inițiale și a activității enzimei în procesul utilizat

pentru imobilizarea biocatalizatorului.[534].

Pentru ca imobilizarea enzimei să fie eficientă moleculele de α-amilază trebuie să

fie suficient de mari pentru a fi păstrate în interiorul matricei dar substratul și produsul

trebuie să fie suficient de mici pentru a trece prin porii gelului. S-au obținut particule de

alginat de calciu reticulate ionic cu CaCl2 (soluție de concentrație 2%) iar diametrul porilor a

fost între 80-100Ȧ. Moleculele de amidon sunt foarte mari și este de așteptat ca reacția de

hidroliză a amidonului să nu fie la fel de eficientă cu enzima imobilizată comparativ cu cea

liberă.

Avantajul principal al imobilizării constă în posibilitatea utilizării imobilizatului în

mai multe cicluri de hidroliză repetate cu păstrarea stabilității și a activității enzimei o

perioadă mai mare de timp. [535].

Page 91: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

90

4.3. Metode de imobilizare a curcuminei

Pentru a crește biodisponibilitatea curcuminei au fost preparate diferite formulări. De

exemplu, nanoglobule pe bază de nanoemulsii au fost preparate pentru a evalua potențialul

de creștere a solubilității curcuminei. În timpul studiilor ex vivo eliberarea curcuminei din

nanoemulsii a fost mult mai eficientă decât din suspensiile de curcumină standard. Această

comportare indică creșterea solubilității în medii apoase. [536]

4.3.1. Complecși cu ciclodextrine

Ciclodextrinele sunt oligozaharide ce conțin între 6 și 8 molecule de zahăr într-o

structură ciclică. Ele pot imobiliza în cavitatea lor hidrofobă compuși insolubili,

îmbunătățind solubilitatea și stabilitatea chimică sau enzimatică a acestora.

S-a obținut un compus hidroxil-β-ciclodextrină cu curcumină ce prezintă o creștere

în absorbția orală în studiile efectuate pe șobolani. [537] Concentrația maximă atinsă la nivel

plasmatic la administrarea acestui compus a fost de 370 ng/ml, de 9 ori mai mare decât

concentrația obținută utilizând suspesia de curcumină standard ( la administrarea unei doze

de 500 mg/kg). Un produs cu ciclodextrină în care curcumina a fost inclusă este disponibil

în farmacii CavamaxTM

W8 Curcumin fiind produs de compania Wacker [538]. Prin

administrarea sa pe cale orală la șobolani concentrația de curcumină din plasmă crește de

10-20 de ori mai mult decât la administrarea curcuminei pudră pură.

4.3.2. Complecși cu fosfatidilcolină

Complexele fosfolipidice, lipozomii și micelele pot reduce hidrofobicitatea

curcuminei, crescând permeabilitatea prin interacțiunea lor cu componentele membranei

celulare.

Absorbția curcuminei din complecșii de fosfatidilcolină hidrogenată din soia a fost

studiată pe șobolani. La 1 g curcumină/Kg, acest preparat dă o concentrație maximă în

plasmă de 1,2 μg/ml la 90 minute după administrare în timp ce curcumina standard utilizată

are o concentrație de 0,5 μg/ml după 45 min [539].

În alte studii au fost preparați complecși similari de curcumină cu fosfatidilcolină

iar doza administrată la șobolani a fost de 1 g/ml. Concentrația maximă de curcumină găsită

în plasmă a fost de trei ori mai mare decât concentrația standard [540].

MerivaTM

(Indena) este un compus format din complecși de curcuminoizi

(curcumin I, II și III) cu lecitina (în special fosfatidilcolina). Concentrațiile din plasmă ale

celor 3 componente au fost testate la administrarea orală la voluntari umani sănătoși,

Page 92: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

91

absorbția totală a lor în sânge fiind de 29 de ori mai mare decât pentru amestecul de

curcuminoizi neformulați. Trebuie remarcat faptul că absorbția curcuminei astfel formulate

este mai mare decât a curcuminei libere [541].

4.3.3. Nanoparticule lipidice

Sunt constituite din materiale biocompatibile și biodegradabile cum ar fi

trigliceridele și acizii grași.

Au fost preparate nanoparticule solide de lipide compuse din polisorbat, lecitină din

soia și Compritol 888 ATO™ prin metoda emulsifierii. Particulele au formă sferică și o

dimensiune de 134,6 nm; a fost administrată la șobolani o doză de 50 mg/kg. Concentrația

maximă plasmatică a fost de 14,3 μg/ml iar biodisponibilitatea a fost de 39 ori mai mare

decât a soluției de control ce conține curcumină [552].

Alte nanoparticule lipidice au fost compuse din poloxamer 188, gliceril

monostearat, lecitină din soia, trigliceride cu catene medii și curcumină. Dimensiunea

particulelor a fost de 129 nm. Administrate la șobolani cu o doză de 80 mg/kg au condus la

obținerea unei concentrații maxime mărite (565 ng/ml și 279 ng/ml) după diferite intervale

de timp 30 min și 1 h. [543].

4.3.4. Lipozomi

Sunt sisteme de eliberare care încorporează principii active nesolubile și permit

eliberarea lor în medii apoase, utilizate în general utilizați pentru administrarea parenterală

Există doar câteva exemple de administrare a lipozomilor ce conțin curcumină pe cale orală

[544, 545]. Lipozomi obținuți din lecitină cu diametrul de 253 nm încărcați cu curcumină au

fost administrați pe cale orală la șobolani. La administrare unei doze de 100mg/kg

concentrația maximă de curcumină în plasmă este de 319 ng/ml la 30 minute după

administrare în timp ce concentrația plasmatică maximă atinsă după administrarea souției de

control a fost de 65 ng/ml la 2 h de la administrare [546]. Lipozomi acoperiți cu silice și

încărcați cu curcumină au fost preparați pentru protejarea lor de mediul agresiv din tractul

gastrointestinal. Testele in vitro au arătat că aceste sisteme prezintă o mai mare stabilitate la

acțiunea lichidului gastric și eliberează controlat curcumina. Au fost efectuate teste in vivo

pe șobolani. Doza administrata a fost de 50 mg/kg iar concentrația maximă atinsă a fost de

450 ng/ml după 2 ore de la administrare. Biodisponibilitatea a fost de 7-8 ori mai mare decât

cea a soluției standard [547].

Page 93: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

92

4.3.5. Micro/nanoemulsii

Sunt definite ca formulări coloidale, izotropice, transparente sau puțin opalescente

conținând surfactanți, ulei și apă.

O micro/nano emulsie formată din Capryol 90 (propilen glicol monocaprilat, 11%

ulei), cremofor RH 40 (propilen glicol 40 hidrogenat-ulei castor, 44 %, surfactant) și

Transcutol P (eter înalt purificat –dietilen glicol monoetil, 42%, co-surfactant) a fost

preparată într-o soluție apoasă. Solubilitatea curcuminei a fost de 32,5 mg/ml iar

dimensiunea picăturilor a fost de 27,3 nm. Studiul farmacocinetic a fost condus pe șobolani

iar rezultatele au fost comparate cu cele obținute la utilizarea soluției standard de curcumină.

La o doză de 200 mg/kg concentrația plasmatică maximă a fost de 3,75 μg/ml după un timp

de 138 minute, în timp ce doza de control la 100 mg/ml a avut o concentrație maximă de

0,83 μg/ml după 1,5 ore. Biodisponibilitatea curcuminei din emulsie a crescut de 22,6 ori

comparativ cu cea din soluția de control [548].

Alți cercetători au preparat o microemulsie cu dimensiunea picăturilor de 218 nm

utilizând curcumină, ulei, surfactanți și apă. Doza administrată șoarecilor a fost de 197

mg/kg iar concentrația plasmatică maximă atinsă a fost de 29,9 μg/ml după o oră, iar

biodisponibilitatea a fost de 9,8 % , de 9 ori mai mare decât cea a curcuminei neformulate

[549].

O micro/nanoemulsie compusă din curcumină, PEG600 și Cremofor a fost

preparată în așa fel încât concentrația de curcumină să ajungă la 100 mg/ml iar dimensiunea

picăturilor a fost de 69 nm. Testările in vivo s-au efectuat pe șobolani doza administrată

fiind de 1,8 g/kg iar concentrația curcuminei în plasmă găsită a fost de 4,73 μg/ml după 20

de minute de la administrare. Alte sisteme utilizate pentru a crește solubilitatea și

biodisponibilitatea curcuminei sunt sistemele de autoemulsionare și micelele [550].

4.3.6. Imobilizarea în particule de polimer

Un alt studiu prezintă încapsularea curcuminei în nanoparticule de hidrogel

(chitosan). Nanoparticulele pe bază de amestec de polizaharide au eliberat 95% curcumină

în 7 ore iar eficiența depinde de raportul dintre polimeri (de cantitatea de caragenan din

particule) [551].

Au fost preparate nanoparticule de apotransferină încărcate cu curcumină utilizând

metoda soluție-ulei (sol-oil chemistry) constatându-se o eliberare treptată pentru o perioadă

destul de îndelungată; 50 % din curcumină rămâne încă în particule după 6 ore de la

eliberare. [163]

Page 94: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

93

Nanoparticule coloidale denumite Theracurmin au fost preparate din curcumină,

guma ghatti și apă [552, 553] iar la administrarea orală a 50 mg/kg și 10 mg/kg la șobolani

concentrația găsită în plasmă a fost de 764 ng/ml, repectiv 900 ng/ml după o oră de la

administrare. Administrarea orală a 30 mg/kg theracurmin la voluntarii umani sănătoși a

condus la creșterea de 27 de ori a biodisponibilității comparativ cu administrarea pudrei de

curcumină standard. [554]

Nanoparticulele de curcumină preparate de Cheng și colab (2013) pe bază de

poli(etilen glicol), poli(acid lactic) și poli(vinil pirolidonă) [555] conduc la obținerea unei

concentrații de 6 ori mai mare de curcumină în plasmă sangvină după administrarea

intravenoasă comparativ cu pudra de curcumină. Se poate concluziona că prin imobilizare

solubilitatea și biodisponibilitatea curcuminei crește.

Polimerii utilizați în mod frecvent în imobilizarea curcuminei sunt poli(acidul

lactic), poli(acidul glicolic) și copolimerul lor acid poli(lactic-co-glicolic) (PLGA).

Au fost preparate microsfere de PLGA cu curcumină cu dimensiunea de 20-30 μm

și s-au dovedit eficiente în eliberarea controlată și pentru administrarea sub formă injectabilă

subcutanată sau intramusculară. Particulele au diametrul mediu de 264 nm și au fost

administrate oral la șobolani cu o doză de 100 mg/kg. [556] Concentrația plasmatică

maximă a fost de 265 ng/ml (la 2 ore după administrare) iar biodisponibilitatea a fost de 10

ori mai mare decât la pudra de curcumină neîncapsulată. Nanosfere similare de PLGA s-au

obținut cu dimensiuni mai mici de 200 nm și aceeași doză de curcumină a fost administrată

oral la șobolani [556]. Concentrația de curcumină din plasmă a fost de 6,75 μg/ml după 2 ore

de la administrare iar biodisponibilitatea a fost cu 26,5 % mai mare decât la suspensia de

curcumină standard. Biodisponibilitatea soluției standard de curcumină în acest studiu a fost

de 4,7 % dar alte studii afirmă că biodisponibilitatea soluției standard de curcumină este de 1

% [202, 557].

În alte rapoarte unde nanoparticulele de PLGA au dimensiuni mai mici 163 nm,

concentrația maximă plasmatică a curcuminei a fost de 57 ng/ml după 15 minute de la

administrare la șobolani. Studiile pe aceste sisteme se concentrează pe investigarea

influenței dimensiunii particulelor și a diferitelor tehnici de obținere asupra creșterii

biodisponibilității și a concentrației de curcumină în sânge [558].

Page 95: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

94

REZULTATE ORIGINALE

Page 96: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

95

Obiectivul principal al tezei de doctorat îl constituie obținerea unor sisteme

particulate cu caracter de hidrogel, pe bază de polizaharide reticulate ionic, destinate

imobilizării de principii active cu potențiale aplicații în industria alimentară.

Selecția unor polizaharide în vederea obținerii particulelor suport pentru imobilizare

se bazează pe caracterul lor biocompatibil și a lipsei de toxicitate, condiții absolut obligatorii

pentru realizarea de materiale cu aplicații în domeniul alimentar, farmaceutic sau cosmetic,

dat fiind faptul că lucrează în contact sau în interiorul organismului uman. La aceste

considerente se adaugă abundența dat fiind faptul că provin din surse regenerabile, ceea ce

determină un preț redus, precum și reactivitatea ridicată în condiții blânde de temperatură și

presiune și în absența catalizatorilor, adeseori toxici și greu de îndepărtat din produsul

rezultat. Totodată, metodele alese pentru obținerea particulelor sunt simple, ușor de utilizat,

asigurând o bună reproductibilitate.

Realizarea obiectivului principal a presupus îndeplinirea mai multor obiective

asociate, precizate în cele ce urmează.

* Elaborarea unei metode de obținere a unor particule pe bază de gelan sau

amestecuri ale acestuia cu alte polizaharide, destinate includerii de principii active de

interes pentru industria alimetară, prin gelifiere ionotropă în prezența unor cationi

metalici divalenți.

* Caracterizarea fizico-chimică a particulelor obținute prin metode adecvate scopului

pentru care au fost preparate, respectiv obținerea de bioreactoare pentru fermentarea

glucozei

* Obținerea de sisteme particulate conținând celule de drojdie imobilizate în matricea

de tip hidrogel și stabilirea parametrilor optimi de lucru pentru realizarea de sisteme

stabile, cu performanțe bune în fermentarea glucozei

* Caracterizarea sistemelor particulate conținând celule de drojdie imobilizate în

matricea de hidrogel, din punct de vedere al stabilității structurale, al activității

biocatalitice și al posibilității de utilizare repetată în cicluri de fermentare a glucozei.

* Obținerea de sisteme particulate pe bază de gelan, obținute prin gelifiere ionotropă

cu cationi metalici divalenți, conținând -amilază imobilizată; caracterizarea lor

fizico-chimică și din punct de vedere al activității biologice în procesul de hidroliză a

amidonului

* Obținerea și caracterizarea fizico-chimică a unor sisteme particulate pe bază de

complecși polielectrolitici de natură polizaharidică conținând curcumină imobilizată;

studiul procesului de eliberare in vitro a principiului activ.

Page 97: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

96

CAPITOLUL 5

MATERIALE, TEHNICI EXPERIMENTALE, METODE DE CARACTERIZARE

Prezentul capitol are ca scop prezentarea materialelor care au stat la baza obținerii

particulelor de hidrogel cu compuși biologic activi imobilizați cu aplicații în industria

alimentară , al tehnicilor experimentale precum și a metodelor de caracterizare utilizate.

5.1. Materiale

Biopolimeri utilizați în obținerea particulelor de hidrogel cu compuși biologic activi

imobilizați

Biopolimerii utilizați în obținerea particulelor de hidrogel cu celule de drojdie

imobilizată au fost gelanul, i-caragenanul și sarea de sodiu de carboximetil celulozei.

Polizaharidele sunt principalele materiale utilizate pentru imobilizarea celulelor de drojdie

datorită biocompatibilității și lipsei de toxicitate.

Gelanul este un biopolimer anionic liniar cu secvențe de tetrazaharide care se repetă

formate din două reziduuri de β-D-glucoză, un reziduu de acid β-D-glucuronic și unul de α-

L-ramnoză într-un raport 2:1:1 [267]. Structura chimică a gelanului este prezentată în figura

4.

Gelanul deacetilat utilizat pentru obținerea particulelor de hidrogel a fost procurat de

la Kelkogel (pentru aplicații alimentare) și are masa moleculară cuprinsă între 2-3 × 105

Da.

Carboximetil celuloza (CMC) este un eter celulozic conținând gruparea –CH2-

COOH (Na) legata prin legatura eterica la gruparea hidroxilica de la C6 a celulozei. Gradul

de substitutie variaza intre 0.4-2.2, si se prezinta de regula sub forma sarii de sodiu

(CMCNa), cu solubilitate ridicata in apa. Structura carboximetil celulozei este redată în

figura 7(b). Carboximetil celuloza a fost cumpărată de la Sigma Aldrich și are un grad de

substituție de 75%.

Caragenanul aparține familiei de galactani hidrofili liniari sulfatați cu o masă

moleculară mare, fiind format din unități alternante de D-galactopiranoză și 3,6-anhidro-

galactoză (3,6-AG) unite prin legături alternante de α-1,3 și β-1,4- glicozidice. Structura

caragenanului este prezentată în figura 9(b). I-caragenan (Car), conține 2 grupari –HOSO3-

/mol (464 Da). A fost procurat de la Sigma Aldrich.

Chitosanul reprezintă produsul principalul obținut prin procedeul de deacetilare

alcalină a chitinei și este un polimer cationic liniar natural semi-cristalin, policationic, cu

structură liniară, compus din unități (1→4)-2-acetamido-2-deoxi-β-D-glucan (N-acetil-D-

glucozamină) și (1→4)-2-amino-2-deoxi-β-D-glucan (D-glucozamină) [354]. Structura

Page 98: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

97

chitosanului este prezentată în figura 8(b). Chitosanul utilizat este procurat de la Sigma

Aldrich, are o masă moleculară medie și un grad de deacetilare de 75%.

Polizaharidele menționate anterior au un spectru larg de aplicații în diferite domenii

dar în special în domeniul biomedical și alimentar.

Agenții de reticulare utilizați

Ca agenți de reticulare ionici au fost utilizați:

Acetat de magneziu tetrahidrat: M=214,45 g/mol, Procurat de la Sigma Aldrich

Figura 11. Structura acetatului de magneziu

Acetatul de calciu: M=158,17 g/mol, procurat de la Sigma Aldrich

Figura 12. Structura acetatului de calciu

Acetatul de zinc: M=183,48 g/mol, procurat de la sigma Aldrich

Figura 13: Structura acetatului de zinc

Clorura de calciu: CaCl2, M=110,98 g/mol, procurat de la Sigma Aldrich

Sulfatul de sodiu: Na2SO4, M=142,04 g/mol, procurat de la Sigma Aldrich

Figura 14: Structura chimică a sulfatului de sodiu

Compuși biologic activi utilizați pentru imobilizare

Drojdia utilizată este o drojdie comercială de panificație, de gen Saccharomyces

cerevisiae, cu un conținut de 70% apă, procurată de la Pakmaya, România.

Curcumina pudră, extrasă din Curcuma Longa, are formula chimică C21H20O6,

M=368,38 g/mol., se păstrează la -20˚C. Structura sa chimică este prezentată în

figura 3.

Page 99: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

98

α-Amilază extrasă din pancreas porcin, sub formă de pudră, temperatura la care se

păstrează este de 2-8˚C și este procurată de la Sigma Aldrich. Formula sa

supramoleculară este prezentată în figura 1.

Alte substanțe utilizate:

Amidonul solubil este utilizat ca substrat pentru hidroliza enzimatică în prezența α-

amilazei. Are masa moleculară 342,3 g/mol și este achiziționat de la Sigma Aldrich.

Figura 15. Structura chimică a amidonului

α-D-Glucoza anhidră este utilizată ca substrat în procese fermentative în prezența

drojdiei pentru formarea alcoolului etilic. Are masa moleculară 180,16 g/mol. A fost

procurată de la Sigma Aldrich.

Figura 16. Structura chimică a glucozei

Albumina serică bovină are masa moleculară de aproximativ 66 kDa. A fost

achiziționată sub formă de pudră de la Sigma Aldrich. Este utilizată pentru determinarea

proteinelor prin metoda Lowry.

Tween 20 este un tensioactiv non-ionic cu masa moleculară 1228g/mol și balanța

hidrofil-lipofil de 16,7. A fost utilizat pentru stabilizarea emulsiilor și pentru a crește

solubilitatea curcuminei în medii apoase. A fost procurat de la Sigma Aldrich.

Figura 17. Structura chimică pentru polietilen glicol sorbitan monolaurat (Tween 20).

5.1.5. Alti reactivi utilizat:

Fosfat disodic, Na2HPO4·12H2O, M = 358,14 g/mol, Chemical Company.

Fosfat monosodic, NaH2PO4·2H2O, M = 156,02 g/mol, Chemical Company.

Page 100: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

99

Acetat de sodiu, M= 82,0343 g/mol

Bicarbonat de sodiu, M= 84,007g/mol

Soluție de Iod,

Acid clorhidric

Reactiv Folin Ciocâlteu

NaOH, M=40 g/mol

CuSO4

Na2CO3

Solvenți

Apă bidistilată produsă în laboratoarele proprii;

Alcool etilic C2H5-OH, M= 46,07 g/mol, achiziționat de la Chemical Company

Acid acetic glacial, M=60,05 g/mol, Chemical Company.

5.2. Tehnici experimentale

In acest paragraf sunt descrise toate tehnicile de caracterizare a celor trei tipuri de

imobilizate obținute în cadrul tezei, unele dintre ele fiind comune.

5.2.1. Prepararea particulelor conținând celule de drojdie imobilizate în matrici

polimere (polizaharide).

Obținerea particulelor pe bază de polizaharide conținând drojdie imobilizată este

schematic prezentată în fig. 18.

Figura18. Prezentare schematică a procesului de obținere a particulelor din polizaharide

conținînd celule de drojdie imobilizate, prin gelifiere ionotropă,

utilizând procedeul extruderii prin capilară.

Page 101: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

100

Modul de lucru este următorul. 0.25 g polimer (amestec de polimeri) se dizolvă în

25 ml apă bidistilată, sub agitare, la temperatura de 70-80ºC. Întrucât soluţia de polimer este

destul de fluidă şi nu formează particule stabile la picurarea în baia de reticulant ionic, se

procedează la prereticularea polimerului/amestecului de polimeri, anterior extruderii, prin

adăugarea unui volum de soluţie agent de reticulare (clorură sau acetat al metalului divalent)

de diferite concentraţii, când se obţine un fluid vâscos, posibil a fi extrudat. Soluția se

răcește la 30º-35ºC, iar apoi se extrude în picături cu ajutorul unei seringi printr-un ac cu

diametrul de 23 Gauge și lungimea de 30 mm, la presiune de apăsare constantă a pistonului

seringii, în 125 ml soluţie de agent de reticulare de diferite concentraţii. Procesul de

extrudere al întregii soluții durează aproximativ 10 minute. Particulele sferice se formează

instantaneu la contactul picăturilor cu soluția de acetat al metalului divalent din baia de

coagulare, fiind lăsate pentru maturare în soluţia de extrudere timp de 2 ore, după care sunt

spălate cu apă bidistilată pentru îndepărtarea excesului de agent de reticulare. Particulele se

separă prin filtrare şi se păstrează în stare umflată la frigider la temperatura de 4-6˚C până la

efectuarea caracterizărilor.

Particulele conținând celule de drojdie imobilizată s-au obţinut similar, după

adăugarea prealabilă în soluția de polimeri ce urmează a fi extrusă, a unei suspensii de

drojdie (1,25 g drojdie conținând 0.375 g celule, în 5 ml apă), la temperatura de 40˚C,

asigurând astfel un raport masic drojdie/polimer de 5/1 (g/g). Suspensia este agitată timp de

10 min până la obținerea unui amestec omogen, după care este extrusă în condițiile precizate

anterior. Particulele cu celule de drojdie sunt ținute pentru maturare timp de 1 oră în soluția

din baia de coagulare, după care sunt separate prin filtrare, se spală pe filtru cu trei porții de

câte 100 ml apă bidistilată și se păstrează în recipienti închiși, la o temperatură cuprinsă între

4-6ºC, până la caracterizarea și testarea lor ulterioară.

Prepararea fiecăruia dintre imobilizatele de celule în diferite matrici de polizaharide

prezintă unele particularități ce vor fi prezentate în cele ce urmează.

Particule cu celule de drojdie imobilizate în matrice de gelan reticulate cu Ca2+

Agentul de reticulare utilizat în acest caz este clorura de calciu. Prereticularea se

face cu un volum de 1.25 ml soluție de CaCl2 de concentrații diferite (c = 0.1; 0.3; 0.4; 0.5%

- g/100 ml), acesta fiind un parametru de influență a caracteristicilor particulelor obținute.

În scopul stabilirii influenței cantității de reticulant asupra proprietăților

particulelor, în baia de extrudere s-au utilizat soluții de CaCl2 cu diferite concentrații: 2%,

3% și 4 % (g/100 ml).

Page 102: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

101

Particule cu celule de drojdie imobilizate în matrice de gelan reticulate cu Mg2+

Pentru a stabili influența concentrației soluției de gelan asupra caracteristicilor

particulelor, s-a lucrat la valori ale acesteia de 0.8%, 1%, 1.15% și 1.3% (g/100 ml).

Agentul de reticulare utilizat este acetatul de magneziu. Prereticularea se face cu

soluții de diferite concentrații: 0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8% (g/100 ml).

Concentrația soluțiilor de Mg(OCOCH3)2 în baia de reticulare a fost de 1%, 2%,

3%, 4% (g/100 ml).

Particule cu celule de drojdie imobilizate în matrice de gelan reticulate cu Zn2+

Agentul de reticulare este acetatul de zinc. Prereticularea se face cu soluții de

diferite concentrații, respectiv 0.02%, 0.04%, 0.06%, 0.08% și 0.1% (g/100 ml).

Concentrația soluțiilor de Zn(OCOCH3)2 în baia de reticulare a fost de 0.07%,

0.08%, 0.1% și 0.3% (g/100 ml).

Particule cu celule de drojdie imobilizate în matrice de gelan în amestec cu

carboximetil celuloză (sare de sodiu), reticulate cu Mg2+

S-a lucrat cu 0.25 g amestec de gelan și carboximetil celuloză (CMCNa) în diferite

rapoarte masice și anume: gelan/CMCNa = 100/0; 80/20; 65/35; 50/50 și 35/65 (g/g).

S-a utilizat cu acetat de magneziu ca agent de reticulare.

Concentrația Mg(OCOCH3)2 în soluția de prereticulare a fost constantă (0,4% -

g/100 ml), iar în baia de coagulare de 2% g/100 ml (cxonstantă în toate experimentele).

Particule cu celule de drojdie imobilizate în matrice de gelan în amestec cu

carboximetil celuloză (sare de sodiu) și caragenan reticulate cu diferiți cationiu

divalenți

S-a lucrat cu amestecuri în diferite proporții de gelan, CMCNa si caragenan,

rapoartele masice ale celor trei polizaharide fiind precizate mai jos.

Gelan/CMCNa/Caragenan = 40/30/30; 40/20/40; 20/40/40; 33/33/33 (g/g/g).

Sau utilizat trei agenți de reticulare – acetat de calciu, acetat de magneziu, acetat de

zinc -, de concentrații diferite în prereticulant și în baia de extrudere.

Concentrația soluțiilor de prereticulare a fost de 2.8 x10-2

M pentru acetatul de

magneziu și de calciu, respectiv 1.1x10-3

M pentru acetatul de zinc.

Page 103: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

102

Concentrația soluțiilor în baia de extrudere (reticulare) a fost de 2.8 x10-1

M pentru

acetatul de magneziu și de calciu, respectiv 1.1x10-2

M pentru acetatul de zinc.

5.2.2. Prepararea particulelor conținând α-amilază imobilizată în matrice de gelan.

Particulele de gelan cu α-amilază imobilizată au fost obținute prin reticulare ionică

cu acetat de magneziu, utilizând metoda extruderii. Schematic, procesul de obținere este

prezentat în figura 1. S-a lucrat cu mai multe concentrații de α-amilază pentru a determina

concentrația optimă care poate fi imobilizată în particule de gelan.

0.1 g gelan (1%) au fost dizolvate la temperatura de 80-90˚C, sub agitare, în 10 ml

soluție tampon acetat care are un pH de 5.6. Soluția astfel obținută se răcește până la

temperatura de 60˚C când se adaugă sub agitare cantitatea de α-amilază dizolvată în 2 ml

soluție tampon acetat, pH 5.6. Baia de gelifiere ionotropă conține 10 ml soluție tampon

acetat și 10 ml soluție acetat de magneziu de concentrație 2%. Extruderea se efectuează în

picături cu ajutorul unei seringi, la temperatura de 60˚C (la o temperatură mai mică soluția

de gelan astfel obținută devine foarte vâscoasă iar activitatea enzimatică a α-amilazei scade).

La contactul cu soluția de reticulant, picăturile extruse se transformă instantaneu în particule

sferice, umflate. Particulele cu α-amilază imobilizată obținute se păstrează la frigider la

temperatura de 4-6˚C până la efectuarea testelor ulterioare.

Figura 19. Prezentare schematică a preparării particulelor de gelan cu α-amilază

imobilizată

Eficiența de imobilizare a enzimei se determină cu relația (1)

E =

x 1 (1)

unde, mEi-cantitatea de enzimă inițială

mEs-cantitatea de enzimă care se găsește în supernatant după extrudere.

Page 104: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

103

5.2.3. Prepararea particulelor conținând cucrcumină imobilizată în matrici de

polizaharide

Au fost utilizate două tehnici de realizare a sistemelor particulate polimer-

curcumină, ambele având la bază realizarea de complecși polielectrolitici între polizaharide

cu caracter ionic diferit.

Prima metodă se referă la realizarea particulelor pe bază de gelan, respectiv

gelan/caragenan prin complexare polielectrolitică cu chitosan, fiind prezentată schematic în

figura 2.

O cantitate de 20 mg curcumină se dizolvă în 10 ml ulei de măsline sub agitare, la

60˚C. Soluția de polimer (concentrație de 0.75% gelan sau gelan/i-caragenan) se prepară

separat prin dizolvarea a 1.5 g polimer în 20 ml apă distilată, sub agitare, la temperatura de

80-90˚C. Soluția uleioasă de curcumină se emulsionează prin adăugare în picături în soluția

apoasă de polizaharidă, după ce în aceasta din urmă se adaugă 1% Tween 20 (surfactant).

Emulsionarea are loc sub agitare energică (2000 rot/min), timp de 30 minute.

Figura 20. Prezentarea schematică a procesului de obținere a particulelor cu curcumină prin

metoda emulsiei și a complexării polielectrolitice.

Emulsia formată se extrude apoi cu ajutorul unei seringi și a unui ac cu

dimensiunea de 23 Gauge într-o soluție de 60 ml chitosan 1% (1% chitosan dizolvat în 1 %

acid acetic) ce conține și 20 ml soluție de acetat de magneziu 2%. Particulele se lasă în

amestecul rezultat, la frigider, la temperatura de 4-6˚C pentru 4-5 ore pentru stabilizare după

care se filtrează și se spală cu apă bidistilată pentru îndepărtarea excesului de chitosan și

Page 105: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

104

acetat de magneziu. Uscarea particulelor se efectuează la vid la temperatura de 30˚C, după

care acestea se păstrează în recipiente închise până la efectuarea caracterizărilor ulterioare.

A doua metodă utilizată pentru imobilizarea curcuminei în particule de polizaharide

se bazează, de asemenea, pe formarea unui complex polielectrolitic fiind prezentată

schematic în figura 3. Metoda presupune parcurgerea a două etape pentru obținerea

particulelor.

Etapa I. Prepararea microparticulelor de chitosan cu curcumină imobilizată.

În această etapă 200 mg curcumină se dizolvă în 20 ml alcool etilic absolut. Se

prepară separat o soluție de chitosan 0,05% în 0,06 M acid acetic (40 ml), în care se adaugă

o soluție de Na2SO4 de concentrație 0,1% (16 ml). Amestecul este supus ultrasonării (sondă

de ultrasunete tip Sonics and Materials, Vibra Cell) timp de 4 minute, cu adăugarea în

picături a curcuminei dizolvată în alcool etilic.

Figura 21. Prezentarea schematică a procesului de obținere a particulelor de gelan

ce conțin microparticule de chitosan cu curcumină imobilizată, reticulate ionic

cu acetat de magneziu, prin metoda extruderii.

Suspensia de particule de chitosan reticulat ionic astfel rezultată, este menținută la

40˚C sub agitare pentru evaporarea alcoolului etilic, după care separarea microparticulelor

se efectuează prin centrifugare. Final, microparticulele se spală de trei ori cu apă bidistilată

și se resuspendă în 100 ml apă bidistilată. Suspensia rezultată, dacă nu este folosită imediat

se păstreaza la T = 4-6˚C până la utilizarea în următoarea etapă.

Page 106: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

105

Etapa II. Prepararea particulelor de hidrogel pe bază de gelan conținând

microparticule de chitosan.

Gelanul se dizolvă în 20 ml apă bidistilată la 80-90˚C, pentru obținerea unei soluții

de concentrație 2%. Când se ajunge la temperatura 50˚C se adaugă sub agitare puternică

(2000 rot/min), în picături, 20 de ml din suspesia de microparticule de chitosan cu

curcumină, preparată în etapa I. Amestecul format se extrude cu ajutorul unei seringi printr-

un ac cu diametrul de 23 Gauge în 100 ml soluție acetat de magneziu de concentrație 2%. Se

formează simultan complexul polielectrolitic și aree loc și reticularea gelșanului. Particulele

de complex formate se păstrează în soluția de reticulare timp de 3 ore după care sunt

separate prin filtrare. Uscarea particulelor se face la temperatura camerei, la 25˚C, după care

acestea se păstrează în recipiente etanșe, la rece, până la efectuarea caracterizărilor.

5.3. Tehnici de caracterizare

5.3.1. Spectroscopia FTIR-ATR

Spectrele FTIR ale unor polizaharide precum și ale unor particule obținute pe bază

de amestecuri de polimeri, prin reticulare cu diferiți cationi divalenți, au fost înregistrate

utilizând un spectrofotometru FTIR Cary 630 cu ATR la interfața probelor pe un interval de

frecvența de 4,000–650 cm−1

la o rezoluție de 4-cm−1

(fig. 4). Software-ul utilizat pentru

colectarea datelor a fost Cary 630 MicroLab PC și software-ul Agilent Resolution Pro a fost

utilizat pentru determinarea poziției picurilor.

Figura 22. Spectrofotometru FTIR Cary 630 (Agilent Technologies, USA)

5.3.2. Morfologia particulelor (microscopie electronică de baleiaj)

Particulele, atât cele conținând celule de drojdie cât și cele conținând - amilază

sau curcumină au fost caracterizate prin microscopie electronică de baleiaj pentru a

determina morfologia, porozitatea și a evalua calitativ măsura în care celulele de drojdie se

Page 107: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

106

regăsesc în matricea polimeră. Particulele au fost secționate și uscate, au fost metalizate cu

aur utilizând un dispozitiv de pulverizare catodică (Cressington 108 auto) si analizate cu

ajutorul unui microscop HITACHI SU), respectiv TEMP 3000 HITACHI fig. 23)

Figura 23. Microscop electronic de baleiaj tip (a)-TEMP 3000 HITACHI;

Microscop Hitachi SU 1510 (b)

5.3.3. Stabilitatea structurală a particulelor conținând drojdie

Stabilitatea structurală a particulelor conținând drojdie imobilizatăa fost evaluată

indirect, prin teste reologice de baleiaj în amplitudine și frecvență. S-a pornit de la

presupunerea că o structură mai stabilă, puternică, realizată prin reticulare, determină valori

ridicate ale modulului de acumulare (G‘) probând o mai bună stabilitate mecanică. Testele

au fost effectuate pe un reometru modular Physica MCR 501 (Anton Paar, Austria) (fig. 24),

utilizând un sistem Peltier pentru reglarea temperaturii și o geometrie plan-paralelă.

a b

Figura 24. Reometru modular Physica MCR 501(a) și schema dispozitivului plan-plan

folosit pentru studii reologice

Toți parametrii reologici măsurați au fost determinați în regim dinamic oscilatoriu.

Același număr de particule din fiecare probă, selectate astfel încât să aibă același diametru,

au fost plaste între plăcile dispozitivului reometrului, până când cea superioară le atinge,

asigurându-se apoi o ușoară presiune. Testele de baleiaj în amplitudine au fost aplicate cu

Page 108: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

107

scopul de a determina limita domeniul vâscoelastic (domeniul LVE), care permite să se

stabilească deformația maximă tolerată de probă înainte ca structura sa internă să fie

distrusă. Frecvența a fost menținută constantă (ω = 10 rad/s) în timp ce deformația (γ) a

variat în domeniul 0,01’100%. Pentru testul de baleiaj în frecvență, deformația a fost

păstrată constantă în domeniul vâscoelastic liniar, iar frecvența a variat în domeniul 01 - 100

rad/s.

Toate măsurătorile au fost efectuate la temperatură constantă (T=30oC),

monitorizându-se variația în timp a modulelor de acumulare și pierdere.

5.3.4. Stabilitatea în diferite medii a sistemelor particulate conținând drojdie

Stabilitatea particulelor cu și fără celule de drojdie imobilizate a fost determinată

atât în soluția din baia de reticulare cât și în apă bidistilată. Se consideră că din particulele

mai puțin stabile se pot desprinde fragmente de polimer care determină turbiditatea soluțiilor

apoase în care sunt păstrate. O valoare mai coborâtă a transmitanței se corelează cu o

stabilitate structurală mai redusă a particulelor. De asemenea, turbiditatea soluției la

particulele cu celule de drojdie imobilizate, în cazul celor mai puțin stabile, poate fi

determinată de celulele de drojdie ce pot difuza din matricea polimeră în mediul în care sunt

păstrate.

Turbiditatea mediilor apoase în care sunt păstrate particulele este evaluată prin

măsurarea transmitanței T%, la o lungime de undă de 550 nm, la diferite intervale de timp,

atât în soluția de extrudere cât și în apă bidistilată, cu ajutorul unui spectrofotometru

BOECO S-22, la lungimea de undă de 550 nm (fig. 25)

Figura 25. Spectrofotometru UV-VIS tip BOECO S-22.

Particulele (10 g) au fost păstrate în 50 ml soluție de reticulare timp de 24 de ore

după care au fost spălate cu apă bidistilată; cele care conțin celule de drojdie imobilizată au

fost păstrate în apă bidistilată timp de 24 de ore iar particulele fără celule de drojdie au fost

păstrate 36 de ore in același mediu. Măsurarea transmitanței s-a efectuat la fiecare 12 ore.

Page 109: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

108

Particulele fără celule de drojdie au fost păstrate la temperatura camerei între măsurători, iar

cele cu celule de drojdie au fost păstrate la temperatura de 4-6˚C. Măsurarea transmitanței a

fost efectuată în triplicat, deviația standard fiind în limita de ± 0,3%.

Imobilizarea celulelor în particule de polimeri, are ca efect printre altele protejarea

biocatalizatorului de mediile, uneori agresive, în care lucrează. Se impune însă ca

imobilizatele să fie stabile în soluții alcoolice (formate în urma fermentării) cu concentrația

de minim 80 g/l, care să justifice separarea alcoolului prin distilare și să permită reutilizarea

lor. Pentru acest motiv, câteva tipuri de particule au fost analizate din punct de vedere al

stabilității într-o soluție alcoolică de 100g/l, această proprietate fiind evaluată, ca și în cazul

anterior, prin monitorizarea transmitanței mediului alcoolic în care au fost suspendate

probele, la diferite durate (intre 12 si 84 ore). Particulele cu celule de drojdie au fost păstrate

la frigider la 4-6˚C intre măsurători. Înainte de determinarea transmitanței probele au fost

păstrate la temperatura de 30˚C (temperatura la care are loc procesul de fermentare) timp de

255 min (durata unui ciclu fermentativ).

5.3.6. Gradul de umflare

Particulele obținute au caracter de hidrogel, astfel încât s-a considerat utilă

determinarea capacității lor de a reține apa – uzual cuantificată prin gradul de umflare

(Q,%). Acestă caracteristică este foarte importantă, deoarece ea determină difuzia mai mult

sau mai puțin intensă a substratului în matricea de hidrogel către celulele sau enzima

imobilizate, cât și difuzia produșilor rezultați în exteriorul imobilizatelor.

Atât pentru particulele cu cât și fără celule de drojdie imobilizate, precum și pentru

cele conținând -amilază, Q% a fost determinat gravimetric.

In cazul particulelor de gelan conținând drojdie de berte, reticulate cu acetat de

magneziu, au fost utilizate două metode de determinare a gradului de umflare.

Prima metodă a constat în monitorizarea comportării particulelor în timpul uscării

controlate. O cantitate exact cântărită de particule umflate (menținute timp de 24 ore în apă

bidistilată) au fost suouse uscării controlate la T=30 0C (temperatura la care se face

fermentarea glucozei). La intervale de timp de câte 1 oră, particulele au fost cântărite, iar

operațiunea a fost repetată până caând proba a ajuns la greutate constantă, ce semnifică

pierderea completă a apei (deci, particulele ajung în stare perfect uscată).

Pentru toate celelalte tipuri de particule s-a folosit metoda clasică de determinare a

gradului de umflare. Probele au fost uscate la temperatura de 40˚C până la greutate

constantă. O cantitate de particule exact cântărită (Muscat) a fost imersată în 5 ml apă

Page 110: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

109

bidistilată, ce a fost îndepărtată prin filtrare la intervale de câte o oră iar suprafața

particulelor a fost tamponată cu hârtie de filtru pentru a îndepărta excesul de apă. Masa

particulelor umflate (Mparticule umflate) a fost stabilită prin cântărire. Apa reținută de particule

(Mapă) reprezintă diferența dintre masa particulelor umflate (Mparticule uscate ) și masa

particulelor uscate (Muscat). După cântărire probele au fost reintroduse în apă, operațiunea

repetându-se după fiecare oră până la atingerea echilibrului. Gradul de umflare s-a exprimat

ca raport între cantitatea de apă existentă în particule la fiecare interval de timp și cantitatea

de particule complet uscate (relația 2)

(2) 100 M

M Q(%)

uscate particule

apă

Determinarea gradului de umflare s-a făcut în triplicat. Deviația standard este in

limita de ± 3%.

5.3.6.Viabilitatea celulară şi concentraţia celulelor de drojdie din medii apoase și

din particulele de imobilizat

Se consideră că din particulele cu celule de drojdie imobilizată mai puțin stabile pot

difuza mai multe celule. Pentru a stabili dacă viabilitatea celulară se păstrează în timp s-a

considerat util măsurarea concentrației de celule și a viabilității celulare din soluția apoasă în

care acestea sunt păstrate. Particulele de imobilizat au fost păstrate în 50 ml soluție ce

conține diferite concentrații de agent de reticulare timp de 24 de ore, apoi au fost spălate cu

apă bidistilată pentru îndepărtarea excesului de reticulant și păstrate pentru încă 36 de ore în

50 ml de apă bidistilată. După fiecare determinare particulele au fost păstrate la frigider la

temperatura de 4-6˚C în soluția de extrudere sau în apă bidistilată, în funcție de mediul

pentru care se evaluează aceasta caracteristică.

Metoda se aplică frecvent pentru evaluarea calităţii drojdiei comprimate, a stării

fiziologice şi determinarea procentuală a celulelor autolizate, a influenţei unor factori de

mediu asupra activităţii fiziologice a celulei de drojdie. Ea se bazează pe faptul că celulele

de drojdie neviabile fie în urma procesului de autoliză, fie a unui factor exterior ce produce

modificări ireversibile în structura proteinelor, işi pierd proprietăţile fermentative. Prin

suspendarea celulelor de drojdie în soluţie diluată de albastru de metilen și citrat de sodiu,

celulele inactive fiziologic se vor colora în albastru deoarece în urma inactivării

reductazelor, nu se mai produce trecerea colorantului în forma sa de leucoderivat incolor,

asa cum are loc în celula vie activă.

Page 111: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

110

Concret, viabilitatea celulară si numărul de celule de drojdie din mediile în care

particulele au fost suspendate, în soluţie diluată de albastru de metilen și citrat de sodiu 2%,

au fost determinate cu ajutorul unui microscop optic (Optika Model B-330) şi a unei camere

de numărare Marienfeld (Neubauer) (fig. 26). Cu ajutorul acesteia se pot număra celulele

neviabile (autolizate – de culoare albastră), din totalul de celule care se exprimă apoi

procentual (număr sau greutate, aceasta din urmă determinată din curba de etalonare).

(a) (b)

Figura 26. Microscop optic (Optika Model B-330) (a) şi cameră de numărare Marienfeld

(Neubauer) (b)

Concentraţia de celule de drojdie (număr celule/ml) din soluţia de extrudere s-a

determinat după 12 ore și 24 de ore; ulterior, particulele au fost spălate şi resuspendate în

apă bidistilată; s-a determinat concentraţia de celule după 12 ore, 24 ore și în unele cazuri,

36 ore. În funcţie de numărul de celule de drojdie vii si lizate ce se găsesc în soluţia de

extrudere după perioadele de timp menţionate anterior s-a determinat viabilitatea celulară

(Vc %) (relația 4)

(3) 100 lizate) celuleN viicelule(N

viiceluleN Vc

În care :

Vc -reprezintă viabilitatea celulară ;

Ncelule vii-reprezintă numărul de celule vii determinate cu ajutorul camerei de numărare ;

Ncelule lizate-reprezintă numărul de celule moarte (autolizate) determinate cu ajutorul camerei

de numărare.

Pentru determinarea cantității de celule de drojdie care se găsesc în supernatant

după obținerea particulelor și pentru determinarea cantității de celule de drojdie care se

consumă după fiecare ciclu de fermentare s-a construit în prealabil o curbă de etalonare care

corelează concentrația de celule de drojdie cu greutatea lor (fig. 27).

Page 112: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

111

Pentru prepararea soluției stoc cu celule de drojdie 0,1 g drojdie au fost dizolvate în

50 ml soluție acetat de magneziu de concentrație 0,5 %. Au fost făcute mai multe diluții

până în momentul în care celule au putut fi numărate cu ajutorul camerei de numărare și a

microscopului optic. Soluțiile au avut concentrații ce variază între 0,39 x 10-2

mg drojdie/ml

și 2,5 x 10-2

mg drojdie/ml. Cu ajutorul microscopului optic și a camerei de numărare s-a

determinat numărul de celule care se găsește în fiecare probă iar apoi s-a trasat curba de

calibrare prezentată în figura 27.

Figura 27. Curba de etalonare care corelează concentrația de celule de drojdie cu greutatea

lor.

Pe baza acestei curbe a putut fi calculată greutatea unei celule de drojdie, care este

de = 3.7x10-11

g /celula . Corectitudinea rezultatului obținut este atestată de faptul că

literatura raportează o valoare cuprinsă între 2.4 x 10-11

și 12 x 10-11

g/celula [559].

Masurătorile viabilității celulare au fost efectuate în triplicat, în tabelele de la

capitolele ulterioare fiind indicate valorile medii ale rezultatelor obținute. Deviația standard

este in limitele de ± 0,3%.

Păstrarea viabilității celulare în timpul procesului de fermentare este o condiție

esențială pentru ca particulele să poată fi utilizate în mai multe cicluri fermentative. Pentru a

stabili dacă celulele proliferează în matricea polimeră în intervalul dintre diferite cicluri de

fermentare, s-a procedat astfel. Câte 2-3 particule exact cântarite din fiecare probă testată din

punct de vedere al activității fermentative au fost dezintegrate mecanic cu ajutorul unui

ultraturax la 2000 rot/min in 100 ml H2O bidistilată, pentru a obține o dispersie omogenă de

celule. Prin colorarea dispersiei cu celule cu albastru de metilen, prin metoda anterior

descrisa, s-a determinat concentrația de celule și viabilitatea celulară din particule. În funcție

de numărul de celule/ml (concentrația de celule) din curba de calibrare trasată s-a evaluat

Page 113: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

112

cantitatea de celule care se găsește în particule după fiecare ciclu de fermentare (g celule/g

particule).

5.3.7. Testarea activității fermentative a particulelor ce conțin celule de drojdie.

Testarea capacităţii imobilizatelor de a produce fermentarea glucozei s-a efectuat

într-un fermentator (fig. 11) în care s-a introdus un volum de 50 ml soluţie glucoză (c = 8%)

și o cantitate totdeauna constantă de particule de imobilizat (30 g). Pentru a permite

compararea procesului de fermentare în prezența particulelor de imobilizat cu cel realizat în

prezența drojdiei libere, s-a realizat fermentarea glucozei în prezența celei din urmă într-o

cantitate practic egală cu cea din particule.

Fermentarea s-a condus la temperatura de 30˚C, monitorizându-se volumul de CO2

degajat, pe baza căruia s-a stabilit cantitatea de glucoză fermentată în timp, respectiv

eficienţa (randamentul) procesului. Fiecare ciclu de fermentare durează 255 de minute, iar

volumul de CO2 este citit după fiecare 15 minute. După fiecare ciclu de fermentare

particulele au fost recuperate din fermentator, spălate cu apă bidistilată pentru îndepărtarea

excesului de glucoză şi reticulant şi păstrate în frigider la temperatura de 4-6ºC diferite

perioade de timp, care pentru diferitele tipuri de imobilizat obținute au variat între 0,5 – 24

ore, până la următorul ciclu de fermentare.

Figura 28. Instalația de fermentare. 1 – reactorul de fermentare termostat; 2-

ciclindru pentru măsurarea volumului de CO2; 3-particule cu celule de drojdie imobilizate.

În unele cazuri, ce vor fi prezentate la capitolul ‖Rezultate și discuții‖, în

fermantator s-au mai introdus diferite cantități de agent de reticulare, sau s-a cret un mediu

Page 114: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

113

de o anumită valoare a pH-ului. Acesta a fost ajustat fie cu soluție 2% acid acetic fie cu

bicarbonat de sodiu (NaHCO3).

Rezultatele obținute în urma studiului cinetic al procesului de fermentare au stat la

baza calculării unor parametri specifici ai acestuia, respectiv productivitatea specifică și

viteza de fermentare.

Teoretic cantitatea de etanol formată, se poate deduce pe baza volumului de CO2

măsurat, deoarece în condițiile de lucru alese, fermentația alcoolică este singura activitate

metabolică a drojdiei. Calculele se efectueaza pe baza reacției de fermentare a glucozei:

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2

180g 2x46g 2x22,4L

Productivitatea specifică în etanol a fost determinată astfel:

Se trasează curba de fermentare : volumul măsurat VCO2 (ml) în funcție de timp

T(min)

Din porțiunea liniară se calculează panta dreptei alegând două puncte de pe aceasta

(V1, V2 și t1, t2 sunt coordonatele celor două puncte) și se determină viteza de

formare a CO2 exprimată în ml CO2/min de pe dreptă (relația 5).

=

, tg α = vCO2/t ml/min (4)

Volumul de gaz la 0˚C (273K) se calculează în funcție de volumul de CO2 (ml/min)-

obținut în etapa anterioară-la temperatura de colectare (30˚C-303 K). (Volumul de

gaz la 0˚C va fi exprimat în l/h) (relația 6)

VCO2 (0˚C)=

, ⁄ (5)

Din ecuația de fermentare a glucozei se determină debitul de etanol (g

etanol/h)(relația7).

=

(6)

Productivitatea specifică (g etanol/h x g drojdie) rezultă ca raportul dintre debitul de

etanol și masa de drojdie uscată.

Cantitatea de drojdie comprimată utilizată pentru fiecare probă a fost de 1.25 g.

Cantitatea totală de drojdie uscată reprezintă 30% din cantitatea totală de drojdie

comprimată adică 0.375g (relația 8)

=

x ⁄ (7)

Page 115: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

114

5.3.8. Determinarea activității -amilazei libere și imobilizate

Testele pe enzima liberă, respectiv imobilizată au fost efectuate pentru a determina

variația activității enzimatice în funcție de concentrația de amidon. S-a lucrat cu o soluție

stoc de amidon cu concentrația de 0.4%, respectiv o soluție de enzimă cu concentrația de

0,3922 mg/ml.

1 ml din soluția stoc de amidon se adaugă peste 6 ml de soluție tampon acetat pH

5,6 aflată într-un pahar sub agitare. Concentrația totală de amidon în cei 7 ml soluție este de

0,57 mg/ml. Se adaugă 200 μl din soluția stoc de enzimă iar din acest moment se începe

cronometrarea. In cazul caracterizării enzimei imobilizate, este luat în lucru 1 g particule

care conțin aproximativ aceeași cantitate de enzimă, ca și cea liberă. Din pahar se iau câte

200 μl probă din minut în minut și se adaugă într-o eprubetă care conține 1 ml HCl utilizat

pentru a opri reacția de hidroliză. 200 μl din eprubeta care conține enzime și HCl se adaugă

într-o eprubetă care conține 5 ml soluție de iod de concentrație 0.05 N. Determinarea se

efectuează colorimetric (amidonul în prezența iodului se colorează în albastru-violet) iar

absorbanța se citește după 20 de minute la o lungime de undă de 620 nm cu ajutorul unui

spectrofotometru.

Viteza reprezintă cantitatea de amidon transformată în glucoză pe minut.

Activitatea enzimatică s-a exprimat ca raport între cantitatea de amidon consumată

și cantitatea de enzimă luată în lucru. În figura 29 este prezentat schematic modul de lucru

pentru determinarea activității enzimatice.

Figura 29. Prezentarea schematică a modului de lucru pentru determinarea

activității α-amilazei libere sau imobilizate.

Cantitatea de amidon nehidrolizată care stă la baza evaluării activității celor două

forme de prezentare a enzimei se stabilește pe baza curbei de etalonare prezentată în fig.30

Page 116: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

115

(a) (b)

Figura 30. Curbele de calibrare pentru amidon utilizând (a) concentrații mai mici de 1 mg/ml

și (b) concentrații până la 4 mg/ml.

Pentru trasarea curbelor de calibrare ale amidonului au fost preparate mai multe

soluții de amidon de concentrații diferite.

Soluția stoc de amidon are o concentrație de 0.4% din care ulterior au fost

obținute prin diluție soluții a căror concentrație a fost:

- 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6 mg/ml (pentru trasarea curbei din figura 30 (a)).

- 0.5; 1; 1.5; 2; 2.5; 3; 3.5; 4 mg/ml (pentru trasarea curbei din figura 30 (b))

După ce soluțiile de amidon au fost preparate se iau câte 200 μl din fiecare probă și

se adaugă într-o eprubetă ce conține HCl 0.5 N. Din acest amestec se iau încă 200 μl și se

adaugă în 5 ml soluție de iod 0.05 N. După 15-20 minute se măsoară absorbanța la o

lungime de undă de 620 nm utilizând pentru măsurare un spectrofotometru UV-VIS tip

BOECO S-22.

5.3.9.Determinarea constantei Michaelis-Menten și a vitezei maxime de hidroliză -

amilaza liberă și imobilizată

Principiile generale ale cineticii reacțiilor chimice se aplică și la reacțiile catalizate

de enzime dar acestea au în plus o trăsătură proprie și anume saturarea cu substrat. Teoria

Michaelis-Menten presupune că enzima E se combină mai întâi cu substratul S pentru a

forma complexul enzime-substrat ES. Acest complex se descompune într-o etapă ulterioară

obținându-se enzima liberă E și produsul P.

Ecuația Michaelis Menten exprimă relația matematică dintre viteza inițială a unei

reacții catalizată enzimatic, concentrația substratului și anumite caracteristici ale enzimei,

fiind valabilă doar pentru reacțiile catalizate enzimatic, cu un singur substrat (relația 8)

v =

(8)

y = 0,1508x R² = 0,9944

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0 0,2 0,4 0,6 0,8 Concentratia amidon, mg/ml

Abso

rban

ta

y = 0,0791x R² = 0,9986

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 1 2 3 4 5

Absorbanța

Concentrația de amidon, mg/ml

Page 117: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

116

unde, v0-viteza inițială de reacție.

Vmax-Viteza maximă de reacție

Km-constanta Michaelis Menten

[S]-concentrația substratului.

Pentru determinarea constantei Km și a vitezei maxime de reacție, Vmax, au fost

utilizate mai multe concentrații de amidon între 3 și 30 mg/ml. Câte 1 ml din fiecare soluție

de amidon a fost adăugat în 6 ml soluție tampon acetat, pH 5,6.

Cantitatea de enzimă imobilizată și cantitatea de enzimă liberă utilizată în reacția de

hidroliză a fost aceeași (cantitatea de enzimă liberă adăugată a fost de 400 μl din soluția stoc

de enzimă, adică 0,16 mg enzimă iar cantitatea de enzimă imobilizată în 0,5 g particule a

fost tot de 0,16 mg enzimă). Determinarea vitezei de reacție s-a efectuat după 10 min

(utilizând testele de determinare a activității enzimatice descrise anterior ) și a fost exprimată

ca fiind cantitatea de amidon consumată într-un minut.

5.3.11. Influența pH-ului și a temperaturii asupra activității enzimatice

Pentru a determina pH-ul la care activitatea enzimatică este maximă s-a lucrat la

mai multe valori ale acestuia în baia de hidroliză enzimatică: 4; 4,5; 5; 5,6; 6 și 6,5.

Temperatura la care a fost efectuată hidroliza amidonului a fost de 60˚C.

Pentru a determina temperatura la care activitatea enzimatică este maximă s-a

efectuat hidroliza enzimatică în prezența enzimei libere sau a enzimei imobilizate utilizând

mai multe temperaturi cuprinse între 20 și 75˚C. PH-ul utilizat în mediul de hidroliză a fost

5,6.

Procedeul prin care s-a determinat activitatea enzimatică la diferite valori ale celor

doi parametri este cel descris anterior.

5.3.11.Testarea activității enzimatice a particulelor conținând enzimă imobilizată, în

mai multe cicluri hidrolitice

Particulele cu α-amilază imobilizată au fost testate în mai multe cicluri de hidroliză

repetate și s-a urmărit modul în care activitatea enzimatică evoluează de la un ciclu la altul.

Pentru această determinare s-au utilizat 1 ml amidon 0,4% in 6 ml soluție tampon

acetat la pH 5,6, 0,5 g particule conținând enzimă (0,15 mg enzimă) iar temperatura la care

s-a determinat activitatea enzimatică (prin procedeul descris anterior) a fost de 35˚C. S-a

ales această temperatură deoarece la 60˚C, după ciclul 4 de hidroliză particulele devin

instabile. Fiecare ciclu de hidroliza durează 10 minute.

Page 118: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

117

5.3.12.Cinetica eliberării curcuminei din particulele de imobilizat

Capacitatea de eliberare a curcuminei din particule a fost studiată prin difuzie în

două medii de pH diferit. S-a studiat eliberarea curcuminei în soluție tampon fosfat la

pH=7,4 care este specific sângelui, respectiv pH-ul care se găsește în fluidele din colon și la

pH = 2 utilizând o soluție preparată din NaCl și HCl care simulează pH-ul din mediul

gastric.

0,5 g de particule preparate prin metoda I sau 0,05 g particule preparate prin metoda

II sunt imersate în 20 ml soluție tampon fosfat pH =7.4 sau pH= 2, sub agitare, la

temperatura de 37˚ C iar din timp în timp sunt prelevate probe pentru a determina

spectrofotometric cantitatea de curcumină eliberată, la lungimea de undă de 425 nm

utilizând un spectrofotometru Boeco UV.

Deoarece curcumina este o substanță hidrofobă și este foarte puțin solubilă în medii

apoase (solubilitatea este de 0,006% în apă) s-a adăugat Tween 20 (tensioactiv) în fluidul în

care se efectuează eliberarea 1%. Curbele de etalonare pentru curcumina neimobilizată,

construite în soluția tampon fosfat și în soluția ce simulează lichidul gastric intestinal sunt

prezentate în figura 31.

Modul de lucru a fost următorul:

Pentru prepararea soluției stoc de curcumină s-au dizolvat la 10 mg curcumină în

50 de ml soluție (de pH 7.4 sau pH 2) ce conține și 1% Tween 20. Din această soluție prin

diluție au fost preparate 8 soluții a căror concentrație variază între 1μg/ml și 8 μg/ml.

Absorbanța s-a măsurat la o lungime de undă de 425 nm cu ajutorul unui spectrofotometru.

(a) (b)

Figura 31. Curbe de etalonare a curcuminei în soluție tampon fosfat pH 7,4 (a) și în soluție

ce simulează lichidul gastric, pH 2 (b)

y = 0,1201x R² = 0,9987

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 5 10

Absorbanța

Concentrația de curcumină, μg/ml

y = 0,1161x R² = 0,999

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 2 4 6 8 10

Absorbanța

Concentrația de curcumină, μg/ml

Page 119: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

118

CAPITOLUL 6

Obținerea de sisteme particulate pe bază de polizaharide reticulate

ionic conținând celule de drojdie imobilizate

Imobilizarea celulelor de drojdie în/pe diferite suporturi pentru obținerea alcoolului

etilic prin fermentare este studiată de peste 4 decenii, și continua să suscite interesul

cercetătorilor. Avantajele utilizării imobilizatelor de celule de drojdie comparativ cu

utilizarea lor tradiționala – în formă liberă -, sunt numeroase, printre ele putând aminti:

- protectia celulelor față de distrugere prin solicitare mecanică, factori de mediu sau

metaboliți toxici cum sunt cei produși de alcoolul etilic, ceea ce le păstrează viabilitatea și

activitatea o perioadă mare de timp [560, 561];

- productivitate crescută a utilajului de fermentare prin creșterea densității populației de

celule și utilizarea unor debite mari de substrat în procesul de producție;

- posibilitatea reutilizării catalizatorului biologic în cicluri ferementative repetate[332];

- reducerea pericolului de contaminare a produsului de fermentare prin ușurința separării

biocatalizatorului la sfârșitul procesului prin simplă filtrare;

- posibilitatea trecerii la procese continui, cu avantajele binecunoscute: eficiență ridicată,

productivitate ridicată, costuri mai reduse de operare, control mai bun al procesului și

posibilitatea de automatizare și conducere pe calculator, etc.[494].

Imobilizarea celulelor de drojdie este încă mult explorată în industria alimentară

pentru producerea vinului şi a berii în procese fermentative continue. Sistemele particulate

sferice conținând celule de drojdie de bere pot fi considerate adevărate bioreactoare de mici

dimensiuni, ceea ce a impus utilizarea acestui termen - pe care îl vom folosi adeseori pe

parcursul lucrării -, în literatura de specialitate.

Cercetările raportate în prezentul capitol se referă la obținerea mai multor tipuri de

particule sferice pe bază de polianioniți de natură polizaharidică (simpli sau în amestec),

conținând celule de drojdie de imobilizate, prin gelifiere ionotropă - reticulare -, în prezența

a diferiți cationi metalici divalenți, printr-un proces de extrudere prin capilară.

Abordarea noastră în obținerea acestui tip de imobilizate are, în cea mai mare parte,

caracter original pe de o parte fiindcă sunt utilizate ca suport, în unele cazuri, amestecuri de

polizaharide anionice, și pe de altă parte fiindcă utilizează ca reticulanți cationi ai unor

metale divalente care după cunoștința noastră nu au mai fost semnalați în literatura

domeniului.

Trebuie menționat faptul că în compoziția tuturor biorectoarelor astfel obținute intră

gelanul, adăugat relativ recent la gama de agenți de gelifiere disponibili comercial având

Page 120: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

119

utilizare în industria alimentară. Argumentele pentru utilizarea sa tot mai extensivă, nu doar

în domeniul alimentar ci și în cel farmaceutic, o constituie biodegradabilitatea, lipsa de

toxicitate, stabilitatea chimică pe un domeniu larg de valori de pH (pH = 2-10), rezistența la

numeroase enzime; aceleași argumente au stat la baza deciziei noastre de a-l folosi în

cercetările intreprinse în cadrul acestei lucrări de doctorat.

Prin reticulare ionică sau covalentă, gelanul poate include, datorită caracterului de

hidrogel al rețelelor formate, importante de compuși hidrofili, celule, microorganisme,

enzime etc. Există însă puține lucrări dedicate obținerii de hidrogeluri pe bază de gelan

reticulat ionic, destinate includerii de celule de drojdie. O excelentă trecere în revistă a

tehnicilor de obținere a particulelor de gelan prin gelifiere ionotropă sau complexare

polielectrolitică este realizată de Patil ș.a. [432], aplicația acestora constituind-o însă

realizarea de sisteme polimer-medicament cu eliberare controlată.

Rezultatele cercetărilor noastre au fost au fost grupate în 5 subcapitole, funcție de

natura ionului metalic utilizat ca reticulant sau de natura suportului (polizaharidă simplă sau

amestecuri de polizaharide).

6.1. Particule pe bază de gelan reticulat cu clorura de calciu conținând celule de

drojdie imobilizate

CaCl2 a fost ales ca agent de reticulare în acest studiu deoarece ionii de calciu pot

avea un rol în protejarea celulelor de drojdie împotriva efectelor toxice produse de etanol la

fel ca și ionii de magneziu sau zinc. Ionii de calciu, dacă sunt suplimentați în concentrații

mari, pot înlocui magneziul într-o serie de căi biochimice ceea ce poate conduce la o

creștere celulară și păstrarea viabilității celulare. Alte cercetări au reliefat faptul că

suplimentarea calciului în mediul de fermentare are un efect tampon ce împiedică creșterea

pH-ului în mediu ceea ce conduce la obținerea unei eficiențe mărite în fermentare.

Particulele obținute în cadrul studiului nostru au fost caracterizate din punct de vedere

morfologic, fizico-chimic iar activitatea lor fermentativă a fost testată și comparată cu cea a

drojdiei libere.

Formarea rețelei polimere care include în ochiurile sale celulele de drojdie, are la

bază interacțiile ionice realizate între grupările carboxilat ale gelanului și ionii de Ca2+

.

Celula de drojdie este un coloid încărcat electric, putând pierde această sarcină electrică sau

să-și schimbe semnul. Ea este încărcată pozitiv în stare normală, dar în mediul de

fermentare, după o perioadă de timp are loc înmugurirea sa iar celula își schimbă sarcina

electrică care devine negativă. La finele fermentării sarcina electrică redevine pozitivă. [561,

562] Ionul de calciu poate adera la membrana plasmatică celulară când este încărcată

Page 121: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

120

negativ, conferindu-i acesteia mai multa stabilitate la factorii de stres care pot interveni în

procesele fermentative. [28, 31]. In acest mod, celulele de drojdie pot participa la

ranforsarea rețelei, crescându-i astfel stabilitatea mecanică. In principiu însă, dimensiunea

mai mare a acestora comparative cu raza ionică a Ca2+

determină împiedicări sterice care pot

influența negativ formarea rețelei si deci stabilitatea sa structurală. Trebuie găsit deci un

echiliberu între cantitatea de celule de drojdie imobilizată și cantitatea de reticulant folosit,

pentru a asigura o structură puternică, stabilă în timp.

Figura 32 prezintă schematic structura rețelei pe bază de gelan reticulat cu inii de Ca2+

conținând în ochiurile sale celule de drojdie.

Figura 32. Reprezentarea schematică a rețelei de gelan reticulat ionic, conținând celule de

drojdie în ochiurile sale.

Teste preliminare au probat faptul că particule obținute în absența celulelor de

drojdie prezintă o bună stabilitate structurală (mecanică), chiar și după perioade destul de

îndelungate de păstrare.

Indiferent dacă structura este foarte stabilă, și cu atât mai mult, mai slabă, este

posibil ca după realizarea reticulării unele fragmente de polimer sau celulele de drojdie să nu

fie bine prinse în rețeaua polimeră și să se desprindă de aceasta, ceea ce poate determina o

anumită turbiditate în soluția de reticulare.

Pentru a înțelege mai bine factorii predominanți asupra stabilității structurale a

particulelor, s-a efectuat mai întâi un studiu privind stabilitatea particulelor considerând

drept criteriu turbiditatea supernatantului în care sunt suspendate acestea, respective

măsurând transmitanța acestuia.

Page 122: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

121

Gradul de reticulare, care determină stabilitatea structurală a rețelei, va determina

deci turbiditatea mediului de păstrare a particulelor. La rândul său, această caracteristică

structurală este funcție de cantitatea de ioni de Ca2+

utilizați ca reticulant. Ionii alcalini de Ca

pot fi introduși în polimer fie în stadiul de preparare a soluției de gelan (după cum s-a

precizat în paragraful 5.3, cu scopul de a crește ușor vâscozitatea acesteia și a permite

formarea de picături sferice la ieșirea din capilară), fie în stadiul de gelifiere ionotropă când

soluția de polizaharid este introdusă în picături în baia de coagulare.

6.1.1. Teste preliminare de obținere a particulelor de hidrogel

Anterior cercetărilor detaliate, s-a realizat un număr de teste preliminare cu scopul

de a stabili parametrii cei mai semnificativi de influență a proprietăților particulelor de

gelan, cu și fără celule imobilizate.

S-a constatat că unul dintre aceștia îl constituie cantitatea de ioni de Ca2+

, respectiv

raportul dintre cantitatea de gelan și cea de CaCl2, în etapa de pregelifiere (înainte de

extrudere). La o cantitate constantă de polizaharid (0,25 g) și drojdie (1,25 g), s-a adăugat un

volum de 1,25 ml soluție de CaCl2 de diferite concentrații. S-a constatat că un raport masic

de 3,3 mg CaCl2/g gelan permite obținerea unor particule mai stabile, turbiditatea

supernatantului în care s-au păstrat fiind mai miccă decât la utilizarea unui raport masic de

2,5 mg CaCl2/ g gelan. Concluzia firească este aceea că un număr mai mare de ioni Ca2+

la

prereticulare conduce la o mai buna stabilitate a particulelor finale. Valoarea menționată mai

sus a raportului nu trebuie depăsită, totuși, deoarece vâscozitatea soluției crește nedorit de

mult făcând greu posibilă extruderea prin capilară.

Reticularea devine intensă, influențând decisiv stabilitatea structurală a particulelor,

când picătura de soluție de gelan vine în contact cu o soluție mai concentrată de CaCl2 în

baia de extrudere. Ionii de Ca2+

din această soluție interacționează cu grupele carboxilat și cu

celulele de drojdie din suprafața picăturilor, contribuind la formarea unei rețele mai dense și

mai stabile, păstrând însă caracter de hidrogel ce îi permite absorbția unor cantități mari de

apă. Ca urmare, un alt parametru de ionfluență al stabilității particulelor îl constituie

concentrația ionilor de Ca2+

din baia de coagulare. Teste realizate la două concentrații

diferite de CaCl2 în baia de coagulare au relevat că valoarea transmitanței supernatantului

după 2 ore de păstrare a particulelor în acest mediu a fost de peste 91,5 %, crescând cu

concentrația reticulantului. Este un efect la care ne-am așteptat, cauzat de creșterea gradului

de reticulare ce implică în mai mare măsură atașarea în rețea a macromoleculelor de

polizaharid prin punțile ionice formate .

Page 123: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

122

Un alt potențial factor de influență îl constituie raportul gravimetric dintre

cantitatea de drojdie de imobilizat și cea de gelan. Câteva experimente realizate pentru a

elucida această influență au indicat că un raport drojdie/gelan de 5/1 (g/g) permite cea mai

eficientă imobilizare. Supernatantul în care se află particulele astfel obținute prezintă o

valoare ridicată a transmitanței (> 90%). Peste această valoare, valoarea transmitanței scade

drastic. Koyama and Seki [428] au ajuns la aceeași concluzie: o cantitate mai ridicată de

celule de drojdie poate reduce rezistența rețelei, determinând detașarea unor fragmente din

rețeaua polimeră sau migrarea celulelor din imobilizat.

Pe baza acestor rezultate preliminare s-a efectuat un studio mai amplu de elucidarea

a influenței parametrilor importanți ai procesului la obținerea particulelor cu și fără cellule

imobilizate, care pot afecta proprietăți ale acestora precum: capacitatea de umflare în medii

apoase, morfologia, activitatea biocatalitică. Pornind de la raportul optim drojdie/gelan de

5/1 (g/g), a fost variată concentrația ionilor Ca2+

din soluția inytrodusă la pre-extrudere

(prereticulare) și în baia de coagulare.

Programul experimental și codul probelor realizate sunt prezentate în tabelul 10.

Tabel 10. Programul experimental și codul probelor *

*25 mL soluție de gelan, c =1 % (w/v)

**1.25 mL soluție de clorură de calciu

***125 mL ml soluție de clorură de calciu

Se discută în cele de mai jos influența parametrilor considerați în studiu asupra unor

caracteristici importante ale particulelor obținute.

Proba Concentrația

soluției de

CaCl2 la pre-

extrudere

(%, w/v)**

Concentrația

soluției de

CaCl2 în baia

de coagulare

(%, w/v)***

Fără

celule

Cu

celule

PD1 0.1 2

P2 PD2 0.3 2

PD3 0.4 2

PD4 0.5 2

P5 PD5 0.3 3

P6 PD6 0.3 4

Page 124: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

123

6.1.2. Stabilitatea particulelor și viabilitatea celulară

După cum s-a precizat anterior,valorile transmitanței supernatantului în care s-au

păstrat particulele după extrudere constitiue o măsură a stabilitătții structurale a acestora.

Tabelul 11 prezintă valorile transmitanței pentru particulele cu și fără drojodie păstrate în

două medii: cel din baia de extrudere, respective apă bidistilată.

Table 11. Valorile transmitanței pentru două medii în care au fost păstrate

particulele cu și fără drojdie după extrudere, la diferite durate.

Proba

Transmitanța (%)

In soluția din

baia de

coagulare

In apă bidistilată

12 h 24 h. 12 h. 24 h. 36 h. 48 h

P2 95.6 95.2 99.1 98.3 97.5 95.9

P5 96.5 95.4 99.4 98.5 97.9 96.1

P6 96.5 95.6 99.8 99.2 98.7 96.3

Se constată că particulele sunt, în general, stabile, după cum probează valorile

ridicate ale transmitanței. După cum era de așteptat, cele mai stabile sunt particulele obținute

prin coagulare într-o soluție de CaCl2 concentrație 4% (P6).

Valorile transmitanței scad ușor cu durata de păstrare în mediul apos, pentru toate

probele. Particulele s-au dovedit a fi mai stabile în apă bidistilată, probabil și datorită

faptului că după păstrarea lor mai întâi în bala de coagulare fragmentele de polimer mai slab

prinse în rețea au fost deja îndepărtate.

Pentru particulele conținând celule de drojdie, turbiditatea a fost măsurată în

mediile diferite în care au fost păstrate. In acest caz, turbiditatea mediului lichid poate fi

influențată nu doar de fragmentele de polimer desprinse din rețea, dar și de celulele de

drojdie ce pot difuza din particule. Pentru aceste probe, transmitanța, concentrația celulelor

și viabilitatea celulară au fost determinate după 12 și 24 ore.

Tabelul 12 prezintă rezultatele obținute, în corelare și cu concentrațiile CaCl2

utilizate la pre-extrudere, respectiv cu durata de păstrare.

Page 125: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

124

Tabel 12. Influența concentrației soluției de CaCl2 utilizată la pre-extrudere și a duratei de

păstrare asupra stabilității particulelor și a viabilității celulare.

Proba

Transmitanța (%)

Concentrația celulelor

(nr. celule/ml) x 104 în

supernatant

Viabilitatea celulară, %

În soluția

de CaCl2

din baia de

coagulare

În apă

bidistilată

În soluția

de CaCl2

din baia de

coagulare

În apă

bidistilată

În soluția

de CaCl2

din baia de

coagulare

În apă

bidistilată

12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h

PD1 97.9 95.9 99.2 98.3 7.75 9 3.5 4 100 97.3 100 94.1

PD2 97.9 97 99.4 98.8 10 13 3.5 5.5 100 98.1 100 95.6

PD3 98.7 93.4 98.7 97.4 17.5 42.5 10.5 13.3 100 98.8 97.7 96.7

PD4 93 91.5 97.6 97 30 45 13 16.3 99.2 98.4 98.1 95.6

Exceptând proba PD4 (cu concentrația de 0,5% CaCl2 în pre-extrudat și 2% CaCl2

în baia de coagulare), valorile transmitanței sunt ridicate, chiar mai mari decât în cazul celor

înregistrate pentru același tip de particule fără celule imobilizate, sugerând buna stabilitate

structurală a celor dintâi. Acest rezultat constituie și un argument indirect că celulele incluse

în rețeaua hidrogelului interacționează cu ionii de Ca2+

, stabilizând strutura particulei.

Transmitanța scade ușor cu durata de păstrare în mediul apos. Trebuie menționat căp

viabilitatea celulară este ridicată chiar și după mai mult de 24 de ore de păstrare în lichid;

valorile înregistrate sunt, în general, mai mari de 95%.

Concluzii similare rezultă dacă se analizează rezultatele prezentate în tabelul 13,

pentru particulele cu celule imobilizate obținute la diferite concentrații ale reticulantului în

baia de coagulare. Stabilitatea acestora rămâne ridicată în comparație chiar cu particulele

fără celule imobilizate, și crește ușor cu concentrația ionilor de Ca2+, consecință a difuziei

unei cantități mai mici de celule din rețeaua polimeră. Viabilitatea celulară scade și ea, dar

valorile rămân ridicate (>90%). Concentrații mai mici de celule difuzate se constată după 24

h în soluția de coagulare, înainte de transferul în apă bidistilată.

Page 126: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

125

Tabel 13. Influența concentrației soluției de CaCl2 din baia de coagulare și a duratei de

păstrare asupra stabilității particulelor cu celule de drojdie și a viabilității celulare

Proba

Transmitanța (%)

Concentrația celulelor

(nr. celule/ml) x 104 in

supernatant

Viabilitatea celulară,

%

În soluția

de CaCl2

din baia de

coagulare

În apă bidistilată

În soluția

de CaCl2

din baia

de

coagulare

În apă

bidistilată

În soluția

de CaCl2

din baia

de

coagulare

În apă

bidistilată

12h 24h 12h 24h 36h 24h 12h 36h 24h 24h 36h

PD2 96.8 96 99.3 98.3 97.8 35 3.3 15 97.9 97 95.2

PD5 97 96.1 99.4 98.7 98.3 26.5 3.3 13.8 97.2 97 94.8

PD6 97.5 96.2 99.4 98.8 98.5 20 3 9.75 96.4 93.9 92.9

Utilizarea celulelor imobilizate în cicluri repetate de fermentare implică staționarea

lor perioade îndelungate de timp în mediul alcooloc format, ceea ce le poate distruge.

Examinând rezultatele prezentate în tabelul 14, se poate constata că valorile transmitanței

mediului alcoolic în care au fost suspendate particulele de imobilizat sunt încă ridicate chiar

și după 84 ore, cele mai mari înregistrându-se pentru particulele cu nivelul cel mai ridicat de

reticulare (PD6). S-a observat atunci când concentrația celulelor în supernatant a fost joasă,

viabilitatea celuară s-a menținut la valori ridicate.

Tabelul 14. Influența mediului alcoolic asupra stabilității în timp

a particulelor și viabilității celulelor de drojdie.

Proba Transmitanța (%)

Concentrația celulelor de

drojdie în supernatant

(nr. celule /ml x)

Viabilitatea celulară, %

12h 36h 60 h 84h 12h 36h 60h 84h 12h 36h 60 h 84h

PD2 97.8 96.6 95.8 94.7 16.3 20 25.8 38.3 98.5 96.4 97.2 96.8

PD5 98.4 97.4 96.8 96.1 8.8 12 14.3 21.3 97.2 96 95 94.4

PD6 98.7 97.8 97.3 96.5 8.3 10.5 11 18.8 97.1 95.5 95.7 93.8

Page 127: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

126

Concluzia evidentă este aceea că particulele conținând cellule de drojdie

imobilizate sunt stabile în mediul alcoolic, ceea ce este o condiție importantă pentru

utilizarea lor în cicluri fermentative repetate.

6.1.3. Gradul de umflare

Particulele de gelan conținând celule de drojdie imobilizată pot fi considerate

adevărate bioreactoare de mici dimensiuni. Substratul de fermentare (în acest caz glucoza)

difuzează în matricea polimeră unde intră în contact cu celulele de drojdie. Difuzia este

influențată de capacitatea particulelor de a se umfla în mediul apos, deci în final de gradul

lor de reticulare. Difuzia produsului de fermentare – alcoolul etilic -, din particule este

influențată de aceeași caracteristică alor. S-a considerat util din acest motiv să se evalueze

abilitatea particulelor de a se umfla în medii apoase, pentru a o corela cu alte proprietăți,

inclusiv cu capacitatea de fermentare.

Figura 33 ilustrează variația gradului de umflare (Q, %) în timp, pentru particule de

gelan cu și fără drojdie imobilizată, obținute utilizând ca reticulant în baia de coagulere,

soluții de CaCl2 de diferite concentrații.

Rezultatele prezentate demonstrează valori ridicate ale gradului de umflare în apă,

indiciu puternic al caracterului de hidrogel al particulelor.

(a) (b)

Figura 33. Variația gradului de umflare in apă, în timp, pentru particule de gelan fără (a) și

cu (b) celule de drojdie imobilizate, obținute în diferite condiții de extrudere

Gradul maxim de umflare ca și viteza procesului (panta porțiunii liniare a curbelor)

scad cu creșterea concentrației reticulantului din baia de coagulare. Trebuie notat, de

asemenea, că valorile maxime ale umflare pentru particulele conținând celule de drojdie

imobilizate sunt mai coborâte decât ale particulelor (fig. 4 b) fără celule, pentru aceleași

condiții de extrudere. Efectul este datorat, evident, interacției suprafeței negative a celulelor

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 5 10

Gra

du

l d

e u

mfl

are

, Q

%

P2 P5 P6

Timp (h)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 10 20 30 40

PD2 PD5 PD6

Gra

du

l d

e u

mfl

are

, Q

%

Timp (h)

Page 128: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

127

cu ionii de Ca2+, ceea ce contribuie suplimentar la reticularea matricii, după cum s-a mai

discutat anterior.

Rezultatele obținute sunt în deplină concordanță cu cele privind stabilitatea

structurală a particulelor, evaluată indirect prin transmitanța mediilor apoase în care au fost

suspendate. Particulele caracterizate de un grad maxim de umflare mai ridicat determină o

valoare mai ridicată a trransmitanței nu doar în mediile apoase în care au fost suspendate ci

și în alcool.

6.1.4. Morfologia particulelor

Informații importrante referitoare la morfologia particulelor, atât fără cât și cu cellule

imobilizate, au fost aduse de analiza prin microscopie electroniucă de baleiaj. Fotografiile au

fost realizate în secțiune, atât la probe umflate în apă cât și uscate, pentru mai multe

particule, dar pentru ilustraree au fost alese doar cele referitoare la particulele P2, respectiv

PD2, fiind prezentate în fig. 3.

Se constată că particulele fără celule de drojdie (fig. 34, A) prezintă o morfologie

poroasă în stare umflată, în timp ce particulele cu celule imobilizate (fig. 34 B) prezintă o

morfologie mai compactă, celulele fiind puternic ancorate în matricea polimeră, desigur

datprită și interacțiilor de natură ionică stabilite cu agentul de reticulare; ele prezintă tendința

de a forma aglomerate.

Morfologia acestor particule este și în accord cu comportarea lor la umflare, care

evidențiază valori mai coborâte ale gradului maxim de umflare pentru acest tip de particule.

Celulele de drojdie sunt relative uniform distribuite în matricea polimeră, și se poate

constata că aceasta le acoperă cu un strat subțire (fig. 34 C).

Toate rezultatele prezentate anterior probează faptul că particulele de gelan conțin un

mare număr de celule, matricea polimeră protejandu-le și fixându-le puternic, ceea ce

permite să anticipăm că aceste bioreactoare ar putea fi utilizate cu secces în cicluri repetate

de fermentare.

Page 129: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

128

Figura 34. Fotografii de microscopie electronică de baleiaj pentru particulele de tip P2 și

PD2 umflate în apă (A) sau uscate (B).

6.1.5. Activitatea fermentativă a biorectoarelor

Scopul obținerii imobilizatelor a fost acela de utilizare a lor în procese de

fermentare a glucozei, ceea ce a impus evaluarea lor realizate în diferite condiții de a cataliza

reacția în corelare cu parametrii procesului de obținere, și îndeosebi de a verifica dacă sunt

capabile de a fi utilizate în cicluri fermentative repetate.

Au fost selectate pentru acest studiu două tipuri de imobilizate, ceracterizate de

grade de reticulare diferite, respectiv PD2 și PD5. Rezultatele obținute sunt prezentate în fig.

35, care ilustrează variația randamentului de transformare a glucozei în timp, pentru 5 cicluri

fermentative repetate, la cele două tipuri de biorecatoare, comparativ cu fermentarea în

prezența drojdiei libere.

A - P2 particule umflate în apă

B - PD2 particule cu celule imobilizate, umflate în apă

C - PD2 particule cu celule imobilizate, uscate

Page 130: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

129

(a) (b)

Figura 35. Variația în timp a randamentului de fermentare a glucozei pentru 5 cicluri, în

prezența bioreactoarelor de tip PD2 (a) și PD5 (b) comparativ cu fermentarea în prezența

drojdiei libere (curba 0 din diagrame)

Se constată că după 255 minute (durata unui clclu), randamentul de fermentare

obținut cu ambele tipuri de imobilizate este superior celui obținut în prezența drojdiei libere.

Un randament superior se obține cu particulele PD2 comparativ cu PD5, pentru toate cele 5

cicluri fermentative (fig. 4 a). O explicație plauzibilă este aceea poate fi pusă pe seama

gradului diferit de reticulare al celor două tipuri de paticule. In mod evident, procesul de

fermentare este catalizat de celulele de drojdie imobilizate în matricea polimeră, și doar unm

mic procent este datorat fermentării declanșate de cellule libere din mediu, care sunt în

număr mic (după cum s-a probat anterior) și nu pot justifica randamentele ridicate de

transformare a glucozei. Substratul (soluția de glucoză) difuzează în matricea de hidrogel

unde intră în contact cu celulele imobilizate, suferind transformarea. Intensitatea difuziei

este determinată de densitatea rețelei reticulate; difuzie mai intensă și mai rapidă se produce

printr-un hidrogel cu grad ai redus de reticulare. Rezultă că difuzia substratului prin matricea

de tip PD2 este mai intensă, ceea ce explică randamentele de fermentare mai ridicate, în

perfectă concordanță cu valorile gradului de umflare și a transmitanței celor două tipuri de

particule. Reamintim că în ambele tipuri de particule se află imobilizată aceeași cantitate de

celule de drojdie, iar concentrația și volumul soluției de glucoză supusă fermentării au fost

aceleași în ambele cazuri.

Cercetările anterioare au arătat că pentru particulele de alginat reticule ionic cu

CaCl2 concentrația optima din baia de gelifiere care determină obținerea de randamente

optime în procesul de fermentare a fost de 2 %. Un grad de reticulare mai mic conduce la un

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 100 200 300

1

2

3

4

5

0

Timp (min)

Ra

nd

am

entu

l în

glu

coză

ferm

enta

tă, η

%

0

10

20

30

40

50

60

70

0 100 200 300

Ran

dam

entu

l în

glu

coză

ferm

enta

tă,

η%

Timp (min)

1

2

3

4

5

0

Page 131: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

130

transfer de masă mai mare datorită difuziei substratului la celulele de drojdie din interiorul

matricei [439]. Limitarea transferului de masă este o problemă în imobilizarea celulelor prin

metoda includerii deoarece celulele iși pot păstra viabilitatea ridicată și se poate obține o

productivitate mare în etanol doar dacă există un schimb eficient între nutrienți si particule.

[405].

Constatarea cea mai importantă rezultată în urma acestui studio este aceea că

particulele de imobilizat pot fi utilizate în cicluri repetate de fermentare, după separarea

facilă prin filtrare și spălarea cu apă bidistilată, în urma fiecărui ciclu realizat. Figura 36

prezintă valoarea randamentelor maxime de fermentare (după 255 min) obținute după 10

cicluri fermentative. O observația surprinzătoare este aceea că randamentul obținut cu

bioreactoarele de tip PD2 sunt mai mari pentru ciclurile 2 și 3, comparativ cu primul.

Același fenomen s-a constatat și pentru ciclul 2 al probei PD3. Explicația poate fi legată de

faptul că celulele imobilizate în cele două matrici suferă un proces de multiuplicare după

primul ciclu de fermentare, efect ce a fost verificat ulterior pentru alte tipuri de imibolizate

prezentate în această lucrare. Pentru ambele tipuri de particule fermentarea a continu at

timp de 10 cicluri; randamentele maxime atinse sunt prezentate în fig. 36.

(a) (b)

Figura 36. Valoarea maximă a randamentului de fermentare a glucozei (după 155 min),

pentru 10 cicluri repetate, la probele PD2 (a) și PD5 (b).

Pentru proba PD5 se poate aprecia că randamentul de fermentare rămâne practic constant

(cu excepția discutată anterior) pentru cele 10 cicluri; particulele PD5 prezintă însă fluctuații

mai mari ale valorii randamentului de fermentare pe parcursul celor 10 cicluri. Randamentul

în fermentare la proba PD5 nu variază foarte mult deoarece gradul de reticulare al

particulelor este mai mare iar particulele sunt mai stabile.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 2 3 6 7 8 9 10 0 Numărul de cicluri de fermentare

Randam

entul în glucoză

fermentată, η

%

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0

Numărul de cicluri de fermentare

Ran

dam

entu

l în

glu

coză

ferm

enta

tă, η

%

Page 132: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

131

Trebuie totuși menționat că, în toate cele 10 cicluri fermentative realizate cu ambele

tipuri de particule, se obțin randamente superioare comparativ cu cel realizat în prezența

drojdiei libere.

Rezultate similare privind variația randamentului în fermentare au fost observate și

de alți cercetători. Mariam și colab, 2009 a obținut microbioreactoare de alginat de sodiu cu

celule de drojdie imobilizate obținute prin reticulare ionică utilizând ca agent de reticulare

clorura de calciu care au fost testate din punct de vedere al activității fermentative. Numărul

maxim de cicluri de fermentare a fost de 6 iar o valoare maximă a randamentului de

fermentare s-a observat după al 4-lea ciclu de fermentare după care randamentul scade

brusc. Explicația dată pentru acest comporament a fost că microbioreactoarele devin

instabile după al 4-lea ciclu de fermentare și își schimbă forma [440].

Pentru a stabili dacă particulele sunt stabile în mediul de fermentare după fiecare

ciclu de fermentare, a fost determinat, pe baza curbei de calibrare, numărul celulelor de

drojdie din mediul de reacție și cantitatea lor. Se cunoaște cantitatea inițială de celule de

drojdie care a fost imobilizată ca fiind 30% din 1.25 g, mai exact 0.375 g. Prin diferență cu

cantitatea de celule ce se găsește în mediul de fermentare după fiecare ciclu fermentativ, se

poate deterimina teoretic cantitatea de celule rămasă în particule, neglijând totuși posibila lor

proliferare. Prin această evaluare s-a dorit a se evidenția îndeosebi faptul că celulele sunt

bine ancorate în matricea polimeră și nu difuzează în măsură mare în mediul de fermentare

chiar și după mai multe cicluri fermentative.

Pentru exemplificare, în tabelul 6 sunt prezentate rezultatele referitoare la

imobilizatele de tip PD5.

Page 133: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

132

Tabel 15. Cantitatea de celule de drojdie rămase în particule

după fiecare din cele 10 cicluri fermentatiove

Numărul ciclului de fermentare

Cantitatea de celule

(g) în 10 ml soluție

(în baia de

fermentare) x 104

Cantitatea de

celule rămase în

particule (g)

I 1.667 0.3743

II 3.196 0.374

III 0.835 0.3739

IV 0.879 0.3738

V 0.556 0.3737

VI 1.019 0.3736

VII 1.7139 0.3735

VIII 0.602 0.3734

IX 0.509 0.3734

X 0.162 0.3732

Se constată din datele prezentate în tabel că numărul de celule care difuzează din

particule (în fapt, cantitatea lor) este foarte mic în comparație cu cantitatea de celule care

rămân prinse în rețeaua polimeră. Se poate deci afirma că particulele sunt stabile și pot fi

utilizate în mai multe cicluri fermentative repetate.

6.1.6.Evaluarea viabilității celulare și a cantității de celule din particule după fiecare ciclu de

fermentare

Păstrarea viabilității celulare în timpul procesului de fermentare este o condiție

esențială pentru ca particulele să poată fi utilizate în mai multe cicluri fermentative. In

tabelul 16 sunt prezentate valorile viabilității celulare și numărului/cantității de celule de

drojdie rămase în particule (stabilite după dezagregarea mecanică a imobilizatelor), în

funcție de numărul ciclului de fermentare (considerat selectiv).

Page 134: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

133

Tabel 16. Viabilitatea celulară și cantitatea de celule/gram de particule

determinate după diferite cicluri de fermentare repetate, pentru proba PD2.

Numărul

ciclului de

fermentare

Numărul de

celule/g

particule x

108

Cantitatea

de celule

din particule

(mg/g)

Viabilitatea

celulară, %

0 4,81 17,81 94,16

1 5,9 21,86 94,9

2 5,97 21,86 95,3

4 6,44 23,71 92,24

8 7,56 27,78 90,16

9 6,4 23,71 90,36

10 5,95 22,04 90,26

Viabilitatea celulară din particule tinde să scadă de la un ciclu la altul. O creștere ușoară se

observă la ciclurile 1 și 2 determinată de proliferarea celulelor. Valorile mari ale viabilității

celulare demonstrează că matricea polimeră protejează celulele de drojdie de factorii care

pot să afecteze creșterea celulară. În figura 8 este prezentată evoluția randamentului maxim

de fermentare în corelare cu cantitatea de celule din particule după fiecare ciclu de

fermentare. Rezultatele prezentate în tabelul 7 și fig. 8 atestă că celulele din matricea

polimeră nu diminuiază de la un ciclu la altul ci chiar proliferează în interiorul particulelor.

Există o bună concordanță între cantitatea de celule din particule și evoluția randamentului

în fermentare. După ciclul 6 de fermentare randamentul începe să scadă, la fel ca și

cantitatea de celule din particule.

Figura 37. Evoluția cantității de celule (mg)/g particule în funcție de numărul ciclului de

Page 135: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

134

fermentare pentru proba PD2 în corelare cu randamentul maxim obținut după fiecare ciclu

de fermentare.

Rezultatele obținute demonstrează, de asemenea, că gradul de reticulare al

particulelor este optim asigurând o porozitate adecvată, necesară pentru un schimb eficient

de nutrienți între mediul de fermentare și celulele din interiorul particlelor. Randamentele în

fermentare obținute sunt optime, comparabile cu cele obținute la fermentarea cu drojdia

liberă, iar particulele pot fi cu ușurință recuperate din fermentator și reutilizate în mai multe

cicluri fermentative.

6.1.7. Productivitatea specifică și viteza de fermentare

Curbele cinetice de fermentare au o alură practice liniară, ceea ce permite cu

ușurință estimarea vitezeri procesului, exprimată ca procent de glucoză transformată în

unitatea de timp. Pe baza lor se poate evcalua, de asemenea, productivitatea specifică în

etanol (g etanol/g drojdie x h, din particulele de imobilizat).

Valorile acestor caracteristici sunt prezentate în tabelul 17. Este interesant faptul că

valorile productivității specifice sunt practice aceleași pentru cele mai multe dintre ciclurile

de fermentare, și sunt comparabile sau chiar superioare celei corespunzătoare fermentării în

prezența celulelor de drojdie libere.

Tabel 17. Valorile vitezei de fermentare și ale productivității specifice

în etanol pentru imobilizatele PD2 and PD3, pentru cele 10 cicluri de fermentare.

Numărul

ciclului de

fermentare

Viteza de fermentare

(% glucose

transformată /min)

Productivitatea

specifică în etanol

(g etanol / h .g

drojdie)

PD2 PD3 PD2 PD3

1 0.24 0.27 0.6 0.6

2 0.31 0.27 0.97 0.8

3 0.29 0.22 1.07 0.6

4 0.2 0.2 0.6 0.6

5 0.22 0.2 0.6 0.6

6 0.27 0.2 0.83 0.6

7 0.24 0.2 0.6 0.6

8 0.22 0.16 0.6 0.6

9 0.18 0.16 0.6 0.5

10 0.2 0.2 0.6 0.6

Drojdie liberă 0.07 0.6

Page 136: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

135

Concluzii

Gelanul constuituie o matrice convenabilă pentru imobilizarea celuleor de drojdie,

fiind ușor de reticulat cu ioni de Ca2+, conducând la particule stabile în medii apoase sau

alcoolice, astfel încât pot fi utilizate într-un număr ridicat de cicluri de fermentare.

Stabilitatea particulelor este ușor influențată de cantitatea de reticulant introdus în

soluția de polizaharid înainte de extrudere, sau în baia de coagulare.

Agentul de reticulare influențează, totuși, comportarea particulelor în medii apoase

prin gradul de reticulare atins, care la rândul său deterină intemnsitatea difuziei substratului

către celulele imobilizate.

Particulele fără celule de drojdie prezintă o morfologie ușor poroasă, care devine

mai compactă în prezența celulelor de drojdie ce pot participa la reticulare.

Studiul demonstrează potențialul bioreactoarelor obținute de a fi utilizate în procese

de ferementare repetate, cu eficiență ridicată, superioară chiar drojdiei libere; ele pot fi luate

în considerare în procese fermentative continue ale glucozei, de interes pentru industria de

profil.

6.2. Particule pe bază de gelan reticulat cu acetat de magneziu conținând celule de

drojdie imobilizate

Magneziul, metal divalent din aceeași grupă cu calciul, face parte din clasa

metalelor alcalino-pâmăntoase cu electropozitivitate destul de ridicată care îi imprimă și

reactivitate mare. El poate participa, ca si calciul, la formarea de legături ionice suficient de

puternice, argument important pentru a-l selecta ca agent de reticulare ionică a gelanului. Pe

lângă acest argument, s-a ținut cont și de alte avantajele aduse de magneziu și de sarea pe

care am selectat-o ca reticulant – respectiv acetatul de magneziu -, comparativ cu clorura de

calciu utilizată anterior.

Avantajele utilizării magneziului pentru creșterea celulară și în procese

fermentative sunt multiple. Ionul de magneziu este un ionul metalic cel mai abundent

implicat într-o gamă largă de procese metabolice [29, 30]. El constitue cam 0,3% din

întreaga cantitate de drojdie uscată și activează peste 300 de enzime [22, 33, 48]. Menținerea

integrității celulare, ceea ce include stabilizarea structurală a acizilor nucleici, a

polinucleotidelor, a cromozomilor, polizaharidelor și lipidelor a fost atribuită magneziului

[27]

Page 137: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

136

Magneziul este absorbit in mod activ de către celulele de drojdie din mediul de

fermentare pentru a îndeplini roluri fiziologice esențiale [28] și este necesar pentru activarea

unor enzime glicolitice cum ar fi glucokinaza, glucoză-6-fosfat dehidrogenaza, fosfoglicerat

kinaza și enolaza; rolul ionului metalic de a ajuta la creșterea celulară și la protejarea celulei

în timpul fermentării este cunoscut [27]. Deficiența de magneziu din mediu poate conduce la

încetinirea metabolismului drojdiei iar o consecință poate fi incetinirea sau oprirea

procesului fermentativ [28] Ionul magneziu favorizeaza proliferarea celulelor de drojdie

constituind un factor de creștere (până la o anumită concentrație).

Ionul CH3COO-, spre deosebire de ionul Cl

-, favorizează deplasarea echilibrului

reacției de schimb ionic spre formarea rețelei, ceea ce conduce la structuri mai stabile din

punct de vedere mecanic. La concentrații sub 0,7 % (masic) nu afectează viabilitatea

celulelor, spre deosebire de ionul de Cl-.

La aceste caracteristici se adauga, desigur, lipsa de toxicitate a reticulantului

utilizat.

Un ultim argument îl constituie faptul că, după informațiile noastre, în literatura nu

este semnalată obținerea de imobilizate de celule de drojdie în matrici de gelan reticulat cu

ionul magneziu.

Așadar, cercetarea de față are ca scop obținerea de particule sferice cu caracter de

hidrogel conținând celule de drojdie, pe bază de gelan reticulat ionic – gelifiere ionotropă -,

printr-un proces de extrudere, utilizând ca agent de reticulare acetatul de magneziu.

Particulele obținute sunt caracterizate fizico-chimic și morfologic, din punct de vedere al

stabilității structurale, al activității biocatalitice, al posibilității de a fi utilizat în cicluri

fermentative repetate, al productivității specifice.

Realizarea imobilizatelor de drojdie în matricea de gelan are la bază fixarea

celulelor de drojdie în ochiurile rețelei formate prin reticularea polizaharidului, ca urmare a

legării ionice a cationilor de magneziu la anionii carboxilat ai gelanului. Reacția de

bazaăeste urmatoarea:

Mg2+

(-OCOCH3)2 + 2 Gelan-COO

-Na

+ Gelan-COO

- Mg

2+ -OCO-Gelan + 2Na

+

+2CH3COO-

Structura rezultată este reprezentată schematic in fig. 38.

Page 138: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

137

Figura 38. Prezentarea schematica a structurii imobilizatelor de celule de drojdie (bulinele

albastre) in sfere de gelan reticulat cu cationi de Mg2+

.

In scopul stabilirii condițiilor optime de obținere a particulelor au fost luați în

considerare mai mulți parametri, pornind de la informațiile obținute în urma studiului

privind reticularea gelanului cu ioni de Ca 2+

și anume:

- concentrația solutiei de gelan: 0.8%, 1%, 1.15%, 1.3 % (w/v)

- concentrația soluţiei de Mg(OCOCH3)2 în preextrudat (v = 0,5 ml): 0.2%, 0.4%, 0.6%,

0.8% (w/v)

- concentrația soluţieide Mg(OCOCH3)2 în care se face extruderea (v = 50 ml): 1%, 2%, 3%,

4% (w/v)

Majoritatea particulelor au fost obţinute prin extrudere în capilară (ac de seringă) cu

diametrul interior de 600 microni şi lungimea de 30 mm. Incercarea de utilizare a unei

capilare cu diametrul de 800 microni, la o lungime de 40 mm, conduce la sfere cu diametru

mai mare, mai puțin stabile în mediu apos (valori mai reduse ale transmitanţei). In toate

cazurile, particulele obţinute sunt sferice şi au dimensiuni cuprinse între 2.5 si 3.7 mm în

funcţie de valoarea parametrilor procesului și de caracterristicile capilarei. In fotografia din

fig. 10 sunt prezentate, comparativ, particule sferice de gelan fără (a) și cu drojdie

imobilizată (b), obținute la aceleași valori ale parametrilor procesului de extrudere (proba P5

din tabelul 18).

a b

Page 139: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

138

Fig. 39. Fotografie prezentând aspectul particulelor de gelan reticulat cu

ioni de Mg2+

fără (a) și cu (b) drojdie imobilizată

In tabelul 18 sunt prezentate câteva dintre probele obținute, cu codificarea lor,

valorile concrete ale parametrilor procesului de extrudere și diametrul particulelor.

Tabelul 18. Tipuri de particule de gelan obținute prin gelifiere ionotropa: parametrii

procesului de obținere prin extrudere si diametrul lor mediu.

Se constată o influență că parametrilor procesului de extrudere luați în considerare

influențează diametrul particulelor obținute. Astfel, creșterea concentrației soluției de

polimer determină creșterea ușoară a diametrului sferelor (probele P1-P3), efect firesc dat

fiind faptul că reticularea, care se face pe seama aceleiași cantități de reticulant din

preextrudat și din baia de extrudere, devine mai puțin intensă. Efectul cel mai pronunțat îl

produce concentrația soluției de reticulant în preextrudat (probele P4 – P7; P11 ; p13), când

diametrul scade de la 3,3 la 2,5 mm. Cantitatea de reticulant din baia de extrudere contribuie

la reticularea suplimentară a gelanului din particulă, dar mai ales la suprafața acesteia, căreia

îi conferă stabilitate mecanică; diametrul particulei scade cu creșterea concentrației

Proba Caracteristicile

capilarei

(diametru x

lungime)

(mm/mm)

Concentrația

Soluției de

gelan

(g/100 ml )

Concentrația

soluției de

Mg(OCOCH3)2î

n preextrudat

( g/100 ml )

Concentrația soluției

de Mg(OCOCH3)2

în baia de extrudere

(g/100 ml )

Diametrul

mediu al

particulei

(mm)

P1 0.6 x 30 0.8 0.4 2 2.5

P2 0.6 x 30 1.15 0.4 2 2.6

P3 0.6 x 30 1.3 0.4 2 3.0

P4 0.6 x 30 1 0.2 2 3.3

P5 0.6 x 30 1 0.4 2 2.8

P6 0.6 x 30 1 0.6 2 2.7

P7 0.6 x 30 1 0.8 2 2.5

P8 0.6 x 30 1 0.4 1 3.1

P9 0.6 x 30 1 0.4 3 2.6

P10 0.6 x 30 1 0.4 4 2.5

P11 0.8 x 40 1 0.4 1 3.7

P12 0.8 x 40 1 0.4 2 3.0

P13 0.8 x 40 1 0.8 2 2.6

Page 140: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

139

reticulantului în baia de extrudere (probele P8, P5, P9, P10; P11-P12). Caracteristicile

geometrice ale capilarei influențează diametrul particulelor, ăn sensul creșterii acestuia cu

creșterea diametrului (lungimea capilarei nu variază semnificativ) (probele P8, P11).

Pentru caracterizarea ulterioară a particulelor, au fost luate în considerare doar cele

obținute prin extrudere prin capilara cu caracteristicile diametru/lungime = 0.6/30

(mm/mm).

6.2.1. Morfologia particulelor

Influența observată anterior, a cantității agentului de reticulare asupra dimensiunii

particulelor de imobilizat a impus analiza morfologică a acestora, prin microscopie

electronică de baleiaj. S-a constatat o influență evidentă a cantității de reticulant utilizat

asupra acestei caracteristici. Pentru ilustrare (fig. 40) s-au reținut probele P9 si P10, care

diferă prin cantitatea de reticulant utilizat în baia de coagulare.

Este evident din analiza fotografiilor, indiferent de rezoluție, că proba P10 are o

structură mai compactă, determinată de utilizarea unei cantități mai mari de reticulant.

Figurile relevă, de asemenea, prezența matricii de gelan reticulat care ancorează celulele de

drojdie, cu caracter mai poros în cazul probei P9. In concordanță cu aspectul morfologic

sunt unele proprietati fizico-chimice, precum stabilitatea structural, comportarea la umflare

in medii apoase, stabilitatea mecanica, ce vor fi discutate în cele ce urmează.

Page 141: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

140

a b

Fig. 40. Fotografii de microscopie electronică de baleiaj

ale particulelor P9 (a) și P10 (b) (trei rezoluții)

6.2.2. Stabilitatea în apă şi viabilitatea celulară

Pentru a aprecia stabilitatea particulelor obținute determinată de o structurare mai

mult sau mai puțin puternică a lor, s-a considerat utilă și semnificativă, la fel ca în cazul

reticulării cu ionul Ca2+, în primul rând determinarea turbidității (transmitanței) mediilor

apoase în care acestea sunt obținute, respectiv păstrate. Evident, valori ridicate ale

transmitanței sugereaza stabilitate ridicată a particulelor, tradusă prin puține fragmente de

gelan care se desprind din acestea. In cazul imobilizatelor, transmitanța poate fi afectată și

de trecerea în mediul lichid a unor celule nefixate în rețeaua polimeră.

Valorile mari ale transmitanţei obținute în urma determinărilor atestă faptul că

particulele sunt stabile în timp atât în soluţia de extrudere cât şi în apă bidistilată; câteva

rezultate sunt prezentate in Tabelul 19.

Page 142: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

141

Tabel.19. Valorile transmitanței soluției de extrudere, respectiv a apei bidistilate în care s-au

păstrat câteva dintre particulele obținute

Proba Concentrația

soluției de

gelan

(g/100 ml)

Concentrația

soluției de

Mg(OCOCH3)2în

preextrudat

( g/100 ml)

Concentrația

soluției de

Mg(OCOCH3)2în

baia de extrudere

(g/100 ml)

Transmitanța T (%)

în soluția de

extrudere în apă bidistilată

30 min.

12

h. 3 h. 12h. 24 h.

P4 1 0,2 2 99,6 98,8 98,5 97,0 95,6

P5 1 0,4 2 99,8 99,0 99,0 98,2 96,7

P9 1 0,4 3 99,2 99,1 99,1 99,0 97,9

P10 1 0,4 4 99,8 99,3 99,1 99,0 98,2

Transmitanţa în soluţia de extrudere este de peste 99% după 30 de minute scăzând

ușor după 12 h, ccea ce sugerează prinderea în rețea a întregii cantități de gelan, dar și

imobilizarea practic totală a cantității de drojdie supusă încapsulării. Păstrarea probelor în

apă bidistilată, după separarea din supernatantul din baia de extrudere, evidențiază o scădere

treptată a transmitanței cu durata de păstrare (între 3 si 24 ore), valoarea acesteia rămânând

totuși ridicată. Valorile cele mai mari ale transmitanței se înregistrează la particulele mai

reticulate, respectiv cele cu mai mult reticulant fie în preextrudat (P2) fie în baia de

extrudere (P10). Efectul este firesc, datorită faptului că macromoleculele de gelan sunt mai

bine fixate în rețea o dată cu creșterea cantității de Mg(OCOCH3)2.

Valorile transmitanţei sunt mai reduse la particulele cu drojdie încapsulată (Pi+D)

în comparaţie cu cele înregistrate la particulele obținute în aceleași condiții fără drojdie, dar

totuşi sunt destul de ridicate, ceea ce conduce la concluzia că drojdia a fost imobilizată

eficient în rețeaua polimeră (Tabelul 20).

Page 143: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

142

Tabel 20. Valorile transmitanței soluției de extrudere, respectiv a apei bidistilate în care s-au

păstrat câteva dintre particulele obținuteconținînd drojdie încapsulată, în corelare cu

concentrația celulelor în cele două medii și cu viabilitatea celulară

În cazul păstrării particulelor în soluţia de acetat de magneziu din baia de extrudere

valorile transmitanţei au fost cuprinse între 86,5-99,8 (dupa 4 h) scăzând ușor cu durata

păstrării (86.5-98.8). Transmitanța crește cu creșterea concentrației reticulantului atât ăn

preextrudat (probele P4+D, P5+D) cât și în baia de extrudere (P9+D, P10+D), atât la

păstrarea în supernatantul din baia de extrudere, cât și în apa bidistilată, indiferent de durata

păstrării.

Desigur, cele mai mici valori ale transmitanței se înregistrează la păstrarea mai

îndelungată în apă (24 h). Transmitanța este corelată foarte bine cu concentrația celulelor

care au părăsit imobilizatul, respectiv cu gradul de reticulare al matricei de gelan. Se

constată că atât în supernatantul continând reticulant, cât și ulterior, la păstrarea în apă

distilată, concentrația celulelor libere scade cu gradul de reticulare, și crește cu durata

păstrării iîn aceste lichide (transmitanța variază invers proporțional).

Deși numărul de celule care părăsesc matricea polimeră scade cu creșterea gradului

de reticulare a acesteia, numărul de celule moarte din totalul de celule libere crește ușor

(viabilitatea celulară scade, atât în supernatantul de la extrudere cât și în apa distilată).

Efectul este logic: creșterea gradului de reticulare determină difuzia mai dificilă a

nutrienților către celulele de drojdie imobilizate în matrice, astfel încât acestea mor

Proba

Transmitanța, T%

Concentraţia celulelor de

drojdie/ml x 104 in

supernatant

Viabilitatea celulară, %

în soluție de

Mg(OCOCH3)2 în apă bidistilată

în soluția de

Mg(OCOCH3)2

în apă

bidistilată

în soluția de

Mg(OCOCH3)

2în

în apă

bidistilată

4h 12h 4h 12h 24h 12h 12h 24h 12h 12h 24h

P4+D 93,7 86,5 94 85,3 86,4 16,5 38 58,5 96 95,73 94,15

P5+D 96,3 94,8 96,8 90,2 88 10,75 11 23,5 93 93,18 93,49

P9+D 97,7 96,4 97,4 96,4 95 6,25 9,25 18,5 92 89,19 88,24

P10+D 99,8 98,8 98,3 96,7 95,5 2,5 6 14,5 90 88,07 87,93

Page 144: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

143

(autoliză) în măsura mai mare, și se regasesc printre celulele ce părăsesc matricea în

proporție mai ridicată (viabilitatea celulară scade).

6.2.3. Stabilitatea în soluții alcoolice și viabilitatea celulară

Incapsularea celulelor de drojdie în gelan, ca și în alți polimeri, are ca efect printre altele

protejarea biocatalizatorului de mediile, uneori agresive, în care lucrează. Acest efect

permite reutilizarea imobilizatelor în cicluri fermentative succesive. Se impune însă ca

imobilizatele sa fie stabile în soluții alcoolice (formate în urma fermentării) cu concentrația

de minim 80 g/l, care să justifice separarea alcoolului prin distilare și să permită reutilizarea

lor. Pentru acest motiv, câteva tipuri de particule au fost analizate din punct de vedere al

stabilității într-o soluție alcoolică de 100g/l, această proprietate fiind evaluată, ca și în cazul

anterior, prin monitorizarea transmitanței mediului alcoolic în care au fost suspendate sferele

de gelan cu drojdie încapsulată, la diferite durate (între 12 si 84ore). Rezultatele obținute

sunt prezentate în Tabelul 21.

Tabel 21. Valorile transmitanței soluției alcoolice (100 g/l), în care au fost suspendate câteva

dintre particulele obținute, conținând drojdie încapsulată

Probe

Transmitanța în alcool

T%

Concentraţia celulelor

de drojdie/ml x 104 Viabilitatea celulara, %

12h 36h 60 h 84h 12h 36h 60h 84h 12h 36h 60 h 84h

P5+D 99,2 98,3 98 97,6 3 3,5 4,5 5,5 100 93,3 90 88

P9+D 99,4 99,1 98,3 97,8 2,75 3,5 4 5,25 100 93,3 94,11 91,3

P10+D 99,7 99,4 99 98,1 2 2,5 3,5 4 100 90,9 93,33 88,88

Se constată că matricea polimeră protejează celulele de drojdie imobilizate de metaboliții

toxici din etanol și le păstrează viabilitatea celulară mai mult timp, la valori ridicate.

6.2.4. Caracteristicile de umflare în apă

Sferele de gelan obținute prin gelifiere ionotropă prezintă un evident caracter de

hidrogel, astfel încât caracteristicile lor de umflare în apă sunt importante atât pentru

stabilitatea lor, cât și pentru utilizarea ulterioară în fermentare, unde se impune ca substratul

(glucoza) să poata difuza la celulele de drojdie prinse în rețeaua polimeră.

Page 145: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

144

Comportamentul în apă al particulelor cu și fără celule de drojdie, s-a evaluat prin gradul de

umflare (Q, %). S-au utilizat pentru această determinare doar o parte din probe (P4, P5, P9,

P10), respectiv cele mai stabile (care au valori mai mari ale transmitanţei) şi cu diferite

concentraţii fie in preextrudat, fie în baia de extrudere. Gradul de umflare a fost determinat

în două variante:

Variația in timp a gradului de umflare determinat prin uscarea treptată a particulelor

la temperatură constantă, este reprezentată în fig. 41.

a b

Figure.41. Variația în timp a gradului de umflare în condițiile uscării unor particule până la

greutate constantă. a – particule fără drojdie; b – particule cu drojdie.

Se constată că proba cea mai reticulată (P10) prezintă valorile cele mai coborâte

ale gradului de umflare, efectul fiind determinat de gradul lor mai ridicat de reticulare.

Evoluții apropiate ale acestei proprietăți prezinta celelalte trei tipuri de particule (Fig. 41, a).

La un grad de reticulare identic, particulele încărcate cu drojdie prezintă valori mai coborâte

ale gradului de umflare, efect care sprijină, indirect, ipoteza că între grupele funcționale ale

polimerului și cele ale proteinei din compoziția drojdiei se manifestă interacții puternice, la

care se adaugă cele dintre ionii de Mg2+

și celulă având drept consecință creșterea densității

rețelei polimere (Fig. 41 b). În cazul probei P10 acest efect este însă mai putin evident,

comportarea sa fiind foarte apropiată de cea a celorlalte trei tipuri de particule, probabil

datorită faptului ca densitatatea maximă a rețelei este asigurată de cantitatea mare de

reticulant ionic, iar interacțiunile dintre drojdie și gelan contribuie doar în măsură

neînsemnată la creșterea densității de reticulare.

Determinarea gradului de umflare prin suspendarea particulelor inițial uscate

perfect, în apă distilată și cântărirea lor după diferite perioade de timp, a condus la rezultate

diferite. Se constată că procesul de pierdere, respectiv reținere de apă nu sunt reversibile.

Uscarea probelor conduce la formarea de legături puternice de hidrogen între lanțurile de

Page 146: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

145

gelan, accentuând reticularea matricei; ca urmare, valoarea gradului de umflare obținută prin

imersarea în apă a particulelor este inferioară celei obtinută prin varianta anterioară, pe toată

durata de studiu a procesului (Figura 13). Evident însă, gradul de umflare scade cu creşterea

densităţii de reticulare (probele P1, P2, P10).

a b

Figura 42. Variația în timp a gradului de umflare în condițiile umflării unor particule ce nu

conţin drojdie (a) și la cele care conțin celule de drojdie (b) pînă la greutate constantă.

Gradul de umflare la particulele ce conţin celule de drojdie depinde, de asemenea, de

gradul de reticulare. La un grad de reticulare identic, particulele încărcate cu drojdie prezintă

valori mai coborâte ale gradului de umflare în comparaţie cu cele care nu conţin drojdie,

prin posibila participare a biocatalizatorului la reticularea polizharidului.

6.2.5. Stabilitatea mecanică a particulelor evaluată prin teste reologice

Utilizarea in cicluri repetate de fermentare a imobilizatelor presupune o stabilitate

structurală ridicată, informații preliminare fiind obținute prin evaluarea, după cum s-a

prezentat anterior, a stabilității în medii apoase. S-a considerat utilă însă și efectuarea unor

teste reologice care pot oferi informații asupra acestei proprietăți.

Testele oscilatorii sunt foarte utile în descrierea microstructurii materialelor

vâscoelastice, oferind informaţii despre structura şi elasticitatea unui material. Parametrii

reologici măsuraţi sunt modulul de acumulare G‘ (o măsură a energiei de deformare

acumulată de probă în timpul forfecării, reprezentând comportamentul elastic al

materialului), modulul de pierderi G‖ (o măsură a energiei de deformare utilizată de probă în

timpul forfecării, reprezentând comportamentul vâscos al materialului), unghiul de fază δ,

factorul de amortizare sau de pierderi tan δ = G‖/G‘ (care descrie raportul dintre componenta

vâscoasă şi cea elastică a unui comportament vâscoelastic) şi vâscozitatea complexă η*.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 10 20 30 40

P5 P9P10

Sw

ell

ing

de

gre

e, S

D %

T

Page 147: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

146

Pentru studiu au fost alese două probe, care diferă prin gradul de reticulare conferit

de cantitățile diferite de reticulant utilizat, considerând că ele pot oferi concluzii ce pot fi

generalizate apoi la celelalte probe, care din punct de vedere al gradului de reticulare

(evaluat indirect prin gradul de umflare în apă) se situiază între acestea două. Acestea sunt

P5 si P10, cu și fără drojdie (L).

Un prim set de teste l-a constituit baleiajul de amplitudine (AS – amplitude sweep),

cu ajutorul căruia s-au determinat limitele domeniului vâscoelastic liniar ca fiind 0,1%

pentru probele P5 şi P5+D şi 0,05% pentru probele P10 şi P10+D (figura 43).

Fig. 43 Rezultatele testului de baleiaj în amplitudine pentru probele P5 și (P5)+D respectiv

pentru probele P10 şi P10+D

Al doilea set de teste, realizat pentru aceleași probe, l-a constituit baleiajul de

frecvenţă (FS - frequency sweep), ale cărui rezultate sunt prezentate în Figura 44.

Fig.44.Rezultatele testului de baleiaj în frecvență pentru probele P5 şi P5+D,

respectiv P10 şi P10+D

În cazul diagramelor obtinuţe la testele de baleiaj de frecvenţă, modulul de

acumulare (G') descrie comportarea elastică a probei dând informaţii cu privire la stabilitatea

şi rezistenţa sa structurală (―rigiditate‖), în timp ce modulul de pierderi (G") oferă informaţii

100

101

102

103

104

Pa

G'

G''

0.01 0.1 1 10 100%

Strain

1

Storage Modulus

Loss Modulus

2

Storage Modulus

Loss Modulus

3

Storage Modulus

Loss Modulus

4

Storage Modulus

Loss Modulus

101

102

103

104

105

Pa·s

| *|

102

103

104

Pa

G'

G''

0.1 1 10 1001/s

Angular Frequency

1

Complex Viscosity

Storage Modulus

Loss Modulus

2

Complex Viscosity

Storage Modulus

Loss Modulus

3

Complex Viscosity

Storage Modulus

Loss Modulus

4

Complex Viscosity

Storage Modulus

Loss Modulus

Page 148: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

147

cu privire la comportarea vâscoasă (―flexibilitatea‖). Tangenta unghiului de pierderi, tan(δ),

se calculează ca raport al celor doi moduli: tan(δ) = G''/G'.

Testele de baleiaj de frecvenţă au permis observarea influenţei gradului de reticulare,

respectiv a adaosului de drojdie asupra stabilităţii particulelor. Astfel, valorile mai mari ale

modulului de acumulare G‘ şi creşterea diferenţei dintre cei doi moduli dinamici indică

prezenţa unei reţele interne mai stabile, o stabilitate mecanică şi structurală mai bună.

Se constată că valorile modulului G‘ pentru cele două probe sunt apropiate, semnificând

faptul că stabilitatea şi rezistenţa structurală ale probelor sunt apropiate, în concordanţă şi cu

valorile transmitanţei soluţiilor din supernatant. Proba cu un grad mai mare de reticulare

(concentraţia în baia de extrudere de 4 % faţa de 2% din cealaltă probă) prezintă o stabilitate

uşor superioară. Rezultatele sunt în concordanţă, de asemenea, cu caracteristicile de umflare

ale probelor: valoarea mai redusă a gradului maxim de umflare pentru proba mai reticulată

este determinată de densitatea sa superioară de reticulare, care conferă totodată rezistență

structurală (și deci rigiditate) mai ridicate.

Testele reologice au permis, totodată, evidenţierea faptului că stabilitatea

particulelor încărcate cu drojdie este mai ridicată decât a celor neîncărcate, păstrându-se

totodata mai ridicată la particulele mai reticulate. Și în acest caz, concordanța cu rezultatele

anterioare privind comportarea la umflare a particulelor este deplină, întărind concluzia că

insăși drojdia contribuie la ranforsarea structurii rețelei.

6.2.6. Testarea activităţii fermentative a imobilizatelor

Au fost realizate fermentări cu toate tipurile de imobilizate, constatându-se obținerea

de randamente ridicate, comparabile cu cele realizate cu drojdia liberă. Dintre acestea au fost

selectate trei tipuri de particule (P5, P9, P10), utilizate într-un număr mare de cicluri

repetate.

Figura 45 prezintă curbe de fermentare (variația în timp a randamentului de

fermentare a glucozei) realizate cu cele trei tipuri de particule comparativ cu drojdia liberă,

pentru câteva cicluri de fermentare (1 – 4). Trebuie menționat că ciclurile de fermentare s-au

succedat la intervale de timp de maxim 15 minute între ele, intervale necesare spălării

particulelor după ciclul anterior și termostatării soluției de substrat la temperatura de 300C.

In fig. 45 au fost reprezentate curbele primelor 4 cicluri de fermentare. Pentru comparație,

pe fiecare figură este prezentată și curba de fermentare în prezența drojdiei libere (aceeași

cantitate cu cea încapsulată în particulele de gelan) - P0.

Page 149: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

148

Se constată că cele mai ridicate randamente în fermentare se ating cu particulele P5,

caracterizate de un grad mai redus de reticulare (cu excepția ciclului 2, mai eficace pentru

proba 9). Explicația constă în densitatea de reticulare mai mică a rețelei de hidrogel, care

facilitează difuzia moleculelor voluminoase de substrat (glucoza) la celule de drojdie. In

sprijinul acestei explicații vin si rezultatele fermentării în prezența probei P10, randamentele

fiind în acest caz cele mai coborâte, evident datorită gradului de reticulare cel mai ridicat al

acesteia, în corelare si cu curbele de umflare (fig. 41, 42). Pentru toate probele au fost

realizate 20 de cicluri fermentative, constatându-se că se obțin randamente ridicate, chiar

superioare primului ciclu de fermentare.

Pentru studii mai aprofundate, a fost reținută proba P5, figura 46 prezentând curbe

de fermentare pentru primele 5 cicluri, comparativ cu o cantitate de drojdie liberă

echivalentă celei imobilizată în matricile sferice de gelan. Proba P5Y are o concentrație de

2% acetat de magneziu în baia de reticulare.

a

b

c

d

Fig. 45. Curbe de fermentare realizate de particulele de tip P5, P9 si P10 în cicluri de

fermentare diferite: a - ciclul 1; b – ciclul 2; c – ciclul 3; d – ciclul 4.

Page 150: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

149

Figura. 46. Variația în timp a randamentului de fermentare a glucozei în prezența

imobilizatului P5, în 5 cicluri de fermentare succesive, comparativ cu drojdia liberă.

Valorile ridicate ale randamentului atinse chiar dupa 5 cicluri, au determinat utilizarea în

continuare a imobilizatului până la 20 de cicluri, intervalul de timp între cicluri fiind de 15

min. In figura 47 este ilustrat randamentul maxim de fermentare a glucozei, selectiv, pentru

câteva dintre cele 20 de cicluri. Trebuie precizat că randamentul de fermentare, indiferent de

ciclul la care se face referire, este superior celui atins în prezența drojdiei libere, fapt

confirmat și de alte rezultate raportate în literatură [332].

Surprinzator este faptul că cel mai mic randament se obține la primul ciclu de

fermentare, chiar dacă este superior celui obținut în prezenta drojdiei libere. O creștere

însemnată a acestuia se înregistrează între ciclurile 2-4. Microbioreactoare de alginat de

sodiu cu celule de drojdie imobilizate obținute de Irfana Mariam și colab. în 2009 au fost

testate în mai multe cicluri fermentative, iar o creștere maximă a randamentului de

fermentare s-a observat după al 4-lea ciclu de fermentare după care randamentul scade

brusc. Datorită faptului că reactoarele devin instabile și își schimbă forma numărul maxim

de cicluri de fermentare efectuate a fost de 6 [440]. O explicație posibilă ar fi faptul că dupa

primul ciclu se produce o umflare mai accentuată a particulelor, care facilitează difuzia

substratului la celulele imobilizate. După ciclul 6 de fermentare, valoarea randamentului

maxim scade ușor, păstrându-se la valori relativ constante până la ciclul 20. Scăderea

treptată a randamentului în următoarele cicluri poate fi datorată, în principiu, reducerii

numărului de celule de drojdie din matricea sferică de gelan.

Page 151: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

150

Figura 47. Randamentul maxim de fermentare a glucozei în prezența drojdiei libere (0),

respectiv a drojdiei imobilizate în particulele de tip P5+D, pentru cîteva dintre cele 20 de

cicluri de fermentare (interval de 15 min între cicluri)

Pentru a determina dacă particulele sunt stabile în mediul de fermentare după

fiecare ciclu de fermentare a fost determinat numărul de celule de drojdie care difuzează în

mediul de fermentare și pe baza curbei de etalonare a fost determinată cantitatea lor. Am

dorit să arătăm prin această determinare faptul că celulele sunt bine prinse în rețeaua

polimeră și nu difuzează în număr mare în mediul de fermentare chiar și după multe cicluri

de fermentare. Cantitatea inițială de celule a fost de 0.375 g și din această cantitate s-a

scăzut cantitatea de celule determinată după fiecare ciclu de fermentare și s-a determinat

cantitatea teoretică de celule care a rămas imobilizată în particule. În această determinare nu

s-a luat în considerare posibilitatea particulelor de a prolifera. Rezultatele obținute sunt

prezentate în tabelul 22 (pentru proba P5+D).

Page 152: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

151

Tabelul 22. Cantitatea de celule de drojdie rămasă în particulele de gelan (g) după fiecare

ciclu de fermentare

Numărul

ciclului de

fermentare

Numărul de

celule /ml

după fiecare

fermentare

Cantitatea de

celule de

drojdie /ml

după fiecare

fermentare

(g/ml)

Cantitatea de

celule de

drojdie/ 50 ml

după fiecare

fermentare

(g/50 ml)

Cantitatea

teoretică de

celule de

drojdie

rămasă în

particulele de

gelan (g) după

fiecare

fermentare

I 54,25 x 10 4

2,01 x 10-5

1,005 x 10 -3

0,373416

II 26,5 x10 4

9,8 x 10-6

4,9 x 10-4

0,372926

III 13,5 x10 4

5 x 10 -6

2,5 x 10-4

0,372676

IV 12,5 x 10 4

4,63 x 10-6

2,315 x 10-4

0,3724445

V 13,5 x 104 5 x 10

-6 2,5 x 10

-4 0,3721945

VI 10.5 x 104 3,89 x 10

-6 1,94 x 10

-4 0,3720005

VII 11,5 x 104 4,2 x 10

-6 2,1 x 10

-4 0,371795

VIII 6.5 x 104 2.4 x 10

-6 1,2 x 10

-4 0.371675

IX 4,75 x 104 1,76 x 10

-6 0.88 x 10

-4 0,371587

X 4.5 x 104 1,67 x 10

-6 0.835 x 10

-4 0,3715035

XI 4.5 x 104 1,67 x 10

-6 0.835 x 10

-4 0.37142

XII 11,25 x 104 4,17 x 10

-6 2,085 x 10

-4 0.3712115

XIII 94,25 x 104 34,9 x 10

-6 17.45 x 10

-4 0.3694665

XIV 4.5 x 104 1,67 x 10

-6 0.835 x 10

-4 0,369383

XV 6,25 x 104 2,3 x 10

-6 1.15 x 10

-4 0,369268

XVI 6,25 x 104 2,3 x 10

-6 1.15 x 10

-4 0.369153

XVII 9.25 x 104 3,43 x 10

-6 1.715 x 10

-4 0.3689815

XVIII 6,25 x 104 2,3 x 10

-6 1.15 x 10

-4 0.3688665

XIX 4.5 x 104 1,67 x 10

-6 0.835 x 10

-4 0.368783

XX 5,75 x 104 2,13 x 10

-6 1,065 x 10

-4 0,3686765

Page 153: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

152

Se constată că după fiecare ciclu de fermentare, din matricea de gelan iese o

cantitate de celule foarte redusă însă comparativ cu cea imobilizată (6,323 x 10-3

g).

Rezultatele obținute demonstrează că particulele testate în procese fermentative

repetate sunt stabile. Este evident că fermentarea se produce practic în matricea sferică de

gelan, în care difuzează glucoza. Singura explicație pentru obținerea de randamente ridicate

chiar dupa 20 de cicluri, o constituie faptul că, pe de o parte matricea de gelan protejează

celulele de drojdie de inactivare şi păstrează viabilitatea acestora, iar pe de altă parte că ionul

magneziu din acetatul de magneziu, la concentrația de 0.5% din fermentator, nu numai că

păstreaza viabilitatea celulară ci, este posibil ca prin difuzia sa în matricea polimeră să

contribuie la proliferarea celulelor imobilizate în aceasta. Randamentul de fermentare, chiar

dacă nu variază după o lege evidentă, se păstrează la valori ridicate cel puţin până la cel de

al 20-lea ciclu.

După cum s-a menționat anterior, randamentele de fermentare depind și de tipul de

particule în care s-a imobilizat drojdia, respectiv de condițiile în care acestea au fost

obţinute. Astfel, eficacitatea fermentării depinde de concentrația soluției de acetat de

magneziu din baia de coagulare, respectiv de gradul de reticulare a particulelor. Cu creșterea

densității de reticulare scade randamentul de fermentare, efect constatat nu doar după primul

ciclu. Explicația poate fi următoarea: pe de o parte, cu creșterea gradului de reticulare

responsabil de scăderea gradului de umflare a particulelor în mediul apos, se realizează o

difuzie mai lentă a substratului (glucoza în soluție) în interiorul matricii polimere, respectiv

spre celulele de drojdie. Pe de altă parte, rețeaua densă, ale cărei ochiuri devin comparabile

probabil cu dimensiunea celulelor de drojdie, împiedică eventuala proliferare a acestora,

datorita difuziei mai lente a acetatului de magneziu (ionul magneziu care stimuleaza

proliferarea celulară). Se constată, totodată, că numarul de celule prezente în supernatant

după fiecare ciclu de fermentare este tot mai redus, ceea ce semnifică faptul că ele sunt

imobilizate puternic în matricea polimeră prin care nu mai pot difuza.Trebuie remarcat și

faptul că numărul de cicluri de fermentare ce poate fi realizat cu particulele de imobilizat

scade pentru cele trei tipuri de particule, de la 20 (proba P5) la 9 (proba P9), respectiv 6

(proba P10).

Lipsa de hrană (glucoza) ăn celulele de drojdie poate duce la liza acestora (moartea)

de aceea schimbul de nutrienţi între mediul de fermentare și particulele ce conţin drojdie

trebuie să fie optim. Particulele de gelan ce conţin celule de drojdie nu trebuie sa fie, deci,

prea reticulate şi trebuie sa aibă o porozitate bună care sa permită acest schimb.

Page 154: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

153

Rezultatele foarte bune obtinute cu particulele de tip P5, au incurajat încercarea de a realiza

un numar cât mai mare de cicluri de fermentare. In acest caz, între ciclurile de fermentare s-a

mărit intervalul de timp la 4 ore, pentru a obține informații indirecte și asupra acestui

parametru, asupra performanțelor imobilizatului. S-au realizat astfel un numar de 40 de

cicluri, și este foarte probabil ca particulele să mai poată fi utilizate încă un numar de cicluri

până la pierderea totală a activității biocatalitice. In fig. 48 este prezentată doar valoarea

randamentului de fermentare atins după 255 minute, pentru câteva cicluri considerate

aleator. Se constată că în toate cazurile se obțin randamente superioare celui realizat în

prezența unei cantități de drojdie liberă, echivalentă cu cea din imobilizat.

Figura 48. Valoarea randamentului de fermentare a glucozei atins dupa 255 minute, în cazul

utilizării succesive a imobilizatului P5, comparativ cu drojdia liberă

(Prezentare aleatorie a unor cicluri din totalul de 40 realizate).

Pe de altă parte, valoarea randamentelor atinse la diferite cicluri de fermentare este

practic constantă (cel puțin până la cel de al 20-lea ciclu), cu puțin inferioară celei

corespunzătoare primului ciclu. O creștere neașteptată a randamentului se produce la

ultimele 15 cicluri de fermentare, o explicație putând fi faptul că celulele de drojdie au

proliferat în matricea polimeră, mărind astfel activitatea biocatalitică a acestora. Se mai

constată și faptul că mărirea intervalului de timp dintre cicluri are ca efect ușoara scădere a

randamentului de fermentare, comparativ cu cazul anterior, cand ciclurile s-au succedat cu

un interval de doar 15 minute între ele.

Comparativ cu randamentele în fermentare obținute utillizând particule cu drojdie

reticulate cu ioni de Ca2+

, cele obținute utilizând particule reticulate cu ioni de Mg2+

sunt

constant mai ridicate. Rezultatul nu este surprinzător, fiind cunoscut fapul că magneziul este

benefic pentru celulele de drojdie de bere amplificând proliferarea lor. Determinarea

numărului/cantității de celule din particule după dezagregarea lor mecanică au evidențiat

0

10

20

30

40

50

60

1 3 8 10 13 16 18 20 24 31 35 40

Number of fermentation cycles

Page 155: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

154

valori superioare față de cele raportate în subcapitolul 5.2., referitor la particulele reticulate

cu Ca2+. Tabelul 23, prezintă numărul, cantitatea și viabilitatea celulelor de drojdie din

imobilizatele realizate în prezența magneziului, după fiecare ciclu de fermentare, pe durata a

10 cicluri.

Tabel 23. Numărul, cantitatea și viabilitatea celulară a drojdiei de bere

din imobilizate de gelan reticulat cu ioni de Mg2+

determinate

după fiecare din cele 10 cicluri de fermentare

Număru

ciclului de

fermentare

Numărul

de

celule/g

particule

x 10 8

Cantitatea

de

celule/g

particule,

mg

Viabilitatea

celulară, %

0 6,36 23,56 94,98

1 7,04 26,08 93,72

2 6,09 22,56 93,91

3 6,45 23,9

4 7,22 26,75 94,23

5 6,65 24,64

6 6,14 22,75

7 7,35 27,23

8 7,06 26,89 88,94

9 6,29 23,3 91,66

10 7,08 26,23

Este evident din rezultatele prezentate rolul protector al matricii față de celulele de

drojdie imobilizate, ceea ce permite proliferarea lor în rețeaua polimeră, menținându-le într-

un număr ridicat ce favorizează obținerea de randamente mari, permanent superioare celui

obținut cu drojdia liberă.

Concluzii.

Acetatul de magneziu constituie un agent de reticulare adecvat pentru obținerea de

particule de gelan destinate imobilizării celulelor de drojdie, conducând la structuri stabile

din punct de vedere mecanic, fără a afecta viabilitatea celulară.

Creșterea cantității de reticulant determină obținerea unor structuri mai compacte a

matricii sferice de gelan prin creșterea gradului de reticulare, mărind stabilitatea structurală a

imobilizatelor și reducând gradul maxim de umflare în medii apoase.

Capacitatea de fermentare a glucozei prin utilizarea acestor imobilizate crește cu

reducerea cantității de reticulant utilizat, deoarece este facilitată astfel difuzia substratului la

celulele de drojdie din particula polimeră.

Page 156: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

155

Particulele de gelan continînd celule de drojdie imobilizată pot fi reutilizate un

număr mare de cicluri fermentative (cel puțin 40 cicluri) fără pierderea semnificativă a

activității biocatalitice, și asigurând valori ale randamentului de fermentare a glucozei

superioare celui atins prin utilizarea celulelor libere.

Bioreactoarele obținute prezintă potential aplicativ în procese fermentative din

industria alimentară, dat fiind și caracterul netoxic al reticulantului utilizat.

6.3. Particule pe bază de gelan reticulat cu acetat de zinc conținând celule de

drojdie imobilizate

Este cunoscut faptul că celulele de drojdie necesită o gamă largă de metale pentru

proliferarea lor și pentru metabolism [28]. În procesele fermentative, în special cele din

industria berii, ionii metalici cheie sunt cei de magneziu și zinc care acționeaza ca și

cofactori pentru multe enzime biosintetice și metabolice incluzând aici și diverse enzime

glicolitice și alcool dehidrogenaza. Celulele de drojdie necesită pentru o creștere optimă o

cantitate mai mare de magneziu și potasiu, în timp ce ionii de zinc, mangan, fier și cupru

sunt necesari în cantități foarte mici, ca urme, concentrațiile necesare fiind micromolare [32,

53]. Metalele grele, chiar în concentrații micromolare, pot fi toxice pentru celulele de

drojdie[13].

Zincul este un element foarte important în procesele fermentative deoarece are rol

de activator enzimatic al alcoologenazei și al dehidrogenazei. Un mediu deficient în zinc

poate duce la încetinirea sau la o fermentare incompletă iar această problemă a fost

semnalată în industria berii [51].

Ocazional, biodisponibilitatea unor minerale esențiale poate fi limitativă iar acest

lucru poate afecta negativ procesul de fermentație. De exemplu, concentrațiile de zinc pot

descrește în timpul zdrobirii strugurilor, în timpul fermentării și limpezirii mustului deoarece

ionul metalic, fiind un metal tranzițional, creează complecși în precipitatul din vin (borhot).

În consecință, concentrațiile de zinc din must pot deveni compromise ceea ce duce

la o performantă scăzută în fermentare. Ionul de zinc are un rol semnificativ în metabolismul

celulei de drojdie și nu doar pentru că este un activator enzimatic dar și pentru că poate

stimula absorbția de maltoză și maltotrioză în procesele de obținere a drojdiei, realizându-se

astfel randamente mari în fermentare [20,22,23].

Ionul de zinc poate avea un rol benefic asupra stabilității și dinamicii membranei

celulare [52].

Page 157: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

156

Celulele de drojdie au capacitatea de a absorbi foarte eficient mineralele esențiale și

a le exclude pe cele neesențiale. Zincul poate fi absorbit de către celule din mediul de

fermentare pentru a îndeplini roluri fiziologice esențiale [28].

Nutriția minerală a drojdiilor este importantă pentru producătorii de bere, vinuri,

pentru cei ce produc bioetanol sau băuturi obținute prin distilare, deoarece se dorește

creșterea capacitații fermentative a celulelor de drojdie, obținerea de randamente optime în

fermentare și produse de calitate.

Prezentul subcapitol raportează rezultatele obținute în realizarea particulelor de

gelan cu celule de drojdie imobilizate reticulate ionic, prin metoda extruderii, în prezența

ionilor de Zn2+, cu reale perspective de a fi utilizate în industria băuturilor alcoolice.

Selectarea acetatului de zinc drept agent de reticulare este argumentată de considerentele

expuse anterior: lipsa de toxicitate și rolul important pe care îl joacă zincul în procesele de

fermentare.

Particulele obținute au fost caracterizate din punct de vedere morfologic, fizico-

chimic iar activitatea lor fermentativă a fost testată și comparată cu activitatea fermentativă a

drojdiei libere. Particulele pot fi ușor recuperate din fermentator prin filtrare, sunt stabile și

pot fi utilizate în mai multe cicluri de fermentare repetate.

Ca și în cazurile anterior discutate, reticularea gelanului cu ionii de Zn2+

(provenit

din acetat de zinc) are la bază reacția de mai jos:

2 Gelan-COO-Na

+ + (CH3COO

-)2Zn

2+ (Gelan-COO

-)2Zn

2+ + 2 CH3COO

- Na

+

Celulele de drojdie sunt prinse în ochiurile rețelei formată prin reticulare ionică.

Caracterul de metal tranzițional al zincului metal determină și reacţii de complexare, ceea ce

conduce la formarea unei reţele de gel mai puternice (mai reticulate) comparativ cu

utilizarea altor metale divalente din grupa a IIA principală (Ca, Mg).

Structura rețelei formate este prezentată în figura 49.

Page 158: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

157

Figura 49. Prezentare schematică a structurii particulelor sferice de gelan cu celule de

drojdie imobilizate, reticulate ionic cu Zn2+

.

După cum s-a discutat anterior, celula de drojdie este un coloid încărcat electric,

putând pierde sarcina electrică sau să-și schimbe semnul. În suprafață este încărcată pozitiv

dar după introducerea în mediul de fermentare, după o perioadă de timp are loc înmugurirea

iar celula iși schimbă sarcina electrică care devine negativă, putând stabili interacții cu ionul

reticulant. La finele fermentării sarcina electrică a celulei de drojdie redevine pozitivă. Ionii

de zinc, pe lângă rolurile fiziologice pe care le au în metabolismul celulei de drojdie, pot

adera la membrana plasmatică celulară, încarcată negativ, conferindu-i acesteia mai multă

stabilitate la factorii de stres care pot interveni în procesele fermentative [561,562].

Posibilitatea formării de legături coordinative între ionii de zinc și matrice, permite

a priori realizarea unor rețele mai ferme de gelan, ceea ce necesită reevaluarea concentrației

acestora atât în pre-extrudat cât și în baia de reticulare. S-a impus astfel determinarea

concentrației optime de agent de reticulare necesară, atât în baia de extrudere cât și în pre-

extrudat, care să permită obținerea unor particule cu și fără celule de drojdie stabile în

mediile apoase în care lucrează.

Comparativ cu reticularea cu ioni de Ca2+

, respectiv de Mg2+

, pentru ionii de Zn2+

s-a lucrat cu concentrații de acetat cu un ordin de mărime mai mic. Între particulele cu celule

de drojdie imobilizată și mediul de fermentare (în care se găsește soluția de glucoză) trebuie

să existe un schimb eficient de nutrienți pentru ca celulele să poată prolifera, pentru a obține

mai multe cicluri de fermentare repetate și o eficiență optimă a procesului.

S-au realizat în consecință mai multe particule urmărindu-se influența concentrației

de acetat de zinc în cele două medii. De asemenea, comportarea în procese fermentative a

Page 159: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

158

particulelor cu celule de drojdie imobilizata a fost verificată pentru fiecare probă în parte.

Programul experimental realizat este redat in tabelul 24.

Tabel 24. Programul experimental pentru obținerea particulelor de

gelan reticulat cu Zn2+

fără și cu celule de drojdie

*volumul soluției:1.25 ml ; **volumul soluției: 125 ml

Același program experimental s-a utilizat pentru obținerea particulelor cu celule de

drojdie imobilizate, codul probelor conținând în plus litera D.

Proba Concentrația

de gelan (%)

Concentrația

de acetat de

zinc în

preextrudat*

(%)

Concentrația

de acetat de

zinc în baia

de

reticulare**

(%)

A2

0.1

0.02

0.1 A3 0.04

A4 0.06

A5 0.08

L2

0.1

0.02

0.08 L3 0.04

L4 0.06

L5 0.08

N2

0.1

0.02

0.05 N3 0.04

N4 0.06

N5 0.08

Page 160: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

159

6.3.1. Stabilitatea particulelor și viabilitatea celulară

Stabilitatea în apă a particulelor cu și fără celule de drojdie imobilizată s-a evaluat ca și în

cazurile anterioare, prin determinarea turbidității (transmitanței) soluției în care particulele

sunt suspendate diferite perioade de timp; rezultatele pentru o parte din probe fără celule de

drojdie sunt redate în tabelul 25.

Tabel 25. Valorile transmitanței pentru particule fără celule de drojdie imobilizate,

determinate după diferite perioade de păstrare în medii apoase.

Proba

Transmitanța, T %

În soluția

din baia de

extrudere

În apă bidistilată

12 h 24 h 12 h 24 h 48 h

A2 99 98,8 99,4 99,2 99

A3 99.6 99,3 99,6 99,3 99,1

A4 99.4 99,2 99,7 99,4 99,1

A5 99,6 99,4 99,7 99,6 98,7

L2 99,2 98,6 99,4 99,1 98,5

L3 99,3 98,8 99,4 99,2 98,9

L4 99,4 99,1 99,6 99,3 99

L5 99,5 99,2 99,7 99,4 99,2

N2 99,1 98,2 99,2 98,9 97,1

N3 99,4 98,3 99,3 98,9 97,4

N4 99,5 98,4 99,9 99 97,7

N5 99,2 98,8 99,2 98,8 97,9

Page 161: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

160

Datele prezentate atestă că stabilitatea particulelor este foarte ridicată în ambele

medii de păstrare, chiar dacă în pre-extrudat și în baia de reticulare s-au utilizat soluții de

concentrații net inferioare celor folosite la reticularea cu clorură de calciu sau acetat de

magneziu.

Cu cât crește concentrația de reticulant din preextrudat cresc ușor și valorile

transmitanței, indiferent de tipul de probă analizat. De asemenea, cu creșterea concentrației

de reticulant din baia de extrudere se observă că turbiditatea soluției în care sunt păstrate

probele scade ușor (valorile transmitanței cresc). Evident, se poate erafirma că valorile

transmitanței cresc cu creșterea gradului de reticulare.

Valorile transmitanței nu au variat foarte mult după 24 de ore de păstrare a

particulelor în soluția de reticulare. Se observă că ele scad foarte puțin chiar și după 48 de

ore de păstrare în apă bidistilată. Evident rezultatele obținute sunt consecința structurilor

puternic reticulate la care zincul participă nu doar prin legăturile ionice formate cu gelanul ci

și prin cele coordinative.

Turbiditatea soluției apoase în care particulele cu celule de drojdie imobilizate sunt

păstrate a fost determinată prin măsurarea transmitanței după anumite intervale de timp. În

acest caz turbiditatea mediului poate fi determinată nu doar de fragmentele de polimer care

nu sunt bine prinse în rețeaua polimerică ci și de celulele de drojdie care ipotetic difuzează

în timp din particule. S-a impus pentru probele ce conțin celule de drojdie determinarea la

diferite intervale de timp (la fiecare 12 ore) a transmitanței, a concentrației de celule/ml și a

viabilității celulare.

Concentrația de celule și viabilitatea celulară au fost stabilite după 12 ore, respectiv

24 de ore de păstrare a particulelor în soluția în care s-a efectuat extruderea și după 12 ore,

respectiv 24 ore de păstrare a particulelor în apă bidistilată. Rezultatele obținute sunt

prezentate în tabelul 26.

Tabel 26. Valorile transmitanței și viabilității celulare la câteva probe

păstrate în diferite medii

Proba

Transmitanța, T% Concentrația celulelor x

104

in supernatant Viabilitatea celulară, %

în soluția de

acetat de

zinc

în apă

distilată

în soluția de

acetat de

zinc

în apă

distilată

în soluția de

acetat de zinc în apă distilată

Page 162: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

161

12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h

A2D 98,9 98,1 98,9 97,9 7 10 2,75 5,5 100 95,24 84,62 88

A4D 98,1 97,7 97,5 97,2 16 10,25 9,25 18 96.96 95.34 92.5 92.3

A5D 98,8 97,9 98,9 97,5 2 10 2,75 5 98.88 97.56 91.66 86.95

L2D 98,5 97,9 98,7 97,4 7,25 11,25 3,5 6,25 100 95,74 87,5 89,2

L4D 98,6 96,9 97,6 97,4 7,25 9,25 3 4,5 93,54 92.5 92.3 85.71

L5D 97,6 97,5 98,4 97,8 5,25 6,25 2,5 5 91.3 89,28 83.33 83.3

N2D 98,4 97 98,6 96,5 8,5 12,5 4,75 8 100 92,59 95 91,43

N4D 97,4 97,1 98,2 96.8 7,5 9,25 3 5.25 90.9 90.2 92.3 91.3

N5D 98,2 97,9 99 97.5 5 6,25 2,5 4.75 90.9 89.2 83.33 82.6

Pentru toate particulele cu celule de drojdie analizate se observă că valorile

transmitanței cresc atunci cînd crește concentrația soluției de acetat de zinc în baia de

extrudere sau în preextrudat. Toate probele au valori ale transmitanței apropiate.

La probele A4D, A5D după 24 de ore de păstrare în apă bidistilată se observă că

valoarea transmitanței scade puțin cu creșterea gradului de reticulare. Aceste rezultate pot fi

o consecință a gradului mare de reticulare, ceea ce determină ca în ochiurile rețelei polimere

să nu poată fi imobilizate numeroase celule, deoarece se formează o rețea mai densă și

compactă.

Datorită legăturilor coordinative foarte stabile create de ionul de zinc, particulele de

gelan cu și fără celule de drojdie imobilizate sunt prezintă o stabilitate structurală ridicată,

care crește, în general, cu creșterea gradului de reticulare.

Concentrația de celule/ml care se regăsesc în baia de reticulare sau apă bidistilată

scade atunci când gradul de reticulare crește, dar numărul de celule ce difuzează din

matricea polimerică este redus.

Concentrația de celule din baia de reticulare măsurată la diferite intervale de timp

este mai mare decât concentrația de celule de drojdie ce se găsește la păstrarea particulelor

în apă bidistilată. O ipoteză ar fi aceea că o parte din celulele de drojdie care nu au fost

prinse în rețea (datorită densității mari a acestei) se regăsesc în soluția de extrudere. Această

ipoteză ar putea fi susținută și de faptul că după 24 de ore de păstrare în soluția de extrudere

concentrația de celule existente în supernatant nu a crescut foarte mult.

După 24 de ore de păstrare în baia de reticulare particulele sunt spălate cu apă

bidistilată și păstrate în acest mediu pentru încă 24 de ore (măsurătorile se efectuează la

fiecare 12 h). Concentrația de celule/ml care difuzează din particule este mult mai mică după

Page 163: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

162

păstrarea particulelor în apă bidistilată, ceea ce ar putea confirma ipoteza mai sus

menționată.

Viabilitatea celulară are valoarea de 82,6% pentru o singură probă analizată,

celelate probe prezentând valori ale acestei proprietăți de peste 88 % după 48 de ore de

păstrare în apă bidistilată. Aceasta sugerează că particulele de gelan ajută la păstrarea

viabilității celulare în timp iar particulele cu celule de drojdie imobilizate ar putea fi utilizate

în procese fermentative în cicluri repetate de fermentare.

6.3.2. Stabilitatea mecanică a particulelor

Pentru utilizarea particulelor în cicluri repetate de fermentare stabilitatea lor

structurală este foarte importantă, așa încâ evauarea sa prin teste reologice devine necesară,

chiar dacă este o metodă indirectă.

Au fost alese pentru analiză 6 probe obținute la aceeași concentrație de acetat de

zinc în preextrudat (0,06%), aceeași concentrație în polimer (1 %) dar cu concentrații

diferite în baia de reticulare. Probele alese pentru testare au fost particule cu și fără celule de

drojdie imobilizate.

Un prim set de teste l-a constituit baleiajul de amplitudine (cu ajutorul căruia s-au

determinat limitele domeniului vâscoelastic liniar (figura 50).

Se constată că valorile modulului G‘ pentru cele trei probe sunt apropiate,

semnificând faptul că stabilitatea și rezistența structurală ale probelor (―rigiditatea‖) sunt

apropiate, în concordanța și cu valorile transmitanței soluțiilor de supernatant. Proba L4

manifestă stabilitate uşor superioară în comparaţie cu proba N4, explicabilă prin gradul de

reticulare mai ridicat. Testele reologice au pus în evidenţă faptul că particulele ce conţin

celule de drojdie (A4D, L4D și N4D) au o stabilitate puţin mai redusă în comparaţie cu

particulele fără drojdie (A4, L4, N4) iar stabilitatea lor creşte cu creşterea gradului de

reticulare.

Page 164: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

163

Figura 50: Baleiaj de amplitudine (AS – amplitude sweep) pentru probele A4 şi A4D, L4 și

L4D respectiv N4 şi N4D

T = 30 OC, deformaţia γ = 0,01’100%, frecvenţa unghiulară constantă, ω=10 rad/s

Al doilea set de teste, realizat pentru aceleasi probe, l-a constituit baleiajul de frecvenţă (FS -

frequency sweep), ale cărui rezultate sunt prezentate in Figura 51.

Figura 51. Baleiaj de frecvenţă (FS – frequency sweep) pentru probele A4şi A4D, L4 și L4D

respectiv N4 şi N4D (T=30 OC, deformaţia constantă în domeniul liniar vâscoelastic,

frecvenţa unghiulară ω=0,1’100 rad/s)

Se constată în acest caz valoarea ușor superioară a modulului G‘, pentru probele A4

și A4D față de valoarea corespunzătoare probei L4 și L4D, argumentând o stabilitate

ridicată a probei cu grad mai înalt de reticulare.

6.3.3. Gradul de umflare

Comportamentul în apă al particulelor sferice de gelan, cu și fără celule de drojdie,

s-a evaluat prin gradul de umflare (Q %).

S-au utilizat pentru această determinare doar o parte din probe (A2, L2 și N2),

respectiv cele mai stabile obținute la diferite concentraţii de acetat de zinc în baia de

extrudere, cea din preextrudat fiind aceeași pentru toate probele analizate.

În figura 52 este prezentată variația în timp a gradului de umflare.

101

102

103

104

Pa

G'

G''

0.01 0.1 1 10 100%

Strain

A4

Storage Modulus

Loss Modulus

A4+D

Storage Modulus

Loss Modulus

N4

Storage Modulus

Loss Modulus

N4+D

Storage Modulus

Loss Modulus

L4

Storage Modulus

Loss Modulus

L4+D

Storage Modulus

Loss Modulus

101

102

103

104

105

Pa·s

| *|

102

103

104

Pa

G'

G''

0.1 1 10 1001/s

Angular Frequency

A4

Complex Viscosity

Storage Modulus

Loss Modulus

A4+D

Complex Viscosity

Storage Modulus

Loss Modulus

N4

Complex Viscosity

Storage Modulus

Loss Modulus

N4+D

Complex Viscosity

Storage Modulus

Loss Modulus

L4

Complex Viscosity

Storage Modulus

Loss Modulus

L4+D

Complex Viscosity

Storage Modulus

Loss Modulus

Page 165: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

164

Figura 52. Variația în timp a gradului de umflare pentru probele A2, L2 și N2.

Rezultatele obținute demonstrează că particulele au un puternic caracter de

hidrogel, ele putând absorbi cantități mari de apă. Gradul de umflare depinde de gradul de

reticulare al particulelor. Cu cât densitatea de reticulare este mai mare cu atât valoarea

gradului de umflare scade. Rezultatele obținute sunt în concordanță cu rezultatele obținute la

testele reologice și la testarea stabilității particulelor în medii apoase prin măsurarea

transmitanței.

6.3.4. Morfologia particulelor

Fotografiile realizate prin microscopie electronică de baleiaj pun în evidență

morfologia particulelor cu celule de drojdie. Probele alese pentru analiză, A2D și L2D au

aceeași concentrație de acetat de zinc în preextrudat și diferă prin concentrația de reticulant

din baia de extrudere. Analiza a fost efectuată pe secțiunea transversală a particulelor de

gelan uscate conținând celule de drojdie imobilizate.

În fig. 53 sunt prezentate fotografiile realizate prin microscopie electronică de baleiaj pentru

cele două probe analizate. Ele pun în evidență faptul că celulele de drojdie se găsesc în

număr mare în interiorul particulelor, fiind bine prinse în matricea polimeră în ambele tipuri

de particule.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 2 4 6 8 10

Q % A2

Q% L2

Q% N2

Time(h)

Sw

elli

ng

deg

ree,

Q %

A2D L2D

Page 166: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

165

Figura 53. Fotografii de microscopie electronică de baleiaj pentru perticulele A2D și L2D.

(3 grade de mărire)

Probele analizate au grade diferite de reticulare. Fotografiile evidențiază faptul că în

cazul probei A2 se formează o rețea polimerică mai densă (compactă), celulele de drojdie

fiind mai bine prinse în ochiurile sale comparativ cu proba L2. Dimensiunea celulelor de

drojdie este de 3-4 μm. În cazul probei L2 se observă o structură mai poroasă comparativ cu

proba A2, tot datoriaă gradului mai redus de reticulare.

(a) (b)

(d) (e)

(f) (g)

Page 167: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

166

6.3.5. Activitatea fermentativă a particulelor ce conțin celule de drojdie

S-a analizat cinetica procesului de fermentare în prezența mai multor tipuri de

particule, monitorizând variația în timp a eficienței de transformare a glucozei. Au fost

efectuate mai multe cicluri de fermentare pentru fiecare probă în parte, intervalul de timp

dintre cicluri fiind de 24 de ore. Pentru a optimiza procesul de fermentare din punct de

vedere al eficienței procesului, s-a studiat influența mai multor factori:

a) concentrația de acetat de zinc adăugată înainte de extrudere (din preextrudat);

b) concentrația de acetat de zinc din baia de extrudere;

c) timpul de păstrare al particulelor în baia de reticulare după extrudere

d) pH-ul din baia de fermentare;

e) concentrația de acetat de zinc din baia de fermentare.

6.3.5.1. Influența concentrației de agent de reticulare din preextrudat.

Au fost selectate probe care diferă prin concentrația de acetat de zinc adăugată

înainte de extrudere, restul parametrilor care pot influența procesul de fermentare fiind

mentinuți constanți. Probele analizate au fost L2D, L4D și L5D. Concentrația de acetat de

zinc din soluția de fermentare a fost de 0,01%, pH-ul fiind ajustat la valoarea 6. În figura 54

sunt prezentate curbele de fermentare la probele menționate anterior.

Se poate observa după primul ciclu de fermentare că valorile randamentelor

obținute sunt aproximativ egale, superioare celui obținut la fermentarea cu drojdie. Începând

cu al doilea ciclu de fermentare eficiența fermentării scade mult la probele obținute cu o

concentrație de acetat de zinc de 0,06% (L4D) și 0,08% (L5D) în preextrudat. Același

comportament îl putem observa și după al treilea ciclu de fermentare. Pentru particulele

obținute cu o concentrație de 0,02% acetat de zinc în preextrudat putem observa că

randamentul în fermentare la primele 2 cicluri de fermentare este menținut aproape constant

iar în al treilea ciclu de fermentare scade dar este superior randamentului obținut cu drojdia

liberă.

Page 168: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

167

(a) (b)

(c)

Figura 54: Variația în timp a eficienței fermentării pentru probe la care diferă concentrația

de acetat de zinc din preextrudat respectiv după diferite cicluri de fermentare: (a) primul

ciclu; (b) al doilea ciclu; (c) treilea ciclu.

Această comportare a particulelor de imobilizat în procesele fermentative este

influențată de gradul de reticulare. Cu creșterea concentrației de acetat de zinc din

preextrudat crește gradul de reticulare al particulelor. La particulele cu un grad de reticulare

mai ridicat eficiența în fermentare scade. În figura 55 sunt prezentate valorile randamentului

de fermentare funcție de numărul de cicluri la fiecare tip de probă analizat.

(a|) (b)

Page 169: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

168

(c)

Figura 55: Randamentul maxim obținut în diferite cicluri de fermentare, cu diferite tipuri de

imobilizat, comparativ cu randamentul obținut la fermentarea cu drojdie liberă (0) :

(a) L2D, (b) L4D, (c) L5D.

Pentru toate probele analizate se constată că randamentul în fermentare scade de la

un ciclu la altul. Proba cu cel mai bun randament în fermentare este L2, deci cu un grad mic

de reticulare, considerată ca fiind optimă.

6.3.5.2. Influența concentrației de acetat de zinc din baia de extrudere

Probele selectate sunt A2D, L2D și N2D. PH-ul soluției din baia de fermentare a

fost ajustat la valoarea pH = 5, cunoscut fiind faptul că pH-ul optim de proliferare a celulelor

de drojdie este cuprins între 4 și 6. În figura 56 sunt prezentate curbele de fermentare a celor

trei probe după primul ciclu de fermentare. Soluția de glucoză din fermentator a avut o

concentrație de 0.007 % acetat de zinc.

Page 170: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

169

Figura 56: Variația în timp a eficienței fermentării glucozei pentru probe care diferă prin

concentrația de reticulant din baia de extrudere

Se poate observa că prin scăderea concentrației de reticulant din baia de extrudere

eficiența fermentării crește. Este evident că efectul se datorează gradului mai mic de

reticulare și porozității mai mari a particulelor, având ca efect intensificarea difuziei

substratului (glucoza) către celulele de drojdie din matricea de gelan.

Totodată, nutrienții din baia de fermentare difuzează mai ușor în interiorul

particulelor cu celule de drojdie imobilizate, care pot prolifera în interiorul matrticei

polimere crescând eficiența fermentării.

6.3.5.3. Influența timpului de păstrare a particulelor în baia de extrudere

Pentru a determina timpul optim de păstrare al particulelor în baia de reticulare

după extrudere a fost selectată proba L2D. Timpul stabilit pentru păstrarea particulelor în

baia de gelifiere este de 2 h, respectiv 12 h. După perioada de păstrare în soluția de extrudere

probele au fost spălate cu apă bidistilată pentru îndepărtarea excesului de acetat de zinc și

testate din punct de vedere al activității fermentative.

Au fost alese două concentrații diferite de acetat de zinc din baia de fermentare:

0.015% și 0.01 %. PH-ul soluției în care se face fermentarea a fost 5 în cazul utilizării unei

concentrații de acetat de zinc de 0.015%, repectiv 6 pentru concentrația de 0.01 %. În figura

57 sunt prezentate valorile randamentului de fermentare după diferite cicluri pentru probele

analizate.

Page 171: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

170

(a) (b)

(c) (d)

Figura 57: Influența timpului de păstrare al particulelor în soluția de extrudere pentru proba

L2D la pH 5 și 0,015% acetat de zinc în baia de fermentare: (a) după 2 ore de păstrare a

particulelor în soluția de extrudere, (b) după 12 h de păstrare a particulelor în soluția de

extrudere; respectiv la pH 6 si 0,01% acetat de zinc în baia de fermentare (c) după 2 ore de

păstrare a particulelor în soluția de extrudere și (d)după 12 ore de păstrare a particulelor în

soluția de extrudere.

Păstrarea în soluția de extrudere a particulelor o perioadă mai lungă de timp

determină apariția unui grad de reticulare mai mare, sub acțiunea ionului Zn2+

. Eficiența

fermentării crește atunci când gradul de reticulare este mai mic deoarece nutrienții ce se

găsesc în baia de fermentare difuzează mai ușor la celulele de drojdie ce se găsesc în

interiorul particulelor de gelan iar acestea pot prolifera.

Celulele de drojdie necesită cantități foarte de mici de ioni de zinc, în concentrații

micromolare, pentru indeplinirea rolului fiziologic din cadrul metabolismului celular.

Se poate observa o ușoară creștere a eficienței fermentării atunci când soluția pentru

fermentare conține 0.015% acetat de zinc la pH 5 comparativ cu utilizarea soluției de 0.01%

acetat de zinc, pH 6. Această comportare la fermentare a particulelor poate fi determinată de

faptul că zincul în concentrații mici este un factor de creștere pentru celulele de drojdie iar

pH-ul optim pentru proliferarea lor variază între 4 și 6.

Page 172: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

171

În ambele cazuri analizate se observă că eficiența fermentării crește atunci când

particulele sunt păstrate în baia de reticulare timp de 2 ore.

6.3.5.4. Influența pH-ului din baia de fermentare

PH-ul mediului de fermentare nu este considerat de mulți cercetători un factor

esențial de influență în procesele fermentative. O serie de studii au relatat însă faptul că pH-

ul mediului de fermentare joacă un rol important în asimilarea ionilor metalici de către

celulele de drojdie în timpul proceselor fermentative. De asemenea, unele cercetări afirmă că

pH-ul are un rol important în legarea cationilor metalici în locurile de absorbție de pe

peretele celular al celulei.[57, 563]

S-a utilizat pentru această determinare proba L2D care s-a dovedit cea mai eficace

din punct de vedere al randamentelor de fermentare iar pH-ul din baia de fermentare a fost

reglat la valorile 5, respectiv 6. Particulele au fost păstrate în baia de reticulare după obținere

pentru 2 ore după care au fost spălate cu apă bidistilată și testate în procese fermentative

repetate. Baia de fermentare conține glucoză dizolvată în soluție aposă de acetat de zinc

acetat de zinc de concentrație 0,01%. Ciclurile de fermentare au fost repetate după 24 de ore.

Diagramele de fermentare ale probei L2D realizate la valori diferite de pH în baia de

fermentare sunt redate în figura 58.

(a)

Page 173: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

172

(b)

Figura 58: Randamentele obținute la diferite cicluri de fermentare pentru proba L2D la (a)

pH 6 și (b) pH 5

Rezultatele obținute demonstrează faptul că pH-ul este un factor foarte important

pentru obținerea unor randamente optime în fermentarea glucozei în prezența particulelor cu

celule de drojdie imobilizate și pentru utilizarea particulelor în cât mai multe cicluri de

fermentare repetate. Scăzând valoarea pH-ului de la 6 la 5 observăm că eficiența în

fermentare crește și este comparabilă cu eficiența pe care o obținem la drojdia liberă; de

asemenea, numărul ciclurilor de fermentare crește. Rezultatele obținute ne determină să

afirmăm că celulele de drojdie pot prolifera mai eficient în interiorul particulelor de gelan la

valoarea 5 a pH -ului.

Rezultatele sunt în acord cu cercetările amintrite anterior, care raportează faptul că

pentru o fermentare optimă pH-ul mediului de fermentare trebuie sa fie între 4,5 și 5.

6.3.5.5. Influența concentrației de acetat de zinc din baia de fermentare

Pentru proba L2D a fost testată activitatea fermentativă utilizând diferite

concentrații de acetat de zinc în baia de fermentare. Concentrația de glucoză dizolvată a fost

de 8% și a fost menținută constantă iar pH-ul în baia de fermentare a fost menținut la

valoarea pH = 5 în toate cazurile analizate.

Glucoza a fost dizolvată în soluții apoase de acetat de zinc de trei concentrații:

0,015 %, 0,01% respectiv, 0,007%. În figura 59 sunt prezentate diagramele obținute după

mai multe cicluri de fermentare a particulelor în condițiile mai sus menționate.

Page 174: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

173

(a) (b)

(c)

Figura 59. Numărul de cicluri de fermentarer realizate cu proba L2D la pH 5 cu diferite

concentrații de acetat de zinc in baia de fermentare

(a) 0,015%, (b) 0,01% și (c) 0,007%.

Este evident că eficiența fermentării depinde de concentrația de acetat de zinc din

baia de fermentare. Cele mai multe cicluri de fermentare sunt obținute în cazul utilizării unei

concentrații de 0,01 % acetat de zinc. Utilizarea unei concentrații mai mici de 0,07% duce la

realizarea unui număr mai mic de cicluri de fermentare. Această comportare se datorează

faptului că ionul de zinc este un factor de creștere pentru celulele de drojdie în anumite

concentrații. O concentrație mai mică în baia de fermentare poate determina o rată de

proliferare mai scăzută a celulelor, iar în consecință, randamentul în fermentare poate să

scadă.

În cazul utilizării unei concentrații mai mari de acetat de zinc se poate realiza un

număr mai mic de cicluri de fermentare deoarece ionul de Zn2+

poate reticula suplimentar

matricea de gelan; ca urmare, difuzia nutrienților din mediul de fermentare în particule se

realizează dificil. Celulele de drojdie imobilizate în particulele de gelan nu pot difuza din

particule și nici nu pot prolifera în interiorul particulelor. În timp apare liza (autoliza)

celulelor iar procesul de fermentare încetinește sau chiar se oprește.

Din curbele de fermentare și din diagramele analizate anterior s-a observat faptul că

în procesele fermentative ce conțin în mediul de fermentare o concentrație de 0,01 %

Page 175: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

174

respectiv, 0,007 % acetat de zinc, pH-ul mediului de fermentare fiind 5, se obțin randamente

ridicate după câteva cicluri fermentative. Randamentele obținute nu evoluează totuși după o

lege clară cu numătul de cicluri de fermentare. Se poate însă observa, după 5 cicluri, o

tendință de scădere a randamentului a acestuia.

Acest comportament ar putea fi explicat prin faptul că substratul împreună cu ionii

de zinc difuzează mai greu în interiorul particulelor, ceea ce le poate întârzia proliferarea.

Este posibil ca ionii de zinc să fie în deficit în interiorul particulelor cu celule de drojdie

imobilizată, iar cei din mediul de fermentare să ajungă după un anumit timp la celule pentru

a fi absorbiți de acestea. Ionii de zinc au un rol semnificativ în nutriția celulelor de drojdie

având pe lângă rolul de activator enzimatic și rolul de a stimula absorbția de maltoză și

maltotrioză de către celule, nutrienți care sporesc viteza de fermentare.

Această variație a randamentului în timp este posibil să fie determinată, deci, de

proliferarea celulelor de drojdie în interiorul particulelor de gelan.

Randamentul de fermentare obținut în prezența particulelor este comparat cu randamentul

obținut la fermentarea drojdiei libere. Se poate observa că în cele mai multe cazuri eficiența

fermentării în prezența imobilizatelor este superioară celei obținute în prezența drojdiei

libere.

După cum s-a menționat anterior, în particule s-a adăugat o suspensie de drojdie

obținută din 1,25 g drojdie și 5 ml apă. Cantitatea de celule de drojdie reprezintă 30% din

cantitatea totală de drojdie, adică 0,375 g. Înainte de fiecare ciclu de fermentare, pe baza

curbei de etalonare s-a stabilit cantitatea de celule de drojdie care a fost imobilizată în

particule în funcție de numărul de celule care difuzează în mediul de păstrare al particulelor.

Eficiența în imobilizare pentru toate probele analizate a fost de peste 99 %.

După fiecare ciclu de fermentare s-a stabilit cantitatea de celule de drojdie care

difuzează în supernatant. Aceasta determinare s-a efectuat pentru a stabili dacă proliferarea

celulară are loc sau nu în interiorul particulelor de gelan ce conțin celule de drojdie. În

tabelul 27 sunt prezentate rezultatele obținute în urma determinărilor efectuate.

Page 176: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

175

Tabel 27. Cantitatea de celule de drojdie din baia de fermentare consumată după fiecare

ciclu de fermentare:

Proba

Numărul

ciclului de

fermentare

Concentrația

de acetat de

zinc din baia

de extrudere

(%)

Numărul

total de

celule/ml x

104 măsurat

după

fiecare

ciclu de

fermentare

Cantitatea

totală de

celule de

drojdie

consumată

(mg)

Cantitatea

teoretică de

celule de

drojdie

rămasă în

particule (g)

A2D 6 0.01 51.5 0.142 0.37394

6 0.007 40.25 0.86065 0.37414

L2D 13 0.01 184.5 3.667852 0.37133

9 0.007 75.75 1.496716 0.3735

Testarea activității fermentative pentru probele analizate a avut loc în două medii de

fermentare diferite ce se diferențiază prin cantitatea de acetat de zinc în care este dizolvată

glucoza (0,01 %, respectiv 0,007%). PH-ul mediului de fermentare în toate cazurile

analizate a fost reglat la 5.

Rezultatele din tabelul 4 arată că din particulele testate în procesul de fermentare

difuzează un număr mic de celule, mult inferior celui rămas în particule. Ele demonstrează

faptul că fermentarea are loc dominant în particulele de gelan și nu este determinată de

celulele libere din supernatant.

Cantitatea de celule de drojdie care difuzează din particule după fiecare ciclu de

fermentare depinde de concentrația de acetat de zinc din baia de reticulare. Pentru proba

A2D cantitatea de celule este mai mică față de cantitatea de celule care difuzează din proba

L2D deoarece gradul de reticulare al probei A2D este mai mare.

Concentrația de acetat de zinc din mediul de fermentare are o influență

semnificativă asupra cantității de celule care difuzează din particule. Pentru obținerea unei

eficiențe optime în fermentare trebuie ca ionii de zinc din mediul de fermentare să aibă o

concentrație optimă. Astfel pentru probele cu 0,01% acetat de zinc în baia de fermentare

cantitatea de celule care difuzează din particule este mai mare decât în cazul probelor unde

s-au utilizat alte concentrații. Rezultatele obținute anterior în urma fermentărilor efectuate

într-un mediu cu concentrația în acetat de zinc de 0,01% și faptul că din particule difuzează

un număr mai mare de celule în mediul cu acestă concentrație ne determină să afirmăm că

aceasta poate fi concentrația optimă de acetat de zinc în mediul de fermentare pentru

obținerea unei eficiențe crescute a procesului. Difuzia unui număr mai mare de celule în

Page 177: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

176

mediul de fermentare poate fi o consecință a faptului că ionii de zinc sunt absorbiți eficient

de celulele de drojdie care iși pot îndeplini rolurile fiziologice esențiale cum ar fi creșterea și

nutriția, ele se pot multiplica mai ușor la această concentrație ceea ce ar putea explica și

difuzia unui număr mai mare de celule în mediul de fermentare.

Faptul că particulele cu celule de drojdie pot fi recuperate cu ușurință din

fermentator și pot fi reutilizate în mai multe cicluri fermentative arată că matricea de gelan

protejeaza celulele de drojdie de metaboliții toxici produși de etanol, viabilitatea celulară se

păstrează iar celulele de drojdie ar putea prolifera în interiorul particulelor de gelan.

Procesul de fermentare depinde mult de concentrația de acetat de zinc utilizată în

baia de fermentare. Astfel pentru aceeași probă utilizând o concentrație de 0,01% se pot

obține mai multe cicluri fermentative cu randamente comparabile cu cele obținute la

fermentarea drojdiei libere, sau decât dacă în baia de fermentare utilizăm concentrații mai

mari sau mai mici de reticulant. O explicatie ar putea fi aceea că un mediu cu deficit în zinc

poate duce la încetinirea procesului de fermentare iar în cazul utilizării unei concentrații mai

mari de acetat de zinc are loc o reticulare suplimentară a particulelor de gelan. Nutrienții din

mediul de fermentare nu mai pot difuza în particule, iar în timp procesul de fermentare se

oprește deoarece celulele nu pot prolifera și nu isi pot exercita funcțiile metabolice necesare.

Trebuie menționat faptul că matricea polimeră are un rol protector față de celulele

imobilizate, permițând proliferarea lor și menținerea viabilității celulare la valori ridicate

(tabelul 5). Numărul, cantitatea și viabilitatea celulară au fost determinate după

dezintegrarea particulelor de imobilizat la terminarea celului fermentativ la care s-au

raposrta rezultatele în tabelul 5.

Se explică și în acest mod posibilitatea de reutilizare a imobilizatelor pe parcursul

mai multor cicluri de fermentare, cu randamente convenabile, superioare în majoritatea

cazurilor celui atins cu drojdia liberă.

Page 178: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

177

Tabel 28. Numărul, cantitatea și viabilitatea celulelor de drojdie de bere imobilizate

în matricea de gelan reticulat cu ioni de Zn2+

după diferite

cicluri fermentative (L2D)

Numărul

ciclului de

fermentare

Numărul

de

celule/g

particule

x 10 8

Cantitatea

de

celule/g

particule,

mg

Viabilitatea

celulară, %

0 4,84 17,93 95,43

1 4,94 18,3 91,48

2 6,75 25 92,69

3 8,08 29,94

4 7,44 27,57 92,82

5 6,6 24,45

6 6,62 24,53

7 7,93 29,38

8 5,51 20,41 91,9

9 6,36 23,56 88,79

10 6,32 23,45

6.3.6. Productivitatea specifică și viteza de fermentare

Porțiunea liniară a curbelor cinetice ale procesului de fermentare permite evaluări

privind viteza cu care acesta se produce. Pe baza acestor informații s-a putut calcula

productivitatea specifică în etanol, rezultatele obținute pentru fiecare tip de particule.

Tabelul 29 prezintă, spre ilustrare rezultatele obținute în cazul fermentărilor cu probele A2D și

L2D.

Page 179: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

178

Tabel 29:Valorile vitezei de fermentare și productivității specifice în etanol

obținute după fiecare ciclu de fermentare efectuat pentru probele A2D și L2D.

Proba

Numărul

ciclului de

fermentare

Concentrația

acetatului de

zinc în baia de

reticulare (%)

Viteza de

transformare

a glucozei

%/min

Productivitatea

specifică în

etanol, g

etanol/h x g

yeast

A2D

1

2

3

4

5

6

0.01

0.11

0.13

0.13

0.13

0.13

0.089

0.59

0.59

0.59

0.59

0.2

0.2

1

2

3

4

5

6

0.007

0.13

0.13

0.089

0.13

0.089

0.067

0.59

0.59

0.59

0.39

0.59

0.37

L2D

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

0.01

0.13

0.13

0.11

0.089

0.49

0.089

0.067

0.84

0.13

0.29

0.089

0.156

0.044

0.59

0.59

0.39

0.39

0.74

0.59

0.59

0.59

0.39

0.82

0.39

0.39

0.59

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0.007

0.13

0.13

0.22

0.51

0.22

0.13

0.13

0.13

0.18

0.59

0.67

0.99

0.99

1.03

0.59

0.59

0.32

0.59

Viteza de fermentare pentru drojdia liberă este de 0.067 % conversie glucoză/ min

iar productivitatea specifică pentru drojdia liberă este de 0,18 g etanol/g glucoză x g drojdie.

Se constata că viteza procesului se plaseaza în aceeași ordine cu randamentul de

fermentare, pentru toate probele analizate. Viteza de fermentare pentru majoritatea ciclurilor

Page 180: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

179

fermentative efectuate este superioară celei obținute la fermentarea drojdiei libere. Procesele

fermentative pentru probele A2D și L2D s-au efectuat în două medii de fermentare ce diferă

prin concentrația de acetat de zinc în care se dizolvă glucoza.

În majoritatea ciclurilor de fermentare vitezele de fermentare obținute cu particulele L2D sunt

superioare celor obținute la fermentarea probei A2D.

Referitor la productivitatea specifică în etanol se constată că pentru cele mai multe

cicluri de fermentare efectuate s-a obținut o productivitate superioară sau egală cu

productivitatea specifică obținută la fermentarea cu drojdie liberă.

Concluzii

Acetatul de zinc poate constitui un candidat important ca reticulant ioinic al

gelanului, permițînd obținerea de imobilizate de drojdie în matricea polizaharidului.

Comparativ cu reticulările determinate de ionii de Ca2+

respectiv Mg2+, concentrațiile ionului

de Zn2+

pentru obținerea acelorași performanțe în reticulare sunt cu un ordin de mărime mai

mici, datorită capacității acestui metal tranzițional de a realiza rticulări suplimentare prin

angajarea de legături coordinative cu gelanul.

Particulele obținutsunt stabile în timp în medii apoase iar viabilitatea celulară are

valori de peste 85% după 24 de ore de păstrare a particulelor în apă bidistilată ceea ce

semnifică că matricea de gelan are un rol protector.

Valoarea gradului de umflare crește atunci când gradul de reticulare scade iar

rezultatele sunt în concordanță cu cele obținute la testele reologice.

Particulele care au un grad de reticulare mai mare sunt cele mai stabile din punct de vedere

mecanic.

Microscopia electronică de baleiaj evidențiază faptul că celulele de drojdie se

găsesc în număr mare în particulele de gelan, iar probele mai puțin reticulate au o structură

mai poroasă, porozitatea lor scazând cu creșterea gradului de reticulare.

Activitatea fermentativă depinde mult de concentrația de acetat de zinc utilizată în

preextrudat, în baia de reticulare și în mediul de fermentare.

PH-ul mediului de fermentare și timpul de păstrare al particulelor în baia de

reticulare influențează activitatea fermentativă a particulelor.

Rezultatele obținute conduc la stabilirea condițiilor optime de obținere a imobilizatelor:

concentrația soluției de gelan 1%, concentrația acetatului de zinc în preextrudat 0,02 %,

concentrația acetatului de zinc din baia de reticulare 0,07%, concentrația acetatului de zinc

Page 181: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

180

din mediul de fermentare 0,01%, pH-ul mediului de fermentare 5, timpul optim de păstrare

al particulelor în baia de reticulare 2 ore.

Particulele de imobilizat reticulate ionic cu acetat de zinc pot fi recuperate cu

ușurință din mediul de fermentare prin filtrare și pot fi utilizate în mai multe cicluri

fermentative, numărul maxim fiind 13.

Productivitatea specifică în etanol obținută la fermentarea probelor cu celule de

drojdie imobilizate este comparabilă (la unele cicluri de fermentare chiar mai buna) cu

productivitatea specifică în etanol obținută la drojdia liberă.

Particulele de gelan cu celule de drojdie imobilizate obținute pot fi utilizate cu

succes în procese fermentative și ar putea reprezenta o nouă abordare în rezolvarea

problemei deficitului de zinc cu care se confruntă producătorii din industria berii.

6.4. Particule pe bază de amestecuri de gelan și carboximetil celuloză reticulate cu

acetat de zinc, conținând celule de drojdie imobilizate

Imobilizarea celulelor de drojdie în matrici polimere are numeroase consecințe

pozitive: protecția celulelor față de acțiunile mecanice și factori de mediu (pH, presiune

osmotică, turbulența mediului în care lucrează), realizarea unui schimb eficient de nutrienți

și metaboliți cu mediul exterior, recuperarea ușoară din mediile de fermentare și reutilizarea

într-un alt ciclu fermentativ etc. Imobilizatele astfel obtinute pot fi considerate adevarate

bioreactoare, cu eficiență mult mai ridicată decât în cazul utilizării drojdiei libere,

dependentă și de suprafaţa lor specifică, porozitate, capacitate de umflare şi stabilitate.

Polizaharidele îndeplinesc condiţiile cerute pentru imobilizarea unui principiu

biologic activ, în particular a celulelor de drojdie, așa cum s-a evidențiat în mai multe

rânduri pe parcursul acestei lucrări de doctorat: sunt lipsite de toxicitate, inerte

farmacologic, nu conţin impurităţi sau aditivi şi compuşi reziduali ai proceselor de reticulare

sau polimerizare, prezintă structură chimică bine precizată. Abilitatea lor de a forma geluri

fizice chiar şi la concentraţii foarte mici reprezintă una dintre cele mai importante proprietaţi

funcţionale ale acestora. Formarea structurilor tridimensionale oferă o cale de creştere a

stabilităţii chimice şi mecanice a sistemului.

Posibilitatea utilizării gelanului ca matrice polimeră pentru realizarea de astfel de

imobilizate a fost discutată anterior. In literatură există informații privind posibilitatea

utilizării de amestecuri de polizaharide ionice, una dintre acestea fiind carboximetil celuloza

în forma sa solubilă în apă – sarea de sodiu (CMCNa).

Page 182: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

181

Carboximetil celuloza (CMC) este un eter celulozic care dizlovat în apă conduce la

formarea unor soluţii coloidale, ce conţin, la concentraţii mici, macromolecule filiforme, iar

la concentraţii mari geluri. Soluţiile de CMCNa sunt pseudoplastice, iar gelurile tixotrope;

sunt vâscoase la pH acid (vâscozitatea creste cu scaderea valorii pH-ului), vâscozitatea

scăzând cu cu temperatura, dar revinind la valoarea iniţială după răcire [564]. CMCNa este

un polimer biocompatibi, netoxic, dar nebiodegradabil. După informațiile noastre nu a fost

încă utilizat în scopul imobilizarii celulelor de drojdie de bere. De asemenea, în literatura nu

există informații privind utilizarea unor amestecuri de Gelan și CMCNa pentru realizarea de

matrici destinate încapsulării celulelor de drojdie.

Prezentul subcapitol raportează rezultatele obținute utilizând amestecuri de gelan și

CMCNa ca suporturi pentru imobilizarea de celule de drojdie. Imobilizatele au fost realizate

prin gelifiere ionotropă în prezența acetatului de magneziu, printr-un proces de extrudere

prin capilară a suspensiilor de drojdie în solutia de polimer. La baza alegerii procedeului,

agentului de reticulare și a parametrilor procesului au stat informațiile prezentate în

subcapitolul 5.2, referitor la obținerea matricilor sferice doar din gelan reticulat ionotrop cu

ioni de Mg2+

.

Cele două polizaharide cu care s-a lucrat sunt deci polianioni, care diferă prin masa

moleculară (mai redusă la CMCNa) si prin densitatea anionilor carboxilat de-a lungul

lanțului polimeric: un anion la fiecare patru cicluri de glucoza din gelan (unitatea

structurală) respectiv 0,75 anioni pe fiecare ciclu de glucoză din CMCNa. Rezultă că

CMCNa, deși se caracterizează prin masă moleculară mai coborâtă, poate genera rețele mai

dense decât gelanul prin reticulare ionotropă cu cationi bivalenti.

Realizarea imobilizatelor de drojdie în matricea de polizaharide are la bază,

evident, fixarea celulelor în ochiurile rețelei formate prin reticularea ionică a lanțurilor

polimere, ca urmare a legării ionice a cationilor de magneziu la anionii carboxilat ai Gll și ai

CMCNa. Teste preliminare au dovedit că CMCNa nu formează singură particule stabile,

probabil datorita masei moleculare mai reduse.

Utilizând însâ amestecuri ale celor două polizaharide se formează o rețea

interpenetrată/interconectată, foarte stabilă. Structura schematică a unei astfel de rețele este

prezentată în figura 60. Celulele de drojdie, cu sarcina electrică negativă în suprafață, pot

lega ionii de Mg2+

consolidând astfel structura rețelei polimere.

Pe baza rezultatelor preliminare,în scopul efectuării studiului au fost obținute 5

tipuri de particule, cu și fără drojdie, ale caror notații și compoziții ale amestecului de

polizaharide de plecare sunt prezentate în tabelul 30.

Page 183: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

182

Figura 60. Structura schematică a rețelei ionice interpenetrate/interconectate dintre gelan și

CMCNa, formată prin reticulare ionică cu Mg2+

.

Tabel 30. Codificarea probelor obținute și compoziția acestora*

Codificarea probei

Gelan

(%)

CMCNa

(%)

fără

drojdie

cu

drojdie

P0 PD0 100 0

P1 PD1 80 20

P2 PD2 65 35

P3 PD3 50 50

P4 PD4 35 65

*Concentrația soluției de Mg(OCOCH3)2 în preextrudat = 0.4 %

Concentrația soluției de Mg(OCOCH3)2 în baia de extrudere = 2 %

În toate cazurile, particulele obţinute sunt sferice şi au diametrul de aproximativ 2,5

mm în stare umflată, așa cum se obțin din procesul de extrudere.

Rezultatele obținute pentru particulele pe baza amestecului de polizaharide vor fi

comparate, în multe cazuri, cu cele obținute pentru particule pe bază doar de gelan, chiar

dacă acestea au fost discutate la subcapitolul 5.2.

Page 184: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

183

6.4.1. Evaluarea stabilității și a viabilității celulare

Pentru evaluarea stabilității în timp, a cărei importanță a fost subliniată în mai multe

rînduri, s-a procedat la determinarea turbidității soluțiilor în care particulele au fost

suspendate. S-a stabilit această mărime la diferite intervale de timp atât în soluția de

extrudere cât și în apă bidistilată. În tabelul 2 sunt prezentate rezultatele obținute în urma

măsurării turbidității (transmitanței) a două medii apoase în care au fost suspendate

particulele. Codurile particulelor conținând drojdie conțin literea D.

Tabel 31. Valoarea transmitanței unor medii apoase în care au fost suspendate particulele cu

și fără drojdie încapsulată*

Se observă că particulele care nu conțin celule de drojdie au valori ridicate ale

transmitanței atât în soluția de reticulare după 24 ore, cât și în apă bidistilată după 48 h (P0-

P4 comparativ cu PD0-PD4). Valoare ușor mai coborâtă a transmitanței în apă distilată se

obține în cazul particulelor constituite doar din gelan. Se poate deci afirma că particulele de

hidrogel formate din amestecuri gelan/CMCNa sunt puțin mai stabile comparativ cu

particulele de gelan obținute în aceleași condiții, evident datorită densității mai mari a

rețelei.

Totuși cu creșterea cantității de CMCNa se observă o ușoară scădere a valorilor

transmitanței. Singura explicație posibila este aceea ca datorită dimensiunii mult mai mici a

macromoleculelor de CMCNa comparativ cu cele ale gelanului, cele situate pe suprafața

Proba

Transmitanța , T %

în soluția de

extrudere în apă bidistilată

12h 24 h. 12h 24h. 36h. 48h

P0 99.8 99.0 99 98.2 96.7 96,7

P1 99.3 99,1 99,8 99,5 98,9 98,6

P2 99,3 98,8 99,5 99,4 98,8 98,5

P3 99 98,4 99,5 99,1 98,7 98,3

P4 98,4 98,2 99,3 98,7 98,3 98,1

P0D 96.3 94.8 96.8 90.2 88 88

P1D 98,4 98 99,1 98,7 98,3 98

P2D 98,4 97,4 99,1 98,6 98,1 97,8

P3D 97,9 97,4 99,2 98,2 97,5 97

P4D 97,3 96,7 99 98,2 97,4 96,9

Page 185: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

184

particulelor, nefiind legate în rețea, se pot desprinde în număr tot mai mare odata cu

creșterea cantității acestui polimer în amestec. De altfel, după cum am menționat anterior,

CMCNa singur nu poate forma particule stabile, acestea dezagregându-se imediat după

extrudere. Și la particulele ce conțin drojdie valorile transmitanței scad puțin cu creșterea

conținutului de CMCNa, dar se mențin totuși mai mari în comparație cu proba care conține

doar gelan.

În cazul tuturor particulelor, cu și fără drojdie încapsulată, stabilitatea scade ușor în

timp, păstrându-se totuși ridicată (minimul înregistrat pentru transmitanță este de 96,7 %).

Pentru utilizarea în cicluri fermentative repetate a particulelor ce conțin celule de

drojdie eficiența biocatalitica depinde mult de viabilitate și de capacitatea de proliferare a

celulelor. Tabelul 32 prezintă rezultatele obținute în urma determinărilor efectuate.

Tabel 32. Viabilitatea celulară concentrațiade celule din mediile în care au fost păstrate

imobilizatele

Proba

Concentraţia celulelor de drojdie

(număr celule/ml x 104) în supernatant

Viabilitatea celulară, %

în soluție de

acetat de

magneziu

2%

în apă bidistilată

în soluție de

acetat de

magneziu

2%

în apă bidistilată

12h 24h 12h 24h 36h 48h 12h 24h 12h 24h 36h 48h

P0D 16,5 38 58,5 96 95,73 94,15

P1D 2,5 4,5 1,5 2,5 2,75 4,5 100 94,74 100 90,91 91,66 90

P2D 2,75 6 2 3 3,75 5 100 96 88,89 92,31 93,75 90,9

P3D 7,25 9 2,75 7 9,25 12 100 94,73 100 94,11 94,87 94,11

P4D 7,75 9,5 5,75 8 9,5 14 100 95 94,44 93,33 95 94,92

Se constată că la probele care au o valoare a transmitanței mai scăzută, concentrația

celulelor în supernatant este mai ridicată, ceea ce semnifică faptul că turbiditatea

supernatantului este dată nu doar de polimerul desprins din rețea ci și de celulele neprinse în

matrice. Cu creșterea concentrației de CMCNa în amestecul de polimeri se observă o

creștere a concentrației celulelor. Aceste rezultate sunt în completarea celor obținute la

măsurarea transmitanței. Cu cât crește gradul de reticulare cu atât ochiurile rețelei

polimerice sunt mai mici, rețeaua este mai densă, și nu mai permite includerea tuturor

celulelor, o parte dintre acestea rămânând, probabil, doar adsorbite în suprafață. În cazul

Page 186: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

185

probei P0D se poate observa faptul că numărul de celule care difuzează din particule este

mult mai mare în comparație cu numărul de celule care difuzează din celelalte probe

analizate.

Se observă că viabilitatea celulară are valori ridicate pentru toate probele analizate

după diferite perioade de timp. Acestea atestă faptul că matricea polimeră protejează celulele

impotriva unor factori degradativi, astfel încât viabilitatea lor se pastrează în timp.

Stabilitatea în medii alcoolice a fost evaluată pentru a evidenția faptul că matricea

polimeră în care celulele de drojdie sunt imobilizate le protejează de metaboliții toxici care

se găsesc în etanol. În tabelul 4 sunt prezentate valorile transmitanței și ale viabilității

celulare pentru probele P2D si P4D, comparativ cu proba P0D. Valorile transmitanței la

probele cu drojdie sunt redate în tabelul 32.

Tabel 33. Valorile transmitanței și viabilității celulare în medii alcoolice

Proba Transmitanța, T%

Concentraţia celulelor

de drojdie

(număr celule/ml x 104)

Viabilitatea celulară, %

12h 36h 60 h 84h 12h 36h 60h 84h 12h 36h 60 h 84h

P0D 99.2 98.3 98 97.6 3 3.5 4.5 5.5 100 93.3 90 88

P2D 98,9 98,4 98,2 97,8 1,75 2,75 4 5 87,5 91,66 94,11 90,9

P4D 98,9 98,8 98,6 97,9 3,75 5 6 7,25 93,75 90,91 92,3 90,62

Transmitanța are valori mari, ceea ce semnifică faptul că stabilitatea în alcool a

particulelor este ridicată. Rezultatele arată faptul că valoarea transmitanței crește cu

creșterea conținutului de CMCNa. Viabilitatea celulară se păstrează la valori ridicate chiar și

după 84 h de păstrare în medii alcoolice (peste 90 %) pentru particulele cu celule de drojdie

imobilizate ce conțin CMCNa, fiind ușor mai redusă pentru pentru particulele de gelan

(88%).

Se poate afirma pe baza rezultatelor obținute, că matricea polimeră alcătuită din

cele două polizaharide protejează celulele de drojdie imobilizate de metaboliții toxici din

etanol, iar particulele de pe bază de amestec gelan-CMCNa oferă o protecție îmbunătățită

celulelor de drojdie imobilizate comparativ cu particulele doar de gelan.

Page 187: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

186

6.4.2. Gradul de umflare în apă

Toate particulele obtinute manifesta un puternic caracter de hidrogel, astfel încât s-a

considerat utilă și în acest caz evaluarea comportarii lor la umflare în apă, prin determinarea

variației gradului de umflare pe un interval de timp de 20 ore (fig. 4)

Figura 61. Cinetica procesului de umflare pentru particule fără drojdie.

Pentru particulele care conțin CMCNa se obțin valori mai mici ale gradului maxim

de umflare comparativ cu P0 (care conține doar gelan), rezultat al densității mai mari de

reticulare, în concordanță cu valorile transmitanței discutate anterior. Gradul maxim de

umflare scade cu creșterea concentrației de CMCNa în particule, deci cu creșterea gradului

de reticulare, efect pe care l-am anticipat când am selectat CMCNa ca partener în

coreticulare cu gelanul, dat fiind numărul mare de grupări carboxilat, reticulabile, pe care îl

conține.

Pentru particulele continand celule de drojdie imobilizate se constată că gradul

maxim de umflare pentru toate probele analizate este mai mic comparativ cu cel caracteristic

celor fără drojdie (Fig. 62). Acest efect probează încă o dată faptul că celulele de drojdie, cu

sarcini electrice negative pe suprafață, participă practic la reticulare ranforsând structura și

rămânând astfel puternic ancorate în rețeaua polimeră. Și în acest caz valoarea gradului de

umflare scade cu creșterea concentrației de CMC.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

0 5 10 15 20 25

P1 P2 P3 P4P0

Time (h)

Sw

ell

ing

de

gre

e, S

D %

Page 188: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

187

Figura 62. Cinetica procesului de umflare în apă la particulele ce conțin celule de drojdie

imobilizate.

6.4.3. Morfologia particulelor

Morfologia particulelor în stare de echilibru apă/gheață, ca și uscate a fost

evidențiată prin microscopie electronică de baleiaj a secțiunilor acestora. În figura 63 sunt

prezentate fotografii corespunzatoare particulelor fără celule de drojdie, realizate prin

înghețarea acestora și analiza lor prin tehnica ‖environemental‖.

a b c

Figura 63. Fotografii de microscope electronică de baleiaj pentru particule fără celule de

drojdie realizate în secțiune pe probe înghețate: P0 (a), P2 (b), P4 (c) (grade diferite de

mărire).

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 10 20 30 40

Q% P1 +D Q% P2+D

Q% P3+D Q% P4+D

Time (h)

Sw

ell

ing

de

gre

e, S

D%

Page 189: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

188

Se constată ca proba P0, prezintă o secțiune mai neuniformă și o porozitate mai

accentuată. Cu creșterea concentrației de CMCNa suprafața particulelor devine tot mai

uniformă iar porozitatea scade.

În figura 64 sunt prezentate fotografii de microscopie electronica de baleiaj în

secțiune pentru particule ce contin celule de drojdie.

(a) (b) (c)

Figura 64. Microscopie electronică de baleiaj pentru particule cu celule de drojdie

încapsulată, realizate în secțiune în stare uscată, metalizate: P0D (a), P2D (b), P4D (c)

(diferite grade de mărire)

Cu creșterea conținutului de CMCNa, suprafața particulelor devine mai densă,

gradul de reticulare al particulelor crește iar porozitatea diminuiază. Trebuie evidențiată

populația mare de celule din particulele de imobilizat, atestând faptul că aceste particule pot

constitui microbioreactoare utilizabile în procese fermentative.

6.4.4. Evaluarea capacității de fermentare a glucozei în prezența imobilizatelor

obținute în diferite condiții

Activitatea fermentativă a fost evaluată pentru toate particulele cu drojdie

imobilizată obținute, la temperatura de 30˚C și pH 5 (dovedit optim în testele anterioare).

Page 190: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

189

După fiecare ciclu de fermentare particulele au fost recuperate din fermentator prin filtrare,

spălate cu apă bidistilată și păstrate la frigider la temperatura de 4-6˚C până la următorul

ciclu fermentativ. Fiecare ciclu de fermentare a durat 255 minute iar intervalul dintre cicluri

a fost de 24 ore.

Câteva curbe de fermentare obținute sunt prezentate în figura 65.

I II III

IV V VI

VII VIII IX

Figura 65. Evoluția în timp a randamentului în glucoză fermentată pentru 9 cicluri succesive de

fermentare, în prezența particulelor de gelan și gelan/CMC ce conțin celule de drojdie. (Indicele

numeric reprezintă numărul ciclului de fermentare)

Eficiența fermentării dupa 255 minute pentru cele 9 cicluri, la cele 5 tipuri de particule

este prezentată în diagramele din figura 66:

Page 191: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

190

a b c

d e f

g h i

Figura 66: Randamentul maxim în glucoză fermentată după câteva cicluri de fermentare pentru

particule cu celule de drojdie imobilizate comparativ cu drojdia liberă

Din curbele de fermentare și din diagrame se poate constata că pentru proba P0D

eficiența procesului este mai bună comparativ cu celelalte probe analizate, începând cu cel de al

patrulea ciclu de fermentare. Explicația poate fi corelată cu porozitatea mai mare a particulelor,

respectiv densitatea de reticulare mai mică, ce facilitează difuzia substratului la celulele de

drojdie imobilizate. Eficiență ușor mai ridicată în fermentare față de proba P0D, manifestă în

primele 3 cicluri imobilizatele pe bază de gelan/CMCNa. Ea poate fi determinată de faptul că

gradul mai redus de reticulare permite ieșirea din matricea polimeră a unui număr mai mare de

celule, după cum demonstreaza rezultatele privind viabilitatea celulară (Tabelul 31). Probele de

gelan/CMCNa formează o rețea interpenetrată mai densă și mai stabilă datorită gradului de

reticulare mai mare, astfel încât din rețea difezează mai puține celule, cele rămase în matrice

determinând o eficiență mai ridicată a fermentarii.

Important este faptul ca imobilizatele, indiferent de tipul matricii, pot fi reutilizate în

numeroase cicluri de fermentare (în studiul de față s-a mers până la 9 cicluri) fără o pierdere

Page 192: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

191

prea mare a activității biocatalitice. Matricea polimeră păstrează, deci, viabilitatea celulară și

protejează celulele de metaboliții toxici produși de etanol și de factorii de mediu, efecte

demonstrate anterior prin testele de stabilitate în alcool. Mai mult, este foarte probabil ca

celulele sa prolifereze în matrice, efect care poate explica parțial activitatea biocatalitică foarte

puțin modificată în timp.

Eficiența fermentării cu toate tipurile de biorecatoare analizate, în majoritatea

ciclurilor realizate este superioară față de cea obținută la fermentare cu drojdie liberă.

Particulele sunt recuperate cu ușurință din fermentator și se pot utiliza în mai multe cicluri de

fermentare repetate.

6.4.5. Productivitatea specifică și viteza de fermentare

Viteza procesului de fermentare și productivitatea specifică, calculate pe baza curbelor

cinetice, permit următoarele constatări. Vitezele se plasează în aceeași ordine cu randamentul de

fermentare pentru toate probele analizate, excepție făcând proba P0D pentru care viteza este

superioară începând cu ciclul 4 de fermentare.

Valorile productivității specifice a bioreactoarelor comparativ cu drojdia liberă, pentru

câteva cicluri de fermentare alese aleator, sunt prezentate in Tabelul 34.

Tabelul 34. Productivitatea bioreactoarelor pentru cele 5 tipuri de particule conținând celule de

drojdie imobilizată, pentru câteva cicluri de fermentare (alegere aleatorie).

Number of

the

fermentation

cycles

Productivity [(g ethanol/h x g yeast])/particles type

Free

Yeast

P0D P1D P2D P3D P4D

I 0,70 0,63 0,60 0,60 0,60

II 0,60 0,80 0,80 0,60 0,60

III 1,83 0,60 0,60 0,80 0,60

IV 0,57 1,30 0,60 0,80 0,60 0,60

V 1,73 0,60 0,60 0,60 0,60

VI 2,00 0,60 0,60 0,60 0,60

VII 0,60 0,60 0,80 0,60 0,60

VIII 1,00 0,60 0,60 0,60 0,60

IX 1,57 0,60 0,60 0,60 0,60

Page 193: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

192

Concluzii

Gelanul în amestec cu carboximetil celuloza pot fi reticulate ionic formând entități

sferice, capabile să încorporeze celule de drojdie. Avantajul potențial al acestui amestec,

comparativ cu gelanul simplu, îl poate constitui prețul de cost mai scăzut implicat de realizarea

particulelor, dat fiind costul unitar mai redus al derivatului de celuloză.

Coreticularea celor două polizaharide cu ioni de Mg2+

este mai avantajoasă decât cu ioni

de calciu, date fiind beneficiile aduse de prezența Mg celulelor de drojdie.

Densitatea de reticulare a amestecului de polizaharide depinde de compoziția sa, crescând cu

creșterea conținutului de carboximetil celuloză, și se reflectă în toate caracteristicile particulelor

obținute: stabilitate strcturală, morfologie, comportare în mdeii apoase, capacitate de fermentare

a glucozei.

Bioreactoarele pe bază de amestec al celor două polizaharide pot fi utilizate într-un

număr mare de cicluri fermentative, fără o pierdere semnificativă a activității biocatalitice, și pot

fi foarte ușor separate din mediul de fermentare prin simplă filtrare.

6.5. Particule pe bază de amestecuri de gelan, carboximetil celuloză și caragenan

reticulate cu acetat de zinc, conținând celule de drojdie imobilizate

După cum s-a subliniat de mai multe ori pe parcursul lucrării, polizaharidele ionice

sunt candidați ideali pentru imobilizarea de principii biologic active, în particular celule de

drojde. Frecvent utilizați sunt alginații, ale căror avantaje și dezavantaje au fost precizat în

studiul bibliografic. Mai multe lucrări semnalează utilizarea gelanului, care și pentru

cercetările din cadrul tezei de doctorat a constituit suportul de bază. Mai puțin utilizată este

carboximetil celuloza sare de Na (CMCNa), în forma liberă sau modificat chimic, de

exemplu prin grefare cu lanțuri de polimeri sintetici, dar biocompatibili.

Un candidat important pentru bioaplicații îl constiue caragenanul, poligalactan

bogat în esteri sulfat, care ii imprima o temperatură de solubilizare mai mică dar o tărie mai

mică a gelului [399]. K-caragenan a fost cu succes utilizat ca matrice pentru imobilizarea

celulelor de drojdie permițând obținerea unei productivități crescute în etanol. H.Y. Wang

and D. Hettwer (1982) au adăugat în matricea de gel pe bază de k-caragenan hidroxiapatita

sau fosfat tricalcic. Fosfatul tricalcic menține pH-ul la un nivel optim, susține viabilitatea

celulară, creste densitatea gelului și productivitatea în etanol [405]. Particule de k-caragenan

cu celule de drojdie imobilizată prin metoda extruderii utilizând ca agent de reticulare KCl

au mai fost obținute de către A.M. Martinez et al.,(2016) și Francesc Godia et al.(1987).[

Page 194: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

193

406, 446]. Particule de K-karageenan au fost obținute și prin tehnica emulsifierii, care

presupune dispersia soluției apoase de polizaharid într-o fază organică nemiscibilă urmată de

gelifierea și separarea microparticulelor. Deoarece particulele de k-caragenan nu sunt foarte

stabile ele pot fi acoperite cu un strat de chitosan care reduce mărimea porilor iar stabilitatea

mecanică și chimică a gelului crește [459].

Celulele de drojdie necesită o gamă largă de metale pentru proliferarea lor și pentru

metabolism. Ionii metalici au un impact semnificativ asupra unor parametri importanți:

viteza de conversie a zahărului în etanol, în randamentul final în etanol, creșterea și

multiplicarea drojdiei, viabilitatea celulara, factorii de stres și comportamentul de floculare a

drojdiei. [11]. Cationii Mg2+

și Zn2+

sunt cofactori pentru multe enzime glicolitice și

constituie modulatori la factorii de stres pentru drojdie: fluctuații rapide de temperatură,

presiune osmotică ridicată, concentrația crescută în etanol și lipsa nutrienților care afectează

în mod negativ metabolismul celulelor de drojdie și poate rezulta astfel un proces de

fermentare ineficient. [14, 15].

Mg are un rol important în reglarea metabolismului celulei de drojdie, in

menținerea integrității structurale și funcționalității organitelor intracelulare induse de

interacțiunile celulă-celulă cum ar fi flocularea, reglarea expresiei genelor, mecanismul de

absorbție a nutrienților, activarea enzimelor implicate în metabolism [28, 31]

Zincul are rol de activator enzimatic al alcoologenazei și al dehidrogenazei,

stimulează absorbția de maltoză și maltotrioză în procesele de obținere a drojdiei, permițând

obținerea unor randamente mari în fermentare. De asemenea, el are un rol benefic asupra

stabilității și dinamicii membranei celulare.

Calciul protejează, de asemenea, celulele de drojdie împotriva efectelor toxice

produse de etanol. Dacă se utilizează în concentrații mari, pot înlocui magneziul și conduce

la o creștere celulară și păstrarea viabilității celulare; totodată, are un efect tampon

împiedicând creșterea pH-ului în mediu și favorizând creșterea randamentului de

transformare a glucozei.

Puține lucrări tratând obținerea de imobilizate de drojdie prin gelifierea ionotropă a

unor polizaharide anionice au abordat utilizarea unor amestecuri de astfel de polimeri. De

asemenea, puține studii discută, comparativ, rezultatele obținute în utilizarea celor tipuri de

cationi meralici amintiți mai sus.

Cercetarea intreprinsa de noi are ca scop imobilizarea celulelor de drojdie in matrici

obținută din amestecul a trei polizaharide: gelan, i-caragenan și CMCNa, prin metoda

gelifierii ionotrope prin extrudere utilizând ca agenți de reticulare acetatul de calciu, acetatul

Page 195: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

194

de magneziu și acetatul de zinc. Caracterul original constă pe de o parte în utilizarea

amestecului de trei polizaharide în preparea matricei pentru imobilizarea celulelor precum și

in utilizarea a trei agenți de reticulare diferiți. Utilizarea amestecului celor trei polizaharide

este justificată de următoarele considerente.

Gelanul poate genera singur particule prin gelifiere ionotropă, dar nu conferă o

porozitate adecvată. CMCNa are rolul de a crește gradul de reticulare al particulelor datorită

numărului mai mare de grupe carboxilat conținute. Caragenanul participă la reticulare prin

grupele –SO3H dar imprimă și porozitate ridicată particulelor facilitând difuzia substratului

și a produșilor de reacție. S-a studiat, în consecință, influența raportului dintre cei trei

polimeri asupra caracteristicilor fizico-chimice și morfologice, respectiv a capacității de

fermentare a bioreactoarelor formate prin imobilizarea celulelor de drojdie în matricile

sferice formate pe baza amestecului celor trei polizaharide.

Pe baza informațiilor din literatură privind capacitatea diferită de reticulare a unor

cationi metalici divalenti, precum și influența acestora asupra proliferării celulelor de

drojdie, s-a studiat influenta a trei cationi metalici (Mg2+

, Ca2+

, Zn2+

) asupra caracteristicile

fizico-chimice ale particulelor cât, mai ales, asupra activității fermentative a bioreactoarelor

obținute.

Polizaharidele selectate pentru acest studiu au caracter de polianion, și în consecință

capacitatea de gelifiere ionotropă, respectiv de formare a unor rețele cu caracter de hidrogel,

datorită caracterului lor puternic hidrofil. Teste preliminare au condus la concluzia ca

gelanul în amestec cu i-caragenanul formează în prezența cationilor bivalenți o rețea

polimerică interconectată cu o porozitate mare. Celulele de drojdie incluse în particule

difuzează din matrice într-un numar mare în mediul în care sunt păstrate, iar particulele de

imobilizat devin instabile în timp. Pentru a crea o rețea polimerică, mai stabilă și mai densă

astfel încât celulele de drojdie să fie bine fixate în matrice, s-a optat pentru utilizarea

suplimentară a CMCNa cu masă moleculară mai redusă, care conține numeroase grupări

carboxilice și poate genera împreună cu gelanul și caragenanul, prin gelifiere ionotropă,

rețele polimerice interconectate mai stabile structural. Imobilizarea celulelor de drojdie în

matricea de polizaharide are la bază fixarea acestora în ochiurile rețelei obținute prin

reticularea ionică a lanțurilor polimere, ca urmare a legării cationilor metalici la anionii

carboxilat ai gelanului, ai CMCNa și la grupările sulfat acid din caragenan. Utilizând

amestecuri ale celor trei polizaharide se formează o rețea interconectata, stabilă, cu o

porozitate adecvată care permite o difuzie optimă a nutrienților în matricea polimeră astfel

încât viabilitatea celulară să fie păstrată în timp. Structura schematică a unei astfel de rețele

Page 196: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

195

este prezentată în figura 67. Celulele de drojdie, cu sarcina electrică negativă în suprafață se

pot lega de ionii de Me2+

consolidând astfel structura rețelei polimere.

Figura 67. Reprezentare schematică a matricei polimere

conținând celule de drojdie imobilizate.

Studii sistematice anterioare [443] au permis să se stabilească faptul că în cazul

utilizării gelanului ca matrice, concentrația optimă a soluțiilor de (CH3COO)2Ca si

(CH3COO)2Mg în baia de reticulare este de (2,1x10-1

M) astfel încât pentru obținerea tuturor

particulelor s-a utilizat această valoare. Incercări preliminare de reticulare cu (CH3COO)2Zn

la aceeași concentrație au condus însă la imobilizate incapabile, practic, să declanșeze

procesul de fermentare. Explicația este datorată faptului că densitatea rețelei este mult prea

ridicată, datorată participării Zn (metal tranzitional) la reticulare nu numai prin legături

ionice, ci și coordinative. Randamente și viteze de fermentare comparabile cu ale

imobilizatelor realizate în prezența ionilor de Ca și Mg (metale din grupa II-a principală), s-

au obținut pentru concentrații ale ionilor de Zn cu un ordin de mărime mai redus, motiv

pentru care reticularea cu acest cation s-a realizat la o concentrație a (CH3COO)2Zn de 1.1 x

10-2

M (respectiv 0,2%). Concentrațiile celor trei cationi au fost diferite și în preextrudat:

0.028 M pentru acetații de Ca și Mg, respectiv 1,1 x 10-3

M pentru sarea de Zn.

Concentrațiile diferite ale cationilor se justifică și din alt motiv: celulele de drojdie

necesită pentru o creștere optimă o cantitate mai mare de magneziu și calciu, în timp ce ionii

de zinc sunt necesari în cantități foarte mici. [73]

Pentru obținerea particulelor de Gel\CMCNa\Car reticulate ionic cu Ac2Ca, Ac2Mg

si Ac2Zn au fost utilizate diferite rapoarte masice ale polimerilor, programul experimental

complet fiind prezentat în Tabelul 35.

Tabel 35. Programul experimental

Page 197: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

196

Proba Gel

% Car %

CMCNa

%

Concentrația agentului de

reticulare din preextrudat,

M*

Concentrația de agent de

reticulare din baia de

extrudere, M**

Ac2Mg Ac2Ca Ac2Zn Ac2Mg Ac2Ca Ac2Zn

D1 40 30 30

2,8

x10-2

2,8x10

-2

1,1x10

-3

2,1x10

-1

2,1x10

-1

1,1x10

-2

D2 40 20 40

D3 20 40 40

D4 33 33 33

*Volumul de soluție de reticulant în preextrudat - 1,25 ml; **volumul de soluție de

reticulant în baia de gelifiere - 125 ml.

Particulele cu celule de drojdie imobilizate au același raport masic între polimeri și

au fost obținute în aceleași condiții. Pentru a le diferenția față de cele fără celule de drojdie

au fost codificate cu D1Y, D2Y, D3Y și D4Y. Toate particulele obținute sunt sferice și au

diametrul mediu de 2-3 cm.

6.5.1. Caracterizarea particulelor prin spectroscopie FTIR-ATR

Spectroscopia FTIR a fost utilizată pentru a stabili prezența polizaharidelor ăîn

particulele obținute. S-au înregistrat spectrele IR pentru cei trei polimeri (Gel, Car, CMCNa)

și spectrele pentru particulele obținute, reticulate cu Ac2Ca și Ac2Zn.

Figura 68 prezintă spectrele FTIR inregistrate.

(a) (b)

Page 198: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

197

(c) (d)

(e)

Figura 68. Spectrele FTIR pentru:(a) Gel, (b) Car, (c) CMCNa și pentru particulele

obținute din amestecul cu cei trei polimeri reticulate cu (d) acetat de calciu și (e) acetat de

zinc.

Spectrele FTIR atestă calitativ prezența fiecărei polizaharide în compoziția

particulelor. Astfel banda de la 1052,9 cm-1

este specifică grupării HSO3- prezentă în

caragenan. Benzile de la 1029,4 (specifică grupării CH-OH-alcooli ciclici), 1409,4

(specifică grupării OH din gruparea carboxilică) și 1604 (specifică sărurilor acizilor

carboxilici) atestă prezența în particule a gelanului și a CMCNa ale căror spectre sunt practic

identice nepermițând diferențierea lor. Concluzii similare se obțin prin analiza spectrului IR

al particulelor reticulate cu acetat de zinc unde semnalele benzilor menționate anterior se

regăsesc ușor deplasate.

6.5.2. Stabilitatea în timp a particulelor fără celule de drojdie în diferite medii

(apoase)

Pentru ca particulele să poată fi utilizate în procese fermentative repetate este

important ca stabilitatea lor să fie testată în diferite medii apoase.

Asa cum s-a menționat în secțiunea „Metode de caracterizare‖, din particulele mai

puțin stabile se pot detașa fragmente de polimer ce pot difuza din matrice în soluția în care

sunt păstrate determinând creșterea turbidității acesteia. Rezultatele măsurătorilor de

Page 199: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

198

transmitanță pentru particule fără celule imobilizate sunt prezentate în Tabelul 34. Pentru a

putea diferenția probele s-au adoptat următoarele notații: particulele reticulate cu acetat de

magneziu au fost codificate cu DiMg, particulele reticulate cu acetat de calciu au fost notate

cu DiCa și particulele reticulate cu acetat de zinc au fost notate cu DiZn (unde i- reprezintă

numărul probei)

Tabel 36. Valorile transmitanței pentru probele fără celule de drojdie determinată

după diferite perioade de păstrare în medii apoase.

Proba

Transmitanța , T %

în baia de

coagulare în apă bidistilată

12h 24 h. 12h 24h. 36h.

D1Mg 99,6 98,7 99 98,5 97,1

D2Mg 99,6 98,5 99,1 98,5 97,8

D3Mg 99,6 99,1 98,9 98 95,5

D4Mg 99,4 99,2 99,2 98,5 95,3

D1Ca 99,4 98,2 98,9 97,3 96

D2Ca 98,9 98,1 99,2 97,9 96,1

D3Ca 99,1 98,4 98,5 97,0 95,9

D4Ca 98,3 98 98,8 97,2 96,8

D1Zn 98,7 96,8 99,7 99 96,7

D2Zn 98,3 97,1 99,7 99,1 97,5

D3Zn 99,3 97,3 99,7 98,5 97,6

D4Zn 99,5 97,3 99,5 98,7 98,0

Se poate observa din tabel că valorile transmitanței sunt apropiate indiferent de

perioada de păstrare a particulelor în diferite soluții apoase. După 24 de ore de păstrare în

soluția de reticulare valorile transmitanței scad ușor, cele mai mici observându-se la

Page 200: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

199

particulele reticulate cu (CH3COO)2Zn. Pentru acestea, efectul poate fi datorat unei

densități de reticulare ușor inferioare celorlalte două rețele, ceea ce face ca macromolecule

mai scurte din straturile exterioare ale matricii să se desprinda din rețea mai ușor, difuzând

în mediul înconjurator.

Păstrate în apă bidistilată, toate particulele manifestă o ușoara scădere a

transmitanței în timp, evident mai mare dupa 36 ore. Surprinzător, particulele reticulate cu

(CH3COO)2Zn se dovedesc acum mai stabile, probabil datorită faptului că după

desprinderea unor lanțuri polimere din straturile exterioare în baia de coagulare, nu mai are

loc acest proces, miezul matricii fiind mai bine reticulat și deci mai stabil structural.

Valorile transmitanței nu variază foarte mult cu raportul între polimeri. Se poate

observa totuși că proba D2, indiferent de agentul de reticulare utilizat, are o valoare mai

mare a transmitanței decât D1. În cazul probei D3 unde concentrația de caragenan din

amestec este maximă se observă o tendință de scădere a valorii transmitanței în timp

comparativ cu celelalte probe. Creșterea cantității de caragenan în particule este posibil să

influențeze valorile transmitanței obținute deoarece poate determina creșterea porozității

acestora. In consecintă, crește absorbția de apă, ceea ce poate provoca tensiuni mai mari în

rețeaua polimeră, finalizate cu distrugerea sa parțiala și desprinderea unor fragmente de

macromolecule care determină reducerea ușoara a transmitanței.

Se poate aprecia, în concluzie, că valorile mari ale transmitanței atestă stabilitatea în

timp a particulelor fără celule de drojdie, în medii apoase, confirmând astfel rezultatele

anticipate pe baza studiilor anterioare raportate în subcapitolele 5.1-5.4.

6.5.3. Stabilitatea în timp a particulelor cu celule de drojdie imobilizate – evaluarea

concentrației de celule difuzate și a viabilității celulare

Pentru a determina dacă particulele cu celule de drojdie imobilizate sunt stabile în

medii apoase s-a determinat valoarea transmitanței, a concentrației de celule/ml și

viabilitatea celulară în soluția din baia de reticulare sau în apă bidistilată. Aceste

caracteristici au fost detrerminate după 12 ore, respectiv 24 de ore de păstrare a particulelor

în soluția de reticulare și după 12 ore, respectiv 24 ore de păstrare a particulelor în apă

bidistilată. Rezultatele obținute sunt prezentate în Tabelul 37.

Page 201: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

200

Tabel 37. Valoarea transmitanței și a viabilității celulare in diferite medii la câteva probe

analizate

Proba

Transmitanța, T%

Concentrația celulelor de

drojdie

(nr. celule/ml x 104)

Viabilitatea celulară, %

în baia de

reticulare

în apă

bidistilată

în baia de

reticulare

în apă

bidistilată

în baia de

reticulare

în apă

bidistilată

12h 24h 12h 24h 12h 24h 12h 24h 24h 12h 24h

D1Y Mg 96.6 93,2 99,1 98,3 6,75 8,5 2,75 5,25 94,44 95,45 93,62

D2Y Mg 96 94 98,8 98,3 14,75 19 7,25 9,5 96,2 95,83 94,64

D3Y Mg 95,9 94,3 98,2 96,9 10 14,7 9,75 14,5 96,72 96,67 96,59

D4Y Mg 96,5 94,7 98,8 97,5 9,75 13 5,25 7 96,3 96,55 92,68

D1Y Ca 98,2 96,5 99,3 98,5 13 17,2

5 4,25 7,5 95,34 95,45 95,24

D2Y Ca 97,3 95,6 99,3 98,4 22 30 3 7,5 96,7 94,74 93

D3Y Ca 93,5 92 98,7 96,8 40 50 25 33,7

5 95,24 94,33 93,1

D4Y Ca 96 94,7 98,9 96,9 13 15 3,25 9,5 95,24 96 94,33

D1Y Zn 98,9 96,5 99,7 98,6 13 17,2

5 1,75 8 95,83 87,5 86,5

D2Y Zn 98,5 98,4 99,5 99 22 30 3 5,75 95,23 92,3 88,46

D3Y Zn 95,7 90,5 95 86,5 25 35 12,5 20 93,3 94,33 90,91

D4Y Zn 98,6 98,5 97,9 95,3 13 15 3,25 11,7 92,3 92,85 92,16

Page 202: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

201

O primă constatare este aceea că valoarea transmitanței scade cu timpul de păstrare

în cele două medii apoase, dar se pastrează la valori destul de ridicate. Cea mai ridicată

stabilitate o au, în general, particulele reticulate cu Zn2+, chiar dacă (CH3COO)2Zn este

folosit într-o cantitate mult inferioară comparativ cu ceilalți cationi divalenți. Rezultatul

poate fi considerat o confirmare a ipotezei discutate într-un subcapitol anterior, că Zn2+

participă la formarea rețelei nu doar prin legare ionică, ci și coordinativă, formând structuri

stabile. O excepție o constituie proba D3YZn, care dupa 24 h de păstrare în soluția de

reticulare prezintă cea mai ridicată turbiditate, indicând o difuzie mai intensă a celulelor din

matricea polimeră. Explicația o poate constitui doar faptul că în compoziția acestei probe se

gasește cea mai mare cantitate de caragenan, care determină creșterea porozitătii matricei

polimere. Această ipoteză este confirmată de valorile mai mici ale transmitanței și pentru

celelalte probe D3Y. Particulele reticulate cu Mg evidențiază cele mai mici valori ale

transmitanței, probabil datorită faptului că Mg2+

este un element mai slab electropozitiv

decât Ca, astfel încât angajează legături ionice mai slabe ca tărie.

După 24 de ore de păstrare în apă bidistilată probele D3YZn și D4YZn au cele mai

mici valori ale transmitanței comparativ cu aceleași probe reticulate cu (CH3COO)2Mg sau

(CH3COO)2Ca, probabil tot datorită porozității mai mari induse de caragenan; efectul este

același la probele reticulate cu Ca si Mg, conținând cantități mai ridicate de caragenan.

Dacă transmitanța ar fi influențată doar de creșterea porozității din particule, ar

trebui să varieze în următoarea ordine:

T% : D2Y> T% D1Y>T% D4Y>T% D3Y

Pentru majoritatea probelor analizate, indiferent de agentul de reticulare utilizat,

valorile transmitanței variază în această ordine.

Concentrația de celule de drojdie în mediile apoase în care sunt suspendate

particulele de imobilizat se corelează, în general, cu valorile transmitanței soluțiilor în care

difuzează. Ea crește cu durata de păstrare a imobilizatului în mediul lichid, și prezintă cele

mai ridicate valori la probele care au cantități mai mari de caragenan în compoziție (D3Y,

D4Y).

Probele D2Y conțin cea mai redusă cantitate de caragenan; teoretic ar trebui ca și

concentrația de celule care difuzează din particule să fie cea mai mică. Numărul de grupe

carboxilat este însă cel mai mare datorită cantității ridicate de CMCNa, astfel încât gradul de

reticulare este mai mare iar difuzia celulelor prin martricea polimeră este redusă.

Concentrația de celule în ambele medii apoase crește cu durata, efect absolut normal. Se

Page 203: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

202

constată însă că în baia de reticulare regăsim concentrații mai mari de celule decât în apă

bidistilată.

Valorile transmitanței în cazul păstrării particulelor în apă bidistilată, deși variază în

același mod ca și în cazul păstrării în mediul de reticulare, sunt totuși mai coborâte. Efectul

este explicabil prin faptul ca păstrarea în apă se face dupa 24 ore de păstrare în baia de

reticulare, când multe dintre celulele mai slab prinse în rețea au difuzat deja în exterior. De

remarcat însa că și în apă bidistilată trendul de variație a concentrației celulelor difuzate este

același ca în baia de reticulare.

Scopul determinării viabilității celulare în mediile în care particulele au fost

păstrare a fost acela de a determina dacă matricea polimeră poate păstra viabilitatea celulară

o perioadă mai mare de timp. Valorile mari ale viabilității celulare, care variază între 86,5%

și 96,59% atestă faptul că matricea polimeră poate păstra viabilitatea celulară la valori

optime în timp.

6.5.4.Capacitatea particulelor de a reține apa

Comportamentul în apă al particulelor sferice de gelan/i-caragenan/CMCNa cu și

fără celule de drojdie, s-a evaluat prin gradul de umflare (Q %). Acesta poate da informații

asupra densității de reticulare a rețelei, respectiv a capacității matricei polimere de a permite

difuzia substratului și a produșilor de fermentare. În figura 69 este prezentată variația în timp

a gradului de umflare pentru toate probele obținute.

(a) (b)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 5 10 15

Sw

elli

ng

deg

ree,

Q%

Time (h)

D1 MgD2 MgD3 MgD4 Mg

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30

Sw

ell

ing

deg

ree, Q

%

Time (h)

D1D Mg

D2D Mg

D3D Mg

D4D Mg

Page 204: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

203

(c) (d)

(e) (f)

Figura 69. Variația în timp a gradului de umflare pentru probele obținute: (a) probe fără

celule de drojdie reticulate cu (CH3COO)2Mg, (b) probe cu celule de drojdie imobilizată

reticulate cu (CH3COO)2Mg, (c) probe fără celule de drojdie reticulate cu (CH3COO)2Ca,

(d) probe cu celule de drojdie imobilizată reticulate cu (CH3COO)2Ca, (e) probe fără celule

de drojdie reticulate cu (CH3COO)2Zn, (f) probe cu celule de drojdie imobilizată reticulate

cu (CH3COO)2Zn.

O primă constatare este aceea că variația gradului de umflare în timp depinde de

cantitatea de caragenan din amestecul de polimeri. Astfel, în majoritatea cazurilor analizate,

cu cât aceasta crește, cu atât valoarea Q crește, efect evident datorat creșterii porozitătii

particulelor, care pot reține cantități de aă nu doar în matricea reticulată ci și în pori. Ordinea

de variație a Q, atât pentru particule cu și fără drojdie, indiferent de agentul de reticulare

utilizat este următoarea:

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 10 20 30

D1Ca

D2Ca

D3Ca

D4Ca

Sw

elli

ng

deg

ree,

Q%

Time (h)

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20

D1D Ca

D2D Ca

D3D Ca

D4D Ca

Sw

elli

ng

deg

ree,

Q%

Time (h)

-100

100

300

500

700

900

1100

0 10 20 30

Sw

elli

ng

deg

ree,

Q %

Time(h)

D1 Zn

D2 Zn

D3 Zn

D4 Zn

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30

Sw

elli

ng

deg

ree,

Q %

Time (h)

D1D Zn

D2D Zn

D3D Zn

D4D Zn

Page 205: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

204

QD3>QD1>QD4>QD2

Valoarea gradului de umflare este determinată și de gradul de reticulare al

particulelor, respectiv de numărul de grupe anionice (carboxilat, sulfat) participante la

formarea legăturilor ionice cu metalul. Se explică astfel că proba D2 prezintă, indiferent de

reticulantul folosit, cea mai mică valoare a Q: ea conține cantitatea maximă de CMCNa

(care crește densitatea de reticulare) și minimă de caragenan (care crește porozitatea).

Probele D1, care conțin cantități mai mici de CMCNa dar mai ridicate de caragenan, au

valori ale Q mai ridicate, consecință a două efecte acționând în același sens: grad de

reticulare mai redus și porozitate mai ridicată. Atât la probele fără drojdie cât și la cele care

conțin celule de drojdie valoarea gradului de umflare depinde și de tipul de agent de

reticulare utilizat; considerând acest criteriu, gradul de umflare variază în ordinea:

QMg2+>QZn2+>QCa2+

Este cunoscut faptul că cationii de Ca2+

determină obținerea de geluri mai puternice

decât cele obținute cu Mg2+

[276]. Concentrația utilizată pentru (CH3COO)2Zn în baia de

reticulare a fost mult mai redusă (de ordinul 10-2 M) dar suficientă pentru a asigura un grad

de reticulare comparabil cu cel realizat de ceilalți cationi divalenți, datorită implicării ionului

de Zn2+

și în reacții de complexare; cantități mai mari din acest reticulant pot deveni toxice

pentru celule [32].

Pentru probele care conțin celule de drojdie valoarea gradului de umflare este mai

mică comparativ cu particulele fără celule de drojdie. Se cunoaște faptul că ionii metalici pot

adera la membrana celulară oferind acesteia mai multă rezistență [52, 565] iar prin legăturile

formate cu celulele de drojdie se poate produce o reticulare suplimentară a particulelor,

determinând un grad mai ridicat de reticulare.

6.5.5. Morfologia particulelor

Fotografiile realizate prin microscopie electronică de baleiaj evidențiază morfologia

particulelor cu celule de drojdie. A fost selectată pentru analiză proba D4Y reticulată cu cei

trei cationi, deoarece polimerii constituenți participă în aceeași proporție. În figura 70 sunt

prezentate fotografiile de microscopie electronică.

Page 206: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

205

D4Y Mg D4Y Ca D4Y Zn

Page 207: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

206

Figura 70. Fotografii efectuate prin microscopie electronică de baleiaj pentru proba D4Y

utilizând ca agenți de reticulare (CH3COO)2Mg, (CH3COO)2Ca și (CH3COO)2Zn.

Fotografiile de microscopie electronică de baleiaj au fost efectuate în secțiune

transversală și evidențiază faptul că celulele se află în număr mare în particule și sunt bine

prinse în rețeaua polimeră. Particulele prezintă o porozitate adecvată care ar permite

schimbul de nutrienți între celule și mediul de fermentare. Cationii metalici utilizați pot

influența gradul de reticulare al particulelor. Morfologia indusă de Ca2+

este mai densă ceea

ce ar putea fi o consecință a unui grad de reticulare mai mare. Particulele reticulate cu Mg2+

prezintă o porozitate mai mare, rețeaua este mai puțin densă determinată și de un grad de

reticulare mai mic în comparație cu proba reticulată cu ioni de calciu. Particulele reticulate

cu ioni de Zn2+

prezintă o densitate comparabilă cu cele reticulate cu Ca2+, chiar dacă

concentrația reticulantului este cu un ordin de mărime mai mic decât în celelalte două

cazuri; efectul a fost explicat anterior.

Morfologia particulelor este în concordanță cu rezultatele prezentate anterior.

6.5.6.Testarea activității fermentative a imobilizatelor

Particulele formate din celulele de drojdie imobilizate în matricea amestecului celor

trei polizaharide, constituind adevărate bioreactoare, au fost testate din punct de vedere al

capacităț de fermentare a glucozei, dar șidin punct de vedere al capacitatii de a menție

viabilitatea celulelor imobilizate sau chiar de a permite proliferarea lor.

Deși nu este considerat un factor critic, care afectează performanța în fermentare,

pH-ul joacă un rol important în asimilarea cationilor metalici de către celule de drojdie în

timpul procesului de fermentare. S-au făcut cercetări asupra influenței pH-ului în procesele

fermentative și s-a observat că are un rol esențial în legarea cationilor metalici în locurile de

absorbție de pe peretele celular. Cercetările anterioare raportează un pH optim pentru mediul

de fermentare ca fiind 4,5-5[57, 563, 566] In consecință, pH-ul soluției de glucoză dizolvată

Page 208: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

207

în diferite concentrații de reticulant introdus în baia de fermentare a fost reglat la valoarea

pH=5.

Testarea activității fermentative pentru toate probele a condus la randamente

ridicate, comparabile cu drojdia liberă. Au fost efectuate câte 10 cicluri fermentative pentru

fiecare probă, iar după fiecare ciclu de fermentare, acestea au fost spălate și păstrate la

frigider la temperatura de 4-6˚C până la efectuarea următorului ciclu. Figura 71 prezintă

variația randamentelor de fermentare în timp pentru cele 4 probe D1Y, D2Y, D3Y și D4Y

reticulate cu acetat de magneziu.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 71. Variația randamentului de fermentare a glucozei în timp pentru mai multe cicluri

de fermentare diferite (notate de la I la X) pentru probe reticulate cu (CH3COO)2Mg : (a)

D1Y, (b) D2Y, (c) D3Y, (d) D4Y. Randamentele obținute după fiecare ciclu de fermentare

au fost comparate cu randamentul obținut la fermentarea drojdiei libere (notația 0 in figuri).

0

10

20

30

40

50

60

70

0 100 200 300

Yie

ld i

n f

erm

ente

d g

luco

se,

η%

Time (min)

D2Y Mg

I

II

IV

VI

IX

X

0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 100 200 300

Yie

ld i

n f

erm

ente

d g

luco

se,

η %

Time (min)

D3Y Mg

I

III

V

VI

VIII

X

00

10

20

30

40

50

60

70

0 100 200 300

Yie

ld i

n f

erm

ente

d g

luco

se,

η %

Time (min)

D4Y Mg

I

III

V

VIII

X

0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 100 200 300

Yie

ld i

n f

erm

ente

d g

luco

se,

η%

Time (min)

D1Y Mg

IIIIVVIVIIIX0

Page 209: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

208

Este cunoscut faptul că ionul Mg2+

constituie cam 0,3% din întreaga masă de

drojdie uscată și activează peste 300 de enzime. Menținerea integrității celulare, ceea ce

include stabilizarea structurală a acizilor nucleici, a polinucleotidelor, a cromozomilor,

polizaharidelor și lipidelor au fost atribuite magneziului.[12, 22, 27, 33, 48, ]

Se constată că pentru toate cele 4 probe randamentele în fermentare sunt apropiate

între ele și sunt mai mari decât cel obținut la fermentarea drojdiei libere. Valorile cele mai

mari au fost obținute cu probele D3Y și D4Y, care prezintă și valorile cele mai ridicate ale

gradului de umflare. Există deci o legatură directă între capacitatea de umflare a particulelor

în medii apoase și capacitatea de fermentare, explicată prin difuzia mai accentuată a

substratului și a produșilor rezultați prin matricile mai puțin reticulate. Se observă că

eficiența în fermentare scade în timp de la un ciclu la altul dar are totuși o valoare superioară

celei obținute la fermentarea cu drojdie liberă.

Pentru particulele D3Y și D4Y reticulate cu (CH3COO)2Ca s-au putut realiza, de

asemenea, 10 cicluri de fermentare, valoarea randamentelor fiind ridicată, comparabilă în

majoritatea cazurilor cu cele obținute cu particulele reticulate cu Mg2+

.

În schimb, pentru cele reticulate cu (CH3COO)2Zn s-au putut realiza doar 4 cicluri

de fermentare pentru proba D3Y și 8 cicluri de fermentare pentru proba D4Y. Proba pentru

care s-au obținut cele mai puține cicluri fermentative (care conține 0,4% caragenan, 0,2%

gelan și 0,4 % CMCNa) conține mai multe grupe funcționale reticulabile în comparație cu

proba D4Y, ceea ce conduce la o cerință mai mare de ioni de zinc pentru reticulare.

Cercetările efectuate anterior asupra influenței ionilor metalici asupra proceselor

fermentative afirmă faptul că ocazional deficiența unor minerale din mediul de fermentare

poate afecta negativ procesul de fermentare în prezența drojdiei. Zincul este un element

foarte important în procesele fermentative deoarece are rol de activator enzimatic al alcool

dehidrogenazei iar un mediu deficient în zinc poate conduce la încetinirea sau la un proces

incomplet de fermentare [51]. În consecință, chiar dacă gradul de reticulare al particulelor și

stabilitatea lor structurală sunt comparabile cu probele reticulate cu Ca2+ și Mg

2+, cantitatea

de Zn2+

este totuși insuficientă pentru a asigura procese repetate de fermentare.

Figura 72 prezintă o comparație între valoarea maximă a randamentelor în

fermentare obținute pentru probele D3Y și D4Y reticulate cu (CH3COO)2Ca,

(CH3COO)2Mg și (CH3COO)2Zn. În fig.72a sunt comparate doar randamentele de

fermentare pentru proba D3Y obținută prin reticulare cu (CH3COO)2Mg și (CH3COO)2Ca

la care au putut fi realizate 10 cicluri fermentative. Pentru particulele de tip D4Y obținute

Page 210: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

209

prin utilizarea celor trei agenți de reticulare sunt prezentate valorile randamentelor de la 8

cicluri de fermentare (Fig.72 b).

(a) (b)

Figura 72. Comparație între valoarea maximă a randamentelor de fermentare a glucozei în

prezența drojdiei libere (0), respectiv a drojdiei imobilizate în particule de tip D3Y și D4Y

reticulate cu diferiți ioni metalici: (a) proba D3Y reticulată cu (CH3COO)2Ca (D3Y Ca) și

(CH3COO)2Mg (D3Y Mg), (b) proba D4Y reticulată cu (CH3COO)2Ca (D4Y Ca),

(CH3COO)2Mg (D4Y Mg) și (CH3COO)2Zn (D4Y Zn).

Se poate constata (fig.72a) că eficiența în fermentare a probelor reticulate cu

(CH3COO)2Mg este comparabilă cu eficiența în fermentare obținută la probele reticulate cu

(CH3COO)2Ca.

Ionii de Ca2+

au rol în protejarea celulelor de drojdie împotriva efectelor toxice ale

etanolului la fel ca și ionii de Zn2+

și Mg2+. Datorită efectului antagonist al magneziului,

efectele pozitive asupra proliferării celulare în momentul suplimentării mediului cu ioni de

Ca2+

pot fi compromise. De aceea suplimentarea cu ioni de Ca2+

trebuie efectuată cu grijă.

Poate fi benefică doar în unele cazuri și anume: dacă ionii de calciu sunt suplimentați în

concentrații mari pot înlocui magneziul într-o serie de căi biochimice, dar aceasta poate duce

în timp la deteriorarea celulei [31, 63, 84, 567].

Randamentele în fermentare obținute pentru probele reticulate cu (CH3COO)2Mg

sunt superioare în comparație cu randamentele obținute pentru aceleași probe reticulate cu

(CH3COO)2Ca. Aceasta poate fi o consecință a faptului că celulele de drojdie au o cerință

mai mare pentru Mg2+

decât pentru Ca2+

așa cum menționează și Elizabeth M. R. Rees and

0

20

40

60

80

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0

Yie

ld i

n f

erm

ente

d g

luco

se,

η %

Number of fermentation cycles

D3Y Mg

D3Y Ca

0

20

40

60

80

1 2 3 4 5 6 7 8 0Y

ield

in

fer

men

ted

glu

cose

,

η %

Number of fermentation cycles

D4Y Mg D4Y Ca D4Y Zn

Page 211: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

210

Graham G. Stewart (1997) [48]. Totodată, particulele reticulate cu Mg2+

prezintă capacitate

mai mare de umflare în apă, deci o difuzie mai accentuată a substratului și produșilor de

reacție prin matricea polimeră. Obținerea randamentelor în fermentare comparabile la

fiecare ciclu de fermentare pentru probele D3Y și D4Y reticulate cu Mg2+

si Ca2+

poate fi un

rezultat al schimbului eficient de nutrienți între mediul de fermentare și celulele imobilizate.

Începând cu ciclul 9 de fermentare apare însă o tendință de scădere a randamentelor. După

cum vom prezenta ulterior, ea este determinată de scăderea numărului și a viabilității

celulelor rămase în matricea polimeră după fiecare ciclu de fermentare.

Pentru proba D4YZn, figura 72 b demonstreaza că la primul ciclu de fermentare se

obține un randament maxim care depășește pe cel corespunzatoare probei D4YCa și este

aproape egal cu randamentul obținut de proba D4YMg. Randamentul scade apoi începând

cu ciclul 2 până la ciclul 8 după care fermentarea se oprește; excepție face ciclul 4 unde se

înregistrează, surpinzător, o creștere a acestuia. După cum s-a afirmat anterior, explicația se

poate datora deficienței în ioni de Zn2+. O caracterizare completă a fost efectuată pentru

toate tipurile de particule D4 deoarece analizele anterioare arătat că sunt stabile iar valorile

randamentelor în fermentare obținute sunt superioare celorlalte probe.

În figura 73 este prezentată evoluția în timp a eficienței fermentării pentru probele

D4YMg, D4YCa și D4YZn, pentru primele 8 cicluri de fermentare comparând randamentele

obținute cu randamentul rezultat la fermentarea drojdiei libere.

(a) (b)

0

10

20

30

40

50

60

70

0 100 200 300

Yie

ld i

n f

erm

ente

d g

luco

se,

η %

Time (min)

I D4Y Mg

I D4Y Ca

I D4Y Zn

0 0

10

20

30

40

50

60

70

0 100 200 300

Yie

ld i

n f

erm

ente

d g

luco

se,

η %

Time (min)

II D4Y Mg

II D4Y Ca

II D4Y Zn

0

Page 212: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

211

(c) (d)

(e) (f)

(g) (h)

Figura 73. Evoluția în timp a randamentului de transformare a glucozei pentru probele D4Y

Mg, D4Y Ca și D4Y Zn, în diferite cicluri de fermentare: (a) - ciclul 1; (b) – ciclul 2; (c) –

ciclul 3; (d) – ciclul 4; (e) – ciclul 5; (f) – ciclul 6; (g) – ciclul 7; (h) – ciclul 8, comparativ

cu randamentul obținut la fermerntarea cu drojdie liberă (T= 30˚C, durata unui ciclu

fermentativ: 255 min).

Se constată că randamentele în fermentare pentru probele D4YMg și D4YCa au

valori foarte apropiate și variază foarte puțin de la un ciclu la altul. În schimb, pentru proba

0

10

20

30

40

50

60

70

0 100 200 300

Yie

ld i

n f

erm

ente

d

glu

cose

, η

%

Time (min)

III D4Y MgIII D4Y CaIII D4Y Zn0 0

10

20

30

40

50

60

70

0 100 200 300

Yie

ld i

n f

erm

ente

d

glu

cose

, η

%

Time (min)

IV D4Y MgIV D4Y CaIV D4Y Zn0

0

10

20

30

40

50

60

70

0 100 200 300

Yie

ld i

n f

erm

ente

d

glu

cose

, η

%

Time (min)

V D4Y MgV D4Y CaV D4Y Zn

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 100 200 300

Yie

ld i

n f

erm

ente

d

glu

cose

, η

%

Time (min)

VI D4Y Mg

VI D4Y Ca

VI D4Y Zn

0

10

20

30

40

50

60

70

0 100 200 300

Yie

ld i

n f

erm

ente

d g

luco

se,

η %

Time (min)

VII D4Y

MgVII D4Y

Ca 0

10

20

30

40

50

60

70

0 100 200 300

Yie

ld i

n f

erm

ente

d

glu

cose

,

η %

Time (min)

VIII D4Y MgVIII D4Y CaVIII D4Y Zn0

Page 213: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

212

D4YZn eficiența fermentării scade cu numărul de cicluri, efect explicat anterior. Valorile

ridicate ale randamentelor în fermentare și faptul că se păstrează aproape constante pentru

multe cicluri de fermentare ne-au condus la concluzia că schimbul dintre mediul de

fermentare și celulele imobilizate se realizează eficient. Matricea D4Y, care conține

proporții egale ale celor 3 polizaharide, este pe de o parte suficient de poroasă datorită

cantității destul de ridicate de caragenan, dar și suficient de stabilă structural datorită

numărului ridicat de grupe carboxilice participante la reticulare. Acest echilibru explică

difuzia mai facilă a diferitelor specii moleculare prin matrice, dar și stabilitatea sa mecanică

ce îi permite utilizarea în cicluri repetate de fermentare fără a se dezintegra.

6.5.7. Evaluarea viabilității celulare și a cantității de celule din particule după

fiecare ciclu de fermentare

Pentru ca procesul de fermentare să poată avea loc în mai multe cicluri fermentative

și pentru a obține o eficiență bună în fermentare, ideal este ca celulele de drojdie să

prolifereze în interiorul matricei polimere. Pentru a stabili dacă se produce acest efect și

pentru a determina influența ionilor metalici asupra proliferării celulare polimere au fost

utilizate particulele de tip D4Y. După fiecare ciclu de fermentare o cantitate de particule cu

celule de drojdie în dispersie apoasă (100 ml) a fost dezintegrată mecanic cu ajutorul unui

ultraturax pană la obținerea unei suspensii omogene. Prin tehnica indicata la „mod de lucru‖

s-a stabilit numărul de celule de drojdie din suspensie, respectiv din particulele ce le-au

conținut. Viabilitatea celulară și numărul de celule dintr-un gram de particule sunt prezentate

în Tabelul 38.

Tabel 38. Viabilitatea celulară și numărul de celule/gram de particule

Numărul

ciclului de

fermentare

Numărul de celule x 10-8

/g

particule

Viabililitatea celulară, Vc

%

D4Y

Mg

D4Y

Ca

D4Y

Zn

D4Y

Mg

D4Y

Ca

D4Y

Zn

0* 4,65 5,14 4,41 95,93 96,51 97,08

I 5,23 5,91 5,47 95,92 94,54 96,48

VI 7,81 8,74 9,44 95 94,7 92,15

VIII 7,35 7,55 8,8 94,32 94,05 91,98

Page 214: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

213

X 8,21 6,91 7,54 92,95 88,61 87,79

Viabilitatea celulară la particulele analizate scade ușor de la un ciclu de fermentare

la altul dar se păstrează la valori ridicate ceea ce indică faptul că matricea polimeră

protejează destul de eficient celulele. Raymond și colab. (2004) au imobilizat celule de

drojdie în particule de k-caragenan acoperite cu chitosan, determinând viabilitatea celulară și

numărul de celule din acestea și concluzionând că celulele proliferează în interiorul

particulelor. Callone și colab. (2008) au determinat numărul de celule din particule de

alginat acoperite cu un strat de silice constatând, de asemenea, că celulele proliferează.[14,

415]

Figura 74. prezintă evoluția cantității de celule/g particule funcție de numărul

ciclului de fermentare pentru proba D4Y comparativ cu randamentul maxim obținut după

fiecare ciclu de fermentare.

(a) (b)

(c)

0

30

60

0 20 40 60

Fermentation time (h)

D4Y Mg

Quantity of yeast cellsfrom particles, mgYield obtained aftereach fermentation cyles 0

30

60

0 20 40 60

Fermentation time (h)

D4Y Ca

Yield obtained after eachfermentation cycle

0

30

60

0 10 20 30 40

Fermentation time (h)

D4Y Zn

Quantity of yeast cellsfrom 1 g of particles, mg

Page 215: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

214

Figura 74. Evoluția în timp a cantitații de celule din particule funcție de numărul de cicluri

de fermentare pentru proba D4Y reticulată cu: (a) (CH3COO)2Mg, (b) (CH3COO)2Ca și (c)

(CH3COO)2Zn

Este evident că celulele de drojdie proliferează în interiorul particulelor analizate.

Pentru particulele D4YMg cantitatea de celulele de drojdie înainte de fermentare

este de 17,21 mg/g si crește constant de la un ciclu de fermentare la altul până după ciclul 8,

când aceasta atinge 36,55mg/g particule. O scădere apare după ciclul 8 de fermentare,

urmată apoi de o usoară tendință de creștere. Valoarea maximă a randamentului în

fermentare urmează practic aceeași evoluție până la ciclul 8 (când se înregistrează un

maxim), în perfectă concordanța cu evoluția cantității de celule din particule. După ciclul 8

însă, randamentul maxim continuă să scadă ușor, aparent discordant față de modul de

variație a cantității de celule. Analizând însă aceste rezultate în corelare cu tabelul 2,

explicația devine evidentă: chiar dacă numărul total de celule în particule crește după ciclul

8, numărul de celule vii scade, explicând randamentele mai mici de fermentare.

O foarte bună concordanță între cele două mărimi analizate este evidențiată în cazul

D4YCa, la care numărul inițial de celule de drojdie este de 18,98 mg/g particule. Cantitatea

de celule de drojdie crește până după ciclul 6 de (31,4 mg celule/g particule), după ciclul 7

având tendința să scadă. Similar variază randamentul maxim de fermentare.

Pentru proba D4Y Zn rezultatele sunt relativ diferite. Cantitatea de celule crește de

la un ciclu de fermentare la altul devenind practic constantă după ciclul 7. Randamentele de

fermentare scad însă continuu, exceptând ciclul 4 la care se înregistrează un maxim. Pentru

ultimele cicluri de fermentare explicația poate fi datorată, de asemenea, scăderii viabilității

celulare, în ciuda proliferării sau păstrarii constante a cantității de celule. Cercetările asupra

influenței ionului de zinc asupra proceselor fermentative pentru fabricarea berii arată că

suplimentarea cu ioni de zinc a mustului de bere conduce la intensificarea floculării,

determinata probabil de legarea sa de pereții celulari ai celulelor. Taylor și Orton au arătat că

zincul inhibă flocularea doar când se găsește în mediu în concentrații foarte mari [568, 569].

Prin urmare, în interiorul particulelor D4YZn celulele pot crea aglomerate care nu permit un

schimb eficient de nutrienți, ceea ce duce la scăderea productivității în etanol. De altfel,

fotografiile de microscopie electronică de baleiaj din fig. 4 sugerează o tendintă mai mare de

aglomerare a celulelor în cazul matricilor reticulate cu Zn2+. Ionii de zinc pot avea două

efecte contrare: pe de o parte conduc la creșterea numărului de celule de drojdie în interiorul

matricei polimere deoarece zincul are rol de activator enzimatic (efect ce se constată și în

Page 216: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

215

cazul nostru), pe de altă parte complexează atât cu grupele funcționale din amestecul de

polimeri cât și cu proteinele care aparțin membranelor celulare. Se formează astfel legături

coordinative foarte puternice iar productivitatea în etanol scade datorită aglomeratelor

celulare formate în timp și a limitării difuziei nutrienților.

Rezultatele din fig. 75 permit a stabili factorii care determină scăderea

randamentului în fermentare, ca și numărul ciclurilor la particulele reticulate cu Zn2+

.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 75. Randamentele maxime de fermentare a glucozei în prezența drojdiei libere (0),

respectiv a drojdiei imobilizate în particule de tip (a) D1Y; (b) D2Y; (c) D3Y și (d) D4Y

reticulate cu (CH3COO)2Zn.

Probele D1YZn si D4YZn prezintă cea mai ridicată eficiență în fermentare și pot fi

utilizate până la 8 cicluri fermentative. Explicația este evidentă: conțin cel mai mic număr de

grupe funcționale anionice capabile să participe la reticulare – ceea ce determină rețele cu

densitate mai mică de reticulare , si cantitatea practic maximă de caragenan – ceea ce

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6 7 8

Yie

ld i

n f

erm

ente

d g

luco

se,η

%

Number of fermentation cycles

D1Y Zn

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 0

Yie

ld i

n f

erm

ente

d g

luco

se,

η %

Number of fermentation cycles

D2Y Zn

0

10

20

30

40

50

1 2 3 4 0

Yie

ld i

n f

erm

ente

d g

luco

se,

η %

Number of fermentation cycles

D3Y Zn

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4 5 6 7 8 0

Yie

ld i

n f

erm

ente

d g

luco

se,

η %

Number of fermentation cycles

D4Y Zn

Page 217: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

216

determină porozitatea cea mai ridicată. Ambele efecte au ca rezultat creșterea difuziei

tuturor speciilor moleculare spre- și dinspre matricea polimeră, cu consecințe favorabile

asupra procesului de fermentare. Probele D2YZn si D3YZn au performanțe mai reduse,

probabil determinate de gradul mai mare de reticulare indus de numărul mare de grupe

anionice de pe lanțurile polimerilor, confirmat și de studiul capacitații de umflare în medii

apoase. Acesta din urma variază în seria celor 4 probe în ordinea:

D3Y> D2Y> D4Y>D1Y

Pentru a evalua stabilitatea particulelor de imobilizat în mediul de fermentare s-a

determinat numărul, respectiv cantitatea de celule care se găsesc în mediul de fermentare

după fiecare ciclu. Irfana Mariam și colab, 2009 a obținut microbioreactoare de alginat de

sodiu cu celule de drojdie prin reticulare ionică utilizând ca agent de reticulare CaCl2 care au

fost testate din punct de vedere al activității fermentative, iar o creștere maximă a

randamentului de fermentare s-a observat după al 4-lea ciclu de fermentare după care

randamentul scade brusc. Numărul maxim de cicluri de fermentare efectuat cu aceste

microbioreactoare a fost de 6. Explicația dată pentru acest comporament a fost că

microbioreactoarele devin instabile după al 4-lea ciclu de fermentare și își schimbă forma iar

celulele difuzează în număr mare în mediul de fermentare [440]. Prin studiul nostru am dorit

să stabilim daca celulele sunt bine prinse în rețeaua polimeră și nu difuzează în număr mare

în mediul de fermentare chiar și după mai multe cicluri de fermentare.

În tabelul 39 sunt prezentate rezultatele obținute.

Tabelul 39. Cantitatea de celule de drojdie difuzate din particule după fiecare ciclu de

fermentare

Proba

Numărul

total de

cicluri de

fermentare

Numărul total

de celule din

mediul de

fermentare/ml

x 10 4

Cantitatea totală

de celule de

drojdie care

difuzează din

particule, mg

D3Y Mg 10 167,25 2,9052

D4Y Mg 10 128 2,4613

D3Y Ca 10 169,5 3,496

Page 218: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

217

Se constată că numărul total de celule care difuzează din particulele reticulate cu

(CH3COO)2Mg și (CH3COO)2Ca crește cu creșterea porozității indusă de caragenan.

Cantitatea de celule care difuzează este mai mare la probele reticulate cu

(CH3COO)2Ca față de cantitatea de celule care difuzează din probele reticulate cu

(CH3COO)2Mg. Putem concluziona că particulele de imobilizat reticulate cu (CH3COO)2Mg

sunt mai stabile decât cele reticulate cu (CH3COO)2Ca. Celulele de drojdie au o cerință mai

mare pentru ionii de Mg2+

iar aceștia pot adera cu mai multă ușurință la membrana

plasmatică a celulelor în comparație cu ionii de Ca2+

. Aceasta poate conduce la structuri mai

stabile având în vedere faptul că biocatalizatorul poate participa, practic, la reacția de

reticulare [28, 31].

La particulele cu acetat de zinc cantitatea de celule care difuzează din particule

crește cu scăderea numărului de grupe funcționale reticulabile, efect constatat și la ceilalți

reticulanți. Diferența constă însă în faptul că numărul de celule difuzate din aceste particule

este mult mai mic comparativ cu cele reticulate cu Ca2+

sau Mg2+. Explicația poate consta în

faptul că ionii de Zn2+

sunt absorbiți eficient de celulele de drojdie de care se leagă mai

puternic, ancorându-le mai eficient în matricea polimeră.

Rezultatele din tabelul 37 demonstrează că din particulele testate în procesul de

fermentare difuzează un număr mic de celule, mult inferior celui rămas în particule. Ele

D4Y Ca 10 139,25 2,85076

D3Y Zn 4 41,75 1,18312

D4Y Zn 8 56 1,24564

Page 219: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

218

dovedesc faptul că fermentarea are loc dominant în particule și nu în celulele libere din

supernatant.

Faptul că particulele cu celule de drojdie pot fi recuperate cu ușurință din

fermentator și pot fi reutilizate în mai multe cicluri fermentative arată că matricea polimeră

în care celulele de drojdie sunt imobilizate le protejează de metaboliții toxici produși de

etanol, viabilitatea celulară se păstrează iar celulele de drojdie pot prolifera în interiorul

particulelor obținute.

6.5.8. Productivitatea specifică și viteza de fermentare

Exploatând porțiunea liniară a curbelor cinetice de fermentare s-a calculat viteza cu

care se produce procesul, precum și productivitatea specifică în etanol, rezultatele obținute

pentru fiecare tip de particule, comparativ cu drojdia liberă pentru câteva cicluri de

fermentare, fiind prezentate în Tabelul 40, împreună cu viteza procesului la 45 minute.

Tabel 40. Productivitatea specifică și viteza procesului de fermentare

Viteza de fermentare pentru drojdia liberă este de 0.067 % conversie glucoză/ min iar

productivitatea specifică pentru drojdia liberă este de 0.51 g etanol/g glucoză x g drojdie. Se

D3Y

Mg

D4Y

Mg

D3Y

Ca

D4Y

Ca

D3Y

Zn

D4Y

Zn

D3Y

Mg

D4Y

Mg

D3Y

Ca

D4Y

Ca

D3Y

Zn

D4Y

Zn

I 0,27 0,22 0,24 0,2 0,2 0,2 0,79 0,79 0,79 0,79 0,59 0,79

II 0,27 0,24 0,2 0,27 0,2 0,2 0,7 0,79 0,59 0,79 0,59 0,59

III 0,2 0,2 0,2 0,22 0,16 0,2 0,79 0,77 0,76 0,79 0,4 0,59

IV 0,2 0,27 0,2 0,27 0,2 0,2 0,79 0,79 0,76 0,79 0,4 0,79

V 0,2 0,27 0,22 0,22 - 0,2 0,79 0,79 0,79 0,79 - 0,59

VI 0,2 0,2 0,2 0,27 - 0,2 0,59 0,79 0,59 0,62 - 0,59

VII 0,27 0,24 0,2 0,2 - 0,2 0,79 0,72 0,59 0,59 - 0,4

VIII 0,2 0,24 0,2 0,2 - 0,13 0,59 0,82 0,59 0,79 - 0,4

IX 0,29 0,2 0,2 0,22 - - 0,98 0,79 0,79 0,79 - -

X 0,2 0,2 0,22 0,27 - - 0,59 0,63 0,79 0,79 - -

Specific productivity (g etanol / h x g

yeast cells)

Number of

the

fermentation

cycles

Fermentation rate, % glucose

conversion/min

Page 220: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

219

constată că viteza procesului se plasează în aceeași ordine cu valorile randamentului de

fermentare, pentru toate probele analizate. Viteza de fermentare pentru majoritatea ciclurilor

fermentative efectuate este superioară celei obținute la fermentarea cu drojdie libere.

Pentru majoritatea probelor productivitatea specifică în etanol este mai mare decât

productivitatea specifică a drojdiei libere. Cele mai bune productivități au fost obținute cu

proba D4Y reticulată cu acetat de magneziu.

Concluzii

Amestecurile pe baza de gelan, carboximetil celuloza (sare de sodiu) și caragenan, în

diferite proporții, reticulate cu ioni metalici divalenți – Ca2+

, Mg2+

, Zn2+

proveniți din acetați

-, obținute prin extrudere, permit obținerea de particule sferice capabile să fixeze în

matricea polimeră celule de drojdie.

Matricile sferice reticulate, fără drojdie, sunt stabile în medii apoase, stabilitatea

nedepinzand, practic, de compoziția lor în polimeri sau de natura cationului metalic utilizat

ca reticulant; stabilitate ușor mai ridicată o prezintă particulele reticulate cu ioni de Zn2+

,

chiar dacă concentrația sa este cu un ordin de mărime mai mică decât a celorlalți doi cationi.

Toate particulele prezintă caracter de hidrogel, important pentru asigurarea unui

bun transport al substratului, nutrienților și produșilor de fermentare prin matricea polimeră.

Morfologia și proprietațile fizico-chimice ale particulelor depind de compoziția lor

în polimeri și de natura reticulantului; porozitatea particulelor crește cu cantitatea de

caragenan din compoziție.

Capacitatea de a reține apa este funcție de gradul de reticulare, ce depinde la rândul

său de compoziția în polimeri a particulelor – ce determină numarul grupelor reticulabile -,

de cantitatea de reticulant și de porozitatea lor; capacitate mai ridicată de reținere a apei

manifestă particulele reticulate cu Mg2+

ca și cele conținînd cantități mai ridicate de

carageenan.

Particulele de imobilizat manifestă un grad de reticulare mai ridicat datorită

participării celulelor înseși la interacții ionice cu ionii metalici.

Matricea polimeră, indiferent de compoziția sa, păstrează viabilitatea celulară la

valori optime în timp

Page 221: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

220

Activitatea fermentativă depinde de raportul între polimeri din particule și de tipul de

reticulant utilizat; eficiența cea mai bună în fermentare a fost se obține cu probe reticulate cu

Mg2+, și cea mai redusa la cele reticulate cu Zn

2+.

Particulele de imobilizat pot fi utilizate repetat în cel puțin 10 cicluri fermentative.

Fermentarea se produce dominant în particulele polimere purtătoare de celule de

drojdie, și nu în supernatantul în care difuzează parțial celulele.

Matricea polimeră obținută păstrează viabilitatea celulară la valori ridicate de peste

82%, chiar după 10 cicluri de fermentare.

Productivitatea specifică în etanol este mai ridicată la particulele de imobilizat

decât la drojdia liberă.

Particulele de gelan/i-caragenan/CMCNa cu celule de drojdie imobilizate obținute

pot fi utilizate cu succes în procese fermentative și ar putea reprezenta o nouă abordare în

rezolvarea problemei deficitului de ioni metalici cu care se confruntă producătorii din

industria băuturilor alcoolice.

CAPITOLUL 7

Imobilizarea -amilazei în particule de gelan reticulat ionic.

Enzimele sunt catalizatori biologici ce reduc energia de activare a unor reacții

chimice. Întregul domeniu biotehnologic depinde de activitatea lor, fie că acestea acţionează

singure sau asociate, în unele cazuri. Cu excepţia ribozimelor, enzimele sunt în majoritate

proteine, putând conţine însă şi componente lipidice sau zaharoase.

Descoperirea primei enzime aparţine lui Payen şi Persoz, care în anul 1833 publică

o lucrare privind separarea dintr-un extract apos de malţ a unui produs care scindează

amidonul la zaharuri mai simple, până la glucoză. Acest produs nu este altul decât

amilaza.[69].

Enzimele sunt catalizatori şi respectă toate legile catalizei:

nu se consumă în timpul reacţiei şi teoretic pot provoca transformarea unui număr

nelimitat de molecule de substrat. Eventuala denaturare a enzimei (pierderea funcţiei

Page 222: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

221

biocatalitice datorită modificărilor care apar la nivelul structurii tridimensionale şi care

alterează conformaţia centrului activ) este independentă de actul catalitic;

nu modifică natura reacţiei, echilibrul sau bilanţul ei termodinamic, reacţia fiind

posibilă si in absenţa sa;

accelerează viteza de reacţie, pentru acest parametru cinetic înregistrându-se valori

de aproximativ 10 ori mai mari decăt cele obţinute în absenţa biocatalizatorului.

Cea mai importantă deosebire dintre o enzimă şi un catalizator clasic constă în

înalta specificitate de acțiune a celei dintâi, concretizată prin capacitatea de a cataliza un

singur tip de reacţie biochimică; de cele mai multe ori, ea catalizează transformarea unei

singure substanţe chimice (specificitate absolută), fiind însă posibilă şi acţiunea asupra unui

număr de substanţe, înrudite structural prin aceeaşi grupare sau aceleasi grupe de atomi pe

care biocatalizatorul le recunoaşte (specificitate relativă).

Problema cea mai importantă pe care o ridică utilizarea enzimelor drept catalizatori

in diverse transformări chimice o constituie faptul că, in stare liberă ele nu pot funcţiona

decât într-un ciclu enzimatic, ceea ce conduce la un consum ridicat al unui astfel de compus

deoarece nu poate fi recuperat din produsii de reacţie şi reutilizat, asemănător catalizatorilor

clasici. Totodată, rămânând în produşii de reacție, enzima constitue o impuritate, impunând

îndepărtarea sa prin diferite metode, ceea ce complică tehnologiile ce apelează la astfel de

catalizatori.

Aceste dezavantaje pot fi parţial sau total eliminate prin insolubilizarea enzimei pe

un suport, mineral sau organic, prin legare chimică sau prin interacţiuni fizice. De asemenea,

enzimele imobilizate pot fi ușor separate din produşii de reacţie şi ulterior regenerate prin

tratare cu soluții tampon de pH corespunzător celui de activare maximă a biocatalizatorului,

fiind reutilizate într-un alt ciclu enzimatic, cu avantajele ce decurg de aici.

Prima încercare de a imobiliza o enzimă a fost realizată de Michaelis şi Ehrenreich în

1908 [527] prin adsorbţia invertazei pe cărbune, dar acest preparat precum si altele obţinute

prin imobilizarea altor enzime au dovedit o activitate scazută şi inconstantă.

Rezultate superioare au fost obţinute după cel de-al doilea război mondial, când

tehnicile de imobilizare s-au diversificat, incluzând legarea covalentă la suport, legarea

ionică, includerea în geluri, încapsularea sau simpla reticulare cu alte molecule de enzimă,

pentru a forma particule [528, 529].

Termenul de ―enzimă imobilizată‖ este utilizat pentru a descrie: insolubilizarea

enzimelor prin adsorbţie, legarea covalentă şi includere în matrice polimeră, ca modele ale

enzimelor asociate membranelor biologice funcţionând în organismele vii sau pentru

Page 223: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

222

microîncapsularea enzimelor ca modele de celule artificiale, pentru enzimele din mediul

intracelular.

Principiul general al procedeelor de imobilizare a enzimelor constă în legarea sau

fixarea unei enzime sau a unui sistem multienzimatic de suportul insolubil în apă, în

condiţiile păstrării proprietăţilor catalitice, respectiv specificitatea de acţiune şi posibilitatea

de a acţiona la pH şi temperatură asemănătoare enzimelor libere (neimobilizate). În funcţie

de natura legăturilor care se stabilesc între enzime şi suportul de imobilizare, procedeul sau

metodele de imobilizare pot fi fizice sau chimice.

Procedeele fizice se bazează pe imobilizarea enzimelor prin intermediul legăturilor

fizice ca de exemplu, interacţiuni electrostatice, formarea de legaturi ionice, formarea de

legături de hidrogen, interacţiuni proteină-proteină etc.,

Factorii critici ce trebuie luaţi în considerare la folosirea enzimelor imobilizate sunt

următorii:

eficienţa economică a imobilizării determinată de costul enzimei, suportului şi

metoda de imobilizare;

activitatea enzimei imobilizată care este în funcţie de tehnica de imobilizare,

caracteristicile materialului de suport, viteza de difuzie a substratului la enzimă şi a

produsului de transformare;

caracteristicile substratului ce trebuie transformat ;

stabilitatea enzimei care trebuie menţinută un timp cât mai îndelungat ;

contaminarea microbiologică a sistemului enzimă-suport în timpul utilizării

reactorului respectiv [530, 532; 533]

O categorie de enzime cu importante aplicații în industria alimentară o constituie

hidrolazele, care produc scindarea unor legături formate prin eliminarea apei (esterice,

amidice, eterice etc). Printre cei mai importanți reprezentanți ai acestei clase se numără -

amilaza, care produce hidroliza legăturilor α-1,4 glicozidice din polizaharide cu gradul de

polimerizare cel puțin egal cu 3. Amiloza, polizaharidă din compoziția amidonului, este

scindată sub acțiunea - amilazei la oligozaharide cu grad de polimerizare mai mic, numite

dextrine. O hidroliză prelungită continuă scindarea lanțurilor polizaharidice pînă la maltoză

şi maltotrioze. α-Amilazele nu pot scinda legăturile α-1,6-glucozidice din amilopectină, cel

de al doilea component al amidonului.

Literatura raportează multe exemple de imoblizate ale - amilazei pe diferite

suporturi. Reținem spre exemplificare includerea - amilazei produsă de Hylocereus

Page 224: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

223

polyhirus într-o matrice formată din gumă arabică și chitosan cu o eficienţă de încapsulare

de 96.2 %. Procesul de încapsulare ajută enzima sa fie stabilă în prezenţa agenţilor de

oxidare şi a surfactanţilor. Studiul probează faptul că această combinaţie de polimeri, cu rol

de agenţi de acoperire, protejează enzima de pierderea activităţii în timpul liofilizării.

Creşterea stabilităţii şi activitatea înaltă a - amilazei încapsulate face ca această abordare

să constituie o alegere atractivă pentru aplicaţii în biotehnologie si enzimologie [84].

Rezultatele raportate în acest capitol se referă la imobilizarea prin includere a -

amilazei într-o matrice sferică de gelan, reticulat ionic cu Mg2+, utilizând ca tehnică

extruderea prin capilară a soluției de polizaharid conținând enzima într-o baie de gelifiere

ionotropă conținând acetat de magneziu, deci aceeași tehnică utilizată la obținerea de

imobilizate de celule de drojdie raportate în capitolele precedente.

După informațiile noastre, în literatură nu există un astfel de studiu, ceea ce atestă

caracterul original al abordării noastre. Particulele de imobilizat sunt caracterizate fizico-

chimic, morfologic și din punct de vedere al activității enzimatice în mai multe cicluri

hidrolitice.

Obţinerea particulelor de gelan reticulat ionic are la baza reacția de schimb ionic

dintre gelan (sare de sodiu) si acetatul de magneziu, prezentată în subcapitolul 5.2..

In principiu, pentru ca o enzimă să poată fi imobilizată în rețele polimerice trebuie

ca moleculele sale să fie suficient de mari pentru a fi păstrate în interiorul matricei de gel, iar

moleculele substratului trebuie să fie suficient de mici pentru a trece prin porii matricei de

gelan. In cazul nostru, aceste condiții sunt îndeplinite, ochiurile rețelei stabilizând -

amilaza în interiorul lor, dar permițând difuzia amidonului (substrat) în interiorul particulei.

Prin metodologia descrisă în capitolul 4, au fost obținute 4 tipuri de particule,

diferind prin concentrația enzimei dizolvată în soluția de gelan supusă apoi extruderii,

conform planului experimental prezentat în tabelul 41.

Tabel 41. Planul experimental de obținere a imobilizatelor de de α-amilază *

Proba Concentrația soluței

de α-amilază (mg/ml)

Eficiența în

imobilizare, Ei %

P1 1 61,9

P2 2 68,27

P3 3 74,63

P4 4 65,5

* -concentrația soluției de gelan: 1%

- concentrația soluției de acetat de magneziu în baia de gelifiere: 2 %

Page 225: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

224

- pH-ul soluției tampon acetat utilizată: 5.6.

- temperatura de imobilizare: 60˚C.

Particulele au fost obţinute prin extrudere printr-o capilară (ac de seringă) cu

diametrul interior de 600 microni şi lungimea de 30 mm. Particulele obţinute sunt sferice şi

au diametrul mediu de 2,5 mm.

Eficiența în imobilizare a enzimei s-a determinat pe baza cantității de enzime din

supernatant. Pentru determinarea proteinelor din particule a fost trasată o curbă de calibrare

care corelează cantitatea de albumină cu absorbanța (figura. Cantitatea de proteine s-a

determinat utilizând metoda Lowry.

Culoarea albastră rezulta in urma complexării legăturii peptidice cu sulfatul de

cupru si a reducerii reactivului Folin-Ciocalteu de catre resturile de tirozina si triptofan din

proteina. Waterborg JH, Matthews HR, The lowry method for protein quantitation, Methods

Mol Biol. 1984;1:1-3

Rezultatele privind eficiența în imobilizare a α-amilazei în particule de gelan sunt

redate în tabelul 1. Eficiența maximă în imobilizare a fost obținută utilizând o concentrație

de 3 mg/ml enzime și a fost de 74, 63%. În figura 76 este prezentată curba de calibrare a

albuminei serice bovine pe baza căreia s-a determinat cantitatea de enzimă neimobilizată.

Figura 76: Curba de calibrare a albuminei serice bovine (BSA)

Structura schematizată a particulelor obținute este prezentată în figura 77.

y = 0,0007x R² = 0,9961

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 200 400 600

Ab

sorb

an

ță

Concentrația de albumină, μg/ml

Page 226: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

225

Figura 77. Structura schematizată a α-amilazei imobilizate în particule de gelan reticulat

ionic

7.1. Morfologia particulelor cu α-amilază imobilizată

În particulele analizate prin microscopie electronică de baleiaj a fost imobilizată

aceeași cantitate de α-amilază iar probele diferă prin concentrația de agent de reticulare

utilizată în baia de gelifiere, respectiv 1% și 2 % acetat de magneziu. Probele au fost uscate

iar fotografiile de microscopie electronică de baleiaj au fost realizate în secțiune.

Fotografiile obținute sunt prezentate în figura 78.

Morfologia particulelor în secțiune este asemănătoare, relevând formațiuni fibrilare,

evident datorate polizaharidului. Morfologia acestor particule este diferită de a celor

conținând celule de drojdie imobilizate (prezentate în subcapitolele 5.1.-5.5), la care

prezența celulelor sferice de drojdie împiedică realizarea de formațiuni fibrilare.

Page 227: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

226

(a) (b)

Figura 78. Fotografii de microscopie electronică de baleiaj pentru particule

conținând - amilază imobilizată, reticulate cu (a) 1% , respectiv (b) 2% acetat de magneziu

în baia de reticulare.

Creșterea cantității de agent de reticulare are ca efect, previzibil, creșterea gradului

de reticulare, probată în fotografii de creșterea dernsității matricii polimere (fig. 78, b).

Rezultatul este în deplină concordanță cu modul de variație a gradului de umflare.

7.2. Capacitatea de umflare în mediu apos

Sferele de gelan obținute prin gelifiere ionotropă prezintă un evident caracter de

hidrogel, astfel încât caracteristicile lor de umflare în apă sunt importante atât pentru

stabilitatea lor, cât și pentru utilizarea ulterioară în procese hidrolitice repetate. O matrice de

tip hidrogel permite, a priori, difuzia substratului în interiorul particulei pentru contactul cu

enzima, dar și difuzia produșilor de hidroliză în afara matricei polimerice. În figura 79 este

prezentată variația gradului de umflare pentru proba P3 obținută cu concentrații diferite în

baia de gelifiere.

0

500

1000

1500

2000

2500

0 5 10 15 20 25 30

Q1%

Q2%

Q3%

Gra

du

l d

e u

mfl

are

, Q

%

Timp (h)

Page 228: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

227

Figura 79. Variația gradului de umflare în timp pentru trei tipuri de particule cu α-

amilază imobilizată, obținute cu diferite concentrații de acetat de magneziu în baia de

reticulare (concentrații de 1%, 2% și 3% acetat de magneziu)

Se constată că proba cea mai reticulată (3 % acetat de magneziu) prezintă valorile

cele mai coborâte ale gradului de umflare, efectul fiind determinat de gradul lor mai ridicat

de reticulare. Evoluții apropiate ale acestei proprietați prezintă celelalte trei tipuri de

particule. Gradul de umflare din particule crește cu scăderea gradului de reticulare.

7.3. Caracterizarea enzimei libere

În vederea comparării ulterioare a imobilizatelor de enzimă, cu enzima liberă, s-a

impus mai întâi caracterizarea celei din urmă. Testele pe enzima liberă au fost efectuate

pentru a determina activitatea enzimatică în funcție de concentrația de amidon. În figura 80

sunt prezentate variația vitezei de hidroliză a amidonului și a activității enzimatice a α-

amilazei.

Viteza de hidroliză reprezintă cantitatea de amidon transformată în glucoză/ minut.

Se poate constata din figura 80 (a) că viteza de transformare a amidonului în zaharuri scade

în timp după, iar 10 minute rămâne aproape constantă. Din acest motiv timpul necesar

pentru fiecare ciclu de hidroliză a fost stabilit ca fiind de 10 minute.

(a) (b)

Figura 80. Variația în timp a vitezei de hidroliză a amidonului (a) și a activității enzimatice

a α-amilazei libere

Activitatea enzimatică se exprimă ca raport între cantitatea de substrat hidrolizat

(amidon) consumat și cea de enzimă (liberă sau imobilizată) utilizată pentru hidroliză

=

(9)

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 5 10 15

Vit

eza

, m

g a

mid

on

tran

sform

at/m

in

Timp (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Activitatea enzimatică

Concentrația de enzime, mg/ml

Page 229: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

228

Pentru determinarea activității enzimatice a α-amilazei libere s-au utilizat mai multe

concentrații de α-amilază cuprinse între 0,03922 mg/ml și 0,3922 mg/ml. Fiecare probă a

fost lăsată în contact cu soluția care conține 1 ml soluție de amidon 0,4 % și 6 ml soluție

tampon acetat pH 5,6 timp de 10 minute. După 10 minute se iau câte 200 μl probă iar

determinarea se efectuează așa cum a fost descrisă anterior. Activitatea enzimatică s-a

exprimat ca raport între cantitatea de amidon consumată și cantitatea de enzimă luată în

lucru.

Din figura 80(b) se constată că activitatea enzimatică scade cu creșterea

concentrației de enzime în mediul de hidroliză.

7.4. Determinarea constantei Michaelis-Menten și a vitezei maxime de hidroliză

Principiile generale ale cineticii reacțiilor chimice se aplică și la reacțiile catalizate

de enzime dar acestea au în plus o trăsătură proprie și anume saturarea cu substrat.

Ecuația Michaelis Menten exprimă relația matematică dintre viteza inițială a unei

reacții catalizată enzimatic, concentrația substratului și anumite caracteristici ale enzimei. În

figura 81 este prezentată cinetica Michaelis Menten pentru α-amilaza liberă și pentru α-

amilaza imobilizată în particule de gelan reticulate ionic iar valorile constantei Km și vitezei

maxime Vmax atât pentru enzima liberă cât și imobilizată sunt redate în tabelul 4.

Figura 81. Cinetica Michaelis-Menten pentru enzima liberă și enzima imobilizată în

particule de gelan reticulate cu acetat de magneziu

Tabel 42. Valorile constantei Km și vitezei maxime Vmax pentru enzima liberă și

imobilizată.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30

α-amilaza libera α-amilaza imobilizată

Concentrația de amidon, mg/ml Vit

eza,

mg a

mid

on t

ransf

orm

at/m

in

Page 230: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

229

Proba Temperatura, T˚C PH Km, mg/ml Vmax, mg

glucoză/min

α-Amilaza

liberă 60 5,6

1,003 2,02

α-Amilaza

imobilizată 2,45 1,57

Valoarea constantei Km arată afinitatea enzimei pentru substrat. O valoare mare a

constantei Km sugerează o afinitate mai mică a enzimei pentru substrat. În general, valoarea

vitezei maxime este mai mare pentru enzima liberă față de cea imobilizată, iar constanta Km

este mai mică la enzima liberă față de cea imobilizată.

Datele obținute în studiul nostru sunt comparabile cu cele din literatură. În cazul

enzimei imobilizate se observă o scădere a afinității pentru substrat (amidon) ce poate fi

cauzată de schimbările structurale ale enzimei care au loc în timpul imobilizării, apariția

unor fenomene de impiedicare sterică datorate suportului utilizat și a efectelor provocate de

o difuzie mai lentă.

7.5. Influența pH-ului și a temperaturii asupra activității enzimei libere șli

imobilizate

Determinările s-au efectuat în scopul stabilirii valorii optime a celor doi parametri,

care asigură o activitate enzimatică maximă. Cantitatea de α-amilază liberă a fost aceeași cu

cea imobilizată în particule în toate determinările efectuate.

În figura 82 este prezentată influența pH-ului și a temperaturii asupra activității

enzimatice.

Page 231: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

230

a b

Figura 82. Influența pH-ului (a) și a temperaturii (b) asupra activității enzimatice

pentru enzima liberă și imobilizată

Determinările s-au efectuat atât pentru enzima liberă cât și pentru cea imobilizată.

Enzima liberă are o activitate enzimatică mai ridicată decât cea liberă, după cum s-a

constatat și din evaluarea constantei Km, dar în ambele cazuri se observă că valoarea

maximă activității enzimatice a fost atinsă la pH 5,6 (fig. 82). Activitatea enzimei libere este

superioară celei imobilizate indiferent de temperatura la care are loc reacția. In cazul

ambelor forme de prezentare ale enzimei însă, optimul de activitate este atins la temperatura

de 60˚C.

7.6. Testarea activității enzimatice a enzimei imobilizate în mai multe cicluri

hidrolitice

Particulele cu α-amilază imobilizată au fost testate în mai multe cicluri de hidroliză

repetate pentru a verifica dacă imobilizatele de acest tip pot fi reutilizate, fără o pierdere

esențială a activității. Proba selectată pentru determinare a fost P3, reticularea ionică fiind

realizată cu o sluție de concentrație 2 % acetat de magneziu. În figura 83 sunt prezentate

rezultatele obținute în urma hidrolizei repetate cu acest imobilizat.

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

4 5 6

α-amilaza liberă α-amilaza imobilizată

PH

Act

ivit

ate

a e

nzi

ma

tică

0

1

2

3

4

5

6

20 30 40 50 60 70 80 90

α-amilaza liberă α-amilaza imobilizată

Act

ivit

ate

a e

nzi

ma

tică

Temperature, T˚C

Page 232: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

231

(a)

(b)

Figura 83. Testarea activității enzimatice în cicluri hidrolitice repetate pentru particule cu α-

amilază imobilizată (3 mg/ml), utilizând ca substrat amidonul la (a) pH 5,6 și (b) pH 5,2 și

pH 5,6.

În figura 83(a) sunt prezentate rezultatele obținute în urma testării activității

enzimatice a particulelor cu enzimă imobilizată, în mai multe cicluri hidrolitice. Se constată

că α-amilaza imobilizată în particule își păstrează activitatea enzimatică după mai multe

cicluri hidrolitice, aceasta nesuferind o diminuare importantă până la ciclul 11, după care

începe să scadă. După fiecare ciclu de hidroliză particulele au fost separate prin filtrare și

spălate cu soluție tampon acetat, pH 5,6 și au fost păstrate în această soluție tampon acetat

pentru 5 minute până la următorul ciclu de hidroliză. Durata dintre cicluri a fost de 10

minute.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 2 3 5 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19Act

ivit

atea

en

zim

atic

a

Numarul de cicluri hidrolitice

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Act

ivit

atea

en

zim

atic

a

Numarul ciclurilor hidrolitice

pH 5,2

pH 5,6

Page 233: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

232

Pentru a stabili dacă activitatea enzimei nu poate fi adusă în apropierea valorii

inițiale, s-a realiat un test constând în tratarea imobilizatului cu o soluție mai acidă decât cea

la care se manifestă activitate maximă.

Astfel după 2 cicluri de hidroliză utilizând soluția tampon acetat la pH 5,6, probele

cu enzimă imobilizată au fost spălate cu soluția tampon acetat la pH 5,2 și menținute la acest

pH timp de 30 minute. Rezultatele obținute sunt prezentate în figura 83 (b). Se poate observa

că activitatea enzimatică crește după fiecare ciclu de hidroliză catalizat de particulele ce au

fost păstrate în soluția tampon acetat cu un pH de 5,2.

Concluzii

Au fost obținute particule stabile de gelan cu caracter de hidrogel conținând α-

amilază imobilizată, prin gelifiere ionotropă cu ioni de Mg2+;

Valoarea gradului de umflare în medii apoase scade cu cresterea concentratiei de

reticulant, consecință a creșterii gradului de reticulare

Morfologia particulelor relevă formațiuni fibrilare, porozitatea matricii reducându-se

cu creșterea gradului de reticulare

Temperatura și pH-ul la care activitatea enzimei sunt maxime au valorile: T=60˚C,

respectiv pH= 5,6;

Constanta Michaelis-Menten evidențiază în cazul enzimei imobilizate o scădere a

afinității pentru suport (amidon).

-amilaza imobilizată poate fi ușor recuperată din mediul de hidroliză, putând fi

utilizată în 11 cicluri hidrolitice repetate fără scăderea activității enzimatice; aceasta începe

să se reducă treptat pana la ciclul 19

-amilaza imobilizată în particule de gelan poate fi regenerată prin tratare cu un

mediu mai acid.

Rezultatele obținute sunt încurajatoare, imobilizatele astfel obținute constituyid, în

principiu, o alternativă la biotehnologiile care lucrează cu -amilază liberă, avantajele fiind

evidente.

Page 234: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

233

CAPITOLUL 8

Imobilizarea curcuminei în particule pe bază de polizaharide complexate

polielectrolitic și reticulate ionic cu acetat de magneziu

Prevenţia bolilor cronice este o problemă pentru ţările dezvoltate. Factori cum ar fi

îmbătrânirea populaţiei şi creşterea costurilor de îngrijire a sănătăţii subliniază necesitatea de

prevenire a bolilor. Terapii nutriţionale, precum alimentele funcţionale şi suplimentele

alimentare reprezintă o abordare pentru prevenirea bolilor cronice. [94]

In 1979, Stephen DeFellce, fondator și președinte al fundatiei pentru inovaţie situată

in Cranford, New Jersey propune termenul de ‖nutraceutic‖ rezultat din combinarea

cuvântului nutriţie cu farmaceutic. Nutraceuticul este astfel definit ca un aliment care oferă

beneficii medicale sau de sănătate, inclusiv în prevenirea şi tratamentul bolilor [93].

Deşi există multe definiţii ale alimentelor funcţionale, o temă comună este faptul că

acestea pot oferi beneficii pentru sănătate ―dincolo de hrana de bază‖ [96] Aceste beneficii

pentru sănătate sunt de obicei asociate cu încorporarea unuia sau mai multor compuşi

bioactivi [95].

O scurtă trecere în revistă a nutraceuticelor şi ingredientelor bioactive permite

evidențierea următoarelor categorii de compuși.

prebiotice: inulina, oligozaharidele –susţin sănătatea intestinului şi ajută la refacerea

microflorei intestinale;

probiotice: lactobacili, bifidobacterii- îmbunătăţesc sănătatea intestinului [97]

substanţe fitochimice: beta-caroten, licopen, flavonoizi, proantocianidine, polifenoli,

alicina: reduc riscul apariţiei bolilor cardiovasculare, cancer, diabet, boli degenerative [98]

lanţuri lungi de acizi graşi omega-3: acid dodecahexaecanoic (DHA), acid

eicosapentaenoic (EPA)- susţin îmbunătăţirea sănătaţii cardiovasculare [99]

peptide bioactive: peptide derivate din lapte-reduc presiunea sangelui [100]

carotenoizii: beta-caroten, licopen, luteina, zeaxantina, astaxantina- reduc riscul

bolilor de ochi şi cancerul [101]

ierburi şi condimente: uleiuri esenţiale, diverse preparate de ierburi-au o gamă largă

de beneficii [571]

Cei mai mulți dintre aceștia sunt dificil de încorporat în produsele alimentare apoase,

şi sunt de multe ori extrem de sensibili la deteriorarea oxidativă [103].

Există de aceea o mare nevoie de a dezvolta sisteme de eliberare pentru industria

alimentară care pot fi utilizate pentru a încapsula şi proteja componenţii bioactivi.

Page 235: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

234

Sistemele de eliberare pentru alimente funcţionale cu componenţi bioactivi lipofili trebuie să

posede unele calităţi importante. O calitate esenţială este aceea că trebuie să fie compatibile

atât cu componentul bioactiv cât şi cu produsul în care vor fi încorporate pentru a crea un

aliment funcţional sau o băutură funcţională. Alte atribute includ creşterea stabilităţii sau

eliberarea controlată a componenţilor bioactivi. Sistemele de eliberare pe bază de emulsii

sunt cele mai potrivite pentru a crea sisteme de transport al lipidelor bioactive. [104].

Acestea trebuie să fie astfel create încât să furnizeze atributele reologice dorite pentru un

anumit produs cum ar fi grosimea, structura, sau pot fi elaborate pentru a avea un impact

neglijabil asupra produsului. Factorii care includ concentraţia, mărimea, forma şi compoziţia

acestor particule joacă un rol important în modul cum reologia alimentelor sau băuturilor

este afectată. Pentru orice sistem de eliberare este esenţial ca acesta să rămână stabil pentru

întregul ciclu de viaţă al produsului. Mai mult, particulele de hidrogel nu ar trebui să

influenţeze negativ termenul de valabilitate al produsului în sine.

Curcumina este un compus cu beneficii foarte importante pentru organismul uman.

Efectele sale farmacologice au fost evidențiate de numeroase cercetări, care au subliniat

acțiunea sa în prevenția și tratarea unor boli cronice. [117-121]

Curcumina a fost prima dată izolată din turmeric - Curcuma Longa -, în 1815, fiind

folosită multă vreme în India ca remediu în casă pentru tratarea unor afecțiuni. In timp, s-a

dovedit a prezenta o excelentă acțiune de eliminare a speciilor active de oxigen, ceea ce îi

conferă activitate antioxidantă în celulele normale.

Marele său dezavantaj îl constituie insolubilitatea în apă și biodisponibilitatea

scăzută în celule. Atenuarea sau eliminarea acestor dezavantaje a fost încercată prin

realizarea de formulări pe bază de micele, lipozomi, nanoparticule ș.a.

Tot mai multe cercetări raportează încapsularea/includerea curcumine în

nanoparticule pe bază de polimeri naturali - chitosan, guma ghatti [554] -, sau sintetici -

poli(etilen glicol), poli(acid lactic), poli(vinil pirolidonă), poli(acid lactic-co-acid glicolic)

[556].

Alte tipuri de formulări implică complexarea cu ciclodextrine, complecși cu

fosfatidil-colină, includerea în nanoparticule lipidice sau încapsularea în lipozomi,

micro/nano emulsii, după cum s-a detaliat în capitolul 3, de studiu bibliografic.

Cercetările raportate în acest capitol au ca scop realizarea unor noi formulări prin

imobilizarea curcuminei în particule de polizaharide pentru a-i crește solubilitatea și

biodisponibilitatea.

Page 236: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

235

Imobilizarea curcuminei a fost realizată în două tipuri de particule pe bază de

complecși polielectrolitici între polizaharide cu caracter ionic diferit. S-a evaluat capacitatea

particulelor de a se umfla în medii diferite și caracteristicile lor morfologice. Cinetica de

eliberare a curcuminei a fost studiată în două medii de pH diferit, simulând mediile

fiziologice: soluție tampon fosfat la pH 7,4 și o soluție ce simulează fluidul gastric la pH 2.

Primul tip de particule, pe bază de gelan, respectiv amestec de gelan cu caragenan,

au fost obținute în două etape conform procedeului descris în capitolul 5. Soluția apoasă de

gelan, respectiv amestec de polizaharide, în care s-a emulsionat soluția curcuminei în ulei, în

prezența emulsionantului Twin pentru stabilizare, a fost extrusă printr-o capilară în baia de

reticulare conținând acetat de magneziu. Particulele formate instantaneu au constituit miezul

pe care s-a depus ulterior chitosan, care complexează ionic cu grupările anionice rămase

neimplicate în reticulări din cele două polizaharide anionice inițiale. Proporția de i-

caragenan utilizată în amestec cu gelanul este de 30%. O cantitate mai mare de i-caragenan

conduce la formarea unor particule instabile. Cercetările raportate în literatură au demonstrat

că ionii de potasiu sunt eficienți în reticularea caragenanului. Cu toate acestea, concentrațiile

mari de potasiu nu sunt dorite în aplicațiile medicale deoarece pot cauza aritmii și slăbiri

severe ale mușchilor datorită hiperkalemiei așa cum a raportat în cercetările sale Poncelet și

colab. [572]

Așadar, originalitatea abordării noastre constă în utilizarea amestecului celor două

polizaharide anionice pentru crearea miezului particulei finale, și reticularea cu ionii de

Mg2+, bazată și pe experiența anterioară privind imobilizarea celulelor de drojdie și a -

amilazei în particule de gelan obținute prin gelifiere ionotropă.

Schematic, structura particulelor este prezentată în fig. 84

Page 237: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

236

Figura 84. Structura particulelor de polizaharide cu curcumină imobilizată obținute

prin metoda emulsionării și a complexării polielectrolitice

Al doilea tip de imobilizat este constituit din microparticule de chitosan în care a

fost inclusă curcumina, dispersată mai întâi sub forma unei suspensii fine în apă, în care apoi

a fost adăugată soluție de chitosan (procedeu descris în capitolul 5). Realizarea încorporării

principiului activ în microparticule este atestată de culoarea galben închis a acestora.

Încapsularea curcuminei în microparticule de chitosan este benefică conducând la

îmbunătățirea solubilității și a biodisponibilității când este administrată pe cale orală.

Dispersarea microparticulelor de chitosan încorporând curcumină, într-o soluție de gelan,

permite complexarea polielectrolitică a celor două polizaharide. Complexul polielectrolitic

rezultat este apoi supus gelifierii ionotrope prin extrudere într-o baie conținând acetat de

magneziu, având ca rezultat obținerea particulelor finale constând în matricea de gelan ce

conține dispersate microparticule de chitosan încărcate cu curcumină. Particulele formate

sunt sferice, stabile și au diametrul mediu de 3 mm când sunt umflate, respectiv 0,5 mm

cand sunt uscate. Schematic, aceste particule sunt prezentate în fig. 85.

Figura 85. Prezentarea schematică a particulelor de gelan ce conțin microparticule

de chitosan cu curcumină imobilizată.

În tabelul 43 este prezentat programul experimental utilizat pentru obținerea celor

două tipuri de particule, iar în figura 86 sunt prezentate fotografii ale acestora.

Page 238: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

237

Tabel 43. Programul experimental pentru obținerea particulelor și

eficiența de imobilizare pentru fiecare tip de particule.

Proba Gelan (%) i-caragenan

(%)

Chitosan

(%)

Concentrația

soluției de

acetat de

magneziu

(%)

Eficacitatea

imobilizării

(%)

P1* 100 0 - 2 70,0

P2* 70 30 - 2 67,42

P3**

89 - 11

1 82,94

P4** 2 87,0

P5** 3 87,16

*Extruderea emulsiei de polimer care conține curcumină a fost realizată într-un amestec

compus din 60 ml soluție 1% chitosan și 20 ml soluție acetat de magneziu de concentrație 2

%.

** Particulele au în compoziție 89% gelan și 11% chitosan; volumul soluției de acetat de

magneziu : 100 ml

(a) (b) (c)

Figura 86. Particule cu curcumină imobilizată: (a) proba P3 cu particule umflate, (b) proba

P3 particule uscate și (c) proba P1 particule uscate.

8.1. Morfologia particulelor

Pentru evaluarea morfologiei particulelor s-a procedat la analiza secțiunilor

acestora prin microscopie electronică de baleiaj. Probele alese pentru această analiză au fost

P1, P2 și P3, fotografiile obținute fiind prezentate în fig. 87

Page 239: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

238

Figura 87. Fotografii obținute prin microscopie electronică de baleiaj în secțiune, pentru

particule conținând curcumină imobilizată.

Particulele P1 și P2 prezintă o morfologie poroasă, mult accentuată la proba P2,

care conține și i-caragenan. Rezultatul este în concordanță cu studiul efectuat Diana

Guzman-Villanueva și colab. (2013) care au observat creșterea porozității in

microparticulele de alginat/caragenan atunci când cantitatea de caragenan din particule

crește [552], și a fost constatat și în cazul imobilizatelor de cu celule de drojdie de bere care

aveau în compoziția matricii această polizaharidă (subcapitolul 5.5)

Pentru proba P3 se observă că microparticulele de chitosan ce conțin curcumină, în

număr mare, sunt bine prinse în rețeaua polimeră a matricii de gelan. Diametrul lor este de

aproximativ 2-3 μm.

8.2. Capacitatea de umflare în medii apoase

Capacitatea particulelor de a se umfla în medii diferite a fost evaluată prin măsurarea

gradului de umflare. Acesta a fost determinat gravimetric pentru probele P3, P4 și P5 în

soluție tampon fosfat pH = 7,4 precum și în soluție ce simulează fluidul gastric intestinal la

pH 2. Probele diferă prin cantitatea de agent de reticulare din baia de gelifiere.

În figura 88 sunt prezentate curbele de variație în timp ale gradului de umflare

determinat în medii de pH diferit.

P1 P2

P3

Page 240: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

239

a b

Figura 88. Variația în timp a gradului de umflare pentru probele P3, P4 și P5. (a) soluție

tampon fosfat pH = 7,4 ; (b) soluție care simulează lichidul gastric pH = 2.

O primă constatare este faptul că valoarea gradului de umflare este mai ridicată în

mediu ușor bazic (fig. 88a). Explicația este legată de faptul că particulele prezintă gelan în

stratul exterior, pH-ul bazic având ca efect formarea de anioni carboxilat din grupele acide

care nu au participat la reticularea cu ionii de Mg2+. Apar astfel respingeri electrostatice între

macromoleculele de polizaharid, care determină relaxarea rețelei și facilitează pătrunderea

unor cantități mai mari de apă. Concluzii similare sunt raportate în literatură [555].

La pH = 2, gradul de umflare mai mic poate fi explicat ca fiind o consecință a

formării legăturilor de hidrogen între grupele carboxilice și grupările –OH din polizaharide,

efect raportat anterior și de către alți cercetători [444, 555].

Indiferent de mediul de umflare folosit, gradul de umflare crește cu reducerea

gradului de reticulare, respectiv a cantității de reticulant ionic folosit.

8.3. Cinetica de eliberare a curcuminei din particule

Cinetica de eliberare a curcuminei a fost studiată, de asemenea, în două medii

diferite de pH: soluție tampon fosfat pH = 7,4 și soluție care simulează fluidul gastric la pH

= 2, la temperatura fiziologică (T=37˚C), până la echilibru. În figura 89 sunt prezentate

curbele de eliberare pentru probele analizate.

0

500

1000

1500

2000

2500

0 5 10 15

Gra

du

l d

e u

mfl

are

. Q%

P3

P4

P5

Timp (h)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 5 10 15

Gra

du

l d

e u

mfl

are

, Q%

Timp (h)

P3

P4

P5

Page 241: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

240

(a) (b)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 500 1000 1500Timp (min)

Can

tita

tea d

e cu

rcu

min

ă

elib

erată

, μ

g

P

1P

2

(c) (d)

Figura 89. Cinetica eliberării curcuminei din diferite particule: (a) P3, P4, P5 în soluție

tampon fosfat pH=7,4; (b) P3, P4, P5 în soluție pH=2; (c) P1, P2 în soluție tampon fosfat

pH= 7.4, (c) P1, P2 în soluție pH 2.

Cantitatea maximă de curcumină eliberată indiferent de probă (respectiv eficiența

de eliberare – tabel 44) este mai mare în soluția tampon fosfat la pH = 7,4 decât în cea care

simulează fluidul gastric la (pH= 2).

0

200

400

600

800

1000

1200

0 2000 4000 6000 8000

Ca

nti

tate

a d

e cu

rcu

min

ă

elib

era

tă, μ

g

Timp (min)

P3

P4

P50

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 5000 10000

Ca

nti

tate

a d

e c

urc

um

ină

e

lib

era

tă, μ

g

Timp (min)

P3

P4P5

0

100

200

300

400

500

600

700

0 2000 4000 6000Ca

nti

tate

a d

e c

urc

um

ină

e

lib

era

tă, μ

g

Timp (min)

P1

P2

Page 242: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

241

Tabel 44. Eficiența de eliberare a curcuminei

în medii cu pH diferit

Proba

Eficiența de eliberare a

curcuminei din particule,

%

pH 7,4 pH 2

P1 68 60,47

P2 73,96 69,75

P3 83,81 64,72

P4 69,17 61,41

P5 58,62 55,32

Eficiența de eliberare crește cu scăderea gradului de reticulare la particulele de

gelan ce conțin microparticule de chitosan cu curcumină imobilizată indiferent de pH-ul

mediului în care a avut loc eliberarea.

Comparând probele P1 și P2, se constată creșterea cantității de curcumină eliberată

atunci când în compoziția amestecului de polimeri este și o cantitate de i-caragenan. Acest

comportament este determinat de porozitatea mai mare a particulelor care permit o difuzie

mai intensă a curcuminei. Și în acest caz cantitatea de curcumină eliberată la pH = 7,4 este

mai mare decât cantitatea de curcumină eliberată la pH = 2, explicația fiind aceeași ca în

cazul anterior anterior.

Eficiența de eliberare mai ridicată în mediu bazic, pentru toate probele analizate,

este, de asemenea, consecința unei umflări mai intense a matricii care permite creșterea

ochiurilor rețelei și, deci, difuzia facilitată a principiului activ.

În cazul P3, P4, P5 eliberarea curcuminei se efectuează cu o viteză mai mare până

la 720 min după care cantitatea de curcumină eliberată în timp începe să scadă până la un

punct de echilibru la aproximativ 5000 min când cantitatea de curcumină eliberată rămâne

constantă atât la pH =7.4 cât și la pH= 2.

În cazul particulelor P1 și P2 la pH =7.4 cantitatea de curcumină eliberată crește

constant până la 1440 minute după care particulele nu mai eliberează. La pH =2 particulele

eliberează curcumină până la 420 minute după care cantitatea de curcumină rămâne

constantă.

Este important de subliniat faptul că cea mai mare parte din curcumina imobilizată

în particule este eliberată în primele 12-15 ore, timp apropiat de cel de staționare a

alimentelor în tractul digestiv, ceea ce permite aucmularea treptată a, practic, întregii

cantități de compus biologic activ în organism.

Page 243: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

242

Se impune a evidenția faptul că în cazul probelor în care curcumina a fost inclusă

după dizolvarea în ulei (P1, P2), chiar și în condițiile unei porozități ridicate indusă de

prezența carageenanului, eficiența de eliberare a principiului activ este mai redusă decât în

cazul celorlalte probe (în care curcumina a fost solubilizată în alcool anterior imobilizării,

alcoolul fiind apoi îndepărtat prin evaporare). Singura expicație plauzibilă o constituie

prezența uleiului, nemiscibil cu mediul apos în care se face eliberarea indiferent de

caracterul său bazic sau acid, ceea ce crează o barieră suplimentară în procesul de eliberare.

Concluzii

Au fost obținute două tipuri de particule sferice pe bază de polizaharide pentru

imobilizarea curcuminei utilizând două metode diferite bazate pe complexarea

polielectrolitică a polizaharidelor constituente și gelifiere ionotropă în prezența ionilor

metalici divalenți.

Eficiența de imobilizare a curcuminei este ridicată atunci când anterior includerii în

particule este dizolvată în alcool, și crește cu creșterea densității de reticulare.

Gradul de umflare și cantitatea de curcumină eliberată din particule cresc atunci

când gradul de reticulare al particulelor scade.

Particulele conținând curcumină dizolvată anterior într-o fază uleioasă manifestă o

eficiență de eliberare mai redusă. Prezența carageenanului în compoziția matricii polimere

determină o morfologie diferită, caracterizată prin porozitate accentuată, ceea ce are ca efect

intensificaprocesului de difuzie.

Indiferent de tipul de particule obținut, curcumina este eliberată conform unor

profiluri cinetice specifice celor două tipuri de imobilizate, atât în mediu acid cât și în mediu

bazic, cu eficiență mai ridicată în cel din urmă.

Page 244: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

243

CONCLUZII GENERALE

Cercetările efectuate în cadrul lucrării de doctorat au abordat un domeniu foarte

actual și de mare interes pentru aplicații în industria alimentară, ce pot fi extinse și la alte

industrii care apelează la biotehnologii.

Scopul lucrării l-a constituit obținerea unor noi sisteme formate din compuși biologic

activi de interes pentru aplicații în industria alimentară, imobilizați în matrici sferice cu

caracter de hidrogel pe bază de polizaharide reticulate ionic.

Din categoria compușilor biologic activi au fost selectați pentru studiu trei tipuri:

celule de de drojdie de bere utilizate în procesul de fermentare a glucozei în vederea

obținerii alcoolului etilic, -amilaza folosită ca biocatalizator în prcesul de hidroliză a

amidonului pentru obținerea glucozei, respectiv curcumina, compus natural cu deosebite

beneficii pentru sănătatea umană, din categoria nutraceuticelor.

Domeniul de aplicații ale imobilizatelor obținute a impus selectarea suporturilor

polimere ținând cont de constrângerile pe care le impune un astfel de produs, care fie

lucrează în contact sau în interiorul organismului uman, fie generează produși care sunt

utilizați în aceste condiții: biocompatibilitate, lipsa toxicității și eliminarea riscului de a

forma produși toxici prin biodegradare în timpul proceselor pe care le catalizează sau în

organimul uman.

Realizarea sistemelor polimer - produs biologic activ sub formă de particule

insolubile în mediul în care lucrează pentru a permite utilizarea lor în cicluri repetate fie de

fermentare (în cazul celulelor de drojdie de bere), fie de hidroliză (în cazul -amilazei), a

impus reticularea polimerilor într-o manieră care să permită accesul prin difuzie al

substratului la principiul activ imobilizat precum și difuzia ulterioară a produșilor de reacție

în afara particulei imobilizatului – respectiv realizarea unor suporturi cu caracter de

hidrogel. In consecință, reticulanții selectați au trebuit să îndeplinească obligatoriu condiția

de a fi netoxici.

Având în vedere toate aceste constrângeri s-a optat pentru utilizarea ca suporturi a

unor polizaharide ionice – gelan, carboximetil celuloză sare sodică, caragenan, chitosan -

reticulabile prin gelifiere ionotropă cu ioni ai unor metale divalente – Ca2+

, Mg2+

, Zn2+

-, sau

prin complexare polielectrolitică, metoda de obținere a suportului sub formă de particule

fiind extruderea prin capilară.

S-au conturat trei direcții de cercetare, determinate de natura compusului biologic

activ imobilizat:

Page 245: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

244

- obținerea de bioreactoare pentru fermentarea glucozei

- obținerea de bioreactoare pentru hidroliza amidonului

- obținerea de nutraceutice.

La finalul fiecărui capitol care raportează rezultatele cercetărilor obținute în cadrul

celor trei direcții au fost prezentate concluziile rezultate în urma studiului. Acestea au

permis stabilirea concluziilor generale ce vor fi prezentate în cele ce urmează.

1. Polizaharidele ionice constituie candidați ideali pentru obținerea de imobilizate ale

celulelor de drojdie de bere, -amilazei și curcuminei, sub formă de particule cu caracter de

hidrogel, printr-un procedeu simplu de gelifiere ionotropă cu ioni metalici divalenți,

utilizând tehnica extruderii prin capilară.

2. Gelanul - folosit ca materie primă de bază pentru obținerea imobilizatelor în toate

cercetările intreprinse în cadrul tezei -, folosit singur constituie o matrice convenabilă, ușor

de reticulat cu ioni de Ca2+

, Mg2+

, Zn2+

conducând la particule stabile în medii apoase sau

alcoolice, astfel încât pot fi utilizate într-un număr ridicat de cicluri de fermentare.

3. Stabilitatea particulelor de gelan gelifiat ionotrop depinde de natura reticulantului,

cantitatea de agent de reticulare din soluția de prereticulare precum și din baia de gelifiere

(coagulare).

4. Ionul Mg2+

din acetatul de magneziu furnizează structuri mai stabile din punct de

vedere mecanic în condițiile păstrării unei viabilitătți celulare ridicate. Ionul de Zn2+

permite

obținerea de performanțe în reticulare comparabile cu ionii Ca2+

și Mg2+, în condițiile

utilizării unor cantități cu un ordin de mărime mai coborâte ca aceștia, determinată de

capacitatea sa de a participa la reticulare și prin legături coordinative cu polizaharidul.

5. Stabilitatea structurală a particulelor, caracteristicile lor morfologice,

caracteristicle de umflare în medii apoase și în final și performanțele în procese de

fermentare sunt influențate de cantitatea de agent de reticulare utilizat atât în faza de pre-

reticulare cât mai ales în cea de gelifiere ionotropă. Cantități mai mari de agent de reticulare

măresc stabilitatea structurală, reduc gradul de umflare în apă prin creșterea densitătății de

reticulare, reduc ușor randamentul în fermentare al imobilizatelor deoarece determină o

difuzie mai lentă a substratului către celulele imobilizate.

6. Particulele suport, fără principiul activ imobilizat, prezintă o structură mai

poroasă, care devine mai densă în prezența celulelor de drijdie, capabile de a participa ele

însele la legături ionice cu matricea și determinând astfel o reticulare mai avansată. Aceste

legături pot explica, de asemenea, ancorarea puternică a celulelor de drojdie în matricea

Page 246: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

245

polimeră responsabilă de faptul că doar o mică parte din acestea difuzează în mediul în care

sunt suspendate particulele.

7. Stabilitatea imobilizatelor este ridicată, indiferent de agentul de reticulare utilizat,

fapt atestat de valoarea ridicată a transmitanței mediilor apose în care sunt suspendate,

precum și de testele reologice efectuate. Această proprietate se păstrează la valori practic

nemodificate în timp.

8. Bioreactoarele pe bază de gelan reticulat cu cele trei tipuri de cationi metalici

manifestă o capacitate ridicată de fermentare a glucozei, superioară chiar utilizării drojdiei

libere.

9. Gelanul poate fi utilizat în amestec cu carboximetil celuloza pentru formarea de

particule prin același procedeu, rezultând structuri interconectate/interpenetrate stabile.

Prezența unui număr mai ridicat de grupe reticulabile în carboximetil celuloză constituie un

avantaj, deoarece permite substituirea unei cantități ridicate de gelan cu un derivat celulozic

mai ieftin.

10. Raportul de combinare a gelanului cu carboximetil celuloza constituie un factor

ce influențează densitatea de reticulare a matricei, și de aici caracteristicile morfologice,

stabilitatea, comportamentul la umflare în medii apoase, capacitatea de fermentare a

imobilizatelor.

11. Amestecuri din trei polizaharide – gelan, carboximetil celuloză sare de sodiu și

caragenan -, în diferite proporții pot fi reticulate cu cei trei cationi metalici, caracteristicile

lor morfologice, structurale și fizico-chimice fiind influențate de raportul polimerilor și de

natura ionului reticulant. Matricile rezultate prezintă o structură complexă, fiind de tip

interconectat/interpenetrat.

12. Prezența caragenanului în compoziția particulelor are ca efect creșterea

porozității acestora cu efecte benefice asupra capacității de difuzie a substratului în miezul

matricei, ce determină final capacitatea de fermentare produsă de acestea.

13. Utilizarea Mg2+

și a Zn2+

ca agenți de reticulare este avantajoasă nu numai prin

caracteristicile pe care le imprimă particulelor, ci și din punct de vedere al beneficiilor aduse

de acești ioni asupra celulelor de drojdie de bere imobilizate: creșterea viabilității și a

capacității de proliferare.

14. Metaboliții din mediul de fermentare, cu caracter toxic, nu au un efect pronunțat

asupra celulelor de drojdie incluse în matricea polimeră; indiferent de compoziția sa, aceasta

păstrează viabilitatea celulară la valori optime în timp.

Page 247: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

246

15. pH-ul mediului de fermentare și durata de păstrare a imobilizatelor în baia de

reticulare influențează activitatea bioreactoarelor, indiferent de compoziția lor; valoarea

optimă a pH-ului în soluția de glucoză supusă fermentării este 5, în concordanță cu rezultate

stabilite în alte cercetări, iar timpul optim de păstrare în baia de reticulare este de 2 ore.

16. Toate imobilizatele păstreaza stabilitate structurală/mecanică ridicată în soluții

apoase de alcool etilic, caracteristică importantă pentru posibilitatea reutilizării lor în cicluri

repetate de fermentare.

17. Fermentarea se produce dominant în particulele purtătoare de celule de drojdie de

bere, și nu în mediul lichid din baia de fermentare, în care se găsește un număr foarte redus

de celule de drojdie libere.

18. Celulele de drojdie de bere proliferează în matricea polimeră, indiferent de natura

sa. In matricea polimeră se găsesc în cea mai mare proporție celule vii, dovadă fiind

viabilitatea celulară care se păstrează la valori foarte ridicate, de minim 82 %, chiar după un

număr mare de cicluri de fermentare.

19. Biorectoarele obținute pot fi recuperate cu ușurință din mediul de fermentare și

reutilizate în alt ciclu fermentativ după o durată scurtă de păstrare în apă distilată. In funcție

de natura reticulantului și a matricel polimere, se poate ajunge până la 40 de cicluri

fermentative, cu randamente permanent superioare celui atins cu celule de drojdie libere.

20. Particulele cu drojdie de bere imobilizată în matrici polizaharidice (simple sau în

amestec) reticulate ionic pot reprezenta o nouă abordare în producerea alcoolului etilic de uz

alimentar sau pentru carburanți (biodiesel) datorită avantajelor pe care le manifestă: ușurință

în obținere, folosirea pentru generarea matricii a unor polizaharide ieftine, din surse

regenarabile, utilizarea de agenți de reticulare ieftini, consum redus de biocatalizator

(drojdie de bere) datorită posibilității de utilizare repetată un număr mare de cicluri

fermentative, recuperare facilă din mediul de fermentare, potențiala rezolvare a deficitului

de ioni metalici importanți pentru proliferarea și viabilitatea celulelor de drojdie – problemă

cu care se confruntă producătorii din industria băuturilor alcoolice -, posibilitatea trecerii la

procese de fermentare continui cu avantajele binecunoscute. O potențială utilizare o poate

constitui șampanizarea vinurilor, industrie în care în prezent se utilizează imobilizate pe

bază de alginat, mai puțin stabile structural.

21. Gelanul constituie o matrice adecvată pentru imobilizarea -amilazei, în scopul

obținerii de particule prin gelifiere ionotropă cu ioni de Mg2+, potențial utilizabile în procese

repetate de hidroliză a amidonului.

Page 248: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

247

22. Morfologia și proprietățile de umflare în medii apoase ale particulelor sunt și în

acest caz influențate de cantitatea de reticulant. Particulele prezintă în structură o morfologie

fibrilară, tot mai densă cu creșterea cantității de reticulant, cu capacitate de umflare în apă

ce diminuiază cu acest parametru.

23. Particulele de imobilizat manifestă o activitate biocatalitică maximă la

temperatura de 60˚C și pH= 5,6, la fel ca și enzima liberă, ceea ce atestă faptul că prin

imobilizarea enzima nu este denaturată.

24. Valoarea mai ridicată a constantei Michaelis-Menten pentru enzima imobilizată

atestă, după cum era de așteptat, o afinitate ușor mai redusă a acesteia pentru substrat

(amidon), determinată și de gradele mai mici de libertate ale enzimei, și de factori sterici.

25. Imobilizatele de -amilază imobilizată pot fi ușor recuperate din mediul de

hidroliză, având capacitatea de reutilizare până la 11 cicluri hidrolitice repetate fără scăderea

activității enzimatice; activitatea enzimatică se reduce apoi treptat până la cel de al 19-lea

ciclu.

26. Activitatea enzimatică a imobilizatelor poate fi readusă aproape de valoarea

inițială prin regenerare într-un mediu mai acid.

27. Imobilizatele de -amilază în matrici reticulate ionic pe bază de gelan deschid

perspectiva utilizării în procese hidrolitice continui, cu toate avantajele ce decurg din

acestea.

28. Polizaharidele ionice constituie candidați importanți la realizarea de matrici

pentru imobilizarea curcuminei, conducând la noi formulări nutraceutice.

29. Complexarea polielectrolitică a unor perechi de polizaharide cu caracter ionic

diferit – gelan și chitosan – completată de gelifierea ionotropă cu ioni metalici divalenți,

realizată prin două tehnici diferite, permite obținerea de particule capabilă să încorporeze

curcumina.

30. Particulele de imobilizat prezintă morfologii diferite funcție de modul de

obținere: fie de tip ‖miez-manta‖ când miezul este format din gelan gelifiat ionotrop,

conținând curcumină, complexat ulterior polielectrolitic cu chitosan, fie de tip

microparticule de chitosan conținând curcumină, dispersate într-o matrice de gelan gelifiat

ionotrop cu care formează complexul polielectrolitic.

30. Eficiența de imobilizare a curcuminei crește daca aceasta este dizolvată inițial în

alcool etilic ce este ulterior îndepărtat prin evaporare; creșterea gradului de reticulare a

matricii determină creșterea cantității de curcumină incapsulată.

Page 249: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

248

31. Caracteristicile de umflare în apă și catntitatea de curcumina eliberată în medii de

pH diferit se îmbunătățesc prin reducerea gradului de reticulare a matricii de gelan.

32. Utilizarea carageenanului în amestec cu gelanul determină o morfologie diferită,

caracterizată prin porozitate accentuată, ceea ce are ca efect intensificarea difuziei

curcuminei în procesul de eliberare.

33. Profilul de eliberare a curcuminei este specific celor două tipuri de imobilizate

obținute, atât în mediu acid simulând pH-ul gastric (acid) cât și cel intestinal (bazic),

procesul decurgând cu eficiență mai ridicată în cel din urmă.

Page 250: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

249

Bibliografie:

[1] C. Bro, B. Regenberg, J. Forster, J. Nielsen, ―In silico aided metabolic engineering of Sa

ccharomyces cerevisiae for improved bioethanol production,‖ Metabolic Engineering, vol. 8,

no. 2, pp. 102–111, 2006.

[2] C. A. Cardona, Ó. J. Sánchez, ―Fuel ethanol production: Process design trends and integr

ation opportunities,‖ Bioresource Technology, vol. 98, no. 12, pp. 2415–2457, 2007.

[3] B. C. H. Chu, H. Lee, ―Genetic improvement of Saccharomyces cerevisiae for xylose fer

mentation,‖ Biotechnology Advances, vol. 25, no. 5, pp. 425–441, 2007.

[4] W. K. Bronn, The technology of yeast production-Baker‘s yeast –Technical University,

Berlin (1984/85)

[5] A. J. Dobbs, M. Peleg, R. E. Mudgett, R. Rufner, ―Some physical characteristics of activ

e dry yeast,‖ Powder Technology, vol. 32, no. 1, pp. 63–69, 1982.

[6] G. Reed, T. W. Nagodawithana, ―Baker‘s Yeast Production,‖ Yeast Technology, pp. 261

–314, 1991.

[7] E. Potthoff, O. Guillaume-Gentil, D. Ossola, J. Polesel-Maris, S. LeibundGut-Landmann

, T. Zambelli, J. A. Vorholt, ―Rapid and Serial Quantification of Adhesion Forces of Yeast a

nd Mammalian Cells,‖ PLoS ONE, vol. 7, no. 12, p. e52712, 2012.

[8] F. Randez-Gil, I. Córcoles-Sáez, J. A. Prieto. ‖Genetic and Phenotypic Characteristics

of Baker's Yeast: Relevance to Baking,‖ Annual Review of Food Science and Technology

Vol. 4, pp.191-214, 2013.

[9] F. M. Klis, C. G. de Koster, S. Brul, ―Cell Wall-Related Bionumbers and Bioestimates of

Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans,‖ Eukaryotic Cell, vol. 13, no. 1, pp. 2–9, 2

013.

[10] H. C. Lange, J. J. Heijnen, ―Statistical reconciliation of the elemental and molecular bio

mass composition of Saccharomyces cerevisiae,‖ Biotechnology and Bioengineering, vol. 7

5, no. 3, pp. 334–344, 2001.

Page 251: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

250

[11] J. Youatt, ―Calcium and Microorganisms,‖ Critical Reviews in Microbiology, vol. 19, n

o. 2, pp. 83–97, 1993.

[12] G. M. Walker, ―The Roles of Magnesium in Biotechnology,‖ Critical Reviews in Biote

chnology, vol. 14, no. 4, pp. 311–354, 1994.

[13] R. P. Jones, G. M. Gadd, ―Ionic nutrition of yeast—physiological mechanisms involved

and implications for biotechnology,‖ Enzyme and Microbial Technology, vol. 12, no. 6, pp.

402–418, 1990.

[14] B. R. Gibson, ―125th Anniversary Review: Improvement of Higher Gravity Brewery Fe

rmentation via Wort Enrichment and Supplementation,‖ Journal of the Institute of Brewing,

vol. 117, no. 3, pp. 268–284, 2011.

[15] J. J. Rautio, A. Huuskonen, H. Vuokko, V. Vidgren, J. Londesborough, ―Monitoring ye

ast physiology during very high gravity wort fermentations by frequent analysis of gene expr

ession,‖ Yeast, vol. 24, no. 9, pp. 741–760, 2007.

[16] J. Ding, X. Huang, L. Zhang, N. Zhao, D. Yang, K. Zhang, ―Tolerance and stress respo

nse to ethanol in the yeast Saccharomyces cerevisiae,‖ Applied Microbiology and Biotechno

logy, vol. 85, no. 2, pp. 253–263, 2009.

[17] X. Q. Zhao, F. W. Bai, ―Mechanisms of yeast stress tolerance and its manipulation for e

fficient fuel ethanol production,‖ Journal of Biotechnology, vol. 144, no. 1, pp. 23–30, 2009.

[18] D. Briggs, C. Boulton, P. Brookes, R. Stevens, ―Brewing,‖ Brewing Science and Practi

ce. Woodhead, Cambridge, UK, pp. 410-439, 2004

[19] M.K. Somda, A. Savadogo, B. Nicolas, T. Philippe, T.A. Sabadenedyo, „Effect of

mineral salts in fermentation process using mango residues as carbon sources for bioethanol

production‖, Asian J. Ind. Engr.,vol. 3, pp. 29-38, 2011.

[20] F.-Q. Wang, C.-J. Gao, C.-Y. Yang, P. Xu, ―Optimization of an ethanol production med

ium in very high gravity fermentation,‖ Biotechnology Letters, vol. 29, no. 2, pp. 233–236,

2006.

Page 252: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

251

[21] B. R. Gibson, ―125th Anniversary Review: Improvement of Higher Gravity Brewery Fe

rmentation via Wort Enrichment and Supplementation,‖ Journal of the Institute of Brewing,

vol. 117, no. 3, pp. 268–284, 2011.

[22] G. M. Walker, R. De Nicola, S. Anthony, R. Learmonth, ―Yeast-metal

interactions:impact on brewing and distilling fermentations‖, J. Inst. Brew Dist. APSC.,

pp.19-24, 2006.

[23] P. Aleksander, A. Piotr, M. Makarewicz, ‖Accumulation and release of metal ions by

brewer‘s yeast during successive fermentations ‖, J InstBrew, vol. 115, no 1, pp. 78-83,

2009.

[24] N. P. Pisat, A. Pandey, C. W. MacDiarmid, ―MNR2 Regulates Intracellular Magnesium

Storage in Saccharomyces cerevisiae,‖ Genetics, vol. 183, no. 3, pp. 873–884, 2009.

[25] R. De Nicola, N. Hall, S.G. Melville, G.M. Walker, ‖Influence of zinc on distiller‘s

yeast: cellular accumulation of zinc and impact on spirit congeners,‖ J Inst. Brew., vol. 115,

no 3, pp. 265-271, 2009.

[26] D. J. Eide, ―Zinc transporters and the cellular trafficking of zinc,‖ Biochimica et Bioph

ysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research, vol. 1763, no. 7, pp. 711–722, 2006.

[27] R. M. Birch, G. M. Walker, ―Influence of magnesium ions on heat shock and ethanol st

ress responses of Saccharomyces cerevisiae,‖ Enzyme and Microbial Technology, vol. 26, n

o. 9–10, pp. 678–687, 2000.

[28] H. O. Udeh, T. E. Kgatla, A. I. O. Jideani, „Effect of mineral ion addition on yeast

performance during very high gravity wort fermentation‖, International Journal of

Biological, Biomolecular, Agricultural, Food and Biotechnological Engineering, vol 8, pp.

1208-1216, 2014

[29] R. J. Elin, ―Magnesium: The Fifth but Forgotten Electrolyte,‖ Am J Clin Pathol, vol. 10

2, no. 5, pp. 616–622, 1994.

[30] A. Hartwig, ―Role of magnesium in genomic stability,‖ Mutation Research/Fundamenta

l and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, vol. 475, no. 1–2, pp. 113–121, 2001.

[31] O. Udeh, T.E Kgatla, ―Role of magnesium ions on yeast performance during very high

gravity fermentation,‖ Journal of Brewing and Distilling, vol. 4, no. 2, pp. 19–45, 2013.

Page 253: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

252

[32] G. M. Walker, ―Metals in Yeast Fermentation Processes,‖ Advances in Applied Microb

iology, pp. 197–229, 2004.

[33] J. Bose, O. Babourina, Z. Rengel, ―Role of magnesium in alleviation of aluminium toxi

city in plants,‖ Journal of Experimental Botany, vol. 62, no. 7, pp. 2251–2264, 2011.

[34] S. Blazejak, W. Duszkiewicz-Reinhard, M. Gniewosz, P. Wiatrzyk, ―Impact of magnesi

um and mannose in the cultivation media on the magnesium biosorption, the biomass yield a

nd on the cell wall structure of Candida utilis yeast,‖ European Food Research and Technolo

gy, vol. 227, no. 3, pp. 695–700, 2007.

[35] F. M. Klis, C. G. de Koster, S. Brul, ―Cell Wall-Related Bionumbers and Bioestimates

of Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans,‖ Eukaryotic Cell, vol. 13, no. 1, pp. 2–9,

2013.

[36] J. K. Park, J. W. Lee, J. Y. Jung, ―Cadmium uptake capacity of two strains of Saccharo

myces cerevisiae cells,‖ Enzyme and Microbial Technology, vol. 33, no. 4, pp. 371–378, 20

03.

[37] N. P. Pisat, A. Pandey, C. W. MacDiarmid, ―MNR2 Regulates Intracellular Magnesium

Storage in Saccharomyces cerevisiae,‖ Genetics, vol. 183, no. 3, pp. 873–884, 2009.

[38] M. Gniewosz, W. Duszkiewicz-Reinhard, S. Blazejack, J. Sobiecka, M. Zarzecka,

„Investigations into magnesium biosorption by waste brewery yeast Saccharomyces

uvarum‖, Acta Sci. Pol.Technol. Aliment., vol. 6, no. 1, pp. 57-67, 2007.

[39] K. J. Blackwell, I. Singleton, J. M. Tobin, ―Metal cation uptake by yeast: a review,‖ Ap

plied Microbiology and Biotechnology, vol. 43, no. 4, pp. 579–584, 1995.

[40] S.V. Avery, J. M. Tobin, „Mechanism of strontium uptake by laboratory and

brewingstrains of Saccharomyces cerevisiae‖, Appl. Environ. Microbiol., vol. 58, pp. 3883-

3889, 1992.

[41] A. Graschopf, J. A. Stadler, M. K. Hoellerer, S. Eder, M. Sieghardt, S. D. Kohlwein, R.

J. Schweyen, ―The Yeast Plasma Membrane Protein Alr1 Controls Mg2+ Homeostasis and I

s Subject to Mg2+-dependent Control of Its Synthesis and Degradation,‖ Journal of Biologic

al Chemistry, vol. 276, no. 19, pp. 16216–16222, 2001.

[42] A. L. Maynard, The influence of magnesium ions on the growth and metabolism of

Saccharomyces cerevisiae. Thesis, Dundee Institute of Technology, Dundee, UK, 1993.

Page 254: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

253

[43] Maede T, Wurdler-Murphy SM, Saito H (2004). Metabolism of wort by yeast. In:

Brewing Science and Practice Briggs DE, Boulton CA, Brookes PA, Stevens R (2004).

Woodhead Cambridge, UK, pp. 410.

[44] G. M. Walker, „Magnesium as a stress protectant for industrial strains of

Saccharomyces cerevisiae‖, J. Am. Soc. Brew. Chem, vol. 56, pp. 109-113, 1998.

[45] Hu CK, Bai FW, An LJ Enhancing ethanol tolerance of a self-flocculating fusantof

Schizosaccharomyces pombe and Saccharomyces cerevisiae by Mg2+ via reduction in

plasma membrane permeability.Biotechnol. Lett. 25:1191-1194. 2003

[46] Y. Trofimova, G. Walker, A. Rapoport, ―Anhydrobiosis in yeast: influence of calcium a

nd magnesium ions on yeast resistance to dehydration-rehydration,‖ FEMS Microbiology Le

tters, vol. 308, no. 1, pp. 55–61, 2010.

[47] B. S. Levine, J. W. Coburn, ―Magnesium, the Mimic/Antagonist of Calcium,‖ New Eng

land Journal of Medicine, vol. 310, no. 19, pp. 1253–1255, 1984.

[48] E. M. R. Rees, G. G. Stewart, ―Effects of Magnesium, Calcium and Wort Oxygenation

on the Fermentative Performance of Ale and Lager Strains Fermenting Normal and High Gr

avity Worts*,‖ Journal of the Institute of Brewing, vol. 105, no. 4, pp. 211–218, 1999.

[49] P. J. Slininger, B. S. Dien, S. W. Gorsich, Z. L. Liu, ―Nitrogen source and mineral opti

mization enhance d-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124,‖

Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 72, no. 6, pp. 1285–1296, 2006.

[50] R. A. Villen, W. Borzani, A. S. Netto, ―Influence of the accumulation of phosphate and

magnesium ions in the yeast cells on the ethanol productivity in batch ethanol fermentation,‖

Braz. arch. biol. technol., vol. 52, no. 1, pp. 153–155, 2009.

[51] H. Densky, P.J. Gray and A. Buday, „Further studies on the determination of zinc and

its effects on various yeasts‖, Proceedings of the American Society of Brewing Chemists,

93-94, 1966.

[52] R. P. Learmonth and E. Gratton, „Assessment of membrane fluidity in individual yeast

cells by Laurdan Generalised Polarisation and Multi-photon Scanning Fluorescence

Microscopy‖, in: Fluorescence Spectroscopy, Imaging and Probes- New Tools in Chemical,

Page 255: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

254

Physical and Life Sciences, Springer Series on Fluorescence: Methods and Applications,

Springer, Heidelberg, pp. 241-252, 2002.

[53] I. Russell and G. G. Stewart, ―Brewing,‖ Biotechnology Set, pp. 419–462.

[54] Nicola, R.D., et al., Influence of zinc on distillers's yeast: cellular accumulation of zinc

and impact on spirit congeners. J. Inst. Brew. 115(3): p. 265-271, 2009.

[55] V. Vidgren, J. Londesborough, ―125th Anniversary Review: Yeast Flocculation and Se

dimentation in Brewing,‖ Journal of the Institute of Brewing, vol. 117, no. 4, pp. 475–487, 2

011.

[56] Y.-L. Jin, R. Alex Speers, ―Flocculation of Saccharomyces cerevisiae,‖ Food Research

International, vol. 31, no. 6–7, pp. 421–440, 1998.

[57] V. Stehlik-Thomas, V.G. Zetic, D. Stanzer, S. Grba, N. Vahcic, ―Zinc, copper and

manganese enrichment in yeast Saccharomyces cerevisiae‖, Food Technol. Biotechnol., vol

42, no 2, pp. 115-120, 2004.

[58] C. Zufall, T. Tyrell, ―The Influence of Heavy Metal Ions on Beer Flavour Stability,‖

Journal of the Institute of Brewing, vol. 114, no. 2, pp. 134–142, 2008.

[59] M. Shakoury-Elizeh, J. Tiedeman, J. Rashford, T. Ferea, J. Demeter, E. Garcia, R. Rolf

es, P. O. Brown, D. Botstein , C. C. Philpott, ―Transcriptional Remodeling in Response to Ir

on Deprivation in Saccharomyces cerevisiae,‖ Molecular Biology of the Cell, vol. 15, no. 3,

pp. 1233–1243, 2003.

[60] F. Gaensly, G. Picheth, D. Brand, T. M. B. Bonfim, ―The uptake of different iron salts b

y the yeast Saccharomyces cerevisiae,‖ Braz. J. Microbiol., vol. 45, no. 2, pp. 491–494, 201

4.

[61] C. A. Martínez-Garay, R. de Llanos, A. M. Romero, M. T. Martínez-Pastor, S. Puig, ―R

esponses of Saccharomyces cerevisiae Strains from Different Origins to Elevated Iron Conc

entrations,‖ Appl. Environ. Microbiol., vol. 82, no. 6, pp. 1906–1916, 2016.

[62] K. A. Gray, L. Zhao, M. Emptage, ―Bioethanol,‖ Current Opinion in Chemical Biology,

vol. 10, no. 2, pp. 141–146, 2006.

Page 256: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

255

[63] G. N. Vemuri, M. A. Eiteman, J. E. McEwen, L. Olsson, J. Nielsen, ―Increasing NADH

oxidation reduces overflow metabolism in Saccharomyces cerevisiae,‖ Proceedings of the N

ational Academy of Sciences, vol. 104, no. 7, pp. 2402–2407, 2007.

[64] C. Wittmann, M. Hans, W. A. van Winden, C. Ras, J. J. Heijnen, ―Dynamics of intracel

lular metabolites of glycolysis and TCA cycle during cell-cycle-related oscillation inSacchar

omyces cerevisiae,‖ Biotechnology and Bioengineering, vol. 89, no. 7, pp. 839–847, 2005.

[65] H.A. Krebs, P.D.J. Weitzman (1987). Krebs' citric acid cycle: half a century and still

turning. London: Biochemical Society. ISBN 0-904498-22-0

[66] J. S. Morton, „Glycolysis and Alcoholic Fermentation‖, Acts & Facts., vol. 9, no.12,

1980 http://www.icr.org/article/glycolysis-alcoholic-fermentation/

[67] I. Schomburg, A. Chang, S. Placzek, C. Sohngen, M. Rother, M. Lang, C. Munaretto,

S. Ulas, M. Stelzer, A. Grote, M. Scheer, D. Schomburg, ―BRENDA in 2013: integrated rea

ctions, kinetic data, enzyme function data, improved disease classification: new options and

contents in BRENDA,‖ Nucleic Acids Research, vol. 41, no. D1, pp. D764–D772, 2012.

[68] G.M. Cooper, The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. Sunderland (MA): Sinauer

Associates; The Central Role of Enzymes as Biological Catalysts. 2000.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9921/

[69] I.F. Dumitriu, D. Iordănescu, Introducere în enzimologie, Ed. Medicală, Bucureşti,

1981

[70] N. Gheorghiţă, A. Iacobovici, L. Jerca, I. Popovici,‖ Biochimie medicală- curs‖,

Universitatea de Medicină şi Farmacie ― Gr. T. Popa‖, Iaşi, 1996

[71] P. Tomme, N. R. Gilkes, R. C. Miller, A. J. Warren, D. G. Kilburn, ―An internal cellulo

se-binding domain meidates adsorption of an engineered bifunctional xylanase/cellulase,‖ ―

Protein Engineering, Design and Selection,‖ vol. 7, no. 1, pp. 117–123, 1994.

[72] I.Chibata. Immobilized Enzymes, Research and Development. Halsted Press Book,

New York, 298.1978, AM Kilbanov (ed), Analytical Biochemistry, 93, pp. 1-25.1979

[73] H.-B. Shen, K.-C. Chou, ―EzyPred: A top–down approach for predicting enzyme functi

onal classes and subclasses,‖ Biochemical and Biophysical Research Communications, vol.

364, no. 1, pp. 53–59, 2007.

Page 257: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

256

[74] K. O. Soetan, O. O Aiyelaagbe, C. O. Olaiya, A review of the biochemical, biotechnol

ogical and other applications of enzymes, African Journal of Biotechnology, vol. 9, no. 4, p

p. 382-393, 2010.

[75] R. Gupta, P. Gigras, H. Mohapatra, V. K. Goswami, B. Chauhan, ―Microbial α-amylase

s: a biotechnological perspective,‖ Process Biochemistry, vol. 38, no. 11, pp. 1599–1616, 20

03.

[76] M. C. Santa-Maria, C.-J. Chou, G. C. Yencho, C. H. Haigler, W. F. Thompson, R. M. K

elly, B. Sosinski, ―Plant cell calcium-rich environment enhances thermostability of recombin

antly produced α-amylase from the hyperthermophilic bacteriumThermotoga maritime,‖ Bio

technology and Bioengineering, vol. 104, no. 5, pp. 947–956, 2009.

[77] A. Sundarram, T. P. K. Murthy, „α-Amylase Production and Applications: A Review‖,

Journal of Applied & Environmental Microbiology, vol. 2, no. 4, pp.166-175, 2014.

[78] L. Taneja, V. Arya, ―Inhibition of salivary amylase by black tea in high-caries and low-

caries index children: A comparative in vivo study,‖ Ayu, vol. 36, no. 3, pp. 278-282, 2015.

[79] F. A. Scannapieco, G. Torres, M. J. Levine, ‖Salivary a-Amylase: Role in Dental

Plaque and Caries Formation,‖ Critical Reviews in Oral Biology and Medicine, vol. 4(3/4),

pp.301-307, 1993.

[80] U. M. Nater, R. La Marca, K. Erni, U. Ehlert, ―Alpha-Amylase Activity in Blood Increa

ses after Pharmacological, But Not Psychological, Activation of the Adrenergic System,‖ PL

oS ONE, vol. 10, no. 6, p. e0130449, 2015.

[81] W. R. Matull, S.P. Pereira, J.W. O‘Donohue, ―Biochemical markers of acute pancreatiti

s,‖ Journal of Clinical Pathology, vol. 59, no. 4, pp. 340–344, 2006.

[82] P. M. De Souza, P. de Oliveira Magalhães,‖ Application of microbial α-amylase in

industry – A review‖. Brazilian Journal of Microbiology, vol. 41, no. 4, pp. 850-861, 2010.

[83] A. S. Melim Miguel, T. Souza, E. V. da Costa Figueiredo, B. W. Paulo Lobo, G. Maria,

―Enzymes in Bakery: Current and Future Trends,‖ Food Industry, 2013.

[84] A. G. Cunha, A. Gandini, ―Turning polysaccharides into hydrophobic materials: a critic

al review. Part 2. Hemicelluloses, chitin/chitosan, starch, pectin and alginates,‖ Cellulose, vo

l. 17, no. 6, pp. 1045–1065, 2010.

Page 258: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

257

[85] M. J. E. . van der Maarel, B. van der Veen, J. C. . Uitdehaag, H. Leemhuis, L. Dijkhuiz

en, ―Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family,‖ Jou

rnal of Biotechnology, vol. 94, no. 2, pp. 137–155, 2002.

[86] R. A. Talja, M. Peura, R. Serimaa, K. Jouppila, ―Effect of Amylose Content on Physica

l and Mechanical Properties of Potato-Starch-Based Edible Films,‖ Biomacromolecules, vol.

9, no. 2, pp. 658–663, 2008.

[87 ca 85] M. J. E. . van der Maarel, B. van der Veen, J. C. . Uitdehaag, H. Leemhuis, L. Dij

khuizen, ―Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family,

‖ Journal of Biotechnology, vol. 94, no. 2, pp. 137–155, 2002.

[88] W. Douglas Crabb, C. Mitchinson, ―Enzymes involved in the processing of starch to su

gars,‖ Trends in Biotechnology, vol. 15, no. 9, pp. 349–352, 1997.

[89] S. Kumar, T. Satyanarayana, ―Purification and Kinetics of a Raw Starch-Hydrolyzing,

Thermostable, and Neutral Glucoamylase of the Thermophilic Mold Thermomucor indicae-s

eudaticae,‖ Biotechnology Progress, vol. 19, no. 3, pp. 936–944, 2003.

[90] P. M. de Souza, P. de Oliveira e Magalhães, Brazilian Journal of Microbiology 41: 850-

861, 2010

[91] Iurciuc Camelia Elena (Tincu)http://www.infoapollonia.ro/sanatate/substantele-

nutraceutice-si-alimentele-functionale-o-noua-abordare-in-preventia-bolilor-cronice/

[92] H. K. Bieselskl, Nutraceuticals: the link between nutrition and medicine. 2nd Edition.

New York: Marcel Deckker. Chapter 3 Nutraceuticals in health and disease prevention: p. 1-

26, 2001

[93] M. A. Augustin, Y. Hemar, ―Nano- and micro-structured assemblies for encapsulation o

f food ingredients,‖ Chem. Soc. Rev., vol. 38, no. 4, pp. 902–912, 2009.

[94] C. J. Henry, ―Functional foods,‖ European Journal of Clinical Nutrition, vol. 64, no. 7,

pp. 657–659, 2010.

[95] F. Yangilar, ―The Application of Dietary Fibre in Food Industry: Structural Features, Ef

fects on Health and Definition, Obtaining and Analysis of Dietary Fibre: A Review‖, J Food

Nutr,. Vol. 1, No. 3, 13-23, 2013.

Page 259: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

258

[96] M. De Vresee, J. Schrezenmeier, ―Probiotics, prebiotics, and synbiotics‖, Adv Biochem

Eng Biotechnol. ; 111:1-66, 2008

[97] R. H. Liu, „Health benefits of fruit and vegetables are from additive and synergistic

combinations of phytochemicals‖, Am. J. Clin. Nutr., 5184-5208, 2003.

[98] M. Abeywardena, R. J. Head, ―Longchain n−3 polyunsaturated fatty acids and blood ve

ssel function,‖ Cardiovascular Research, vol. 52, no. 3, pp. 361–371, 2001.

[99] RJ FitzGerald, BA Murray, DJ Walsh, „Hypotensive peptides from milk proteins‖, J

Nutr, vol. 134, no. 4,pp. 980-988, 2004.

[100] N. I. Krinsky, E. J. Johnson, ―Carotenoid actions and their relation to health and diseas

e,‖ Molecular Aspects of Medicine, vol. 26, no. 6, pp. 459–516, 2005.

[101] L.C. Tapsell , I. Hemphill, L. Cobiac, C.S. Patch, D.R. Sullivan,M. Fenech,

S.Roodenrys ,J.B. Keogh, P.M. Clifton, P.G. Williams ,V.A. Fazio, K.E. Inge, „Health

benefits of herbs and spices: the past, the present, the future‖, Med J Aust., 185, pp. 4-24,

2006

[102] C. J. Henry, ―Functional foods,‖ European Journal of Clinical Nutrition, vol. 64, no. 7,

pp. 657–659, 2010.

[103] D. J. McClements, E. A. Decker, J. Weiss, ―Emulsion-Based Delivery Systems for Lip

ophilic Bioactive Components,‖ Journal of Food Science, vol. 72, no. 8, pp. R109–R124, 20

07.

[104] D. B. Genovese, J. E. Lozano, M. A. Rao, ―The Rheology of Colloidal and Noncolloid

al Food Dispersions,‖ Journal of Food Science, vol. 72, no. 2, pp. R11–R20, 2007.

[105] DJ McClements. Food Emulsions: Principles, Practice, and Techniques. (2nd ed ed.).

Boca Raton: CRC Press 2005.

[106] D. J. McClements, E. A. Decker, Y. Park, J. Weiss, ―Designing Food Structure to Con

trol Stability, Digestion, Release and Absorption of Lipophilic Food Components,‖ Food Bi

ophysics, vol. 3, no. 2, pp. 219–228, 2008.

[107] E. Acosta, ―Testing the effectiveness of nutrient delivery systems,‖ Delivery and Cont

rolled Release of Bioactives in Foods and Nutraceuticals, pp. 53–106, 2008.

Page 260: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

259

[108] R. M. Faulks, S. Southon, ―Assessing the bioavailability of nutraceuticals,‖ Delivery a

nd Controlled Release of Bioactives in Foods and Nutraceuticals, pp. 3–25, 2008.

[109] D. J. McClements, Y. Li, ―Review of in vitro digestion models for rapid screening of e

mulsion-based systems,‖ Food & Function, vol. 1, no. 1, pp. 32-59, 2010.

[110] C. Chung, L. Sanguansri, M. A. Augustin, ―In vitro lipolysis of fish oil microcapsules

containing protein and resistant starch,‖ Food Chemistry, vol. 124, no. 4, pp. 1480–1489, 20

11.

[111] C. J. Barrow, C. Nolan, B. J. Holub, ―Bioequivalence of encapsulated and microencap

sulated fish-oil supplementation,‖ Journal of Functional Foods, vol. 1, no. 1, pp. 38–43, 200

9.

[112] E. Choe, D. B. Min, ―Chemistry of Deep-Fat Frying Oils,‖ Journal of Food Science, v

ol. 72, no. 5, pp. R77–R86, 2007.

[113 ca 111] C. J. Barrow, C. Nolan, B. J. Holub, ―Bioequivalence of encapsulated and

microencapsulated fish-oil supplementation,‖ Journal of Functional Foods, vol. 1, no. 1, pp.

38–43, 2009.

[114] R. J. Elias, S. S. Kellerby, E. A. Decker, ―Antioxidant Activity of Proteins and Peptide

s,‖ Critical Reviews in Food Science and Nutrition, vol. 48, no. 5, pp. 430–441, 2008.

[115] E. Choe, D. B. Min, ―Mechanisms of Antioxidants in the Oxidation of Foods,‖

Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, vol. 8, no. 4, pp. 345–358, 2009.

[116] W.H. Telfer, D. Kennedy, Biologia organismelor, Editura Ştiinţifică şi Enciclopedică,

Bucureşti, pp 32-55, 1986

[117] Aggarwal B.B., Kumar A., Bharti A.C. Anticancer Res. 2003, 23, 363–398.

[118] R. Wilken, M. S. Veena, M. B. Wang, E. S. Srivatsan, ―Curcumin: A review of anti-ca

ncer properties and therapeutic activity in head and neck squamous cell carcinoma,‖ Mol Ca

ncer, vol. 10, no. 1, p. 12, 2011.

[119] Grykiewicz G., Silfirski P. Acta Biochim. Pol. 2012, 59, 201–212.

[120] T. Esatbeyoglu, P. Huebbe, I. M. A. Ernst, D. Chin, A. E. Wagner, G. Rimbach, ―Curc

umin-From Molecule to Biological Function,‖ Angewandte Chemie International Edition, v

ol. 51, no. 22, pp. 5308–5332, 2012.

Page 261: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

260

[121] S. C. Gupta, S. Prasad, J. H. Kim, S. Patchva, L. J. Webb, I. K. Priyadarsini, B. B. Ag

garwal, ―Multitargeting by curcumin as revealed by molecular interaction studies,‖ Natural

Product Reports, vol. 28, no. 12, pp. 1937-1955, 2011.

[122] K. Indira Priyadarsini, ―Chemical and Structural Features Influencing the Biological A

ctivity of Curcumin,‖ Current Pharmaceutical Design, vol. 19, no. 11, pp. 2093–2100, 2013.

[123] Vogel, H.A.; Pelletier. J. Pharma 1815, 2, 50.

[124]S. Singh, B. B. Aggarwal, ―Activation of Transcription Factor NF- B Is Suppressed by

Curcumin (Diferuloylmethane),‖ Journal of Biological Chemistry, vol. 270, no. 42, pp. 2499

5–25000, 1995.

[125] P. S. Ramanjaneyulu, Y. S. Sayi, V. A. Raman, K. L. Ramakumar, ―Spectrophotometr

ic determination of boron in nuclear grade uranium compounds with curcumin and studies o

n effect of HNO3,‖ Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, vol. 274, no. 1, pp. 1

09–114, 2007.

[126] V. P. Paulucci, R. O. Couto, C. C. C. Teixeira, L. A. P. Freitas, ―Optimization of the e

xtraction of curcumin from Curcuma longa rhizomes,‖ Revista Brasileira de Farmacognosia,

vol. 23, no. 1, pp. 94–100, 2013.

[127] Lee, K.J.; Yang, H.J.; Jeong, S.W.; Ma, J.Y. Korean J. Pharmacogn. 2012, 43, 250–

256.

[128] K.-J. Lee, J.-Y. Ma, Y.-S. Kim, D.-S. Kim, Y. Jin, ―High Purity Extraction and Simult

aneous High-performance Liquid Chromatography Analysis of Curcuminoids in Turmeric,‖

Journal of Applied Biological Chemistry, vol. 55, no. 1, pp. 61–65, 2012.

[129] M. Li, M. O. Ngadi, Y. Ma, ―Optimisation of pulsed ultrasonic and microwave-assiste

d extraction for curcuminoids by response surface methodology and kinetic study,‖ Food Ch

emistry, vol. 165, pp. 29–34, 2014.

[130] K. Patel, G. Krishna, E. Sokoloski, Y. Ito, ―Preparative separation of curcuminoids fro

m crude curcumin and turmeric powder by ph-zone-refining countercurrent chromatography

,‖ Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, vol. 23, no. 14, pp. 2209–221

8, 2000.

Page 262: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

261

[131] Y.-J. Kim, H. J. Lee, Y. Shin, ―Optimization and Validation of High-Performance Liq

uid Chromatography Method for Individual Curcuminoids in Turmeric by Heat-Refluxed Ex

traction,‖ Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 61, no. 46, pp. 10911–10918, 20

13.

[132] M. Takenaka, T. Ohkubo, H. Okadome, I. Sotome, T. Itoh, S. Isobe, ―Effective Extrac

tion of Curcuminoids by Grinding Turmeric (Curcuma longa) with Medium-chain Triacylgl

ycerols,‖ Food Science and Technology Research, vol. 19, no. 4, pp. 655–659, 2013.

[133] W. Baumann, S. V. Rodrigues, L. M. Viana, ―Pigments and their solubility in and extr

actability by supercritical CO2 - I: the case of curcumin,‖ Brazilian Journal of Chemical Eng

ineering, vol. 17, no. 3, pp. 323–328, 2000.

[134] A. L. Chassagnez-Méndez, N. C. F. Corrêa, L. F. França, N. T. Machado, M. E. Araúj

o, ―A mass transfer model applied to the supercritical extraction with CO2 of curcumins fro

m turmeric rhizomes (Curcuma longa L),‖ Brazilian Journal of Chemical Engineering, vol. 1

7, no. 3, pp. 315–322, 2000.

[135] N. Kurmudle, L. D. Kagliwal, S. B. Bankar, R. S. Singhal, ―Enzyme-assisted extractio

n for enhanced yields of turmeric oleoresin and its constituents,‖ Food Bioscience, vol. 3, pp

. 36–41, 2013.

[136] M. Paramasivam, R. Poi, H. Banerjee, A. Bandyopadhyay, ―High-performance thin la

yer chromatographic method for quantitative determination of curcuminoids in Curcuma lon

ga germplasm,‖ Food Chemistry, vol. 113, no. 2, pp. 640–644, 2009.

[137] I. Ali, A. Haque, K. Saleem, ―Separation and identification of curcuminoids in turmeri

c powder by HPLC using phenyl column,‖ Analytical Methods, vol. 6, no. 8, pp. 2526-2536,

2014.

[138] Lee, K.J.; Kim, Y.S.; Jung, P.M.; Ma, J.Y. Asian J. Chem. 2013, 25, 6306–6310.

[139] Lee, K.J.; Kim, Y.S.; Ma, J.Y. Asian J. Chem. 2013, 25, 909–912.

[140]V. Lampe, J. Milobedzka, ―Studien über Curcumin,‖ Ber. Dtsch. Chem. Ges., vol. 46,

no. 2, pp. 2235–2240, 1913.

Page 263: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

262

[141] K. V. D. Babu, K. N. Rajasekharan, ―SIMPLIFIED CONDITION FOR SYNTHESIS

OF CURCUMIN I AND OTHER CURCUMINOIDS,‖ Organic Preparations and Procedure

s International, vol. 26, no. 6, pp. 674–677, 1994.

[142] S. Venkateswarlu, M. S. Ramachandra, G. V. Subbaraju, ―Synthesis and biological ev

aluation of polyhydroxycurcuminoids,‖ Bioorganic & Medicinal Chemistry, vol. 13, no. 23,

pp. 6374–6380, 2005.

[143] Venkata Rao, E.; Sudheer, P. Indian J. Pharm. Sci. 2011, 73, 262–270.

[144] K. Priyadarsini, ―The Chemistry of Curcumin: From Extraction to Therapeutic Agent,

‖ Molecules, vol. 19, no. 12, pp. 20091–20112, 2014.

[145] Priyadarsini, K.I.. J. Photochem. Photobiol. C 2009, 10, 81–96

[146] K. I. Priyadarsini, ―Free Radical Reactions of Curcumin in Membrane Models,‖ Free

Radical Biology and Medicine, vol. 23, no. 6, pp. 838–843, 1997.

[147] K. I. Priyadarsini, D. K. Maity, G. H. Naik, M. S. Kumar, M. K. Unnikrishnan, J. G. S

atav, H. Mohan, ―Role of phenolic O-H and methylene hydrogen on the free radical reaction

s and antioxidant activity of curcumin,‖ Free Radical Biology and Medicine, vol. 35, no. 5, p

p. 475–484, 2003.

[148] B. Mishra, K. Indira Priyadarsini, M. K. Bhide, R. M. Kadam, H. Mohan, ―Reactions

of Superoxide Radicals with Curcumin: Probable Mechanisms by Optical Spectroscopy and

EPR,‖ Free Radical Research, vol. 38, no. 4, pp. 355–362, 2004.

[149] S. V. Jovanovic, C. W. Boone, S. Steenken, M. Trinoga, R. B. Kaskey, ―How Curcum

in Works Preferentially with Water Soluble Antioxidants,‖ Journal of the American Chemic

al Society, vol. 123, no. 13, pp. 3064–3068, 2001.

[150] Y.-M. Sun, H.-Y. Zhang, D.-Z. Chen, C.-B. Liu, ―Theoretical Elucidation on the Antio

xidant Mechanism of Curcumin: A DFT Study,‖ Organic Letters, vol. 4, no. 17, pp. 2909–29

11, 2002.

[151] J. E. Kim, A. R. Kim, H. Y. Chung, S. Y. Han, B. S. Kim, J. S. Choi, ―In vitro peroxy

nitrite scavenging activity of diarylheptanoids fromCurcuma longa,‖ Phytotherapy Research,

vol. 17, no. 5, pp. 481–484, 2003.

[152] Iwunze, M.O.; McEwan, D. Cell. Mol. Biol. 2004, 50, 749–752.

Page 264: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

263

[153] M. Borsari, E. Ferrari, R. Grandi, M. Saladini, ―Curcuminoids as potential new iron-ch

elating agents: spectroscopic, polarographic and potentiometric study on their Fe(III) comple

xing ability,‖ Inorganica Chimica Acta, vol. 328, no. 1, pp. 61–68, 2002.

[154] Kim, J.E.; Kim, A.R.; Chung, H.Y.; Han, S.Y.; Kim, B.S.; Choi, J.S.. Cell. Mol. Biol.

2004, 50, 749–752.

[155] L. Shen, H.-F. Ji, ―The pharmacology of curcumin: is it the degradation products?,‖ Tr

ends in Molecular Medicine, vol. 18, no. 3, pp. 138–144, 2012.

[156] L. C. Price, R. W. Buescher, ―Kinetics of Alkaline Degradation of the Food Pigments

Curcumin and Curcuminoids,‖ Journal of Food Science, vol. 62, no. 2, pp. 267–269, 1997.

[157] Y.-J. Wang, M.-H. Pan, A.-L. Cheng, L.-I. Lin, Y.-S. Ho, C.-Y. Hsieh, J.-K. Lin, ―Sta

bility of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products,‖ Jour

nal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol. 15, no. 12, pp. 1867–1876, 1997.

[158] M. V. Cañamares, J. V. Garcia-Ramos, S. Sanchez-Cortes, ―Degradation of Curcumin

Dye in Aqueous Solution and on Ag Nanoparticles Studied by Ultraviolet–Visible Absorptio

n and Surface-Enhanced Raman Spectroscopy,‖ Appl Spectrosc, vol. 60, no. 12, pp. 1386–1

391, 2006.

[159] A. Khurana, C.-T. Ho, ―High Performance Liquid Chromatographic Analysis of Curcu

minoids and Their Photo-oxidative Decomposition Compounds in Curcuma Longa L,‖ Journ

al of Liquid Chromatography, vol. 11, no. 11, pp. 2295–2304, 1988.

[160] H. H. Tønnesen, H. de Vries, J. Karlsen, G. B. Van Henegouwen, ―Studies on Curcum

in and Curcuminoids IX: Investigation of the Photobiological Activity of Curcumin Using B

acterial Indicator Systems,‖ Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 76, no. 5, pp. 371–373,

1987.

[161] U. Singh, S. Verma, H. N. Ghosh, M. C. Rath, K. I. Priyadarsini, A. Sharma, K. K. Pu

shpa, S. K. Sarkar, T. Mukherjee, ―Photo-degradation of curcumin in the presence of TiO2 n

anoparticles: Fundamentals and application,‖ Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, v

ol. 318, no. 1–2, pp. 106–111, 2010.

Page 265: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

264

[162] S. Awasthi, U. Pandya, S. S. Singhal, J. T. Lin, V. Thiviyanathan, W. E. Seifert, Y. C.

Awasthi, G. A. S. Ansari, ―Curcumin–glutathione interactions and the role of human glutathi

one S-transferase P1-1,‖ Chemico-Biological Interactions, vol. 128, no. 1, pp. 19–38, 2000.

[163] M. L. P. S. van Iersel, J.-P. H. T. M. Ploemen, I. Struik, C. van Amersfoort, A. E. Key

zer, J. G. Schefferlie, P. J. van Bladeren, ―Inhibition of glutathione S-transferase activity in h

uman melanoma cells by α,β-unsaturated carbonyl derivatives. Effects of acrolein, cinnamal

dehyde, citral, crotonaldehyde, curcumin, ethacrynic acid, and trans-2-hexenal,‖ Chemico-B

iological Interactions, vol. 102, no. 2, pp. 117–132, 1996.

[164] Fang, J.; Jun, L.; Holmegren, A.. J. Biol. Chem. 2005, 280, 25284–25290

[165] Y. Jung, W. Xu, H. Kim, N. Ha, L. Neckers, ―Curcumin-induced degradation of ErbB

2: A role for the E3 ubiquitin ligase CHIP and the Michael reaction acceptor activity of curc

umin,‖ Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research, vol. 1773, no. 3, p

p. 383–390, 2007.

[166] W. Li, W. Wu, F. Yu, H. Huang, X. Liang, J. Ye, ―Catalytic asymmetric Michael addit

ion with curcumin derivative,‖ Organic & Biomolecular Chemistry, vol. 9, no. 7, p. 2505-25

11, 2011.

[167] S. Dutta, S. Padhye, K. I. Priyadarsini, C. Newton, ―Antioxidant and antiproliferative

activity of curcumin semicarbazone,‖ Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 15, n

o. 11, pp. 2738–2744, 2005.

[168] D. Simoni, M. Rizzi, R. Rondanin, R. Baruchello, P. Marchetti, F. P. Invidiata, M. Lab

bozzetta, P. Poma, V. Carina, M. Notarbartolo, A. Alaimo, N. D‘Alessandro, ―Antitumor eff

ects of curcumin and structurally β-diketone modified analogs on multidrug resistant cancer

cells,‖ Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 18, no. 2, pp. 845–849, 2008.

[169] Khalil, M.I.; Al-Zahem, A.M.; Al-Qunaibit, M.H.. Bioinorg. Chem. Appl. 2013,

doi:10.1155/2013/982423.

[170] M. H. M. Leung, T. Harada, T. W. Kee, ―Delivery of Curcumin and Medicinal Effects

of the Copper(II)-Curcumin Complexes,‖ Current Pharmaceutical Design, vol. 19, no. 11, pp

. 2070–2083, 2013.

[171] O. Vajragupta, P. Boonchoong, H. Watanabe, Y. Wongkrajang, N. Kammasud, ―Man

ganese complexes of curcumin and its derivatives: evaluation for the radical scavenging abil

Page 266: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

265

ity and neuroprotective activity,‖ Free Radical Biology and Medicine, vol. 35, no. 12, pp. 16

32–1644, 2003.

[172] O. Vajragupta, P. Boonchoong, L. J. Berliner, ―Manganese Complexes of Curcumin A

nalogues: Evaluation of Hydroxyl Radical Scavenging Ability, Superoxide Dismutase Activi

ty and Stability towards Hydrolysis,‖ Free Radical Research, vol. 38, no. 3, pp. 303–314, 20

04.

[173] A. Barik, B. Mishra, L. Shen, H. Mohan, R. M. Kadam, S. Dutta, H.-Y. Zhang, K. I. P

riyadarsini, ―Evaluation of a new copper(II)–curcumin complex as superoxide dismutase mi

mic and its free radical reactions,‖ Free Radical Biology and Medicine, vol. 39, no. 6, pp. 81

1–822, 2005.

[174] A. Barik, B. Mishra, A. Kunwar, R. M. Kadam, L. Shen, S. Dutta, S. Padhye, A. K. Sa

tpati, H.-Y. Zhang, K. Indira Priyadarsini, ―Comparative study of copper(II)–curcumin com

plexes as superoxide dismutase mimics and free radical scavengers,‖ European Journal of M

edicinal Chemistry, vol. 42, no. 4, pp. 431–439, 2007.

[175] A. Kunwar, H. Narang, K. I. Priyadarsini, M. Krishna, R. Pandey, K. B. Sainis, ―Dela

yed activation of PKCδ and NFκB and higher radioprotection in splenic lymphocytes by cop

per (II)–Curcumin (1:1) complex as compared to curcumin,‖ Journal of Cellular Biochemistr

y, vol. 102, no. 5, pp. 1214–1224, 2007.

[176] P. R. KOIRAM, V. P. VEERAPUR, A. KUNWAR, B. MISHRA, A. BARIK, I. K. PR

IYADARSINI, U. K. MAZHUVANCHERRY, ―Effect of Curcumin and Curcumin Copper

Complex (1:1) on Radiation-induced Changes of Anti-oxidant Enzymes Levels in the Livers

of Swiss Albino Mice,‖ Journal of Radiation Research, vol. 48, no. 3, pp. 241–245, 2007.

[177] Baum, L.; Ng, A.. J. Alzheimer‘s Dis. 2004, 6, 367–377.

[178] T. Jiang, X.-L. Zhi, Y.-H. Zhang, L.-F. Pan, P. Zhou, ―Inhibitory effect of curcumin o

n the Al(III)-induced Aβ42 aggregation and neurotoxicity in vitro,‖ Biochimica et Biophysic

a Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease, vol. 1822, no. 8, pp. 1207–1215, 2012.

[179] T. Jiang, L. Wang, S. Zhang, P.-C. Sun, C.-F. Ding, Y.-Q. Chu, P. Zhou, ―Interaction

of curcumin with Al(III) and its complex structures based on experiments and theoretical cal

culations,‖ Journal of Molecular Structure, vol. 1004, no. 1–3, pp. 163–173, 2011.

Page 267: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

266

[180] M. Gianluca, F. Erika, L. Gigliola, A. Valentina, F. Francesca, M. Claudio, P. Frances

ca, S. Monica, M. Ledi, ―The role of coordination chemistry in the development of innovativ

e gallium-based bioceramics: the case of curcumin,‖ Journal of Materials Chemistry, vol. 21

, no. 13, pp. 5027-5037, 2011.

[181] D. Pucci, T. Bellini, A. Crispini, I. D‘Agnano, P. F. Liguori, P. Garcia-Orduña, S. Piril

lo, A. Valentini, G. Zanchetta, ―DNA binding and cytotoxicity of fluorescent curcumin-base

d Zn(ii) complexes,‖ MedChemComm, vol. 3, no. 4, pp. 462-468, 2012.

[182] X. Mei, D. Xu, S. Xu, Y. Zheng, S. Xu, ―Gastroprotective and antidepressant effects o

f a new zinc(II)–curcumin complex in rodent models of gastric ulcer and depression induced

by stresses,‖ Pharmacology Biochemistry and Behavior, vol. 99, no. 1, pp. 66–74, 2011.

[183] K. K. Sharma, S. Chandra, D. K. Basu, ―Synthesis and antiarthritic study of a new oral

ly active diferuloyl methane (curcumin) gold complex,‖ Inorganica Chimica Acta, vol. 135,

no. 1, pp. 47–48, 1987.

[184] K. H. Thompson, K. Böhmerle, E. Polishchuk, C. Martins, P. Toleikis, J. Tse, V. Yuen

, J. H. McNeill, C. Orvig, ―Complementary inhibition of synoviocyte, smooth muscle cell or

mouse lymphoma cell proliferation by a vanadyl curcumin complex compared to curcumin a

lone,‖ Journal of Inorganic Biochemistry, vol. 98, no. 12, pp. 2063–2070, 2004.

[185] J. Rennolds, S. Malireddy, F. Hassan, S. Tridandapani, N. Parinandi, P. N. Boyaka, E.

Cormet-Boyaka, ―Curcumin regulates airway epithelial cell cytokine responses to the polluta

nt cadmium,‖ Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 417, no. 1, pp.

256–261, 2012.

[186] H. Oguzturk, O. Ciftci, M. Aydin, N. Timurkaan, A. Beytur, F. Yilmaz, ―Ameliorative

effects of curcumin against acute cadmium toxicity on male reproductive system in rats,‖ An

drologia, vol. 44, no. 4, pp. 243–249, 2012.

[187] R. Agarwal, S. K. Goel, J. R. Behari, ―Detoxification and antioxidant effects of curcu

min in rats experimentally exposed to mercury,‖ Journal of Applied Toxicology, pp. 457–46

8, 2010.

[188] S. Daniel, J. L. Limson, A. Dairam, G. M. Watkins, S. Daya, ―Through metal binding,

curcumin protects against lead- and cadmium-induced lipid peroxidation in rat brain homoge

Page 268: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

267

nates and against lead-induced tissue damage in rat brain,‖ Journal of Inorganic Biochemistr

y, vol. 98, no. 2, pp. 266–275, 2004.

[189] V. Eybl, D. Kotyzová, L. Lešetický, M. Bludovská, J. Koutenský, ―The influence of c

urcumin and manganese complex of curcumin on cadmium-induced oxidative damage and tr

ace elements status in tissues of mice,‖ Journal of Applied Toxicology, vol. 26, no. 3, pp. 20

7–212, 2006.

[190] I. Ali, K. Saleem, D. Wesselinova, A. Haque, ―Synthesis, DNA binding, hemolytic, an

d anti-cancer assays of curcumin I-based ligands and their ruthenium(III) complexes,‖ Medi

cinal Chemistry Research, vol. 22, no. 3, pp. 1386–1398, 2012.

[191] A. Valentini, F. Conforti, A. Crispini, A. De Martino, R. Condello, C. Stellitano, G. R

otilio, M. Ghedini, G. Federici, S. Bernardini, D. Pucci, ―Synthesis, Oxidant Properties, and

Antitumoral Effects of a Heteroleptic Palladium(II) Complex of Curcumin on Human Prosta

te Cancer Cells,‖ Journal of Medicinal Chemistry, vol. 52, no. 2, pp. 484–491, 2009.

[192] John, V.D.; Kuttan, G.; Krishnankutty, K.. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2002, 21, 219–

224.

[193] Huang, Q.-M.; Wang, S.; Pan, W.; Deng, P.-X.; Zhou, H.; Pan, Z.-Q.. Chem. J. Chin.

Univ.-Chin. 2012, 33, 732–737.

[194] A. Hussain, K. Somyajit, B. Banik, S. Banerjee, G. Nagaraju, A. R. Chakravarty, ― En

hancing the photocytotoxic potential of curcumin on terpyridyl lanthanide( iii ) complex for

mation ,‖ Dalton Trans., vol. 42, no. 1, pp. 182–195, 2013.

[195] A. Kunwar, A. Barik, R. Pandey, K. I. Priyadarsini, ―Transport of liposomal and albu

min loaded curcumin to living cells: An absorption and fluorescence spectroscopic study,‖ B

iochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1760, no. 10, pp. 1513–1520, 2

006.

[196]L. Li, F. S. Braiteh, R. Kurzrock, ―Liposome-encapsulated curcumin,‖ Cancer, vol. 104

, no. 6, pp. 1322–1331, 2005.

[197] S. Prasad, A. K. Tyagi, B. B. Aggarwal, ―Recent Developments in Delivery, Bioavaila

bility, Absorption and Metabolism of Curcumin: the Golden Pigment from Golden Spice,‖ C

ancer Research and Treatment, vol. 46, no. 1, pp. 2–18, 2014.

Page 269: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

268

[198] B. Wahlström, G. Blennow, ―A Study on the Fate of Curcumin in the Rat,‖ Acta Phar

macologica et Toxicologica, vol. 43, no. 2, pp. 86–92, 2009.

[199] G. Shoba, D. Joy, T. Joseph, M. Majeed, R. Rajendran, P. Srinivas, ―Influence of Pipe

rine on the Pharmacokinetics of Curcumin in Animals and Human Volunteers,‖ Planta Medi

ca, vol. 64, no. 04, pp. 353–356, 1998.

[200] Chang MT, Tsai TR, Lee CY, Wei YS, Chen YJ, Chen CR, et al.. J Agric Food Chem.

2013;61:9666-71

[201] Cheng AL, Hsu CH, Lin JK, Hsu MM, Ho YF, Shen TS, et al. Anticancer Res.

2001;21:2895-900.

[202] R. A. Sharma, S.L. Euden Platton, D.N. Cooke, A. Shafayat, H.R. Hewitt, ―Phase I Cli

nical Trial of Oral Curcumin: Biomarkers of Systemic Activity and Compliance,‖ Clinical C

ancer Research, vol. 10, no. 20, pp. 6847–6854, 2004.

[203]K.-Y. Yang, L.-C. Lin, T.-Y. Tseng, S.-C. Wang, T.-H. Tsai, ―Oral bioavailability of c

urcumin in rat and the herbal analysis from Curcuma longa by LC–MS/MS,‖ Journal of Chr

omatography B, vol. 853, no. 1–2, pp. 183–189, 2007.

[204] J. Sun, C. Bi, H. M. Chan, S. Sun, Q. Zhang, Y. Zheng, ―Curcumin-loaded solid lipid

nanoparticles have prolonged in vitro antitumour activity, cellular uptake and improved in vi

vo bioavailability,‖ Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, vol. 111, pp. 367–375, 2013.

[205] V. G. Kadajji, G. V. Betageri, ―Water Soluble Polymers for Pharmaceutical Applicatio

ns,‖ Polymers, vol. 3, no. 4, pp. 1972–2009, 2011.

[206] F.-L. Mi, Y.-M. Lin, Y.-B. Wu, S.-S. Shyu, Y.-H. Tsai, ―Chitin/PLGA blend microsph

eres as a biodegradable drug-delivery system: phase-separation, degradation and release beh

avior,‖ Biomaterials, vol. 23, no. 15, pp. 3257–3267, 2002.

[207] N. K. Sahu, P. S. Gils, D. Ray, P. K. Sahoo,Advances in Polymer Science and Techno

logy: An International Journal, 3, 22 (2013)

[208] Y. Zhang, C.-C. Chu, ―In vitro Release Behavior of Insulin from Biodegradable Hybri

d Hydrogel Networks of Polysaccharide and Synthetic Biodegradable Polyester,‖ Journal of

Biomaterials Applications, vol. 16, no. 4, pp. 305–325, 2002.

Page 270: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

269

[209] G. A. Abraham, A. Gallardo, J. San Román, A. Fernández-Mayoralas, M. Zurita, J. Va

quero, ―Polymeric matrices based on graft copolymers of PCL onto acrylic backbones for rel

easing antitumoral drugs,‖ Journal of Biomedical Materials Research Part A, vol. 64A, no. 4

, pp. 638–647, 2003.

[210] J. Liu, Y. Xiao, C. Allen, ―Polymer–drug compatibility: A guide to the development o

f delivery systems for the anticancer agent, ellipticine,‖ Journal of Pharmaceutical Sciences,

vol. 93, no. 1, pp. 132–143, 2004.

[211] B. ‐H. Chen, D. J. Lee, ―Slow Release of Drug through Deformed Coating Film: Effec

ts of Morphology and Drug Diffusivity in the Coating Film,‖ Journal of Pharmaceutical Scie

nces, vol. 90, no. 10, pp. 1478–1496, 2001.

[212] Å. Tunón, J. Gråsjö, G. Alderborn, ―Effect of intragranular porosity on compression b

ehaviour of and drug release from reservoir pellets,‖ European Journal of Pharmaceutical Sc

iences, vol. 19, no. 5, pp. 333–344, 2003.

[213] I. Vroman, L. Tighzert, ―Biodegradable Polymers,‖ Materials, vol. 2, no. 2, pp. 307–3

44, 2009.

[214] Morris C (editor) (1992), Academic Press Dictionary of Science and Technology, San

Diego, Academic, 1742

[215] E. C. Y. Li-Chan, The University of British Columbia, Canada, Properties of proteins

in food systems: an introduction, in Proteins in food processing, R. Y. Yada, ed, Published

by Woodhead Publishing Limited Abington Hall, Abington Cambridge CB1 6AH England

www.woodhead-publishing.com (2004)

[216] J. Nehete, M. Narkhede, R. Bhambar, S. Gawali, ―Natural proteins: Sources, isolation,

characterization and applications,‖ Pharmacognosy Reviews, vol. 7, no. 14, pp. 107-116, 20

13.

[217] J. J. Coon, ―Collisions or Electrons? Protein Sequence Analysis in the 21st Century,‖

Anal. Chem., vol. 81, no. 9, pp. 3208–3215, 2009.

[218]S. Y. Cho, C. Rhee, L. Wiss, ―Mechanical properties and water vapor permeability of e

dible films made from fractionated soy proteins with ultrafiltration,‖ LWT - Food Science a

nd Technology, vol. 37, no. 8, pp. 833–839, 2004.

Page 271: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

270

[219] M. Subirade, I. Kelly, J. Guéguen, M. Pézolet, ―Molecular basis of film formation fro

m a soybean protein: comparison between the conformation of glycinin in aqueous solution

and in films,‖ International Journal of Biological Macromolecules, vol. 23, no. 4, pp. 241–2

49, 1998.

[220] J. M. S. Renkema, T. van Vliet, ―Heat-Induced Gel Formation by Soy Proteins at Neut

ral pH,‖ Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 50, no. 6, pp. 1569–1573, 2002.

[221] Haard NF, Chism GW. Characteristics of edible plant tissue. In: Fennema O, editor. F

ood Chemistry.New York, NY: Marcel Dekker; 1996. p. 1067

[222] Kinsella JE. Relationships between structure and functional properties of food proteins

. In: Fon, Codon, editors. Food Proteins. New York: Springer Publishing; 1982. pp. 51–104

[223] K. Dangaran, P. M. Tomasula, P. Qi, ―Structure and Function of Protein-Based Edible

Films and Coatings,‖ Edible Films and Coatings for Food Applications, pp. 25–56, 2009.

[224] R. Shukla, M. Cheryan, ―Zein: the industrial protein from corn,‖ Industrial Crops and

Products, vol. 13, no. 3, pp. 171–192, 2001.

[225] Koyoro H, Powers JR. Functional properties of pea globulin fractions. Cereal Chem. 1

987;64:97–101

[226] A. Nesterenko, I. Alric, F. Silvestre, V. Durrieu, ―Vegetable proteins in microencapsul

ation: A review of recent interventions and their effectiveness,‖ Industrial Crops and Product

s, vol. 42, pp. 469–479, 2013.

[227] J. S. Hamada, ―Characterization and Functional Properties of Rice Bran Proteins Modi

fied by Commercial Exoproteases and Endoproteases,‖ Journal of Food Science, vol. 65, no.

2, pp. 305–310, 2000.

[228] Bienvenido OJ. Rice in human nutrition organization united nations ETL, Agriculture

power, Rome. 1994

[229] K. Kaewka, C. Therakulkait, K. R. Cadwallader, ―Effect of preparation conditions on

composition and sensory aroma characteristics of acid hydrolyzed rice bran protein concentr

ate,‖ Journal of Cereal Science, vol. 50, no. 1, pp. 56–60, 2009.

Page 272: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

271

[230] M. Pinciroli, A. A. Vidal, M. C. Añón, E. N. Martínez, ―Comparison between protein

functional properties of two rice cultivars,‖ LWT - Food Science and Technology, vol. 42, n

o. 10, pp. 1605–1610, 2009.

[231] S. Hata, J. Wiboonsirikul, A. Maeda, Y. Kimura, S. Adachi, ―Extraction of defatted ric

e bran by subcritical water treatment,‖ Biochemical Engineering Journal, vol. 40, no. 1, pp.

44–53, 2008.

[232] I. Sereewatthanawut, S. Prapintip, K. Watchiraruji, M. Goto, M. Sasaki, A. Shotipruk,

―Extraction of protein and amino acids from deoiled rice bran by subcritical water hydrolysi

s,‖ Bioresource Technology, vol. 99, no. 3, pp. 555–561, 2008.

[233] S. Agboola, D. Ng, D. Mills, ―Characterisation and functional properties of Australian

rice protein isolates,‖ Journal of Cereal Science, vol. 41, no. 3, pp. 283–290, 2005.

[234] J. S. Hamada, ―Characterization and Functional Properties of Rice Bran Proteins Modi

fied by Commercial Exoproteases and Endoproteases,‖ Journal of Food Science, vol. 65, no.

2, pp. 305–310, 2000.

[235] C. Ordóñez, M. . Asenjo, C. Benitez, J. . González, ―Obtaining a protein concentrate fr

om integral defatted sunflower flour,‖ Bioresource Technology, vol. 78, no. 2, pp. 187–190,

2001.

[236] S. González-Pérez, J. M. Vereijken, ―Sunflower proteins: overview of their physicoch

emical, structural and functional properties,‖ Journal of the Science of Food and Agriculture,

vol. 87, no. 12, pp. 2173–2191, 2007.

[237] Linden GL. Masson, Paris: 1994. Biochimie agro-industrielle: Valorisation

alimentaire de la pro-duction agricole

[238] J.-L. Audic, B. Chaufer, G. Daufin, ―Non-food applications of milk components and d

airy co-products: A review,‖ Le Lait, vol. 83, no. 6, pp. 417–438, 2003.

[239] Swaisgood HE. Review and update of casein chemistry. J Dairy Sci. 1993;76:3054–61

. Swaisgood HE. Characteristics of milk. In: Fennema O, editor. Food chemistry. New York

: Marcel Dekker; 1996. p. 1067

Page 273: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

272

[240] Y. D. Livney, ―Milk proteins as vehicles for bioactives,‖ Current Opinion in Colloid

& Interface Science, vol. 15, no. 1–2, pp. 73–83, 2010.

[241] Rosemberg M, Young SL. Whey proteins as microencapsulating agents. Microencaps

ulation of anhydrous milk fat structure evaluation. Food Struct. 1993;12:31–41

[242] J. E. Kinsella, C. V. Morr, ―Milk proteins: Physicochemical and functional properties,

‖ C R C Critical Reviews in Food Science and Nutrition, vol. 21, no. 3, pp. 197–262, 1984.

[243] L. Sawyer, G. Kontopidis, S.-Y. Wu, ―beta-Lactoglobulin - a three-dimensional perspe

ctive,‖ International Journal of Food Science and Technology, vol. 34, no. 5–6, pp. 409–418,

1999.

[244] I. J. Haug, K. I. Draget, O. Smidsrød, ―Physical and rheological properties of fish gelat

in compared to mammalian gelatin,‖ Food Hydrocolloids, vol. 18, no. 2, pp. 203–213, 2004.

[245] F. Badii, N. Howell, ―Fish gelatin: Structure, gelling properties and interaction with eg

g albumen proteins,‖ Food Hydrocolloids, vol. 20, no. 5, pp. 630–640, 2006.

[246] Y. Mine, ―Recent advances in the understanding of egg white protein functionality,‖ T

rends in Food Science & Technology, vol. 6, no. 7, pp. 225–232, 1995.

[247] K. Numata, D. L. Kaplan, ―Silk-based delivery systems of bioactive molecules,‖ Adva

nced Drug Delivery Reviews, vol. 62, no. 15, pp. 1497–1508, 2010.

[248] G. H. Altman, F. Diaz, C. Jakuba, T. Calabro, R. L. Horan, J. Chen, H. Lu, J. Richmon

d, D. L. Kaplan, ―Silk-based biomaterials,‖ Biomaterials, vol. 24, no. 3, pp. 401–416, 2003.

[249] A. O. Elzoghby, W. S. Abo El-Fotoh, N. A. Elgindy, ―Casein-based formulations as pr

omising controlled release drug delivery systems,‖ Journal of Controlled Release, vol. 153,

no. 3, pp. 206–216, 2011.

[250] A. O. Elzoghby, W. M. Samy, N. A. Elgindy, ―Albumin-based nanoparticles as potent

ial controlled release drug delivery systems,‖ Journal of Controlled Release, vol. 157, no. 2,

pp. 168–182, 2012.

Page 274: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

273

[251] Y. Yamada, K. Nishizawa, M. Yokoo, H. Zhao, K. Onishi, M. Teraishi, S. Utsumi, M.

Ishimoto, M. Yoshikawa, ―Anti-hypertensive activity of genetically modified soybean seeds

accumulating novokinin,‖ Peptides, vol. 29, no. 3, pp. 331–337, 2008.

[252] M. Esmaili, S. M. Ghaffari, Z. Moosavi-Movahedi, M. S. Atri, A. Sharifizadeh, M. Fa

rhadi, R. Yousefi, J.-M. Chobert, T. Haertlé, A. A. Moosavi-Movahedi, ―Beta casein-micelle

as a nano vehicle for solubility enhancement of curcumin; food industry application,‖ LWT

- Food Science and Technology, vol. 44, no. 10, pp. 2166–2172, 2011.

[253] S. V. Silva, F. X. Malcata, ―Caseins as source of bioactive peptides,‖ International Dai

ry Journal, vol. 15, no. 1, pp. 1–15, 2005.

[254] Z. Persin, K. Stana-Kleinschek, T. J. Foster, J. E. G. van Dam, C. G. Boeriu, P. Navar

d, ―Challenges and opportunities in polysaccharides research and technology: The EPNOE v

iews for the next decade in the areas of materials, food and health care,‖ Carbohydrate Poly

mers, vol. 84, no. 1, pp. 22–32, 2011.

[255] T. Coviello, P. Matricardi, C. Marianecci, F. Alhaique, ―Polysaccharide hydrogels for

modified release formulations,‖ Journal of Controlled Release, vol. 119, no. 1, pp. 5–24, 200

7.

[256] B. Posocco, E. Dreussi, J. de Santa, G. Toffoli, M. Abrami, F. Musiani, M. Grassi, R.

Farra, F. Tonon, G. Grassi, B. Dapas, ―Polysaccharides for the Delivery of Antitumor Drugs,

‖ Materials, vol. 8, no. 5, pp. 2569–2615, 2015.

[257] C. Iurciuc (Tincu), A. Savin, C. Lungu, P. Martin and M. Popa, Gellan. Food

Applications, Cellulose Chem. Technol., 50 (1), 1-13 (2016)

[258] I. W. Sutherland, ―Novel and established applications of microbial polysaccharides,‖

Trends in Biotechnology, vol. 16, no. 1, pp. 41–46, 1998.

[259] A. Sanchez, M.E. Ramirez, L.G. Torres, E. Galindo and W.J. Mob, World J Microbiol

Biotechnol, 13, 443 (1997).

[260] K. Kang, G.T. Veeder, P.J.Mirrasoul, T. Kaneko and I.W. Cottrell,Appl Environ Micr

obiol,43, 1086 (1982).

Page 275: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

274

[261] M.J. Miles, V.J. Morris, M.A. O‘Neill, in ―Gums and Stabilizers for Food Industry‖,

Vol. 2, edited by G.O. Phillips, D.J.Wedlock, P.A. Williams, Pergamon Press, Oxford, UK,

1984, pp. 485–497

[262] I.B. Bajaj, S.A. Survase, P.S. Saudagar and R.S. Singhal, Food Technol. Biotechnol.,

45, 341 (2007)

[263] M.K. Kim, I.Y. Lee, J.H. Ko, Y.H. Rhee and Y.H. Park, Biotechnol. Bioeng, 62, 317 (

1999)

[264] K. M. Nampoothiri, R. R. Singhania, C. Sabarinath, A. Pandey, ―Fermentative product

ion of gellan using Sphingomonas paucimobilis,‖ Process Biochemistry, vol. 38, no. 11, pp.

1513–1519, 2003.

[265] M. G. Sosa-Herrera, C. L. A. Berli, L. P. Martínez-Padilla, ―Physicochemical and rheo

logical properties of oil-in-water emulsions prepared with sodium caseinate/gellan gum mixt

ures,‖ Food Hydrocolloids, vol. 22, no. 5, pp. 934–942, 2008.

[266] P.-E. Jansson, B. Lindberg, P. A. Sandford, ―Structural studies of gellan gum, an extra

cellular polysaccharide elaborated by Pseudomonas elodea,‖ Carbohydrate Research, vol. 12

4, no. 1, pp. 135–139, 1983.

[267] M. A. O‘Neill, R. R. Selvendran, V. J. Morris, ―Structure of the acidic extracellular ge

lling polysaccharide produced by Pseudomonas elodea,‖ Carbohydrate Research, vol. 124, n

o. 1, pp. 123–133, 1983.

[268]G. P. Okiror, C. L. Jones, ―Effect of temperature on the dielectric properties of low acy

l gellan gel,‖ Journal of Food Engineering, vol. 113, no. 1, pp. 151–155, 2012.

[269] R. Chandrasekaran, R. P. Millane, S. Arnott, E. D. T. Atkins, ―The crystal structure of

gellan,‖ Carbohydrate Research, vol. 175, no. 1, pp. 1–15, 1988.

[270] Y. Nitta, R. Takahashi, K. Nishinari, ―Viscoelasticity and Phase Separation of Aqueou

s Na-Type Gellan Solution,‖ Biomacromolecules, vol. 11, no. 1, pp. 187–191, 2010.

[271] S.M. Hasheminya and J.Dehghannya, Intl. J. Agri. Crop. Sci., 5, 3016 (2013)

Page 276: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

275

[272] K.M. Manjanna, T.M. Pramod Kumar,B. Shivakumar, Int J Chem Tech Res., 2, 509 (2

010)

[273] S. Noda, T. Funami, M. Nakauma, I. Asai, R. Takahashi, S. Al-Assaf, S. Ikeda, K. Nis

hinari, G. O. Phillips, ―Molecular structures of gellan gum imaged with atomic force micros

copy in relation to the rheological behavior in aqueous systems. 1. Gellan gum with various

acyl contents in the presence and absence of potassium,‖ Food Hydrocolloids, vol. 22, no. 6,

pp. 1148–1159, 2008.

[274] F. Mazen, M. Milas, M. Rinaudo, ―Conformational transition of native and modified g

ellan,‖ International Journal of Biological Macromolecules, vol. 26, no. 2–3, pp. 109–118, 1

999.

[275] L. Dai, X. Liu, Z. Tong, ―Critical behavior at sol–gel transition in gellan gum aqueous

solutions with KCl and CaCl2 of different concentrations,‖ Carbohydrate Polymers, vol. 81,

no. 2, pp. 207–212, 2010.

[276] E. R. Morris, K. Nishinari, M. Rinaudo, ―Gelation of gellan – A review,‖ Food Hydro

colloids, vol. 28, no. 2, pp. 373–411, 2012.

[277] S. J. Pérez-Campos, N. Chavarría-Hernández, A. Tecante, M. Ramírez-Gilly, A. I. Ro

dríguez-Hernández, ―Gelation and microstructure of dilute gellan solutions with calcium ion

s,‖ Food Hydrocolloids, vol. 28, no. 2, pp. 291–300, 2012.

[278] H. Grasdalen, O. Smidsrød, ―Gelation of gellan gum,‖ Carbohydrate Polymers, vol. 7,

no. 5, pp. 371–393, 1987.

[279] R. Takahashi, H. Tokunou, K. Kubota, E. Ogawa, T. Oida, T. Kawase, K. Nishinari, ―

Solution Properties of Gellan Gum: Change in Chain Stiffness between Single- and Double-

Stranded Chains,‖ Biomacromolecules, vol. 5, no. 2, pp. 516–523, 2004.

[280] M. T. Nickerson, A. T. Paulson, ―Rheological properties of gellan, κ-carrageenan and

alginate polysaccharides: effect of potassium and calcium ions on macrostructure assemblag

es,‖ Carbohydrate Polymers, vol. 58, no. 1, pp. 15–24, 2004.

Page 277: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

276

[281] Y. Huang, P. P. Singh, J. Tang, B. G. Swanson, ―Gelling temperatures of high acyl gel

lan as affected by monovalent and divalent cations with dynamic rheological analysis,‖ Carb

ohydrate Polymers, vol. 56, no. 1, pp. 27–33, 2004.

[282] J. Tang, M. A. Tung, Y. Zeng ―Compression strength and deformation of gellan gels f

ormed with mono- and divalent cations,‖ Carbohydrate Polymers, vol. 29, no. 1, pp. 11–16,

1996.

[283] M. Annaka, J.-I. Honda, T. Nakahira, H. Seki, M. Tokita, ―Multinuclear NMR study o

n the sol-gel transition of gellan gum,‖ Physical Chemistry and Industrial Application of Gel

lan Gum, pp. 25–30, 1999

[284] E. Miyoshi,T. Takaya and K. Nishinari, CarbohydrPolym, 30, 109 (1996)

[285] E. R. Morris, R. K. Richardson, L. E. Whittaker, ―Rheology and gelation of deacylated

gellan polysaccharide with Na+ as the sole counterion,‖ Physical Chemistry and Industrial A

pplication of Gellan Gum, pp. 109–115, 1999.

[286] K. Nishinari and E. Miyoshi, Prog Colloid Polym Sci, 114, 68 (1999)

[287] A.I. Rodr guez-Hernández, S. Durand, C. Garnier, A. Tecante, J. . Doublier, ―Rheolog

y-structure properties of gellan systems: evidence of network formation at low gellan concen

trations,‖ Food Hydrocolloids, vol. 17, no. 5, pp. 621–628, 2003.

[288] E. Manning, and E. R. Morris, in―Food polymers, gels and colloids‖, edited by E.

Dickinson,Cambridge, UK: Royal Society of Chemistry, 1991, pp. 22-33

[289] A. P. Gunning, V. J. Morris, ―Light scattering studies of tetramethyl ammonium gellan

,‖ International Journal of Biological Macromolecules, vol. 12, no. 6, pp. 338–341, 1990.

[290 ca 288] G. Robinson, C. E. Manning, and E. R. Morris, in―Food polymers, gels and

colloids‖, edited by E. Dickinson,Cambridge, UK: Royal Society of Chemistry, 1991, pp.

22-33

[291] Y. Yuguchi, M. Mimura, S. Kitamura, H. Urakawa, K. Kajiwara, ―Structural character

istics of gellan in aqueous solution,‖ Food Hydrocolloids, vol. 7, no. 5, pp. 373–385, 1993.

[292] R. Mao, J. Tang, B. G. Swanson, ―Texture properties of high and low acyl mixed gella

n gels,‖ Carbohydrate Polymers, vol. 41, no. 4, pp. 331–338, 2000.

Page 278: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

277

[293] I. Giavasis, L.M. Harvey, B. McNeil, Crit. Rev.Biotechnol., 20, 177 (2000)

[294] G.R. Sanderson and R. C. Clark, in ―Gums and Stabilizers for the food industry‖, edite

d by G.O. Phillips and D.J. Wedlock, Oxford University press, UK, , 1984, pp. 201-210.

[295] M. Papageorgiou, S. Kasapis, ―The effect of added sucrose and corn syrup on the phys

ical properties of gellan—gelatin mixed gels,‖ Food Hydrocolloids, vol. 9, no. 3, pp. 211–22

0, 1995.

[296] J.R. Tang, M. Mao, A. Tung and B.G. Swanson, Food Hydrocoll.,16, 191, 2002

[297] E. Miyoshi, K. Nishinari, ―Effects of sugar on the sol-gel transition in gellan gum aque

ous solutions,‖ Physical Chemistry and Industrial Application of Gellan Gum, pp. 83–91, 19

99.

[298] E. Miyoshi, T. Takaya, K. Nishinari, ―Effects of glucose, mannose and konjac glucom

annan on the gel–sol transition in gellan gum aqueous solutions by rheology and DSC,‖ Poly

mer Gels and Networks, vol. 6, no. 3–4, pp. 273–290, 1998.

[299]S. Bayarri, E. Costell, L. Durán, ―Influence of low sucrose concentrations on the compr

ession resistance of gellan gum gels,‖ Food Hydrocolloids, vol. 16, no. 6, pp. 593–597, 2002

.

[300] G. Sworn, S. Kasapis, ―Effect of conformation and molecular weight of co-solute on t

he mechanical properties of gellan gum gels,‖ Food Hydrocolloids, vol. 12, no. 3, pp. 283–2

90, 1998.

[301] W. Gibson, G. R. Sanderson, ―Gellan gum,‖ Thickening and Gelling Agents for Food,

pp. 119–143, 1997.

[302] M.A. Rao, in ―Rheology of fluids and semisolid foods: Principles and applications‖, e

dited by G.V. Barbarosa-Canovas, Gaithersburg, MD: Aspen Publishers, 1999, 27-59

[303] M. T. Nickerson, A. T. Paulson, F. R. Hallett, ―Pre-gel solution properties of gellan po

lysaccharides: Effect of potassium and calcium ions on chain associations,‖ Food Research I

nternational, vol. 41, no. 5, pp. 462–471, 2008.

Page 279: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

278

[304] O.P. Nautiyal,J Food Process Technol, 2, 1 (2011), P.A. Williams and G.O. Phillips, i

n ―Handbook of Hydrocolloids‖, edited by G.O Phillips and P.A Williams,Woodhead Publis

hing Ltd,Cambridge, UK, 2000, pp. 1–19, T. Funami, Food Hydrocoll, 25, 1904 (2011)

[305] J. Milan and G.Maleki, in―Food Industrial Processes – Methods and Equipment‖,

edited by B. Valdez, InTech Europe: Croatia, 2012, pp. 17 – 38

[306] V.J. Morris,in―Food polysaccharides and their applications‖, edited by A.M. Stephen,

G.O. Phillips and P.A. Williams, CRC Press Taylor &Francis Group 6000 Broken Sound Pa

rkway NW, 2006, pp. 413-454

[307] A. B. Norton, P. W. Cox, F. Spyropoulos, ―Acid gelation of low acyl gellan gum relev

ant to self-structuring in the human stomach,‖ Food Hydrocolloids, vol. 25, no. 5, pp. 1105–

1111, 2011.

[308] I. T. Norton, W. J. Frith, S. Ablett, ―Fluid gels, mixed fluid gels and satiety,‖ Food Hy

drocolloids, vol. 20, no. 2–3, pp. 229–239, 2006.

[309] D. A. Garrec, S. Frasch-Melnik, J. V. L. Henry, F. Spyropoulos, I. T. Norton, ―Designi

ng colloidal structures for micro and macro nutrient content and release in foods,‖ Faraday

Discussions, vol. 158, p. 37, 2012.

[310] C. Ramalingam, J. Priya and S. Mundra, Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res., 27, 322 (2014)

[311] I.W.Sutherland, in ―Food Biotechnology‖ 2nd

edition, edited by K. Shetty, G. Paliyath,

A. Pometto and R.E. Levin, Taylor and Francis, Boca Raton, FL, USA, 2005, pp. 193-220

[312] N.W.G. Young in ―Gums and stabilizers for the food industry‖, edited by P.A. Willia

ms, G.O. Phillips, Cambridge: RSC, 2002,pp. 226-23

[313] G. Sworn, G. R. Sanderson, W. Gibson, ―Gellan gum fluid gels,‖ Food Hydrocolloids,

vol. 9, no. 4, pp. 265–271, 1995.

[314] I.I. Norton, D. . Jarvis, T.J. Foster, ―A molecular model for the formation and properti

es of fluid gels,‖ International Journal of Biological Macromolecules, vol. 26, no. 4, pp. 255

–261, 1999.

[315] S.M. Hasheminya, S.M.A. Ebrahimzadeh-Mousavi, M.R. Ehsani and J. Dehghannya,

Food Res, 21, 179 (2011)

Page 280: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

279

[316] S.-M. Hasheminya, S.-M.-A. Ebrahimzadeh-Mousavi, M.-R. Ehsani, J. Dehghannya, ―

Production of a fiber-enriched pasteurized and non-pasteurized fermented acidified drink usi

ng gellan,‖ Food Bioscience, vol. 3, pp. 29–35, 2013.

[317] J. F. Bradbeer, R. Hancocks, F. Spyropoulos, I. T. Norton, ―Self-structuring foods bas

ed on acid-sensitive low and high acyl mixed gellan systems to impact on satiety,‖ Food Hy

drocolloids, vol. 35, pp. 522–530, 2014.

[318] S. Banerjee, S. Bhattacharya, ―Compressive textural attributes, opacity and syneresis o

f gels prepared from gellan, agar and their mixtures,‖ Journal of Food Engineering, vol. 102,

no. 3, pp. 287–292, 2011.

[319] A. Kayacier, M. Dogan, ―Rheological properties of some gums-salep mixed solutions,

‖ Journal of Food Engineering, vol. 72, no. 3, pp. 261–265, 2006. A. AGOUB, E. MORRIS,

―Particulate rheology and acid-induced gelation of oxidised cellulose,‖ Carbohydrate Polym

ers, vol. 71, no. 3, pp. 416–427, 2008.

[320] C. Liang, X. Hu, Y. Ni, J. Wu, F. Chen, X. Liao, ―Effect of hydrocolloids on pulp sedi

ment, white sediment, turbidity and viscosity of reconstituted carrot juice,‖ Food Hydrocollo

ids, vol. 20, no. 8, pp. 1190–1197, 2006. S. S. Manjunatha, D. K. Das Gupta, ―Instrumental

Textural Characteristics of Restructured Carrot Cubes,‖ International Journal of Food Proper

ties, vol. 9, no. 3, pp. 453–462, 2006.

[321] S. Banerjee, R. Ravi, S. Bhattacharya, ―Textural characterisation of gellan and agar ba

sed fabricated gels with carrot juice,‖ LWT - Food Science and Technology, vol. 53, no. 1, p

p. 255–261, 2013.

[322] S. Albert, G. S. Mittal, ―Comparative evaluation of edible coatings to reduce fat uptak

e in a deep-fried cereal product,‖ Food Research International, vol. 35, no. 5, pp. 445–458, 2

002. M. . Garc a, C. Ferrero, N. Bértola, M. Martino, N. Zaritzky, ―Edible coatings from cell

ulose derivatives to reduce oil uptake in fried products,‖ Innovative Food Science & Emergi

ng Technologies, vol. 3, no. 4, pp. 391–397, 2002.

[323] I. BAJAJ, R. SINGHAL, ―Gellan gum for reducing oil uptake in sev, a legume based

product during deep-fat frying,‖ Food Chemistry, vol. 104, no. 4, pp. 1472–1477, 2007.

Page 281: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

280

[324] E. Durán, E. Costell, L. Izquierdo, L. Durán, ―Low sugar bakery jams with gellan gum

—guar gum mixtures. Influence of composition on texture,‖ Food Hydrocolloids, vol. 8, no.

3–4, pp. 373–381, 1994.

[325] M. J. Martin, F. Lara-Villoslada, M. A. Ruiz, M. E. Morales, ―Effect of unmodified st

arch on viability of alginate-encapsulated Lactobacillus fermentum CECT5716,‖ LWT - Foo

d Science and Technology, vol. 53, no. 2, pp. 480–486, 2013.

[326] G. K. Gbassi, T. Vandamme, ―Probiotic Encapsulation Technology: From Microencap

sulation to Release into the Gut,‖ Pharmaceutics, vol. 4, no. 4, pp. 149–163, 2012.

[327] L.-E. Shi, Z.-H. Li, D.-T. Li, M. Xu, H.-Y. Chen, Z.-L. Zhang, Z.-X. Tang, ―Encapsul

ation of probiotic Lactobacillus bulgaricus in alginate–milk microspheres and evaluation of t

he survival in simulated gastrointestinal conditions,‖ Journal of Food Engineering, vol. 117,

no. 1, pp. 99–104, 2013.

[328] R. Rajam, P. Karthik, S. Parthasarathi, G. S. Joseph, C. Anandharamakrishnan, ―Effect

of whey protein – alginate wall systems on survival of microencapsulated Lactobacillus plan

tarum in simulated gastrointestinal conditions,‖ Journal of Functional Foods, vol. 4, no. 4, p

p. 891–898, 2012.

[329] W. Sun, M. W. Griffiths, ―Survival of bifidobacteria in yogurt and simulated gastric ju

ice following immobilization in gellan–xanthan beads,‖ International Journal of Food Micro

biology, vol. 61, no. 1, pp. 17–25, 2000.

[330] A. Nag, K.-S. Han, H. Singh, ―Microencapsulation of probiotic bacteria using pH-indu

ced gelation of sodium caseinate and gellan gum,‖ International Dairy Journal, vol. 21, no. 4

, pp. 247–253, 2011.

[331] A.Mantaluta, D.Cojocaru, C. Savin and R. Pasa. Annnals of the „AlexandruIoanCuza‖

University, Genetics and Molecular Biology, 12, 81 (2012)

[332] S. M. Tan, P. W. S. Heng, L. W. Chan, ―Development of Re-Usable Yeast-Gellan Gu

m Micro-Bioreactors for Potential Application in Continuous Fermentation to Produce Bio-

Ethanol,‖ Pharmaceutics, vol. 3, no. 4, pp. 731–744, 2011.

Page 282: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

281

[333] Y.-H. Lin, H.-F. Liang, C.-K. Chung, M.-C. Chen, H.-W. Sung, ―Physically crosslinke

d alginate/N,O-carboxymethyl chitosan hydrogels with calcium for oral delivery of protein d

rugs,‖ Biomaterials, vol. 26, no. 14, pp. 2105–2113, 2005.

[334] V. R. Sinha R. Kumria, ―Polysaccharides in colon-specific drug delivery,‖ Internation

al Journal of Pharmaceutics, vol. 224, no. 1–2, pp. 19–38, 2001.

[335] O. Chambin, G. Dupuis, D. Champion, A. Voilley, Y. Pourcelot, ―Colon-specific drug

delivery: Influence of solution reticulation properties upon pectin beads performance,‖ Inter

national Journal of Pharmaceutics, vol. 321, no. 1–2, pp. 86–93, 2006.

[336] P. Moslemy, R. J. Neufeld, D. Millette, S. R. Guiot, ―Transport of gellan gum microbe

ads through sand: an experimental evaluation for encapsulated cell bioaugmentation,‖ Journ

al of Environmental Management, vol. 69, no. 3, pp. 249–259, 2003.

[337] B. N. Singh, L. D. Trombetta, K. H. Kim, ―Biodegradation Behavior of Gellan Gum in

Simulated Colonic Media,‖ Pharmaceutical Development and Technology, vol. 9, no. 4, pp.

399–407, 2004.

[338] F. Yang, S. Xia, C. Tan, X. Zhang, ―Preparation and evaluation of chitosan-calcium-g

ellan gum beads for controlled release of protein,‖ European Food Research and Technology

, vol. 237, no. 4, pp. 467–479, 2013.

[339] R. P. Swatloski, S. K. Spear, J. D. Holbrey, R. D. Rogers, ―Dissolution of Cellose with

Ionic Liquids,‖ Journal of the American Chemical Society, vol. 124, no. 18, pp. 4974–4975,

2002.

[340] T. Heinze, Volume of the series Advances in Polymer Science 271, 1, 2005.

[341] J. Shokri, K. Adibki, ―Application of Cellulose and Cellulose Derivatives in Pharmace

utical Industries,‖ Cellulose - Medical, Pharmaceutical and Electronic Applications, 2013.

[342] J. Zhou, L. Zhang, Q. Deng, X. Wu, ―Synthesis and characterization of cellulose deriv

atives prepared in NaOH/urea aqueous solutions,‖ Journal of Polymer Science Part A: Poly

mer Chemistry, vol. 42, no. 23, pp. 5911–5920, 2004.

Page 283: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

282

[343] D. Klemm, B. Heublein, H.-P. Fink, A. Bohn, ―Cellulose: Fascinating Biopolymer and

Sustainable Raw Material,‖ Angewandte Chemie International Edition, vol. 44, no. 22, pp. 3

358–3393, 2005.

[344] Naveen Chella, Kiran Kumar Yada, Rashmi Vempati, Preparation and Evaluation of

Ethyl Cellulose Microspheres Containing Diclofenac Sodium by Novel W/O/O Emulsion

Method, J. Pharm. Sci. & Res. Vol.2 (12), 2010,884-888

[345] T. Heinze, A. Koschella, ―Carboxymethyl Ethers of Cellulose and Starch - A Review,

‖ Macromolecular Symposia, vol. 223, no. 1, pp. 13–40, 2005.

[346] E. Doelker, in Hydrogels in medicine and pharmacy, vol II Polymers, CRC Press. Inc.,

2000.

[347] P. Mischnick, D. Momcilovic, ―Chemical Structure Analysis of Starch and Cellulose

Derivatives,‖ Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, pp. 117–210, 2010.

[348] M. Gökgöz, M. Yiğitoğlu, ―Immobilization of Saccharomyces cerevisiae on to modifi

ed carboxymethylcellulose for production of ethanol,‖ Bioprocess and Biosystems Engineeri

ng, vol. 34, no. 7, pp. 849–857, 2011.

[349] M. Yiğitoğlu, N. Iş klan, R. Özmen, ―Graft copolymerization ofN-vinyl-2-pyrrolidone

onto sodium carboxymethylcellulose with azobisisobutyronitrile as the initiator,‖ Journal of

Applied Polymer Science, vol. 104, no. 2, pp. 936–943, 2007.

[350] A. Usman, K. M. Zia, M. Zuber, S. Tabasum, S. Rehman, F. Zia, ―Chitin and chitosan

based polyurethanes: A review of recent advances and prospective biomedical applications,‖

International Journal of Biological Macromolecules, vol. 86, pp. 630–645, 2016.

[351] V. Zargar, M. Asghari, A. Dashti, ―A Review on Chitin and Chitosan Polymers: Struct

ure, Chemistry, Solubility, Derivatives, and Applications,‖ ChemBioEng Reviews, vol. 2, no

. 3, pp. 204–226, 2015.

[352] Dutta, P.K., Duta, J.,Tripathi, V.S., Chitin and Chitosan: Chemistry, properties and

applications, Journal of Scientific and Industrial Research, Volume 63, Issue 1, January

2004, Pages 20-31

Page 284: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

283

[353] Yang, A., & Wu, R. (2001). Mechanical properties and interfacial interaction of a nov

el bioabsorbable chitin fiber reinforced poly(∈-caprolactone) compositeJournal of Materials

Science Letters, 20(11), 977–979

[354] H. Honarkar, M. Barikani, ―Applications of biopolymers I: chitosan,‖ Monatshefte für

Chemie - Chemical Monthly, vol. 140, no. 12, pp. 1403–1420, 2009.

[355] M. Rinaudo, ―Chitin and chitosan: Properties and applications,‖ Progress in Polymer S

cience, vol. 31, no. 7, pp. 603–632, 2006.

[356] A. M. de Campos, Y. Diebold, E. L. S. Carvalho, A. Sánchez, M. José Alonso, ―Chito

san Nanoparticles as New Ocular Drug Delivery Systems: in Vitro Stability, in Vivo Fate, a

nd Cellular Toxicity,‖ Pharmaceutical Research, vol. 21, no. 5, pp. 803–810, 2004.

[357] P.K. Dutta, J. Dutta, V.S. Tripathi, Journal of Scientific & Industrial Research, 63, 20

(2004)

[358] N. Acosta, C. Jiménez, V. Borau, A. Heras, ―Extraction and characterization of chitin

from crustaceans,‖ Biomass and Bioenergy, vol. 5, no. 2, pp. 145–153, 1993.

[359] S. V. Madihally, H. W. T. Matthew, ―Porous chitosan scaffolds for tissue engineering,

‖ Biomaterials, vol. 20, no. 12, pp. 1133–1142, 1999.

[360] L. L. Hench, ―Biomaterials: a forecast for the future,‖ Biomaterials, vol. 19, no. 16, pp

. 1419–1423, 1998.

[361] S. S. Koide, ―Chitin-chitosan: Properties, benefits and risks,‖ Nutrition Research, vol.

18, no. 6, pp. 1091–1101, 1998.

[362] S. M. Hudson and D. W. Jenkins, ―Chitin and Chitosan,‖ Encyclopedia of Polymer Sci

ence and Technology, 2001.

[363] I. Aranaz, M. Mengibar, R. Harris, I. Panos, B. Miralles, N. Acosta, G. Galed, A. Hera

s, ―Functional Characterization of Chitin and Chitosan,‖ CCB, vol. 3, no. 2, pp. 203–230, 20

09.

Page 285: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

284

[364] M. Dash, F. Chiellini, R. M. Ottenbrite, E. Chiellini, ―Chitosan—A versatile semi-synt

hetic polymer in biomedical applications,‖ Progress in Polymer Science, vol. 36, no. 8, pp. 9

81–1014, 2011.

[365] M. Amidi, E. Mastrobattista, W. Jiskoot, W. E. Hennink, ―Chitosan-based delivery sys

tems for protein therapeutics and antigens,‖ Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 62, no.

1, pp. 59–82, 2010.

[366] P. Agrawal, G. J. Strijkers, K. Nicolay, ―Chitosan-based systems for molecular imagin

g,‖ Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 62, no. 1, pp. 42–58, 2010.

[367] H. Wang, H., W. Li, Y. Lu, Z. Wang, W. Zhong, ―Studies on chitosan and poly(acryl

ic acid) interpolymer complex. II. Solution behaviors of the mixture of water-soluble chitosa

n and poly(acrylic acid),‖ J. Appl. Polym. Sci., vol. 61, pp. 2221–2224, 1996.

[368] M. Prabaharan, ―Review Paper: Chitosan Derivatives as Promising Materials for Contr

olled Drug Delivery,‖ Journal of Biomaterials Applications, vol. 23, no. 1, pp. 5–36, 2008.

[369] M.-H. Ho, D.-M. Wang, H.-J. Hsieh, H.-C. Liu, T.-Y. Hsien, J.-Y. Lai, L.-T. Hou, ―Pr

eparation and characterization of RGD-immobilized chitosan scaffolds,‖ Biomaterials, vol. 2

6, no. 16, pp. 3197–3206, 2005.

[370] B. Krajewska, ―Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immob

ilizations: a review,‖ Enzyme and Microbial Technology, vol. 35, no. 2–3, pp. 126–139, 200

4.

[371] N. L. B. M. Yusof, A. Wee, L. Y. Lim, E. Khor, ―Flexible chitin films as potential wo

und-dressing materials: Wound model studies,‖ Journal of Biomedical Materials Research, v

ol. 66A, no. 2, pp. 224–232, 2003.

[372] T. Minagawa, Y. Okamura, Y. Shigemasa, S. Minami, Y. Okamoto, ―Effects of molec

ular weight and deacetylation degree of chitin/chitosan on wound healing,‖ Carbohydrate Po

lymers, vol. 67, no. 4, pp. 640–644, 2007.

[373] Y. Kato, H. Onishi, Y. Machida, ―Application of Chitin and Chitosan Derivatives in th

e Pharmaceutical Field,‖ CPB, vol. 4, no. 5, pp. 303–309, 2003.

Page 286: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

285

[374] A. M. Papineau, D. G. Hoover, D. Knorr, D. F. Farkas, ―Antimicrobial effect of water‐

soluble chitosans with high hydrostatic pressure,‖ Food Biotechnology, vol. 5, no. 1, pp. 45–

57, 1991.

[375] N. R. Sudarshan, D. G. Hoover, D. Knorr, ―Antibacterial action of chitosan,‖ Food Bi

otechnology, vol. 6, no. 3, pp. 257–272, 1992.

[376] A. G. Imeri, D. Knorr, ―Effects of Chitosan on Yield and Compositional Data of Carro

t and Apple Juice,‖ J Food Science, vol. 53, no. 6, pp. 1707–1709, 1988.

[377] N. V. SOTO-PERALTA, H. MÜLLER, D. KNORR, ―Effects of Chitosan Treatments

on the Clarity and Color of Apple Juice,‖ J Food Science, vol. 54, no. 2, pp. 495–496, 1989.

[378] D. W. S. Wong, F. A. Gastineau, K. S. Gregorski, S. J. Tillin, A. E. Pavlath, ―Chitosan

-lipid films: microstructure and surface energy,‖ Journal of Agricultural and Food Chemistry

, vol. 40, no. 4, pp. 540–544, 1992.

[379] B. L. BUTLER, P. J. VERGANO, R. F. TESTIN, J. M. BUNN, J. L. WILES, ―Mecha

nical and Barrier Properties of Edible Chitosan Films as affected by Composition and Storag

e,‖ Journal of Food Science, vol. 61, no. 5, pp. 953–956, 1996.

[380] P. D. Hoagland, N. Parris, ―Chitosan/Pectin Laminated Films,‖ Journal of Agricultura

l and Food Chemistry, vol. 44, no. 7, pp. 1915–1919, 1996.

[381] F. S. Kittur, K. R. Kumar, R. N. Tharanathan, ―Functional packaging properties of chit

osan films,‖ Zeitschrift f�r Lebensmitteluntersuchung und -Forschung A, vol. 206, no. 1, p

p. 44–47, 1998.

[382] C. Jeuniaux, K. A. Almas, A. Baradarajan, H. Blair, P. Decock, S. Deiana, A. Dessi, B

. Dubois, A. Findon, H. Kozlowski, J. Mckay, G. Micera, C. A. Sastry, C. Senstad, J. P. Tho

me, J. V. Daele, B. Venkatrao, ―Chitosan as a Tool for the Purification of Waters,‖ Chitin in

Nature and Technology, pp. 551–570, 1986.

[383] M. Potara, E. Jakab, A. Damert, O. Popescu, V. Canpean, S. Astilean, ― Synergistic an

tibacterial activity of chitosan–silver nanocomposites on Staphylococcus aureus ,‖ Nanotech

nology, vol. 22, no. 13, p. 135101, 2011.

Page 287: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

286

[384] C. Anchisi, M. C. Meloni, A. M. Maccioni, ―Chitosan beads loaded with essential oils

in cosmetic formulations,‖ International Journal of Cosmetic Science, vol. 29, no. 6, pp. 485

–485, 2007.

[385] S. Gautier, E. Xhauflaire-Uhoda, P. Gonry, G. E. Piérard, ―Chitin-glucan, a natural cel

l scaffold for skin moisturization and rejuvenation,‖ International Journal of Cosmetic Scien

ce, vol. 30, no. 6, pp. 459–469, 2008.

[386] J.-F. Revol, R. H. Marchessault, ―In vitro chiral nematic ordering of chitin crystallites,

‖ International Journal of Biological Macromolecules, vol. 15, no. 6, pp. 329–335, 1993.

[387] R. A. A. Muzzarelli, ―CHITIN CHEMISTRY,‖ Chitin, pp. 87–154, 1977.

[388] G. Crini, G. Torri, M. Guerrini, M. Morcellet, M. Weltrowski, B. Martel, ―NMR chara

cterization of N-benzyl sulfonated derivatives of chitosan,‖ Carbohydrate Polymers, vol. 33,

no. 2–3, pp. 145–151, 1997.

[389] C.-B. Ahn, J.-Y. Je, ―Chitosan and Its Derivatives as Potential Cosmetic Agents : A re

view,‖ J. Chitin Chitosan, vol. 20, no. 4, pp. 287–296, 2015.

[390] P. K. Dutta, M. N. V. Ravikumar, J. Dutta, ―CHITIN AND CHITOSAN FOR VERSA

TILE APPLICATIONS,‖ Journal of Macromolecular Science, Part C: Polymer Reviews, vol

. 42, no. 3, pp. 307–354, 2002.

[391] F. Akhtar, M. M. A. Rizvi, S. K. Kar, ―Oral delivery of curcumin bound to chitosan na

noparticles cured Plasmodium yoelii infected mice,‖ Biotechnology Advances, vol. 30, no. 1

, pp. 310–320, 2012.

[392] M. P. Souza, A. F. M. Vaz, M. T. S. Correia, M. A. Cerqueira, A. A. Vicente, M. G. C

arneiro-da-Cunha, ―Quercetin-Loaded Lecithin/Chitosan Nanoparticles for Functional Food

Applications,‖ Food and Bioprocess Technology, vol. 7, no. 4, pp. 1149–1159, 2013.

[393] D. Kurukji, I. Norton, F. Spyropoulos, ―Fabrication of sub-micron protein-chitosan ele

ctrostatic complexes for encapsulation and pH-Modulated delivery of model hydrophilic acti

ve compounds,‖ Food Hydrocolloids, vol. 53, pp. 249–260, 2016.

Page 288: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

287

[394] X.F. ZHENG, Q. LIAN, S.T. SONG Chitosan-Gelatin-Pectin Composite Films from

Polyion-Complex Hydrogels, Asian Journal of Chemistry; Vol. 25, No. 10 (2013), 5363-

5366

[395] J. M. Souza, A. L. Caldas, S. D. Tohidi, J. Molina, A. P. Souto, R. Fangueiro, A. Zille,

―Properties and controlled release of chitosan microencapsulated limonene oil,‖ Revista Bra

sileira de Farmacognosia, vol. 24, no. 6, pp. 691–698, 2014.

[396] V. NAYDENOVA, S. VASSILEV, M. KANEVA , G. KOSTOV, ENCAPSULATIO

N OF BREWING YEAST IN ALGINATE/CHITOSAN MATRIX: COMPARATIVE STU

DY OF BEER FERMENTATION WITH IMMOBILIZED AND FREE CELLS, Bulgarian J

ournal of Agricultural Science, 19 (2) 2013, 123–127

[397] D. F. Silva, H. Rosa, A. F. A. Carvalho, P. Oliva-Neto, ―Immobilization of Papain on

Chitin and Chitosan and Recycling of Soluble Enzyme for Deflocculation ofSaccharomyces

cerevisiaefrom Bioethanol Distilleries,‖ Enzyme Research, vol. 2015, pp. 1–10, 2015.

[398] J. Duan, Y. Zhang, S. Han, Y. Chen, B. Li, M. Liao, W. Chen, X. Deng, J. Zhao, B. H

uang, ―Synthesis and in vitro/in vivo anti-cancer evaluation of curcumin-loaded chitosan/pol

y(butyl cyanoacrylate) nanoparticles,‖ International Journal of Pharmaceutics, vol. 400, no.

1–2, pp. 211–220, 2010.

[399] J. Necas, L. Bartosikova, ―Carrageenan: a review‖, Veterinarni Medicina, vol. 58, no.

4, pp. 187-205, 2013.

[400] V. L. Campo, D. F. Kawano, D. B. da Silva, I. Carvalho, ―Carrageenans: Biological pr

operties, chemical modifications and structural analysis – A review,‖ Carbohydrate Polymer

s, vol. 77, no. 2, pp. 167–180, 2009.

[401] V. D. Prajapati, P. M. Maheriya, G. K. Jani, H. K. Solanki, ―RETRACTED: Carragee

nan: A natural seaweed polysaccharide and its applications,‖ Carbohydrate Polymers, vol. 1

05, pp. 97–112, 2014.

[402] K. Nakagawa, N. Sowasod, T. Charinpanitkul, A. Soottitantawat, W. Tanthapanichako

on, ―Encapsulation of Curcumin Loaded Oil Droplets By Cryotropic Gel Formation from O/

W Emulsion,‖ Procedia Food Science, vol. 1, pp. 1973–1979, 2011.

Page 289: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

288

[403] S. Janaswamy, S. R. Youngren, ―Hydrocolloid-based nutraceutical delivery systems,‖

Food & Function, vol. 3, no. 5, p. 503, 2012.

[404] D. Guzman-Villanueva, I. M. El-Sherbiny, D. Herrera-Ruiz, H. D. C. Smyth, ―Design

andIn VitroEvaluation of a New Nano-Microparticulate System for Enhanced Aqueous-Phas

e Solubility of Curcumin,‖ BioMed Research International, vol. 2013, pp. 1–9, 2013.

[405] H. Y. Wang, D. J. Hettwer, ―Cell immobilization ink-carrageenan with tricalcium pho

sphate,‖ Biotechnology and Bioengineering, vol. 24, no. 8, pp. 1827–1838, 1982.

[406] Martinez A., Vivas G., Quicazan M., 2016, Evaluation of alcoholic fermentation durin

g the production of mead using immobilized cells in kappa-carrageenan, Chemical Engineeri

ng Transactions, 49, 19-24

[407] F. Godia, C. Casas, B. Castellano, C. Sold, ―Immobilized cells: behaviour of carrageen

an entrapped yeast during continuous ethanol fermentation,‖ Applied Microbiology and Biot

echnology, vol. 26, no. 4, 1987.

[408] S. W. Chan, H. Mirhosseini, F. S. Taip, T. C. Ling, I. A. Nehdi, C. P. Tan, ―Emulsion

formulation optimization and characterization of spray-dried κ-carrageenan microparticles f

or the encapsulation of CoQ10,‖ Food Science and Biotechnology, vol. 25, no. S1, pp. 53–6

2, 2016.

[409] S. Yamazaki, T. Mori, I. Ogino, S. R. Mukai, ―Flexible film-type catalysts encapsulati

ng urease within κ-carrageenan hydrogel network,‖ Chemical Engineering Journal, vol. 278,

pp. 122–128, 2015.

[410] F. G. Fischer, H. Dörfel, ―Die Polyuronsäuren der Braunalgen (Kohlenhydrate der Alg

en I),‖ Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie, vol. 302, no. Jahresband, pp.

186–203, 1955.

[411] K. Y. Lee, D. J. Mooney, ―Alginate: Properties and biomedical applications,‖ Progress

in Polymer Science, vol. 37, no. 1, pp. 106–126, 2012.

[412] Pratibha Chaturvedi, Sandeepan Mukherjee, Shraddha Mehta, Pialy Chatterjee and Ab

hay Chowdhary, MEDIA STANDARDIZATION FOR CURCUMIN ENHANCEMENT IN

CURCUMA LONGA TISSUE CULTURE AND PROTEIN PROFILE OF TREATED SA

Page 290: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

289

MPLES, WORLD JOURNAL OF PHARMACY AND PHARMACEUTICAL SCIENCES,

Volume 3, Issue 10, 965-975

[413] Călinescu, I., Chipurici, P., Trifan, A., Bădoiu, C., 2012. Immobilisation of

Saccharomyces cerevisiae for the production of bioethanol. U.P.B. Sci. Bull. 74, 33-40

[414] S. H. Hong, M. Shin, J. Lee, J. H. Ryu, S. Lee, J. W. Yang, W. D. Kim, H. Lee, ―STA

PLE: Stable Alginate Gel Prepared by Linkage Exchange from Ionic to Covalent Bonds,‖ A

dv. Healthcare Mater., vol. 5, no. 1, pp. 75–79, 2015.

[415] E. Callone, R. Campostrini, G. Carturan, A. Cavazza, R. Guzzon, ―Immobilization of

yeast and bacteria cells in alginate microbeads coated with silica membranes: procedures, ph

ysico-chemical features and bioactivity,‖ Journal of Materials Chemistry, vol. 18, no. 40, p.

4839, 2008.

[416] B. L. Tee, G. Kaletunç, ―Immobilization of a thermostable α-amylase by covalent bind

ing to an alginate matrix increases high temperature usability,‖ Biotechnology Progress, vol.

25, no. 2, pp. 436–445, 2009.

[417] A. D. Baldwin, K. L. Kiick, ―Polysaccharide-modified synthetic polymeric biomateria

ls,‖ Biopolymers, vol. 94, no. 1, pp. 128–140, 2010.

[418] M. F. Maitz, ―Applications of synthetic polymers in clinical medicine,‖ Biosurface an

d Biotribology, vol. 1, no. 3, pp. 161–176, 2015.

[419] T. R. Hoare, D. S. Kohane, ―Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges,‖ Pol

ymer, vol. 49, no. 8, pp. 1993–2007, 2008.

[420] K. S. Soppimath, T. M. Aminabhavi, A. M. Dave, S. G. Kumbar, W. E. Rudzinski, ―St

imulus-Responsive ‗Smart‘ Hydrogels as Novel Drug Delivery Systems,‖ Drug Developmen

t and Industrial Pharmacy, vol. 28, no. 8, pp. 957–974, 2002.

[421]Y. Qiu, K. Park, ―Environment-sensitive hydrogels for drug delivery,‖ Advanced Drug

Delivery Reviews, vol. 53, no. 3, pp. 321–339, 2001.

[422] James S, Encylopedia of Pharmaceutical Techonology, 3rd edition, Vol-1325-1333

Page 291: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

290

[423] K.Shekhar, M.Naga Madhu, B.Pradeep, David Banji, A review on microencapsulation

, International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, Volume 5, Issue 2,

November – December 2010; Article-012, 58-62

[424] D. J. McClements, E. A. Decker, Y. Park, J. Weiss, ―Structural Design Principles for

Delivery of Bioactive Components in Nutraceuticals and Functional Foods,‖ Critical Review

s in Food Science and Nutrition, vol. 49, no. 6, pp. 577–606, 2009.

[425] L. Chen, G. E. Remondetto, M. Subirade, ―Food protein-based materials as nutraceutic

al delivery systems,‖ Trends in Food Science & Technology, vol. 17, no. 5, pp. 272–283, 20

06.

[426] P. Burey, B. R. Bhandari, T. Howes, and M. J. Gidley, ―Hydrocolloid Gel Particles: F

ormation, Characterization, and Application,‖ Critical Reviews in Food Science and Nutritio

n, vol. 48, no. 5, pp. 361–377, 2008.

[427] D. J. McClements, ―Emulsion Design to Improve the Delivery of Functional Lipophili

c Components,‖ Annu. Rev. Food Sci. Technol., vol. 1, no. 1, pp. 241–269, 2010.

[428] K. Koyama, M. Seki, ―Cultivation of Yeast and Plant Cells Entrapped in the Low-Vis

cous Liquid-Core of an Alginate Membrane Capsule Prepared Using Polyethylene Glycol,‖

Journal of Bioscience and Bioengineering, vol. 97, no. 2, pp. 111–118, 2004.

[429] V. A. Nedović, B. Obradović, I. Leskošek-Čukalović, O. Trifunović, R. Pešić, B. Bug

arski, ―Electrostatic generation of alginate microbeads loaded with brewing yeast,‖ Process

Biochemistry, vol. 37, no. 1, pp. 17–22, 2001.

[430] J. K. Park, H.N . Chang, ―Microencapsulation of microbial cells,‖ Biotechnology Adv

ances, vol. 18, no. 4, pp. 303–319, 2000.

[431] L.S.C. Wan, P.W.S. Heng, L.W. Chan, International Journal of Pharmaceutics. 103, 2

67 (1994)

[432] J. S. Patil, M. V. Kamalapur, S. C. Marapur, D. V. Kadam, ―Ionotropic gelation and p

olyelectrolyte complexation: the novel techniques to design hydrogel particule sustained, mo

dulated drug delivery system. A review‖, Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures

, Vol. 5, No 1, pp. 241 – 248, 2010.

Page 292: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

291

[433] C.P. Champagne, N. Blahuta, F. Brion, C. Gagnon, Biotechnology and Bioengineering

, 68, 681 (2000). N. Blahuta, F. Brion and C. Gagnon, Biotechnology and Bioengineering, 6

8, 681 (2000)

[434] G. Fundueanu, C. Nastruzzi, A. Carpov, J. Desbrieres, M. Rinaudo, ―Physico-chemica

l characterization of Ca-alginate microparticles produced with different methods,‖ Biomateri

als, vol. 20, no. 15, pp. 1427–1435, 1999.

[435] L. S. C. Wan, P. W. S. Heng, L. W. Chan, ―Drug encapsulation in alginate microspher

es by emulsification,‖ Journal of Microencapsulation, vol. 9, no. 3, pp. 309–316, 1992.

[436] K.D. Green, I.S. Gill, J.A. Khan and E.N. Vulfson, Biotechnology and Bioengineering

. 49, 535 (1996)

[437] G. Fundueanu, E. Esposito, D. Mihai, A. Carpov, J. Desbrieres, M. Rinaudo, C. Nastru

zzi, ―Preparation and characterization of Ca-alginate microspheres by a new emulsification

method,‖ International Journal of Pharmaceutics, vol. 170, no. 1, pp. 11–21, 1998.

[438] L. W. Chanp, W. S. Heng, L. S. C. Wan, ―Effect of cellulose derivatives on alginate m

icro spheresprepared by emulsification,‖ Journal of Microencapsulation, vol. 14, no. 5, pp. 5

45–555, 1997.

[439] I. Călinescu, P. Chipurici, A. Trifan, C. Bădoiu, ―Immobilisation of Saccharomyces ce

revisiae for the production of bioethanol‖, U.P.B. Sci. Bull., vol. 74, pp. 33-40, 2012.

[440] I. Mariam, K. Manzoor, S. Ali, Ikram-Ul-Haq, ―Enhanced production of ethanol from

free and immobilized Saccharomyces cerevisiae under stationary culture‖, Pak. J. Bot., vol,

41, no. 2, pp. 821-833, 2009

[441] E. Callone, R. Campostrini, G. Carturan, A. Cavazza, R. Guzzon, ―Immobilization of

yeast and bacteria cells in alginate microbeads coated with silica membranes: procedures, ph

ysico-chemical features and bioactivity,‖ Journal of Materials Chemistry, vol. 18, no. 40, p.

4839, 2008.

[442] Mantaluta, A., Cojocaru, D. Savin, C., Pasa, R., 2012. The testing of some organic sup

ports for yeasts immobilization technology used in sparkling wine production. Annnals of th

e „AlexandruIoanCuza‖ University, Genet. Biol. Mol. 12, 81-85

Page 293: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

292

[443] C. E. Iurciuc (Tincu), L. Alupei, A. Savin, C. Ibănescu, P. Martin, M. Popa, ―Yeast cel

ls immobilized in spherical gellan particles cross-linked with magnesium acetate,‖ Journal o

f Biotechnology, vol. 236, pp. 45–56, 2016.

[444] H. Y. Wang, D. J. Hettwer, ―Cell immobilization ink-carrageenan with tricalcium pho

sphate,‖ Biotechnology and Bioengineering, vol. 24, no. 8, pp. 1827–1838, 1982.

[445 la fel cu 406] Martinez A., Vivas G., Quicazan M., 2016, Evaluation of alcoholic ferme

ntation during the production of mead using immobilized cells in kappa-carrageenan, Chemi

cal Engineering Transactions, 49, 19-24

[446] F. Godia, C. Casas, B. Castellano, C. Sold, ―Immobilized cells: behaviour of carrageen

an entrapped yeast during continuous ethanol fermentation,‖ Applied Microbiology and Biot

echnology, vol. 26, no. 4, 1987.

[447] M. Gökgöz, M. Yiğitoğlu, ―Immobilization of Saccharomyces cerevisiae on to modifi

ed carboxymethylcellulose for production of ethanol,‖ Bioprocess and Biosystems Engineeri

ng, vol. 34, no. 7, pp. 849–857, 2011.

[448] M. Yiğitoğlu, N. Iş klan, R. Özmen, ―Graft copolymerization ofN-vinyl-2-pyrrolidone

onto sodium carboxymethylcellulose with azobisisobutyronitrile as the initiator,‖ Journal of

Applied Polymer Science, vol. 104, no. 2, pp. 936–943, 2007.

[449] J.-S. Lee, G.-H. Kim, H. G. Lee, ―Characteristics and Antioxidant Activity of Elsholtz

ia splendens Extract-Loaded Nanoparticles,‖ Journal of Agricultural and Food Chemistry, v

ol. 58, no. 6, pp. 3316–3321, 2010.

[450] G. Dey, S. Bhupinder, R. Banerjee, ―Immobilization of alpha-amylase produced by Ba

cillus circulans GRS 313,‖ Braz. arch. biol. technol., vol. 46, no. 2, 2003.

[451] A. P. Mörschbächer, G. Volpato, C. F. V. de Souza, ―Kluyveromyces lactis &#946;-ga

lactosidase immobilization in calcium alginate spheres and gelatin for hydrolysis of cheese

whey lactose,‖ Ciência Rural, vol. 46, no. 5, pp. 921–926, 2016.

[452] M. A. Azevedo, A. I. Bourbon, A. A. Vicente, M. A. Cerqueira, ―Alginate/chitosan na

noparticles for encapsulation and controlled release of vitamin B2,‖ International Journal of

Biological Macromolecules, vol. 71, pp. 141–146, 2014.

Page 294: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

293

[453] B. SARMENTO, D. FERREIRA, F. VEIGA, A. RIBEIRO, ―Characterization of insuli

n-loaded alginate nanoparticles produced by ionotropic pre-gelation through DSC and FTIR

studies,‖ Carbohydrate Polymers, vol. 66, no. 1, pp. 1–7, 2006.

[454] P. W. S. Heng, L. W. Chan, T. W. Wong, ―Formation of alginate microspheres produc

ed using emulsification technique,‖ Journal of Microencapsulation, vol. 20, no. 3, pp. 401–4

13, 2003.

[455] E. Belyaeva, D. D. Valle, R. J. Neufeld, D. Poncelet, ―New approach to the formulatio

n of hydrogel beads by emulsification/thermal gelation using a static mixer,‖ Chemical Engi

neering Science, vol. 59, no. 14, pp. 2913–2920, 2004.

[456] S. Iwamoto, K. Nakagawa, S. Sugiura, M. Nakajima, ―Preparation of Gelatin Microbe

ads With a Narrow Size Distribution Using Microchannel Emulsification,‖ AAPS PharmSci

Tech, vol. 03, no. 03, p. e25, 2002.

[457] S. Sajjadi, ―Effect of mixing protocol on formation of fine emulsions,‖ Chemical Engi

neering Science, vol. 61, no. 9, pp. 3009–3017, 2006.

[458] N. V. N. Jyothi, P. M. Prasanna, S. N. Sakarkar, K. S. Prabha, P. S. Ramaiah, G. Y. Sr

awan, ―Microencapsulation techniques, factors influencing encapsulation efficiency,‖ Journa

l of Microencapsulation, vol. 27, no. 3, pp. 187–197, 2010.

[459] M.-C. Raymond, R. J. Neufeld, D. Poncelet, ―Encapsulation of Brewers Yeast in Chito

san Coated Carrageenan Microspheres by Emulsification/Thermal Gelation,‖ Artificial Cells

, Blood Substitutes, and Biotechnology, vol. 32, no. 2, pp. 275–291, 2004.

[460] T. Wang N. He, ―Preparation, characterization and applications of low-molecular-wei

ght alginate–oligochitosan nanocapsules,‖ Nanoscale, vol. 2, no. 2, pp. 230–239, 2010.

[461] Z. Zhang, R. Zhang, L. Zou, L. Chen, Y. Ahmed, W. Al Bishri, K. Balamash, D. J. Mc

Clements, ―Encapsulation of curcumin in polysaccharide-based hydrogel beads: Impact of b

ead type on lipid digestion and curcumin bioaccessibility,‖ Food Hydrocolloids, vol. 58, pp.

160–170, 2016.

Page 295: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

294

[462] Srinidhi M, Manjugowda MR, Jayanthi C and Srikanth A, Coacervation method for pr

eparation of curcumin micro particles using natural polymer casein, World Journal of Pharm

acy and Pharmaceutical Sciences, Volume 4, Issue 06, 293-304, 2015

[463] B.Gander, M.J. Blanco-Príeto, C.Thomasin, Ch.Wandrey, D.Hunkeler, Coacervation

and Phase Separation, Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Third Edition, 2013

[464] C. G. de Kruif, F. Weinbreck, R. de Vries, ―Complex coacervation of proteins and ani

onic polysaccharides,‖ Current Opinion in Colloid & Interface Science, vol. 9, no. 5, pp. 340

–349, 2004.

[465] C. L. Cooper, P. L. Dubin, A. B. Kayitmazer, S. Turksen, ―Polyelectrolyte–protein co

mplexes,‖ Current Opinion in Colloid & Interface Science, vol. 10, no. 1–2, pp. 52–78, 2005

.

[466] H. A. Aziz, K. K. Peh, Y. T. F. Tan, ―Solubility of Core Materials in Aqueous Polyme

ric Solution Effect on Microencapsulation of Curcumin,‖ Drug Development and Industrial

Pharmacy, vol. 33, no. 11, pp. 1263–1272, 2007.

[467]T. M. S. Chang, ―Semipermeable Microcapsules,‖ Science, vol. 146, no. 3643, pp. 524

–525, 1964.

[468] I. D. Alvim, C. R. F. Grosso, ―Microparticles obtained by complex coacervation: influ

ence of the type of reticulation and the drying process on the release of the core material,‖ C

iênc. Tecnol. Aliment., vol. 30, no. 4, pp. 1069–1076, 2010.

[469] G. A. Rocha-Selmi, C. S. Favaro-Trindade, C. R. F. Grosso, ―Morphology, Stability, a

nd Application of Lycopene Microcapsules Produced by Complex Coacervation,‖ Journal of

Chemistry, vol. 2013, pp. 1–7, 2013.

[470] N. Al-Zoubi, H. S. AlKhatib, Y. Bustanji, K. Aiedeh, S. Malamataris, ―Sustained-relea

se of buspirone HCl by co spray-drying with aqueous polymeric dispersions,‖ European Jour

nal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, vol. 69, no. 2, pp. 735–742, 2008.

[471] J. Elversson, A. Millqvist-Fureby, ―In situ coating—An approach for particle modifica

tion and encapsulation of proteins during spray-drying,‖ International Journal of Pharmaceut

ics, vol. 323, no. 1–2, pp. 52–63, 2006.

Page 296: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

295

[472] G. Luna-Solano, M. A. Salgado-Cervantes, G. C. Rodríguez-Jimenes, M. A. García-Al

varado, ―Optimization of brewer‘s yeast spray drying process,‖ Journal of Food Engineering

, vol. 68, no. 1, pp. 9–18, 2005.

[473] K. Donadel, M. D. V. Felisberto, V. T. Fávere, M. Rigoni, N. J. Batistela, M. C. M. La

ranjeira, ―Synthesis and characterization of the iron oxide magnetic particles coated with chi

tosan biopolymer,‖ Materials Science and Engineering: C, vol. 28, no. 4, pp. 509–514, 2008.

[474] I. M. El-Sherbiny, H. D. C. Smyth, ―Controlled Release Pulmonary Administration of

Curcumin Using Swellable Biocompatible Microparticles,‖ Molecular Pharmaceutics, vol. 9

, no. 2, pp. 269–280, 2012.

[475] J. Gómez-Estaca, R. Gavara, P. Hernández-Muñoz, ―Encapsulation of curcumin in ele

ctrosprayed gelatin microspheres enhances its bioaccessibility and widens its uses in food ap

plications,‖ Innovative Food Science & Emerging Technologies, vol. 29, pp. 302–307, 2015.

[476] Y. Wang, Z. Lu, F. Lv, X. Bie, ―Study on microencapsulation of curcumin pigments b

y spray drying,‖ European Food Research and Technology, vol. 229, no. 3, pp. 391–396, 20

09.

[477] A. Nag, K.-S. Han, H. Singh, ―Microencapsulation of probiotic bacteria using pH-indu

ced gelation of sodium caseinate and gellan gum,‖ International Dairy Journal, vol. 21, no. 4

, pp. 247–253, 2011.

[478] M. T. Gokmen, F. E. Du Prez, ―Porous polymer particles—A comprehensive guide to

synthesis, characterization, functionalization and applications,‖ Progress in Polymer Science

, vol. 37, no. 3, pp. 365–405, 2012.

[479] I. Orienti, K. Aiedeh, E. Gianasi, C. Ponti, V. Zecchi, ―Chitosan-Indomethacin Conjug

ates. Effect of Different Substituents on the Polysaccharide Molecule on Drug Release,‖ Arc

hiv der Pharmazie, vol. 329, no. 5, pp. 245–250, 1996.

[480] M. A. Malik, M. Y. Wani, M. A. Hashim, ―Microemulsion method: A novel route to s

ynthesize organic and inorganic nanomaterials,‖ Arabian Journal of Chemistry, vol. 5, no. 4,

pp. 397–417, 2012.

Page 297: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

296

[481]B. N. Singh, L. D. Trombetta, K. H. Kim, ―Biodegradation Behavior of Gellan Gum in

Simulated Colonic Media,‖ Pharmaceutical Development and Technology, vol. 9, no. 4, pp.

399–407, 2004.

[482] Tokumitsu H, Ichikawa H, Fukumori Y. Chitosan–gadopentetic acid complexnanopart

icles for gadolinium neutron capture therapy of cancer: Preparation by novel emulsion-dropl

et coalescence technique and characterization. Pharm Res.;16:1830–5, (1999)

[483] B. F. Gibbs, Selim Kermasha, Inteaz Al, ―Encapsulation in the food industry: a review

,‖ International Journal of Food Sciences and Nutrition, vol. 50, no. 3, pp. 213–224, 1999.

[484] Analava Mitra and Baishakhi Dey, Chitosan Microspheres in Novel Drug Delivery

Systems, Indian J Pharm Sci. Jul-Aug; 73(4), 355–366, (2011)

[485] Shashank Tiwari and Prerana Verma, Microencapsulation technique by solvent

evaporation method(Study of effect of process variables), INTERNATIONAL JOURNAL

OF PHARMACY & LIFE SCIENCES, 2(8): Aug., 2011, 998-1005

[486] S. A. Agnihotri, T. M. Aminabhavi, ―Controlled release of clozapine through chitosan

microparticles prepared by a novel method,‖ Journal of Controlled Release, vol. 96, no. 2, p

p. 245–259, 2004.

[487] G. B. Sukhorukov, E. Donath, H. Lichtenfeld, E. Knippel, M. Knippel, A. Budde, H.

Möhwald, ―Layer-by-layer self assembly of polyelectrolytes on colloidal particles,‖ Colloids

and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, vol. 137, no. 1–3, pp. 253–266,

1998.

[488] I. L. Radtchenko, G. B. Sukhorukov, H. Möhwald, ―Incorporation of macromolecules

into polyelectrolyte micro- and nanocapsules via surface controlled precipitation on colloida

l particles,‖ Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, vol. 202, n

o. 2–3, pp. 127–133, 2002.

[489] F. W. Bai, W. A. Anderson, M. Moo-Young, ―Ethanol fermentation technologies from

sugar and starch feedstocks,‖ Biotechnology Advances, vol. 26, no. 1, pp. 89–105, 2008.

[490] F.W. Bai, L.J. Chen, Z. Zhang, W.A. Anderson, M. Moo-Young, ―Continuous ethanol

production and evaluation of yeast cell lysis and viability loss under very high gravity mediu

m conditions,‖ Journal of Biotechnology, vol. 110, no. 3, pp. 287–293, 2004.

Page 298: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

297

[491] J. Hill, E. Nelson, D. Tilman, S. Polasky, D. Tiffany, ―Environmental, economic, and

energetic costs and benefits of biodiesel and ethanol biofuels,‖ Proceedings of the National

Academy of Sciences, vol. 103, no. 30, pp. 11206–11210, 2006.

[492] Blieck L, Toye G, Dumortier F, Vertrepen KJ, Delvaux FD, Thevelein JM, Vandijck P

(2007). Isolation and characterization of brewer‘s yeast variants with improvedfermentation

performance under high-gravity conditions. Appl. Environ. Microbiol.73:815-824

[493] D. Silva, T. Brányik, G. Dragone, A. Vicente, J. Teixeira, J. Almeida e Silva, ―High gr

avity batch and continuous processes for beer production: Evaluation of fermentation perfor

mance and beer quality,‖ Chemical Papers, vol. 62, no. 1, 2008.

[494] Y. Kourkoutas, M. Kanellaki, A. A. Koutinas, C. Tzia, ―Effect of fermentation conditi

ons and immobilization supports on the wine making,‖ Journal of Food Engineering, vol. 69,

no. 1, pp. 115–123, 2005.

[495] J. O. Westman, C. J. Franzén, ―Current progress in high cell density yeast bioprocesse

s for bioethanol production,‖ Biotechnology Journal, vol. 10, no. 8, pp. 1185–1195, 2015.

[496] Ivanova, V., Petrova, P., Hristov, J., 2011. Application in the Ethanol Fermentation of

Immobilized Yeast Cells in Matrix of Alginate/Magnetic nanoparticles, on Chitosan-Magnet

ite Microparticles and Cellulose-coated Magnetic nanoparticles. Int. Rev. Chem. Eng. 3, 289

–299

[497] A. Groboillot, D. K. Boadi, D. Poncelet, R. J. Neufeld, ―Immobilization of Cells for A

pplication in the Food Industry,‖ Critical Reviews in Biotechnology, vol. 14, no. 2, pp. 75–1

07, 1994.

[498] P. J. Verbelen, D. P. De Schutter, F. Delvaux, K. J. Verstrepen, F. R. Delvaux, ―Immo

bilized yeast cell systems for continuous fermentation applications,‖ Biotechnol Lett, vol. 28

, no. 19, pp. 1515–1525, 2006.

[499] T. Brányik, A. A. Vicente, J. M. Machado Cruz, J. A. Teixeira, Biotechnology Letters,

vol. 23, no. 13, pp. 1073–1078, 2001.

Page 299: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

298

[500] J. C. Duarte, J. A. R. Rodrigues, P. J. S. Moran, G. P. Valença, J. R. Nunhez, ―Effect o

f immobilized cells in calcium alginate beads in alcoholic fermentation,‖ AMB Express, vol.

3, no. 1, p. 31, 2013.

[501] S. Rathore, P. M. Desai, C. V. Liew, L. W. Chan, P. W. S. Heng, ―Microencapsulation

of microbial cells,‖ Journal of Food Engineering, vol. 116, no. 2, pp. 369–381, 2013.

[502] R. P. John, R. D. Tyagi, S. K. Brar, R. Y. Surampalli, D. Prévost, ―Bio-encapsulation

of microbial cells for targeted agricultural delivery,‖ Critical Reviews in Biotechnology, vol.

31, no. 3, pp. 211–226, 2010.

[503] D. Sarayd n, H. N. Öztop, E. Karadağ, A. Y. Öztop, Y. Iş kver, O. Güven, ―The use of

immobilized Saccharomyces cerevisiae on radiation crosslinked acrylamide–maleic acid hyd

rogel carriers for production of ethyl alcohol,‖ Process Biochemistry, vol. 37, no. 12, pp. 13

51–1357, 2002.

[504] G.M.S.G. Baptista, J.M.A. Cóias, A.C.M. Oliveira and J.M.S. Rocha, Immobilisation

of yeasts for continuous fermentation, Communicating Current Research and Educational

Topics and Trends in Applied Microbiology A. Méndez-Vilas (Ed.) pages 418-425, 2004

[505] M. Daria Fumi, G. Trioli, O. Colagrande, ―Preliminary assessment on the use of immo

bilized yeast cells in sodium alginate for sparkling wine processes,‖ Biotechnology Letters,

vol. 9, no. 5, pp. 339–342, 1987.

[506] I.-K. Yoo, G. H. Seong, H. N. Chang, J. K. Park, ―Encapsulation of Lactobacillus case

i cells in liquid-core alginate capsules for lactic acid production,‖ Enzyme and Microbial Te

chnology, vol. 19, no. 6, pp. 428–433, 1996.

[507] E. Corton, M. Piuri, F. Battaglini, S. M. Ruzal, ―Characterization of Lactobacillus Car

bohydrate Fermentation Activity Using Immobilized Cell Technique,‖ Biotechnology Progr

ess, vol. 16, no. 1, pp. 59–63, 2000.

[508] A. Idris, W. Suzana, ―Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial p

H and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized Lacto

bacillus delbrueckii,‖ Process Biochemistry, vol. 41, no. 5, pp. 1117–1123, 2006.

Page 300: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

299

[509] L. M. D. Goncalves, M. T. O. Barreto, A. M. B. R. Xavier, M. J. T. Carrondo, J. Klein

, ―Inert supports for lactic acid fermentation. A technological assessment,‖ Applied Microbi

ology and Biotechnology, vol. 38, no. 3, 1992.

[510] E. P. Bardi, A. A. Koutinas, ―Immobilization of yeast on delignified cellulosic materia

l for room temperature and low-temperature wine making,‖ Journal of Agricultural and Food

Chemistry, vol. 42, no. 1, pp. 221–226, 1994.

[511] P. Loukatos, M. Kiaris, I. Ligas, G. Bourgos, M. Kanellaki, M. Komaitis, A. A. Kouti

nas, ―Continuous Wine Making by γ-Alumina-Supported Biocatalyst,‖ Applied Biochemistr

y and Biotechnology, vol. 89, no. 1, pp. 1–14, 2000.

[512] L. Inama, S. Diré, G. Carturan, A. Cavazza, ―Entrapment of viable microorganisms by

SiO2 sol-gel layers on glass surfaces: Trapping, catalytic performance and immobilization d

urability of Saccharomyces cerevisiae,‖ Journal of Biotechnology, vol. 30, no. 2, pp. 197–21

0, 1993.

[513] G. Aykut, V. N. Hasirci, G. Alaeddinoglu, ―Immobilization of yeast cells in acrylamid

e gel matrix,‖ Biomaterials, vol. 9, no. 2, pp. 168–172, 1988.

[514] R. A. Peinado, J. J. Moreno, J. M. Villalba, J. A. González-Reyes, J. M. Ortega, J. C.

Mauricio, ―Yeast biocapsules: A new immobilization method and their applications,‖ Enzy

me and Microbial Technology, vol. 40, no. 1, pp. 79–84, 2006.

[515]A. Deshpande, S. F. D‘souza, G. B. Nadkarni, ―Coimmobilization of D-amino acid oxi

dase and catalase by entrapment ofTrigonopsis variabilis in radiation polymerised Polyacryl

amide beads,‖ Journal of Biosciences, vol. 11, no. 1–4, pp. 137–144, 1987.

[516] Obzturk B. Immobilization of lipase from Candida rugosa on hydrophobic and

hydrophilic supports. MSc dissertation. İzmir (Turkey): Izmir Institute of Technology; 2001.

p. 40

[517] D.E.El-Hadedy, Moataza M. Saad and Hassan H.M, 2014.Protease Inhibitor

Expression with Immobilized Cells of Egyptian Streptomyces lavendulae on Different

Radiated Matrices Using Gamma Radiation. World Journal of Pharmaceutical Sciences

ISSN (Print): 2321-3310; ISSN (Online): 2321-3086

Page 301: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

300

[518] Nedovic VA, Cukalovic IL, Bezbradica D, Obradovic B, Bugarski B (2005) New

porous matrices and procedures for yeast cell immobilisation for primary beer fermentation.

In: Proceedings of the 30th European Brewery Convention. Prague, pp 401–413, ISBN 90-

70143-23-2.

[519] N. Gerbsch and R. Buchholz, The Role of Polymers for the delivery of live cells,

FEMS Microbiol. Rev., 1995, 16, 259–269

[250] S. Maicas, ―The use of alternative technologies to develop malolactic fermentation in

wine,‖ Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 56, no. 1–2, pp. 35–39, 2001.

[521] M. V. Dinu, M. M. Ozmen, E. S. Dragan, O. Okay, ―Freezing as a path to build macro

porous structures: Superfast responsive polyacrylamide hydrogels,‖ Polymer, vol. 48, no. 1,

pp. 195–204, 2007.

[522] A. Rosevear, ―Immobilised biocatalysts-a critical review,‖ J. Chem. Technol. Biotech

nol., vol. 34, no. 3, pp. 127–150, 2008.

[523] S. H. Hong, M. Shin, J. Lee, J. H. Ryu, S. Lee, J. W. Yang, W. D. Kim, H. Lee, ―STA

PLE: Stable Alginate Gel Prepared by Linkage Exchange from Ionic to Covalent Bonds,‖ A

dv. Healthcare Mater., vol. 5, no. 1, pp. 75–79, 2015.

[524] P. Tomme, N. R. Gilkes, R. C. Miller, A. J. Warren, D. G. Kilburn, ―An internal cellul

ose-binding domain meidates adsorption of an engineered bifunctional xylanase/cellulase,‖ ―

Protein Engineering, Design and Selection,‖ vol. 7, no. 1, pp. 117–123, 1994.

[525] T. Tatsuma, H. Tsuzuki, Y. Okawa, S. Yoshida, T. Watanabe, ―Bifunctional Langmuir

-Blodgett film for enzyme immobilization and amperometric biosensor sensitization,‖ Thin

Solid Films, vol. 202, no. 1, pp. 145–150, 1991.

[526] L.Michaelis., M.Ehrenreich, Biochem. J. 10: 283–290.1908

[527] K. Mosbach, ―Preface,‖ Immobilized Enzymes and Cells Part B, pp. 13–15, 1987.

[528] K. D. Le, N. R. Gilkes, D. G. Kilburn, R. C. Miller, J. N. Saddler, R. A. J. Warren, ―A

streptavidin-cellulose-binding domain fusion protein that binds biotinylated proteins to cellu

lose,‖ Enzyme and Microbial Technology, vol. 16, no. 6, pp. 496–500, 1994.

Page 302: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

301

[529] T. R. Jack and J. E. Zajic, ―The immobilization of whole cells,‖ Advances in Biochem

ical Engineering, pp. 125–145, 1977.

[530] Banu, C., „Biotehnologii in industria alimentară‖, Editura Tehnică,

Bucureşti,2000

[531] B. M. Brena, F. Batista-Viera, ―Immobilization of Enzymes,‖ Methods in Biotechnolo

gy™, pp. 15–30, 2006.

[532] S.Nisha,S. Arun Karthick and Gobi, Chemical Science Review and Letters, 1(3), 148-

155, 2012

[533] M. Amid, Y. Manap, N. Zohdi, ―Microencapsulation of Purified Amylase Enzyme fro

m Pitaya (Hylocereus polyrhizus) Peel in Arabic Gum-Chitosan using Freeze Drying,‖ Mole

cules, vol. 19, no. 3, pp. 3731–3743, 2014.

[534] Sunita Singh, A comparitive study on immobilization of alpha amylase enzyme on

different matrices, International Journal of Plant, Animal and Environmental Sciences, 2014

IJPAES ISSN 2231-4490, 192-198

[535] Lily N. Meyer, Effect of Immobilization Method on Activity of Alpha-Amylase, A

Thesis, The Ohio State University The Ohio State University May 18, 2007

[536] A. Kumar, A. Ahuja, J. Ali, S. Baboota, ―Curcumin Loaded Nano Globules for Solubil

ity Enhancement: Preparation, Characterization and <I>Ex Vivo</I> Release Study,‖ Journa

l of Nanoscience and Nanotechnology, vol. 12, no. 11, pp. 8293–8302, 2012.

[537] H.-Z. Ouyang, L. Fang, L. Zhu, L. Zhang, X.-L. Ren, J. He, A.-D. Qi, ―Effect of exter

nal factors on the curcumin/2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin: in vitro and in vivo study,‖ Jou

rnal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, vol. 73, no. 1–4, pp. 423–433, 201

1.

[538] Wacker Chemie AG: Info sheet of CAVAMAX® W8 CURCUMIN

[539] K. Maiti, K. Mukherjee, A. Gantait, B. P. Saha, P. K. Mukherjee, ―Curcumin–phospho

lipid complex: Preparation, therapeutic evaluation and pharmacokinetic study in rats,‖ Intern

ational Journal of Pharmaceutics, vol. 330, no. 1–2, pp. 155–163, 2007.

[540] N. K. Gupta, V. K. Dixit, ―Bioavailability Enhancement of Curcumin by Complexatio

n with Phosphatidyl Choline,‖ Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 100, no. 5, pp. 1987

–1995, 2011.

Page 303: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

302

[541] J. Cuomo, G. Appendino, A. S. Dern, E. Schneider, T. P. McKinnon, M. J. Brown, S.

Togni, B. M. Dixon, ―Comparative Absorption of a Standardized Curcuminoid Mixture and

Its Lecithin Formulation,‖ Journal of Natural Products, vol. 74, no. 4, pp. 664–669, 2011.

[542] V. Kakkar, S. Singh, D. Singla, I. P. Kaur, ―Exploring solid lipid nanoparticles to enha

nce the oral bioavailability of curcumin,‖ Molecular Nutrition & Food Research, vol. 55, no.

3, pp. 495–503, 2010.

[543] M. Fang, Jin, Bao, Gao, Xu, Wang, Wang, Yao, Liu, ―In vitro characterization and in

vivo evaluation of nanostructured lipid curcumin carriers for intragastric administration,‖ IJ

N, p. 5395, 2012.

[544] D. Matabudul, K. Pucaj, G. Bolger, B. Vcelar, M. Majeed, L. Helson, Anticancer Res,

32, 4359 (2012)

[545] L. Helson, G. Bolger, M. Majeed, B. Vcelar, K. Pucaj, D. Matabudul, Anticancer

Res,32, 4365 (2012)

[546] M. Takahashi, S. Uechi, K. Takara, Y. Asikin, K. Wada, ―Evaluation of an Oral Carrie

r System in Rats: Bioavailability and Antioxidant Properties of Liposome-Encapsulated Cur

cumin,‖ Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 57, no. 19, pp. 9141–9146, 2009.

[547] C. Li, Zhang, Su, Feng, Long, Chen, ―Silica-coated flexible liposomes as a nanohybrid

delivery system for enhanced oral bioavailability of curcumin,‖ IJN, p. 5995, 2012.

[548] L. Hu, Y. Jia, F. Niu, Z. Jia, X. Yang, K. Jiao, ―Preparation and Enhancement of Oral

Bioavailability of Curcumin Using Microemulsions Vehicle,‖ Journal of Agricultural and Fo

od Chemistry, vol. 60, no. 29, pp. 7137–7141, 2012.

[549] H. Yu, Q. Huang, ―Improving the Oral Bioavailability of Curcumin Using Novel Orga

nogel-Based Nanoemulsions,‖ Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 60, no. 21,

pp. 5373–5379, 2012.

[550] L. Zhongfa, M. Chiu, J. Wang, W. Chen, W. Yen, P. Fan-Havard, L. D. Yee, K. K. Ch

an, ―Enhancement of curcumin oral absorption and pharmacokinetics of curcuminoids and c

urcumin metabolites in mice,‖ Cancer Chemotherapy and Pharmacology, vol. 69, no. 3, pp.

679–689, 2011

Page 304: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

303

[551] D. Guzman-Villanueva, I. M. El-Sherbiny, D. Herrera-Ruiz, H. D. C. Smyth, ―Design

andIn VitroEvaluation of a New Nano-Microparticulate System for Enhanced Aqueous-Phas

e Solubility of Curcumin,‖ BioMed Research International, vol. 2013, pp. 1–9, 2013.

[552] U. Gandapu, R. K. Chaitanya, G. Kishore, R. C. Reddy, A. K. Kondapi, ―Curcumin-L

oaded Apotransferrin Nanoparticles Provide Efficient Cellular Uptake and Effectively Inhibi

t HIV-1 Replication In Vitro,‖ PLoS ONE, vol. 6, no. 8, p. e23388, 2011.

[553] H. Sasaki, Y. Sunagawa, K. Takahashi, A. Imaizumi, H. Fukuda, T. Hashimoto, H. W

ada, Y. Katanasaka, H. Kakeya, M. Fujita, K. Hasegawa, T. Morimoto, ―Innovative Preparat

ion of Curcumin for Improved Oral Bioavailability,‖ Biological & Pharmaceutical Bulletin,

vol. 34, no. 5, pp. 660–665, 2011.

[554] Makino Y, Kurita T, Imaizumi A, Hashimoto T: Novel curcumin nano-suspensions

with enhanced oral bioavailability and stability. Presented to 10th France-Japan DDS

Symposium, October 13, 2012 (Bordeau, France)

[555] K. K. Cheng, C. F. Yeung, S. W. Ho, S. F. Chow, A. H. L. Chow, L. Baum, ―Highly S

tabilized Curcumin Nanoparticles Tested in an In Vitro Blood–Brain Barrier Model and in A

lzheimer‘s Disease Tg2576 Mice,‖ The AAPS Journal, vol. 15, no. 2, pp. 324–336, 2012.

[556] X. Xie, Q. Tao, Y. Zou, F. Zhang, M. Guo, Y. Wang, H. Wang, Q. Zhou, S. Yu, ―PLG

A Nanoparticles Improve the Oral Bioavailability of Curcumin in Rats: Characterizations an

d Mechanisms,‖ Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 59, no. 17, pp. 9280–9289

, 2011.

[557] J. Sun, C. Bi, H. M. Chan, S. Sun, Q. Zhang, Y. Zheng, ―Curcumin-loaded solid lipid

nanoparticles have prolonged in vitro antitumour activity, cellular uptake and improved in vi

vo bioavailability,‖ Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, vol. 111, pp. 367–375, 2013.

[558] T. Kurita, Y. Makino, „Novel Curcumin Oral Delivery Systems‖, Anticancer

Research, vol. 33 no. 7, pp. 2807-2821, 2013

[559] S. A. Haddad, C. C. Lindegren, „A Method for Determining the Weight of an

Individual Yeast Cell‖, Appl. Microbiol., vol. 1, pp. 153–156, 1953.

[560] P. Kandylis , D. Dimitrellou, A. A. Koutinas, „Winemaking by barley supported yeast

cells‖, Food Chemistry, vol. 130, pp. 425–431, 2012

Page 305: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

304

[561] S. Torresi, M. T. Frangipane, G. Anelli, „Biotechnologies in sparkling wine

production. Interesting approaches for quality improvement: A review‖, Food Chemistry,

vol. 129, 1232–1241, 2011.

[561] A. A. Eddy, A. D. Rudin, „The Structure of the Yeast Cell Wall. I. Identification of

Charged Groups at the Surface‖, Proceedings of the Royal Society of London. Series B,

Biological Sciences, vol. 148, no. 932 (Mar. 18,), pp. 419-432, 1958.

[562] M. Malm, Changes in the Electrical Charge of Yeast Cells Treated with Sodium

Fluoride, Nature, vol 157, pp. 731-732, 1946.

[563] T. Tuszynski, A. Pasternakiewicz, ―Interaction of metal ions on the yeast growth

Saccharomyces cerevisiae in depending of medium pH‖, Chem. Inz. Ekol. vol. 6, no 5-6, pp.

720-728, 1999

[564] X. H. Yang, W. L. Zhu, ― Viscosity properties of sodium carboxymethylcellulose

solutions―, Cellulose, vol.14, pp. 409–417, 2007.

[565] P. N. Lipke and R. Ovalle, ―Cell Wall Architecture in Yeast: New Structure and New

Challenges‖, J. Bacteriol., vol. 180, no. 15, pp. 3735-3740, 1998.

[566] C. Zufall, T. Tyrell, ―The Influence of Heavy Metal Ions on Beer Flavour Stability,‖

Journal of the Institute of Brewing, vol. 114, no. 2, pp. 134–142, 2008.

[567] S. Liu, Y. Hou, W. Liu, C. Lu, W. Wang, S. Sun, „Components of the calcium-

calcineurin signaling pathway in fungal cells and their potential as antifungal targets‖,

Eukaryot Cell , vol.14, pp. 324 –334, 2015.

[568] N. W. Taylor, W. L. Orton, „Calcium in flocculence of Saccharomyces cerevisiae‖, J.

Inst. Brew, vol. 81, pp. 53-57, 1975.

[569] N. W. Taylor, W. L. Orton, Effect of alkaline-earth metal salts on flocculence in

Saccharomyces cerevisiae, J. Inst. Brew, vol. 79, pp. 294-297, 1973.

[570] H. Ruttloff, ―L. B. WINGARD, JR., E. KATCHALSKI-KATZIR und L.

GOLDSTEIN: Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol. 1: Immobilized Enzyme

Principles. 364 Seiten, 22 Abb., 111 Tab. Academic Press, New York, San Francisco,

London 1976. Preis: 29,50 $,‖ Nahrung, vol. 22, no. 5, pp. 521–521, 1978.

[571] P. de Vos, M. M. Faas, M. Spasojevic, J. Sikkema,‖ Encapsulation for preservation

of functionality and targeted delivery of bioactive food components‖, Int Dairy J, vol. 20,

no. 4, pp. 292-302, 2010.

[572] D. Poncelet, R. Lencki, C. Beaulieu, J. P. Halle, R. J. Neufeld, and A. Fournier,

―Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. I. Methodology,‖ Applied

Microbiology and Biotechnology, vol. 38, no. 1, Oct. 1992.

Page 306: CONCEPEREA DE NOI PARTICULE DE HIDROGEL PE BAZĂ DE ...

305