Revista CENIC Ciencias Biológicas. 41, No. Especial, 2010 Cloning of the human insulin cDNA gene in hairy roots of Brassica oleracea var italica (broccoli) Clonación del cDNA del gen de la insulina humana en raíces aéreas de Brassica oleracea var italica (brócoli)

Berenice García Reyes1, María del Carmen Montes Horcasitas1, Emma Gloria Ramos Ramírez1, Armando Ariza Castolo2, Josefina Pérez Vargas3, Octavio Gómez Guzmán1, and Graciano Calva Calva*,1

1Biotecnología y Bioingeniería, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional. Avenida Instituto Politécnico Nacional 2508, Colonia San Pedro Zacatenco, México D. F. Código Postal 07360. Tel: 01 (55) 57473800 Ext. 4348. gcalva@cinvestav.mx, bgribqdf@gmail.com 2Química, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional. Avenida Instituto Politécnico Nacional 2508, Colonia San Pedro Zacatenco, México D. F. Código Postal 07360. Tel: 01 (55) 57473800 Ext. 3727 3Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec. División Ingeniería Bioquímica, Posgrado en Ingeniería Bioquímica. Av. Tecnológico S/N. Colonia Valle de Anáhuac, Ecatepec de Morelos, Estado de México, Código Postal 55210. Tel: 50002300 RESUMEN. La insulina humana es una proteína de actividad hormonal que regula los niveles de glucosa en sangre. Cuando la insulina falla se desarrolla el padecimiento conocido como diabetes. La insulina se ha expresado en bacterias, levaduras, hongos, células animales y sistemas vegetales por biotecnología vegetal. En este trabajo presentamos los resultados del uso de raíces transformadas de Brassica oleracea var italica (Brocoli) para producir insulina humana. Materiales y Métodos: El cDNA del correspondiente gen humano fue transfectado a Brocoli via Agrobacterium rhizogenes LBA9402 con el vector pCAMBIA1105.1. La transformación del tejido de raíces fue confirmada por PCR, reacciones de restricción y ensayos de β-glucuronidasa. Resultados y Discusión: La presencia del cDNA correspondiente a preproinsulina y proinsulina fue β-glucuronidasa positiva para varias de las líneas. Aunque el rendimiento fue variable, cinco líneas mostraron valores apropiados con potencial para ser usadas como modelo de estudio en la producción en biorreactores. ABSTRACT. The human insulin is a protein with hormonal activity that regulates the glucose levels in blood. When insulin fails appears the diabetes decease. Insulin has been expressed in bacteria, yeast, fungi, animal cells, and in vegetal systems through plant biotechnology. In this work we present the results of using hairy roots cultures of Brassica oleracea var italica (Broccoli) to produce the human insulin. The cDNA from the corresponding human gen was transfected into Broccoli via Agrobacterium rhizogenes LBA9402 with the pCAMBIA1105.1 vector. PCR, restriction reactions, and β-glucuronidase assay were used to demonstrate the transformation of the hairy root tissue. The presence of the cDNA for preproinsulin and proinsulin was β-glucuronidase assay positive for several strains. Although yield was variable, five strains showed proper values with potential to be used as model to study the production in bioreactors.

Palabras claves:: raíces transformadas, biotecnología vegetal, Insulina, proteínas heterólogas, proteínas terapéuticas.

Keywords: hairy roots, plant biotechnology, Insulin, heterologous protein, therapeutic proteins.

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INTRODUCCION La insulina es una proteína con actividad hormonal que regula los niveles de glucosa en la sangre, aunque también participa en la regulación de otros procesos fisiológicos como la utilización de algunos nutrientes, estimulación de la síntesis de glucógeno, aminoácidos, proteínas y consumo de lípidos1. Las deficiencias en su modo de acción se dan cuando su biosíntesis es insuficiente y deficiente, provocando alteraciones en sus funciones fisiológicas, directamente la concentración de glucosa en la sangre, produciendo así el padecimiento conocido como diabetes. Esta es una enfermedad metabólica crónica caracterizada por alteraciones en metabolismo de la glucosa, grasas y proteínas. La insulina humana recombinante se ha expresado en diversos organismos, incluyendo bacterias, levadura, hongos, células y órganos de animales y plantas transgénicas2. Actualmente su producción comercial se ha limitado a microorganismos como Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae, sin embargo los sistemas basados en biotecnología vegetal en algunos casos ofrecen ventajas tanto en producción, como en bioseguridad y economía. Debido a ello, para varias proteínas con actividades biológicas la biotecnología vegetal se ha propuesto como alternativa de producción real y económicamente viable3. Esas biotecnologías basadas en plantas pueden utilizar plantas transgénicas completas o sus células, tejidos u órganos cultivados en biorreactores de manera similar a los sistemas de fermentación para microorganismos4. De lo anterior, en este trabajo se dan los resultados sobre el establecimiento de cultivos de raíces transformadas para la producción de insulina humana con el objetivo de coadyuvar a la creciente demanda de esta proteína debida al aumento de la población que presenta problemas de diabetes. Como modelo vegetal se utilizó Brassica oleracea var. italica debido a la disponibilidad de la metodología para su transformación y su alta capacidad natural de acumulación de proteína.5 MATERIALES Y METODOS cDNA Se aisló a partir de la clona 3950204 (Open Biosystems, USA) de E. coli llevando el cDNA del gen de la insulina humana (Ins) insertado en el plásmido pDNR-Lib. La extracción del plásmido se llevo a cabo mediante el kit PureLinkTM (Invitrogen K2100-10). Una vez obtenido el plásmido se determino su concentración y pureza haciendo una dilución 10:1000 plásmido-agua α y midiendo absorbancia en un espectrofotómetro CAMSPEC (mod. M330) a 260 nm y 280 nm respectivamente. El cDNA se liberó del plásmido pDNR-Lib con las enzimas de restricción EcoR I, y Xho I. PCR Para la amplificación por PCR se usó un termociclador TECHNE (mod. TC312) y el kit PlatinumR Super Mix High Fidelity (Invitrogen 12532-016) bajo condiciones de 94 ºC 30 s de desnaturalización, 60 ºC 1 minuto de alineamiento y 70 ºC 1 minuto de extensión, en 40 ciclos. Los oligos directo y reverso fueron diseñados en este trabajo y contienen en sus secuencias bases correspondientes con la enzima Eco31 combinada con las enzimas Nco I, Bgl II para los oligos directo y reverso respectivamente y finalmente en la secuencia se incluyen bases que corresponden a las regiones del cDNA para preproinsulina y proinsulina por separado. Inserción del cDNA en pCAMBIA Se recuperó el vector binario pCAMBIA 1105.1 de una cepa de E. coli (adquirido de la casa CAMBIA.ORG) mediante el kit comercial de miniprep PureLinkTM (Invitrogen K2100-10). Una vez obtenido el plásmido se caracterizó con varias enzimas de restricción que liberan fragmentos conocidos observando los resultados por electroforesis en gel de agarosa. Las enzimas de restricción Nco I, Bgl II y Eco31 I fueron usadas para generar extremos cohesivos en el vector binario pCAMBIA1105.1 en una relación de 1:1 U de enzima-µDNA para las enzimas Nco I, Bgl II (Figura 1A); y el cDNA amplificado anteriormente en una relación 1.5:1 U de enzima-µDNA para la enzima Eco31.

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Fig. 1. Vector binario pCAMBIA 1105.1 y comparación esquemática de los amplificados preproinsulina y proinsulina utilizados para generar los constructos finales. (A) Vector pCAMBIA 1105.1, (B) Amplificados preproinsulina y proinsulina. Los colores en los fragmentos esperados representan las secuencias de la señal para translocación a retículo endoplásmico (naranja), cadena B (verde), péptido C (negro) y cadena A (azul). Una vez obtenido el DNA se comprobó que la reacción de restricción se efectuaba haciendo una ligación entre los mismos fragmentos; vector-vector amplificado-amplificado y la formación de los constructos, vector-preproinsulina y vector-proinsulina (Figura 1B). Se utilizó una T4 DNA ligasa (Invitrogen 15224-025) y varias relaciones de vector-vector, amplificado-amplificado y vector-amplificado observando los resultados por electroforesis en gel de agarosa. Para la amplificación de los constructos obtenidos se usó la cepa de E.coli DH5α transformada por electroporación utilizando las mezclas de ligación (vector-preproinsulina y vector-proinsulina) y células electrocompetentes en una celda de electroporación de 2mm bajo condiciones de 25 μF, 2.5 kV, 200 Ω por 25 ms. Se incubaron por 3-4 hrs las células electroporadas y se propagaron en medio de cultivo LB (Luria-Bertani) con estreptomicina (100 µg/ml). Se seleccionaron aleatoriamente clonas resultantes bajo esta selección, para obtener el constructo por extracción plasmídica mediante el kit PureLinkTM (Invitrogen K2100-10). Este plásmido se usó como templado para comprobar la integración del amplificado de interés (preproinsulina y proinsulina) al vector pCAMBIA 1105.1 por PCR. Se selecciono una clona PCR positiva de cada constructo (pCppINS-bgr y pCpINS-bgr) para extraer los constructos y transferirlos por electroporación a Agrobacterium. Transformación de Agrobacterium Se usó la cepa de Agrobacterium rhizogenes LBA9402 la cual contiene el plásmido pRi-1855 del tipo agropina,6,7 que induce la formación de raíces transformadas mediante la transferencia del TRi-DNA de dicho plásmido. Dicha cepa transformada por electroporación, bajo las condiciones ya mencionadas, resultó en cepas de Agrobacterium rhizogenes pC1105.1, Agrobacterium rhizogenes pCppINS-bgr y Agrobacterium rhizogenes pCpINS-bgr. La presencia de los plásmidos en las clonas correspondientes se llevo acabo de la misma forma que con las clonas de E. coli. Estas cepas de Agrobacterium rhizogenes se usaron para la transfección del T-DNA contenido en cada constructor a plántulas de Brócoli e inducir líneas de raíces transformadas con el cDNA correspondiente. Transfección del cDNA a Brócoli Fueron plántulas de Brócoli obtenidas mediante la germinación de semillas en medio B5 (Gamborg; Sigma-Aldrich G5768) adicionado con vitaminas (Sigma-Aldrich M7150) y 1.8 g/l de fitagel®. Las plántulas de 3-4 semanas de germinación y sin hojas verdaderas se usaron para la transfección por punción, la cual desencadena las señales químicas entre planta-agrobacterium promoviendo la transfección del TRi-DNA del plásmido bacteriano al genoma

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de la planta. 6 Por otro lado, plántulas mayores a un mes y con hojas verdaderas se usaron para la obtención de explantes de raíces para el establecimiento de cultivos de raíces no transformadas en medio SH (Schenk y Hildebrandt; Sigma-Aldrich S6765) adicionado con vitaminas (Sigma-Aldrich S3766) y sin reguladores del crecimiento. Prueba de la transformación del tejido radical Se utilizó el ensayo de actividad de GUS colocando un fragmento de tejido radical en 230 µl de buffer de tinción (50 mM NaHPO4 pH 7, 0.5 % Triton X-100, 10 mM EDTA) y 20 µl de X-Gluc (20 mM X-Gluc en DMF). Se sometió al vació por 10 min 3 veces, se incubo a 37 ºC 16 h y se observo el tejido bajo microscopio óptico a 25, 100, 160 y 200 X según el caso. Prueba de la presencia del cDNA en el tejido vegetal Se utilizó la amplificación por PCR de los fragmentos de preproinsulina y proinsulina con los oligos correspondientes a partir del DNA genómico del tejido vegetal. Este se extrajo del tejido mediante la técnica reportada por Rouhibakhsh,8 y se utilizo como templado para la PCR utilizando un termociclador TECHNE (mod. TC312) con el kit PlatinumR Super Mix High Fidelity (Invitrogen 12532-016), con las condiciones mencionadas arriba. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Obtención del cDNA Con el uso de oligos diseñados para añadir al cDNA del gen ins la secuencia correspondiente a las enzimas Nco I, Bgl II y Eco 31 I, la cual reconoce secuencia de nucleotidos anteriores al sitio de corte y realiza el corte en las secuencias correspondientes a los sitios de Nco I y Bgl II, se logró amplificar dos fragmentos contenidos en el cDNA del gen ins con el tamaño de 495 y 364 pb correspondientes para la secuencia del cDNA de la preproinsulina y proinsulina respectivamente (Figura 2). Estos dos amplificados fueron denominados ppINS-bgr y pINS-bgr respectivamente. Debe señalarse que el cDNA del gen ins corresponde a la secuencia de la preproinsulina, mientras el fragmento correspondiente a la proinsulina carece de la región codificante para el péptido señal.

Fig. 2. Productos de PCR del vector pDNR-Lib-Ins amplificado con los oligos prepro y pro insulina diseñados en este trabajo. Carril 1, ppINS-bgr; carril 2, pINS-bgr. Inserción del cDNA en pCAMBIA El vector pCAMBIA 1105.1 se digirió con las enzimas Nco I y Bgl II (Figura 1). Los sitios para estas enzimas se encuentran después del promotor 35s y antes del gen GUSplus que codifica para la β-glucuronidasa y son complementarios a los que poseen los fragmentos ppINS-bgr y pINS-bgr amplificados arriba para la prepro y proinsulina. Después de la restricción se procedió a establecer las condiciones para la ligación del vector con los fragmentos. Se encontró que es necesario mantener una relación (µg) vector:fragmento de

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4:1 y un exceso de la enzima de ligación utilizando 3 μl (Figura 3). Los plásmidos resultantes fueron denominados pCppINS-bgr y pCpINS-bgr.

Fig. 3. Condiciones y productos de las reacciones de ligación del los fragmentos ppINS-bgr y pINS-bgr con el vector pCAMBIA 1103.1 previamente digerido con las enzimas Nco I y Bgl II. Los plásmidos resultantes se denominaron pCppINS-bgr y pCpINS-bgr para la prepro y proinsulina respectivamente. Clonación de los plásmidos pCppINS-bgr y pCpINS-bgr en E. Coli y Agrobacterium Se clonaron en células electrocompetentes de Escherichia coli DH5α por electroporación. Las clonas fueron propagadas en medio LB con estreptomicina y su transformación se comprobó por extracción del DNA plasmídico y la amplificación de los fragmentos ppINS-bgr y pINS-bgr por PCR con los oligos prepro y pro insulina (Figura 4). La presencia del cDNA respectivo fue positiva en todas las clonas probadas. Además el fragmento preproinsulina amplificado del vector pCppINS-bgr se sometió a restricción con la enzima Nco I liberando un fragmento de 422 pb correspondiente al cDNA de preproinsulina desde el sitio ATG como se esperaba (Figura 5). Esto se realizó primero en E. coli con la finalidad de aumentar y conservar las construcciones para posteriormente generar las cepas correspondientes de Agrobacterium rhizogenes para la transfección del cDNA a Brócoli. Las clonas resultantes de Agrobacterium rhizogenes se seleccionaron como se describió para E. coli, sin embargo en este caso se usó estreptomicina a una concentración cinco veces mayor.

Fig. 4. Amplificación por PCR de los fragmentos ppINS-bgr (A) y pINS-bgr (B) con los oligos diseñados para la amplificación del cDNA de la preproinsulina y proinsulina a partir del DNA plasmídico extraído de varias clonas de E. coli transformadas con las construcciones pCppINS-bgr y pCpINS-bgr respectivamente.

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Fig. 5. Liberación desde el sitio ATG del segmento del cDNA de 422 pb de la preproinsulina por restricción con Nco I del fragmento obtenido por amplificación por PCR a partir del vector pCppINS-bgr contenido en E. coli. Inducción de raíces transformadas Las plántulas con 3-4 semanas de edad consideradas como jóvenes fueron utilizadas para la inducción de raíces aéreas por punción con la cepa silvestre de Agrobacterium rhizogenes LBA9402 y con la misma transformada con el vector pCAMBIA 1105.1 y con los plasmidos pCppINS-bgr y pCpINS-bgr (Figura 6). Los explantes de hipocotilo con raíces aéreas en el punto de punción se incubaron en medio SH con cefotaxima para evitar la colonización de Agrobacterium y propagar las raíces aéreas. De las raíces propagadas posteriormente se establecieron cultivos en medio líquido (Figura 6-C). Paralelamente a estas actividades las plántulas que no fueron punzadas y que alcanzaron mayor cantidad de raíces fueron utilizadas para establecer líneas de raíces no transformadas en cultivo líquido, los cuales fueron utilizadas como control (Figura 6-A).

Fig. 6. Cultivo de raíces no transformadas (A) y transformadas de Brócoli (C). B, plántulas de Brócoli de 3-4 semanas de edad mostrando las raíces aéreas inducidas después de 2 semanas de haber sido punzadas con Agrobacterium. Una vez que se establecieron los cultivos sumergidos de las líneas no transformadas y las transformadas con Agrobacterium rhizogenes LBA9402 y con Agrobacterium rhizogenes pCAMBIA 1105.1 y por otro lado con Agrobacterium rhizogenes pCppINS-bgr y Agrobacterium rhizogenes pCpINS-bgr se comparó la morfología de los tejidos de raíz de

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cada línea, además se utilizó como presión de selección la resistencia a higromicina y se seleccionaron con base a la reacción de GUS en todas las líneas (Figura 7).

Fig. 7. Diferencias morfológicas, de resistencia y de expresión de GUS en cultivos de raíces no transformadas y transformadas con Agrobacterium rhizogenes LBA9402 y con Agrobacterium rhizogenes pCAMBIA 1105.1. Las micrografías tomadas se realizaron a 100X en todos los casos. Los cultivos de raíces no transformadas mostraron un crecimiento típico, pilosidad normal y sensibilidad a la higromicina, dado que únicamente se desarrollaron en ausencia de esta y al aplicar la reacción GUS esta resultó negativa (Figura 7-A). Estos resultados fueron los esperados debido a que estos cultivos no poseen resistencia a higromicina ni contienen el gen de la β-glucuronidasa. Por otra parte, los cultivos de raíces transformadas inducidas con la cepa Agrobacterium rhizogenes LBA9402 silvestre mostraron las características de un crecimiento acelerado y una alta pilosidad debido a la transferencia del TRi-DNA del plásmido pRi1855 que posee esta cepa. Por supuesto estos cultivos también mostraron sensibilidad a higromicina y dan reacción de GUS negativa (Figura 7-B). Esto debido a que a pesar de ser cultivos de raíces transformadas, no poseen la capacidad de resistencia a higromicina ni de la expresión de β-glucuronidasa para la reacción GUS que están en el vector pCAMBIA 1105.1 y por lo tanto en los plásmidos pCppINS-bgr y pCpINS-bgr. Así, los cultivos de raíces inducidas con la cepa Agrobacterium rhizogenes pCAMBIA 1105.1 mostraron las características de un crecimiento acelerado y alta pilosidad, resistencia a higromicina y actividad de β-glucuronidasa, razón por la cual estos cultivos crecen y se desarrollan en presencia de higromicina y fueron GUS positivos (Figura 7-C). Los resultados del análisis de la actividad de β-glucuronidasa en varias 9 líneas de raíces aéreas transformadas con la construcción pCppINS-bgr que lleva el cDNA para proproinsulina, y de 5 líneas de raíces transformadas con la construción pCpINS-bgr, mostraron que varias de ellas expresaban positivamente el gen GUS (Figura 8). De ellas, las líneas pp7, pp8 y pp9 que contienen el cDNA para preproinsulina, y las p1, p2, p3 y p4 que contiene el cDNA para proinsulina mostraron expresión fuerte de β-glucuronidasa y por lo tanto deben estar expresando también el cDNA correspondiente. Las diferencias en los niveles de expresión se puede deber a la manera aleatoria en la que es insertado al genoma el fragmento de T-DNA que a su vez contiene el cDNA. Esto podría explicar por que la actividad de β-glucuronidasa fue positiva tanto en el tejido como en el medio de cultivo de algunas líneas (pp8, p2, p3, p4 y p5), mientras en otras como las líneas pp7 y pp9 la expresión fue intracelular, e inclusivo diferencial dentro del tejido. Estos resultados

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demuestra que el rendimiento de los productos de le expresión del DNA foráneo es muy variable, sin embargo varias de las líneas demuestran expresión suficiente que podrían permitir dar seguimiento a las proteínas correspondientes e iniciar estudios para la producción en biorreactores.

Fig. 8. Ensayo de GUS para las líneas de raíces transformadas con Agrobacterium rhizogenes pCppINS-bgr y Agrobacterium rhizogenes pCpINS-bgr. Obsérvese la expresión de β-glucuronidasa tanto en el tejido como en el medio para la línea pp8, p2, p3, p4, p5 a diferencia de las líneas pp7 y pp9 que expresan actividad de β-glucuronidasa sólo en algunas partes del tejido y no el medio de reacción. CONCLUSIONES Se establecieron cultivos varias líneas de raíces transformadas con los fragmentos del cDNA del gen Ins que codifican para la preopro y proinsulina. Los niveles de expresión evaluados por la actividad de β-glucuronidasa son adecuados para dar seguimiento a las estructuras de las proteínas correspondiente y utilizar estas líneas en estudios encaminados a su producción en biorreactores de laboratorio. AGRADECIMIENTOS El primer autor agradece a CONACYT por la beca otorgada para realizar el presente proyecto.

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