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Si no es capaz de desarrollar algo semejante, cite la fuente. Λ = Զ = Z MATERIAL DE DOCENCIA PARA CONSULTA No utilice este material didáctico fuera de contexto. 01 Clase práctica: Histoquímica Temas: . Curso de Postgrado: Histología animal comparada: técnicas básicas para microscopía óptica y electrónica (marzo 2018). Introducción a la histoquímica. Detección de Hidratos de carbono. Detección de Proteínas. Detección de Lípidos. Histoquímica Especial: Amiloide. Histoquímica Especial: Pigmentos. Histoquímica Especial: Elementos químicos (calcio, cobre). Octava Edición 2018 Estudio de la Neurosecreción. Índice de las pantallas al final

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Si no es capaz de desarrollar algo semejante, cite la fuente.

Λ = Զ = ZMATERIAL DE DOCENCIA PARA CONSULTA

No utilice este material didáctico fuera de contexto.

01

Clase práctica: HistoquímicaTemas:

.

Curso de Postgrado: Histología animal comparada: técnicas básicas para

microscopía óptica y electrónica (marzo 2018).

Introducción a la histoquímica.Detección de Hidratos de carbono.Detección de Proteínas.Detección de Lípidos.Histoquímica Especial: Amiloide. Histoquímica Especial: Pigmentos.Histoquímica Especial: Elementos químicos (calcio, cobre).

Octava Edición 2018

Estudio de la Neurosecreción. Índice de las pantallas al final

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02Introducción a la Histoquímica:Es la determinación de sustancias presentes en los tejidos, utilizando

reacciones y coloraciones específicas, que nos informan sobre un tipo de fisiología especial que desarrollan las células. Estas técnicas sirven para

establecer cual es el desempeño de un tejido u órgano, y su funcionamientoespecífico, pudiéndolas desarrollarlas en cortes histológicos, o en tejidos y

órganos enteros como una pieza.

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En todos los casos cortes histológicos o piezas de tejidos, siempre es necesario la fijación y el tratamiento específico para cada una de las sustancias a determinar. En caso que el material biológicos sea piezas enteras, además de los cuidados y

técnicas utilizadas para los cortes histológicos, se deben implementar otras técnicas como el cultivo organotípico y los procesos complicados de montado de la pieza.

En la bibliografía específica se podrán encontrar con los tratamientos previos que se le deben dar al material biológico para proteger o resguardar las sustancias a determinar.

Sustancias

Fisiología celular

Objetivo corto:

Objetivo largo:

ProteínasHidratos de CarbonoLípidos

Primer Nivel Segundo Nivel Tercer NivelCarácter: ÁcidoBásico

Grupos ionógenos:CarboxiloSulfatosFosfatos

Célula diferenciada o no diferenciada, de digestión, de reserva, secretora, etc.

Sustancias orgánicas específicas: melanina

Iones inorgánicos: calcio, hierro, cadmio

Sustancias orgánicas:Objetivos:

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03Introducción a la Histoquímica:

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Fijación: para propósitos histoquímicos generales se recomienda el líquido de Baker.Fijador formaldehído cálcico de Baker (para lípidos): formol, 10 ml; cloruro de calcio al 10 % (anhidro), 10 ml; agua destilada, 80 ml; agregar carbonato de calcio hasta solución saturada. Para marinos cambiar por cloruro de calcio 40 ml y agua destilada 50 ml. Conservador: formol, 10 ml; cloruro de calcio al 10 % (anhidro), 10 ml; cloruro de cadmio al 10 %, 10 ml y agua destilada a 70 ml; carbonato de calcio hasta solución saturada. Fijar durante 2 o 3 días. Conserva muchas sustancias citoplasmáticas. Citología no nuclear. Para lípidos seguir con cortes por congelación.

Fijador de Carnoy: alcohol 100 %, 6 volúmenes; cloroformo, 3 volúmenes; ácido acético glacial, 1 volumen. Fijar por 3 horas. Pasar al alcohol, 90 o 100 %. Fijador general, cromosomas, glucógeno.

Fijador de Hamazaki: A) agua destilada, 250 ml; cloruro de mercurio, 7,5 g; dicromato de potasio, 5 g; ácido acético glacial, 2,5 ml. B) formaldehído al 4 %, con carbonato de calcio a saturación. A) Durante 3 días. B) Durante 1 día. Propósitos histoquímicos generales y especial para músculos.

Fijador de Lang: agua destilada, 100 ml; cloruro de mercurio, 7 g. (solución saturada); ácido acético glacial, de 5 a 10 ml. Fijar hasta 6 horas, pasar al alcohol 70 %. Tejidos glandulares y con colágeno.

Fijador de Zenker: Solución Madre: agua destilada, 100 ml; cloruro de mercurio, 5 g; bicromato de potasio, 2,5 g; sulfato de sodio, 1 g. A la Solución Madre agregar 5 ml de ácido acético glacial antes de usar. Fijar por 24 horas, lavar 24 horas, alcohol 70 %. Propósitos histoquímicos generales.

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Dentro de los hidratos de carbono o glúcidos encontramos a los polisacáridos que están formados por más de diez moléculas de monosacáridos (azúcares simples). Se pueden dividir en polisacáridos simples (glucógeno, galactógeno) o polisacáridos complejos(mucopolisacaridos, mucoproteínas y mucolípidos). Fijación: Bouin, Carnoy, fríos.Polisacáridos simples (glucógeno, galactógeno):

Polisacáridos complejos (mucopolisacaridos ácidos):

Polisacáridos complejos (mucopolisacaridos neutros, mucoproteínas, mucolípidos):

Reacción APS (PAS) o ácido peryódico – reactivo de Schiff y método del carmín de Best.

Método de Hale y métodos del azul alcián.

Reacción APS (+) y método del azul alcián (-).

(*) También llamados mucopolisacaridos nitrogenados.

(*)

(*)

Mucopolisacaridos = Glucosaminoglucanos Hidratos de carbono:

Estudio de la glándula del albumen de Pomacea canaliculata:

métodos del azul alcián sin coloración de fondo, mucopolisacáridos ácidos en células a (ga).

Tricrómico de Masson modificado

Escalas 20 μm

Referencias: ga: subpoblación de células glandulares azules; gb: subpoblación de células glandulares blancas; c: conductos ciliados excretores.

Se llaman glucoconjugados a los carbohidratos (glucanos) unidos a proteínas (glucoproteínas) o a

lípidos (glucolípidos) en forma covalente.

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Otras técnicas empleadas para mucosustancias o mucopolisacáridos nitrogenados son: 1. método de Salazar (glicoproteínas y mucopolisacáridos ácidos y neutros); 2. método de Steedman con azul alcián (pH 7), variante de Mowry (pH 3,5) y de Spicer (pH 2) (mucopolisacáridos ácidos); 3. método de Feyrter, deslipidizado con piridina, técnicas de Baker y de Keilig (mucopolisacáridos ácidos); 4. método de Halmi y Davies o de la fucsina paraldehído sin oxidación (mucopolisacáridos sulfatados y carboxilados); 5. azul de toluidina al 0,2 %, pH 4,4 con tampón cítrico fosfato montado en medio acuoso y bálsamo de Canadá (radicales ionógenos: carboxilo, sulfatos y fosfatos) (la metacromasia no resiste la deshidratación, especialmente en la mucopolisacáridosácidos sulfatados); 6. azul de toluidina al 0,2 %, pH 3,4 con tampón cítrico fosfato (radicales ionógenos: sulfatos y fosfatos); 7. metilación (alcohol metílico – ácido clorhídrico) y metacromasia (obtención de resultados negativos); 8. metilación, saponificación (alcohol etílico – hidróxido de potasio) y metacromasia (radical ionógeno: carboxilos); 9. azul de toluidina al 0,01 %, pH 3,4 con tampón diluido cítrico – fosfato adicionado con nitrato de uranilo N/1000 (radical ionógeno: sulfatos); 10. esterificación sulfúrica (ácido sulfúrico al 50 % en éter etílico) y metacromasia (mucoides); y 11. método de Gomori o de la fucsina paraldehído con oxidación (mucinas).

Para metacromasia ver apartado (pantalla 06) Hidratos de carbono:

Estas técnicas nunca debe ser utilizadas de manera aislada. El procedimiento es detectar la naturaleza de un mucopolisacáridos ácido primero y luego ver que clase de

radicales ionógenos participan en la sustancia.

Tabla completa de determinaciones.

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Detección de la metacromasia para mucopolisacáridos: La metacromasia es la propiedad de cambiar de color que ciertos colorantes tienen frente a sustancias específicas, estas sustancias “polimerizan” el colorante, lo ordenan en una secuencia, que cambia la propiedad del colorante a otro color distinto. En general los componentes tisulares, hidratos de carbono, que son cromotropos, son algunos mucopolisacáridos ácidos (carboxilados, C; sulfatados, S; y fosfatados, F) y las nucleoproteínas (cromatina). Método: 1. azul de toluidina al 0,2 %, pH 4,6 (todos son +, C, S y F) y 3,4 (S y F) de tampón acetato; 2. metilación (alcohol metílico – ácido clorhídrico) y metacromasia (1) (todos son negativos -, C, S y F); y 3. metilación, saponificación (alcohol etílico - hidróxido de potasio) y metacromasia (1) (+ sólo C). Color rojo o púrpura, indica metacromasia positiva. Resultados: azul, alfa metacromasia (ortocromasia); violeta, beta metacromasia; rojo, gama metacromasia.

Célula con beta metacromasia Célula con gama metacromasia

ortocromasia

beta metacromasia

gama metacromasia

Metacromasia:

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Detección del glucógeno en hígado: dos son los métodos más usados para su revelación, reacción APS o ácido peryódico – reactivo de Schiff y método del carmín de Best. Como el último puede tener falta de sensibilidad, indicaremos un control con APS.

Veamos un ejemplo: glucógeno

Reacción de APS – enzima.Reacción de APS Reacción de APS con artefacto de técnica: reacción de fuga

400X1000X 500X

Las sustancias APS positivas (+) son: los polisacáridos simples (glucógeno, galactógeno), mucopolisacáridos neutros, mucoproteínas, glucoproteínas, glucolípidos,

fosfolípidos, lípidos insaturados, y pigmentos ceroides y lipofucsina. No colorea los mucopolisacáridos ácidos salvo que tengan un tratamiento previo particular.

Utilizar dos preparados con cortes homólogos. Tratar uno de ellos (control) con saliva filtrada o pancreatina (amilasa, sacarasa o ptialina) al 2%, entre 37 y 40 °C durante una hora. Luego proceder a la oxidación con peryódico y al revelado con el reactivo de Schiff en ambos preparados. El glucógeno debería desaparecer al ser tratado con la enzima, en el preparado control.

Realizar ajuste para tejidos de invertebrados.

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También se puede determinar los grupos electronegativos totales o acidofilia total mediante el método de Deitch. Y para determinar la basofilia, los métodos de: 1. tionina 0,5 %, pH 4,2 y 2. azul de toluidina 0,2 %, pH 4,2.

Las proteínas son de fácil fijación ya que todos los líquidos fijadores actúan sobre ellas destruyendo su estructura cuaternaria, haciéndolas precipitar.

Proteínas:

Los procedimientos histoquímicos sobre las proteínas se pueden diferenciar en: 1. los generales que determinan el carácter proteico; 2. los que determinan familias o grupos de aminoácidos presentes; y 3. los que se centran en saber un determinado grupo (aminoácido).El primer caso se puede determinan mediante la reacción de desaminación oxidativa con ninhidrina y luego una revelación de los grupos transformados mediante el reactivo de Schiff.

Parénquima de hirudíneo marcando la presencia de glándulas con proteínas ácidas.

400X

Intestino de rata

400X

Método de Deitch, con amarillo naftol S

Método de ninhidrina - SchiffComo la proteína constituye toda la parte

estructural de los tejidos, generalmente las coloraciones para detectar proteína, no dan buena información debida a lo intenso de la coloración.

Con la metodología clásica para las preparaciones histológicas la mayoría de las proteínas dan una

ligera eosinofilia.

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Otras técnicas específicas son: 1. método de Hartig – Zacharias (proteínas "siderófilas“, señalización); 2. método de Salazar (proteínas combinadas "tanófilas"); 3. método de Morel y Sisley, variante de Lillie (tirosina); 4. método de Chèvremont y Fréderic (grupos tioles, SH); 5. bloqueo de grupos tioles, por sublimado y por yodo, con posterior revelado (obtención de resultados negativos); 6. reducción de grupos tioéteres (S-S) a tioles con sulfuro de amónio y posterior revelado; 7. detección de grupos tioéteres por comparación entre revelado de grupos tioles (5) y revelado de grupos tioles y tioéteres (6), siempre con verificación por bloqueo; 8. método de Adams y Sloper con azul alcián o APFAA (grupos tioéteres, S-S); 9. método de Adams y Sloper, variante de Lillie o APAAA (grupos tioéteres, S-S); 10. APYAT (ácido peryódico – azul de toluidina); 11. APAAT (ácido peracético – azul de toluidina); 12. APFAT (ácido perfórmico – azul de toluidina) (las oxidaciones seguidas por metacromasia con azul de toluidina ponen de manifiesto sustancias con grupos tioles y tioéteres); 13. método de Pearse o APAS (grupos tioéteres, S-S); 14. método de Pearse, variante de Lillie o APFS (grupos tioéteres, S-S) y 15. método de Gomori o fucsina parahaldeído con oxidación (grupos tioéteres, S-S y grupos tioles, SH).

Proteínas:

Definiciones: Señalización: indica que existe la sustancia, pero no es específica y necesita de una comprobación adicional. No es histoquímica. Sensibilidad: la

posibilidad de que estando la sustancia a detectar, sea revelada por el método. Especificidad: un método histoquímico que señala bien una sustancia, sin errores.

Tabla completa de determinaciones.

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Estudio del ovotestis:

Espermatozoides foráneosEspermátidas Oocito “Maza

caótica”“Esfera amarilla” en atrio“Esfera

amarilla”Colas de espermatozoidesCorte fino, azul de toluidina Parafina, método de Hale

(mucopolisacáridos ácidos, azul claro)

Escalas: 40 micrones

Las esferas amarillas están compuesta de proteínas ácidas recicladas y

mucopolisacáridos ácidos, derivados de la “maza caótica” del fondo de los acinos del ovotestis y quedan retenidas en el atrio del

órgano. En ellos se ubican los espermatozoides foráneos y son mantenidos hasta que se liberen los oocitos desde los acinos. La fecundación se

produce en el atrio de la gonada. Epitelio germinal

Acino del ovotestis

OocitoTrofocitos

Espermatozoides Esfera amarilla

Atrio

Masa caótica

de Biomphalaria glabrata

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A. Preparación para cortes por congelación.1. La pieza luego se ser fijada se lava y se congela en agua destilada.2. Se monta en un crióstato y se realizan cortes de menos de 5 micrones.3. Se depositan los cortes en agua destilada. 4. Se montan en portaobjetos (puede ser en cubreobjetos chicos) muy bien limpios y sacar el exceso de agua.

Como los procedimientos para la inclusión en parafina no conservan los lípidos, se necesita una metodología especial, donde no exista el uso de

alcoholes.

El crióstato es un micrótomo de tipo Minot, debido a que ocupa menos lugar, montado en una cámara de congelación. Los comandos de regulación, la cuchilla y el mecanismo de avance, se encuentran dentro de la cámara, que está a unos 20 °C bajo cero, y el volante de inercia, que efectúa los cortes, permanece en el exterior.También, dentro de la cámara, existen placas de congelamiento rápido, para tratar a las piezas. Se colocan orientados en el portataco metálico y se congelan en la placa.

Lípidos: inclusiones 1

Sí no es necesario proteger a los lípidos, se recomienda el colodionado:5. Secar con cuidado con papel de filtro fino. 6. Cubrir con solución de celoidina (colodión) (0,05 a 0,1 %) en éter y alcohol absoluto. 7. Sacar el exceso de celoidina y se deja algunos segundos al aire sin dejar secar. Cuando la celoidina se ha fijado, sumergir en agua destilada por 1 a 2 minutos, para arrastrar el alcohol absoluto y el éter contenidos en los cortes y colorear.

Agua y CongelaciónTres técnicas:

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B. Se puede utilizar el método de Hamilton, para impregnar la pieza y hacerla más duras, se sigue especialmente cuando los órganos no resiste la temperatura.

Impregnación con Azúcar y Congelación

Si bien la obtención de cortes por congelación es un método rápido y bueno, cuando se necesita proteger el tejido de los lavados con alcoholes, y es también, un muy buen método para preparar cortes histológicos con coloraciones extemporáneas en los quirófanos; NO es una técnica utilizada cuando se trata de invertebrados, debido a que se “desarman” cuando se descongelan. Los órganos se pierden, “vuelan” por efecto de las corrientes de líquidos. Para solucionar este problema y proteger los lípidos, es necesario seguir otra técnica.

Solución A: disolver 142,5 g. de azúcar de caña pura en 150 ml de agua destilada. Disolver calentando, cuando frío filtrar a través de muselina y luego añadir formol hasta 3 %. Solución B: disolver 2,8 g. de goma arábiga en 150 ml de agua destilada. Suspender la goma arábiga dentro de un trozo de muselina en agua destilada. Cuando se disuelva filtrar por muselina. Añadir formol hasta 2 %. Mezclar ambas soluciones y usar. Puede ser que se tenga que diluir paraincluir más despaciosamente. Luego congelar. No forma taco, pero no cristaliza.

Lípidos: inclusiones 2

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C. Inclusión en Gelatina y cortes por congelación. Tejidos con lípidos.

Impregnación con Gelatina y Congelación

1. Gelatina al 25 %, humedecer durante 24 horas, disolver al calor y filtrar, agregar siempre un grano de timol a la parte filtrada y a filtrar; 2. Calentar a 37 °C, colocar el animal desde el agua de lavado y dejarlo por 24 horas; 3. Poner en molde de papel metalizado con una base algo gelificada, de unos 5 milímetros, orientar la pieza y terminar de gelificar en heladera; 4. Hacer el taco (como el de parafina) y retallar; 5. Fijar la gelatina y conservar en el líquido de Baker por 24 horas; 6. Lavar con agua destilada por 4 horas; 7. Preparación de portaobjetos: a. una parte de gelatina al 25 % y 9 de agua destilada llevar a 60 °C; y b. Sumergir el portaobjetos hasta que se caliente, escurrir, limpiar atrás y secar; 8. Cortar por congelación y dejar los cortes en agua destilada, de allí sacar los cortes y colocarlos en los portaobjetos preparados; 9. Fijar con vapores de formol; 10. Sumergir en el líquido de Baker hasta coloración. Luego de la coloración se monta en gelatina glicerinada o cemento de Apáthy(ver anexo Montado de la teórica de Invertebrados) y ocluir si necesario. Sacar fotos testigos lo más rápido posible; muchas coloraciones pierden sus límites con el tiempo y se opacan.

Lípidos: inclusiones 3

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La aplicación de técnicas químicas y bioquímicas sobre los cortes histológicos de invertebrados, siguen los lineamientos generales para los vertebrados. A continuación se dará una guía, presuntamente completa, de las sustancias que más usualmente, son requeridas en los estudios sobre lípidos.

Para los procedimientos de histoquímica de lípidos, fijar con Baker o Ciaccio (bicromato de potasio al 10 %, 50 ml; ácido fórmico al 1 %, 50 ml; formol, 20 ml; agua destilada, 5 ml). Se deben seguir los procedimientos predichos sobre cortes por congelación, con o sin inclusión en gelatina. También se puede incluir en parafina si luego de la fijación se procede a la poscromización(insolubilización de lípidos) con bicromato cálcico de Baker (bicromato de potasio, 5 g; cloruro de calcio anhidro, 1 g; agua, 100 ml), de 7 a 15 días.

Referencias: cc = célula columnar, cl = célula ciliada, hc = hemocele,

lu = lumen.

Escala: 50 μm.

Negro Sudan B, poscromización con bicromato cálcico de Baker durante 10 días.

Positivo en bases de células columnares.

Pared izquierda, postootecal del oviducto de Biomphalaria glabrata

Los lípidos se pueden encontrar solos o combinados con proteínas y/o glúcidos, los combinados se pueden desenmascarar por: 1. fenol al 1 %; 2. lavado abundante en agua; 3. ácido acético al 25 % y 4. ácido oxálico al 10 %. Todos los métodos son revelados con negro Sudan B. Conviene hacer controles.Los sudanes son colorantes que se diluyen en lípidos.

Lípidos: coloraciones y controles

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cg

cc

15Las técnicas a utilizar son: 1. negro Sudan B a temperatura ambiente (lípidos líquidos); 2. negro Sudan B a 60 °C (lípidos sólidos); 3. método de Feyrter o metacromasia por montaje con tionina – ácido tartárico (lípidos ácidos, sulfátidos y fosfolípidos); 4. método de Lison, por autoxidación (lípidos no saturados); 5. método de Pearse o APAS (lípidos no saturados); 6. método de Pearse, variante de Lillie o APFS (lípidos no saturados, fosfolípidos y cerebrósidos); 7. método de Hayes (lípidos con grupos acetálicos) y 8. método de Lorrain - Smith, variante de Cain (lípidos neutros y con grupos electronegativos).

Los controles se deben hacer por eliminación de lípidos con una mezcla de partes iguales de cloroformo y metanol,

durante 12 horas a 40 °C. Se trata un par de preparados homólogos, uno se deslipidiza, y

ambos se tratan con negro Sudan B.

A: Lipoproteínas por desenmascaramiento; B: Método de Feyrter, metacromasia.

Oviducto preootecal:

Referencias: cc = célula columnar, cg = célula globosa, hc = hemocele, lu = lumen.

A

B

.Escalas 50 μm.

de Biomphalaria glabrata

Tabla de determinaciones.

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Los métodos utilizados son: 1. método de Lendrum con Dahlia; 2. método de Bancroft con violeta de metilo; 3. método de Bennhold con rojo Congo, modificaciones de Highman y de Puchtler, y 4. método con rojo Congo y birrefringencia. Por comparación se pueden utilizar controles con tejido afectado con amiloidosis (piel o córnea humana).

Método de Bennhold con rojo Congo, modificación de Puchtler y birrefringencia

AmiloidePuesta de huevos de Biomphalaria glabrata

Pared de la cápsula

Cáscara del huevo ViteloSustancia gelatinosa

400X

Siempre es un depósito extracelular y tiene significado biológico como aislante y por su alta higroscopía favorece al balance hídrico,

intercambio de solutos y mantiene la temperatura constante.

Detección de pigmentos: De los pigmentos naturales no respiratorios (no hematogénicos), que encontramos en los tejidos animales veremos los de origen lipídicos: cromolipoides (ceroides y lipofucsinas) y los no lipídicos: las melaninas. Los ceroides no representan nada más que una fase precoz de la constitución de los lípidos lipofucsínicos, caracterizados por una oxidación poco pronunciada.Las lipofucsinas pertenecen a un grupo heterogéneo de sustancias pigmentadas y representan productos de oxidación de precursores lipídicos o lipoproteínas, pero sucarácter histoquímico presenta variaciones en función del origen, del lugar y del modo de formación del pigmento, así como también su grado de oxidación.Todos los lípidos en su primer estadio de oxidación reaccionan como los pigmentos ceroides. La oxidación final de los ceroides produce las lipofucsinas.

Histoquímica Especial: Amiloide Tabla de determinaciones.

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Cromolipoides:

En blanco, en cortes por congelación (ocre),En blanco, en cortes a la parafina (ocre),Decoloración por peróxido (ocre),Decoloración por ácido crómico (ocre),Decoloración por ácido peryodico (ocre),Prueba para fluorescencia (de naranja a pardo dorado),Método para lípidos (temperatura ambiente) (negro),Método para lípidos (a 60 °C) (negro),Método para lípidos (desenmascarado) (negro),Basofilia: tionina al 0,5 %, pH 4,2 (azul o celeste),Basofilia: azul de toluidina al 0,2 %, pH 4,2 (azul),Reacción argentafín clásica de Masson con el líquido de Fontana (negro),Método de Schmorl (reducción del ferricianuro) (azul o celeste),Método de Perls (azul de Prusia) (ocre, -; algo celeste, -+; azul, +),Método de Lillie (hierro ferroso) (ocre),Método de Lillie azul de Nilo A (hidratado) (azul),Método de Lillie azul de Nilo A (deshidratado) (azul),Método de Hueck con azul de Nilo sulfatado (azul o celeste),Método de Gomori (hematoxilina al cromoalumbre) (azul),Reactivo de Schiff (fucsia a rosado),Método de Hayes o reacción plasmal con sublimado - reactivo de Schiff (acetalfosfátidos o plasmalógenos) (púrpura o violáceo),Método de Lison, autoxidación con oxígeno atmosférico – reactivo de Schiff (lípidos no saturados) (púrpura), yAPS (peryódico), APAS (peracético), APFS (perfórmico) (púrpuras).

Serie de métodos para la constatación de los pigmentos cromolipoides.Se basan en su naturaleza lipídica

combinada con proteínas y su resistencia a la oxidación .

Son de color ocre a pardo escuro, son pigmentos

intracelular, y derivan de la oxidación de lípidos y

lipoproteínas.

Tabla completa de determinaciones.

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Cromolipoides:Los métodos a utilizar serán: 1. tionina 0,5 %, pH 4,2, 2. azul de toluidina 0,2 %, pH 4,2 3. Método de Schmorl4. Método de Lorrain – Smith5. Método de Ziehl – Neelsen.

Se debe comprobar además, su naturaleza ácida:1. Método de Ziehl – Neelsen con fucsina básica -alcohol ácido (acidorresistencia) (violeta);2. Método de Lorrain – Smith, variante de Caincon azul de Nilo concentrado y diluido (lípidos ácidos) (azul o violáceo); y3. Método de Feyrter o coloración por montaje (lípidos ácidos) (verdoso o violeta). Además como existe la posibilidad de que sean carotenoides hay que descartarlos por:Líquido de Lugol (ocre, negativo), Solución de ácido sulfúrico (ocre, negativo)

Lipofucsina:

Referencias: cb = cuerpo basófilo (cromolipoides), ea

= esferas amarillas, hc = hemocele, ls = lumen del

acino, mt = matriz. "Masa caótica" de Biomphalaria glabrata.

Basofilia con azul de toluidina.

Escala: 50 μm.

H – E

Hígado

(40X)

Método de Schmorl

Método de Lorrain – Smith

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Las diferencias entre el pigmento ceroide y las lipofucsinas serían: 1. La basofilia aumenta con el grado de oxidación (pigmento ceroide → (oxigeno) →lipofucsina), como indican los métodos de la tionina y el azul de toluidina.2. Los métodos de Lison, APAS y APFS, revelan un mayor resultado positivo para las lipofucsinas que para los ceroides. Esto se puede deber a una acentuada concentración de lípidos insaturados (fosfolípidos), cuando se presentan. Además, en los ceroides existirá una acentuada reacción positiva del APS, que demuestra el estado intermedio de oxidación de lípidos insaturados, cuando estos se presentan.3. Los ceroides sometidos a la luz fluorescente toman un color pardo dorado y las lipofucsinas, un color naranja.4. Las lipofucsinas dan positivo con el método de Lillie con azul Nilo A, sólo en las preparaciones hidratadas, y el método de Gomori.Los pigmentos ceroides, se detectan por su leve reacción positiva mediante el método de Feyrter para los lípidos ácidos; positiva la reacción plasmal (método de Hayes); y ser negativos con el método de Ziehl – Neelsen.Los ceroides se señalan, como sustancias derivadas de la oxidación de lípidos no saturados y con una alta ácidorresistencia, que derivarían hacia lipofucsinas.

Método de Ziehl – Neelsen. Nada violeta (-)

Método de Hayes.Púrpura (+)

Referencias: cb = cuerpo basófilo, hc = hemocele,

ls = lumen del acino, mt = matriz.

"Masa caótica" de Biomphalaria glabrata.

Escala: 50 μm.

Ceroides y precursores

Pigmento ceroide y lipofucsinas:

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Existe un nuevo método que comienza a ser utilizado denominado Método AFIP, del Instituto de Patología de las Fuerzas Armadas de los Estados Unidos, para determinar

específicamente a la lipofucsina. Procedimiento: Fijar en formol 10 %, incluir en parafina y cortar en 6 micrómetros. Desparafinar e hidratar. Colocar en la Solución de carbolfucsina de Kinyoun (fucsina básica, 4 g; fenol cristalizado (ácido carbólico), 8 g; alcohol etílico 95 %, 20 ml; agua destilada, 100 ml), durante una hora. Enjuagar con agua destilada varias veces. Diferenciar con una solución de alcohol 70 % al 1 % de ácido clorhídrico, sumergiendo los preparados de 5 a 6 veces, o hasta que las secciones se tornen de color rosa pálido. Lavar con agua corriente durante 5 minutos y luego enjuagar con agua destilada. Contrastar con una solución de ácido pícrico al 2 %, durante 1 minuto aproximadamente. Deshidratar y aclarar con alcohol etílico al 95 %, alcohol etílico absoluto y xilol, 2 veces y por 2 minutos con cada uno. Resultados: lipofucsina, roja y fondo, amarillo. Los pigmentos muestran un color parduzco fluorescente bajo luz ultravioleta.

Las fotos son de la publicación de I. Hernández Melendi, E. Boix Valdez, A. Govin Chávez, S. Suárez

Argüelles. Hospital Pediátrico Docente, Juan Manuel

Márquez, CUBA

Determinación de lipofucsina:

Baso Hígado (40X)

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Las técnicas a utilizar son: 1. decoloración por permanganato de potasio al 0,1 % y al 0,25 %; 2. decoloración por ácido peryódico; 3. decoloración por ácido peracético; 4. decoloración por ácido crómico;5. decoloración por ácido nítrico; 6. decoloración por peróxido de hidrógeno; 7. decoloración por el método de Gomori (mezcla permangánica – sulfúrica); 8. decoloración por el método de Mayer (cloro naciente); 9. basofilia con tionina al 0,5 %, pH 4,2; 10. reacción de Masson o argentafín clásica, con el líquido de Fontana; 11. reacción de Schmorl (reducción del ferricianuro); 12. método de Perls (azul de Prusia); 13. método de Lillie, con el hierro ferroso; 14. método de Hueck con azul de Nilo sulfatado; 15. método de Lillie, con el azul de Nilo; 16. APS; 17. APAS y 18. APFS.

Estrategias para el estudio de la melanina: 1. Reducción por reacción de Schmorl; 2. Reacción de Masson o argentafín clásica, con el líquido de Fontana; 3. Captura del ión ferroso, método de Lillie; y 4. Las técnicas de decoloración.

Melanina: La melanina es un pigmento intracelular granuloso, de color amarillo, pardo o negro,

que proviene de la acción de la tirosinasa sobre la tirosina y sus derivados.

Reacción de Schmorl

Método de Lillie, con el hierro

ferroso

Células de pigmento ocre por fuera de los acino de

Biomphalaria glabrata

Hipodermis con melanosomas.

Escala: 10 μm.

Tabla completa de determinaciones.

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Calcio iónico como carbonatos, oxalatos y fosfatos. El calcio iónico, común en invertebrados, es señalizado por la formación de lacas, quelación y

sustitución. Las lacas están basados en colorantes específicos (azul alcian, purpurina, azul Luxor sólido, alizarina S), o mediante la utilización de metales pesados (cromo, mercurio, cobalto, plata).

Ejemplificaremos, con el método de plata de Von Kossa (según Gomori).Fijación: alcohol absoluto 60 mL, cloroformo 40 mL o alcohol formolado (partes iguales de alcohol absoluto y formol comercial neutralizado; puede bajarse la concentración de formol hasta 10 %. Metodología con doble control:1. 4 (A, B, C y D) preparados de cortes histológicos hidratados.2. Tratar dos preparados (A y B) con alcohol ácido (alcohol absoluto con ácido clorhídrico al 0,5 %).3. En todos los preparados sustituir el calcio con solución de nitrato de plata al 2 %, durante una hora. A y C en oscuridad, y B y D bajo la luz.4. Enjuagar con agua destilada, tres veces, 3 minutos.5. A y C reducir con solución acuosa de pirogalol al 1 %, durante 2 o 3 minutos.6. Enjuagar A y C con agua destilada, tres veces, 3 minutos.7. En todos los preparados fijar con hiposulfito de sodio al 5 % por medio minuto.8. En todos coloración de contraste, deshidratar y montar.

Malacoplaquia en ilion humano y en riñón de oveja.

Reacción de encapsulamiento

de huevos de helmintos en

tejido de vertebrados.

Sólo con coloración nuclear de fondo.

Von Kossa, H – E (malo)

La diferencia entre con luz y sin luz

sólo es para comparar

reducciones.

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Cobre:Como ejemplo de la señalización de metales pesados, propondremos la relacionada con el cobre, ya que es un metal contaminante que suele ser utilizado en estudios sobre contaminación y debe ser señalizado, mediante cortes histológicos indicando el lugar de depósito, transitorio o permanente.

Si bien tiene importancia histórica el revelado mediante la coloración de ácido rubeánico o ditioxamida, indicaremos el método con rodanina (DMAB rodanina).

Fijación: formaldehído al 4 % neutralizado es el mejor, eventualmente otro que no agregue cobre.

Metodología:1. Cortes histológicos hidratados.2. Tratar con la solución de trabajo de rodanina, durante 3 horas a 60 °C. Revisar cada 30 minutos.3. Enjuagar con agua destilada, tres veces, 3 minutos.4. Coloración nuclear de fondo a la hematoxilina (cualquiera).5. Azulado de la coloración nuclear en agua corriente, nunca soluciones amoniacales.6. Deshidratar, aclarar y montar.

Soluciones: Madre: 1 diluir 0,2 mg de 5 – (p-dimetilaminobenzilida) rodanina en 100 mL de alcohol absoluto hasta color sangre, es una solución saturada, pueden quedar cristales en el fondo.Trabajo: 1,5 ml de madre en 50 mL de agua destilada.

Acumulación patológica

de cobre en hígado de humanos

Helix pomatia(Gastropoda), caracol de jardín, contaminado. Tejido conectivo de la glándula digestiva.

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24Neurosecreción es el fenómeno que presenta el tejido nervioso de secretar sustancias químicas, consideradas como neurohormonas. En los invertebrados estas sustancias son evidentes en el mismo tejido nervioso, en los órganos neurohemales y en las sinapsis, como mediador químico entre neuronas. Los sistemas nerviosos que evidencian actividad neurosecretora, indican aumento del metabolismo, y asociado con momentos de la vida del animal como la reproducción, la muda, la metamorfosis, etc.

Para esto se propone dividir el estudio en cuatro pasos:Primer paso: comprobación del tejido nervioso.Segundo paso: comprobación de la extensión del sistema nervioso.Tercer paso: constatación de la inervación en cortes histológicos.Cuarto paso: estudio de la neurosecreción.

Las neuronas se determinan por la presencia de los cuerpos de Nissl, que no son más que unidades del retículo endoplasmático granulardiseminado en el citoplasma del cuerpo neuronal. Cualquier colorante básico puede ser usado para su detección como la tionina; pero la más sencilla es la coloración ortocromática del azul de toluidina, o coloración de Nissl, seguida de la deshidratación mediante alcohol etílico de los cortes histológicos.

azul de toluidina, pH 4,5

15 micrómetros

Detección de la neurosecreción:

Primer paso: comprobación del tejido nervioso.

Para asociar esta secreción con el sistema nervioso, necesitamos vincular mediante estudios histológicos estos dos fenómenos, constatando que la supuestaneurosecreción emana del sistema nervioso.

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Segundo paso: comprobación de la extensión del sistema nervioso. Son coloraciones en masa, en bloque o “in toto”, donde se puede apreciar la conformación del sistema nervioso y la inervación de las neuronas, mediante la visualización de las neurofibrillas que presenta. Los cuerpos de Nissl no están en toda la neurona, sólo en el cuerpo neuronal. Son técnicas que no siempre dan buenos resultados, pero que son altamente necesarias para saber si estamos en presencia de un órgano neurohemal; o como esta inervado un órgano en particular, especialmente si posee componentes musculares y hay que saber de su dinámica; etc.

Detección de la neurosecreción:

Dos métodos son utilizados: 1. Resulta de una modificación de la técnica original de Ehrlich: la pieza de tejido vivo, debe ser lo más chica posible; puede ser un trozo de la pared del cuerpo, una porción de órgano hueco, una glándula en su totalidad, órganos reproductores, sistema nervioso aislado, ganglios, etc. La pieza es colocada en una solución al 1 % de azul de metileno en solución de cloruro de sodio isotónica (solución fisiológica isoosmótica, entre 6 y 8 de salinidad por litro), durante una hora y exponer al aire para su oxidación completa (hasta un día). El color se fija con una solución al 10 % de molibdato de amonio, durante 10 minutos. Se lava bien, se deshidrata y se lo monta.

Ganglio nervioso de Hirudo medicinales

(1891). Azul de metileno

El método del azul de metileno (variante de la técnica original de Ehrlich fue utilizado por Ramón y Cajal para demostrar la existencia de las

espinas dendríticas, con un método de tinción diferente al

método de Golgi, con plata. Células de

Purkinje del cerebelo (método de Ehrlich).

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Detección de la neurosecreción: Segundo paso: comprobación de la extensión del sistema nervioso. (continuación)

A. Redes intersticiales situadas en el sarcoplasma de las fibras musculares de las alas de los insectos.B. Redes horizontales dobles en los músculos de las patas.

2. Modificación del método de Ramón y Cajal o impregnación argéntica en bloque: fijar la pieza en 50 ml de alcohol 96 % con el agregado de 4 gotas de amoníaco (hidróxido de amonio al 28 %, solución saturada), durante 24 o 48 horas según el tamaño de la pieza. Lavar rápidamente e impregnar en una solución de nitrato de plata al 1 % a 40 °C, durante una semana. Reducir con ácido pirogálico (hidroquinona) al 1 %, con 10 % de formol, durante 24 horas, la última hora subir la temperatura a 40 °C; lavar y virar al oro con una solución de cloruro de oro al 0,2 %, durante 5 minutos y fijar el color con hiposulfito de sodio al 5 %, durante 2 minutos. Se necesita ajustar al material utilizado.

Células sensitivas de la lombriz de tierra con el cuerpo celular que reside en el epidermis

Epidermis Ganglio

A B

Técnica de Ramón y

Cajal

100X

Cerebelo

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Tercer paso: constatación de la inervación en cortes histológicos.Detección de la neurosecreción:

1. Método de Klüver-Barrera: (mielina y células nerviosas)Se puede aplicar sobre cortes desparafinados hasta de 20 micrómetros, fijados en formaldehído.

Resultados: La mielina y todo los fosfolípidos quedan desde azul claro hasta verde y las células, de rosa a violeta.

Procedimiento en la Guía de Trabajos Prácticos.

2. Impregnación Argéntica de Tolivia:

Resultados: La plata (negro) precipita en los axones, dendritas

y en la cromatina.

Procedimiento en la Guía de Trabajos Prácticos.

Zona limítrofe

entre sustancia

gris y blanca de medula

espinal

400X

400X

Sustancia gris de medula espinal

500X

Cerebro, Neocórtex (sustancia gris) con

sus 6 capas.

Sustancia blanca

Meninges

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Cuarto paso: estudio de la neurosecreción.Habiendo determinado la naturaleza nerviosa del tejido, se procede a una postfijación; una oxidación permangánica; una determinación de la naturaleza basofílica o acidofílica; y entonces se puede utilizar una coloración general para visualizarla.La postfijación se realiza con el líquido de Bouin cromado (100 ml de Bouin con el agregado de 4 g de alumbre de cromo), durante 24 horas a 40 °C. Oxidar con el oxidante de Gomori (15 ml de permanganato de potasio al 2,5 %; 15 ml de ácido sulfúrico al 5 %; 90 ml de agua destilada), tratado durante 30 a 60 segundos. Decolorar con bisulfito de sodio al 5 %. Continuar con una determinación de basofilia.

Detección de la neurosecreción:

Las coloraciones más utilizadas (luego de postfijar y oxidar) son:

Tricrómico de Mallory (Azan de Heindenhain):Procedimiento en la Guía de Trabajos Prácticos.

1. producto de secreción es acidófilo

2. producto de secreción es basófiloFucsina paraldehído (solución comercial): 1. Cortes perfectamente hidratados luego de haber sido refijados y oxidados.2. Colorear durante 5 minutos por la solución de uso acidificada de fucsina paraldehído.3. Lavar con agua destilada.4. Aclarar el fondo con alcohol absoluto con 0,5 % de ácido clorhídrico, 3 minutos.5. Lavar por unos segundo con agua destilada o alcohol 70 %.6. Coloración de contraste (eosina acuosa o alcohólica).7. deshidratar, aclarar y montar.

Resultados: secreción, roja o azul.

Dos tipos de células

fucsinófilas del ganglio óptico del tentáculo,

botón terminal.

Centro del neuropilo del nervio óptico con secreción

fucsinófila, indicando

neurosecreción.

Caracol: Helix aspersa

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Epitelio del carrefour de Biomphalaria peregrina. Escala: 50 μm.

Tri - APS.

Referencias: al = albumen; el = epitelio; flecha: paraneuronas

Neuropilo del cordón nervioso ventral de Trulliobdella capitis.

Tricrómico de Masson modificado

600X

Ejemplos de Neurosecreción:Casos de neurosecreción encontrados:

400XÓrgano sensorial epitelial de

Trulliobdella capitis un hirudíneo marino.Tricrómico de Masson modificado

Basofilia

Basofilia

Estas paraneuronas muy posiblemente estén relacionada con la descarga de

albumen al carrefour, en el momento en que un oocito ya fecundado pasa por él.

Cuidado: primero descartar la presencia de lipofucsinas.

Se debe hacer notar que esta neurosecreción puede estar relacionada a un ciclo secretor y que por lo tanto, no es constante en el tiempo.

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Índice:

Temas: Pantallas:

Introducción a la histoquímica. 02

Detección de Hidratos de carbono. 04

Detección de Proteínas. 08

Detección de Lípidos. 11

Histoquímica Especial: Amiloide. 16

Histoquímica Especial: Pigmentos. 16

Histoquímica Especial: Calcio. 22

Histoquímica Especial: Cobre. 23

Estudio de la Neurosecreción. 24

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Si no es capaz de desarrollar algo semejante, cite la fuente.

Λ = Զ = ZMATERIAL DE DOCENCIA PARA CONSULTA

No utilice este material didáctico fuera de contexto..

François Vincent Raspail(1794 - 1878)

Padre de la Histoquímica"Omnis cellula e cellula"