Cinetica enzimatica 2 2011

Universidad de Oriente

Núcleo Bolívar

Escuela de Ciencias de la Salud “Francisco Batisttini”

Dpto. de Ciencias Fisiológicas: Bioquímica

Profesora Zulay Castillo Pérez

Proteínas con actividad catalítica de los seres vivos.

Unidades del Metabolismo

Regulan la velocidad de las reacciones químicas espontáneas(ΔG-).

No promueven reacciones no-espontáneas (Δ G +).

Incrementan la velocidad de reacción 103 a 1012 veces sinafectar el sentido de la reacción.

No forman parte del producto de la reacción.

Enzimas

Catalizador de origen biológico y naturaleza proteica, de

alto peso molecular y conformación tridimensional

característica, acelera la reacción al disminuir la energía

de activación.

Contiene un centro activo, generalmente situado en un entorno

apolar. La actividad catalítica requiere que dicho centro adopte

una conformación determinada, mantenida por el resto de la

molécula proteica.

Enzimas

Estructura

No hacen factibles las reacciones imposibles

Son sustancias que, sin consumirse en unareacción, aumentan notablemente su velocidad.

Ello hace posible que en condiciones fisiológicas tenganlugar reacciones que sin catalizador requeriríancondiciones extremas de presión, temperatura o pH.

Prácticamente todas las reacciones químicas que tienenlugar en los seres vivos están catalizadas por enzimas.

* En su mayoría son proteínas, hay ARN con capacidad catalítica (ribozimas)

Aumentan la velocidad de reacción ◊ De 106 a 1012 veces vs sin enzima.◊ Aún más rápido que los catalizadores químicos.

Condiciones de reacción◊ Temperatura 25-40 o C (algunas hasta 75 o C)◊ pH neutro (5-9), la mayoría 6.5 – 7.5◊ Presión atmosférica normal

Capacidad de regulación◊ Por concentración de sustrato◊ Por concentración de enzima◊ Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato)◊ Por inhibidores no competitivos (modificación covalente de la

enzima)◊ Por regulación alostérica

Alta especificidad de reacción◊ Interacción estereoespecífica con el sustrato◊ No hay productos colaterales.

Propiedades generales

Las enzimas simples están constituidas por

proteína sin requerir de la unión de otra molécula o

grupo químico para realizar su actividad catalítica.

Las enzimas conjugadas poseen en su estructura

una parte no protéica esencial para su

funcionamiento que según su naturaleza puede

llamarse cofactor o coenzima.

Enzimas simples y conjugadas

Apoenzima: fracción protéica

Cofactor: grupo que se une a la fracción protéica parapermitir el correcto funcionamiento de la enzima.

Holoenzima: fracción protéica + cofactor o coenzima

Átomo, ion o molécula que participa en el proceso catalítico sin

ser enzima ni sustrato.

Los cofactores participan de dos maneras distintas:

A través de una fijación muy fuerte a la proteína y salen sin sermodificados del ciclo catalítico.

Como un segundo substrato; salen modificados del sitiocatalítico y por lo general requieren otra enzima para volver alestado original.

Cofactores

En función de su naturaleza los cofactores se denominan:

Grupos prostéticos: se trata de iones o moléculas

inorgánicas.

Coenzima: es una molécula orgánica. Aquí se puede

señalar, que muchas vitaminas funcionan como coenzimas;

y realmente las deficiencias producidas por la falta de

vitaminas responde más bien a que no se origina la

coenzima, para una determinada enzima.

Cofactores

Tiamina B1 Tiamina pirofosfato

RiboflavinaFAD (Flavín adenín dinucleótido), FMN (Flavín

mononucleótido)

Piridoxina PLP (Piridoxal fosfato)

Cobalamina Metilcobalamina, cobamida

Ácido pantoténico Coenzima A (CoA)

NicotinamidaNAD+ (Nicotín adenín dinucleótido) Y NADP+

(Nicotín adenín dinucleótido fosfato)

Ácido lipoico Lipoamida

Ácido fólico THF (Tetrahidrofolato)

Coenzimas de naturaleza

vitamínica

Hemo Hemoenzimas , citocromos

Complejos Fe-S Ferredoxinas

Quinonas Transporte electrónico mitocondrial yfotosintético

Glutatión Redox, transporte de aminoácidos

ATP Transferencia de fosfato y/o energía

UTP Transferencia de grupos glucosídicos

Carnitina Transportador de grupos acilo

Coenzimas de naturaleza no

vitamínica

Región de la enzima donde se une la molécula de sustrato

de forma específica, suele ser un bolsillo o una hendidura

que se forma entre las cadenas laterales de los aminoácidos.

Estas cadenas:

• Facilitan la unión del sustrato (especificidad de sustrato)

• Intervienen en la catálisis (centro catalítico)

Sitio Activo

1. Supone una porción relativamentepequeña del volumen total de laenzima

2. Es una entidad tridimensional

3. Se unen a los sustratos por fuerzasrelativamente débiles

4. Son hoyos o hendiduras de las quesuele quedar excluida el agua, salvoque sea un componente de lareacción

5. La especificidad del enlace dependede la disposición de los átomosdel centro activo

Sitio Activo. Características

Lugar de la enzima en el que ocurre la catálisis y

puede incluir también:

• Coenzimas

• Cofactores

Puede coincidir o no con el centro activo

Sitio Catalítico

PUENTES DE H

INTERACCIONES IÓNICAS

ENLACES COVALENTES

Mecanismo de unión del sustrato

al sitio activo

En 1894, Emil Fischer propuso la hipótesis de la llave-cerradura

Modelos de interacción del

sustrato y el sitio activo

Sitio activo

En 1958, Koshland propuso el modelo del ajuste inducido

Modelos de interacción del

sustrato y el sitio activo

Conformación del estado de transición

Sitio activo

Estereoespecificidad

Centros activos asimétricos: sólo L-aminoácidos

Capacidad de distinguir entre estereoisómeros

Especificidad geométrica

Grupos químicos que interactúan con el sitio activo

Más limitante que la estereoespecificidad

Enzimás digestivas: más “preferencia” que “especificidad”

Especificidad de la unión

enzima-sustrato

Antiguamente, los enzimas recibían nombres

particulares, asignados por su descubridor.

Ejemplo:

amilasa (hidroliza el almidón)

Glc + ATP Glc-6P + ADP

Al ir aumentando el número de enzimas conocidos, se hizo

necesaria una nomenclatura sistemática que informara

sobre la acción específica de cada enzima y los sustratos

sobre los que actuaba.

Nomenclatura enzimática.

Nombres particulares

Consta actualmente de 3 partes:

el sustrato preferente

el tipo de reacción realizado

terminación "asa"

ejemplo: la glucoquinasa

ATP-glucosa-fosfo-transferasa



Nombres sistemáticos

El nombre es identificado por un código numérico:

Encabezado por las letras EC (enzymecommission), seguidas de cuatro números separados porpuntos:

el primer número indica a cual de las seis clasespertenece la enzima,

el segundo se refiere a distintas subclases dentro decada grupo,

el tercero y el cuarto se refieren a los grupos químicosespecíficos que intervienen en la reacción.


Comisión de enzimas

Ej.: ATP:glucosa fosfotransferasa (glucoquinasa)


EC 2.7.1.2.

2: transferasa

7: fosfotransferasa

1: el aceptor es un grupo OH

2: es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo

fosfato.



Clases

1. Óxido-reductasas

2. Transferasas

3. Hidrolasas

4. Liasas

5. Isomerasas

6. Ligasas



Catalizan reacciones de transferencia de hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro

AH2 + B ⇄ A + BH2

Ared + Box ⇄ Aox + Bred

Clase 1-Oxidorreductasas

Catalizan la transferencia de un grupo químico (distinto del hidrógeno) de un sustrato a otro

A-B + C ⇄ A + C-B

Clase 2-Transferasas

Catalizan las reacciones de hidrólisis

A-B + H2O ⇄ AH + B-OH

Clase 3-Hidrolasas

Catalizan reacciones de ruptura o unión de sustratos

A-B ⇄ A + B

Clase 4-Liasas

Catalizan la interconversión de isómeros

AB ⇄ BA

Clase 5-Isomerasas

Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis

simultánea de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.)

A + B + XTP ⇄ A-B + XDP + Pi

Clase 6-Ligasas

Perfil energético de una

reacción espontánea

Perfil energético de una

reacción catalizada

Mecanismo de acción enzimática

La acción de los catalizadores consiste en disminuir la Energía de activación.

Las enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya que disminuyen la energía de activación, aún más que los

catalizadores inorgánicos.

Por ejemplo, la descomposición del agua oxigenada (H2O2)

puede ocurrir:

sin catalizador Ea= 18 Kcal/mol

con un catalizador inorgánico (platino) Ea= 12 Kcal/mol

con una enzima específico (catalasa) Ea= 6 Kcal/mol

Así, se puede calcular que el platino acelera la reacción

20.000 veces, mientras que la catalasa la acelera 370.000

veces.


Para que una reacción química tenga lugar, las moléculas de los reactantes

deben chocar con una energía y una orientación adecuadas.

La enzima :

aumenta la concentración efectiva de los sustratos (aumenta la

probabilidad de choque)

permite que los reactantes (sustratos) se unan a su centro activo con

una orientación óptima para que la reacción se produzca y

modifica las propiedades químicas del sustrato unido a su centro

activo, debilitando los enlaces existentes y facilitando la formación

de otros nuevos


Estudio cuantitativo de la catálisis enzimática queproporciona información sobre las velocidades dereacción, afinidad de las enzimas por su sustrato,mecanismos de reacción y los inhibidores

Aplicación:

- Mejor comprensión de las rutas metabólicas

- Diseño de tratamientos más adecuados

Velocidad de una reacción bioquímica: Cambio de laconcentración de un reactante o un producto por unidadde tiempo

Cinética enzimática

1. Concentración de sustrato

2. Concentración de enzima

3. pH

4. Temperatura

5. Efectores (Activadores e Inhibidores)

Variables que influyen en la velocidad de una

reacción enzimática

La velocidad inicial Vo de la reacción A → P , donde A= Sustrato y P=Producto, es:

Es proporcional a la frecuencia con que las moléculas reactantesforman el producto, la velocidad de reacción es

- Δ[A] Δ[P]Vo=

ΔtΔt=

Donde

[A]= concentración de sustrato

[P]= concentración del producto

T= tiempo

Vo= K [A]x Donde

Vo= velocidad

K= constante de velocidad (temp, pH, fuerza iónica)

X= orden de reacción

Reacción de Primer Orden:La velocidad es

proporcional a laconcentración de sustrato

Reacción de Orden Cero:

Independientementede la concentración desustrato, la velocidad esconstante

Orden de Reacción: Suma de los componentes de lostérminos de concentración en la expresión develocidad

Orden de una reacción enzimática

Modelo propuesto por Leonor Michaelis y MaudMenten en 1913

Hipótesis del Estado Estacionario: establece que [ES]se mantiene casi constante durante gran parte de lareacción

E + S ES E + Pk1

K-1

k2

Donde:

K1= constante de velocidad dela formación de ES

K-1= constante de velocidadde la disociación de ES

K2= constante de velocidad dela formación y liberación delproducto del lugar catalítico

K1 [E][S]=K-1 [ES] + K2 [ES]

Cinética Michaelis-Menten

Inducen una nueva constante: Km (Constante de Michaelis)

Ecuación de Michaelis-Menten:

vV s

K sm

max

Donde

Vmax= velocidad máxima

Km= constante de Michaelis

[S]= concentración del sustrato

Km=K-1 + K2

K1

Cinética Michaelis-Menten

Representa la Ecuación de Michaelis-Menten

Km (Constante de Michaelis): mide laconcentración del sustrato a la que laenzima tiene la mitad de la velocidadmáxima (Vmáx/2)

Vmáx: Se alcanza cuando todos los centroscatalíticos de la enzima se encuentranocupados por sustrato

Efecto de la [S]

Km y Vmax se determina midiendo las velocidades iniciales de reacción a varias [S]

No todas las enzimas cumplen las condiciones

(Enzimas alostéricas)

Difícilmente aplicable a reacciones con dossustratos

No se puede determinar con exactitud Vmaxni Km (Hipérbola rectangular, nunca llega aVmax)

Cinética Michaelis-Menten.

Limitantes

Unidades Internacionales (UI): Cantidad deenzima necesaria para producir 1 μmol deproducto/minuto

Nueva Unidad: Katal

Cantidad de enzima que transforma 1 mol desustrato/segundo (6 x 107 UI)

Grado de Pureza: Actividad Específica. Númerode UI en 1 mg de proteína

Unidades de actividad

enzimática

Consiste en representar la recíproca de la ecuación de Michaelis-Menten

Resultado: línea recta

Pendiente: Km/Vmax

Corte en ordenada: 1/Vmax

Corte en Abscisa (extrapolado): -1/Km

1

v0

KM

Vmax

1

S

1

Vmax

Donde:

y = 1/Vo

x = 1/[S]

m = Km/Vmáx

b = 1/Vmáx

Ecuación de Lineweaver-Burk

Representación de

Lineweaver-Burk

Inhibidores: moléculas que reducen la actividad deuna enzima (fármacos, antibióticos, conservantesalimentarios, venenos)

- Importante para regular las rutas metabólicas

- Tratamiento clínico

Tipos de Inhibición Enzimatica:

Isostérica: Reversible (competitiva, acompetitiva y nocompetitiva) e Irreversible

Alostérica

Inhibición enzimática

Representación de MM de unaactividad enzimática sin inhibir frentea un inhibidor competitivo

Representación de dobles recíprocos de unaactividad enzimática sin inhibir frente a uninhibidor competitivo

Inhibición Competitiva

Inhibición Acompetitiva

Representación de doblesrecíprocos de una actividadenzimática sin inhibir frentea un inhibidor acompetitivo

Representación de MM de unaactividad enzimática sin inhibir frentea un inhibidor no competitivo

Representación de dobles recíprocosde una actividad enzimática sininhibir frente a un inhibidor nocompetitivo

Inhibición no competitiva

Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico dela enzima, modificándola covalentemente, su acción no sedescribe por una constante de equilibrio Ki, sino por unaconstante de velocidad ki:

E + I E’

A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los inhibidoresirreversibles depende del tiempo de actuación del inhibidor.

Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamentetóxicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfóricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

Inhibidores

Sustratos suicidas:

(Inhibidores activados enzimáticamente)

E + I EI EI* E’ + I*1 2 3

1. El inhibidor se unen al centro activo de la enzima, de manera específica, igualque el substrato o un inhibidor competitivo convencional

2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especiealtamente reactiva I*

3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva aligual que un inhibidor irreversible.

Tienen por tanto:

(a) la especificidad del inhibidor competitivo y

(b) la potencia de los inhibidores irreversibles

Ejemplo: Sistema de la b-lactamasa bacteriana

La utilización masiva de antibióticos b-lactámicos(penicilinas, sus derivados semisintéticos ycefalosporinas) ha conducido a la aparición deresistencias a los mismos.

Los microorganismos resistentes a estosantibióticos lo son por producir una enzima, la b-lactamasa, que inactiva a los antibióticos b-lactámicos.

R CO NHS

N

O

CH3

CH3

COO-

R CO NHS

HN

CH3

CH3

COO-

CO

O-

-Lactamasa

Penicilina (activa)

Ác.peniciloico (inactivo)

Factores que afectan la actividad enzimática

[E] Temperatura

pH

Características:

También llamadas regulables, la actividad de la enzima seafecta por moléculas efectores que se unen en otros lugares;sitios alostéricos o regulables

Catalizan pasos reguladores claves de las rutas bioquímicas

La regulación puede ser:

- Activación alostérica: enzima aumenta afinidad por elsustrato (disminuye su Km), así como su velocidad de catalisis

- Inhibición alosterica: efectores negativos.

Enzimas Alostéricas

Características:

Cinéticamente no sigue elcomportamiento catalítico deMM

- Gráfica: curva sigmoidea ohiperbólica

La presencia de una sigmoideimplica la existencia decooperatividad en la fijacióndel substrato

Vo

[S]


La cooperatividad (positiva) consiste en que la fijación de unamolécula de substrato favorece la fijación del siguiente, y así hastaocuparse toda la molécula

s s s ss s

s

s

s s

+ + +

1 2 3

En términos de Km veríamos que Km1 > Km2 > Km3

Existe también cooperatividad negativa, cuando la fijación deuna molécula de substrato dificulta la fijación del siguiente.


Modelos que tratan de explicar la cinética de lasenzimas alostéricas

1. Monad, Wyman y Chanqeux (MWC)

2. Kosland, Nemethy y Filmes (KNF)

3. Eigen (Eig)

s

s s s s s

ss s

s

ii i i i i

i i i

i

Forma R

Forma T

Los inhibidores alostéricos aumentan elgrado de cooperatividad

Los activadores alostéricos disminuyen elgrado de cooperatividad; aconcentraciones elevadas de activador, lacinética pasa a ser michaeliana, y deja deser sigmoide.

Inhibidores y activadoresalostéricos

s

0 2 4 6 8 10 12

Y

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Activador

Inhibidor

Sin Inhibición

Los efectores alostéricos operan sobreel grado de cooperatividad del sistema:

- Control Homoalostérico

- Control Heteroalostérico

s si

Centro

activoCentro

alostérico

Centro

alostérico

Centro

activo

En ausencia de inhibidor, el sustratose fija normalmente al centro activo

Cuando el inhibidor ocupa el centroalostérico, tiene lugar un cambioconformacional en el centro activo queimpide la fijación del sustrato

Inhibición Alostérica

La mayoría de las enzimas catalizan reaccionescon dos o más sustratos

Varios mecanismos posibles

- Orden de unión de los sustratos

- Orden de liberación de los productos

Determinación más compleja que en las enzimasmonosustrato

- Para cada sustrato hay Km, Kcat y Vmax

Cinética de reacciones multiustrato

Secuencial Ordenado

Secuencial Aleatorio

Mecanismo secuencialo de desplazamientosimple:

adición de todos lossustratos para poderobtener los productos

Mecanismos principales de reacciones

multiustrato

Mecanismo de doble desplazamiento o pingpong:

no se han unidos todos los sustratos cuando ya haysalida de productos

Mecanismos principales de reacciones

multiustrato

Catálisis: Proceso en el que aumenta la velocidad ala que una reacción se aproxima al equilibrio

Catálisis Covalente

- Grupo reactivo que se une transitoriamente mediante enlace covalente

Catálisis Ácido-Base

- Molécula diferente de H2O acepta o cede protón

Catálisis por Iones Metálicos

- Varias funciones, dependiendo de la reacción

Catálisis por Aproximación

Catálisis por unión del Estado de Transición

Quimotripsina: proteasa que rompe enlaces peptídicosadyacentes a los aminoácidos aromáticos

Catálisis Covalente

- Unión irreversible con el diisopropilfluorofosfato (DFP)

- Actividad de residuo clave, Ser 195

Catálisis Ácido-Base

- Otros dos elementos de “triada catalítica”

- Asp 102 e His 57

Quimotripsina: Dos Mecanismos Catalíticos

Aprox. 30% de las enzimas usan iones metálicos:

- Metaloenzimas unidas fuertemente a metales de transición:Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ o Co3+

- Metaloenzimas unidad débilmente a metales en solución:Na+, K+, Mg2+ o Ca2+

Mecanismos:

- Enlace con el sustrato para permitir su adecuada orientación

- Participación del metal en mecanismos de oxidorreducción

- Estabilizador de la reacción al atraer cargas negativas del sustrato

Catálisis por Iones Metálicos

Observada en reacciones con varios sustratos

- Reactantes se encuentran en relación espacialóptima

Proximidad: acercamiento simple de las moléculas

- Aumentos de velocidad de hasta 5x

Orientación: acercamiento de los grupos

Catálisis por Proximidad y Orientación

Uno de los mecanismos más importantes

- Enzima tiene mayor afinidad por el estadode transición que por los sustratos oproductos

Conjuntamente con los demás, es responsablede los grandes aumentos de velocidad

Catálisis por unión del Estado de Transición

Regulación de la actividad enzimática

Las rutas bioquímicas están organizadas en reacciones químicas catalizadaspor enzimas, donde la regulación se hace más compleja

Razones de la regulación:

- Mantenimiento de un estado ordenado

- Conservación de la energía

- Respuestas a las variaciones ambientales

Se realiza:

- Regulación de la concentración enzimática

- Regulación de la actividad intrínseca de la enzima

1. Regulación alostérica

2. Regulación por modificación covalente

Regulación alostérica

Procesos a nivel celular; regulación de ajuste fino de la actividadenzimática, a través de efectos de retroalimentación (negativao positiva)

Regulación por modificación covalente

Procesos a nivel supracelular (orgánico); regulación a gran escalade actividades enzimáticas, a través de modificación covalentede enzimas, provocadas por señales (transducción de señales)

Retroalimentación Negativa en Vías Metabólicas

Thr a-cetobutirato IleTreonina

desaminasa

Síntesis de Isoleucina

El producto final de la ruta, Isoleucina, inhibe a la primeraenzima de la misma, Treonina desaminasa

Regulación alostérica

Suele haber fenómenos de modificación covalente de enzimas en larespuesta celular a señales químicas:

1. Neurotransmisores

2. Hormonas

3. Factores de crecimiento

4. Estímulos morfogenéticos y de diferenciación

5. Muerte celular programada (apoptosis)

6. Estímulos antigénicos

7. Luz y otros agentes físico-químicos


Fosforilación: Protein kinasas

Sobre residuos de Ser, Thr y Tyr

Ser

ATP ADP

Ser

C

N

C

C

N

C

C

N

CH2OH

O

H

R

H

O

R'

H

H

H

H

C

N

C

C

N

C

C

N

CH2O

O

H

R

H

O

R'

H

P O-

O

O-

H

H

H

Defosforilación: Protein fosfatasas

Sobre residuos previamente fosforilados: Ser-P, Thr-P, Tyr-P

Ser Ser

C

N

C

C

N

C

C

N

CH2OH

O

H

R

H

O

R'

H

H

H

H

C

N

C

C

N

C

C

N

CH2O

O

H

R

H

O

R'

H

P O-

O

O-

H

H

H

H2O Pi


Adenilación.Sistema de la Glutamina sintetasa

Tyr

O

OH OH

N

N N

N

H2NC

N

C

C

N

C

C

N

O

H

R

H

O

R'

H

CH2 O P

O

O-

O CH2

H

H

H

ADP-ribosilación. Actúa NAD+ como donador del grupo ADP-ribosa

H

H

H

O

OH OH

N

N N

N

H2N

+

C

N

C

C

N

C

C

N

O

H

R

H

O

R'

H

NHC

NH2

N

O

OH OH

CH2 O P O P O CH2

O O

O-O-H

Son variantes de una misma enzima. Formas físicamentedistintas de una enzima pero que catalizan una mismareacción

Enzimas multiméricas con varios tipos de subunidades- LDH: cuatro cadenas, tipos M y H- 5 isoenzimas diferentes- Preferencia por reacciones diferentes

Permite ajustes sutiles en función catalítica, una enzimasimple puede tener isoenzimas, ej: anhidrasa carbónica

Isoenzimas

Niveles enzimáticos como índices de enfermedad

Enzimas Funcionales: Actúan normalmente enlas reacciones del metabolismo

Enzimas No Funcionales: Aumentan sus nivelescuando hay daño tisular o orgánico

Niveles enzimáticos como índices de enfermedad

Enzima no Funcional Daño ocasionado

a-amilasa Daño pancreático

Fosfatasa AlcalinaObstrucción biliar, cáncer de huesos

Fosfataa Ácida Cáncer de Próstata

Creatinfosfoquinasa (CKmb), Lactato Deshidrogenasa (LDH-H4), a-

hidroxibutirato DH

Infarto al miocardio

Trasaminasa Glutámica Oxaloacético (TGO)

Evalúa infarto

Trasaminasa Glutámica Pirúvica (TGP)

Evalúa la Hepatitis

Cinetica enzimatica 2 2011

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