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CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIVATES PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM AMBIENTE E DESENVOLVIMENTO ESTUDO ELETROQUÍMICO E IONTOFORÉTICO DA LIBERAÇÃO E PERMEAÇÃO IN VITRO DE α-TOCOFEROL PRESENTE EM PREPARAÇÕES COSMÉTICAS CONTRA FOTOENVELHECIMENTO Elisa Paludo Lajeado, março de 2014
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CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIVATES
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU
MESTRADO EM AMBIENTE E DESENVOLVIMENTO
ESTUDO ELETROQUÍMICO E IONTOFORÉTICO DA LIBERAÇÃO E
PERMEAÇÃO IN VITRO DE α-TOCOFEROL PRESENTE EM PREPARAÇÕES
COSMÉTICAS CONTRA FOTOENVELHECIMENTO
Elisa Paludo
Lajeado, março de 2014
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Elisa Paludo
ESTUDO ELETROQUÍMICO E IONTOFORÉTICO DA LIBERAÇÃO E
PERMEAÇÃO IN VITRO DE α-TOCOFEROL PRESENTE EM PREPARAÇÕES
COSMÉTICAS CONTRA FOTOENVELHECIMENTO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ambiente e
Desenvolvimento, do Centro Universitário
UNIVATES, como parte da exigência para
obtenção do grau de Mestre em Ambiente
e Desenvolvimento na área de
concentração Tecnologia e Ambiente.
Orientadora: Profª. Dra. Simone Stülp
Co-orientador: Profº. Dr. Maurício
Hilgemann
Lajeado, março de 2014
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Dedico essa dissertação à minha mãe Tarcila, pela dedicação incansável,
pelos ensinamentos, pelo suporte, amor, carinho, apoio, paciência,
pela força, amizade, compreensão, por ser meu alicerce, minha companheira,
enfim, por acreditar em mim!
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AGRADECIMENTOS
Escrever uma dissertação de Mestrado é uma experiência enriquecedora e de
plena superação. Modificamo-nos a cada tentativa de buscar respostas às nossas
aflições. Para aqueles que compartilham conosco desse momento, parece uma
tarefa interminável, que só se torna realizável graças a muitas pessoas que
participam, direta ou indiretamente, mesmo sem saber realmente o que e para que
nos envolvemos em uma pesquisa. Desta forma, só tenho a agradecer essas
pessoas que passaram pelo meu caminho e deixaram um pouco de si.
Agradeço de coração a minha orientadora professora Simone Stülp pela
oportunidade, pela enorme paciência (em todos os choros), por todos os
ensinamentos, principalmente os de eletroquímica, pela orientação concedida, apoio
e confiança que me foi depositada. Obrigada por dividir seus conhecimentos e suas
experiências, por mostrar os caminhos mais adequados e pelo incentivo e motivação
constantes.
Ao professor Dênis Barnes, meu eterno agradecimento pela orientação
durante a graduação e um dos grandes responsáveis pela minha entrada no
PPGAD, meu especial obrigada pela amizade, pelos conselhos, pela confiança e
principalmente por ter me incentivado a continuar a vida acadêmica. Aos professores
Giovana Sinigaglia e João Tassinary, obrigada pelos incentivos, ensinamentos e
principalmente pelo exemplo de profissionais. A professora Débora Cerutti agradeço
citando a frase: “Aquilo que guardamos para nós, acabamos perdendo um dia;
aquilo que damos, conservamos às vezes, para sempre...” Paul Schmidt.
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Ao professor Eduardo Miranda Ethur pelo grande apoio, incentivo e amizade,
além das colaborações durante a realização deste trabalho. Ao professor Maurício
Hilgemann pelas contribuições realizadas.
À Laís por ter compartilhado comigo as angústias e tensões de se elaborar
uma dissertação, pela amizade conquistada, incentivo, pelas horas de colaboração,
auxílio, dedicação e responsabilidade.
À Univates, ao PPGAD e aos professores do mestrado, pela oportunidade de
aprendizado e crescimento profissional.
À teacher Margareth Bresolin por toda a confiança, apoio, incentivo, pela
amizade conquistada e, principalmente, por confiar em mim! Conquistamos juntas!
Aos meus amigos, que entenderam as horas de ausência, torceram e me
incentivaram, não tenho palavras para agradecer o quanto esse apoio foi importante.
Aos amigos que se formaram no PPGAD: Camila, Cristiano, Darliane e Luiz, gostaria
de dizer que percorremos este caminho juntos, nos complementando e nos
fortalecendo. Obrigada pela rica troca, cumplicidade, companheirismo e amizade.
À minha maravilhosa família, à minha mãe, às minhas irmãs Dani e Tchane, e
aos meus cunhados Ota e Cleberson, a os meus sobrinhos e afilhados Dudu, Luisa
e Pedro, minha base, meu tudo, vocês são o melhor da minha vida. Obrigada pelo
apoio incondicional ao longo deste processo de dissertação e de muitos outros.
Obrigada por acreditarem em mim, mesmo quando eu não acreditava. Ao meu pai
(in memorian) o convívio foi pouco, mas o carinho sempre esteve presente.
Enfim, a todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a
realização deste trabalho, meus sinceros e profundos agradecimentos, pois ninguém
vence sozinho. No final das contas, talvez devêssemos parar de tentar retribuir às
pessoas que nos apoiam em nossas vidas. Talvez fosse mais sábio se render à
milagrosa abrangência da generosidade humana e simplesmente continuar dizendo
obrigada, para sempre e com a sinceridade, enquanto tivermos voz, diria Elizabeth
Gilbert.
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"O futuro não é um lugar onde estamos indo, mas um lugar que estamos criando.
O caminho para ele não é encontrado, mas construído e o ato de fazê-lo
muda tanto o realizador quanto o destino". (Antoine de Saint-Exupery)
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RESUMO
A iontoforese é um método de administração de substâncias através da pele, com propósito terapêutico específico, utiliza-se de potencial ou corrente elétrica para promover a transferência transdermal de um fármaco. A camada córnea corresponde a uma espessura de cerca de 20 µm, sendo reconhecida como a principal barreira à transferência transdermal de fármacos. Em vista disso, cada vez mais técnicas diferentes vêm sendo testadas para a penetração de substâncias através do estrato córneo. Destaca-se ainda o α-tocoferol (vitamina E), um antioxidante natural capaz de reduzir ou bloquear as reações de oxidação induzidas pelos radicais livres nas membranas biológicas em função de exposição solar, por exemplo. O presente estudo tem como objetivo realizar avaliações eletroquímicas do gel + α-tocoferol quando submetido a aplicações de iontoforese, bem como verificar os potenciais de liberação e permeação do α-tocoferol quando associados à iontoforese. Para a realização dos experimentos utilizou-se a célula de difusão tipo Franz, aplicando-se as técnicas de voltametria cíclica e espectrofotometria UV/Vis para avaliação do sistema. A partir dos resultados observa-se um aumento da difusão e degradação do sistema, devido à redução da corrente de pico em 0,78 V das moléculas de α-tocoferol, quando submetido à iontoforese. Nas análises voltamétricas do gel + α-tocoferol, nos diferentes tempos de aplicação de iontoforese o sinal de corrente decai com o tempo, já que parte dele é permeada observa-se uma diminuição da altura do pico e seu consequentemente alargamento. Acredita-se que esteja ocorrendo uma degradação do α-tocoferol pela ação da iontoforese, e que seu produto esteja sendo oxidado no eletrodo de platina num potencial próximo ao do α-tocoferol. Nos ensaios de permeabilidade do α-tocoferol sem e com a aplicação de iontoforese, obteve-se uma diferença significativa de t = 4; p = 0,01 com a aplicação. Nos ensaios de permeação utilizando a muda de pele de cobra Boa constrictor há uma tendência de aumento de fluxo entre os tempos de 2 e 10 min, sendo esta uma diferença significativa, esse fato pode ser devido a utilização da membrana. Desta forma o α-tocoferol possui um comportamento eletroquímico ativo com a aplicação de iontoforese em meio gel de hidroxietilcelulose, avaliando também uma tendência à degradação do ativo com o aumento do tempo de aplicação da iontoforese observado na análise eletroquímica e de difusão. E a aplicação da iontoforese demostrou eficiência no aumento de permeação e liberação do α-tocoferol, comparado a condições sem aplicação. Palavras-chave: Iontoforese. α-tocoferol. Eletroquímica.
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ABSTRACT
Iontophoresis is a method of administration of substances through the skin, with a specific therapeutic purpose, it uses electric current or potential to promote the transfer of a transdermal drug. The corneal layer corresponds to a thickness of about 20 microns, being recognized as the primary barrier to transdermal drug transference. In view of this, and more different techniques have been tested since for the penetration of substances through the stratum corneum. We also highlight the α-tocopherol (vitamin E), a natural antioxidant able to reduce or block the oxidation reactions induced by free radicals in biological membranes due to exposure to sunlight, for example. The present study aims to conduct electrochemical evaluations gel + α-tocopherol when subjected to iontophoresis applications as well as to verify the potential of release and permeation of α-tocopherol when combined with iontophoresis. We used for the experiments, the Franz diffusion cell type, applying the cyclic voltammetry and UV/Vis spectrophotometry to evaluate the system. It was observed, from the results an increase of the diffusion and degradation of the system due to the reduction in peak current at 0.78 V of the molecules of α-tocopherol, when subjected to iontophoresis. In the voltammetric analysis of the gel + α - tocopherol in different times of application of iontophoresis current signal decays with time, since part of it is permeated , there is a decrease of the peak height and consequently its enlargement. It is believed that degradation is occurring α-tocopherol by the action of iontophoresis, and that your product is being oxidized at the platinum electrode at a potential close to that of α - tocopherol. The permeation tests of α-tocopherol with and without the application of iontophoresis, we obtained a significant difference in t = 4, p = 0.01 with the application. In permeation tests using seeding of skin of snake Boa constricitor a trend of increased flow between periods of 2 and 10 min, which is a significant difference, this might be due no use of membrane. Thus the α-tocopherol has an active electrochemical behavior with the application of iontophoresis amid gel hydroxyethylcellulose, a trend also evaluating the degradation of the asset with the increase of time of application of iontophoresis observed in electrochemical analysis, and diffusion. And the application of iontophoresis demonstrated effectiveness in increasing permeation and release of α-tocopherol, compared to conditions without application.
Keywords: Iontophoresis. α-tocopherol. electrochemical.
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Processo de formação dos radicais livres no organismo. ......................... 20
Figura 2 - Fotoenvelhecimento unilateral. ................................................................. 22
Figura 3 - Ação antrópicas x qualidade de vida. ........................................................ 23
Figura 4 - Camadas da pele: epiderme, derme e hipoderme. ................................... 25
Figura 5 - Representação esquemática da epiderme. ............................................... 26
Figura 6 - Biomembrana de pele de muda de cobra Boa constrictor em solução de
azida sódica 0,0002% em água destilada. ................................................................ 28
Figura 7 - Estrutura química do α-Tocoferol. ............................................................. 29
Figura 8 - Atividade antioxidante do α-tocoferol. ....................................................... 31
Figura 9 - Esquema de transferência de íons durante a iontoforese. (A) Íons positivos
são conduzidos para longe do ânodo. (B) Íons negativos são conduzidos para longe
do cátodo. .................................................................................................................. 35
Figura 10 - Célula Eletroquímica ............................................................................... 39
Figura 11- Esquema do sistema utilizado com a célula de difusão tipo Franz. ......... 41
Figura 12 - Sistema de difusão utilizado nos experimentos de liberação permeação.
.................................................................................................................................. 42
Figura 13 – Curva de calibração, da solução de α-tocoferol nas concentrações de:
0,09054 µmol L-1, 0,36277 µmol L-1, 0,725546 µmol L-1 e 1,4510 µmol L-1. .............. 42
Figura 14 - Equipamento de iontoforese utilizado nos experimentos. ....................... 43
Figura 15 - Voltametria cíclica de eletrodo de platina em sistema contendo gel de
hidroxietilcelulose (linha tracejada), e este acrescido de α-tocoferol 1% (linha
contínua), v = 10 mV/s. ............................................................................................ 45
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Figura 16 - Voltametria cíclica de eletrodo de platina em sistema contendo gel de
hidroxietilcelulose acrescido de α-tocoferol 1% nos diferentes tempos estudados: a:
0 min; b: 2 min; c: 6 min; d: 10 min e e: 12 min, v = 10 mV/s. .................................. 46
Figura 17 - Voltametria cíclica de eletrodo de platina em sistema contendo gel de
hidroxietilcelulose com aplicação de iontoforese nos tempos: a: 0 min; b: 2 min; c: 6
min; d: 10 min e e:12 min, v = 10 mV/s. ................................................................... 48
Figura 18 - Quantidade liberada de α-tocoferol em função do tempo (horas) em
sistemas de difusão vertical contendo gel de hidroxietilcelulose/α-tocoferol. ............ 49
Figura 19 - Quantidade liberada de α-tocoferol em função do tempo (horas) em
sistemas de difusão vertical contendo gel de hidroxietilcelulose/α-tocoferol associado
à iontoforese. ............................................................................................................. 49
Figura 20 - Coeficiente de permeabilidade do α-tocoferol sobre a membrana de
acetato de celulose sem (controle) e com aplicação de iontoforese. ........................ 51
Figura 21- Aplicação de iontoforese em placa de Petri do α-tocoferol 1% associado
ao gel de hidroxietilcelulose nos tempos de 10 e 12 minutos.................................... 53
Figura 22 - Oxidação do α-tocoferol. ......................................................................... 54
Figura 23 - Quantidade permeada do α-tocoferol com aplicação de iontoforese
(branco) e sem aplicação de iontoforese (preto). ...................................................... 55
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ag/AgCl - Prata/Cloreto de prata
ERO - Espécies reativas de oxigênio
CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência
RL - Radical livre
UV - Ultravioleta
UVA - Ultravioleta A
UVB - Ultravioleta B
UVC - Ultravioleta C
UV/VIS - Ultravioleta visível
α - Alfa
β - Beta
γ - Gama
δ - Delta
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 14
1.1 Tema ................................................................................................................. 15
1.2 Problema ........................................................................................................... 15
1.3 Hipóteses .......................................................................................................... 16
1.4 Objetivos ........................................................................................................... 16
1.4.1 Objetivo Geral ................................................................................................ 16
1.4.2 Objetivos Específicos ..................................................................................... 16
1.5 Justificativa ........................................................................................................ 16
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................... 19
2.1 Envelhecimento e interdisciplinaridade ............................................................. 19
2.2 Pele ................................................................................................................... 24
2.3 Biomembrana de pele de muda de cobra (Boa constrictor) .............................. 27
2.4 Membrana de acetato de celulose .................................................................... 29
2.5 α-tocoferol ......................................................................................................... 29
2.6 Iontoforese ........................................................................................................ 33
3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 38
3.1 Reagentes ......................................................................................................... 38
3.2 Comportamento eletroquímico do α-tocoferol ................................................... 39
3.3 Análise de liberação e permeação in vitro do α-tocoferol em sistema de difusão
vertical ....................................................................................................................... 40
3.4 Aplicação da Iontoforese in vitro ....................................................................... 43
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ......................................................................... 44
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4.1 Comportamento eletroquímico do α-tocoferol em sistema associado à
iontoforese ................................................................................................................. 44
4.2 Determinação da quantidade liberada de α-tocoferol em sistema de difusão
vertical ....................................................................................................................... 48
4.3 Determinação da permeação in vitro de α-tocoferol em biomembrana de Boa
constrictor .................................................................................................................. 54
5 CONCLUSÃO ...................................................................................................... 58
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 60
6 APÊNDICES ........................................................................................................ 68
APÊNDICE A ............................................................................................................. 69
APÊNDICE B ............................................................................................................. 70
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1 INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, os fatores essenciais para a vida se tornaram prejudiciais, à
medida que a ação antrópica torna-os nocivos, pois a redução da camada de ozônio
tem levado a um aumento da radiação UV na superfície terrestre. Esse fato tem
provocado danos ao organismo e à pele, bem como o envelhecimento precoce e o
fotoenvelhecimento, sendo que, em alguns casos, sua relação com efeitos
radicalares são comprovados (CLARKE, 2006; AZULAY; AZULAY; AZULAY-
ABULAFIA, 2008). Desta forma, o processo oxidativo pode ocasionar efeitos
deletérios nas células e tecidos do corpo humano; o oxigênio reativo e as espécies
de nitrogênio danificam as células (SKOOG et al., 2006).
A profilaxia do envelhecimento precoce da pele tem assumido uma
importância crescente na população, e tem como componente essencial das
estratégias de prevenção, a utilização de antioxidantes em formulações cosméticas.
Os antioxidantes atuam neutralizando a ação dos radicais livres, revertendo, ou até
detendo, os danos por eles causados (GOMES; DAMAZIO, 2009).
O α-tocoferol é um antioxidante natural, que possui a capacidade de reagir
com as espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio (BAUMANN, 2004). Este
composto é utilizado comumente em diversas preparações cosméticas, como na
formulação de fotoprotetores e rejuvenescedores. Contudo, sua aplicação tópica tem
como principal desafio uma maior permeabilidade do α-tocoferol na pele, o que
poderia potencializar sua bioatividade.
A permeabilidade cutânea é um dos principais parâmetros a serem
considerados nos tratamentos dermatológicos. Sabe-se que vários fatores
influenciam na permeação cutânea de fármacos como barreiras naturais, tipo de
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veículo utilizado, tempo de aplicação, entre outros. O desenvolvimento de sistemas
tópicos de liberação de fármacos, como a iontoforese, tem se intensificado nos
últimos anos, com o objetivo de otimizar a biodisponibilidade dos princípios ativos,
que muitas vezes são suscetíveis à degradação, aumentando assim a eficácia do
tratamento (GRATIERI; GELFUSO; LOPEZ, 2008).
A iontoforese consiste na associação de uma corrente elétrica com aplicação
tópica de fármacos, a qual aumenta sua liberação transdérmica através do estrato
córneo, elevando a eficácia terapêutica de diversos tratamentos. Esta técnica já vem
sendo utilizada na prática dermatológica e cosmética, tendo sua eficácia já
comprovada no aumento da permeação de diferentes princípios ativos (SILVA;
GUEDES; PIRES, 2012).
Em face do exposto, o objetivo do presente trabalho foi o de estudar a
liberação e permeação do α-tocoferol, quando adicionado a um hidrogel, com e sem
a aplicação de iontoforese, além de avaliar, por meio eletroquímico, possíveis
reações de oxidação ocorridas após a aplicação deste. A importância deste trabalho
reside na avaliação da promoção, por parte da iontoforese, do aumento de liberação
(facilitador) do fármaco para o meio, em ensaios in vitro, investigando possíveis
alterações estruturais ocorridas neste sistema.
1.1 Tema
Aplicação da iontoforese na terapia tópica (dermatológica) in vitro
com α-tocoferol.
1.2 Problema
Qual a influência da técnica de iontoforese, em termos de variáveis físico-
químicas, na terapia tópica com α-tocoferol?
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1.3 Hipóteses
1. A estabilidade estrutural da molécula de α-tocoferol não é influenciada pela
técnica de iontoforese;
2. A iontoforese aumenta o transporte transmembrana da molécula de
α-tocoferol.
1.4 Objetivos
1.4.1 Objetivo Geral
Analisar e identificar a associação entre o princípio ativo α-tocoferol e a
técnica de iontoforese, em termos de análise eletroquímica e de difusão vertical.
1.4.2 Objetivos Específicos
1. Analisar a técnica de iontoforese in vitro na membrana de acetato de celulose
e biomembrana de muda de pele de cobra;
2. Avaliar o efeito da iontoforese sobre a estrutura molecular do α-tocoferol, por
meio de técnicas eletroquímicas;
3. Avaliar o efeito da técnica de iontoforese na permeabilidade cutânea do
α-tocoferol em modelo in vitro;
4. Comparar os resultados obtidos da liberação e permeação do princípio ativo
α-tocoferol associado à técnica de iontoforese.
1.5 Justificativa
Com as alterações ambientais sofridas nos últimos anos, como a depleção de
ozônio (EPA, 2010), a exposição solar e, por consequência, a incidência à radiação
UV tem aumentado na superfície terrestre. Tendo em vista este efeito, danos ao
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organismo (HIRAMOTO et al., 2013), à pele, envelhecimento precoce e
fotoenvelhecimento têm sido relatados, sendo que em alguns casos, sua relação
com efeitos radicalares são comprovados (WLASCHEK, 2001). Tais efeitos levam ao
envelhecimento tecidual e o ressecamento da pele. O carcinoma de pele é o mais
diagnosticado entre a população, sendo a região cérvico-facial e o dorso das mão
como regiões mais acometidas, e com maior predisposição a exposição dos raios
solares. Tal condição gera desconforto e pode levar ao desenvolvimento de outras
desordens dermatológicas, além de causar uma aparência antiestética.
Com o intuito de inibir ou amenizar efeitos do fotoenvelhecimento,
tratamentos têm sido utilizados como prevenção, atenuação, ou para amenizar
efeitos da exposição à radiação UV/solar. Dentre estes tratamentos, podem ser
citados: o uso de fotoprotetores e rejuvenescedores, de compostos reativos com o
oxigênio, dentre outros.
Os antioxidantes têm sido utilizados como tratamento para a jovialidade
cutânea, sendo o α-tocoferol um dos princípios ativos que, quando utilizado
isoladamente ou associado a outros compostos, têm demonstrado efeitos positivos
em relação à proteção na exposição solar, proteção de doenças, incluindo o câncer
(BURKE, 2003) e inibindo a ação dos radicais livres (GUIRRO; GUIRRO, 2002).
O α-tocoferol possui importante papel na função de antioxidante da
membrana, associando-se a manutenção da estrutura lipídica. Desta forma, trabalha
inibindo a formação de peróxidos lipídicos, uma vez formados pela oxidação das
gorduras insaturadas, a qual interferem na integridade das membranas biológicas
(GUIRRO; GUIRRO, 2002; KEDE; SABATOVICH, 2004; LEONARDI, 2008).
Ainda, a busca por novos sistemas promotores de permeação permite
otimizar a entrega dérmica de compostos, que muitas vezes são suscetíveis à
degradação (KAUR; KAPILA; AGRAWAL, 2007), devido a variações de temperatura,
de concentração de oxigênio, dentre outros, sendo a vitamina E um composto
passível de degradação, em função de variações ambientais (SABLIOV et al., 2009).
Dentre os promotores de permeação, pode-se destacar a iontoforese, com o
objetivo de otimizar a biodisponibilidade dos fármacos, de forma tópica, na pele,
aumentando assim a eficácia do tratamento.
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Desta forma, os pacientes podem se beneficiar com o aumento da eficácia do
tratamento através de uma melhor absorção do fármaco. Assim, possibilita-se
condutas terapêuticas eficientes, com resultados clínicos rápidos como: rápida
liberação do fármaco, tratamento de várias patologias tanto estéticas como
dermatológicas; não apresenta agressões digestivas, tratamento local e seguro
reduzindo assim a possibilidade de superdosagem ou subdosagem, possibilita-se a
utilização de um fármaco com curta meia-vida biológica.
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2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Envelhecimento e interdisciplinaridade
A expectativa de vida está cada vez mais aumentando, paralelamente houve
um crescente interesse em envelhecer sem parecer velho, ou seja, retardar ao
máximo os sinais do envelhecimento no organismo como um todo, especialmente a
pele (RIBEIRO, 2010).
Evidencia-se o envelhecimento cronológico cutâneo ou intrínseco, ao qual, a
pele, sem que se perceba, vai perdendo lentamente as suas propriedades de
resistência e autorregulação, ocorre modificação do material genético por meio de
enzimas, alterações proteicas, a proliferação celular decresce, diminui a síntese de
colágeno, de elastina e de outras macromoléculas, há menor regeneração celular,
há diminuição das defesas antioxidantes, espessamento dos vasos, fibras de
colágeno tornam-se quebradiças e fibras de elastina fragmentam-se, dentre outras
alterações (MAGALHÃES, 2000; KEDE; SABATOVICH, 2004; BAUMANN, 2004;
GOMES; DAMAZIO, 2009).
Destaca-se ainda, as oxidações químicas e enzimáticas envolvendo a
formação de radicais livres (RL) (Figura 1), que aceleram o fenômeno do
envelhecimento por danos ao DNA e por atuarem na desidrogenação, hidroxilação e
na glicação proteica. As espécies de radicais de oxigênio, inclusive peróxido de
hidrogênio e radicais hidroxila, são formados naturalmente, por fatores endógenos,
através do metabolismo humano (metabolismo de alimentos, processos musculares
e produção de hormônios) e por fatores exógenos, como o impacto da radiação
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ultravioleta sobre a pele, poluição, estresse, entre outros (KEDE; SABATOVICH,
2004; BAUMANN, 2004; HIRATA; SATO; SANTOS, 2004; GOMES; DAMAZIO,
2009).
Figura 1 - Processo de formação dos radicais livres no organismo.
Fonte: Adaptado de PEYREFITTE, 1998.
Desta forma, as espécies reativas de oxigênio (ERO), também conhecidas
como RL, que são formados quando um átomo possui um elétron desemparelhado,
situação energeticamente instável, a qual confere alta reatividade passando a
capturar seu par em outro átomo pertencente a outra molécula, danificando essa
estrutura. O estresse oxidativo pode ser definido como um desequilíbrio entre a
formação de ERO e a capacidade antioxidante total do organismo (BRUICE, 2006,
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SMITH; MARKS; LIEBERMAN, 2007; LEONARDI, 2008). A ação da oxidação sobre
as células e tecidos do corpo humano pode ser bastante prejudicial (SKOOG, 2006).
Desta forma, a produção dos RL ocorre devido à quebra da paridade da órbita
externa das moléculas por agentes externos ou por reações internas do organismo,
ou seja, esses compostos são formados quando as moléculas de oxigênio se
combinam com outras moléculas, gerando um número excessivo de elétrons.
Quando uma molécula de oxigênio apresenta-se com elétrons pareados é estável;
todavia, o oxigênio com um elétron sem par é “reativo”, pois ele capta elétrons de
componentes vitais, danificando-os (BAUMANN, 2004; BAYNES; DOMINICZAK,
2010).
Entretanto, com estudo de diferentes ciências chega-se a um paradoxo, onde
as plantas durante a fotossíntese absorvem dióxido de carbono e rejeitam o
oxigênio. Os animais e os seres humanos realizam o processo inverso, desta forma,
utiliza-se o oxigênio liberado pelas plantas, contudo, respirar é algo essencial à vida
e gera obrigatoriamente a formação de RL. Ainda, destaca-se a radiação solar como
também sendo fundamental para a vida, mas seu componente ultravioleta causa
efeitos indesejáveis na pele em exposição elevada (PEYREFITTE, 1998). Os
mesmos são fatores naturais, aos quais, em condições normais, observa-se um
equilíbrio entre a produção de espécies reativas e os sistemas de defesa
antioxidante do próprio organismo.
Toda via, os fatores essenciais para a vida se tornam prejudiciais à medida
que a ação antrópica os torna nocivos. A intensidade da radiação UV que atinge a
superfície terrestre é influenciada por diversos fatores ambientais, entre eles,
destacam-se os níveis da camada de ozônio e a poluição ambiental. O dano das
radiações sobre diversas estruturas celulares varia de acordo com o comprimento de
onda. A camada de ozônio absorve 100% da radiação UVC, 90% da radiação UVB e
praticamente não absorve a radiação UVA, desta forma, com a danificação da
camada de ozônio, aumenta a transmissão de UV para a superfície da Terra.
(CLARKE, 2006; BARRETO; et al., 2008; MONTAGNER; COSTA, 2009;
RAI; SHANMUGA; SRINIVAS, 2012).
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Ao atingirem a pele, as radiações podem ser parcialmente refletidas,
refratadas e, em partes, absorvidas. Apenas a porção de radiação absorvida pela
pele dará inicio à reação fotoquímica inaugural da resposta biológica (lei de Grotthus
e Draper). Como consequência da interação da radiação ultravioleta com a pele,
pode surgir indução de mutações celulares, desenvolvimento de malignidades e
modificação da resposta imunológica da pele (AZULAY; AZULAY; AZULAY-
ABULAFIA, 2008).
Como exemplo da participação dos radicais livres gerados pela radiação no
mecanismo de envelhecimento humano, cita-se um estudo realizado com
trabalhadores da usina atômica de Chernobyl na Ucrânia, o qual mostra que 80%
das pessoas que trabalham na usina apresentam idade biológica superior aos
habitantes de Kiev na Ucrânia, que não foram expostos à radiação proveniente do
acontecido em 1986 (POLYUKHOV, 2000).
Outro exemplo é o de fotoenvelhecimento unilateral, caminhoneiro de 69
anos, que trabalhou durante 28 anos dirigindo, apresentou espessamento
assintomático e enrugamento da pele, no lado esquerdo da sua face (elastose
solar), causado pelo fotoenvelhecimento acentuado, como se pode observar na
Figura 2 (JENNIFER, 2012).
Figura 2 - Fotoenvelhecimento unilateral.
Fonte: JENNIFER, 2012.
Denomina-se assim envelhecimento extrínseco ou fotoenvelhecimento, o qual
está relacionado a fatores externos, principalmente os ambientais, surgindo
principalmente em áreas foto-expostas, devido ao efeito repetitivo da ação dos raios
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ultravioletas, além de outros fatores como a poluição, álcool e o tabagismo (KEDE,
SABATOVICH, 2004, BAUMANN, 2004; GOMES; DAMAZIO, 2009).
Assim, pode-se dizer que o envelhecimento cutâneo está relacionado aos
efeitos da idade, alterações hormonais e a fatores ambientais que o ser humano
está exposto durante toda a vida, conforme a Figura 3 (KEDE, SABATOVICH, 2004,
BAUMANN, 2004).
Figura 3 - Ação antrópicas x qualidade de vida.
Fonte: Autora
Todavia, os antioxidantes são inibidores de RL, suprindo a formação ou as
ações de ERO, oferecendo os elétrons que eles buscam para se estabilizar. Estes
podem ser incorporados à pele através de cosméticos (LEONARDI, 2008).
Desta forma, o uso de cosméticos que contenham antioxidantes naturais já
vem sendo utilizados para a elaboração dos mesmos desde os tempos remotos,
com a finalidade de tratamento e beleza da pele (BARATA, 2003). A Cosmetologia
pode ser definida como sendo uma ciência que estuda os cosméticos, desde a
concepção de conceitos até a aplicação dos produtos elaborados. Entre estes dois
extremos, encontra-se a pesquisa de novas matérias primas, tecnologias,
desenvolvimento de formulações, produção, comercialização, controle de qualidade,
toxicologia, eficácia de produtos, dentre outros. Nesse contexto, considera-se uma
atividade multidisciplinar envolvendo conhecimentos de diferentes áreas, à qual
possui a finalidade de prevenção e melhora de alterações inestéticas na pele
(RIBEIRO, 2010).
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Ressalta-se desta forma, a importância do conhecimento de outras ciências
para serem trabalhados e transformados pelas necessidades do desenvolvimento da
ciência importadora. As disciplinas etnológicas, por exemplo, explicam o processo
cultural de aproveitamento dos recursos do meio (PHILIPPIS Jr., 2000).
Por outro lado, analisa-se que há relação entre essência, beleza e saúde, na
qual não pode haver beleza sem saúde e esta é evidenciada por aquela, sendo
beleza tudo o que a natureza encerra, e os produtos naturais e seus derivados são,
em princípio, um dos principais responsáveis pela realização desse desejo, comum
à maioria das pessoas (BARATA 2003).
O uso de plantas e seus componentes sempre foi objetivo de estudo tanto
para cosmetologia como para dermatologia. Com o avanço do conhecimento e o
aprimoramento de técnicas, passou-se a utilizar métodos de isolamento e de
elucidação estrutural; desta forma, permite-se conhecer melhor e, avaliar seus
elementos ativos e mecanismos de ação (CUNHA, 2004).
Todavia se não é possível evitar 100% todos os processos ambientais e
físicos, boa parte pode ser prevenida ou remediada.
2.2 Pele
A pele é o maior órgão do corpo humano, com uma espessura variável,
representando algo em torno de 16% do peso corpóreo. É por intermédio da pele
que estamos totalmente expostos ao meio ambiente. Em suas atribuições incluem a
proteção contra agressões físicas, químicas e biológicas; a absorção da radiação
ultravioleta tanto para a síntese de vitamina D como para a proteção; barreira
relativamente impermeável; excreção (suor) e a termorregulação; órgão sensorial;
sinalização sexual; e defesa imunológica do organismo (KIERSZENBAUM, 2008;
GOMES; DAMAZIO, 2009; GARTNER; HIATT, 2010).
A pele possui uma estrutura complexa, sendo formada por epiderme, derme e
tecido subcutâneo ou hipoderme (Figura 4). Em sua composição química tem-se
água, protídios (aminoácidos, colágeno, elastina, ceratina, melanina, glicoproteína,
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enzima entre outros), lipídios (ácidos graxos, colesterol, fosfolipídios e triglicerídeos),
glicídios (ácido hialurônico, glicose e glicogênio), sais minerais (cálcio, cobre,
enxofre, ferro, fósforo, iodo, magnésio, manganês, potássio, sódio, zinco entre
outros) (GOMES; DAMAZIO, 2009).
Figura 4 - Camadas da pele: epiderme, derme e hipoderme.
Fonte: SAMPAIO; RIVITTI, 2008.
A epiderme é basicamente um tecido epitelial estratificado queratinizado, com
variações estruturais e funcionais significativas na dependência do seu sítio
anatômico, constituída por: queratinócitos responsáveis pelo corpo da epiderme e de
seus anexos (pelos, unhas e glândulas); os melanócitos; células de Langerhans,
com função imunológica; e células de Merkel integradas ao sistema nervoso. É
avascular, isto é, não possui circulação sanguínea e linfática (KIERSZENBAUM,
2008; GOMES; DAMAZIO, 2009; GARTNER; HIATT, 2010; AZULAY; AZULAY;
AZULAY-ABULAFIA, 2008).
Ainda, a epiderme pode ser dividida em 5 camadas ou estratos (Figura 05)
sendo elas: 1) camada basal ou germinativa, é a camada mais profunda, formada
por células de formato cuboide a colunar. Essas células são responsáveis pela
renovação celular, através da mitose; 2) estrato espinhoso ou camada de Malpighi,
as células que compõem essa camada também apresentam atividade mitótica,
também formam grânulos de revestimento por membrana, cujo conteúdo rico em
lipídios é composto por ceramidas, fosfolipídios e glicoesfingolipídios; 3) camada
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granulosa, é composta por células que acumulam grânulos de querato-hialina, deste
modo, preenchem as células por completo, destruindo seus núcleos e organelas; 4)
camada lúcida, mais comum em peles espessas, é composta de células anucleadas
e achatadas, o qual lhe dá o aspecto translúcido; 5) camada córnea é a camada
mais superficial, os queratinócitos se transformam em queratina, células sem vida.
Assim, as camadas superficiais são descamadas na mesma proporção em que vão
sendo substituídas pela atividade mitótica da camada basal e do estrato espinhoso
(GOMES; DAMAZIO, 2009; GARTNER; HIATT, 2010).
Figura 5 - Representação esquemática da epiderme.
Fonte: GARTNER; HIATT, 2010.
O estrato córneo corresponde a cerca de 20 μm da epiderme, é reconhecido
como a principal barreira à transferência transdermal de fármacos, funcionando
como uma barreira protetora. Ele possui proteínas e lipídios múltiplos que podem
ligar-se reversível ou irreversivelmente a fármacos. Assim, as camadas da epiderme
possuem comportamento fisiológico e físico-químico de aceitar ou não a permeação
de certas substâncias (BAUMANN, 2004; GOMES; DAMAZIO, 2009; BRUNTON,
2012).
A epiderme ainda pode ser classificada em espessa ou delgada, dependendo
da espessura da camada córnea. A epiderme da pele espessa é composta das
cinco camadas distintas, já a epiderme da pele delgada não apresenta a camada
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lúcida (e por vezes a camada granulosa), entretanto, as células individuais que
constituem as camadas ausentes estejam presentes (GARTNER; HIATT, 2010).
A derme situada logo abaixo da epiderme é composta por tecido conjuntivo
denso não moderado, contém colágeno do tipo I e numerosas fibras elásticas. É
bastante vascularizada, subdividida em camada papilar e camada reticular
(GUIRRO; GUIRRO, 2004; GARTNER; HIATT, 2010).
Desta forma, um dos principais desafios dos fármacos é romper a função da
pele de manter a barreira cutânea entre os meios endógeno e exógeno,
possibilitando assim, a permeação de fármacos na pele (GOMES; DAMAZIO, 2009).
O caminho para a permeação de um ativo nas camadas da pele pode ter três
vias potenciais no tecido: pelos folículos pilosos com suas glândulas sebáceas
associadas; via ductos sudoríparos; ou pelo estrato córneo contínuo existente entre
os apêndices (ANSEL; POPOVICH; ALLEN Jr., 2000; AULTON, 2005; CERIZE,
2012).
Além da transferência de íons, desenvolver-se principalmente nos ductos das
glândulas sudoríparas, e em menor extensão nos folículos pilosos e glândulas
sebáceas (LOW; REED, 2001).
2.3 Biomembrana de pele de muda de cobra (Boa constrictor)
Com a dificuldade de obtenção e utilização de pele humana para estudos de
permeação, passou-se a pesquisar em modelos animais, percebendo-se que a
membrana era similar a do humano.
A pele de muda de cobra Boa constrictor (Figura 6), fornece uma barreira
similar ao extrato córneo humano, constituindo-se de: camada externa, denominada
de β, composta por β-queratina, α-queratina intracelular, mesos queratina, estruturas
multilamelar e camada lipídica intercelular. Além disso, na camada do meio
apresenta-se de três a cinco camadas com estrutura de multicamadas de células
cornificadas envolvidas por lipídios intercelulares, apresentando similaridade ao
estrato córneo humano (ITOH et al. 1990; RIGG; BARRY, 1990).
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Figura 6 - Biomembrana de pele de muda de cobra Boa constrictor em solução de azida sódica 0,0002% em água destilada.
Fonte: Autor.
Os lipídios são importantes componentes da pele, controlando a
permeabilidade de componentes, a sua descamação aumenta a permeabilidade de
água tanto no estrato córneo humano como na pele de muda de cobra (ITOH et al.,
1990).
Destaca-se ainda, que a pele de muda de cobra Boa constrictor pode ser
obtida sem a morte do animal, uma vez que a troca de pele (ou ecdise) ocorre
regularmente no animal adulto, em geral a cada 2 ou 3 meses, fornecendo material
em abundância, sendo de fácil armazenamento e não sofrendo degradação
microbiológica. Apresenta-se como stratum corneum puro, não viável e desprovido
de folículos pilosos (RIGG; BARRY, 1990).
Estudos confirmam a similaridade entre a muda de pele de cobra e pele
humana, em termos de composição e estrutura, contribuindo com a permeabilidade
de vários compostos e a contribuição dos vários grupos funcionais para a
permeabilidade, evidenciando diferentes graus de sucesso (ITOH et al., 1990;
HARADA et al., 1992; NUNES et al., 2005).
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2.4 Membrana de acetato de celulose
Outra opção além do uso de pele de animais para estudos de permeação é a
pele artificial. São modelos de membrana úteis para estudos de triagem em
permeação cutânea. O modelo de membrana utilizado no estudo foi a de acetato de
celulose (Sartorius Stedim Biotech) com porosidade de 0,45 μm. As folhas de
acetato de celulose para eletroforese são concebidas como um material suporte
inerte para a separação moléculas carregadas de eletroforese (MANUAL
SARTORIUS STEDIM BIOTECH).
2.5 α-tocoferol
Vitamina E é o nome coletivo para um grupo de 8 compostos lipossolúveis,
que apresentam em diferentes graus, a mesma atividade biológica do α-tocoferol,
dos quais é o mais ativo. Os tocoferóis são antioxidantes biológicos (PENTEADO,
2003; LEHNINGER; NELSON; COX, 2008; CHAMPE; HARVEY; FERRIER, 2010).
Em sua estrutura o α-tocoferol (Figura 7) possui um anel 6-cromonol e uma
cadeia lateral. A cadeia lateral é de natureza isoprênica, constituída por 16 átomos
de carbono, sendo responsável pela lipossolubilidade (PENTEADO, 2003). O anel
aromático reage com as formas mais reativas de oxigênio e outros RL as destrói,
assim protege os ácidos graxos insaturados da oxidação (LEHNINGER; NELSON;
COX, 2008).
Figura 7 - Estrutura química do α-Tocoferol.
Fonte: Adaptado de LEHNINGUER; NELSON; COX, 2008.
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O α-tocoferol é o antioxidante natural mais abundante. Encontra-se em
vegetais, óleos, sementes, nozes, milho, soja, farinha de trigo integral, margarina e
em algumas carnes e laticínios (BAUMANN, 2004, GOMES; DAMAZIO, 2009;
CHAMPE; HARVEY; FERRIER, 2010).
Desta forma, o α-tocoferol tem sido extensivamente estudado em diversas
áreas do conhecimento, uma vez que desempenha papeis importantes na
reprodução e em mecanismos antioxidantes de tecidos animais e vegetais (GOMES;
DAMAZIO, 2009, SANTOS et al, 2011).
O α-tocoferol é um antioxidante solúvel em lipídios primários da pele, desta
forma, associa-se a todos às estruturas que têm lipídios em sua composição:
membranas, lipoproteínas e depósitos de gordura, a qual protege as células do
estresse oxidativo (BAUMANN, 2004, GOMES; DAMAZIO, 2009; BAYNES;
DOMINICZAK, 2010). Os tocoferóis, quando expostos ao oxigênio molecular, evitam
a oxidação dos ácidos graxos altamente insaturados (LEHNINGER; NELSON; COX,
2008).
Com importante papel na função antioxidante de membrana, o α-tocoferol
está associado com a manutenção da estrutura lipídica (BAYNES; DOMINICZAK,
2000). A oxidação de gorduras insaturadas produz peróxidos de lipídios, que
interferem na estrutura e função das membranas biológicas. Sabe-se que o α-
tocoferol pode inibir a formação de peróxidos lipídicos, e possui um papel contra o
envelhecimento, particularmente da pele, já que a peroxidação lipídica em tecidos
poderia ser uma das causas do envelhecimento (GUIRRO; GUIRRO, 2002, KEDE;
SABATOVICH, 2004, LEONARDI, 2008).
“O α-tocoferol quebra a formação da cadeia de RL, reagindo com estes e
convertendo-os numa forma praticamente atóxica ou de fraca toxicidade”
(TIRAPEGUI, 2006). O radical tocoferil (Figura 8), o principal produto formado
durante a ação antioxidante da vitamina E, é reciclado pelo ascorbato. A tocoferil
quinona também é formada em baixas quantidades (BAYNES; DOMINICZAK, 2000).
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Figura 8 - Atividade antioxidante do α-tocoferol.
Fonte: BAYNES; DOMINICZAK, 2000.
Entretanto, existe uma notável ausência de dados publicados em estudos de
doses que definam uma porcentagem ideal para a utilização do α-tocoferol. Essa
deficiência pode ser atribuída a parâmetros do estudo mal definidos, bem como a
dificuldade de medir o estresse oxidativo in vivo (THIELE; EKANAYAKE-
MUDIYANSELAGE, 2007).
As concentrações de α-tocoferol em cosméticos podem variar de 0,1 a 2%
(KEDE, SABATOVICH, 2004) e até 5% (BATISTUZZO; ITAYA; ETO, 2006.) Na
Europa e nos EUA têm sido desenvolvidos e comercializados produtos com
concentrações de 0,0001%, usando essa abordagem, produtos contendo α-tocoferol
para o uso de enxaguar, em concentrações inferiores a 0,2%, conduzem
significativamente ao aumento dos níveis de vitamina E no estrato córneo da pele
humana, protegendo-a contra a peroxidação lipídica in vivo. Desta forma, produtos
contendo de 0,1 a 1% o α-tocoferol já demonstram aumento na proteção da pele
contra os danos oxidativos (THIELE; EKANAYAKE-MUDIYANSELAGE, 2007;
ZUSSMAN; AHDOUT; KIM, 2010).
Em estudo de revisão a aplicação tópica no rosto de creme contendo
α-tocoferol 5% a 8%, durante 4 semanas, observou-se uma diminuição da aspereza
da pele, comprimento de linhas faciais e rugas de profundidade, quando comparado
com placebo (KELLER; FENSKE, 1998).
A aplicação de α-tocoferol 30 minutos antes de tratamento com 12-O-
tetradecanoilforbol-13-acetato (10 nmol) inibiram a indução de peróxido de
hidrogênio, e peroxidação lipídica (LPO). Assim sendo, a α-tocoferol é
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particularmente abundante no estrato córneo da pele, protegendo as camadas
externas da pele contra os poluentes e luz UV. Estes resultados confirmam a
eficácia da α-tocoferol contra as primeiras respostas de estresse inflamatório e
oxidativo, sendo dessa forma uma ação quimiopreventiva da vitamina E em câncer
de pele (RAHMAN et al., 2008).
O α-tocoferol é importante na proteção contra a peroxidação lipídica da
membrana, pois é um antioxidante que reduz o eritema do fotoenvelhecimento, a
fotocarcinogênese, o edema e a hipersensibilidade cutânea associada com a
exposição à radiação ultravioleta B (UVB). (LUPO, 2001; GALLARDO, 2005;
AZULAY; BAGATIN, 2009; CASSANO et al., 2009). Esta redução nos níveis de RL
parece se correlacionar com uma redução no enrugamento da pele devido à
exposição à radiação UV crônica, podendo assim o α-tocoferol proporcionar
benefícios quando da sua aplicação tópica na pele humana através da redução ao
dano oxidativo (LANGE, BUETTNERB, 2001).
Um estudo demonstrou que a aplicação tópica, oclusiva pré-tratamento com
5% de α-tocoferol por 24 h inibiu a indução de macrófago humano, induzida por UV
na pele humana in vivo (CHUNG et al., 2002).
O α-tocoferol destaca-se na composição de formulações devido à sua
propriedade umectante e neutralizador de RL (PUGLIESE, 1988 apud LEONARDI;
GASPAR; CAMPOS, 2002). Ajuda a manter a elasticidade da pele, além de
melhorar a microcirculação cutânea. Após a exposição aos raios solares, aliviam e
acalmam a irritação e a inflamação, aumentando a eficácia dos protetores de
radiação solar (CUNHA, 2004). Ainda, a eficácia da ação do α-tocoferol é maior
quando há penetração destas substâncias antioxidantes em camadas mais
profundas do estrato córneo (SCOTTI, 2007).
Destacam-se ainda, os resultados obtidos com a aplicação tópica do α-tocoferol,
em estudos realizados em laboratório e clínicas, indicando que o uso pode beneficiar
no combate a várias doenças de pele, especialmente para ajudar prevenir, retardar
ou impedir certas mudanças degenerativas associadas ao processo de
envelhecimento, como a pele seca e escamosa, e a formação de rugas (ALMEIDA,
2008).
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Baumann (2004) relata que o α-tocoferol parece oferecer uma área
equilibrada para pesquisa, em seu potencial para benefícios terapêuticos, na
prevenção e no tratamento do fotoenvelhecimento. “A aplicação tópica de
combinações de antioxidantes pode resultar em uma capacidade antioxidante
mantida da pele por causa das ações sinérgicas de combinações de antioxidantes”.
Estudos demonstraram que a associação de vitaminas e seus derivados em
cosméticos podem melhorar o seu desempenho. Além disso, testes laboratoriais e
clínicos demonstram evidência de que estas vitaminas, em níveis adequados, têm
importante papel nos processos protetores, corretivos e de renovação da pele
(IDSON, 1994 apud ALMEIDA, 2008).
Além disso, a aplicação de ativos cosméticos com atividade antioxidante pode
fazer a diferença em peles com e sem cuidados, sendo que o estímulo dérmico e
epidérmico, direto ou indireto, melhora a rugosidade da pele (RIBEIRO, 2010).
2.6 Iontoforese
O uso da corrente elétrica com fins terapêuticos, remota de uma longa
trajetória de utilizações, mesmo em tempos em que essa energia era desconhecida
por seus adeptos. O início da utilização da corrente elétrica pode ser ilustrado de
forma muito natural, onde o agente gerador nada mais era do que um peixe capaz
de produzir uma descarga efetiva relatada como analgésica. Entre as espécies tem-
se peixe „gato‟ da família Malapteruridae, o bagre elétrico do Congo e Nilo
classificado como Malapterus electricus. O relato faz referência a Galeno (200 -130
a.C) e ao médico Scribonius Largus (10 a.C e 54 d.C) que indicavam aos pacientes
portadores de gota (AGNE, 2004; AGNE, 2009).
A iontoforese, termo grego que significa transferência iônica, caracteriza-se
como técnica não invasiva, que usa potencial ou corrente elétrica, para promover de
maneira controlada, o aumento da transferência transdermal de uma variedade de
fármacos (GUIRRO; GUIRRO, 2004; FERREIRA et al., 2007). É uma técnica
utilizada como meio de administração de fármacos (ANSEL; POPOVICH; ALLEN Jr.,
2000).
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Pivati descreveu o método de iontoforese em 1747, ao tentar administrar
medicamentos por via transcutânea com ajuda de uma máquina elétrica de corrente
contínua (galvânica), porém, seu uso na administração de fármacos se tornou
popular através de Leduc, após publicação de alguns trabalhos, quando demonstrou
que íons eram transferidos através de eletrodos para a pele pela ação da corrente
elétrica contínua, e comprovou-se que essa transferência era polo orientado, ou
seja, dependia da polaridade do íon e do eletrodo sob o qual era colocado. O
experimento de Leduc mais conhecido foi o uso de drogas letais, como: estricnina
(+) e cianeto (-) em coelhos (LEDUC, 1908 apud OLIVEIRA, 2005; ANGNE, 2009).
Para tal experimento utilizaram dois coelhos denominados “A” e “B”. No
coelho “A”, acoplou-se o eletrodo de polo positivo da corrente galvânica (ânodo) e
sob este colocou-se sulfato de estricnina, que possui polaridade positiva. No coelho
“B”, acoplou-se o eletrodo de polaridade negativa (cátodo), e sob este, cianeto de
potássio, que possui polaridade negativa. Para o fechamento do circuito, foram
colocados eletrodos ligando os coelhos, tendo sob os eletrodos água. Um período
após a aplicação, o coelho “A” apresentou convulsões tetânicas com espasmos que
o levaram à morte, e o coelho “B” morreu de envenenamento por ácido cianídrico. O
experimento foi reproduzido por Leduc invertendo a polaridade da corrente
galvânica, e os coelhos nada sofreram (GUIRRO; GUIRRO, 2002; OLIVEIRA;
GUARATINI; CASTRO, 2005; AGNE, 2009; BORGES, 2010).
Outro, assim, foi repetido em uma experiência realizada por Leduc no século
XX, na qual confirmam o aumento da penetração de fármacos (sulfato de estricnina)
ionizáveis por iontoforese quando comparada ao transporte passivo isolado
(FERREIRA et al., 2007).
No processo iontoforético, a corrente é apropriada para a aplicação
transdérmica de substâncias terapêuticas, devido à capacidade de influenciar na
movimentação dessas substâncias quando apresentam características iônicas
(BORGES, 2006). “O transporte das moléculas carregadas é dirigido por repulsão
elétrica do eletrodo motriz. No entanto, moléculas polares neutras também podem
ser liberadas por um fluxo de água convectivo induzido por corrente (eletroosmose)”
(AULTON, 2005).
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Parte-se do princípio da física em que: “cargas iguais se repelem, e cargas
diferentes se atraem” (Figura 9). Assim, os íons são carregados com cargas elétricas
negativas ou positivas, e são repelidos para o interior da pele quando o eletrodo
colocado sobre ele apresentar a mesma carga elétrica. Os efeitos terapêuticos
podem ser influenciados, pela concentração, intensidade da corrente e duração da
aplicação (ROBINSON; SNYDER-MACKLER; PRATI, 2002; LEONARDI, 2008).
Figura 9 - Esquema de transferência de íons durante a iontoforese. (A) Íons positivos são conduzidos para longe do ânodo. (B) Íons negativos são conduzidos para longe do cátodo.
Fonte: Adaptado de FIALHO; CUNHA, 2004.
Os mecanismos envolvidos na transferência transdermal por iontoforese são:
(1) a eletrorrepulsão, gerada pela interação fármaco–campo elétrico, que provê força
adicional para direcionar íons de polaridade semelhante a do eletrodo sob o qual são
colocados, ou seja, o movimento ordenado de íons na presença de uma corrente
elétrica aplicada ao meio; (2) a eletroosmose se refere ao fluxo de volume de
solvente e movimentação de cargas quando uma diferença de potencial elétrico é
aplicado na pele (OLIVEIRA; GUARANTINI; CASTRO, 2005; GRATIERI; GELFUSO;
LOPES, 2008).
Desta forma, o transporte por iontoforese depende de uma força
eletromotivada que repele íons de um eletrodo de mesma carga e os faz migrar para
um eletrodo de carga oposta (FIALHO; CUNHA JÚNIOR, 2004; BORGES 2006).
Assim, para que ocorra a transmissão de íons para a membrana, deve-se colocar o
fármaco de mesma polaridade sob o eletrodo (BORGES, 2006).
Ainda, destaca-se a amplitude da corrente, na qual deve ser considerados
fatores tais como: tolerância do paciente, polaridade do eletrodo ativo, tamanho do
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eletrodo e a duração do tratamento. A duração de tempo da aplicação da iontoforese
varia de acordo com o estudo (ROBINSON; SNYDER-MACKLER; PRATI, 2002).
Entretanto, a densidade da corrente é a magnitude da corrente aplicada (em
miliampéres), dividida pela área de superfície condutora do eletrodo (em cm²). No
entanto, sugere-se não exceder a dose de segurança de 5 mA, e o tempo de
aplicação total deve ser aumentado proporcionalmente, respeitando o limite de 100
mA/min. Assim os parâmetros acima descritos devem ser respeitados a fim de
minimizar a irritação da pele e as queimaduras (ROBINSON; SNYDER-MACKLER;
PRATI, 2002; BORGES, 2010).
Destaca-se ainda, que os efeitos das substâncias iontoforizadas poderão ser
locais (sob o eletrodo) ou sistêmicos, pois após a transferência, a substância irá se
misturar através dos tecidos por meio da corrente sanguínea. Salienta-se que
apesar de ser possível efeitos sistêmicos por meio da iontoforese, na prática, o
principal objetivo da iontoforese é a ação em nível superficial (LOW; REED, 2001;
BORGES, 2010) Ainda, em tempos curtos de tratamento, efeitos adversos
sistêmicos são eliminados, em virtude da pequena quantidade de fármaco que
atinge a corrente sanguínea (LAI; ROBERTS apud FIALLHO; CUNHA JÚNIOR,
2004) .
Todavia, a utilização de recursos físicos para a permeação de fármacos
resultará em melhor desempenho do cosmético aplicado, disponibilizando-o em
maiores concentrações no tecido alvo de sua atuação, assim, são fundamentais
experimentos nos quais se comprove a eficiência de métodos de permeação de
fármacos, nos quais são fundamentadas teorias que descrevam a penetração de
ativos através da pele (SILVA; GUEDES; PIRES, 2012).
Desta forma, os principais benefícios da iontoforese são: aumento da eficácia
terapêutica; rápido início de liberação do fármaco na pele; possibilidade de
tratamento para várias patologias, tais como: envelhecimento, acne, celulite, entre
outras; não apresenta agressões digestivas; seu efeito é local, possível efeito geral
segundo o composto e a quantidade introduzida; aplicação indolor; permite
aplicações repetidas por várias sessões (ROBINSON; SNYDER-MACKLER; PRATI,
2002; FIALLHO; CUNHA JÚNIOR, 2004; FERREIRA 2007; AGNE, 2009).
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Por outro lado, as maiores desvantagens da aplicação da iontoforese são:
risco de queimaduras e choques resultantes da utilização de correntes elétricas
elevadas e por longos períodos; quando a pele se apresenta sem continuidade,
perda de sensibilidade, sensibilidade ao fármaco administrado e sensibilidade à
corrente (ROBINSON; SNYDER-MACKLER; PRATI, 2002; FIALHO; CUNHA
JÚNIOR, 2004; FERREIRA 2007).
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3 MATERIAIS E MÉTODOS
O presente trabalho tem caráter qualitativo e quantitativo experimental,
realizado nos laboratórios do Núcleo de Eletrofotoquímica e Materiais Poliméricos –
NEMP da UNIVATES, e foi dividido em duas partes: na avaliação eletroquímica a
partir de experimentos in vitro, onde foram analisados experimentos de voltametria
cíclica de sistemas contendo α-tocoferol em gel fluido; na avaliação de permeação e
liberação in vitro de α-tocoferol em gel fluido em sistema de difusão vertical, ambos
os experimentos realizados em amostras com e sem submissão à iontoforese.
3.1 Reagentes
Para a realização das análises foram preparadas amostras contendo 1 % de
α-tocoferol (liquido) produzido pelo laboratório SIGMA-ALDRICH® (Apêndice A), grau
de pureza >96%, lote 091M1311V, com data de fabricação 27/09/2011 e com
validade até 30/08/2014; gel condutor de hidroxietilcelulose 2%, com a formulação
contendo: natrosol 2%, nipagim 0,1%, água destilada 100 % (Apêndice B),
manipulado na Farmácia de Manipulação Bassegio, com data de fabricação
17/01/2013 e com validade de 6 meses, posteriormente foi adquirido mais 1 lote,
com data de fabricação 21/06/2013 com validade de 6 meses, e Hexano P. A.
Nuclear®.
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3.2 Comportamento eletroquímico do α-tocoferol
Utilizou-se a técnica de voltametria cíclica para o estudo do comportamento
eletroquímico do princípio ativo α-tocoferol com e sem a aplicação de iontoforese.
Os voltamogramas cíclicos foram registrados na faixa de potenciais de -0,3 a +1,2 V
em uma velocidade de varredura de 10 mV/s. Todas as medidas foram realizadas
em um sistema de 3 eletrodos, em que um fio de platina era o contra-eletrodo e um
fio de prata revestido com cloreto de prata era usado como referência. Como
eletrodo de trabalho utilizou-se uma placa de platina, com área superficial de 0,385
cm2. As medidas foram realizadas em um potenciostato/galvanostato PGSTAT128N
(AUTOLAB/Ecochemie, Figura 10), sendo que todos os experimentos foram
realizados à temperatura ambiente em meio de gel hidroxietilcelulose, em função da
baixa solubilidade do α-tocoferol. Entre os ensaios, os eletrodos foram limpos com
água deionizada e submetidos a um pré-tratamento, que consistia em flambar os
eletrodos de trabalho e auxiliar, e depois realizar uma varredura cíclica de -0,2 a
+1,35 V em ácido sulfúrico 0,1 M a 10 mV/s.
Figura 10 - Célula Eletroquímica
Fonte: Autor
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3.3 Análise de liberação e permeação in vitro do α-tocoferol em sistema de
difusão vertical
As análises de liberação e permeação do α-tocoferol foram realizadas em
uma célula de difusão vertical tipo Franz, com solução receptora de hexano P. A.
(Nuclear®) (Figura 11). A utilização desta solução receptora justifica-se pela
necessidade de solubilidade adequada do princípio ativo no meio receptor (FDA,
1997), sendo o α-tocoferol lipofílico (ROZMAN et al., 2009a). Este sistema continha
uma membrana de acetato de celulose (Sartorius Stedim Biotech com porosidade de
0,45 μm) ou biomembrana de muda de pele de cobra (Boa constrictor), cedida pelo
Museu de Ciências Naturais da Univates. A área exposta de ambas as membranas
foi de 7,06 cm², sendo este valor utilizado na determinação do fluxo (J) de liberação
para consequente determinação do coeficiente de permeabilidade calculado a partir
do J no estado estacionário versus a concentração de α-tocoferol do compartimento
doador conforme equação 1 (NETZ; ORTEGA, 2002).
p doador/K J C
(1)
A referida membrana tem como finalidade separar o compartimento doador do
receptor, ou seja, formar uma barreira não interferente a um fluido denominado
receptor (NETZ; ORTEGA, 2002). Ressalta-se ainda que as peles de muda de cobra
foram reidratadas por 48 horas em solução de azida sódica na concentração de
0,0002% (NUNES et al., 2005).
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Figura 11- Esquema do sistema utilizado com a célula de difusão tipo Franz.
Fonte: Autor
A célula de difusão foi introduzida no sistema de dupla camisa acoplada ao
banho termostatizado a 37 ºC, simulando a temperatura corporal conforme mostra
na Figura 12. Em contato com a membrana foi adicionado o agente acoplador, gel
hidroxietilcelulose + α-tocoferol 1%. As alíquotas da célula de difusão foram retiradas
em tempos de 2, 6, 10 e 12 minutos, com e sem a aplicação de iontoforese. Após,
foram realizadas análises de varreduras espectrofotométricas (190 a 990 nm), para
a quantificação do substrato na solução receptora, e o comprimento de onda
avaliado foi de 278 nm. Os resultados foram obtidos através de um
Espectrofotômetro Perkin Elmer UV/VIS Spectrometer Lambda 25. Para a
determinação da concentração liberada e permeada das amostras analisadas, foi
construída curva de calibração, a partir de soluções de α-tocoferol nas seguintes
concentrações: 0,09054 µmol L-1, 0,36277 µmol L-1, 0,725546 µmol L-1 e 1,4510
µmol L-1 (Figura 13). Através destes valores obteve se a equação da reta, sendo que
a curva obtida foi: y= -0,002002 + 547,36573x, com coeficiente de correlação
R = 0,97385. A partir da concentração liberada também foi possível determinar o
fluxo de liberação do α-tocoferol por hora para calcular o coeficiente de
permeabilidade (Kp). Todas as amostras foram analisadas com e sem a aplicação da
iontoforese em triplicatas. Na avaliação foi utilizado o teste t, com o auxílio do
software Graphpad Prism®.
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Figura 12 - Sistema de difusão utilizado nos experimentos de liberação permeação.
Fonte: Autor
Figura 13 – Curva de calibração, da solução de α-tocoferol nas concentrações de: 0,09054 µmol L-1, 0,36277 µmol L-1, 0,725546 µmol L-1 e 1,4510 µmol L-1.
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3.4 Aplicação da Iontoforese in vitro
A aplicação de iontoforese in vitro foi realizada com o auxílio de um
equipamento de iontoforese clínico AF5 Tone Derm (Figura 14), cedido pelo
Laboratório de Estética e Cosmética da UNIVATES, sendo que este foi acoplado ao
sistema de difusão vertical, em banho a 37°C em sistema de dupla camisa. Os
eletrodos utilizados nas aplicações in vitro eram de carbono (0,5 cm²) e os
parâmetros seguiram as prescrições da literatura para a prática clínica (BORGES,
2010): frequência de 600 Hz, corrente de 200 µA, polaridade positiva e tempos de 0,
2, 6, 10 e 12 minutos de aplicação, em sistemas contendo gel de hidroxietilcelulose
e gel de hidroxietilcelulose/α-tocoferol.
Figura 14 - Equipamento de iontoforese utilizado nos experimentos.
Fonte: Autor.
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4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Comportamento eletroquímico do α-tocoferol em sistema associado à
iontoforese
Para a realização dos ensaios de caracterização eletroquímica do α-tocoferol,
obteve-se os voltamogramas cíclicos do gel de hidroxietilcelulose com e sem a
adição de 1% de α-tocoferol (Figura 15).
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Figura 15 - Voltametria cíclica de eletrodo de platina em sistema contendo gel de
hidroxietilcelulose (linha tracejada), e este acrescido de α-tocoferol 1% (linha
contínua), v = 10 mV/s.
-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
i /
mA
E/V vs. Ag/AgCl
Com base na avaliação da figura 15, verifica-se que o sistema contendo
somente o gel de hidroxietilcelulose apresenta um comportamento
eletroquimicamente ativo, com pico de oxidação irreversível em 0,80 V, o que é
característico de sistemas contendo parabenos (GIL et al., 2012). Neste caso, o
metilparabeno é um constituinte do hidrogel estudado, sendo utilizado como
conservante antimicrobiano. Com a adição de α-tocoferol, há o aumento da corrente
anódica em função de sua oxidação. Aliado a isto, observa-se uma leve diminuição
no valor do potencial de pico quando comparado ao gel de hidroxietilcelulose apenas
(DIAZ et al., 2004; BARUS et al., 2012). Assim, o potencial de pico de oxidação do
sistema é deslocado para 0,78 V em função da presença do α-tocoferol.
Posteriormente, testou-se o efeito da iontoforese sobre o sistema. Assim,
obtiveram-se os voltamogramas cíclicos do gel de hidroxietilcelulose com a adição
de α-tocoferol 1% após a aplicação da iontoforese nos tempos de 0, 2, 6, 10 e 12
minutos (Figura 16). Com base na figura, é possível tecer alguns comentários sobre
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a atividade eletroquímica do α-tocoferol em meio hidrogel condutor após a aplicação
de corrente elétrica. Com o uso da iontoforese, verifica-se o decréscimo da altura
dos picos de oxidação em função do tempo de aplicação, assim como o
deslocamento do pico para potenciais mais positivos após os primeiros seis minutos.
Figura 16 - Voltametria cíclica de eletrodo de platina em sistema contendo gel de hidroxietilcelulose acrescido de α-tocoferol 1% nos diferentes tempos estudados: a: 0 min; b: 2 min; c: 6 min; d: 10 min e e: 12 min, v = 10 mV/s.
-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
ed
cb
i /
mA
E/V vs. Ag/AgCl
a
Como esperado, o sinal de corrente do α-tocoferol decai com o tempo, já que
parte dele é permeado através da membrana em função da aplicação da
iontoforese, o que posteriormente também será observado nas análises de liberação
do α-tocoferol. No entanto, não se verifica tal efeito ao se analisar a carga que passa
através do sistema, observando-se um valor quase constante em torno de
9,79 (± 0,05) × 10-5 C, independente do tempo de aplicação estudado. De fato,
analisando a figura 16, observa-se uma diminuição da altura do pico e seu
consequente alargamento. Acredita-se que parte do α-tocoferol está sendo
degradada pela ação da iontoforese, e que seu produto de degradação esteja sendo
oxidado no eletrodo de platina num potencial muito próximo ao do α-tocoferol. Outro
fato que corrobora essa afirmação baseia-se no aparecimento de um pequeno pico
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de redução em torno de -0,1 V nas amostras submetidas à iontoforese por 6 e 10
minutos, o que evidencia que não tem-se mais apenas α-tocoferol sendo oxidado no
eletrodo, uma vez que este não apresenta pico de redução ao se realizar a
varredura de potencias no sentido negativo. De fato, Zhang e Zhu (1995) mostraram
que a quinona que se forma como produto final da oxidação do α-tocoferol apresenta
um par redox em torno de -0,8 V (vs Ag/AgCl) e um pequeno pico de oxidação em
+0,3 V, causado pela oxidação do α-tocoferol. Além disso, os autores mostram que
na oxidação do α-tocoferol até a sua respectiva quinona, há a formação de quatro
intermediários, sendo que a iontoforese pode ser a responsável pela formação de
tais intermediários. Continua-se a observar no tempo de 12 min um decréscimo do
pico de corrente em função do tempo de aplicação, não é mais observado o pico de
redução, mas uma possível oxidação do α-tocoferol pode continuar ocorrendo, em
virtude do tempo de aplicação da iontoforese sobre o sistema.
A semelhança observada sobre os picos de α-tocoferol e α-tocoferol com
aplicação de iontoforese no mesmo potencial e respectiva escala, mas com
intensidade de corrente diferentes, sugere que a mesma reação eletroquímica
ocorre naquela região em ambos os casos (GIACOMELLI et al., 2004).
Para verificar se o alargamento dos picos da figura 16 não se devia ao próprio
sinal eletroquímico do gel de hidroxietilcelulose, ao invés de um possível produto de
oxidação do α-tocoferol, registrou-se os voltamogramas cíclicos do gel após a
aplicação da iontoforese por 0, 2, 6, 10 e 12 minutos. Os voltamogramas indicam
que o alargamento dos picos não se deve ao gel, uma vez que o sinal de oxidação
do metilparabeno presente no gel decai em quase toda a sua totalidade após 10 e
12 minutos de aplicação (Figura 17). Consequentemente, o deslocamento do pico de
oxidação, assim como o seu alargamento, se devem à presença de um subproduto
da oxidação do α-tocoferol.
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Figura 17 - Voltametria cíclica de eletrodo de platina em sistema contendo gel de hidroxietilcelulose com aplicação de iontoforese nos tempos: a: 0 min; b: 2 min; c: 6 min; d: 10 min e e:12 min, v = 10 mV/s.
-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
ed
c
b
i /
mA
E/V vs. Ag/AgCl
a
4.2 Determinação da quantidade liberada de α-tocoferol em sistema de
difusão vertical
Após a avaliação eletroquímica, foram realizados experimentos de liberação
em sistemas de difusão vertical, com o intuito de avaliar variações no coeficiente de
permeabilidade em sistemas com e sem aplicação de iontoforese.
As Figuras 18 e 19 representam, respectivamente, a curva da quantidade
liberada de α-tocoferol dos ensaios de difusão sobre a membrana de acetato de
celulose, de sistemas com e sem aplicação de iontoforese. Os resultados obtidos,
para o estudo realizado, com membrana de acetato de celulose indicam que o fluxo
de partículas é proporcional ao gradiente de concentração, conforme a primeira lei
de Fick.
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Figura 18 - Quantidade liberada de α-tocoferol em função do tempo (horas) em sistemas de difusão vertical contendo gel de hidroxietilcelulose/α-tocoferol.
0,00 0,05 0,10 0,15
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Quan
tidad
e L
iber
ada
/ m
mol
L-1 c
m-2
Tempo / horas
Figura 19 - Quantidade liberada de α-tocoferol em função do tempo (horas) em sistemas de difusão vertical contendo gel de hidroxietilcelulose/α-tocoferol associado à iontoforese.
0,00 0,05 0,10 0,15
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
Quan
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e L
iber
ada
/ m
mol
L-1 c
m-2
Tempo / horas
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Para a obtenção dos parâmetros de liberação no sistema analisado, utilizou-
se a lei de Fick, seguindo-se o modelo de dose infinita, em que o gradiente de
concentração é constante, e consequentemente a concentração de fármaco do
compartimento doador também o será (SILVA et al., 2009). Foi utilizado somente o
intervalo de tempo com resposta linear, desta forma o tempo 12 minutos não foi
utilizado nos estudos de liberação, pois foi observado uma tendência de
estabilização de quantidade liberada de α-tocoferol após 10 minutos de
experimento, podendo indicar o decréscimo de liberação em função das
características do sistema em estudo.
Com base nos estudos de liberação em sistemas de difusão vertical, obteve-
se as curvas y= 1,33605x+0,03945, cujo coeficiente de correlação é R = 0,97269
para experimento sem a aplicação de iontoforese (grupo controle), e a curva
y= 2,14661x+0,0585, com R = 0,9860 para sistemas submetidos à iontoforese. Os
resultados de fluxo a partir dos ensaios de liberação sem e com a aplicação de
iontoforese foram, respectivamente, de 1,33605 µmol L-1 cm-2 h-1 e
2,14661 µmol L1cm-2 h-1.
Comparando estes valores de fluxo encontrados, com outro trabalho
publicado (ROZMAN et al., 2009a), têm-se que, em termos de liberação de α-
tocoferol, em membranas de acetato de celulose, os valores são da mesma ordem
de grandeza, sendo os mesmos dependentes da formulação que contém o princípio
ativo estudado.
A partir dos resultados de fluxo, foram calculados os coeficientes de
permeabilidade para o grupo controle e para o grupo com aplicação de iontoforese
conforme figura 20.
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Figura 20 - Coeficiente de permeabilidade do α-tocoferol sobre a membrana de acetato de celulose sem (controle) e com aplicação de iontoforese.
Através dos resultados obtidos, tem-se que o coeficiente de permeabilidade
do α-tocoferol sem e com aplicação de iontoforese foi, respectivamente,
48,1483 cm-2h-1 e 98,81578 cm-2h-1, apresentando diferença estatisticamente
significativa (t = 4; p = 0,01).
Desta forma, verifica-se que a aplicação de iontoforese in vitro promove o
aumento do fluxo e do coeficiente de permeabilidade do α-tocoferol em meio gel de
hidroxietilcelulose, sendo o meio extremamente importante na liberação do ativo
para o meio, bem como na manutenção de sua estrutura e propriedades (CASSANO
et al., 2009).
Em estudos realizados, utilizando a técnica de iontoforese como
potencializador de permeação e liberação de fármaco obtiveram-se resultados
satisfatórios garantindo índices terapêuticos adequados e níveis de concentração
superiores à difusão passiva, suficientes para desencadear os efeitos terapêuticos
desejados (FIALHO; CUNHA JÚNIOR, 2004; NUGROHO et al., 2004; OLIVEIRA;
GUARANTINI; CASTRO, 2005).
Em outro estudo, também utilizando a técnica de iontoforese, obteve-se um
aumento de 6 vezes da quantidade de minoxidil sulfato retida nos folículos já nas
primeiras 3 h de aplicação, garantindo assim, que grandes quantidades do fármaco
atingissem seu local de ação mais rapidamente de quando as partículas fossem
aplicadas passivamente sobre a pele (GELFUSO, 2009).
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Observa-se em estudo utilizando hidrogéis e lipogéis como veículos contendo
vitamina E para utilização, após exposição solar e como tratamento
antienvelhecimento, obtiveram-se adequadas propriedades organolépticas
(consistência e espalhabilidade) e adequada liberação cinética, tornando-se esses
veículos compatíveis para associação com a vitamina E tópica (GALLARDO;
MUÑOZ; RUÍZ, 2005).
Diante dos resultados obtidos, percebe-se que há um aumento do fluxo e do
coeficiente de permeabilidade, devido à aplicação da iontoforese in vitro, sendo este
um aspecto positivo para a prática clínica.
Os resultados encontrados no presente trabalho são corroborados por outros
autores, que também observaram que a iontoforese constitui uma alternativa para
potencializar a penetração de fármacos, para via tópica, garantindo índices
terapêuticos adequados e níveis de concentração superiores à difusão passiva,
suficientes para desencadear os efeitos terapêuticos desejados (FIALHO; CUNHA
JÚNIOR, 2004; NUGROHO et al., 2004; OLIVEIRA; GUARANTINI; CASTRO, 2005).
Ainda, destaca-se que a estabilização ocorrida após o tempo de 10 minutos
pode ter gerado uma possível degradação da molécula de α-tocoferol. Para a
confirmação dos resultados, analisou-se o α-tocoferol em meio gel de
hidroxietilcelulose sobre uma placa de Petri, com aplicação de iontoforese nos
tempos de 10 e 12 min. Posteriormente, diluiu-se o material em 150 mL de hexano,
e realizou-se a análise espectofotométrica, conforme mostra a Figura 21.
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Figura 21- Aplicação de iontoforese em placa de Petri do α-tocoferol 1% associado ao gel de hidroxietilcelulose nos tempos de 10 e 12 minutos.
300 400 500 600 700
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
10 min
Abso
rbâ
ncia
/ u
.a.
Comprimento de onda (nm)
12 min
Observam-se na figura 21 valores próximos a 278 nm como a região de
absorbância máxima, para ambos os tempos, sugerindo assim que o processo
eletroquímico que ocorre é igual. No entanto, para o tempo de 10 min, observa-se
um incremento no pico de absorbância em 0,23 u.a., ao passo que no tempo de 12
min chega apenas a 0,04 u.a., observando assim uma oxidação para o α-tocoferol
em 12 min. Essa oxidação também é vista nas análises voltamétricas às quais
sugere que a oxidação pode estar acontecendo devido ao tempo de aplicação da
iontoforese.
Desta forma, entende-se que para uma definição dos produtos gerados pelo
antioxidante, necessita-se o conhecimento das condições e sistemas, bem como
uma metodologia específica para determinação (ALVES et al, 2010). Assim, as
principais formas de oxidação do α-tocoferol pode ser α-tocoferil quinona, 5,6-epoxi-
α-tocoferil quinona e 2,3-epoxi-α-tocoferil quinona que pode ser reduzido a α-
tocoferil hidroquinona (LIEBLER et al., 1996; BOTTI et al., 2004), ressalta-se ainda
que α-tocoferol pode estar sofrendo ações como: temperatura, corrente ou luz.
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Destaca-se, ainda, outro estudo realizado referente ao comportamento
voltamétrico do α-tocoferol em solventes orgânicos CH3CN e CH2Cl2, no qual mostra
a existência de formas oxidadas de vitamina E, que estão ligados ao material de
partida, através de uma série de reações de transferência de prótons e elétrons.
Uma dessas reações pode gerar a quinona que por sua vez pode ser reduzida
eletroquimicamente a hidroquinona (Figura 22), com pico de redução para quinona
em -1,2 V (YAO; PENG; WEBSTER, 2009), próximo ao pico observado na análise
voltamétrica.
Figura 22 - Oxidação do α-tocoferol.
Em outro estudo no qual utilizou-se a técnica de HPLC, foi feita a
quantificação simultânea do α-tocoferol e de seus produtos oxidativos finais, α-
tocoferol quinone, hidroquinona e epóxi tocoferol quinone (LERAY, 1998). Com o
objetivo de aumentar a estabilidade do α-tocoferol, a molécula pode ser oxidada ou
esterificada originando os derivados α-tocoferol-quinona e α-tocoferol-succinato
(SCOTTI, 2007).
4.3 Determinação da permeação in vitro de α-tocoferol em biomembrana de
Boa constrictor
Após a realização dos ensaios de liberação, foram realizados experimentos
de permeação do α-tocoferol, em células de difusão vertical, com biomembranas de
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Boa constrictor, em grupo controle e após aplicação de iontoforese. Na figura 23
tem-se a média e o desvio padrão da concentração permeada do princípio ativo sem
e com a aplicação de iontoforese, respectivamente, nos tempos 2 e 10 min. Estes
tempos utilizados nesta avaliação justificam-se por serem, respectivamente, o menor
e o maior tempo de aplicação de iontoforese, onde foi possível realizar estudos de
difusão (lei de Fick).
Figura 23 - Quantidade permeada do α-tocoferol com aplicação de iontoforese (branco) e sem aplicação de iontoforese (preto).
Avaliando os resultados apresentados na figura 23, verifica-se que para o
grupo controle há uma tendência de aumento da permeação, porém não há
diferença significativa para os tempos 2 e 10 minutos. Este fato pode ser devido à
utilização de biomembranas neste estudo, que não possuem uniformidade em
termos de espessura, simulando in vitro, a não uniformidade do estrato córneo
humano. Ainda, cabe ressaltar que a muda de pele de cobra Boa constrictor possui
similaridade em termos de propriedades de absorção de água, composição lipídica e
de permeação (NUNES et al., 2005; DUTRA et al., 2013). Nos ensaios de
permeação in vitro com aplicação de iontoforese, a quantidade permeada de α-
tocoferol para o tempo de 2 minutos foi de 0,2336 ± 0,03641 µmol L-1cm-2, e para o
tempo de 10 minutos foi de 0,3649 ± 0,01525 µmol L-1 cm-2, apresentando diferença
significativa, aplicando teste t entre estes tempos (t = 3; p = 0,02), indicando,
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portanto, que a aplicação de iontoforese promove um aumento de permeação,
principalmente em maiores tempos de aplicação de corrente.
Ainda, comparando os resultados de quantidade permeada de α-tocoferol em
biomembrana de muda de pele de cobra, com trabalhos publicados na literatura, que
estudam a permeação do ativo em pele de orelha de coelho (CASSANO et al., 2009)
e em orelha de suíno (ROZMAN et al., 2009a), verifica-se que os resultados
encontrados são da mesma ordem de grandeza quando comparados com os obtidos
para pele de orelha de suíno, em termos de quantidade retida na epiderme, sendo o
estrato córneo sua primeira camada, e em comparação aos estudos com pele de
coelho, os resultados são igualmente semelhantes, quando comparado
principalmente sistemas sem a aplicação de iontoforese.
Observa-se ainda em estudo realizado com a aplicação tópica de ácido
ascórbico associado à iontoforese, utilizando pele de rato como modelo de
membrana, concluiu-se que a liberação de ácido ascórbico teve um aumento de
permeação quando comparada ao experimento sem a aplicação de iontoforese
(EBIHARA et al., 2003).
Em estudo realizado com diferentes veículos para permeação das vitaminas
C e E, mostrou-se que o veículo pode interferir na incorporação de fármacos em
diferentes formulações e que as características de penetração e perfil de permeação
de um fármaco pode, por consequência, ser alterado (ROZMAN et al., 2009b).
Destaca-se ainda o papel do α-tocoferol como de estabilizador das bicamadas
lipídicas no estrato córneo, e um dos mais importantes inibidores da peroxidação
lipídica (GUIRRO; GUIRRO, 2002, KEDE; SABATOVICH, 2004, LEONARDI, 2008,
GUARATINI et al, 2007). Estudos demonstram que a vitamina E é o antioxidante
predominante da barreira fisiológica da pele humana (THIELE; EKANAYAKE-
MUDIYANSELAGE, 2007). Destaca-se assim a utilização da iontoforese como meio
para melhorar a eficácia da permeação tópica local do α-tocoferol (GRATIERI;
GELFUSO; LOPEZ, 2008).
Desta forma os resultados obtidos vão ao encontro de dados da litaratura,
onde observa-se que com o aumento do tempo há um incremento na concentração
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do ativo, sugerindo assim uma liberação mais acentuada do ativo para o meio, por
meio da aplicação da iontoforese.
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5 CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos, observa-se que o α-tocoferol possui um
comportamento eletroquimicamente ativo, com pico de oxidação em 0,78 V, em
meio contendo gel de hidroxietilcelulose. Com a aplicação da iontoforese ao sistema,
observa-se que o sinal de corrente do α-tocoferol decai com o tempo, já que parte
dele é permeado através da membrana em função da aplicação da iontoforese.
Observa-se também que essa diminuição da altura do pico é acompanhada pelo
alargamento do mesmo. Acredita-se que parte do α-tocoferol está sendo degradada
pela ação da iontoforese, e que seu produto de degradação esteja sendo oxidado no
eletrodo de platina num potencial muito próximo ao do α-tocoferol.
Por meio dos ensaios de liberação e permeação, verifica-se que com a
aplicação de iontoforese há um incremento de liberação de α-tocoferol para o meio
receptor, bem como em termos de permeação há uma tendência de aumento da
permeação com o aumento do tempo de aplicação de iontoforese, fator este
relevante para a prática clínica. Observa-se também após o tempo de 12 minutos de
aplicação de iontoforese uma possível oxidação para α-tocoferol, sendo este
resultado compatível com o encontrado em termos de análise voltamétrica.
A aplicação da iontoforese demonstrou eficiência no aumento de permeação
do α-tocoferol, comparada a condições normais, ou seja, na ausência de um
promotor físico. Assim, a permeação do α-tocoferol ficou limitada e restringida a
apenas algumas moléculas, sendo que com a utilização da iontoforese houve um
melhor desempenho do cosmético aplicado, disponibilizando-o em maiores
quantidades no tecido alvo de sua atuação.
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Ressalta-se, desta forma a promissora utilização da técnica de iontoforese,
como meio de aumentar a liberação de fármacos de forma segura e eficaz, prevendo
o seu potencial de liberação tanto para o meio transdérmico como para o meio
tópico. E a aplicação tópica do α-tocoferol com a aplicação da iontoforese em tempo
de 10 minutos mostrou-se eficiente a fim de permear no estrato córneo da pele a fim
de realizar seus efeitos antioxidantes.
Destaca-se assim a importância do estudo da permeação cutânea in vitro, a
qual nos permite estudar os parâmetros que influenciam desde a liberação do ativo e
do veículo para superfície cutânea, até sua difusão nas camadas da pele, além de
observar alterações estruturais no fármaco estudado de maneira prática e sem a
interferência de fatores biológicos.
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