CELLULE E RADIAZIONI - lnl.infn.itnewweb/images/Stage_2017/Stage_H.pdf · Vita cellulare Ciclo...

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Stage H – Cellule e radiazioni CELLULE E RADIAZIONI Stage H 1 Tutor: Roberto Cherubini, Viviana De Nadal Relatori: Giulia Bonello, Luca Calciolari, Linda Giora, Marco Pinamonti

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CELLULE E RADIAZIONI

Stage H

1

Tutor: Roberto Cherubini, Viviana De Nadal

Relatori: Giulia Bonello, Luca Calciolari, Linda Giora, Marco Pinamonti

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•Studiare la sopravvivenza delle cellule sottoposte a irraggiamento di radiazioni ionizzanti: raggi γ e protoni.

•Studiare i danni al DNA prodotti da raggi γ.

Scopo dell’esperienza

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Biologia cellulare

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DNA

Doppia elica Nucleotidi

Desossiribosio Gruppo fosfato Basi azotate

PURINE PIRIMIDINE

Adenina Timina

Guanina Citosina

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Vita cellulare

Ciclo mitotico

Ciclo cellulare

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Checkpoint

1° G1-S 2° G2-Mitosi

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Radiobiologia

Tipi di Radiazioni ionizzanti

Direttamente

Particelle α, β+

, β-

Protoni e ioni

Indirettamente

Raggi X, γ

Neutroni

Radiazioni indirettamente

ionizzanti

Radiazioni direttamente

ionizzanti

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Radiobiologia

Danni radio-indotti:

Molecolare

Subcellulare

Cellulare

Tessuto/organo

Intero corpo

al livello di DNA e RNA

alterazione delle strutture subcellulari

inibizione divisione cellulare / morte cellulare / cellule tumorali

possono portare a morte

morte o accorciamento della vita

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I esperienza: Valutazione della sopravvivenza cellulare tramite saggio clonogenico

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Descrizione della I esperienza

Si prepara una coltura cellulare

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Colture cellulari

Cellule isolate dal loro ambiente naturale e mantenute in un sistema definito

Coltura cellulare

Coltura primaria

Linea cellulare

Colture in monostrato

Colture in sospensione

Coltura cellulare utilizzata: V79 (fibroblasti di Hamster Cinese)

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Parametri chimico – fisici:

Temperatura -> 37° C

% di CO2 e O2

pH -> 7,4

substrato

Sostanze nutritive:

Terreno di coltura:

Terreno di base -> DMEM

Additivi -> siero fetale bovino

Mantenimento

Manipolazione

Controllo dello stato

Espansione

Sterilitá

Microscopi

Subcoltura

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Descrizione della I esperienza

Si prepara una coltura cellulare

Si irraggiano le cellule con due diverse sorgenti di radiazioni a diverse dosi

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Sorgente di Cobalto-60

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Sorgente di Cobalto-60 Caratteristiche:

Attività (07.06.2017) : 5.8 TBq

Energie g : 1.17 MeV e 1.33 MeV

T1/2 : 5. 27 anni

Simbolo:

Rateo di dose: 1 Gy/min; 17.2cm

6027Co

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Acceleratore CN

Linea di fascio di Radiobiologia

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Linea di fascio di Radiobiologia

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Grandezze dosimetriche

dm

dD

J/kg, Gy

Dose

dt

dDD Gy/min

Rateo di dose

dx

dELET keV/mm

Trasferimento lineare di energia

0

...

SFSFr

RX

D

DEBR

Efficacia biologica relativa

D0

SFXR

SF p

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Grandezze dosimetriche

QDH

Dose equivalente

Radiazione Fattore di peso Q

Fotoni ed elettroni

1

Protoni 2

Particelle α e ioni pesanti

20

Neutroni Da 2 a 20

Tessuto Fattore di peso wT

Midollo osseo, polmoni, seno

0.12

Gonadi 0.08

Tiroide, fegato, esofago

0.04

Pelle, cervello 0.01

Dose effettiva

T

T

T HwE Sv Sv

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Descrizione della I esperienza

Si prepara una coltura cellulare

Si irraggiano le cellule con due diverse sorgenti di radiazioni a diverse dosi

Si semina un numero definito di cellule, che varia a seconda della dose

Si lasciano in incubazione per 5 giorni

Si procede con il fissaggio e la colorazione dei cloni

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Fissaggio e colorazione

Colorante utilizzato: Violetto di Genziana

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Descrizione della I esperienza

Si prepara una coltura cellulare

Si irraggiano le cellule con due diverse sorgenti di radiazioni a diverse dosi

Si semina un numero definito di cellule, che varia a seconda della dose

Si lasciano in incubazione per 5 giorni

Si procede con il fissaggio e la colorazione delle popolazioni

Si contano le colonie sopravvissute

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Conteggio

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Descrizione della I esperienza

Si prepara una coltura cellulare Si irraggiano le cellule con due diverse sorgenti

radioattive a diverse dosi Si semina un numero definito di cellule, che varia

a seconda della dose Si lasciano in incubazione per 5 giorni Si procede con il fissaggio e la colorazione delle

popolazioni Si contano le colonie sopravvissute Si analizzano i dati per tracciare la curva di

sopravvivenza

Sta

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0 2 4

0.1

1

0 2 4

0.1

1

Su

rviv

ing

Fra

ctio

n (

S.F

.)

Dose (Gy)Dose (Gy)

Raggi-gamma, Co-60

Protoni, 28.5 keV/mm

1.0 2.6 0.68

RBE 2Gy,g 2.9

RBE 50% 2.6 0.62

0.50

Analisi dati

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II esperienza: Valutazione dei danni al DNA mediante Saggio della cometa

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Saggio della cometa Single-cell gel electrophoresis

Scopo: Valutare i danni subiti dal DNA delle cellule irraggiate con raggi γ

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Danni al DNA

Tipi di danno:

•Rotture a singolo filamento SSB

•Rotture a doppio filamento DSB

•Danno alle basi azotate

• Perdita di una base • Cambiamento di una base • Dimeri di pirimidine

•Cross-link DNA-DNA

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Mutazioni Mutazione: “Qualsiasi cambiamento che alteri la

costituzione chimica o fisica del DNA”

Mutazioni geniche Aberrazioni

Cromosomiche Cromatidiche Sostituzione Inserzione/ delezione

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Saggio della cometa Single-cell gel electrophoresis

Scopo: Valutare i danni subiti dal DNA delle cellule irraggiate con raggi γ

Procedimento • Si irraggia una popolazione di cellule V79 • Le cellule vengono separate dal terreno tramite centrifugazione • Si aggiungono le cellule al gel di agarosio low melting e si stendono sul vetrino • I vetrini vengono messi in soluzi0ne di lisi per 17h e poi in soluzione a pH 13 per 1h • Si procede con l’elettroforesi

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Elettroforesi

Voltaggio di 25 V

Corrente di 300 mA

20 minuti di corsa

Sfrutta la carica negativa del DNA

Buffer a pH 13

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Saggio della cometa Single-cell gel electrophoresis

Scopo: Valutare i danni subiti dal DNA delle cellule irraggiate con raggi γ

Procedimento • Si irraggia una popolazione di cellule V79 • Le cellule vengono separate dal terreno tramite la centrifuga • Si seminano le cellule sui vetrini immerse in agarosio low melting • I vetrini vengono messi in soluzi0ne di lisi per 17h e poi in soluzione a pH 13 • Si procede con l’elettroforesi • Colorazione e analisi fotografica delle “comete”

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Analisi fotografica

Colorante utilizzato: DAPI

Strumento: microscopio a fluorescenza

0.5 Gy Controllo 3 Gy

Testa

Coda

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Tutor: Roberto Cherubini,

Viviana De Nadal

Relatori: Giulia Bonello, Luca Calciolari, Linda

Giora, Marco Pinamonti

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le e

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iazi

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