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CELLULE E RADIAZIONI
Stage H
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Tutor: Roberto Cherubini, Viviana De Nadal
Relatori: Giulia Bonello, Luca Calciolari, Linda Giora, Marco Pinamonti
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•Studiare la sopravvivenza delle cellule sottoposte a irraggiamento di radiazioni ionizzanti: raggi γ e protoni.
•Studiare i danni al DNA prodotti da raggi γ.
Scopo dell’esperienza
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DNA
Doppia elica Nucleotidi
Desossiribosio Gruppo fosfato Basi azotate
PURINE PIRIMIDINE
Adenina Timina
Guanina Citosina
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Radiobiologia
Tipi di Radiazioni ionizzanti
Direttamente
Particelle α, β+
, β-
Protoni e ioni
Indirettamente
Raggi X, γ
Neutroni
Radiazioni indirettamente
ionizzanti
Radiazioni direttamente
ionizzanti
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Radiobiologia
Danni radio-indotti:
Molecolare
Subcellulare
Cellulare
Tessuto/organo
Intero corpo
al livello di DNA e RNA
alterazione delle strutture subcellulari
inibizione divisione cellulare / morte cellulare / cellule tumorali
possono portare a morte
morte o accorciamento della vita
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I esperienza: Valutazione della sopravvivenza cellulare tramite saggio clonogenico
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Descrizione della I esperienza
Si prepara una coltura cellulare
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Colture cellulari
Cellule isolate dal loro ambiente naturale e mantenute in un sistema definito
Coltura cellulare
Coltura primaria
Linea cellulare
Colture in monostrato
Colture in sospensione
Coltura cellulare utilizzata: V79 (fibroblasti di Hamster Cinese)
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Parametri chimico – fisici:
Temperatura -> 37° C
% di CO2 e O2
pH -> 7,4
substrato
Sostanze nutritive:
Terreno di coltura:
Terreno di base -> DMEM
Additivi -> siero fetale bovino
Mantenimento
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Descrizione della I esperienza
Si prepara una coltura cellulare
Si irraggiano le cellule con due diverse sorgenti di radiazioni a diverse dosi
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Sorgente di Cobalto-60 Caratteristiche:
Attività (07.06.2017) : 5.8 TBq
Energie g : 1.17 MeV e 1.33 MeV
T1/2 : 5. 27 anni
Simbolo:
Rateo di dose: 1 Gy/min; 17.2cm
6027Co
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Grandezze dosimetriche
dm
dD
J/kg, Gy
Dose
dt
dDD Gy/min
Rateo di dose
dx
dELET keV/mm
Trasferimento lineare di energia
0
...
SFSFr
RX
D
DEBR
Efficacia biologica relativa
D0
SFXR
SF p
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Grandezze dosimetriche
QDH
Dose equivalente
Radiazione Fattore di peso Q
Fotoni ed elettroni
1
Protoni 2
Particelle α e ioni pesanti
20
Neutroni Da 2 a 20
Tessuto Fattore di peso wT
Midollo osseo, polmoni, seno
0.12
Gonadi 0.08
Tiroide, fegato, esofago
0.04
Pelle, cervello 0.01
Dose effettiva
T
T
T HwE Sv Sv
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Descrizione della I esperienza
Si prepara una coltura cellulare
Si irraggiano le cellule con due diverse sorgenti di radiazioni a diverse dosi
Si semina un numero definito di cellule, che varia a seconda della dose
Si lasciano in incubazione per 5 giorni
Si procede con il fissaggio e la colorazione dei cloni
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Fissaggio e colorazione
Colorante utilizzato: Violetto di Genziana
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Descrizione della I esperienza
Si prepara una coltura cellulare
Si irraggiano le cellule con due diverse sorgenti di radiazioni a diverse dosi
Si semina un numero definito di cellule, che varia a seconda della dose
Si lasciano in incubazione per 5 giorni
Si procede con il fissaggio e la colorazione delle popolazioni
Si contano le colonie sopravvissute
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Descrizione della I esperienza
Si prepara una coltura cellulare Si irraggiano le cellule con due diverse sorgenti
radioattive a diverse dosi Si semina un numero definito di cellule, che varia
a seconda della dose Si lasciano in incubazione per 5 giorni Si procede con il fissaggio e la colorazione delle
popolazioni Si contano le colonie sopravvissute Si analizzano i dati per tracciare la curva di
sopravvivenza
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0 2 4
0.1
1
0 2 4
0.1
1
Su
rviv
ing
Fra
ctio
n (
S.F
.)
Dose (Gy)Dose (Gy)
Raggi-gamma, Co-60
Protoni, 28.5 keV/mm
1.0 2.6 0.68
RBE 2Gy,g 2.9
RBE 50% 2.6 0.62
0.50
Analisi dati
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II esperienza: Valutazione dei danni al DNA mediante Saggio della cometa
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Saggio della cometa Single-cell gel electrophoresis
Scopo: Valutare i danni subiti dal DNA delle cellule irraggiate con raggi γ
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Danni al DNA
Tipi di danno:
•Rotture a singolo filamento SSB
•Rotture a doppio filamento DSB
•Danno alle basi azotate
• Perdita di una base • Cambiamento di una base • Dimeri di pirimidine
•Cross-link DNA-DNA
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Mutazioni Mutazione: “Qualsiasi cambiamento che alteri la
costituzione chimica o fisica del DNA”
Mutazioni geniche Aberrazioni
Cromosomiche Cromatidiche Sostituzione Inserzione/ delezione
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Saggio della cometa Single-cell gel electrophoresis
Scopo: Valutare i danni subiti dal DNA delle cellule irraggiate con raggi γ
Procedimento • Si irraggia una popolazione di cellule V79 • Le cellule vengono separate dal terreno tramite centrifugazione • Si aggiungono le cellule al gel di agarosio low melting e si stendono sul vetrino • I vetrini vengono messi in soluzi0ne di lisi per 17h e poi in soluzione a pH 13 per 1h • Si procede con l’elettroforesi
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Elettroforesi
Voltaggio di 25 V
Corrente di 300 mA
20 minuti di corsa
Sfrutta la carica negativa del DNA
Buffer a pH 13
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Saggio della cometa Single-cell gel electrophoresis
Scopo: Valutare i danni subiti dal DNA delle cellule irraggiate con raggi γ
Procedimento • Si irraggia una popolazione di cellule V79 • Le cellule vengono separate dal terreno tramite la centrifuga • Si seminano le cellule sui vetrini immerse in agarosio low melting • I vetrini vengono messi in soluzi0ne di lisi per 17h e poi in soluzione a pH 13 • Si procede con l’elettroforesi • Colorazione e analisi fotografica delle “comete”
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Analisi fotografica
Colorante utilizzato: DAPI
Strumento: microscopio a fluorescenza
0.5 Gy Controllo 3 Gy
Testa
Coda