Orlab On-Line Mikrobiyoloji Dergisi Yl: 2003 Cilt: 01 Say: 09 Sayfa:1-33 www.mikrobiyoloji.org/pdf/702030901.pdf

Biyoplastik: Poli--Hidroksibtirat (PHB)1Mira Ylmaz2,Yavuz Beyatl3

Biyoplastik (PHB) ve nemiGnlk hayatmzn bir paras olan plastik rnler, kantlanm pek ok dezavantajlarna ramen; kolay ekil alma, elastikiyet, nakliyede rahatlk ve ucuzluk gibi nedenlerden dolay tercih edilen malzemeler olmulardr. Ancak, plastiin kullanlp-atlabilme zellii, imdiden evre kirlilii asndan en byk sorunlardan biri haline gelmitir (1). Her yl birka yzbin ton plastik denize atlr ve okyanusta birikir (2). Dnyada biriken yllk plastik miktar ise 25 milyon ton kadardr (3). Bu nedenle, son yllarda plastikler, ekolojik problemlerin kayna olarak karmza kmaktadrlar (2). 90'l yllarda 100 milyon tonun zerinde retilen ve 2000 ylnda bu rakamn 150 milyon ton olduu tahmin edilen sentetik polimerlerin, yerine kullanlabilecek baka bir malzeme tr olmad srece, evre ve insan salna getirecei ykler gittike artacaktr (4, 5, 6, 7). Petrolden elde edilen sentetik polimerler, plastik atk olarak doaya terk edildiklerinde, toprakta uzun sre paralanamadndan evre kirliliine ve toksik madde birikimine neden olmaktadrlar. Bu nedenle, biyolojik olarak paralanabilen polimerlerin retimi nem kazanm ve petrol kkenli polimerlerin yerini almalarna ynelik almalar artmtr (1, 5). 1970'li yllardaki petrol krizinden sonra petrol fiyatlarnn artmasna da bal olarak, petrol kkenli polimerlere alternatifler aranm ve 1976 ylnda, ngiltere'deki Imperial Kimya Endstrisi (ICI), bakteriyel fermentasyonla retilen poli-Beta-hidroksibtirat'la (PHB) ilgili aratrmalara balamtr (7).

1

Bu alma Gazi niversitesi Fen Bilimleri Enstits biyoloji Anabilim Dalnda Prof. Dr. Yavuz Beyatl danmanl altnda Mira Ylmaz tarafndan yaplan ve 2003 ylnda tamamlanan Topraktan zole Edilen Bacillus Cinsi Bakterilerin Baz Metabolik zelliklerinin Belirlenmesi, Plazmid DNA ve Protein Profillerinin ncelenmesi adl Doktora tezinden alnmtr. 2 Dr. r. Grv., Hacettepe niversitesi Eitim Fakltesi Ortaretim Fen ve Matematik Alanlar Eitimi Blm Biyoloji Eitimi ABD, Beytepe, Ankara. Yazmalardan sorumlu yazarn eposta adresi: mirac@hacettepe.edu.tr 3 Prof. Dr., Gazi niversitesi Fen-Edebiyat Fakltesi Biyoloji Blm Ankara.

1

Gnmzde, PHB gibi biyoparalanabilir, yenilenebilir, biyouyumlu ve doayla dost plastiklerin bakterilerde sentezi ve polimer kimyasndaki uygulamalar ile ilgili alnan olumlu sonularla biyoplastiklere olan ilgi her geen gn artmaktadr (7, 8). eitli aratrclar, biyoplastik retiminde bakteriyel biyoplastiklerin, gelecek uygulamalar iin kullanlabileceini bildirmektedirler (4, 9). Avantajl zelliklerinden yararlanmak ve endstriyel PHB retimi yapmak iin uygun sularn tespiti aratrmalarnda, Alcaligenes, Pseudomonas, Rhizobium, ve Bacillus cinsi gibi bakteri gruplar da yer almaktadr. almalarda, bu cinslere ait vejetatif bakteri hcrelerinin, dier metabolik rnlerin yansra poli--hidroksibtirat gibi metabolik materyaller de depoladklar bildirilmitir (10, 11, 12).

Poli--hidroksibtirat 'n (PHB) Tanm ve TarihesiBakteriyel plastik veya biyoplastik de denilen ve petrokimyasal plastiklerin neden olduu evresel kirlilie alternatif olarak ortaya kan poli--hidroksialkanatlar (PHA), geleneksel plastik potansiyeline sahip, mikrobiyal olarak retilen polimerlerdir (12, 13). PHA'larn bakterilerde, insandaki ya veya bitkilerdeki niasta gibi rol oynad bildirilmektedir (2, 14). Bir ok eidi bulunan PHA'lar, linear, uzun, 3-hidroksi ya asidi monomerlerinden ibaret, aktif mikrobiyal polyesterlerdir (12, 15). Bunlar iinde yer alan poli-Betahidroksibtirat (PHB), PHA'larn en yaygn ve geni kapsaml olarak allan tipidir ve polimerin bu snfna ticari ilginin domasna neden olan PHA'dr (15, 16). lk kez, Lemoigne tarafndan, 1920'li yllarda, topraktan izole edilen Bacillus megaterium bakterisinde bilinmeyen bir materyalin paralanmas sonucu rastlanlan 3-hidroksi btirik asit, poli-3-hidroksibtirat homopolyesteri (PHB) olarak tanmlamtr. Sonraki 30 ylda PHB polimerine olan ilgi giderek artm ve 1958 ylnda Macrae ve Wilkinson Bacillus hcresi iinde PHB sentezi ve paralanmasn ynlendiren hcre ii artlar ve mekanizmasn aratrmlardr (7, 12, 17). PHB ile ilgili aratrmalarla, termoplastik ve elastomerik bir materyal olduu anlalan polimer, patentli rnlere dnmtr (8). Biyoparalanabilir, termoplastik bir materyal olan PHB'n, petrol trevli plastiklerin yerini almak iin ticari olarak retimi almalar, 1960'l yllarda balam, ancak ilk endstriyel retimi 1970'li yllarda gereklemitir (12, 15, 17). retilen ilk ticari rn BIOPOL adyla patentlenmitir (18). Bu yllarda ngiltere'de Imperial Kimya Endstrisi (ICI) birok bakteriyel tr, potansiyel PHB retimi asndan incelemi ve endstriyel retimde, hcre kuru arlnn % 90' zerinde PHB biriktiren Alcaligenes eutrophus bakterisini kullanmaya balamtr (15). Daha sonraki yllarda PHB ile ilgili almalar Pseudomonas, Azotobacter, Hydrogenomonas, Chromatium, Bacillus vb. bakteri cinsleriyle devam etmi; PHB'n fiziksel ve kimyasal zellikleri, molekler arl, ekstraksiyon metodlar, metabolizmas, i-d paralanmas gibi ok ynl zellikleri incelenmitir (7, 12). 2

PHB'n Genel zellikleriHcre ii depo granl eklinde sentezlenen ve biriktirilen PHB, yapsnda ksa zincirli -hidroksi ya asitleri ieren, prokaryotlarn membranla evrili hcre ii depo maddesi olup, tekrarlanan hidrofobik birimlerden oluan uzun bir polimerdir (2, 8, 18, 19, 20). [-OCHCH2C-] n | || CH3 Oekil 1. D(-)-3-hidroksi btirik asit polimerinin kimyasal yaps

Yan zincirinde bir metil grubu bulunan, optike aktif D(-)-3-hidroksi btirik asidin makromolokler bir polimeri olan PHB'n genel forml (C4H6O2)n eklindedir (ekil 1). (n) says 35 000 gibi yksek bir sayya ulaabilir (4, 12, 15, 18, 21, 22)

Hcrede bir redoks dzenleyicisidir (12, 15, 18, 19, 21, 23, 24). Faz kontrast veya elektron mikroskobu (EM) kullanldnda, bakteriyel hcrelerde PHB granlleri kolaylkla gzlenebilir. PHB, genellikle kre eklinde olup, her granl ap olarak 100800 nm arasndadr. Bunlar 2-4 nm kalnlnda niter olmayan bir membranla evrilidir. Granllerin yaklak % 98'i PHB, % 2'si ise protein iermektedir (18, 25). Yaplan EM almalarnda, granln ite yer alan bir merkezi ksm ve birka tabakal membranla evrilmi kabukdan olutuu bildirilmitir (25). PHB'lar, polipropilen gibi petrol trevli yaygn plastiklere benzer materyal zellikler gsterirler (15). Ancak, bir termoplastik olan PHB'n sertlii, polietilene kyasla drt misli fazladr. Hcre iinde sv, atmosferde kat halde olan PHB, organik zc ile hcreden ztlendiinde kristalize olur (4, 15, 18). Kat ama krlgan bir materyal olan PHB'n erime scakl, 157-188 C olup, bu, polimerin termal olarak ayrt scakla yakndr. PHB termoplastik olduundan preslenip ekil verilebilir (4, 15, 18). PHB'n, UV malarna direnli olduu ancak, asit ve baz uygulamalarna kar zayf dirence sahip olduu bildirilmektedir. Ayrca, polimerin su ve hava geirmez oluu hidrolitik paralanmaya kar diren saladndan PHB'n kullanm olanaklar genilemektedir (8). Polimerin molekl arl, zellikle bakterinin trne bal olmakla birlikte, byme koullar ve hcrenin yaam dngsndeki yerine gre de deiebilir (25, 26). PHB moleklnn arlnn 60.0002.000.000 Da arasnda deitii bildirilmektedir (7). Taidi ve arkadalar (26), PHB'n molekler arlnn, karbon kayna olarak metanol kullanldnda Methylobacterium extorquens bakterisinde 0,6X106 Da, Alcaligenes eutrophus bakterisinde, 1,1X106 Da; sksinat kullanldnda ise M. extorquens bakterisinde 1,7X106 Da ve A. eutrophus bakterisinde 1,6SX106 Da molekler arlnda olduunu bildirmilerdir. PHB biyosentez genlerinin, kromozomda veya Plasmid DNA'da lokalize olduu bildirilmektedir (27). PHB'n, biyolojik paralanabilirlii, biyolojik uyum yetenei ve 3

toksik olmay sayesinde endstriyel uygulamalarda kolayca kullanlabilecei bildirilmektedir (28, 29).

PHB Oluum artlar ve TayiniAratrmaclar, PHB'n birok mikroorganizma tarafndan, uygun olmayan reme koullarnda oluturulduunu (18, 30) ve PHB birikiminin genellikle, fazlaca karbon kayna varlnda, ancak byme iin gerekli nitrojen kayna, oksijen ve esansiyel elementler (N, P, S, Mg, K, Fe vb.) gibi besleyici maddelerin eksikliinde gerekletiini bildirmektedirler (12, 16, 18, 19, 22, 23, 30, 31). Yaplan aratrmalarda, byme ve PHB biriktirimi arasnda yakn bir ilgi tespit edilmitir. Buna gre, bakteri geliiminin eksponansiyel faznda PHB birikimi artmakta, ge eksponansiyel-erken durgun dnemde ise maksimum dzeye ulamaktadr (22). Byme srasnda blnme olmayan hcrelerde de, PHB miktarnn yksek oranda artt bilinmektedir (3). Sporlu bakterilerde PHB birikiminin spor oluumundan hemen nce olduu ve sporulizasyonda enerji kayna olarak kullanld belirtilmektedir (21, 32). Yaplan bir almada, Rhizobium bakterilerinde, kltr ortamnn asitlemesine bal olarak hcre lmnn artt ve PHB ieriinin buna bal olarak dt bildirilmitir (33). UV spektrofotometrik olarak tayini yaplabilen PHB, hcreden ayrldnda, slfrik asitle krotonik aside dntrlerek, 235 nm dalga boyundaki absorbans llebilir (34). PHB'n hcrede tehisi ve konsantrasyonunun belirlenmesinde 1H NMR ve Gaz Kromatografisi analizi ve FTIR spektroskopi yntemi kullanlabilmektedir (30, 35, 36). Canl bakteri hcresi ierisindeki PHB depo granllerinin tespit edilmesi iin geni olarak kullanlan metotlardan biri de lipofilik boyalarla boyamadr. Bu amala Nil Blue A, Sudan Black B ve Sudan III gibi baz florosan boyalar kullanlabilir (37, 38, 39, 40).

PHB SenteziPolimerin biyosentezi, monomerlerin oluumu ve birletirilmesi gibi, iki enzimatik aama gerektirir. retim seviyesi, zincir uzunluu ve oluan kopolimerlerin kompozisyonu, bu enzimlerin performansna baldr (41). Hcre iinde PHB birikiminin artmas iin, yksek NAD(P)H, yksek asetil-CoA ve dk serbest CoA dzeyinin olmas gerekmektedir. Bu artlarn oluumu, mikroorganizmalara gre deimekle beraber genelde nitrojen, potasyum, slfr veya oksijenin snrlandrlmas gibi bymeyi snrlandrc etkenlere baldr (7). En kapsaml karakterize edilen polimer olan PHB'n biyosentezi, deiik enzim tarafndan katalize edilen, enzim reaksiyonundan olumaktadr (ekil 2). lk reaksiyon, iki Asetil-CoA moleklnn, -ketoail CoA tiolaz tarafndan, Asetoasetil 4

CoA'ya dntrlmesini iermektedir. kinci reaksiyon, Asetoasetil CoA'nn NADPH bal bir Asetoasetil CoA dehidrogenaz tarafndan, R-3 Hidroksibtiril CoA'ya indirgenmesidir. Son olarak, R-3 Hidroksibtiril CoA monomerleri PHB sentaz tarafndan, PHB'a polimerize olmaktadr. Asetil CoA ve 3-Hidroksibtiril CoA, PHB sentezindeki ara aralardr. Asetat ve PHB, Asetil CoA'nn konsantrasyonunu arttrabilir ve hcrede 3-Hidroksibtiril CoA ve 3H'n sentezini bundan dolay kolaylatrr (15).

Prokaryot hcrelerde PHB'n hcre ii sentezi iin balang bileii, Asetil CoA'dr. Substrat ve Asetil CoA'nn hcre ii konsantrasyonunun artmasyla oluan koullar, sentezde pozitif bir etkiye sahiptir. Bu ayn zamanda PHB sentezini basitletirmektedir Enzimatik olarak katalizlenen reaksiyonun dzenleyici mekanizma idaresi altnda olmas bunun nedeni olarak gsterilmektedir (18). ekil 2. PHB Sentezi (3)

PHB oluumunda ilk basama katalizleyen, -ketoail CoA tiolaz (phbA geni ile kodlanan), ail-CoA+asetil-CoA'daki substratlarn tiolitik ayrlmasn ieren enzim ailesinin bir yesidir. Yksek karyotlardan, mayalara ve prokaryotlara kadar doal olarak bulunurlar (15). Asetoasetil CoA dehidrogenaz (phbB geni ile kodlanan), bir R-3-hidroksiail CoA dehidrogenazdr ve 3-hidroksibtiril-CoA'y asetoasetil-CoA'ya eviren ikinci basama katalizler (15). PHB biyosentez yolunda, tiolaz ve dehidrogenaz enzimleri tarafndan katalizlenen reaksiyonlar, polimerizasyon iin monomer salar. Oluan bu R-3 Hidroksibtiril CoA monomerleri ise, PHB sentaz tarafndan (phbC ile kodlanan) PHB'a polimerize edilir (15). PHB granlleri ile sentaz enzimi polimerizasyonu arasndaki iliki yllardr bilinmektedir. Snrl karbonlu ortamda gelime srasnda, sentaz enzimi znm formda olumaktadr. Nitrojen azlnda ise PHB sentaz olumaktadr. znm sentazn bu artlar altnda hzla tkenmesi PHB granlleri ile ilikilidir (12).

5

PHA sentezinin anahtar enzimleri olan ve 3-hidroksiail-CoA substratlarnn PHA'lara dnmn katalizleyen PHA sentazlarn, 54 farkl eidi tayin edilmi ve klonlanmtr Alt nite kompozisyonu ve substrat zgllne bal olarak PHA sentazlar eit olarak ele alnr. I. Snf PHA sentazlar Alcaligenes eutrophus'dan, II. Snf PHA sentazlar Allochromatium vinosum ve III. Snf PHA sentazlar Pseudomonas aeruginosa'da bulunan enzimlerdendir (42). Caulobacter crescentus 'dan izole edilen 2019 Nkleotid ieren ve 673 aminoasidi kodlayan PHB sentaz geni, phaC, yaklak 73 kDa olan molekler arl ile bugne kadar tanmlanan en byk PHA sentaz enzimidir (43). Miyake ve arkadalar (44), asetil-CoA'nn asetilfosfata dnmn salayan fosfotransasetilaz ezimi ile ilgili yaptklar almada, bu enzimin aa kard asetil fosfatn PHB sentaz aktivatr gibi rol oynadn ve PHB sentezini aktive etttiini bildirmilerdir. Ancak, bu enzimdeki azalmann da PHB sentezi izyolundaki asetilCoA substratn arttrabileceini ve sonu olarak PHB birikiminin ykselebileceini rapor etmilerdir. PHB sentezinde i gren enzimlerin farkl hcre ii artlara uyum salayabilmeleri, PHB reten mikroorganizmalarn geni bir eitlilie sahip olmalarna neden olmaktadr. Ancak, her ne kadar PHB biriktirimi bir ok prokaryotik mikroorganizmada grlr ise de, -keto ail CoA Thiolaz, Asetasetil CoA Dehidrogenaz ve PHB Sentazn enzimatik mekanizmalar ile ilgili biyokimyasal aratrmalar sadece bunlarn iki doal yapmcs olan Zooglea ramigera ve Alcaligenes eutrophus da yaplmtr. rnein, Bacillus megaterium PHB'n ilk olarak izole edildii ve tanmland bakteri olmasna karn, henz biyosentez mekanizmas tam olarak karakterize edilememitir (15).

PHB 'n Biyolojik ParalanabilirliiPHB, biyolojik paralanabilirlii nedeniyle, bir kez kullanlp atlan eyalarn retiminde byk avantajlar salar (18). PHB'n en nemli zelliklerinden biri, toprak ve insan vcudu vb. yerlerde, toksik rnler meydana getirmeksizin tamamen paralanabiliyor olmasdr. PHB'n aerobik ortamdaki paralanma rnleri karbondioksit ve su; anaerobik ortamda paralanma rn ise metandr (1, 3, 7). PHB'n paralanma sresi bir ka aydan (anaerobik), bir ka yla (denizsuyu) kadar, katk maddesi ile ayarlanabilir. Paralanmada nitrojen oksidi olumamas, evre korunmasnda nemlidir. Paralanan biyoplastik bitkilerin gelimesini olumlu ynde etkilemektedir (4, 15, 45) . Polimerin paralanmasnda, bakteri, mantar, ve yksek organizmalar biyolojik faktrler olarak; hidroliz ve oksidasyon kimyasal faktrler olarak; gne , slanma ve mekanik anma ise fiziksel faktrler olarak etki etmektedir (15).

6

PHB ve onun kopolimerleri bakteriler, funguslar ve algler gibi mikroorganizmalar tarafndan belirli evre artlarnda, nispeten ksa bir peryot ierisinde tamamen C02 ve enerjiye dntrlerek paralanabilmektedir (18). Tamamen paralanma iin gereken zaman ve biyoparalanma orannn, kalnlk, yzey zellikleri, s ve evredeki mikrobiyal nfus gibi etkenlere bal olarak deitii bildirilmitir (3, 18). Nguyen ve arkadalar (46), PHB, PHV ve P(HB-HV) (polihidroksibtirat-cohidroksivalerat) kopolimerlerinde, sya bal (170-200 C) paralanmay aratrdklar almalarnda, reaksiyonun ilk birka saatindeki tabakalamay, s etkisiyle erimenin takip ettiini bildirmilerdir. Aratrmaclar, s etkisiyle PHB paralanmasnn hzlandn belirterek, bunun polimerlerin oligomer formlarnn krotonat son gruplar ile ilgili olduunu bildirmilerdir.Mergaert ve arkadalar (47) ise, PHB'n toprakta ve steril tampon zeltide paralanmasn aratrdklar almada, her iki ortamda da molekl arlnn dtn, ancak ktle miktarndaki azalmann sadece toprakta grldn ve bunun toprak eidine bal olarak deitiini bildirmilerdir. Buna gre, ktle azalmasndaki en yksek dzeye killi toprakta ulalmtr. Baz aratrmaclar da, topraktaki P(HB-HV) biyoparalanrlk yzdesinin topran eidi ve ierdii su miktarna bal olarak deitii bildirmektedirler (48). PHB'n, karbon ve enerji kayna olarak bakteriler tarafndan kullanlabilmesi iin depolimerize olmas gerekmektedir. Depolimerizasyon sonucu oluan monomerik 3hidroksibtirik asit ve dimer yap birok organizma iin kullanlabilir substratlardr (ekil 3) (18).

ekil 3. PHB'n paralanmas ve sentezi (3) PHB'n depolimerizasyonu iin kullanlan enzimler hcre ii veya hcre d enzimler olabilir. PHB' paralayan hcre ii enzimler Bacillus megaterium ve Alcaligenes eutrophus'da saptanmtr (18). Hcre ii depolimerazlarn, hcre d depolimerazlardan farkl fonksiyonlar vardr. Hcre ii depolimerazlar, hcre iinde hareketli ve kristalize olmayan, doal PHB elastomerlerini paralarlar. Dnm sonrasnda kristalize olan, denature edilmi PHB ise hcre d depolimerazlar tarafndan hidrolize edilir (3). Bununla beraber, hcre d PHA depolimerazlarla hcre ii depolimerazlar 7

arasndaki yapsal farkllk nedeniyle, bozulmam, doal PHA granllerinin hcre d PHA depolimerazlarla direkt olarak paralanamad bildirilmektedir (7). PHA sentaz ve PHA depolimeraz aktivitelerinin, granllerin membran protein tabakas ile yakn ilikili olduu ve membran paralayc veya tahrip edici metodlar olan PHB ekstraksiyon metodlarnn, sentaz aktivitesinin kaybna ve depolimerizasyona hassasiyetin artmasna yol at bildirilmektedir (7). PHB'n hcre ii paralanmas, PHA depolimeraz enziminin PHB' hidrolize etmesi ile balar. R-3-hidoksibtirat dehidrogenaz ve asetoasetil-CoA sentaz, R-3-hidroksi btirat monomer ve dimerlerinin oluumuna neden olur (7). A. eutrophus'da PHB'n in vivo depolimerizasyonu sonucu oluan 3-hidroksi btirik asit monomerlerinin, hcredeki dk R-(-)-3-hidroksi btirik asit dehidrogenaz ve yksek PHA depolimeraz aktivitesi ile oluturulduu bildirilmitir (3). Ancak, Gribel'in (1968) B. megaterium 'la yapt almada PHA sentaz ve PHA depolimeraz enzimlerinin granle bal olmayp, znm halde olduu bildirilmitir. Burada, granl d membrannn bir proteini, depolimeraz aktivitesini engeller. Buna gre, zc ile granl yapsnn tahrip olmas zerine polimer hidrolizindeki art aklanabilir (7). PHB'n, hcre d paralanmas depolimeraz tarafndan katalizlenir. Bu enzimlerin aktiviteleri polimerin kompozisyonuna, amorf veya kristalin olmasna, yani fizik formuna, rnein blmlerine ve en nemlisi evresel koullara bal olarak deiebilmektedir (15). Alcaligenes faecalis 'de PHB depolimeraz enziminin etkinliinin kristal yapnn kalnlamas ile azald bildirilmitir (49). Abe ve Doi (50), (R)-3-hidroksialkanoik asitlerle koployester oluturan (R)-3hidroksibtirik asitlerin enzimatik paralanmas zerine yaptklar almada, Alcaligenes faecalis T1 PHB depolimeraz enzimi varlnda, kopolyesterin erozyon orannn hem kristaliniteye hem de rnein tabaka kalnlna bal olduunu ve enzimatik paralanmann monomer birimlerin karbon saysndaki artla arttn bildirmilerdir. Hidroliz reaksiyonunun rn iz halindeki D(-)-3-hidroksibtirat monomeriyle esasen bir dimerdir. Dimer ve monomerler hcrelerce ieriye alnr. Hcre iinde bir hcre ii Beta-hidroksibtirat dimer hidrolaz tarafndan dimer katalizlenir ve daha sonra oluan monomer ara metabolik yol izlerine dahil edilir (18). rnein, Alcaligenes faecalis ve Pseudomonas lemoignei 'den elde edilen hcre d PHB depolimeraz enzimi, PHB'dan 3-Hidroksibtirik asit dimer ve trimer yaplarn serbestletirmitir. Yine Bacillus megaterium ile yaplan almalarda da PHB'n paralanmas sonucu 3Hidroksibtirik asit trimer yaplarnn hcrede biriktirildii grlmtr (51). Charles ve arkadalar (52), Rhizobium meliloti 'de PHB'n paralanma iz yolunu etkileyen genlerin kromozom ve mega plazmidde yerletiini tespit etmilerdir.

8

PHB ' Paralayan MikroorganizmalarPHB 'n paralanmasnda, topraktaki birok mikroorganizma grev alr (18). Aerobik ve anaerobik PHB paralayan bakteriler dnda funguslar da, bu ykma katlmaktadr. Bunlar toprak, kompostlar, aerobik ortamlar, anaerobik bataklklar, gldeniz sular ve hava gibi eitli ekosistemlerden izole edildiklerinden PHB'n bu ortamlarda paralanabildii bildirilmitir (53, 54). Topraklarda yer alan paralayc organizmalarn baz Gram negatif mikroorganizmalar, Gram pozitif basiller, streptomycetler ve kf mantarlar olduu bildirilmitir (47). PHB depolimeraz enzimi salglayan bakteri ve mantarlar, PHA'lar suda znebilen oligomer ve monomerlere hidrolize ederler. Aerobik ve anaerobik PHA paralayan mikroorganizmalarn bu yetenekleri PHA kristalleri veya filmleri zerinde yaplan almalarla gerekletirilir (49). Molitoris ve arkadalar (54), bir almalarnda, Comomonas sp., Pseudomonas lemoignei ve P. fluorescens tarafndan polihidroksialkonatlarn yzey tabakasnn bakteriyel olarak paralandn bildirmilerdir. Bakteriyel hidroliz srasnda polimerdeki morfolojik deiikliklerin Taramal Elektron Mikroskobu (SEM) ile aratrld almada, paralanan rneklere bakldnda hidrolizin yzeyden balad grlmtr. Denitrifikasyon yapan baz bakteriler, PHB' anaerobik olarak paralayabilmektedirler. Khan ve Hiraishi (55), aktif amurdan izole ettikleri yeni bir denitrifikant kemoorganotrof bakterinin PHB ve kopolimeri P(HB-HV)' aerobik ve anaerobik artlarda paralayabildiini bildirmilerdir. Denitrifikasyon bakterilerinin PHB ve P(HBHV)' paralamalar onlar elektron vericisi olarak kullanmalar ile mmkn olmaktadr. Stieb ve Schink (56), denizin anoksoik ksmndan izole ettikleri, zorunlu anaerobik, Gram negatif bir bakteri olan Ilyobacter polytropus'un 3-hidroksibtirat, btirata fermente ettiini tespit etmilerdir. evreyle dost, biyoparalanabilir plastiklerin kullanm ve tketimlerinin artmas doal evredeki birikim ve biyoparalanabilir potansiyellerinin iyice bilinmesi gereini ortaya karmtr. Bu amala, polimerleri paralayc mikroorganizmalar ve mekanizmalar zerinde yaplan almalar da her geen gn artmaktadr. Bu almalardan birinde, Sei ve arkadalar (57), PHB paralayan mikroorganizmalarn hzl ve duyarl bir ekilde tespitine yarayan, bir PCR primer seti ve gen probu dizayn etmiler ve bunun almalarnda kullandklar 57 PHB paralayan mikroorganizmadan 47'si zerinde olumlu sonu verdiini bildirmilerdir.

PHB 'n Yenilenebilme zelliiPHB'n biyolojik yaps ve biyolojik ykma uramas kadar nemli olan, onun yenilenebilen kaynaklara dayal retilebilmesi gereidir. Bir doal materyal olan bu polyester bakteriyel orijinlidir ve gerekten bir ok mikroorganizma, bu

9

makromolekl paralama yeteneindedir. Bunun yan sra, petrokimyasal termoplastlar gibi, geri dntrlebilir bir biyoparalanma gsterirler (15). PHB'n fermentatif retimi, ekerler ve ya asitleri gibi tarmsal rnlerin karbon ve enerji kayna olarak kullanlabilmesine baldr. Bu, tarmsal kaynakl karbondioksit ve sudan meydana gelmektedir ve bunlarn biyoparalanabilir PHB'a evriminden sonra, ykm rnleri yine karbondioksit ve sudur (3). Dolaysyla, baz uygulamalar iin biyoparalanma kritik iken, PHB'lar, azalmakta olan fosil yaktlarn yerine yenilenebilen bileikler olarak dikkat ekmektedirler (15).

ekil 4. PHB'n karbon dngs (3)

Biyoplastiklerin yeniden oluum devresi, sentez paralanma sentez olarak gsterilmitir. (ekil 4.) Bu devre tabiatta kendiliinden gerekleebileceinden, evre korunmas asndan da nemlidir (4).

PHB 'n Kullanm AlanlarPHB, kolay ekil alma ve paralanabilme zellikleri nedeniyle daha ok paketleme malzemesi olarak kullanlmaktadr (15) Ancak, biyouyum yeteneklerinin de olmas, implantasyon maddesi olarak kullanmn da her geen gn arttrmaktadr (58). zellikle PHB ve kopolymer poli--hidroksibtirat-co-polihidroksivalerat P(HB-HV), gda ve kozmetik alanndaki paketleme maddeleri, tarm, kiisel temizlik aralar ve biyomedikal rnler gibi alanlarda ok geni potansiyel uygulamalara aktr. Hidroksiasit uzun yan zincirli PHB'lar basnca duyarl yapkanlar olarak kullanlmaktadr. PHB, lateks gibi kat rtler, gnlk krem nclleri retimi ve gdalardaki unun dalmn salayan ajanlarn yapmn salayabilirler (15, 29, 58). Biyouyumlu olan PHB monomerleri insan vcudunda bulunan doal metabolit olmas nedeniyle, polimer vcutta sadece ok hafif bir immnolojik cevap olumasna neden olur. Bu zelliinden dolay PHB insanlarda ilalarn kontroll salnm iin test edilmitir. Byle almalarda ila, PHB den yaplm bir hap iine sktrlm ve az yoluyla hastalara verilmitir (17). PHB'n vcut iinde biyolojik paralanmas yavatr. nsan vcudu PHB depolimeraz enzimi iermez. Bu zelliinden dolay da PHB cerrahi dikiler, protezler ve ineler gibi cerrahi malzemelerin yapmnda kullanlmtr (17).

10

Yaplan almalar, tekstil sanayinde, PHB'dan yararlanlabileceini gstermitir. Alcaligenes eutrophus 'dan izole edilen genlerin pamuk bitkisine (Gossypium hirsutum L.Cv DP50) aktarlmas sonucu, transgenik pamuun lif lmenleri iinde PHB retimi salanmtr. PHB granlleri sayesinde yksek s kapasitesi ve dk termal geirgenlie sahip olan transgenik liflerin tekstil sanayi uygulamalarnda avantaj salad bildirilmitir (59). Biyobozunur plastiklerin paketleme, gda, tp, eczaclk ve tarmdaki kullanm alanlar aada sralanmtr: -Paket filmleri, poetler, torbalar, gda muhafazasnda kullanlmak zere tepsiler ve eitli kaplar, -ampuan ve merubat ieleri, karton st kutularnn i yzey kaplamalar, -la, tablet, insektisit, herbisit ve gbrenin uzun srede, belli hzda salverilmesi iin biyoparalanr tayclar, -Bir kereye mahsus kullanlan tra ba, atal, bak, tabak gibi mutfak kaplar ve bebek bezleri, -Cerrahi pens, ameliyat iplii, eldiven, nlk ve maske, -Kemik deitirilmesi ve cerrahi plakalar, -Pansuman sargs, -Kan damar deitirilmesi, -Bitki sulama borular, bitki yapraklarnn kaplanmas, -Pi (izoelektrik nokta) zelliklerinden yararlanlarak kemik bytlmesi ve tedavisi, -Kiral bileenler retimi iin balatc materyaller, -Taze balk, peynir, et ve et rnleri, kurutulmu rnler, orta nemli gdalar, yal tohumlar, kurutulmu pastaclk rnleri, cipsler, ekerlemeler gibi gdalarda nem ve oksijene kar koruma veya parlaklk salama, aroma kaybn nleme amacyla kullanm (3).

PHB 'n Ziraatta Kullanm AlanlarPHB, zellikle toprakta biyoparalanma gerektiren uygulamalar iin ok uygundur. rnein, film eklinde kaplamada alminyum folyo gibi kullanlmtr. Benzer bir uygulama olarak ekin sulamas iin PHA'lardan yaplacak oluklar kullanlabilir. Bu durumda hasat mevsiminin sonunda bunlarn tarladan toplanmas gerekmeyecektir. Ayrca bunlar tohum kapsllendirilmesinde, fide tamaclnda rnekleri korumak iin, gbre yada pestisitlerin kontroll salnm iin plastik klflar olarak kullanlabilir. K mevsiminde buday topraktaki bir zararldan korumak gerektiinde, uygun bir insektisit PHB granl iine alnabilir ve sonbaharda budayla birlikte topraa ekilir (17).

11

Topraktaki bakteriler PHB granlnde kolonize olmaya balayacak ve PHB yaklak bir haftalk inkbasyon periyodundan sonra insektisidi serbest brakmaya balayacaktr. Bu sre kimyasallarn olmad bir evrede tohumlarn imlenmesi iin yeterli zamandr. Bitki bymesi ve mikrobiyal byme insektisidin salnmyla beraber ge sonbahara kadar srecektir. Yaklaan kla beraber topran scakl decek, mikrobiyal byme oran azalacak ve bylece daha az insektisit serbest braklacaktr. Bylece aktif kimyasallar atlmadan toprakta zararlnn aktivitesi tm k boyunca decektir. lkbahar ve toprak zararls geri geldiinde yksek toprak scakl PHB pelletlerinin daha fazla mikrobiyal paralanmasn tevik edecektir. Bylece dier zararllar iin insektisit mevcut olacak ve bu gzel bir biyolojik geribesleme mekanizmas ortaya karacaktr (17)

PHB'n Veterinerlikte Kullanm AlanlarVeteriner hekimliinde ilalarn salnm iin biyolojik paralanabilen bir matriks olarak PHB'n birok kullanm alan vardr. Polimer zellikle srlarn rumeninde ok iyi paralanabilmektedir. Bu konuda ok tipik bir rnek olarak bir yl boyunca hayvanlarn kurtlanmasn nlemek iin antihelmitik ila ieren PHB'n byk kapslleri yaplmtr. iftiler, ilac, ynetmelikte nerilen dozda iki ayda bir srlarn etrafna brakarak onlarn parazitlenmesini engellemilerdir (17).

PHB'n Tpta Kullanm AlanlarPHB ve kopolimerleri eitli rnlerin yapsnda nemli bir potansiyele sahip olmakla birlikte, son zamanlardaki en ilgin uygulamalar biyolojik uygunluu ve maliyetinden dolay tp ve eczaclk alanlarndadr. Bu alanlardaki gelimeler de olduka ilerlemi safhadadr. Hayvan dokularna PHB girii yksek iddette toksik etki yapmadndan; vcutta absorbe edilebilen protez aletlerin, yapay kan damarlarnn ve cerrahi dikilerin yapmnda PHB'n kullanlmas birok aratrcya klavuzluk etmitir. PHB ve kopolimerlerinin hayvan dokularna implante edildiinde onlarn biyolojik olarak paralanabildii grlm ve bu alanda hem tbbi, hem de eczaclk amalar iin de PHA'larn kullanmna olan ilgi artmtr. Sonuta, veterinerlikte ve insanlarn ilala tedavisinde teropatik bileiklerin kontroll olarak salverilmesi iin PHA'lar kullanlmtr (18, 59, 61). Polimerin uygulama alanlar onun zelliklerine bal olarak, dorudan kullanlmasnn yannda depolimerizasyon rn olan D(-)-3-hidroksibtirik asit monomerinin kullanm da olduka ilgin ve yaygndr. zellikle PHB'n paralanma rn olan D-()-3-hidroksibtirik asit bu alanda ok nemlidir. nk bu tm yksek organizmalarda bir ara metabolit bileiidir; lipit metabolizmasnn rn olarak bulunur. nsan kannn normal bir gesi olan 3-hidroksibtirik asit, belirli dokularda zellikle de beyin ve kalp dokusu iin bir enerji kayna olarak hizmet eder ve bunun beyin geliiminde rol alan aminoasitlerin prekrsr olarak fizyolojik bir role sahip olduu saptanmtr (17). 12

D-(-)-3-hidroksibtirik asitin diabetiklerin kan serumunda anormal konsantrasyonlarda var olan keton yaplarndan biri olarak rol oynadna dair birok bilgiler de vardr. almalar, D(-)-3-hidroksibtirik asidin damar ii veya azdan. karbon salanmas iin kullanlabileceini ve daha yaygn olarak kullanlan glikoz yerine baz klinik avantajlara da sahip olduunu gstermitir. lgin olan bir dier almada da, ok iman (obese) hastalar, 14 gn boyunca teropatik alk altnda tutulduklarnda hi alktan ikayet etmemilerdir (17). Kronik osteomyolitis hastalarnn tedavisinde biyoparalanabilir, biyouyum ve kemik geirgenliini salayan piezoelektrik zellikleri bulunan P(HB-co-HV) kopolimeri kullanlarak, bu kopolimerden hazrlanan kapsller iine antibiyotik konmutur. Tavann tibia kemii iine yerletirilen kapsln, ila salnmnn etkinliinin aratrld almada, kopolimerin antibiyotik tayc bir sistem olarak kullanlabilecei bildirilmitir (62). PHB'n hastanelerde cerrahi sarglar ve eldivenler iinde bir yalayc madde olarak veya ince toz formunda kullanlmas olduka ilgintir. Ayrca biyolojik paralanabilirliiyle ilgisi olmakszn yarada kalabilecek olan bu PHB sarglarndaki fibrillerin, normal sarglardakilerden ok farkl delik yapsna sahip oluu bir avantaj da salar. Hastalar iinde unutulan pamuklarn, birok lkede hukuk davalarnn banda geldii dnlrse bu avantaj olduka nemlidir (17). Yksek teknolojiyle PHB'n gelecee ynelik kullanm alanlarndan biri de; uygun llerde su geirmez bir tp formunda dzenlenen ok ince fibrillerden meydana gelen kan damar veya bir vaskler a gibi kullanlmasdr. Bu a vcut iinde gelien yeni dokular iin geici bir yap iskelesi olarak rol alabilir ve sonuta doal dokular tarafndan tamamen eski haline gelebilir. Bu, vcudun dorudan tepkisini alan sentetik damarlardaki engelleme ve pht oluum problemini tamamen yok eder (17). Metal yap iskeleleri yerine emilebilen maddelerin kullanlmasnn en nemli avantajlar, bunlarn metabolize olabilmeleri, operasyon sonrasnda istenmeyen cerrahi deiimlerin engellenmesi ve oluan damarlarn iskeletinin salanabilmesidir. Ayrca yap iskelelerinin emilmesi sayesinde, ila serbestletirici farmakolojik ajanlarn vcuda dahil edilmesi mmkn olur (58). PHB ve kopolimerlerinin nemli bir zellii de polipeptitler, polinkleotitler, polisakkaritler ve proteinler gibi piezoelektrik polimer olmasdr. PHB ve kopolimerleri polivinilidon, florit polimeri gibi kesikli piezoelektrisite gstermektedir. Poliviniliden florit polimerinin filmleri kemii elektriksel stimlasyon ile kuvvetlendirebildii ve kemiin onarld bilinmektedir. Bu durumda bir kemik krn sabitleyen levhalar benzer mekanik zelliklere sahip takviyeli bir PHB karmndan yaplrsa, uyarlan kemik byr ve geliir. By1e bir kemik krndaki plaka biyolojik olarak paralanabilir ve vcut tarafindan bulunduu yerde yavaa emilebilir. Bu srada kemik de kaynar ve plakay uzaklatrmak iin ikinci bir operasyona gerek kalmaz (17).

13

PHB'n Kimyasallarn Eldesinde Kullanlmas(R)-(-)-hidroksi karboksilik asitler, byk oranda antibiyotikler, vitaminler, aromatikler ve feromonlar gibi ince kimyasallarn sentezi iin kiral yap bloklar olarak kullanlabilirler. Yeni bileenlerin sentezi iin, kiral bir merkeze sahip olan bu bileikler, iki fonksiyonal grup (OH, COOH) ierirler (63). Organik kimyada asimetrik sentez ilemi ok nemlidir ve bu alanda enantiomerik saf bileikler revatadr. D-(-)-3 -hidroksibtirik asit de bu gruba ait olduundan, saf maddelerin geni miktarlarda eldesinde PHB'n kullanlmas nem kazanmaktadr. Doada en yaygn form olan D-(-)-konfigrasyonuna sahip olan bu optik izomerler, bulunduklar ortamda kiral merkezleriyle dierlerinden daha kuvvetli balanma zelliine sahip olduundan kromatografide kullanlabilir. Ayrca bunlarn ya/su emlsiyonlar iin, emlsifikasyon ajan olarak kullanm da mmkndr (17). Birok ila, sadece bir kiral formda aktiftir ve D-(-)-3-hidroksibtirat byle bileiklerin organik sentezinde bir imento blou gibi kullanlr. D-(-)-3 hidroksibtirat monomerinden, Hindistan msrndaki haaratn bir seks hormonu, bir balars hormonu, Cerambycidae familyasndan bir bcein koruyucu substrat ve gzel koku olarak S-citronellol gibi 6 saf kimyasaln organik olarak sentezlendii belirtilmitir (17).

PHB'n Paketleme Filmleri ve Tek Kullanmlk Malzemelerin Yapmnda KullanlmasPHB ve kopolimerlerinin mekanik zellikleri polietilen, polipropilen vs. gibi baz ticari plastiklere benzediinden termoplastik poliesterlerdir. PHB daha krlgan olmas ve zayf zgen dayankll dnda, polipropilenle benzer zelliklere sahiptir (18). Dk su buhar geirgenlii gibi besin paketleme endstrisi asndan nemli olan bir zellii ile de, dk younluklu polietilene benzemektedir (29). Kopolimerler ise daha esnektir ve daha dk erime scaklna sahip olduundan, preslenmi rnlerin imalat iin daha kullanldrlar. Dier taraftan sadece belirli bakteriler tarafindan retilen uzun yan zincirli (C4-C12) polimerler, daha dk erime noktalar ve cam geirgenlik scaklna sahiptir. Bu materyaller lastik benzeridir ve gerekte bir termo-elastomerdir (18). PHB, kopolimerleri kadar iyi bir ekilde preslenebilir, biimlendirilebilir, lif haline dntrlebilir, filmleri yaplabilir ve klorine edilmi polietilen gibi dier sentetik polimerlerle heteropolimer yapmnda kullanlabilir (18). PHB kalp yapm, sktrlm film ve baz fibrillerin gelitirilmesinde kullanlmtr. Yaplan paket filmleri mkemmel bir gaz bariyeri zelliindedir. 25 m kalnlndaki bir PHB filmi 45 cm3/m2/gn'lk bir oksijen geirgenligine sahiptir. Dk olan bu oksijen geirgenliinden dolay gda maddelerinin paketlenmesinde PHB filmleri rahatlkla kullanlabilir. Bu PHB filmleri polipropilen filmleri kadar gldr, fakat polietileter fitalat kadar dayankl deildir. Oysa cam takviyeli PHB kalplar naylon 14

benzerlerine gre daha sert ve dayankldr. Fakat bunlarn da scakla dayankll mhendislik asndan iyi deildir. Ancak birok plastik, cam-fiber dolgusu ilavesiyle kuvvetlendirilebilmitir (17, 18). PHB mkemmel olan gaz bariyer zelliinden dolay, film eklinde kaplamaclkta kullanlmtr. Kanada'daki Hamur ve Kat Aratrma Enstits, Montreal'deki Mc Gill niversitesi ile PHA laktik reten bir firma olan Ecole Politeknik ve Imperial Kimya irketi arasndaki ortak bir projeyle PHB, kaplanm kat ve yksek kalitede film yapmak iin kullanlmtr. Bu kaplanm katlar tamamen biyolojik olarak paralanabilmektedir ve ticari olarak, kaplanm katlarda geri dnm daha kolay olmutur (18). Biyolojik olarak paralanabilirliinden dolay tek kullanmlk rnlerin retimi iin PHA'lara ynelinmitir. Bu alanda Imperial Kimya irketi ve bunun yan kuruluu olan Marlborough Biopolimers gibi irketler PHA'larn aratrlmas ve gelitirilmesinde aktif olarak rol almtr. PHA polimerine bu iki irket ticari isim olarak BIOPOL adn vermitir ve 1970' li yllarda ilk ticari prosesleri patentlemilerdir (18). Imperial Kimya irketi, kadnlara mahsus hijyenik rnler, tek kullanmlk ocuk bezleri ve geri dnm g olan plastik filmler gibi tek kullanmlk mutfak malzemeleri iin PHA'n potansiyel bir pazar olduunu nceden grmesine ramen PHA'n ilk ticari kullancs Almanya'da Wella kozmetik irketidir. Bu irket PHA' enjeksiyonla ie eklinde kalplam ve sa ampuanlarn paketlemek iin kullanmtr (18). Polipropilene fiziksel zellikleri yznden ok benzeyen PHB, polipropilenden yaplan ykanabilir kaplar, krtrlabilen paketler ve ipler gibi pek ok rnn yapmnda da kullanlabilmektedir (17).

PHB retiminde Kullanlan SubstratlarPHB ve eitli PHA'larn retimi iin kullanlan substratlar zellikle karbon kayna asndan bakldnda, glukoz, skroz ve ya asitleri ile alkanlar ve kloroalkanoik asitler gibi kimyasal bileenlerdir (30, 51, 64) Ayrca, btirik ve pentatonik asit, propiyonik asit, 4-hidroksi hegzanoik asit, L-Laktat gibi karbon kaynaklar kullanm da denenmitir (64, 65) PHB ve kopolimerlerin kompozisyonu, kullanlan karbon kaynana bal olarak deiebildii, ancak bu dalmn tesadfi olabilecei de sylenmitir (65, 66) . Ramsay ve arkadalar (67), Alcaligenes latus, Alcaligenes eutrophus, Bacillus cereus, Pseudomonas pseudoflava, Pseudomonas cepacia ve Micrococus halodenitrificans bakterilerini glukoz ve propiyonik asit bulunan ortamda gelitirdiklerinde, nitrojeni snrlandrlm artlar altnda P(HB-co-HV) kopolimeri rettiklerini tespit etmilerdir. Aratrclar, kopolimer iindeki HV orannn propiyonik asit miktarna bal olarak deitiini de saptamlardr. Chen ve arkadalar (45), hcre kuru arlnn %85'i kadar PHB biriktirdiini 15

bildikleri A. latus DSM 1122 suunun PHV retimi zerine yaptklar almada, ortama Na-valerat eklediklerinde sadece PHV, oysa propiyonat ve asetat ayn anda ilave ettiklerinde PHB ve PHV elde edildiini tespit etmilerdir. Amonyum klorr (51), amonyum asetat, balk peptonu (68) amonyum slfat (7) vb. azot ieren kaynaklardan da PHB verimini arttrc almalarda yararlanlmaktadr. Durner ve arkadalar (69), Pseudomonas oleovorans ile yaptklar almada, oktonat ve amonyum ieren besiyerini farkl C/N oranlarnda hazrlamlar ve C/N oran arttnda PHA birikimini ykseldiini ve bunun nitrojenin snrlanmasndan kaynaklandn bildirmilerdir Pseudomonas pseudoflava ile yaplan bir almada da, besiyerinde karbon kayna olarak glukoz ve ksiloz kullanlrsa %PHB verimimin %22, arabinoz kullanlrsa %17 olabilecei bildirilmitir. Aratrclar, arabinoz ve ksiloz ieren ortamda, PHB biriktirilmesinin son aamasnda nitrojen snrlandrldnda, PHB miktarnn dtn de bildirmilerdir (70). Page ve arkadalar (71), Azotobacter vinelandii UWD suunu, glukoz ve balk peptonu ieren besi ortamnda gelitirdiklerinde %80 PHB verimine ulamlardr Rhizobium meliloti'nin fruktozlu ortamda retildiinde yksek miktarda PHB depo ettii bildirilmitir (30). Alcaligenes eutrophus'da Tanaka ve arkadalar (64), L-Laktatl besiyerinde % 55 PHB birikimi tespit etmilerdir. A.eutrophus'un polietilen glikol veya polisakkaritlerden kopolimerler rettii ve bu kopolimer kompozisyonu ve molekler arlnn yaplan mdahalelerle kontrol edilebilecei bildirilmitir (72). Yine ayn bakterinin gklukoz, propiyonik asit veya 4hidroksi btirik asit ya da btirolacton kullanldnda P(3HB-co-3Hv-co-4HB) rettii bildirilmitir (73). Biyoparalanabilir plastiklerin imali iin potansiyel hammadde olan PHB'n, fermentasyon olay ile ktle retiminin gelitirilmesi yoluna gidilmitir. Fermentasyon olay, kesikli, yarkesikli ve srekli fermentasyon olarak gerekletirilebildii bildirilmitir (7).

PHB'n Ucuz retimiPHB oluumu iin kullanlan eker substratnn fiyatnn, PHB retiminin ticari baarsnda snrlayc faktrlerden biri olduu ve polimer retiminin her bir tonu iin, 3 ton glukoz kullanlmas gerektii bildirilmektedir (74). Kullanlan glukozun, maliyeti ykseltmesi sonucunda retilen PHB'n kg fiyat 15-30 US Dolar arasnda deimektedir (75). Polimerin kullanm snrlarn belirleyecek olan maliyet fiyatn drmek iin, rekombinant trler zerinde almalar yaplmasnn yansra, farkl ve ucuz karbon 16

kaynaklar kullanarak yksek PHB verimi elde eden sular zerinde aratrmalar da yaplmaktadr (75). Dk fiyatl biyoplastik retimi iin melas, (1, 10, 74, 76) ksiloz, arpa ve soya atk sular (77) ve peynir alt suyunun (78) kullanlmas aratrlmaktadr. Ucuz PHB retimi iin kullanlabilen melas, bakteriler iin karbon kayna olmasnn yan sra, ierdii vitaminler ve mineraller ile, byme faktr kayna olarak da kullanlmaktadr (79). Page (74), Azotobacter vinelandii UWD suunun eker pancar melas gibi kompleks karbon kaynaklarnda da yksek PHB verimine sahip olduunu saptamtr. Page (1), iyi bir polimer reticisi olan A. vinelandii UWD suunun, ucuz karbon kayna olan eker pancar melasnda retildiinde, glukozun te biri maliyete mal olduunu ve eer ortama valerat ilave edilirse PHV kopolimerinin olutuunu bildirmitir. eker pancar melasnn tanmlanmam bymeyi uyarc faktrler ierdiini syleyen Page, eker pancar melasndan polimer retimini arttrmak iin ortama azot bileenleri ilave edilebileceini de belirtmitir. PHB'n pratik uygulamalarnda retim fiyatlarnn indirgenmesi iin daha ekonomik kltr ortamlar aratrlrken substrat maliyetinin drlmesinin yan sra, karbondioksidin dntrlp ucuz yoldan PHB retilebilmesi iin, Cyanobacter ile de almalar yrtlmektedir. (31, 44, 64, 80, 81, 82) Ucuz karbon kaynaklar ve hatta peyniralt suyu gibi atklardan PHB retimi yaplarak verimin artttrlmas amalanmaktadr. Ahn ve arkadalar (78), rekombinant E. coli kullanarak peynir alt suyundan yksek PHB verimi alndn bildirmilerdir. Kim (83) ise almasnda, yine rekombinant E. coli'yi peynir alt suyunda gelitirmi ve %20 PHB verimi; Azotobacter chrococcum'u ise niasta ieren besi ortamnda gelitirerek, oksijeni snrlandrlm artlar altnda %46 PHB verimi elde etmitir.

Mikroorganizmalarda PHB retimiProkaryotik mikroorganizmalarn geni bir ksm tarafndan sentez edilebilen PHB, toprak, deniz ve tatlsu, bunlarn sedimentleri gibi farkl evresel rneklerden izole edilen, ok sayda heterotrofik ve ototrofik aerobik, fotosentetik anaerobik bakteriler, Actinomycetesler, cyanobakteriler, anaerobik, ya asidi okside eden bakteriler, Gram negatif ve Gram pozitif bakteriler tarafndan depolanabilmektedir (9, 19). PHB, zellikle Alcaligenes sp., Azotobacter sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp. ve eitli toprak mikroorganizmalar gibi bir ok mikroorganizma tarafndan oluturulur (7, 11, 12, 18, 30). Ticari olarak biyoplastik retiminde mperial Kimya irketi ncelikle metilotrofik bakterileri ve Azotobacterleri kullanm, ancak daha sonra PHB retim seviyesi daha yksek olan Alcaligenes eutrophus bakterisi ile devam etmitir.

17

Alcaligenes ve Azotobacter Cinsi Bakterilerde PHB retimiYaplan almalarda, Alcaligenes eutrophus bakterisinin, fruktozu karbon kayna olarak kullanarak hcre kuru arlnn % 80'inden fazlasn PHB olarak biriktirebildii (15) ve Alcaligenes eutrophus'un glukozu kullanabilen mutantlarnn da PHB retiminde kullanlabilecei bildirilmektedir. Alcaligenes latus gibi bu cinse ait dier trler de birok karbon kaynan kullanarak yksek PHB verimi salarlar. Ortamdaki C/N orannn artnn polimer sentezini kolaylatrmas nedeniyle, Alcaligenes trlerinde PHB retiminin kinetiinde byme fazn takiben, azot kaynann snrl hale getirilmesinin olduka belirgin bir depo faz oluturduu rapor edilmitir (18). Beaulieu ve arkadalar (79), Alcaligenes eutrophus DSM 545 suunda %3 glukoz ve farkl amonyum kaynaklar ile seker kam melasnda PHB verimini aratrdklar almalarnda, en iyi byme ve PHB retiminin amonyum slfat ieren besiyerinde olduunu bildirmilerdir. Aratrmada, bakteri tarafndan metabolize edilemeyen melas, karbon kayna olarak deil sadece byme aktivatr olarak kullanlmtr. Optimal byme ve PHB retiminin %0,3 melas orannda saland rapor edilmitir. almada ulalan en yksek PHB Verimi ise %26 seviyesindedir. Tanaka ve arkadalar (64) ise, gelitirdikleri iki aamal fermentasyon metodunda, A. eutrophus'un Lactococcus lactis'in ksilozdan retmi olduu L-Laktat ieren besiyerinde bytlrse, % 55 orannda PHB biriktirdii tespit etmilerdir. Kim ve arkadalar (84), A. eutrophus NCIMB 11599 suunun farkl zamanlarda ve amonyumu snrl artlarda incelemilerdir. Aratrmaclar, en yksek hcre younluu srasnda snrlanan amonyum orannn PHB veriminde %76'lk bir arta sebep olduunu bildirmilerdir. Borman ve arkadalar (85), Azotobacter beijerinckii bakterisinin kasein pepton, maya zt, kasamino asit ve re gibi organik azot kaynaklarnn glukoz veya skroz gibi karbon kaynaklaryla kombine edildiinde, azot snrlamasna gerek kalmadan %50'den fazla PHB retebileceini bildirmilerdir. PHB'n byme ilikili artlardan etkilendiini ve zellikle kazein pepton ieren besiyerinde bymenin durgun faznda en yksek PHB retim deerine ulatn sylemilerdir. almada, oksijeni snrlandrlm artlarda PHB retiminin artt da vurgulanmtr. Farkl Azotobacter trlerinin PHB verimi zerine yaplan almalardan birinde, A. vinelandii UWD suunun glukoz, fruktoz, sakkaroz, maltoz gibi rafine karbon kaynaklar ile eker kam melas, eker pancar melas, msr urubu , malt ekstrakt gibi kompleks karbon kaynaklarnda yksek PHB verimi elde edildii bildirilmitir (74, 86). Page ve Knosp (87), A. vinelandii UWD suunun, glukoz ve yansra amonyum asetat veya N2 ieren besi ortamnda 24 saatlik kltr sonucunda, hcre kuru arlna oranla srasyla %65 ve %75 PHB verimine ulatn bildirmilerdir. Aratrmaclar, bu suda polimer retiminin oksijen snrlandrlmasna bal

18

olmadn, glukozun PHB'a dnmnn etkinliinin oksijeni snrl kltrlerde arttn bildirmilerdir. Niasta gibi ucuz substratlardan PHB retiminin aratrld bir almada Azotobacter chrococcum kullanlm ve farkl oksijen konsantrasyonlar altndaki PHB verimleri aratrlmtr. Oksijen snrlamasnn PHB verimini arttrd belirtilen aratrmada, PHB veriminin %20'den %46'ya ulat bildirilmitir (83).

Bacillus ve Pseudomonas Cinsi Bakterilerde PHB retimieitli aratrclar, biyoplastik retiminde Bacillus biyopolimerlerinin potansiyel gelecek uygulamalar iin kullanlabileceini bildirmektedirler (4, 9). Ayrca, Bacillus 'larn melas gibi ucuz substratlarda hzl bir ekilde bydkleri; yksek scaklk ve yksek osmotik basnca dayankl olduklar ancak, hcre duvar yaplarnn kaln oluu nedeniyle PHB ekstraksiyonu zor olduu bildirilmitir. Yine de avantajl zelliklerinden yararlanmak ve endstriyel PHB retimi yapmak iin uygun sularn tespiti aratrmalar devam etmektedir (10). Bacillus trlerinde PHB sporulasyon iin hcre ii enerji rezervi olarak ilev grmektedir. rnein, B. cereus'da spor oluumundan hemen nce PHB birikiminin maksimum oranda olduu ve bakterinin sporulasyon dneminde PHB'n kullanld bildirilmektedir (21). Benoit ve arkadalar (32), B. thuringiensis zerinde yaptklar almada, durgun fazdaki sporulasyon srasnda PHB'n tketilmeye baladn ve PHB'n spor ekillenmesi srasnda enerji kayna olarak kullanldn bildirmilerdir Kato ve arkadalar (51) yaptklar almada, B. megaterium 'da 3-Hidroksibtirik asit trimer yaplarnn ge eksponansiyel fazda biriktirildiini, durgunlama ve lm faznda ise paralanma sonucunda en yksek dzeye ulatklarn sylemilerdir. Lach ve arkadalar (88), filamentli, kk sferik hcreler oluturan B. megaterium PV302 mutantnda, PHB miktarnn hcre kuru arlnn %16's kadar olduunu tespit etmilerdir. Atasal sula karlatrldnda, mutantta sporulasyon ve gelimede bozukluklar grld bildirilmitir. Yaplan aratrmalarda baz Bacillus sularnn hcre kuru arlnn %50 den fazlasn PHB eklinde biriktirebildii bildirilmektedir (4, 45, 89) Chen ve arkadalar (45), zenginletirilmi besiyerinde bytlen Bacillus bakterilerinde hcre kuru arlna gre %5-20 arasnda PHB biriktirildiini bildirmektedirler. Kato ve arkadalar (51) da kendi izole ettikleri B. megaterium B-124 suunun hcre kuru arlnn %20 sinin PHB olduunu bildirmilerdir. Dave ve arkadalar (4), aktif amurdan izole edilen 10 Bacillus suundan zellikle birinin %70 PHB verimlilie sahip olduunu sylemilerdir. Mercan ve Beyatl (90), 10 adet B. sphaericus suunun PHB retimlerini tespit ettikleri almalarnda, PHB retiminin %5,00-%25,88 arasnda bulmulardr. Ancak

19

zellikle retimi en yksek olan baz sularn, %0,2 beef ekstrakt ieren besi ortamnda yzde verimlerinin %32,50'ye kadar ktn bildirmilerdir. Labuzek ve Radecka (9), B. cereus UW85 suunu nitrojeni snrlandrlm artlarda gelitirmiler ve PHB verimini %9 olarak tespit etmilerdir. Wu ve arkadalar (10), melasl besiyerindeki oksijen artlarn deitirerek yaptklar almada, oksijen miktarndaki azalmann sporulasyona neden olduunu ve PHB retiminin dtn; nitrojen ve fosforun orannn karbona gre dk olduu besiyerlerinde ise PHB retiminin arttn bildirmilerdir. Bacillus sp. Jma5 suunun, PHB verimini %25-35 olarak tespit etmilerdir. Bacillus 'larn amilaz ve proteinaz enzimlerinin varl nedeniyle gda atk sularndan faydalanabileceini bildiren Law ve arkadalar (77), aktif amurdan izole ettikleri Bacillus sularn arpa ve soya atk suyunda gelitirerek PHB verimlerini aratrmlar ve sulardan HF-1'in atklardan %19,22 HF-2'nin ise %10,18 PHB verimine ulatn bildirmilerdir. Aratrmaclar, dk maliyetli PHB retimi iin ucuz karbon kaynaklarnn kullanlabileceini bildirmilerdir. Gouda ve arkadalar (76), eker kam melas ve msr suyunu karbon ve nitrojen kayna olarak kullanarak B. megaterium 'da PHB retimini incelemiler ve en yksek PHB miktarnn melas ve glukoz ieren besiyerinde elde edildiini bildirmilerdir. Aratrmaclar, hcre geliiminin en iyi olduu melas yzdesinin %3 olmasna ramen, en yksek PHB verimi olan %46,2'lik orann %2 melas ieren besiyerinde elde edildiini bildirmilerdir. Hoffmann ve arkadalar (91), almalarnda, glukonat veya asetat gibi basit karbon kaynaklarnda retilirlerse, eitli Pseudomonas bakterilerinin, orta zincir uzunluunda, 3-hidroksi ya asitlerinden ekillenen (C6-C14) PHA biriktirme yeteneinde olduunu belirtmilerdir. Ps. aeruginosa, Ps. putida ve Ps. fluorescens gibi dier florosan Pseudomonas sular da, karakteristik bir zellik olarak karbon kaynaklar varlnda ve snrlayc artlar altnda PHB retimi yapmazlar. Ancak, Huisman ve arkadalar (92), ya asitlerinde retilirlerse, orta zincir uzunluunda (C6-C12) PHA retebildiklerini gstermilerdir. Aratrmaclar, polimer oluturma yeteneinin plasmid DNA'dan kaynaklanmadn, zel bir enzim sisteminin PHA retiminde etkin olduunu belirtmiler ve PHB retmeme zelliklerinin bu bakterilerin snflanmasnda kullanlabileceini bildirmilerdir. Metilotrofik organizmalardan olan baz Pseudomas 'larn da PHB retimi aratrlm ve yksek verim grlmtr. Ps. oleovorans, Ps. aeroginosa, Ps. putida, Ps. fluorescens ve Ps. testotereni, n-alkoller ve n-alkanoik asitler kullanlarak PHB retimi gzlenmitir (12, 17). Karaboz ve Umay (93), Ps. extorguens bakterisini metanol ieren karbon kaynanda rettiklerinde % 27 PHB retimi saptamlardr.

20

Fakltatif metilotrof Pseudomonas sp.135 suu zerinde yaplan bir almada methanol varlnda NH4'n snrl tutulduu ortamda %55, Mg+2 eksikliinde %42,5 ve PO3-4 eksikliinde ise %34,5 PHB verimi saland tespit edilmitir (94). Xi ve arkadalar (95), Ps. stutzeri 1317 suunu glukoz, glukonat, ya asidi ve alkol ieren ortamda yetitirmiler ve PHA yapsnn ortamdaki ya asidi ve alkollere bal olarak deitiini tespit etmilerdir. Aratrclar, glukoz ieren besiyerinde 20. saatte balayan nitrojen eksikliinin hem hcre says hem de polimer miktarnda artmaya neden olduunu ve %50 PHB verimine ulatklarn bildirmilerdir. Ate ve Ekmeki (96), Pseudomonas extorquens DMS 1337 ve Azotobacter chrococcum (TEM)'in pancar melas ieren besi ortamndaki PHB retimini inceledikleri aratrmalarnda, P. extorquens DSM 1337'nin %22,98 ve A. chrococcum (TEM)'in %12,10 PHB retim verimine ulatn bildirmilerdir.

Dier Bakterilerde PHB retimiBiyolojik olarak paralanabilen plastik olan PHA'n fotosentetik retimi iin, gne yardmyla, sera etkisi yaratan gaz olan karbondioksitin kullanm evresel olarak kabul edilebilir olduundan, bu i iin siyanobakterlerin seiminin uygun olduu belirtilmitir. Karbondioksitten PHA biriktiren grup mikroorganizma vardr ki bunlar, hidrojen okside eden kemoototrofik bakteriler, genetik mhendislii ile ykseltilmi bitkiler ve siyanobakterlerdir. Bunlar oksijenik fotosentez ile PHA depo ederler. Asada ve arkadalar (81), termofilik izolat Synechoccus MA19 suu ile yaptklar almada, fotoototrofik artlarda ve nitrojen azlnda PHB biriktirdiini ve PHB granllerinin tilakoid membranla ilikili olduunu bildirmilerdir. Gomez ve arkadalar (97), toprak Gram negatif bakterilerinin eker kam trevli ekerler olan skroz, fruktoz ve glukoz ile propiyonik asitten PHB retimini incelemiler ve %50-80 arasnda verime ulamlardr. Bitkide nodl oluturan toprak bakterilerinden olan Rhizobium cinsi bakterilerin de hcre ii PHB depo etme yetenei birok aratrmaya konu olmutur. Bonartseva ve arkadalarnn (98) yapt almann sonularna gre, PHB ierii, nitrogenaz enzimi aktivitesi ile ters, hidrogenaz enzimi aktivitesi ile doru orantldr. Yine, R. leguminosarum, R. trifoli, R. galega, R. meliloti, R. phaseoli gibi farkl trlerle yaplan almalarda da, PHB retimlerinin sua ve kltrel ortama bal olduu bildirilmitir. Skroz ieren besiyerinde, farkl azot kaynaklar kullanlarak yaplan almada, en yksek PHB veriminin KNO3'l besiyerinde %65 ile R. phaseoli 'den elde edildii bildirilmitir (5, 99). Jan ve arkadalar (30), R. meliloti 'de ortamda karbon kayna olduunda ve gelime iin gerekli nitrojen gibi elementler snrl tutulduunda PHB'n depo edildiini bildirmilerdir. Karbon kayna tmyle kullanldnda ise PHB metabolize edilmektedir. R. meliloti fruktozlu ortamda retildiinde byk miktarda PHB depo etmektedir. 21

Tal ve Okon (100), Azospirillum brasiliense Cd suunun, eksponansiyel fazn son aamasnda, yksek C/N orannda, oksijen snrlandrldnda %5 olan PHB veriminin, %40'a ulatn bildirmilerdir. Brandl ve arkadalar (31), fotosentetik bakteriler olan Rhodospirillum ve Rhodobacter cinsleri zerinde yaptklar aratrmalarda bunlarn da n-alkanoik asitlerden polimer depo ettiini, ayrca nitrojenin snrlandrlmas durumunda %PHB veriminin hcre kuru arlnn %60-%70'i kadar olabildiini bildirmilerdir. Lillo ve Rodriguez-Valera (101) ise, yksek tuz konsantrasyonlarnda yaayan halofilik bakterilerden olan Halobacter mediterranei 'nin, karbon kayna olarak glukoz ve niasta kullanldnda, fosfat snrlandrlm artlar altnda %60 PHB verimi elde edildiini bildirmilerdir. Bunlarn dnda Laktik asit bakterilerinin de PHB retimi iin kullanlabilecei bildirilmitir. Lactobaciller srekli fermentasyon artlarnda retilseler, daha fazla PHB biriktirdikleri ve bunun ticari termoplastik retiminde de kullanlabilecei sylenmitir (5). Qi ve Rehm (43), yaptklar almada en byk PHB sentaz genini tespit ettikleri Caulobacter crescentus bakterisinin, glukoz varlnda %18 PHB rettiini tespit etmilerdir.Bu bakteri zelikle ierdii PHB sentaz enzimi nedeniyle dikkat ekmi ve genetik uygulamaya tabii tutulmutur. Manna ve arkadalar (102), topraktan izole ettikleri 55 toprak streptomycet zerinde yaptklar almada, Streptomyces griseorubiginosus olarak tanmlanan izolatn, %2 glukoz varlnda, durgun fazda, miselial kuru arlnn %9,5'u kadar PHB rettiini tespit etmilerdir. Semenov ve arkadalar (103), birka polyprosthecate bakterisi ile yaptklar almalarnda, Labrys cinsinde yeralan bakterilerin %26, Prothecomicrobium cinsindeki bakterilerin ise %23 PHB miktarna ulatklarn bildirmilerdir. Aktif amur bakterilerinde de PHB'n varl rapor edilmi ve PHB gibi bakteriyel depo polimerlerinin nemi, aktif amur ilemlerinde karbon substrat deiimlerinin anlalmasnda ayrntl olarak allmtr (104). Mikrobiyal oksidasyon srasnda yapkan, topakl ve gri-siyah bir yap olan aktif amur, mikrobiyal hcre, heteropolisakkaritler ve polyester ierdii bildirilmitir (105). Loosdrecht ve arkadalar (13), aktif amur iindeki bakterilerin PHB depo ettiklerini ve hcre d maddeler tkendiinde, depolar araclyla gelimelerini srdrdklerini belirtmilerdir.

22

Genetik Uygulamalarla PHB Eldesi1920'li yllardan bu yana hakknda birok bilgi edinilmi olmasna ramen, ticari PHB retiminin hala ok yksek maliyete neden olmas, sentetik polimerlerin yerini alabilecek kapasiteye sahip olan bu biyoplastiin en nemli dezavantajdr. Son yllarda, molekler biyolojideki gelimelere paralel olarak, daha fazla ve ucuz PHB reten rekombinant bakteriyel sularn ve transgenik bitlilerin gelitirilmesi almalar hz kazanmtr (78, 8).

Rekombinant Mikroorganizmalardan PHB retimiPHB'n rekombinant mikroorganizmalardan yksek oranda retimi, vektr veya promotor aktivitesindeki zenginlemeye bal olarak artmaktadr (41). Bu amala Alcaligenes eutrophus ve Alcaligenes latus bakterilerinin PHB biyosentez genlerinin baaryla aktarld rekombinant Escherichia coli sular kullanlmaktadr (78). Nitekim, 1987 ylnda A. eutrophus genleri, E. coli bakterisine baaryla klonlanm ve normalde PHB retmeyen bakterinin, modifiye edildikten sonra PHB rettii gsterilmitir (14). PHB biyosentetik genlerinin (phbA, phbB ve phbC) Alcaligenes eutrophus'da kromozom ve megaplasmid pHG1'de yerletii bildirilmitir (27). Gelien Hibridizasyon teknikleri ve heterolog tamamlayclar, bu ve dier bakterilerin PHB biyosentez genlerinin izolasyonunu ve klonlanmasn mmkn klmaktadrlar (28). E. coli, PHB retimi almalar iin etkin olarak kullanlabilen bir konak su olup; sadece ok dk molekl arla sahip granl halde olmayan PHB biriktirdii bildirilmitir (106). Rekombinant E. coli'nin PHB retimi iin gelitirilmesinin hzl reyerek, gerekli hcre younluuna ulamas; polimerin yksek miktarda biriktirilebilmesi; ucuz karbon kayna kullanabilmesi, retilen PHB'n kolay saflatrlabilmesi ve sentezlenen polimerin depolimerizasyonuna neden olan enzimlerin eksiklii gibi nemli baz avantajlar vardr. Bu nedenle, rekombinant E.coli bakterilerinden %80-90 orannda PHB verimi elde etmek mmkn olduu bildirilmektedir (3). Lee ve arkadalar (63), E.coli'de PHB retimi iin, A. eutrophus PHB sentez genleri tayan plazmidler kullanmlar ve plazmid stabilitesinin yksek olduunu belirttikleri almalarnda, PHB veriminin %80,1'e ulatn bildirmilerdir. Peynir alt suyu gibi ucuz substratlardan PHB retiminin, bir rekombinant E. coli suu kullanlarak aratrld bir almada, farkl oksijen konsantrasyonlar altndaki PHB verimleri aratrlmtr. Oksijen snrlamasnn PHB verimini arttrd tespit edilen aratrmada, yzde PHB verimi %80'e ulamtr. Aratrmaclar, rekombinant E. coli 'de PHB biyosentez zaman ve oksijen snrlandrlmas zamannn PHB verimi iin nemli olduunu belirtmilerdir (83).

23

Klinke ve arkadalar (82) da, eker veya melas gibi ucuz karbonhidrat kaynaklarndan, rekombinant E. coli yardmyla PHA retimi iin alternatif stratejiler yaplabileceini ve E coli'nin ksa srede reme, PHA'n kolayca saflatrlabilmesi, polimeri paralayc enzim sisteminin yokluu nedeniyle dikkat ektiini sylemilerdir. Aratrmaclar, -oksidasyon dngsn iletemeyen bir E.coli suuna, glukonattan PHA sentezleyemeyen Pseudomonas bakterisininden orta zincir uzunluunda PHA polimeraz enzimini kodlayan geni aktararak, onun glukonattan orta zincir uzunluunda PHA retmesini salamlardr. Rekombinant E. coli 'deki PHA verimi %2,3 olarak tespit etmilerdir. Qi ve Rehm (43), bilinen en byk PHB sentaz genine sahip olduunu bildirdikleri, glukoz varlnda %18 PHB reten, Caulobacter crescentus bakterisini genetik uygulamaya tabii tutmulardr. Bakterideki PHB sentaz enzimi genini, phaC, kodlayan blgeyi mutant A. eutrophus PHB(-)4 ve recombinant E. coli JM109'a aktarmlardr. Sonuta yzde PHB verimi srasyla %62 ve %6 olarak tespit edilmi, zellikle A. eutrophus PHB(-)4'den alnan verim dikkate deer grlmtr. Ahn ve arkadalarnn (78), Alcaligenes latus PHA biyosentez genlerini kopyaladklar E. coli CGSC 4401 suunun, peynir alt suyundan rettii PHB miktarn tespit ettikleri almalarnda, yzde PHB veriminin yaklak %60 civarnda olduunu tespit etmilerdir. Aratrmaclar, farkl oranlardaki znm oksijen konsantrasyonunun etkisini de inceledikleri aratrmalarnn sonucunda, mikroorganizmann aktif PHB sentez fazn geirdii srada znm oksijen konsantrasyonunun drlmesinin PHB sentezini hzla arttrdn bildirmilerdir. Slater ve arkadalar (20) yaptklar almada, A. eutrophus 'dan alnan PHB biyosentez genlerini E. coli fadR atoC mutant bakterisine aktararak, glukoz ve propiyonat ieren ortamda P(HB-co-HV) kopolimerinin retilmesini salamlar ve zellikle ortamdaki propiyonat miktarnn HV ekillenmesinin orann deitirdiini tespit etmilerdir. Fllner ve arkadalar (107), metanol ieren ve nitrojen ve fosforu snrlandrlm ortamda, ok az miktarda PHB biriktiren Mycoplana rubra B346 suuna PHA sentaz enimi genlerini aktarmlar ve PHB birikimini %9,6'den %25'e ykseldiini bildirmilerdir. Hori ve arkadalar (108), Bacillus megaterium 'un kendini ykan bir suu zerinde yaptklar almalarla elde ettikleri transformantn PHB retimini incelemiler ve ortamda glukoz tkenince hcrelerin kendiliinden paralanp, PHB'n serbestletiini tespit etmilerdir.

Transgenik Bitkilerden Biyoplastik EldesiBitkiler birer PHB reticisi olmamalarna karn, PHB genlerinin taycs olabildiklerinden, PHB retebildikleri (24) ve bu nedenle, transgenik bitkilerin ok miktarda ve ucuz PHB retimi iin potansiyel organizmalar olduu bildirilmitir (8, 24, 24

82). Yaplan almalarda bunlardan, kuru arlklarnn %20-40 arasnda PHB elde edilebilmitir (82). Bitkilerde biyoplastik sentezinin deiik metabolik yollarla, sitoplazma, plastid veya peroksizomda gerekleebildii bildirilmektedir (8). Aratrmaclar, gen aktarm yaplm bitkilerin, PHB retimine baladktan sonra niasta retimini braktklarn ve tm enerjilerini polimer yapm iin ynlendirdiklerini sylemektedirler. Bunun, yeni enzimlerin eklenmesi ve varolan enzimlerin almasnn engellenmesi ile ortaya ktn dnen bilim adamlar, PHB' metabolize edemeyen bitkilerin tohumlarnn geliememesini ise bir problem olarak belirtmektedirler (14). Alcaligenes eutrophus 'dan alnan PHB genleri, msr, patates gibi birka farkl bitkiye aktarlarak, onlarn polimer retmesi salanabildii ve Imperial Kimya irketi'nin pilot uygulamalarnda ylda 50 ton PHB-HV kopolimerinin elde edilebildii bildirilmitir (14). Msr ve arpa yal tohumlarnda, ayiei ve soya fasulyesinde PHA'larn retilmesi iin byk irketler tarafndan aratrmalara devam edilmektedir (7). Bitkilerden PHB eldesinde tm fermentasyon ilemlerinin ortadan kalktn ve plastiin direkt olarak elde edilebildiini bildiren aratrmaclar, genetik olarak deitirilmi msr bitkisine sentez ettirilen plastiin, bitkinin ok fazla bymeden hasat edilmesi ile elde edildiini rapor etmilerdir (109). Modifiye msrdan PHA eldesinin ise, olduka sert ve ar bir ilem gerektirdii ancak karbondioksit ve gne nn, karbon ve enerji kayna olduu bu PHA retiminde yaplmas gerekenlerin, fermentasyon ilemlerinden daha fazla olmad sylenmektedir (7). Bitkilere PHA genlerinin aktarlmas ile ilgili ilk aratrmalarda, A. eutrophus bitkisinden alnan genlerin aktarld bitki, Arabidopsis thaliana olmutur (8). Poirier (8), A. thaliana sitoplazmasnda, A. eutrophus'un PHA sentaz ve asetoasetil-CoA redktaz genlerinin etkinlik gsterdiini rapor etmilerdir. 3-ketotiolaz geni bitki sitoplazmasnda mevcuttur. Bu deneyler, tm bitki dokularnn koful, ekirdek ve sitoplazmalarnda PHB sentezinin olduunu fakat, dk miktarda ve zayf tohum geliimine sebep olduunu gstermitir. Daha sonraki aratrmalar, asetil-CoA'dan trigliseridlerin olutuu yer olan, plastid gibi zel organellerde PHB retilme yntemlerinin gelitirilmesine ynlendirilmitir. Bu almalarla, sitoplazmada depolanan PHB'den 100 kez daha fazla, bitkinin kuru arlnn %14' kadar homopolimer elde edilmitir ve PHB granllerin ekli ve bykl, bakteriyel granllere benzemektedir (7). A. eutrophus'un PHA sentaz ve asetoasetil-CoA redktaz genlerinin aktarld pamuk bitkisinde de, pamuk liflerinin PHA ierdii ve bu liflerin yksek sya daha dayankl hale geldii bildirilmitir (7). imdiye dek yaplan almalar, PHB retiminin transgenik bitkiler ile ucuzlatlabileceini gstermektedir ki bu gelecekte marketlerde plastik patateslerle karlaabileceimizi dndrmektedir (3).

25

Aratrmalarda elde edilen sonulardan, PHB retiminin mikroorganizmalarn trne, retim artlarna ve rekombinasyonlarn baarsna bal olarak deiiklik gsterdii tespit edilmitir. Gelecek yllarda PHB polimerinin, geni kullanm alanlarna sunulabilecek dzeyde retiminin byk faydalar getirecei aktr.

Kaynaklar1. Page, W. J., 1992b, Production of polyhydroxyalkanoates by Azotobacter vinelandii UWD in beet molasses culture, FEMS Microbiology Reviews, 103, 149-158. 2. http:// www. bact.wisc. edu/ScienceEd/BacterialPlastics.html 3. Lee, S. Y., 1996, Bacterial Polyhydroxyalkanoates, Biotechnology and Bioengineering, 49, 1-14. 4. Dave, H., Ramakrishna, C. and Desai, J. D., 1996, Production of polyhydroxybutyrate by petrochemical activated sludge and Bacillus sp. IPCB-403. Ind. Jour. Exp. Bio., 34: 216-219 5. Beyatl, Y., 1996, Mikrobiyal Termoplastik retimi, KKEM Dergisi, 19, 2, 23-32. 6. Aslm, B., Salam, N., Beyatl, Y., 1998, Topraktan izole edilen Baz Bacillus trlerinin Poly-- hydroxybutyrate (PHB) retim miktarlarnn belirlenmesi, Biyoteknolojide niversiteSanayi birlii Sempozyumu'98, Anadolu ni. Ve Biyoteknoloji Dernei, 23-24 Ekim 1998 Eskiehir. 7. Braunegg, G., Lefebvre, G., Genser, K. L., 1998, Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: Physiological and engineering aspects, Journal of Biotechnology, 65, 127-161. 8. Poirier, Y., 2002, Polyhydroxyalkanoate synthesis in plants as a tool for biotechnology and basic studies of lipid metabolism, Progress in Lipid Research, 41, 2, 131-155. 9. Labuzek S., and Radecka, I., 2001, Biosynthesis of PHB tercopolymer by Bacillus cereus UW85, Journal of Applied Microbiology, 90, 353-357. 10. Wu, Q., Huang, H., Hu, G., Chen, J., ho, K., Chen, G., 2001, Production of poly-3hydroxybutyrate by Bacillus sp. Jma5 cultivated in molasses media, Antonie van Leeuwenhoek, 80, 111-118. 11. Rosovitz, M., J., Voskuil, M., I., Chambliss, G., H., 1998, Bacillus, Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections, Systematic Bacteriology, by edited L. Collier, A. Balows and M. Sussman, Oxford University Press, Ninth Edition, Volume 2, New York. 12. Anderson, A., Dawes, E., 1990, Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydrxyalkanoates, Microbiological Reviews, 54, 4, 450-472. 13. Loosdrecht, M. C. M., Pot, M. A., Heijnen, J. J., 1997, Importance of bacterial storage polymers in bioprocesses, Wat. Sci. Tec., 35, 1, 41-47. 14. Pool, R., 1989, In search of the plastic potato, Science, 245, 1187-1189. 15. Madison, L. L., Huisman, G. W., 1999, Metabolic Engineering Hydrxyalkanoates): From DNA to Plastic, Mic. Mol. Bio. Reviews, 63, 21-53 16. http:// www. clt.astate.edu/dgilmore/Research%20students/phas.html 17. Holmes, P. A., 1985, Applications of PHB A Microbially produced Biodegradable Thermoplastic, Phys. Technol., 16, 32-36. of Poly(3-

26

18. Lafferty, R. M., Korsatko, B., Korsatko, W., 1988, Microbial produvtion of poly-hydroxybutyric acid, Biotechnology, edited by H. J. Rehm and G. Reed, Volume 6b, Special Microbial Processes, VCH Verlaggesellschaft, Weinheim. 19. Findlay, R. H. and White, D. C., 1983, Polymeric beta-hydroxyalkanoates from Environmental Samples and Bacillus megaterium, Appl. Environ. Microbiol., 45, 1, 71-78 20. Slater, S. Gallaher, T., Dennis, D., 1992, Production of polyhydroxybutyrate-co-3hydroxyvalerate) in a recombinant Escherichia coli strain, Applied and Environmental Microbiology, 58, 4, 1089-1094. 21. Nickerson, K. W., Zarnick W. J. and Kramer, V. C., 1981, Poly--Hydroxybutyrate parasporal bodies in Bacillus thuringiensis, FEMS Microbiology Letters, 12: 327-331. 22. McCool, G. J., Fernandez, T., Li, N., Cannon, M. C., 1996, Polyhydroxyalkanoate Inclusion Body growth and proliferation in Bacillus megaterium, FEMS Microbiol. Lett., 138, 41-48. 23. Valentin, H. E., Lee, E. Y., Choi, C. Y., Steinbchel, A.,1994, Identifications of 4hydroxyhexanoic acid as a new constituent of biosyntheticpolyhydroxyalkanoic acids from bacteria, Appl. Microbiol. Biotechnol.,40, 710-716. 24. http:// www. bio.umass.edu/biochem/cannon/htmlfiles/research.html 25. Dunlop, W. F., Robards, A. W., 1973, Ultrastructural Study of Poly-- hydroxybutyrate granules from Bacillus cereus, J. of Bacteriol. 114, 3, 1271-1280. 26. Taidi, B., Anderson, A., Dawes, E. A., Byrom, D., 1994, Effect of carbon source and concentration on the molecular mass of poly(3-hydroxybutyrate) produced by Methylobacterium extorquens and Alcaligenes eutrophus, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40, 786-790. 27. Steinbchel, A., Schlegel, H. G., 1991, Physiology and molecular genetics of poly(hydroxy-alkanoic acid) synthesis in Alcaligenes eutrophus, Molecular Microbiology, 5, 3, 535542. 28. Steinbchel, A., 1991, Recent advances in the Knowledge of the Metabolism of bacterial polyhydroxyalkanoic acids and potential impacts on the production of biodegradable thermoplastics, Acta Biotechnol., 11, 5, 419-427. 29. Weber, C. J., 2000, Biobased Packaging Materials for the food Industry, The EU Directorate 12, Frederiksberg. 30. Jan, S., Roblot, C., Courtois, J., Courtois, B., Barbotin, J. N. and Seguin, J. P., 1996, 1H NMR spectroscopic determinatin of poly 3-hydroxybutyrate extracted from microbial biomass, Enzyme and Microbial Technol., 18, 195-201. 31. Brandl, H., Gross, R. A., Lenz, R. W., Lloyd, R. and Fuller, R. C., 1991, The accumulation of poly(3-hydroxyalkanoates) in Rhodobacter sphaeroides, Arch. Microbiol., 155, 337-340. 32. Benoit, T. G., Wilson, G. R.and Baugh, C. L., 1990, Fermentation during growthand sporulation of Bacillus thuringiensis HD-1. Letters in Applied Microbiology,10: 15-18 33. Tavernier, P., Portais, J. C., Saucedo, J. E. N., Courtois, J., Courtois, B., Barbotin, J. N., 1997, Exopolysaccharide and poly--hydroxybutyrate coproduction in two Rhizobium meliloti strains, Applied and Environmental Microbiology, 63, 1, 21-26.

27

34. Bonartseva, G., A., Myskina, V. L., 1985, Fluorescence intensty of strains of nodule Bacteria (Rhizobium melliloti, R. phaseoli) differing in activity, Grown in the Presence Lipophilic vital stain phosphine 3R, Microbiol., 54, 4, 535-541. 35. Misra, A. K., Thakur, M. S., Srinivas, P., Karanth, N. G., 2000, Screening of poly-hydroxybutyrate-producing microorganism using Fourier transform infrared spectroscopy, Biotechnology Letters, 22, 1217-1219. 36. Yan, Y., Wu, Q., Zhang, R., 2000, Dynamic accumulation and degradation of poly(3hydroxyalkanoate)s in living cells of Azotobacter vinelandii UWD characterized by 13C NMR, FEMS Microbiology Letters, 193, 269-273. 37. Ostle, A., Holt, J. G., 1982, Nil Blue A as a fluorescent stain for poly--hydroxybutyrate, Applied and Environmental Microbiology, 44, 1, 238-241. 38. Bonartseva, G. A., 1985, Testing for activity of nodule bacteria in terms of poly-hydroxybutyrate accumulation following vital staining of the colonies with phosphine 3R, Microbiology, 54, 3, 371-374. 39. Pierce, L., Schroth, M. N., 1994, Detection of Pseudomonas colonies that accumulate poly--hydroxybutyrate on nile blue medium, Plant Disease, 78,7, 683-685. 40. McCool, G. J.and Cannon, M. C., 1999, Polyhydroxyalkanoate Inclusion BodyAssociated Proteins and Coding Region in Bacillus megaterium, J. Bacteriol.,181 (2), 585592. 41. Taguchi, S., Maehara, A., Takase, K., Nakahara, M., Nakmura, H., Doi, Y., 2001, Analysis of mutational effects of a polyhydroxybutyrate (PHB) polymerase on bacterial PHB accumulation using an in vivo assay system, FEMS Microbiology Letters, 198, 65-71. 42. Rehm, B. H. A., Antonio, R. V., Spiekermann, P., Amara, A. A., Steinbchel, A., 2002, Molecular characterization of the poly(3-hydroxybutyrate9 (PHB) synthase from Ralstobnia eutropha:in vitro evolution, site-specific mutagenesis and development of a PHB synthase protein model, Biochinmica et Biophysica Acta, 1594, 178-190. 43. Qi, Q., Rehm, B. H., 2001, Polyhydroxybutyrate biosynthesis in Caulobacter crescentus: molecular characterization of the polyhydroxybutyrate syntase, Microbiology, 147, 12, 33533358. 44. Miyake, M., Miyamoto, C., Schnackenberg, J., Kuraane, R., Asada, Y., 2000, Phosphotransacetylase as a key facytor in biological production of polyhydroxybutyrate, Applied Biochemistry and Biotechnology., 84-86, 1039-1044. 45. Chen, G. Q., Knig, K. H. and Lafferty, R. M., 1991, Occurrence of poly-D(-)-3hydroxyalkanoates in the genus Bacillus. FEMS Mic. Lett., 84:174-176. 46. Nguyen, S., Yu Ge, G. E., Marchessault R. H., 2002, Thermal degradation of poly(3hydroxyalkanoates): Preparation of well defined oligomers, Biomacromolecules, 3, 1, 219224. 47. Mergaert, J., Webb, A., Anderson, C., Wouters, A., Swings, J., 1993, Microbial degradation of poly(3-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) in soils, Applied and Environmental Microbiology, 59, 10, 3233-3238. 48. Yakabe, Y. Nohara, K., Hara, T., Fujino, Y., 1992, Factors affecting the biodegradability of biodegradable polyester in soil, Chemosphere, 25, 12, 1879-1888.

28

49. Abe, H., Kikkawa, Y., Iwata, T., Aoki, H., Akehata, T., Doi, Y., 2000, Microscopic visualization on crystalline morphologies of thin films for poly[(R)-3-hydroxybutyric acid ] and its copolymer, Polymer, 41, 867-874. 50. Abe, H., Doi, Y., 2002, Side-chain effect of second monomer units on crystalline morphology, thermal properties, and enzymatic degradability for random copolyesters of (R)3-hydroxybutyric acid with (R)-3-hydroxyalkanoic acids, Biomacromolecules, 3, 1, 133-138. 51. Kato, N., Konishi, H., Shimao, M. and Sakazawa, C., 1992, Production of 3Hydroxybutyric Acid Trimer by Bacillus megaterium B-124. Jour. Ferment. And Bioeng., 73, 3: 246-247. 52. Charles, T. C., Cai, G., Aneja, P., 1997, Megaplasmid and chromosomal Loci for the PHB degradation pathway in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti, Genetics, 146, 1211-1220. 53. Budwill, K., Fedorak, P. M., Page, W. J., 1996, Anaerobic microbial degradationof poly(3hydroxyalkanoates) with various terminal electron acceptors, Journal of Environmental Polymer, Degradation, 4, 2, 91-102. 54. Molitoris, H. P., Moss, S. t., de Koning, G. J. M., 1996, Scanning electron microscopy of polyhydroxyalkanoate degradation by bacteria, Appl. Microbiol. Biotechnol., 46, 570-579. 55. Khan, S. T., Hiraishi, A., 2001, Isolation and characterization of a new poly(3hydroxybutyrate)-degrading, denitrifying bacterium from activated sludge, FEMS Microbiology Letters, 205, 253-257. 56. Stieb, M., Schink, B., 1984, A new 3-hydroxybutyrate fermenting anaerobe, Ilyobacter polytropus, ge. Nov. sp. nov., possessing various fermentation pathways, Arch. Microbiol., 140, 139-146. 57. Sei, K., Nakao, M., Mori, K., Ike, M., Kohno, T., Fujita, M., 2001, Design of PCR primers and a gene probe for extensive detection of poly(3-hydroxybutyrate) (PHB)-degrading bacteria possessing fibronectin type III linker type-PHB depolymerases, Appl. Microbiol. Biotechnol. 55, 801-806. 58. Lootz, D., Behrend, D., Kramer, S., Freier, T., Haubold, A., Benkiesser, G., Schmitz, K. P., Becher, B., 2001, Laser cutting: influence on morphological and physicochemical properties of polyhydrxybutyrate, Biomaterials, 22, 2447-2452. 59. Chowdhury, B. and John, M., 1998, Thermal evaluation of transgenic cotton containing polyhydroxybutyrate, Thermochimica Acta, 313, 43-53. 60. Miller, N. D. and Williams, D. F., 1987, On the biodegradation of poly- -hydroxybutyrate (PHB) homopolymer and poly- -hydroxybutyrate-hydroxyvalerate copolymers, Biomaterials, 8, 129-137. 61. http:// www. snf.ch/de/com/prr/prr_arh_00feb21.asp 62. Yamurlu, M. F., Korkusuz, F., Grsel, I., Korkusuz, P., rs, ., Hasrc, V., J. 1999, Sulbactam-cefoperazone polyhydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate (PHBV) local antibiotic delivery system: in vivo effectiveness and biocompatibility in the treatment of implant-related experimental osteomyelitis, Biomed. Mater. Res., 46, 494-503. 63. Lee, S. Y., Yim, K. S., Chang, H. N., Chang, Y. K., 1994, Construction of plasmids, estimation of plasmid stability, and use of stable plasmids for the production of poly(3hydroxybutyric acid) by recombinant Escherichia coli, Journal of Biotechnology, 32, 203-211.

29

64. Tanaka, K., Katamune, K.,Ishizaki, A., 1993, Fermentative production of poly-Betahydroxybutryic acid from xylose by a two-stage culture method employing Lactococcus lactis IO-1 and Alcaligenes eutrophus, Biotechnology Letters., 15, 12, 1217-1222. 65. Doi, Y., Kunioka, M., Nakamura, Y., Soga, K., 1986, Nuclear Magnetic Resonance Studies on Poly ( Beta- hydroxybutyrate) and a Copolester of Beta- Hydroxyvalerate isolated from Alcaligenes eutrophus H16, Macromolecules, 19, 2860-2864. 66. Bloembergen, S., Holden, D., Hamer, G., Bluhm,T., Marchessault, R., 1986, Studies of Composition and Crystallinity of Bacterial Poly(- hydroxybutyrate-co--hydroxyvalerate), Macromolocules, 19, 2865-2871. 67. Ramsay, B. A., Lomaliza, K., Chavarie, C, Dube, B., Bataille, P., Ramsay, J. A., 1990, Production of poly-(-hydroxybutyric-co--hydroxyvaleric) acids, Applied and Environmental Microbiology, 56, 7, 2093-2098. 68. Page, W. J. and Cornish, A., 1993, Growth of Azotobacter vinelandii UWD in fish Peptone Medium and Simplified Extraction of Poly--hydroxybutyrate, Appl. Environ. Microbiol. 5, 12, 4236-4244.81. Asada, Y., Miyake, M., Miyake, J., Kurane, R. and Tokiwa, Y., 1999, Photosynthetic accumulation of poly(hydroxybutyrate) by cyanobacteria the metabolism and potential for CO2 recycling, nternational Journal of Biologicals Macromolecule.,25, 37-42. 69. Durner, R., Witholt, B., Egli, T., 2000, Accumulation of poly(3-hydroxyalkanoates in Pseudomonas oleovorans during growth with octanoate in continuous culture at different dilution rates, Applied and Enviromental Microbiology, 66, 8, 3408-3414. 70. Bertrand, J. L., Ramsay, B. A., Ramsay, J. A., Chavarie, C, 1990, Biosynthesis of poly-hydroxyalaknoates from Pentoses by Pseudomonas pseudoflava, Applied and Environmental Microbiology, 56, 10, 3133-3138. 71. Page, W. J., Sherburne, R., D'Elia, L., Graham, L. L., 1995, Poly(-hydroxybutyrate) extrusion from pleomorphic cells of Azotobacter vinelandii UWD, Can. J. Microbiol.,41, 2231. 73. Madden, L. A., Anderson, A. J., Asrar, J., Berger, P., Garrett, P.,2000, Production and characterization of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-4-hydroxybutyrate) synthesized by Ralstonia eutropha in fed-batch cultures, Polymer, 41, 3499-3505. 74. Page, W. J., 1992a, Suitability of commercial beet molasses fractions as substrates for polyhydroxalkanoate production by Azotobacter vinelandii UWD, Biotechnol. Lett., 14, 5, 385-390. 75. Witholt, B., Kessler, B., 1999, Perspectives of medium chain length poly(hydroxyalkanoates), a versatileset of bacterial bioplastics, Current Opinion in Biotechnology, 10, 279-285. 76. Gouda, M. K., Swellam A. E., Omar, S. H., 2001, Production of PHB by a Bacillus megaterium strain using sugarcane molasses and corn steep liquor as sole carbon and nitrogen sources, Microbiological Research, 156, 3, 201-207. 77. Law, K., Leung, Y., Lawford, H., Chua, H., Lo, W., Yu, P. H., 2001, Production of polyhydroxybutyrate by Bacillus species isolated from municipal activated sludge, Applied Biochemistry and Biotechnology, 91-93, 515-524. 78. Ahn, W. S., Park, S. J., Lee, S. Y., 2000, Production of poly(3-hydroxybutyrate) by fedbatch culture of recombinant Escherichia coli with a highly concentrated whey solution, Applied and Environmental Microbiology, 66, 8, 3624-3627.

30

79. Beaulieu, M., Beaulieu, Y.,Melinard, J., Pandian, S., Goulet, J., 1995, Influence of ammonium salts and cane molasses on growth of Alcaligenes eutrophus and production of polyhydroxybutyrate, Applied and Environmental Microbiology, 61, 1, 165-169. 80. Philippis, R., Ena, A., Guastini, M., Sili, C., Vincenzini, M., 1992, Factors affecting poly-hydroxybutyrate accumulation in cyanobacteria and in purple non-sulfur bacteria, FEMS Microbiology Reviews, 103, 187-194. 81. Asada, Y., Miyake, M., Miyake, J., Kurane, R. and Tokiwa, Y., 1999, Photosynthetic accumulation of poly(hydroxybutyrate) by cyanobacteria the metabolism and potential for CO2 recycling, nternational Journal of Biologicals Macromolecule., 25, 37-42. 82. Klinke, S., Ren, Q., Witholt, B., Kessler, B., 1999, Production of medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoates) from Gluconate by recombinant Escherichia coli, Applied and Environmental Microbiology, 65, 2, 540-548. 83. Kim, B. S., 2000, , Production of poly(3-hydroxybutyrate) from inexpensive substrates, Enzyme and Microbial Technology, 27, 774-777. 84. Kim, S. B, Lee, S. C., Lee, S. Y., Chang, H. N., Chang, Y. K., and Woo, S. I., 1994, Production of poly(3-hydroxybutyric Acid) by fed-batch culture of Alcaligenes eutrophus with glucose concentration control,Biotechnology and Bioengineering, 43, 892-898. 85. Bormann, E. J., Leissner, M., Beer, B., 1998, Growht-associated production of poly(hydroxybutyric acid) by Azotobacter beijerinckii from organic nitrojen substrates, Appl. Microbiol, Biotechnol., 49, 84-88. 86. Page, W. J., 1989, Production of poly--hydroxybutyrate by Azotobacter vinelandii strain UWD during growth on molasses and other complex carbon sources, Appl. Microbiol. Biotechnol., 31, 329-333. 87. Page, W. J. and Knosp, O., 1989, Hyperproduction of Poly--hydroxybutyrate during exponantial growth of Azotobacter vinelandii UWD, Appl. Environ.Microbiol. 55, 6, 13341339. 88. Lach, D. A., Sharma, V. K., and Vary, P. S., 1990, Isolation and characterization of a unique division mutant of Bacillus megaterium, J. Gen. Microbiol., 136, 545-553. 89. Beyatl, Y., Aslm, B., Mumcu, Z. N., 1999, Doada Paralanabilen Termobiyoplastiklerin retimi. Devlet Planlama Tekilat Projesi (DPT : 97K121150), s.21-37, Ankara, 90. Mercan, N., Beyatl, Y., 2001, Bacillus sphaericus sularnn poli--hidroksibtirat (PHB) retimlerinin incelenmesi, Biyoteknoloji (KKEM) Dergisi, 25, 2, 1-7. 91. Hoffmann, N., Steinbchel, A., Rehm, B. H. A., 2000, Homologous functional expression of cryptic phaG from Pseudomonaas oleovorans establishes the transacylase-mediated polyhydroxyalkanoate biosynthetic patway, Appl. Microbiol. Biotechnol.,54, 665-670. 92. Huisman, G. W., Leeuw, O., Eggink, G., Witholt, B., 1989, Synthesis of poly-3hydroxyalkanoates, is a common future of fluorescent Pseudomonads, Applied and Environmental Microbiology, 55, 8, 1949-1954. 93. Karaboz, ., Umay, F. B., 1994, Pseudomonas extorquens den PHB retiminde farkl karbon kaynaklarnn etkisi, XII. Ulusal Biyoloji Kongresi, 6-8 Temmuz 1994 Edirne, 14-17. 94. Daniel, M., Choi, J. H., Kim, J. H., Lebeault, J. M., 1992, Effect of nutrient deficiency on accumulation and relative molecular weight of poly--hydroxybutyric acid by methylotrophic bacterium, Pseudomonas 135, Appl. Microbiol. Biotechnol., 37, 702-706.

31

95. Xi, J., Wu, Q., Yan, y., Zhang, Z., Yu, P. H. F., Cheung, M. Zhang, R., Chen, G., 2000, Hyperproduction of polyester consisting of medium-chain-length hydroxyalkanoate monomers by strain Pseudomonas stutzeri 1317, Antonie van Leuwenhoek, 78, 43-49. 96. Ate, M., Ekmeki, S., 2001, Pancar melas kltrnde Pseudomonas extorquens DSM 1337 ve Azotobacter chrococcum (TEM)'dan PHB retimi, Biyoteknoloji (KKEM) Dergisi, 25, 3, 61-70. 97. Gomez, J. G. C., Rodrigues, M. F. A., Alli, R. C. P., Torres, B. B., Bueno Netto, C. L., Oliveira, M. S., da Silva, L. F., 1996, Evaluation of soil gram-negative bacteria yielding polyhydroxyalkanoic acids from carbohydrates and propionic acid, Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 785-791. 98. Bonartseva, G., A., Myskina, V. L., Zagreba, E. D., 1989, Relationship between poly-hydroxybutyrate content and nitrogenase and hydrogenase activity in some strains of Rhizobium, Mikrobiologiya, 58, 6, 920-922. 99. Bonartseva, G., A., Myskina, V. L., Zagreba, E. D., 1994, Poly--hydroxybutyrate content in cells of various Rhizobium species during growth with different carbon and nitrogen sources, Microbiol., 63, 1, 45-48. 100. Tal S. and Okon, Y., 1985, Production of the reserve material poly--hydroxybutyrate and its function in Azospirillum brasilense Cd, Can. J. Microbiol., 31, 608-613. 101. Lillo, J. G., Valera, F. R., 1990, Effects of culture conditions on poly(-hydroxybutyric acid) production by Haloferax mediterranei, Applied and Environmental Microbiology, 56, 8, 2517-2521. 102. Manna, A., Banerjee, R., Paul, A. K., 1999, Accumulation of poly(3-Hydroxybutyric acid) by some soil Streptomyces, Current Microbiology, 39, 153-158. 103. Semenov, A. M., Hanzlikova, A., Jandera, A., Quantitative estimation of poly-3hydroxybutyric acid in some oligotrophic polyprosthecate bacteria, Folia Microbiol., 34, 267270. 104. Beun, J. J., Dircks, K., van Loosdrecht, M. C. M., Heijnen, J. J., 2002, Poly-hydroxybutyrate metabolism in dynamically fed mixed microbial cultures, Water Research, 36, 1167-1180. 105. Wallen, L. L. and Rohwedder, K. W., 1974, Poly--hydroxyalkanoate from activated sludge, Environmental Science&Technology, 8, 6, 576-579. 106. Sim, S. J., snell, K. D., Hogan, S. a., stubbe, J., Rha, C., Sinskey, A. J., 1997, PHA synthase activity controls the molecular weight and polydispersity of polyhydroxybutyrate in vivo, Nature Biotechnology, 15, 63-67. 107. Fllner, C. G., Mller, S., Steinbchel, A., Babel, W., 1995, Biosynthesis of poly-3hydroxybutyric acid by the facultatively methanol-assimilating bacterium Mycoplasma rubra B346 and recombinant strains, J. Basic Microbiol., 35, 3, 179-188. 108. Hori, K., Kaneko, M., Tanji, Y., Xing, XH., Unno, H., 2002, Construction of self-disruptive Bacillus megaterium in response to substrate exhaustion for polyhydroxybutyrate production, Applied Microbiology and Biotechnology, 59(2-3), 211-216. 109. http:// www. sciam.com/2000/0800issuegerngross.html

32