BIOTECNOLOGIA DE LOSMICROORGANISMOS

Enzimas ligninolíticas

Dra. Isabel E. Cinto

isa.cinto@gmail.com

LigninaPolímeo fenólico -amorfo

Polímero aromático de alto PM, tridimensional, estructura estero-irregular amorfo,insoluble en agua.

Monómeros

La lignina está compuesta por unidades fenilpropano.Se sintetiza por polimeración oxidativa de los alcoholes ρ-cumarílico,coniferílico y sinapílico

Uniones

Unidades básicas ligadas entre sí por diferentes uniones C-C y uniones aril-éter

Tipos de lignina

Guayacil-lignina: principalmente coniferil alcohol(Gimnospermas, helechos, licopodios)

Guayacil-siringil-lignina: coniferil = sinapil alcohol, y cumaril en menor cantidad cumaril en menor cantidad (Angiospemas dicotiledóneas)

Guayaci-siringil-p.hidroxifenil-lignina: los 3 alcoholes + ácido cumárico(pastos)

Extracción de lignina

Laminilla media y pared secundaria contienen lignina

Pared secundaria > porcentaje del volumen celular, por lo tanto > parte de la lignina se localiza allí.

Debido a su estructura la lignina esDebido a su estructura la lignina esaltamente resistente a la degradación, yhasta el momento los únicosorganismos capaces de mineralizarlaefectivamente llevándola a CO2 y H2Ocomo productos finales son los hongosde pudrición blanca

Hongos xilófagos:

•Hongos de pudrición blanda: soft rot fungi

•Hongos de pudrición castaña: brown rot fungi

Existen tres tipos de pudrición que son química y morfológicamente distintosDerivan de formas de ataque enzmático y no enzimático diferente en la madera

•Hongos de pudrición blanca: white rot fungi

Pudrición blanda (soft rot)

La causan generalmente Ascomycota. Todos los componentes de la paredpueden ser degradados pero atacan preferentemente a la celulosa y forman amenudo cavidades microscópicas en la pared celular vegetal (tipo I) odegradan paulativamente toda la pared sin afectar a la laminilla media. Lamadera adquiere una apariencia blanda, amarronada que se torna quebradizacuando se seca.

La pudrición blanda aparece de color paja en fases avanzadas y puede serLa pudrición blanda aparece de color paja en fases avanzadas y puede serdefícil de distinguirla de la pudrición blanca.

Pudrición blanda (soft rot)

Penetración

1 2

Persiste laminillamedia y zonas ricasen guaiacil.

3 4

Chaetomium sp Xylaria sp.

Pudrición blanda (soft rot)

Pudrición castaña (brown rot)

Los hongos que causan pudrición castaña son generalmente Basidiomycotas.Remueven selectivamente celulosa y hemicelulosa de la madera. La maderapierde rapidamente sus propiedades de solidez y experimenta roturas drástica.En estados avanzados la madera es reducida a un residuo de trozos amorfos,blandos, castaños, cúbicos, compuestos mayormente de lignina ligeramentemodificada.Hay muchos menos hongos que causen pudrición castaña que pudricionblanca, y la mayoría afectan a las coníferas.blanca, y la mayoría afectan a las coníferas.

Pudrición castaña (brown rot)

Atacan las capas de la pared a distancia, desde el lumen celular (no soncapaces de degradar extensivamente a la lignina; lo que les facilitaría el accesoacorbohidratos), por lo tanto los agentes del deterioro deben ser moléculas muypequeñas para pasar por los poros de las paredes.

No tienen exoglucanasa y en cambio llevarían a cabo la solubilización de lacelulosa nativa por un mecanismo que involucra a la endoglucanasa y a factoresno proteicos, entre ellos H2O2 y Fe(II) (reactivo de Fenton: que produce radicaleslibres *OH muy reactivos que oxidan las cadenas de celulosa)libres *OH muy reactivos que oxidan las cadenas de celulosa)

Producen extracelularmente H2O2 y la madera contiene suficiente Fe(III).Recientemente se descubrió en Gloeophyllum trabeum un ciclo hidroquinona-quinona redox extracelular que reduce Fe(III) y produce H2O2.

En estadíos tempranos del decaimiento hay reducción de la fuerza mecánicade la madra pero no pérdida de peso seco, mientras que en la pudriciónblanca son dos procesos que progresan en paralelo. Esto se debe a que loshongos de pudrición castaña clivan completamente a través de las regionesamorfas de las microfibrillas antes de usar la celulosa, mientras que los depudrición blanca erosionan progresivamente la superficie de las microfibrillas yconsumen la celulosa a medida que esta es degradada.

Pudrición castaña (brown rot)

HemicelulosaCelulosaDifusión

1 2

Ligninamodificada

3 4

Hongos de pudrición castaña:

Laetiporus sulphureusLenzites sp.Poria placentaGloeophyllum trabeum

Pudrición blanca (white rot)

Son generalmente Basidiomycota, aunque hay algunos Ascomycota.

Tiene un sistema de celulasas, xilanasas y ligninasas que le permite degradartodos los componentes de ls paredes celulares de la madera.

La mayoría de los hongos xilófagos de los árboles caducifolios causanpudrición blanca. La ,adera atacada tiende a perder gradualmente suspropiedades de solidez y retiene su estructura fibrosa aún en estadosavanzados. Se vuelve esponjosa, filamentosa o laminada.avanzados. Se vuelve esponjosa, filamentosa o laminada.

Dado que la lignina es marrón o de color oscuro, su degradación deja lamadera de un color blanco o decolorado en los últimos estadíos del procesopudrición.

Pudrición blanca (white rot)

Dos patrones de ataque:

Remoción preferencial de lignina (degradación selectiva)

Eliminan la lignina de la laminilla media y de la pared secundaria casi porcompleto, quedando intactas grandes cantidades de celulosa de la capa S2de la pared y las células separadas entre sí.

Remoción simultánea de celulosa, lignina (degradación simultánea)

Dejan células perforadas o con paredes secundarias totalmente delgadas.

Estos patrones varían según:Especie fúngicaMadera degradadaDistintas zonas de la madera: tipos celularesque la componen, tipo de lignina y suconcentraciónFactores ambientales (temperatura, humedad,O2)

Ataque selectivo

Difusión HemicelulosaLignina

1 2

Pudrición blanca (white rot)

PectinaLignina

Células separadasCelulosa persiste

3 4

Ataque selectivo

Pudrición blanca (white rot)

Ataque simultáneo

Penetración

1 2

Pudrición blanca (white rot)

3 4

White-rot

Ataque simultáneo

Pudrición blanca (white rot)

Producen enzimas lignignolíticas con capacidadde degradación de colorantes sintéticos

Alta resistencia a toxicidad y metales pesados

Hongos de la pudriciónblanca

Excelente adaptación al método de fermentación en estado sólido

Hifas le otorgan gran adherencia al sustrato

Alta resistencia a toxicidad y metales pesados

Rango de temperatura de crecimiento y deactividad enzimática

Rango de pH de crecimiento y de actividad

Hongos de la pudriciónblanca

Rango de pH de crecimiento y de actividadenzimática

Falta de esporas vegetativas

Genera altas temperaturas metabólicas en SSF

No se lo puede agitar

Degradación de la ligninaLignina-Se forma por la polimerización al azar que da una estructura compleja eirregular.-La diversidad de uniones resentes e irregularidad de su estructura dificultan laproducción de enzimas capaces de reconocer y romper todos los enlaces.-Solución: producción de enzimas de baja especificidad que inician, pero nodirigen, reacciones exidativas en la lignina.

Kirk y Farrel (1987) llamaron a este proceso “combustión enzimática”: la enzimaKirk y Farrel (1987) llamaron a este proceso “combustión enzimática”: la enzimaactiva la lignina para superar una barrera energética e iniciar una fragmentaciónoxidativa termodinámicamente favorecida. La biodegradación de la lignina noprocede removiendo ordenadamente las unidades aromáticas periféricas,también involucra la oxidación de anillos aromáticos y cadenas en el interior delpolímero, incrementando así la solubilidad e higroscopicidad del núcleo delpolímero, paralelamente a la liberación de fragmentos de diferentes

Debido a que la lignina es un polímero insoluble, los estadíos iniciales de labiodegradación deben ser extracelulares. Los estadíos finales que conducen ala mineralización de la lignina que culmina en la liberación de CO2posiblemente se lleven a cabo en el interior de las hifas fúngicas.

Características de ligninasas

ExtracelularesInespecíficasAlto potencial redox

Enzimas ligninolíticasWhite rot fungi

- Lignin-peroxidasa (LiP)- Manganeso peroxidasa (MnP)- Lacasa (oxidasa)

No todos loshongos causantesde pudrición blancaposeen todas lasenzimas de estesistema

Enzimas productoras de H2O2:Glucosa oxidasaGlucosa oxidasa-2Glioxal oxidasa

intracelular

extracelular

Celobiosa-quinona.oxidorectasa (CBQ)Oxida celobiosa y reduce quinonas

Distintasestrategias dedegradación

Organismo modelo: Phanerochaete chrysosporium

Condiciones ligninólisis•Buena fuente carbonada•Nitrogeno limitante (2mM)•Requiere O2

Hay producción de:•H2O2•Veratril alcohol•Veratril alcohol•Polisacárido extracelular

Condiciones para producción de enzimas ligninolíticas

•Buena fuente carbonada (no lignina)

•NitrógenoLimitane (2mM) en Phanerochaete chrysosporumSuficiente en otros: Trametes trogii, Coriolus antarticus, etc.

•Inducción con:Metales: cobre, manganeso, otrosCompuestos arométicos_ ferúlico. Cumárico, xilidinaSustratos lignocelulósicos

•Enzimas ligninolíticas aparecen en general en la fase de metabolismosecundario.

•pHs óptimos para la actividad ligninolítica: ácidos (4-5)

Lignin-peroxidasa (LiP)H2O2 dependiente

Hemoproteína glicosidada extracelularSe caracteriza por su potencial redox inusualmente alto, lo cual permiteabstraer un electrón directamente desde el anillo aromático produciendoradicales aril-catiónicos

Actúa sobre grupos fenólicos y no fenólicos

La LiP es capaz de oxidar veratril alcohol, metabolito producidodurante el crecimiento secundario junto con la enzima.El veratril alcohol oxida compuestos aromáticos.Sería un mediador de la reacción: es oxidado por la LiP a veratrilaldehídoy luego puede oxidar al sustrato ligninaPor su tamaño pequeño puede difundir y actuar a cierta distancia de laenzima, permitiría la oxidación de la lignina a cierta distancia del sitioactivo de la enzima. Además protegería a la LiP contra la inactivación porel H2O2.

Lignin-peroxidasa (LiP)H2O2 dependiente

La enzima es oxidada por el H2O2 y pasa a un compuesto oxidadointermediario (compuesto I: deficiente de 2 e-). Éste retoma a su estadonativa por dos oxidaciones sucesivas: en dicho proceso oxida a la lignina

MediadorProtección anteH2O2 elevada

Manganeso peroxidasa (MnP)

Homoperoxidasa glicosiladaFunción principal: oxidación de Mn(II) a Mn(III), éste forma un complejocon ácidos orgánicos (como oxalato, malonato y lactato) y difunde lejos de laenzima para oxidar otros sustratos como la lignina.Oxida principalmente compuestos fenólicosMecanismos de acción del sistema Mn-peroxidasa-Mn

MnP + H2O2 MnP-I + H2O

MnP-I + Mn2+ MnP-II + Mn3+

MnP-II + Mn2+ MnP + Mn3+ + H2O

Mn3+ + RH Mn2+ + R- + H+

Lacasa

Es una polifenoloxidasa, que contiene cobre en su sitio activo y no requiere H2O2La adición de cobre a los medios de cultivo incrementa su producción.Cataliza: oxidación de σ y ρ-difenoles mediante la abstracción de 1 e- y q H+ desdeun hoxidrilo fenólico, generando radicales fenoxi y reduciendo el O2 a H2O.

Actúa sobre sustratos fenólicosPuede actuar sobre no fenólicos como mediadores (HBT:hidroxibenzotriazol)hidroxibenzotriazol)

Esta actividad enzimática se encuentra en plantas vasculares y hongos(Ascomycota, Basidiomycota y Deuteroycota)En las plantas vasculares participaría en la biosíntesis de lignina. En hongos enmorfogénesis del cuerpo fructífero y melanización.Otros roles sugeridos: detoxificación de quinonas de bajo PM y fenoles producidosdurante la degradación de lignina a través de su oxidación y posteriorpolinimerización.Puede tener también alguna relación con patogenisidad (capacidad de detoxificarcompuestos liberados por plantas atacadas como mecanismo de defensa)

mediadores

LacasaMediadores: moléculas pequeñas que actúan como dadores de e-, una vez oxidadas por la enzima, difunden y oxidan otros sustratos

Modo de acción:

Enzimas productoras de H2O2

La actividad de las peroxidasas depende del suministro de H2O2 extracelular

Glucosa oxidasaGlucosa oxidasa-2Glioxal oxidasa

intracelular

extracelular

Los azúcares pueden ser producidos por la acción de celulasa ohemicelulasas.hemicelulasas.El glioxal es un metabolito excretado por los hongos de pudrición blanca

Celobiohidrolasa (CBQ)Oxida a la celobiosa y otros carbohidratos yreduce quinonas y los radicalesprooducidos por acción de las ligninasas

En la biodegradación de la lignina se forman quinonas intermediarias