Biosynthèse du lactosucrose à partir du lactose et du saccharose ...

Biosynthèse du lactosucrose à partir du lactose et du saccharose par approche homogène en utilisant la

β-galactosidase libre et par approche hétérogène en utilisant la β-galactosidase immobilisée sur différents

matériaux siliceux mésoporeux

Mémoire

Zeineb Ben Rejeb

Maîtrise en génie agroalimentaire Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

© Zeineb Ben Rejeb, 2014

III

Résumé court

Le lactosucrose est un trisaccharide synthétisé par la bioconversion du lactose et du

saccharose en utilisant la β-galactosidase à partir d’Aspergillus oryzae.

La production industrielle du lactosucrose est onéreuse à cause du coût élevé des

enzymes, d’où le recours à immobiliser ces enzymes. Dans cette optique, sept différents

matériaux siliceux mesostructurés ont été utilisés pour immobiliser la β-galactosidase, en

utilisant le glutaraldhéyde. La majorité des matériaux présente une bonne activité.

Cependant, l’enzyme immobilisée sur la silice en forme de mousse montre un rendement

maximal, dépassant celui de l’enzyme libre. En plus, un rendement équivalent à 75% de

celui obtenu à la première utilisation du matériau est maintenu pour la plupart des

biocatalyseurs, après un 5ème recyclage.

Une concentration équimolaire de 60% entre les substrats, un pH de 5 et une température

de 40°C se sont révélés optimaux pour la production du lactosucrose qui a atteint une

concentration de 76,27 g/L.

V

Résumé long

Les oligosaccharides sont des glucides qui modulent la flore colique et améliorent

l’équilibre de la santé humaine. Ils sont largement utilisés comme prébiotiques. Le

lactosucrose est un oligosaccharide qui attire de plus en plus le milieu scientifique et

industriel. Il est un trisaccharide (Glucose-Fructose-Galactose), non digestible avec un

pouvoir sucrant faible. Ce trisaccharide peut être synthétisé par voie enzymatique, via la

bioconversion du lactose et du saccharose, et ceci en utilisant la levansucrose, la

fructofuranosidase ou la β-galactosidase.

Durant ce travail, la β-galactosidase extraite à partir d’Aspergillus oryzae a été utilisée

pour synthétiser le lactosucrose. Dans un premier temps, et afin d’optimiser le rendement

en lactosucrose, nous avons étudié différents paramètres avec l’enzyme libre. Une

concentration équimolaire de 60% entre le lactose et le saccharose, un pH de 5 et une

température de 40°C se sont révélés optimaux pour la production du lactosucrose.

L’optimum est obtenu avec un rendement de 25% (76,27 g/L) en lactosucrose. Un sous-

produit a été isolé, il s’agit d’un autre oligosaccharide (tetrahexose) avec une

concentration de 14,52 g/L. La production actuelle du lactosucrose et d’autres

oligosaccharides à l’échelle industrielle est onéreuse due au coût élevé des enzymes, d’où

le recours à immobiliser celles-ci pour pouvoir les recycler et les réutiliser et par

conséquent, minimiser les coûts de production. Dans cette deuxième partie, nous avons

utilisé sept différents matériaux siliceux pour immobiliser l’enzyme (β-galactosidase

d’Aspergillus oryzae) en utilisant le glutaraldéhyde (GA) comme agent de ‘cross-linking’, et

effectuer la réaction de transglycosylation par la suite dans une approche hétérogène et

comparer le rendement de la réaction avec celui de l’enzyme libre (approche homogène).

Les matériaux synthétisés ont différentes tailles de pores qui varient de 5 à 24 nm et aussi

différentes formes poreuses (hexagonale, cubique, sphérique, forme d’oignon, etc.). Cette

différence de taille et de forme a affecté énormément la rétention enzymatique par ces

matériaux ainsi que le rendement de la réaction en phase hétérogène.

La majorité des matériaux synthétisés présentent une bonne activité. Cependant,

l’enzyme immobilisée sur la silice en forme de mousse (MCF) montre un rendement

maximal, qui dépasse celui obtenu par l’enzyme libre, ce qui confirme que l’immobilisation

d’enzyme sur des supports siliceux mesostructurés peut conférer à l’enzyme des

VI

conditions réactionnelles améliorées afin d’augmenter sa stabilité et par conséquent sa

performance.

Le recyclage de ces biocatalyseurs a été effectué 5 fois successives. Le rendement

obtenu à la 5ème régénération est équivalant à plus que 80% du rendement initial pour la

majorité des matériaux testés.

VII

Abstract

Oligosaccharides are non-digestible carbohydrates that modulate the colonic flora, and

improve the human health balance. They are widely used as prebiotics. Lactosucrose is an

oligosaccharide increasingly attracting scientists and industrials. It is a non-digestible

trisaccharide (Glucose-Fructose-Galactose) with a low sweetening power. This

trisaccharide can be synthesized enzymatically through bioconversion of lactose and

sucrose, using the levansucrose, the fructofuranosidase and the β-galactosidase.

During this work, Aspergillus oryzae β-galactosidase was used to synthetize the

lactosucrose. First, and for lactosucrose yield optimization, we investigated different

parameters with the free enzyme in solution. Equimolar concentrations of 60% lactose and

sucrose, a pH of 5, and a temperature of 40°C, have been found optimal for lactosucrose

production. Optimum lactosucrose yield of 25% (76.27 g/L) was obtained under these

conditions. Another oligosaccharide (tetrahexose) was also isolated as a by-product with a

concentration of 14.52 g/L, so that the biosynthesis produced a total oligosaccharides yield

of 30%.

Currently, the production of lactosucrose and other oligosaccharides at the industrial scale

is still highly costly due to the high cost of enzymes. Thus, immobilizing them is greatly

beneficial being able to be recycled and reused, and therefore minimizes the production

process costs. In this second part, we used seven different highly structuredsiliceous

materials for the enzyme immobilization (Aspergillus oryzae β -galactosidase) using

glutaraldehyde (GA) as a cross-linking agent, and then performing the transglycosylation

reaction in a heterogeneous approach, as well as comparing the reaction yield with that

obtained with free enzyme in solution (homogeneous approach). The materials have pore

sizes ranging from 5 to 24 nm, with different porous shapes (hexagonal, cubic, spherical,

rod-like, vesicle-like, etc.). These differences in size and shape affected greatly the

enzyme immobilization on these materials as well as the heterogeneous phase reaction

yield.

Most materials exhibit good activity. However, the enzyme immobilized on mesostructured

cellular silica foam (MCF) shows a maximum yield, which exceeded that obtained with free

enzyme, confirming that immobilization of enzyme on mesostructured silica supports may

VIII

improve the enzyme performance under the investigated conditions by increasing its

stability and therefore its catalytic activity and selectivity.

Theses biocatalysts were regenerated and recycled, and then they were involved in five

successive cycles. The yield obtained on the 5th cycle represented more than 80% of the

initial yield for 86% of the tested materials.

IX

Table des matières

RÉSUMÉ COURT .............................................................................................................................. III

RÉSUMÉ LONG .................................................................................................................................. V

ABSTRACT ....................................................................................................................................... VII

TABLE DES MATIERES .................................................................................................................... IX

LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................................... XIII

LISTE DES FIGURES ....................................................................................................................... XV

LISTE DES ABRÉVIATIONS ET DES SIGLES ............................................................................... XXI

DÉDICACE .....................................................................................................................................XXIII

REMERCIEMENTS ........................................................................................................................ XXV

AVANT-PROPOS ......................................................................................................................... XXVII

CHAPITRE 1. INTRODUCTION GENERALE ................................................................................ 1

CHAPITRE 2. REVUE DE LITTERATURE .................................................................................... 3

2.1. LACTOSÉRUM ........................................................................................................................ 3

2.1.1. Définition et composition ............................................................................................. 3

2.1.2. Utilisation et valorisation du lactosérum ...................................................................... 5

2.2. LACTOSE ............................................................................................................................... 7

2.2.1. Production et composition ........................................................................................... 7

2.2.2. Applications du lactose .............................................................................................. 10

2.3. OLIGOSACCHARIDES ET ALIMENTS FONCTIONNELS ................................................................. 12

2.3.1. Oligosaccharide : Définition et propriété ................................................................... 12

2.3.2. Aliments fonctionnels: définition et propriétés ........................................................... 14

2.4. LE LACTOSUCROSE .............................................................................................................. 15

2.4.1. Structure .................................................................................................................... 15

2.4.2. Caractéristiques et production mondiale ................................................................... 15

2.4.3. Synthèse du lactosucrose ......................................................................................... 18

2.5. Β–GALACTOSIDASES: STRUCTURE, PRODUCTION, MECANISME DE REACTION ET APPLICATION .. 22

2.5.1. Structure .................................................................................................................... 22

2.5.2. Production ................................................................................................................. 23

2.5.3. Mécanisme de la réaction et applications ................................................................. 25

2.5.4. β-Galactosidase de Aspergillus oryzae et son activité de transgalactosylation........ 27

2.6. IMMOBILISATION DES ENZYMES ............................................................................................. 28

X

2.6.1. Avantage d’immobilisation des enzymes .................................................................. 29

2.6.2. Immobilisation des enzymes : supports .................................................................... 30

2.6.3. Méthode d’immobilisation des enzymes .................................................................... 34

2.7. CONCLUSION ....................................................................................................................... 42

CHAPITRE 3. HYPOTHESES ET OBJECTIFS DE RECHERCHE ICI ........................................ 43

3.1. HYPOTHÈSES DU TRAVAIL ..................................................................................................... 43

3.2. OBJECTIFS DE TRAVAIL ......................................................................................................... 43

3.2.1. Objectif principal ........................................................................................................ 43

3.2.2. Objectifs spécifiques .................................................................................................. 43

CHAPITRE 4. MATERIELS ET METHODES ............................................................................... 45

4.1. MATERIELS BIOLOGIQUES ..................................................................................................... 45

4.2. PRODUITS CHIMIQUES .......................................................................................................... 45

4.3. ÉQUIPEMENTS ..................................................................................................................... 46

4.4. METHODOLOGIE ................................................................................................................... 46

4.4.1. Réaction enzymatique avec l’enzyme libre (approche homogène) ........................... 46

4.4.2. Les analyses HPLC ................................................................................................... 48

4.4.3. Calculs des rendements ............................................................................................ 48

4.4.4. Purification et caractérisation des produits formés .................................................... 48

4.4.4.1. UPLC-MS ............................................................................................................................ 48

4.4.4.2. Analyse du lactosucrose par résonance magnétique nucléaire .......................................... 49

4.4.5. La synthèse des supports .......................................................................................... 49

4.4.5.1. Synthèse du support mésoporeux SBA-15 ......................................................................... 49

4.4.5.2. Synthèse de nanomateriaux en forme de barre (Rod-like) ‘’S2.9’’ et en forme de vésicule

(Vesicle-like) ‘’S34.8’’ ........................................................................................................................... 50

4.4.5.3. Synthèse des MCF (Mesocellular Siliceous Foams) ........................................................... 50

4.4.5.4. Synthèse de LP-FDU-12 ..................................................................................................... 51

4.4.6. Caractérisations des supports ................................................................................... 51

4.4.6.1. Analyses BET ..................................................................................................................... 51

4.4.6.2. Diffraction des rayons X (DRX) ........................................................................................... 52

4.4.6.3. Analyses de Microscopie Électronique à Transmission (MET) ........................................... 52

4.4.7. Immobilisation de β-Galactosidase ........................................................................... 52

4.4.7.1. Immobilisation ‘Cross-linking’ .............................................................................................. 52

4.4.7.2. Rétention d’enzymes par les supports ................................................................................ 53

4.4.8. Réaction enzymatique avec l’enzyme immobilisée (approche hétérogène) ............. 54

4.4.9. Analyses statistiques ................................................................................................. 55

CHAPITRE 5. RESULTATS ET DISCUSSIONS .......................................................................... 57

5.1. RÉACTION ENZYMATIQUE ...................................................................................................... 57

XI

5.1.1. Identification des produits par HPLC, spectrométrie de masse et par la RMN du

proton 57

5.2. RÉACTION ENZYMATIQUE EN PHASE HOMOGÈNE .................................................................... 67

5.2.1. La cinétique de la réaction enzymatique ................................................................... 67

5.2.2. Effet de la concentration enzymatique ...................................................................... 68

5.2.3. Effet de concentration des substrats ......................................................................... 74

5.2.4. Effet du pH................................................................................................................. 80

5.2.5. Effet de la température .............................................................................................. 82

5.2.6. Conclusion ................................................................................................................. 85

5.3. REACTION ENZYMATIQUE EN PHASE HETEROGENE ................................................................. 87

5.3.1. Caractérisation des matériaux................................................................................... 87

5.3.1.1. SBA-15 ............................................................................................................................... 87

5.3.1.1.1. Analyse de la surface BET ........................................................................................... 87

5.3.1.1.2. Analyse par diffraction des rayons X (DRX) ................................................................. 88

5.3.1.1.3. Microscopie Électronique à Transmission (MET) ......................................................... 89

5.3.1.2. Mousse mésocellulaire (MCF) ............................................................................................ 90




5.3.1.3. Nanomatériaux sous forme de barres (rod-like) S-2,9 et sous forme de vésicules (vesicle-

like) S-34,8 ........................................................................................................................................... 94




5.3.1.4. Les LP-FDU-12 ................................................................................................................... 99


5.3.1.4.2. Analyse par diffraction des rayons X (DRX) ............................................................... 101

5.3.1.4.3. Microscopie Électronique à Transmission (MET) ....................................................... 103

5.3.2. Immobilisation de β-galactosidase .......................................................................... 105

5.3.2.1. Effet de pH sur la rétention des enzymes ......................................................................... 106

5.3.2.2. Effet de la concentration d’enzyme sur la quantité immobilisée lors de la rétention ......... 107

5.3.2.3. Effet de la concentration de Glutaraldéhyde (GA) sur la rétention des enzymes

immobilisées ...................................................................................................................................... 113

5.3.3. Réaction de transglycosylation avec l’enzyme immobilisée ................................... 115

5.3.3.1. Réactivité de la β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée sur la MCF .............. 115

5.3.3.2. Réactivité de la β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée sur la SBA-15 ......... 118

5.3.3.3. Réactivité de la β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée sur la S-2.9 ............. 120

5.3.3.4. Réactivité de la β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée sur la S-34.8 ........... 123

5.3.3.5. Réactivité de la β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée sur la S-10-100 ....... 125

5.3.3.6. Réactivité de la β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée sur la S-15-100 ....... 128

XII

5.3.3.7. Réactivité de la β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée sur la S-T-100 ......... 130

5.3.3.8. Comparaison entre la réactivité des matériaux ................................................................. 134

5.3.4. Activité des biocatalyseurs synthétisé après recyclage .......................................... 136

CONCLUSION GÉNÉRALE ............................................................................................................ 143

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................................... 145

ANNEXES........................................................................................................................................ 153

XIII

Liste des tableaux

TABLEAU 1. COMPOSITION DU LAIT BOVIN ET DU LACTOSERUM (SMITHERS ET AL., 1996) ..................................................... 4

TABLEAU 2. COMPOSITION MOYENNE DU LAIT SELON L’ESPECE (G/L) ................................................................................ 8

TABLEAU 3. PRODUCTION DES OLIGOSACCHARIDES DE QUALITE ALIMENTAIRE ESTIMEE EN 1995 .......................................... 17

TABLEAU 4. CONDITIONS ET RENDEMENT EN LACTOSUCROSE PAR LES DIFFÉRENTES ESPÈCES ENZYMATIQUES............................ 21

TABLEAU 5. SOURCE DE Β GALACTOSIDASE ................................................................................................................. 24

TABLEAU 6. LES PRINCIPAUX PRODUITS FABRIQUÉS À L'ÉCHELLE INDUSTRIELLE EN UTILISANT DES ENZYMES IMMOBILISÉES

(BORNSCHEUER, 2008) ................................................................................................................................. 30

TABLEAU 7. PROPRIÉTÉS CARACTÉRISTIQUES DES DIFFÉRENTS MATÉRIAUX DE SILICE MÉSOPOREUSES UTILISÉS POUR ENCAPSULER

DES ENZYMES ............................................................................................................................................... 34

TABLEAU 8. DIFFERENTES METHODES ET DIFFERENTS SUPPORTS D’IMMOBILISATION DE Β-GALACTOSIDASE A PARTIR DE

ASPERGILLUS ORYZAE ..................................................................................................................................... 40

TABLEAU 9. LES CONDITIONS OPERATOIRES DE LA BIOSYNTHESE DE LACTOSUCROSE A PARTIR DE LACTOSE ET DE SACCHAROSE ..... 47

TABLEAU 10. PREPARATION DES STANDARDS A CONCENTRATION PROTEIQUE CONNUE ........................................................ 53

TABLEAU 11. RECAPITULATIF DES DEPLACEMENTS CHIMIQUES DU GOS I ANALYSE PAR RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE (1H-

RMN) ET IDENTIFIE COMME DU LACTOSUCROSE. ................................................................................................. 64

TABLEAU 12. LES DIFFERENTES CONCENTRATIONS DE SACCHAROSE ET DE LACTOSE ETUDIEES POUR LA BIOSYNTHESE DE

LACTOSUCROSE ............................................................................................................................................. 74

TABLEAU 13. LES PROPRIETES TEXTURALES DES SUPPORTS SYNTHETISES. ........................................................................ 105

TABLEAU 14. RESULTATS DU TEST DU TUKEY POUR LA MCF ET LA CONCENTRATION D’ENZYME ........................................... 110

TABLEAU 15. RESULTATS DU TEST DE TUKEY POUR LA S 2,9 ET LA CONCENTRATION D’ENZYME ........................................... 111

TABLEAU 16. RESULTATS DU TEST DE TUKEY POUR LA S 34,8 ET LA CONCENTRATION D’ENZYME ......................................... 111

TABLEAU 17. RESULTATS DU TEST DE TUKEY POUR LA S-T-100 ET LA CONCENTRATION D’ENZYME ...................................... 112

TABLEAU 18. RESULTATS DU TEST DE TUKEY POUR LA S-15-100ET LA CONCENTRATION D’ENZYME ..................................... 112

TABLEAU 19. RESULTATS DU TEST DE TUKEY POUR LA S-10-100 ET LA CONCENTRATION D’ENZYME .................................... 112

TABLEAU 20. RESULTATS DU TEST DE TUKEY POUR LA S 34,8 ET LES CONCENTRATIONS DE GA ........................................... 114

TABLEAU 21. RESULTATS RECAPITULATIFS DES RENDEMENTS EN GALACTO-OLIGOSACCHARIDES (LACTOSUCROSE ET TETRAHEXOSE)

OBTENUS AVEC L’ENZYME IMMOBILISEE SUR LES DIFFERENTS MATERIAUX ............................................................... 133

XV

Liste des figures

FIGURE 1. CAILLES (COAGULATION DE LA CASEINE) ET LACTOSERUM .................................................................................. 4

FIGURE 2. PRINCIPAUX PRODUCTEURS DE FROMAGE DANS LE MONDE EN 2005 (EXPRIMES EN MILLIERS DE TONNES) .................. 5

FIGURE 3. L'UTILISATION COMMERCIALE DE LACTOSERUM DE LAIT ..................................................................................... 7

FIGURE 4. STRUCTURE CHIMIQUE DU LACTOSE............................................................................................................... 9

FIGURE 5. STRUCTURE DES MOLECULES DE LACTOSE EN CONFIGURATION Α ET Β (GÄNZLE ET AL., 2008) ............................. 9

FIGURE 6. VOIES DE TRANSFORMATION DE LACTOSE: LES DERIVES DE LACTOSE (SEKI AND SAITO, 2012) .......................... 11

FIGURE 7. REPRESENTATION SCHEMATIQUE DU PROCESSUS DE PRODUCTION D'OLIGOSACCHARIDES (SAKO ET AL., 1999) ..... 13

FIGURE 8. STRUCTURE DE LACTOSUCROSE .................................................................................................................. 15

FIGURE 9. BIOSYNTHESE DE LACTOSUCROSE PAR A: TRANSFRUCTOSYLATION ET B: TRANSGALACTOSYLATION (DAUDE ET AL., 2012,

LI ET AL., 2009) ........................................................................................................................................... 19

FIGURE 10. REACTIONS D’HYDROLYSE DE SACCHAROSE ET DE LACTOSUCROSE (FUJITA ET AL., 1990) ................................ 21

FIGURE 11. STRUCTURE 3-D DE Β-D-GALACTOSIDASE (A PARTIR DE PROTEIN DATA BANK). ................................................. 23

FIGURE 12. MECANISME DE REACTION POUR LA HYDROLYSE ET LA TRANSGLYCOSYLATION DU LACTOSE PAR KLUYVEROMYCES LACTIS

Β-GALACTOSIDASE (ZHOU AND CHEN, 2001) ............................................................................................... 26

FIGURE 13. LA BIOSYNTHESE DE LACTOSUCROSE ET SES ANALOGUES PAR Β-GALACTOSIDASE DE BACILLUS CIRCULANS A PARTIR DU

LACTOSE ET DU SACCHAROSE COMME SUBSTRATS (LI ET AL., 2009, MU ET AL., 2013) ...................................... 26

FIGURE 14. COMPARAISON DE LA TAILLE DES PORES DE CERTAINS MATERIAUX NANOPOREUX ET LA TAILLE MOYENNE MOLECULAIRE

DE CERTAINES ENZYMES COURAMMENT UTILISES (HUMPHREY AND WRIGHT, 2004) .................................................. 32

FIGURE 15. SCHEMA REPRESENTATIF DE HMMS (KIM ET AL., 2007) .............................................................................. 33

FIGURE 16. IMMOBILISATION COVALENTE DE L'ENZYME SUR UN SUPPORT: (A) DES RESIDUS D'ACIDE AMINE ACTIF; (B)

FONCTIONNALITE DE LIAISON DU SUPPORT; (C) SUPPORT; (D) ESPACE (CAO, 2006) .................................................. 36

FIGURE 17. REPRESENTATION DE L’IMMOBILISATION DES ENZYMES PAR ENCAPSULATION ..................................................... 36

FIGURE 18. REPRESENTATION DE L’IMMOBILISATION PAR RETICULATION «CROSS-LINKING» (KIM ET AL., 2008) .................. 38

FIGURE 19. CHROMATOGRAMME DES SOLUTIONS STANDARDS DES SUCRES (0,5G/L CHAQUE STANDARD). AVEC : A) SACCHAROSE,

B) LACTOSE, C) GLUCOSE, D) GALACTOSE, E) FRUCTOSE. ........................................................................................ 58

FIGURE 20. CHROMATOGRAMME TYPIQUE DES SUBSTRATS ET DES PRODUITS FORMES PAR TRANSGALACTOSILATION ET HYDROLYSE

................................................................................................................................................................. 59

FIGURE 21. MECANISME PROPOSE POUR LA BIOSYNTHESE DE LACTOSUCROSE AVEC LA Β-GALACTOSIDASE D’ASPERGILLUS ORYZAE

................................................................................................................................................................. 60

FIGURE 22. SPECTRE MS DU GOS I .......................................................................................................................... 61

FIGURE 23. SPECTRE 13C-RMN DU GOS I ................................................................................................................ 62

FIGURE 24. SPECTRE 1H- RMN DU GOS I ................................................................................................................. 63

FIGURE 25. SPECTRE MS DU GOS II ......................................................................................................................... 66

FIGURE 26. CINETIQUE DE LA REACTION DE CONVERSION DES SUBSTRATS ET LA FORMATION DES PRODUITS ............................. 68

XVI

FIGURE 27. EFFET DE LA CONCENTRATION D'ENZYME SUR LA PRODUCTION DU LACTOSUCROSE .............................................. 69

FIGURE 28. EFFET DE LA CONCENTRATION D'ENZYME SUR LA PRODUCTION DU TETRAHEXOSE ................................................ 70

FIGURE 29. EFFET DE LA CONCENTRATION D'ENZYME SUR LA BIOCONVERSION DU LACTOSE .................................................. 71

FIGURE 30. LA FORMATION DE GALACTOSE (PRODUIT D'HYDROLYSE DE LACTOSE) AVEC DIFFÉRENTES CONCENTRATIONS D'ENZYME

.................................................................................................................................................................. 73

FIGURE 31. LA FORMATION DE GLUCOSE (PRODUIT D'HYDROLYSE DE LACTOSE AVEC DIFFÉRENTES CONCENTRATIONS D'ENZYME .. 73

FIGURE 32. EFFET DE LA CONCENTRATION INITIALE DE LACTOSE AVEC LE RAPPORT MOLAIRE DES SUBSTRATS 1:1 SUR LA

PRODUCTION DES GOS TOTAUX ....................................................................................................................... 75

FIGURE 33. EFFET DE LA CONCENTRATION INITIALE DE SACCHAROSE AVEC LE RAPPORT MOLAIRE DES SUBSTRATS 2:1 SUR LA






FIGURE 36. EFFET DE LA CONCENTRATION DES REACTIFS INITIAUX SUR LE RENDEMENT DU LACTOSUCROSE ............................... 78

FIGURE 37. EFFET DE LA CONCENTRATION DES REACTIFS INITIAUX SUR LE RENDEMENT DU TETRAHEXOSE ................................. 78

FIGURE 38. EFFET DE LA CONCENTRATION ET LES RAPPORTS MOLAIRES SUR LA FORMATION DU GALACTOSE ............................. 79

FIGURE 39. EFFET DE LA CONCENTRATION ET LES RAPPORTS MOLAIRES SUR LA FORMATION DU GLUCOSE ................................ 80

FIGURE 40. EFFET DU PH SUR LA CONVERSION DE LACTOSE ............................................................................................ 81

FIGURE 41. EFFET DU PH SUR LE RENDEMENT EN GOS TOTAUX ...................................................................................... 82

FIGURE 42. EFFET DE LA TEMPERATURE SUR LA CONVERSION DU LACTOSE ......................................................................... 83

FIGURE 43. EFFET DE LA TEMPERATURE SUR LA FORMATION DES GOS ............................................................................. 84

FIGURE 44. EFFET DE LA TEMPERATURE SUR LE RENDEMENT EN LACTOSUCROSE ................................................................. 84

FIGURE 45. EFFET DE LA TEMPERATURE SUR LE RENDEMENT EN TETRAHEXOSE ................................................................... 85

FIGURE 46. LES ISOTHERMES D'ADSORPTION/DESORPTION D'AZOTE POUR LA SBA-15. LA FIGURE INSEREE REPRESENTE LA

DISTRIBUTION DE LA TAILLE DES PORES. .............................................................................................................. 88

FIGURE 47. LE DIFFRACTOGRAMME (DRX) OBTENU AUX PETITS ANGLES OBTENUS POUR LA SBA-15 ..................................... 89

FIGURE 48. MICROGRAPHES MET DE LA SBA-15 OBSERVE DE DIFFERENTS ANGLES............................................................ 90

FIGURE 49. LES ISOTHERMES D'ADSORPTION/DESORPTION D'AZOTE POUR LA MCF. LA FIGURE INSEREE REPRESENTE LA

DISTRIBUTION DE LA TAILLE DES PORES ............................................................................................................... 91

FIGURE 50. LE DIFFRACTOGRAMME (DRX) OBTENU AUX PETITS ANGLES OBTENUS POUR LA MCF ......................................... 92

FIGURE 51. MICROGRAPHE D’ELECTRON DE TRANSMISSION DE LA MCF (20 NM) .............................................................. 93

FIGURE 52. LES ISOTHERMES D'ADSORPTION/DESORPTION D'AZOTE POUR LA S-2.9. LA FIGURE INSEREE REPRESENTE LA


XVII

FIGURE 53. LES ISOTHERMES D'ADSORPTION/DESORPTION D'AZOTE POUR LA S-34,8. LA FIGURE INSEREE REPRESENTE LA


FIGURE 54. LE DIFFRACTOGRAMME (DRX) OBTENU AUX PETITS ANGLES POUR S-2.9 .......................................................... 96

FIGURE 55. LE DIFFRACTOGRAMME (DRX) OBTENU AUX PETITS ANGLES POUR S-34.8 ........................................................ 97

FIGURE 56. MICROGRAPHE MET DES SILICES SOUS FORME DE BARRES (S2.9 7.7 NM) ....................................................... 98

FIGURE 57. MICROGRAPHE MET DES SILICES SOUS FORME DES VESICULES (S-34.8 16.7 NM) ............................................. 98

FIGURE 58. LES ISOTHERMES D'ADSORPTION/DESORPTION D'AZOTE POUR LA S-10-100 ..................................................... 99

FIGURE 59. LES ISOTHERMES D'ADSORPTION/DESORPTION D'AZOTE POUR LA S-15-100 ................................................... 100

FIGURE 60. LES ISOTHERMES D'ADSORPTION/DESORPTION D'AZOTE POUR LA S-T-100 ..................................................... 100

FIGURE 61. LE DIFFRACTOGRAMME (DRX) OBTENU AUX PETITS ANGLES OBTENUS POUR LA S-10-100 ................................ 101

FIGURE 62. LE DIFFRACTOGRAMME (DRX) OBTENU AUX PETITS ANGLES OBTENUS POUR LA S-15-100 ................................ 102

FIGURE 63. LE DIFFRACTOGRAMME (DRX) OBTENU AUX PETITS ANGLES OBTENUS POUR LA S-T-100 .................................. 103

FIGURE 64. MICROGRAPHE MET DE LA S-10-100(24 NM) ........................................................................................ 104

FIGURE 65. MICROGRAPHE MET DE LA S-15-100(19-20 NM) ................................................................................... 104

FIGURE 66. MICROGRAPHE MET DE LA S-T-100(7.5 NM) ......................................................................................... 104

FIGURE 67. EFFET DU CHANGEMENT DE PH SUR LA RETENTION DES MATERIAUX ............................................................... 106

FIGURE 68. DISTRIBUTION DE RETENTION PRESENTEE PAR LA PROCEDURE GLM DE SAS ..................................................... 107

FIGURE 69. EFFET DE LA QUANTITE D’ENZYME SUR L’IMMOBILISATION ET LA RETENTION DES MATERIAUX .............................. 109

FIGURE 70. EFFET DE LA CONCENTRATION DE GA SUR L’IMMOBILISATION ET LA RETENTION DES ENZYMES PAR LES DIFFERENTS

MATERIAUX ................................................................................................................................................ 114

FIGURE 71. CINETIQUE DE LA REACTION DE FORMATION DES GOS CATALYSEE PAR Β-GALACTOSIDASE IMMOBILISEE SUR LA MCF

COMME SUPPORT A UNE CONCENTRATION ENZYMATIQUE DE 100% ...................................................................... 117

FIGURE 72. COMPARAISON ENTRE LES PRODUITS DE LA REACTION AVEC ENZYMES IMMOBILISEES SUR LA MCF ET LES PRODUITS DE

LA REACTION AVEC DES ENZYMES EN SOLUTION A UNE CONCENTRATION ENZYMATIQUE DE 60% ................................. 118

FIGURE 73. CINETIQUE DE LA REACTION DE FORMATION DES GOS CATALYSEE PAR Β-GALACTOSIDASE SUPPORTEE SUR LA SBA-15 A

UNE CONCENTRATION D’ENZYME DE 100% ...................................................................................................... 119

FIGURE 74. CINETIQUE DES PRODUITS FORMES AU COURS DE LA REACTION CATALYSEE PAR Β-GALACTOSIDASE SUPPORTEE SUR LA

SBA-15 A UNE CONCENTRATION D’ENZYME DE 100% ....................................................................................... 119

FIGURE 75. COMPARAISON ENTRE LES PRODUITS DE LA REACTION AVEC ENZYMES IMMOBILISEES SUR LA SBA-15 ET LES PRODUITS

DE LA REACTION AVEC DES ENZYMES EN SOLUTION A UNE CONCENTRATION ENZYMATIQUE DE 60% ............................. 120

FIGURE 76. CINETIQUE DE LA REACTION DE FORMATION DES GOS CATALYSEE PAR Β-GALACTOSIDASE SUPPORTEE SUR LA ‘S 2,9’ A



‘S 2,9’ A UNE CONCENTRATION D’ENZYME DE 100% ......................................................................................... 122

XVIII

FIGURE 78. COMPARAISON ENTRE LES PRODUITS DE LA REACTION AVEC ENZYMES IMMOBILISEES SUR LA ‘S 2,9’ ET LES PRODUITS


FIGURE 79. CINETIQUE DE LA REACTION DE FORMATION DES GOS CATALYSEE PAR Β-GALACTOSIDASE SUPPORTEE SUR LA ‘S 34,8’ A



‘S 34,8’ A UNE CONCENTRATION D’ENZYME DE 100% ....................................................................................... 124

FIGURE 81. COMPARAISON ENTRE LES PRODUITS DE LA REACTION AVEC ENZYMES IMMOBILISEES SUR LA ‘S 34,8’ ET LES PRODUITS


FIGURE 82. CINETIQUE DE LA REACTION DE FORMATION DES GOS CATALYSEE PAR Β-GALACTOSIDASE SUPPORTEE SUR LA ‘S-10-

100’ A UNE CONCENTRATION D’ENZYME DE 100% ............................................................................................ 126


‘S-10-100’ A UNE CONCENTRATION D’ENZYME DE 100% ................................................................................... 127

FIGURE 84. COMPARAISON ENTRE LES PRODUITS DE LA REACTION AVEC ENZYMES IMMOBILISEES SUR LA ‘S-10-100’ ET LES

PRODUITS DE LA REACTION AVEC DES ENZYMES EN SOLUTION A UNE CONCENTRATION ENZYMATIQUE DE 60% ............... 127

FIGURE 85. CINETIQUE DE LA REACTION DE FORMATION DES GOS CATALYSEE PAR Β-GALACTOSIDASE SUPPORTEE SUR LA ‘S-15-



‘S-15-100’ A UNE CONCENTRATION D’ENZYME DE 100% ................................................................................... 129

FIGURE 87. COMPARAISON ENTRE LES PRODUITS DE LA REACTION AVEC ENZYMES IMMOBILISEES SUR LA ‘S-15-100’ ET LES

PRODUITS DE LA REACTION AVEC DES ENZYMES EN SOLUTION A UNE CONCENTRATION ENZYMATIQUE DE 60% ............... 129

FIGURE 88. CINETIQUE DE LA REACTION DE FORMATION DES GOS CATALYSEE PAR Β-GALACTOSIDASE SUPPORTEE SUR LA ‘S-T-



‘S-T-100’ A UNE CONCENTRATION D’ENZYME DE 100% ..................................................................................... 131

FIGURE 90. COMPARAISON ENTRE LES PRODUITS DE LA REACTION AVEC ENZYMES IMMOBILISEES SUR LA ‘S-T-100’ ET LES PRODUITS


FIGURE 91. CONVERSION DE LACTOSE EN FONCTION DU RENDEMENT EN LACTOSUCROSE DE DIFFERENTS MATERIAUX ............. 135

FIGURE 92. CONVERSION DE LACTOSE EN FONCTION DE RENDEMENT EN TETRAHEXOSE DE DIFFERENTS MATERIAUX ................. 136

FIGURE 93. LA PRODUCTION EN LACTOSUCROSE ET EN TETRAHEXOSE PAR Β-GALACTOSIDASE D’ASPERGILLUS ORYZAE IMMOBILISEE

SUR LA SBA-15 POUR 5 CYCLES SUCCESSIFS ...................................................................................................... 138


SUR LA MCF POUR 5 CYCLES SUCCESSIFS .......................................................................................................... 138


SUR LA S-34.8 POUR 5 CYCLES SUCCESSIFS ....................................................................................................... 139

XIX


SUR LA S-10-100 POUR 5 CYCLES SUCCESSIFS ................................................................................................... 139


SUR LA S-15-100 POUR 5 CYCLES SUCCESSIFS ................................................................................................... 140


SUR LA S-2.9 POUR 5 CYCLES SUCCESSIFS ......................................................................................................... 140


SUR LA S-T-100 POUR 5 CYCLES SUCCESSIFS ..................................................................................................... 141

XXI

Liste des abréviations et des sigles

A.oryzae : Aspergillus oryzae.

BCA: Acide bicinchoninique.

BSA : Sérum albumine bovine.

DRX : Diffraction des rayons X.

Ez : Enzyme.

FOS : Fructooligosaccharide.

FOSHU : Food for Specified Health Uses.

Fru : Fructose.

GA: Glutaraldéhyde.

Gal : Galactose.

Glc : Glucose.

GOS : Galactooligosaccharide.

HCl : Acide chlorhydrique.

HMMS : Hierarchically-ordered mesocellular mesoporous silica

HPLC : Chromatographie phase liquide à haute performance.

I : Intensité.

KCl : Chlorure de potassium.

m/v (%) : Pourcentage massique par rapport au volume.

MET : Microscopie électronique à transmission.

mL : Millilitre.

XXII

MPS : Mesoporous silica « Silice mésopoureuse ».

MS : Spectrométrie de masse.

ONPG : Orthonitrophényl-β-galactoside.

P123 : Acide pluronique (agent structurant, EO20PO70EO20).

rpm : « Rotation per minute » tour par minute.

T : Température.

t : Tonnes.

TEOS : Tétraéthylorthosilicate (précurseur de silice).

TIPB : 1,3,5-triisopropylbenzène.

TMB : 1,3,5-triméthylbenzène.

U : Unité d’enzyme.

u.a. : Unité arbitraire.

UV : Ultra- violet.

XXIII

Dédicace

A mes très chers parents, qui ont toujours été les

meilleurs au monde

A mon époux qui ne cesse de m’encourager

A mon frère et mes deux petites sœurs, qui sont les

plus adorables au monde

A tous mes vrais amis …

A toutes les mains qui m’ont été tendues

XXV

Remerciements

Ce travail a été réalisé à l’Université Laval au laboratoire du Professeur Khaled

Belkacemi, mon directeur de recherche, auprès de qui j'ai énormément appris, à qui je

tiens particulièrement à exprimer toute ma reconnaissance et mes remerciements pour

le soutien et la confiance qu’il m’a accordés durant cette période, et pour m'avoir

accueilli au sein de son laboratoire. Ses précieux conseils m’ont permis de mener à

terme ce projet. Je le remercie énormément pour le temps et l’intérêt qu’il m’a

consacrés.

Je tiens à exprimer ma profonde gratitude au Professeure Safia Hamoudi pour ses

conseils judicieux, sa bonne humeur, son aide indispensable et appréciable.

Je remercie profondément mes collègues de laboratoire Abdelnasser Abidli et Cherif

Larabi pour leurs sympathies, pour l’esprit de travailler en équipe qu’ils m’ont fait

partager, pour leurs disponibilités exceptionnelles et leurs précieux conseils. Ils ont su

faire créer une bonne ambiance durant cette période et m’ont soutenu sans conditions et

n’ont pas hésité à m’aider dans mon travail.

Je voudrais remercier chaleureusement toutes les nombreuses personnes que j’ai

rencontrées durant ces deux ans et qui m’ont aidé lors de la réalisation de ce travail. Je

mentionne spécialement Ahmed Amara et Atef Sahli pour leur disponibilité et leurs

encouragements, Pascal Dubè pour son aide indispensable.

Je remercie tous mes amis qui étaient là et qui m’entouraient dans toutes les situations.

Merci chers amis pour votre amitié si précieuse.

Pour terminer, je tiens plus que tout à adresser mon affection et ma gratitude à ma chère

maman Souad, mon cher papa Habib, mon grand frère Mohamed, mes deux anges

XXVI

Asma & Mariem, et mon cher époux Koutheir pour leur amour et leur soutien et

encouragements tout au long de mes études de maîtrise. Sans leur amour, je ne serais

pas en mesure de faire face aux problèmes même minimes rencontrés au cours de mes

études.

XXVII

Avant-propos

Le présent travail a été réalisé dans le cadre de mon projet de maîtrise. Ce projet portait

sur la synthèse d’un nouveau biocatalyseur à base de β-galactosidase à partir

d’Aspergillus oryzae immobilisée sur différents matériaux siliceux mésoporeux, dans le

but de synthétiser le lactosucrose obtenu par la bioconversion du lactose et du

saccharose. L’immobilisation est effectuée après un processus d’optimisation de

différentes conditions opératoires de la réaction de transglycosylation. Cette

immobilisation permet l’amélioration de la stabilité et la performance de l’enzyme. Ce

projet s’inscrit dans le cadre d’une thématique de recherche d’actualité et d’une pratique

de la chimie verte, visant l’utilisation de l’approche hétérogène pour la biosynthèse des

galacto-oligosaccharides bénéfiques en excluant l’usage des agents chimiques.

Le présent document comporte cinq chapitres. Le chapitre 1, l'introduction, présente la

problématique générale du mémoire. Au chapitre 2, la revue de littérature résume l’état

actuel des connaissances dans la production des oligosaccharides à intérêts bénéfiques

pour la santé humaine, plus précisément le lactosucrose, ainsi qu’une section décrivant

l’enzyme utilisée (β-galactosidase à partir d’Aspergillus oryze) et ses applications ainsi

que les différentes voies d’immobilisation, tout en abordant les principaux aspects

théoriques et pratiques de cette technique. La revue de littérature est suivie d’un 3e

chapitre qui présente respectivement et brièvement, l’hypothèse et les objectifs du

travail. Le chapitre 4 porte sur la présentation du matériel et des méthodes

expérimentales utilisés ainsi que les techniques de caractérisation et d’identification et

les analyses statistiques des données. Les principaux résultats et la discussion sont

présentés au 5 e chapitre.

Les travaux réalisés et les résultats obtenus dans ce chapitre (partie homogène) portant

sur la synthèse du lactosucrose utilisant la β-Galactosidase libre ont fait l’objet d’un

article rédigé. Ce premier article sera soumis à la revue Food Chemistry, sous le titre:

’’Optimization of lactose and sucrose bioconversion using Aspergillus oryzae β-

Galactosidase for the production of lactosucrose’’. Zeineb Ben Rejeb est premier auteur

de cet article.

Un deuxième article détaillant la catalyse hétérogène sera soumis pour publication à la

revue Bioresource Technology, sous le titre : ‘’Biosynthesis of lactosucrose using a novel

XXVIII

heterogeneous biocatalyst based on Aspergillus oryzae β-Galactosidase immobilized on

different silica-based materials for lactose and sucrose conversion’’. Zeineb Ben Rejeb

sera comme premier auteur de cet article.

Ces résultats ont fait également l'objet d'une participation à une séance de posters dans

le cadre de la 5e conférence annuelle du Centre en Chimie Verte et Catalyse CCVC qui

s'est tenue à l’Université McGill, Montréal le 19 mai 2014.

La conclusion et les perspectives sont présentées à la fin en résumant les principaux

résultats obtenus dans le cadre de ce projet. Afin d’atteindre les objectifs visés par cette

étude, j’ai réalisé une revue de littérature et suggéré des protocoles expérimentaux. J’ai

également réalisé l’ensemble des manipulations en laboratoire, traité les données

expérimentales (caractérisation et analyse statistique des données), interprété les

résultats et rédigé ce présent mémoire. Le Professeur Khaled Belkacemi, mon directeur

de recherche, était responsable de la supervision des travaux. Il a contribué à la

planification des expériences et à la discussion des résultats de même que la révision du

manuscrit final.

1

Chapitre 1. Introduction générale

Le lactosérum est un sous-produit de l’industrie fromagère, produit en grande quantité

dans le monde entier et cette production ne cesse d’augmenter. Ce sous-produit

contient environ 20% des protéines du lait et la majorité des sucres du lait (Lactose)

(Smithers et al., 1996). Malgré l’existence d’approches utilisées pour bénéficier d’une

valeur ajoutée au lactosérum, une grande quantité du ce sous-produit est toujours

rejetée (Panesar et Kennedy, 2012). Ceci explique le grand intérêt pour les procédés

innovants, afin de transformer le lactose et explorer ses applications dans les industries

pharmaceutiques et alimentaires. En effet, les oligosaccharides comme le lactulose, le

lactitol, l'acide lactobionique, le lactosucrose, et le galacto-oligosaccharide (GOS)

dérivent du lactose et sont des produits à haute valeur ajoutée, bénéfiques pour la santé

humaine (Gänzle et al., 2008).

Les oligosaccharides et leurs dérivés sont des biomolécules importantes, ayant une

large gamme de fonctions dans les systèmes biologiques. Ils ont des propriétés

prébiotiques qui aident à : (i) l’amélioration de l’équilibre de la flore intestinale ; (ii)

l’amélioration de l'absorption du calcium alimentaire ; (iii) la réduction du taux de

cholestérol sérique et (vi) la synthèse de vitamines B (Aider et De Halleux, 2007, Honda

K1, 1999, Sako et al., 1999).

Les oligosaccharides sont bénéfiques pour la santé, mais leur synthèse par voie

chimique est fastidieuse. Cette synthèse nuit à l’environnement et à la santé humaine à

cause de résidus des solvants persistant. Leur synthèse passe inexorablement par

lusieurs étapes de réactions chimiques et aussi de purification qui sont souvent

onéreuses. Ainsi, d’autres alternatives biologiques sont recherchées, telles que

l’utilisation des enzymes (Emaga et al., 2012, Zhang Ning et al., 2001). En effet, les

oligosaccharides peuvent être synthétisés par voie enzymatique à partir des

disaccharides. La source de l'enzyme et les conditions de la réaction contrôlent le type

et la quantité d'oligosaccharides produits (Crittenden et Playne, 1996). L'utilisation de

l’enzyme β-galactosidase en tant que catalyseur est intéressante dans la réalisation de

telles réactions. où une multitude de produits à haute valeur sont synthétisés, tels que

les galactooligosaccharides (GOS) (Albayrak et Yang, 2002, Gaur et al., 2006, Urrutia et

al., 2013), le lactulose (Vera et al., 2011) et le lactosucrose (Li et al., 2009).

2

Généralement, les β–galactosidases sont utilisées pour l’hydrolyse du lactose et

peuvent également catalyser la formation des galacto-oligosaccharides (GOS) en

présence de lactose comme substrat. La littérature (Li et al., 2009) montre que la

présence de saccharose avec le lactose comme substrats offre la possibilité de

synthèse de lactosucrose, un prébiotique important (Li et al., 2009).

Plusieurs sources microbiennes de la β-galactosidase ont été étudiées pour des

applications alimentaires telles que Aspergillus Niger, Aspergillus oryzae,

Kluyveromyces lactis et Kluyveromyces fragilis (Richmond et al., 1981). La β-

galactosidase à partir de A. oryzae a été appliquée à la biosynthèse de différents

produits tels que les GOS (Albayrak et Yang, 2002), le lactulose (Guerrero et al., 2011),

et les galactosyl-polyhydroxyalcohols (Irazoqui et al., 2009). Elle était utilisée sous la

forme libre ainsi qu’immobilisée. La β-galactosidase à partir de A. oryzae a été

immobilisée par différentes stratégies : (i) encapsulation dans l'alginate; (ii) fixation

covalente sur différents supports, ou (iii) adsorption ionique combinée à la réticulation

(Urrutia et al., 2013).

L’immobilisation est une technique largement utilisée dans les applications industrielles

des enzymes pour améliorer la stabilité, la sélectivité en vers les produits désirés,

l’isolation des produits dans un système biphasique, et la réutilisation des catalyseurs

(régénération et recyclage).

Dans ce travail, il est question de synthétiser le lactosucrose par voie enzymatique,

selon deux approches; homogène et hétérogène. L’immobilisation de β-galactosidase (à

partir de A. oryzae) s’effectuera sur différents matériaux siliceux mésoporeux pour

étudier et comparer la rétention et le rendement de la biosynthèse du lactosucrose afin

de choisir la combinaison matériau/enzyme la plus efficace.

3

Chapitre 2. Revue de littérature

2.1. Lactosérum

2.1.1. Définition et composition

Le Lactosérum est le liquide jaune-vert qui reste après la précipitation et l'élimination de

la caséine du lait au cours de la fabrication du fromage (Figure 1). Il est considéré

comme un sous-produit de l’industrie laitière (Smithers et al., 1996).

Il existe principalement deux variétés de lactosérum, selon l’approche utilisée pour la

précipitation des caséines:

a. Le lactosérum acide (pH<5) : résultant de la production de fromages frais ou

doux (comme le fromage crémeux et le fromage cottage) suite à l’action des

bactéries lactiques.

b. Le lactosérum doux (pH 6-7) : résultant de la production de fromages à pâte dure

suite à la précipitation de la caséine par la présure (fromages à pâte pressée,

semi-pressée, ou molle).

La composition des différents types de lactosérum est variable (Guimarães et al., 2010,

Mawson, 1994).

4

Figure 1. Caillés (coagulation de la caséine) et lactosérum.

Tableau 1. Composition du lait bovin et du lactosérum (Smithers et al., 1996)

Composition Concentration

Lait Lactosérum

(%, wt/vol)

Caséine 2,8 0,0

Protéines solubles 0,7 0,7

Lipides 3,7 0,05

Cendre 0,7 0,7

Lactose 4,9 4,9

Total 12,8 6,35

Le lactosérum représente environ 85-95% du volume du lait et conserve 55% des

nutriments du lait. Ce sous-produit contient essentiellement 100% de glucides totaux

(lactose), et environ 20% des protéines totales du lait (Tableau 1). Le lactosérum

contient également des quantités appréciables d'autres composants tels que les lipides

(0,4-0,5% m/v), les sels minéraux (8-10% d’extrait sec), l’acide lactique (0,05% m/v),

l’acide citrique, ainsi que des composés azotés non protéiques (Guimarães et al., 2010,

Mawson, 1994).

5

Le lactosérum est produit de plus en plus vu l’augmentation mondiale de production du

fromage. En général, pour faire 1 kg de fromage, 9 L de lactosérum sont générés

(Kosikowski, 1979). En effet, plus de 20 millions de tonnes de fromages sont produits

chaque année, soit près de 655 kg/s avec un taux d’augmentation de 2% chaque année.

Comme l’illustre la Figure 2, les États-Unis sont les plus grands producteurs de

fromage, avec 24% de la production mondiale totale en 2005, alors que le Canada est

situé en neuvième position (McDonald, Novembre 2006). La production du lactosérum

continue de croître à travers le monde et dépasse actuellement les 80 x l09 L/J

(Smithers et al., 1996).

De nos jours, trouver des voies de valorisation prometteuses pour le lactosérum est

devenu un ‘leitmotiv’ au niveau mondial.

.

Figure 2. Principaux producteurs de fromage dans le monde en 2005 (exprimés en milliers de tonnes).

2.1.2. Utilisation et valorisation du lactosérum

Les différents modes d'élimination et d’utilisation du lactosérum ont présenté un défi

pour l'homme depuis qu’il a commencé à fabriquer du fromage. Ces modes de

valorisation et d’élimination ont été décrits dans plusieurs publications (Mawson, 1994,

Siso, 1996, Smithers, 2008), et peuvent être illustrés dans trois catégories:

a. Utilisation directe : le lactosérum est utilisé avec peu ou sans traitement ultérieur.

Cela comprend l'utilisation traditionnelle du lactosérum comme ingrédient

6

alimentaire pour les animaux d’élevage et comme engrais pour l'agriculture.

L'inconvénient avec cette utilisation est relié à la trop forte demande en oxygène

du lactosérum (Mawson, 1994).

b. Stabilisation du lactosérum: le lactosérum est traité par des moyens physiques

et/ou chimiques afin de le rendre beaucoup plus stable et résistant à la

dégradation microbienne. Parmi les techniques utilisée, on trouve: (1) la

récupération des protéines par ultrafiltration, et (2) la dénaturation des protéines

par la chaleur, et (3) la concentration par osmose inverse et/ou évaporation

suivie d’une cristallisation du lactose, et (4) la transformation du lactosérum en

poudre. Dans certains de ces procédés, le lactose et les sels du lait retenus dans

le produit sont également manipulés pour étendre les possibilités d’exploitation

de ces produits (Mawson, 1994).. Différentes poudres condensées sont

préparées, telles que (1) la poudre du lactosérum complet, et (2) la poudre du

lactosérum déminéralisé, et (3) la poudre du lactosérum délactosé ou déprotéiné,

et enfin (4) le lactose en poudre (Siso, 1996).

c. Processus de conversion: Le lactose est converti en un autre composé par les

activités de micro-organismes (bioconversion) ou par une réaction chimique. Des

exemples de ces derniers incluent la production du lactulose, du lactitol, du

bioéthanol ainsi que du méthane et la production de levure par fermentation

(Mawson, 1994). Ces procédés de bioconversion sont actuellement exploités à

l'échelle commerciale (Figure 3).

7

Figure 3. L'utilisation commerciale de lactosérum de lait.

2.2. Lactose

2.2.1. Production et composition

Le lactose, ou le sucre de lait, est le glucide majeur (97% des glucides du lait) présent

dans le lait de tous les mammifères, avec quelques exceptions mineures. Sa

concentration approximative est comprise entre 2% et 10%. À titre d’exemple, la teneur

en lactose du lait de vache varie entre 4,4% et 5,2%, avec une moyenne de 4,8%,

comparée à une teneur de 7% dans le lait maternel (Gänzle et al., 2008).

D’autre part, le lactose représente le glucide majoritaire du lait avec la teneur la plus

élevée comparée aux autres constituants du lait maternel et de vache standard (lipides,

protéines et minéraux). Ceci explique son importance en nutrition (Seki et Saito, 2012).

8

Le Tableau 2 illustre la composition moyenne du lait maternel et du lait de vache (Vilain,

2010).

Tableau 2. Composition moyenne du lait selon l’espèce (g/L)

Eau Lipides Protéines

Totales

Glucides

(Lactose)

Matières

minérales

Lait

maternel 905 35 12 – 14 65 - 70 3

Lait de

vache 900 35 – 40 30 -35 45 - 50 8 – 10

Le lactose (β-D-galactopyrannosyl(1→4)β-D-glucopyrannose, C12H22O11, 342,3 g mol−1)

est un disaccharide composé d'une molécule de β-D-galactose (Gal) et d'une molécule

de α/β-D-glucose (Glc) reliées entre elles par une liaison osidique β(1→4) (Gänzle et al.,

2008).

La structure de la molécule de lactose est représentée par la Figure 4. Structure

chimique du lactose. Dans une solution aqueuse, le lactose est présent sous deux

formes (Figure 5) avec des proportions à l’équilibre de 62,7 % comme β-lactose et 37,3

% comme α-lactose. Cet d'équilibre est légèrement affecté par des différences de

température, mais pas par les différences de pH (Gänzle et al., 2008).

9

Figure 4. Structure chimique du lactose.

Figure 5. Structure des molécules de lactose en configuration α et β (Gänzle et al., 2008).

10

La majeure partie de production du lactose, fabriquée à l’échelle industrielle, est

produite à partir de lactosérum (qui est le sous-produit de la production fromagère) suite

à des procédés de purification et de cristallisation (Seki et Saito, 2012).

La production mondiale de lactosérum a été estimée à 137,9 millions de tonnes en 1998

représentant près de 5,5 millions de tonnes de lactose par an. Au Canada, la production

du fromage en 2004 a été estimée à 0,34 million de tonnes, ce qui implique que plus de

0,25 million de tonnes de lactosérum ont été produites cette année (Aider et De Halleux,

2007). Ceci confirme l’abondance de la matière première pour la production de lactose

et de ses dérivés qui prédominent l’intérêt industriel vu leurs qualités et bienfaits

demandés, en plus de la disponibilité de la matière première à bas prix.

2.2.2. Applications du lactose

Les applications du lactose sont de plus en plus nombreuses et variées dans le domaine

alimentaire et pharmaceutique. Le lactose est utilisé largement dans les confiseries, le

pain, les aliments pour animaux et les aliments pour bébé. Il est encore utilisé comme le

glucide le plus adapté à la préparation de nombreux milieux de fermentation. Les

industries pharmaceutiques utilisent le lactose depuis des années comme agent vecteur

de médicament. En outre, le lactose est utilisé comme matière première pour la

fabrication de plusieurs produits (les dérivés de lactose), tels que les oligosaccharides,

les sucres rares et les alcools (Seki et Saito, 2012). Les principales voies de

transformation de lactose sont illustrées dans la Figure 6.

La transformation de lactose suit différentes voies telles que : l’hydrolyse, la

déshydratation, l’isomérisation, la polymérisation, l’hydrogénation, l’oxydation, la

réduction, la fermentation et la voie enzymatique. En effet, le tagatose, un sucre rare, est

un monosaccharide préparé par isomérisation de galactose qui est lui-même produit par

l'hydrolyse du lactose. On le trouve en petites quantités dans les produits laitiers. Bien

que le degré de douceur de tagatose soit d'environ 90% de celui du saccharose, son

pouvoir calorifique est faible. Le lactulose est un disaccharide comprenant le galactose

et le fructose. Il est le produit de la réaction d’isomérisation de lactose dans un milieu

alcalin comme par exemple l’hydroxyde de calcium. Le lactulose a été ajouté aux

préparations pour nourrissons comme un facteur bifidus depuis de nombreuses années.

Le lactosucrose qui est un trisaccharide comprenant le galactose, le glucose et le

fructose est synthétisé par voie enzymatique. L’epilactose est un disaccharide

11

comprenant le galactose et le mannose est préparé par épimérisation du lactose (Aider

et De Halleux, 2007, Seki et Saito, 2012).

Figure 6. Voies de transformation de lactose: les dérivés de lactose (Seki et Saito, 2012).

L'acide lactobionique qui est un acide aldonique comportant du galactose et de l'acide

gluconique. Il est de plus en plus utilisé comme facteur bifidus. Il est généralement

fabriqué par oxydation du groupe aldéhyde du fragment glucose du lactose, mais ces

dernières années une nouvelle méthode de synthèse a été décrite à l'aide d'une enzyme

à partir des cellules Burkholderia cepacia. D’autre part, le lactose peut être une matière

première pour les alcools de sucre tel que le lactitol préparé par hydrogénation

catalytique dans des conditions de haute température et haute pression (Seki et Saito,

2012).

Lactose

Hydrolyse

Fermentation

Polymérisation enzymatique (avec saccharose)

Polymérisation

enzymatique

Isomérisation

Epimérisation

Oxydation

Réduction

Fermentation

Glucose+Galacto

se

Isomérisation Tagatose

Lactulose

Galacto-oligosaccharide

Lactosucrose

Epilactose

Acide Lactobionique

Lactitol

Éthanol

Acide

lactique

Déshydratation

Lactide

Polymérisation

Résine

polylactique

12

2.3. Oligosaccharides et aliments fonctionnels

2.3.1. Oligosaccharide : Définition et propriété

Les oligosaccharides, définis comme étant des oligomères de différents degrés de

polymérisation, peuvent êtres synthétisés aussi bien par voie enzymatique que par voie

chimique. Ils sont solubles dans l’eau et ont un pouvoir sucrant relativement faible (de

l’ordre de 0,3-0,6 fois celui du sucrose), qui dépend de leur structure chimique et de leur

masse moléculaire (Sako et al., 1999). Pour ces raisons, ils sont communément utilisés

comme des substituants au sucre à faible cariogènes dans la confiserie, la confiture, la

pâtisserie, le chewing-gum, le yaourt, les boissons ainsi que dans le régime alimentaire

faible en calories et les aliments pour diabétiques. Outre le secteur alimentaire, d'autres

domaines, tels que l’industrie pharmaceutique et cosmétique, peuvent également

exploiter les propriétés physico-chimiques et physiologiques des oligosaccharides

(Torres et al., 2010). Parmi ces oligosaccharides, on trouve le lactulose, le reffinose, les

maltooligosaccharides, l’inulin, les fructooligosaccharides (FOS) et les

galactooligosaccharides (GOS). Les FOS et les GOS sont généralement produits par

transglycosylation enzymatique, en présence de fructanotransferase et β-galactosidase,

respectivement (Figure 7) (Sako et al., 1999).

« Galactooligosaccharide » est le terme générique pour les oligosaccharides produits à

partir du lactose avec β-galactosidase. Au Japon, les GOS ont été approuvés comme

ingrédients alimentaires FOSHU (Food for Specified Health Uses) et ils sont également

utilisés comme prébiotiques ainsi que dans la préparation des produits pharmaceutiques

(Seki et Saito, 2012). Les GOS peuvent sont considérés comme des oligosaccharides

non digestibles. Ils sont fermentescibles par les bactéries dans le gros intestin (Champ

et al., 2003). Ceci est dû à la spécificité du substrat des enzymes digestives gastro-

intestinales humaines qui sont pour la plupart spécifiques aux liaisons α-glycosidique,

alors que les liaisons glycosidiques des GOS ont une configuration β. Certaines β-

galactosidases, localisées dans l’intestin grêle, sont capables de digérer les GOS, mais

leur activité reste faible dans la plupart du temps (Ito et Kimura, 1993, Qiang et al.,

2009).

13

Les galactooligosaccharides sont particulièrement adaptés dans des produits

alimentaires spécifiques à des catégories bien particulières, tels que la nutrition infantile,

la nutrition clinique et les aliments pour les personnes âgées. Certaine frange de la

population peut tirer un avantage supplémentaire de la consommation de

galactooligosaccharides. Les nourrissons par exemple, peuvent bénéficier de l'effet

bifidogène des GOS car leur microflore contient une faible quantité de bifidobactéries

(Sako et al., 1999). La consommation des GOS peut également être bénéfique pour les

personnes âgées, car ils ont un nombre inferieur de bifidobactéries dans leur microflore

comparé à celui des jeunes et des adultes. Ils souffrent souvent de la constipation et leur

capacité à absorber le calcium est inférieure à celle des jeunes adultes (Zhang Ning et

al., 2001).

Bettrave

Lait de vache

Amidon

Saccharose

Lactose

Amidon soluble

Lactosérum de soya

Xylan

Chitin

Raffinose

Fructo-oligosaccharides

Lactosucrose

Lactulose

Galacto-oligosaccharides

Glycosylsucrose

Oligosaccharides de soya

Malto-oligosaccharides

Isomalto-oligosaccharides

Soya

Xylo-oligosaccharides

Chitin oligosaccharides

Extraction

Transglycosylation

Isomérisation

Hydrolyse

Hydrolyse transglycosylation

Figure 7. Représentation schématique du processus de production d'oligosaccharides (Sako et al., 1999)

14

En général, les GOS peuvent être utilisés comme des :

additifs alimentaires dans les boissons, les aliments congelés, les biscuits, etc.

compléments alimentaires : dans les préparations pour nourrisson, par exemple.

édulcorants: ceci est particulièrement utile pour les diabétiques.

2.3.2. Aliments fonctionnels: définition et propriétés

Un aliment fonctionnel, de façon générale, est tout aliment ou ingrédient qui, en plus de

fournir des effets bénéfiques nutritionnels, peut contribuer à des bénéfices de santé tel

que réduire les risques chroniques des maladies (Marriott, 2000).

Le concept des aliments fonctionnels a été développé au Japon au milieu des années

1980 et a suscité un grand intérêt chez les grandes entreprises alimentaires dans les

quatre coins du monde. Le marché mondial des aliments fonctionnels a augmenté de 10

milliards de dollars américain en 1995, pour atteindre 33 milliards de dollars en l’an 2000

Ce marché a dépassé les 50 milliards en 2010 (Menrad, 2003). Une étude européenne a

estimé que le marché de l’alimentation fonctionnelle valait à peu près 1 milliard d’euros

en 1997 et se base essentiellement sur les produits laitiers.

Traditionnellement, les fruits et les légumes sont considérés comme la source principale

des aliments fonctionnels, mais de récentes recherches ont établi que des aliments

d’origine animale tels que le lait et les produits laitiers peuvent aussi être d’excellentes

sources pour ces composants (Bauman et al., 2006). Prenons le cas du lait fermenté, il

contient des oligosaccharides ainsi que des probiotiques qui améliorent la qualité de la

microflore intestinale humaine. De ce fait, les propriétés fonctionnelles du lait fermenté

sont liées à la fois à ses propriétés probiotiques et à la présence des oligosaccharides

(Martínez-Villaluenga et al., 2008).

15

2.4. Le lactosucrose

2.4.1. Structure

Le lactosucrose, connu comme 4G-β-D-galactosylsucrose, est un trisaccharide composé

d’une molécule de galactose, d’une molécule de glucose et d’une molécule de fructose.

Son nom scientifique est β-D-fructofuranosyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-D-

glucopyranoside et peut être symbolisé par Gal-Glu-Fru. Sa formule chimique est

C18H32O16 et sa masse molaire est de 504,4 g mol-1 (Mu et al., 2013, Seki et Saito, 2012)

(Figure 8).

Figure 8. Structure de lactosucrose.

2.4.2. Caractéristiques et production mondiale

Le pouvoir sucrant du lactosucrose est de 0,3 à 0,6 par rapport au saccharose, avec un

pouvoir cariogène faible et un apport calorique faible(Gänzle, 2012).

Le Japon est le premier pays producteur du lactosucrose commercialisé, ainsi que de

nombreux autres types d'oligosaccharides. Le lactosucrose est utilisé, non seulement

dans beaucoup d’aliments japonais, mais aussi aux États-Unis comme supplément

diététique et fonctionnel (Sharma, 2011, Gänzle, 2012). Il est considéré comme FOSHU

par les japonais depuis 1991 (Crittenden et Playne, 1996). Il possède un effet

probiotique (bifidogène) démontré dans certains essais in-vitro, appliqués sur les

16

animaux et quelques sujets humains (Hussein et al., 1999, Mizote et al., 2009, Teramoto

et al., 2006).

Le lactosucrose est classé parmi les oligosaccharides non digestibles avec d’autres

dérivés de lactose. Il est rapporté comme étant bénéfique pour la santé humaine

(Gänzle, 2012). En effet, le lactosucrose peut stimuler sélectivement la croissance de

Bifidobacterium et il a un effet bénéfique sur les patients atteints de maladies

inflammatoires chroniques intestinales dû à son effet bifidogénique (Fusako et al., 1996,

Ohkusa, 1995, Teramoto et al., 1996). Selon des expériences effectuées sur des rats et

des chiens, le lactosucrose a montré des effets de protection contre l’indométacine

d’ulcère gastrique (Honda, 1999, Terada et al., 1992), ainsi qu’une diminution de la

valeur du pH du son contenu intestinal. Ce dernier changement, accompagné d'autres

facteurs, peuvent augmenter l'absorption du calcium par l'intestin. Ce résultat a été

prouvé chez des femmes jeunes en bonne santé ayant moins d'apport en calcium pour

lesquelles la supplémentation des aliments en lactosucrose à long terme a favorisé

l'absorption intestinale du calcium et a diminué la résorption osseuse (Teramoto et al.,

2006).

Grace aux bienfaits du lactosucrose cités précédemment, sa commercialisation et sa

production mondiale ainsi que celle des autres oligosaccharides non digestibles dérivés

du lactose augmentent de plus en plus dans le monde comme illustré dans le

Tableau 3 (Crittenden et Playne, 1996).

17

Tableau 3. Production des oligosaccharides de qualité alimentaire éstimée en 1995

Classe des

oligosaccharides

Production

estimée en

1995 (t)

principaux fabricants noms

commerciaux

GOS 15000 Yakult Honsha (Japan) Oligomate

Nissin Sugar Manufacturing Company (Japan) Cup-Oligo

Snow Brand Milk Products (Japan) P7L and others

Borculo Whey Products (The Netherlands) TOS-Syrup

Lactulose 20000 Morinaga Milk Industry Co. (Japan) MLS/P/C

Solvay (Germany)

Milei GmbH (Germany)

Canlac Corporation (Canada)

Laevosun (Austria)

lnalco SPA (Italy)

Lactosucrose 1600 Ensuiko Sugar Refining Co. (Japan) Newka-Oligo

Hayashibara Shoji Inc. (Japan) Newka-Oligo

FOS 12000 Meiji Seika Kaisha (Japan) Meioligo

Beghin-Meiji Industries (France) Actilight

Golden Technologies (USA) NutraFlora

Cheil Foods and Chemicals (Korea) Oligo-Sugar

ORAFTI (Belgium) Rafilose and

Raftiline

Cosucra (Belgium) Fibruline

Isomaltulose

oligosaccharides

5000 Mitsui Sugar Co. (Japan) ICP/O

Glucosyl sucrose 4000 Hayashibara Shoji Inc. (Japan) Coupling Sugar

Maltooligosaccharides 10000 Nihon Shokuhin Kako (Japan) Fuji-Oligo

Hayashibara Shoji Inc. (Japan) Tetrup

Isomaltooligosaccharid

es

11000 Showa Sangyo (Japan) lsomalto-900

Hayashibara Shoji Inc. (Japan) Panorup

Nihon Shokuhin Kako (Japan) Biotose and

Panorich

Cyclodextrine 4000 Nihon Shokuhin Kako (Japan) Celdex

Ensuiko Sugar Refining Co. (Japan) Dexy Pearl

Asahi Kasei Kagyo Co. (Japan)

Gentiooligosaccharides 400 Nihon Shokuhin Kako (Japan) Gentiose

Soybean

oligosaccharides

Xylo-oligosaccharides

2000 The Calpis Food Industry Co. (Japan)

Suntory Ltd (Japan)

Soya-oligo

Xylo-oligo

18

2.4.3. Synthèse du lactosucrose

Le lactosucrose est un trisaccharide obtenu suite à une réaction de transfert réversible à

partir du lactose et du saccharose, à l'aide de l'activité des enzymes de

transfructosylation ou transgalactosylation (Schéma 7) (Daude et al., 2012, Kawase et

al., 2001). Dans la première réaction, la fraction fructosyle du saccharose est transférée

au lactose, ainsi le lactosucrose est formé (Gänzle, 2011, Mussatto et Mancilha, 2007). Il

peut être aussi obtenu par la transgalactosylation du saccharose avec la ß-

galactosidase en utilisant le lactose comme donneur de galactosyle et du saccharose

comme accepteur de galactosyle (Gänzle, 2011).

19

Figure 9. Biosynthèse de lactosucrose par A: transfructosylation et B: transgalactosylation (Daude et al., 2012, Li et al., 2009).

20

La synthèse de lactosucrose est obtenue lorsque les réactifs initiaux (lactose et

saccharose) sont présents dans la réaction avec des concentrations équimolaires pour

optimiser le rendement, ainsi que la présence de l’enzyme libre en solution (Mussatto

and Mancilha, 2007).

Le lactosucrose comme les autres oligosaccharides peut être synthétisé par voie

enzymatique ou chimique, mais la méthode enzymatique reste toujours plus

avantageuse; en éliminant et en réduisant l’utilisation des produits toxiques qui peuvent

altérer le produit avec la présence des résidus néfastes pour la santé. La voie

enzymatique nous épargne les traitements et les purifications, en utilisant des solvants

nuisibles à l’environnement. L'utilisation d'enzymes pour la synthèse de sucres

complexes offre plusieurs avantages par rapport à la méthode chimique; les glucides

sont difficiles à manipuler en raison de la présence de nombreux groupements

hydroxyles réactifs. La biosynthèse enzymatique est donc une catalyse très efficace, qui

peut être effectuée sans protection des groupements hydroxyles, avec un large éventail

possible de réactions régiospécifiques et stéréospécifiques. En plus, ces réactions sont

réalisées dans des conditions douces (Hamed et al., 2013).

Il y a trois grandes familles d’enzymes utilisées pour la synthèse de lactosucrose

(Tableau 4) :

a. Les galactosidases et plus précisément les β-galactosidases qui sont

synthétisées par différents microorganismes tels qu’E.Coli, Bacillus circulans,

Aspergillus niger, Bacillus stearothermophilus, Pyrococcus woesei, Arthrobacter

psychrolactophilus (Gänzle, 2011, Li et al., 2009, Oliveira et al., 2011, Sheik-

Asraf et Gunasekaran, 2010).

b. La levansucrases qui est l’enzyme la plus spécifique pour cette réaction dont

ses substrats sont le saccharose et le lactose. La levansucrase est synthétisée

aussi par plusieurs microorganismes (Choi et al., 2004, Gänzle et al., 2008,

Han, 2009).

c. Les β–Fructofuranosidases qui catalysent l'hydrolyse du saccharose pour

donner un mélange de glucose et de fructose, ainsi que la formation des

oligosaccharides comme le lactosucrose dans notre cas (Kawase et al., 2001,

21

Terada et al., 1992). Il est possible aussi d’utiliser les microorganismes

directement pour la production de l’enzyme (Choi et al., 2004, Gänzle, 2011).

Tableau 4. Conditions et rendement en lactosucrose par les différentes espèces

enzymatiques

β-galactosidase β-fructofurannosidase Levansucrase

pH 5 6 7

Température (°C) 40 54 23

Concentration initiale de

substrats (Lactose :

saccharose)

30 : 30 48 : 48 18 :18

Concentration

enzymatique 6 U* 5 U 1 U

Rendement en

lactosucrose (%) 21 4 28,5

Temps de réaction 12h 30 min 12h

*U : Une unité d’enzyme permet d’hydrolyser 1,0 µmole de lactose par minute.

En effet, l'enzyme non seulement catalyse la réaction de transfert mais aussi l'hydrolyse

du saccharose et du lactosucrose ainsi que la formation des produits secondaires

(Figure 10) (Fujita et al., 1990, Mussatto et Mancilha, 2007).

Sucrose + H2O Fructose + Glucose

Lactosucrose + H2O Fructose + Lactose

Figure 10. Réactions d’hydrolyse de saccharose et de lactosucrose (Fujita et al., 1990).

22

Pour cette raison, le rendement maximal de lactosucrose peut être atteint avec un

processus discontinu et une concentration équimolaire de saccharose et de lactose

(Mussatto et Mancilha, 2007).

2.5. β–Galactosidases: Structure, production,

mécanisme de réaction et application

La β-galactosidase, connue aussi comme la lactase (β-D-galactohydrolase, EC 3.2.1.23)

est une enzyme qui hydrolyse des résidus D-galactosyle à partir des oligosaccharides

ou des métabolites secondaires (Husain, 2010). De façon classique, son application

principale est dans l'hydrolyse du lactose et du lactosérum (Oliveira et al., 2011). En plus

de l'hydrolyse, la β-D-galactosidase est capable de catalyser la réaction de

transgalactosylation, conduisant à la formation d'une nouvelle liaison glycosidique entre

deux unités de galactose (Panesar et al., 2010). Les réactions de transgalactosylation

consécutives, conduisent à la formation d'une chaîne de plusieurs unités de galactose,

avec l'unité de glucose terminale (Panesar et al., 2010). Cette enzyme a été classée

parmi les glycosides hydrolases 2 (GH 2) des enzymes actives des glucides (Panesar et

al., 2006).

2.5.1. Structure

A partir de la structure tridimensionnelle (Figure 11) de la β-D-galactosidase

(Kluyveromyces lactis), proposée par Pereira-Rodriguez et al.(Pereira-Rodríguez et al.,

2012), la β-galactosidase est formée d’un tétramère composé de quatre sous-unités

identiques (A B C D), avec 1024 acides aminés.

La taille moléculaire de β-galactosidase dépend de sa source. La plus grande taille

revient à la β-galactosidase obtenue à partir de E. coli lactase (520 à 850 KDa). La β-

galactosidase est aussi obtenue à partir de S. fragilis et A. oryzae avec des poids

moléculaires de 201 et 110 KDa, respectivement (Zhang Ning et al., 2001).

23

Figure 11. Structure 3-D de β-D-galactosidase (à partir de Protein Data Bank).

2.5.2. Production

La β-D-galactosidase est obtenue à partir d'une grande variété de sources telles que les

microorganismes (bactéries, champignons, levures), les animaux et les plantes, en

particulier les amandes, pêches, abricots, pommes (Tableau 5). En fonction de son

origine, les paramètres du procédé enzymatique comme le pH optimal, la température

optimale de réaction, la vitesse de conversion de lactose ainsi que le rendement en

GOS diffèrent nettement (Husain, 2010, Panesar et al., 2006, Richmond et al., 1981).

24

Tableau 5. Source de β galactosidase

Plantes Organes

animaux

Levure Bactéries Champignons

Pêche

Abricot

Amande

Les grains de Kéfir

Roses sauvages

Graines de

Luzerne

Les grains de Café

intestin

cerveau

Les tissus

de la

peau

le foie de

bovin

Kluyveromyces

lactis ya

Kluyveromyces

fragilis

Candida

pseudotropicalis

Escherichia coli

Bacillus megaterium

Thermus acquaticus

Streptococcus lactis

S. thermophilus

L.. bulgaricus

L. helareticus

Neurospora crassa

Aspergillus foetidus

Aspergillus niger

Aspergillus flavus

Aspergillus oryzae

A. phoenicis

Mucor pucillus

Mucor meuhei

En effet, les β galactosidases de sources bactériennes ont été largement utilisées pour

l'hydrolyse du lactose en raison de la facilité pour la fermentation, de l’activité

enzymatique élevée ainsi qu’une bonne stabilité. Traditionnellement, les β-

galactosidases les plus largement utilisées en industrie ont été obtenues à partir

d'Aspergillus spp. et Kluyveromyces spp. (Husain, 2010, Oliveira et al., 2011)

Les β galactosidases d’origine fongique ont généralement un pH optimal acide entre 2,5

et 5,4. Ainsi, elles sont plus efficaces pour l'hydrolyse du lactose présent dans le

lactosérum. Elles sont thermostables, mais bien plus sensibles à l'inhibition des produits

d’hydrolyse. Le galactose est souvent un inhibiteur compétitif. En effet, les enzymes

extraites de Aspergillus Niger sont fortement inhibées par le galactose, tandis que celles

extraites de Aspergillus oryzae sont moins exposées à cette inhibition (Husain, 2010,

Panesar et al., 2006).

La levure Kluyveromyces lactis est une importante source commerciale de β-

galactosidase. La production de la β-galactosidase par cette levure connait plus d'intérêt

depuis son utilisation par l'industrie alimentaire pour la production de lait pauvre en

25

lactose (Husain, 2010, Martínez-Villaluenga et al., 2008). En outre, au cours de cette

hydrolyse il y a production des galactooligosaccharides par transgalactosylation qui ont

suscité beaucoup d'intérêt au cours de ces dernières années (Martínez-Villaluenga et

al., 2008).

2.5.3. Mécanisme de la réaction et applications

Le mécanisme de la réaction d’hydrolyse de lactose par les β-galactosidases est

présenté dans la Figure 12, qui montre que la réaction se fait en deux étapes :

Étape (a) : La molécule de lactose forme le complexe enzyme-galactosyl dans le site

actif d’enzyme, avec libération simultanée du glucose.

Étape (b) : Le complexe enzyme-galactosyle est transféré à l’accepteur nucléophile

contenant un groupe hydroxyle. Le transfert à l’eau produit du galactose (réaction

d’hydrolyse, Schéma 9b avec R : hydrogène). Le complexe enzyme-galactose, formé

par hydrolyse du lactose peut réagir avec les molécules de glucides (avec R : mono ou

disaccharides), conduisant à la formation des di-, tri- et supérieur- galactosyl-

saccharides, appelés galactooligosaccharides (GOS) (Zhou et Chen, 2001).

La production de lactosucrose par β-galactosidase est due au transfert du résidu de

galactosyle du lactose (donneur) au saccharose (accepteur). Contrairement à la

transgalactosylation, la production du lactosucrose par levansucrases et Arthrobacter sp.

K-1 β-fructofuranosidase (transfructosylation), utilise le lactose comme accepteur de

glycosyle et le saccharose comme donneur (Figure 13)(Mu et al., 2013).

26

Figure 12. Mécanisme de réaction pour la hydrolyse et la transglycosylation du lactose par Kluyveromyces lactis β-galactosidase (Zhou et Chen, 2001).

Figure 13. La biosynthèse de lactosucrose et ses analogues par β-galactosidase de Bacillus circulans à partir du lactose et du saccharose comme substrats (Li et al., 2009,

Mu et al., 2013).

Glc

Glc Glc

Glc

Glc

Fru Gal

Gal Gal

Gal

Fru

Fru

Glc Fru Gal

Glc Gal Gal

α-1,2

α-1,2

α-1,2

β-1,4

α-1,2

β-1,4

β-1,4

β-1,4 β-1,4

β-1,4

β-1,3 Lactose Glucose

B. circulans β-galactosidase

27

Le mécanisme de la réaction de la β-galactosidase inclut l’hydrolyse du lactose et une

réaction de transglycosylation. Le processus utilisé pour l’hydrolyse par β-D-

galactosidase du lactose, du lactosérum et d’autres produits laitiers dépend énormément

de la substance hydrolysée. Différents processus sont utilisés suivant la nature du

substrat et les caractéristiques de l'enzyme. La première caractéristique, qui détermine

le choix et l'application d'une enzyme donnée, est la gamme de pH. Les enzymes

tolérant un pH acide sont plus adaptées pour le traitement du lactosérum, tandis que les

enzymes tolérant un pH neutre sont adaptées pour la transformation du lait et de

lactosérum doux. La β-galactosidase est également utilisée pour améliorer la production

et le vieillissement du fromage Cheddar par l’hydrolyse préliminaire du lactose en

glucose (Husain, 2010, Luckarift -Heather et Spain- Jim, 2008, Panesar et al., 2006).

Il y a un marché considérable pour le lait et les produits laitiers sans lactose, qui sont

obtenus par hydrolyse enzymatique à l'aide de β-galactosidases. Ces produits sont

appréciés et consommés par les gens ayant une intolérance au lactose, qui constitue un

problème commun. Il est estimé que plus de 70% de la population adulte dans le monde

a des problèmes de digestion du lactose (Oliveira et al., 2011).

La β-galactosidase est très appréciée pour son action hydrolytique sur le lactose. De

plus, l’activité de transférase de la β-galactosidase produit une série d'oligosaccharides.

Ces oligosaccharides ont un effet bénéfique sur la croissance de la microflore intestinale

souhaitable. Ceci attire de plus en plus l'attention des chercheurs afin d’étudier l’activité

de transférase de la β-galactosidase. En outre, l’action de transférase est utilisée dans

diverses applications pour la production d'ingrédients alimentaires, de produits

pharmaceutiques et d'autres substances biologiquement actives (Panesar et al., 2006).

2.5.4. β-Galactosidase de Aspergillus oryzae et son activité de

transgalactosylation

L'activité de transgalactosylation augmente avec la température dans l’intervalle de 40 à

55°C, ce qui se traduit par l'augmentation de rendement en GOS (Vera et al., 2011). En

effet, la température optimale pour l'hydrolyse du lactose et ONPG (Orthonitrophényl-β-

galactoside) par l'enzyme purifiée est de 50°C, tandis que l’enzyme brute est plus

résistante à la chaleur et son maximum d’activité hydrolytique pour ces mêmes substrats

est atteint à 55-60°C (Park et al., 1979). Cette gamme de température où l’activité

28

enzymatique est maximale, est maintenue aussi bien pour la β-galactosidase libre que

celle immobilisée (Freitas et al., 2011).

L’étude de la stabilité et de l’activité de β-Galactosidase effectuée par plusieurs

chercheurs (Freitas et al., 2011, Park et al., 1979, Vera et al., 2011) montrent que

l’hydrolyse maximale de lactose et ONPG par l'enzyme purifiée libre et immobilisée se

déroule à un pH de 4,.5 et 5,0, respectivement. Mais l’enzyme ne perd pas son activité

lorsqu'elle est maintenue à un pH compris entre 3,6 et 8,0 pendant une nuit à

température ambiante (Park et al., 1979).

Concernant l'influence du pH et de la température sur la synthèse des GOS, il a été

montré que, même si les deux paramètres affectent les vitesses de réaction, ils

n'affectent pas la concentration des produits. Dans la synthèse des GOS cinétiquement

contrôlée, l'équilibre entre la transgalactosylation et l’activité hydrolytique n'est pas

altérée par la température (Vera et al., 2011). Cependant, il a été prouvé que

l'augmentation de la concentration du lactose améliore le rendement maximal. Pour

cela, il faut bien prendre en considération la concentration initiale en lactose. Selon la

littérature, avec l’utilisation β-galactosidase de Aspergillus oryzae à une concentration

initiale en lactose de 500 g/L, le rendement en GOS obtenu est de 27% (p/p), dont

environ 70% sont des trisaccharides et le reste est distribué entre les tetrasaccharides et

les pentasaccharides avec des proportions différentes (Urrutia et al., 2013). D’autre part,

avec une solution de lactose à 200 g/L, l’Aspergillus oryzae β-galactosidase libre forme

seulement des trisaccharides, avec un rendement maximal de 22,6% (p/p) (Gaur et al.,

2006). En effet, la β-galactosidase de Aspergillus oryzae serait préférablement utilisée

lorsque la cible est un produit avec une teneur importante en di-et trisaccharides (Urrutia

et al., 2013).

2.6. Immobilisation des enzymes

Les enzymes, généralement, utilisées dans les réactions sont des enzymes libres, d’où

la difficulté de les récupérer (Luckarift -Heather et Spain- Jim, 2008, Oliveira et al.,

2011). De plus, ces enzymes sont sensibles aux conditions environnementales, et

subissent généralement une dénaturation ou une désactivation par des réactifs

chimiques, la température, le pH, les solvants, etc. (Falahati et al., 2012).

29

Afin de surmonter ces obstacles, et par conséquent diminuer le coût de la réaction,

l’immobilisation des espèces biologiquement actives sur des matériaux inorganiques et

organiques est souvent utilisée dans une tentative de stabilisation de l'activité

enzymatique et afin de permettre la réutilisation du biocatalyseur. Cette stratégie

combine la haute sélectivité des réactions enzymatiques et les propriétés mécaniques

du support (Falahati et al., 2012, Husain, 2010).

2.6.1. Avantage d’immobilisation des enzymes

L’immobilisation des enzymes présente plusieurs avantages tels que :

Utilisation efficace de l’enzyme en garantissant sa stabilité vis-à-vis du pH, de

la température, et des solvants (Husain, 2010, Kim et al., 2007);

Utilisation répétitive de l’enzyme (biocatalyseur) pour la séparation et

récupération du catalyseur à partir du flux de produits, et par conséquent

diminution de coût des réactions enzymatiques (Humphrey et Wright, 2004);

Augmentation de la résistance vis-à-vis le cisaillement, et par conséquent,

une prolongation de la durée de vie de l’enzyme (End et Schöning, 2004);

Amélioration de l’activité de enzymes immobilisée grâce à une meilleure

disponibilité des centres catalytiques actifs (End et Schöning, 2004);

Facilité de développer des procédés continus (Humphrey et Wright, 2004) ;

Amélioration de la résistance mécanique, la densité, la stabilité thermique;

Facilité de manipulation permettant une synthèse à débits élevés dans les

réacteurs continus, et facilité de la régénération des biocatalyseurs (enzymes

supportées) (Husain, 2010);

Amélioration de la vitesse de réaction suite à une cinétique favorablement

améliorée (pour certains types de réacteurs) (End et Schöning, 2004).

Ce domaine est en progression continue vu son intérêt scientifique et ses applications

multiples qui attirent les industriels (Falahati et al., 2012).

30

Le Tableau 6 illustre la majorité des produits fabriqués industriellement suite à des

biocatalyseurs immobilisés. Les principaux domaines industriels liés à ce procédé sont;

la production de sucres, des acides aminés ainsi que des produits chimiques et

pharmaceutiques (Bornscheuer, 2008). En effet, l’immobilisation des enzymes dépend

de deux paramètres : le support et la méthode utilisée pour l’immobilisation.

Tableau 6. Les principaux produits fabriqués à l'échelle industrielle en utilisant des enzymes immobilisées (Bornscheuer, 2008)

Produit Enzyme Capacité (t/an)

Sirop de maïs à haute teneur en

fructose

glucose isomérase (xylose

isomérase)

> 7, 000,000

Acrylamide nitrile hydratase > 30,000

Acide 6-Aminopenicillanique pénicilline acylase 2,000

Acides L-amino Aminoacylase > 300

2.6.2. Immobilisation des enzymes : supports

Étant donné que les exigences spécifiques sont différentes pour chaque enzyme ainsi

que pour ses applications, il est impossible de trouver un support universel pour

l'immobilisation de toutes les enzymes. En plus, il faut prendre en considération les

caractéristiques chimiques et physiques du matériau pour permettre la sélection du

support le plus approprié. Les principales caractéristiques de la composition chimique

sont les produits chimiques de départ pour les synthèses, les groupes fonctionnels

disponibles pour les interactions avec l'enzyme, et la stabilité chimique dans les

conditions réactionnelles employées (Yiu et Wright, 2005). Parmi les caractéristiques

physiques, on cite :

La forme et la taille des pores;

La surface appropriée;

La stabilité thermique;

Le caractère hydrophile;

31

L’insolubilité dans le milieu réactionnel;

Le volume accessible de support pour les enzymes.

En fonction de leurs compositions chimiques, et en se basant sur la littérature, on

distingue deux types de supports pour le procédé d’immobilisation des enzymes: les

supports organiques et inorganiques (End et Schöning, 2004).

En effet, de nombreuses matrices inorganiques ont été testées comme supports pour

l'immobilisation d'enzymes tels que le gel de silice, le verre, l'alumine, des minéraux

argileux, Les zéolites, et les oxydes de métaux de transition (par exemple; NiO et TiO2).

Une partie de ces matériaux sont synthétiques et d'autres sont d'origine naturelle. Bien

qu'ils soient disponibles et non coûteux, les matériaux inorganiques naturels ne sont pas

couramment utilisés pour l’immobilisation des enzymes, puisque leurs caractéristiques

chimiques et physiques sont moins compatibles avec les applications enzymatiques

(End et Schöning, 2004). Tandis que les propriétés des matériaux synthétiques telles

que la surface, la composition chimique, la porosité, la distribution des pores, etc. sont

plus modulables, d’où l’utilisation avantageuse de ces matériaux en biocatalyse.

Les matériaux organiques sont les principaux supports utilisés pour des applications à

grande échelle. Cette utilisation des supports organiques pour l'immobilisation

d'enzymes est due à la variété de groupes fonctionnels organiques qui peuvent disposer

de nombreuses interactions avec l’espèce enzymatique, en particulier par des liaisons

covalentes. Mais ces matrices présentent quelques inconvénients dus à l’instabilité

thermique par rapport aux matrices inorganiques ainsi qu’une instabilité vis-à-vis des

solvants et les attaques microbiennes (End et Schöning, 2004). D’où l’intérêt accordé

aux supports inorganiques ces dernières années, et exceptionnellement aux supports

mésoporeux à base de silice. Ils présentent toute une famille de matériaux

nanostructurés très ordonnés qui permettent l’encapsulation des molécules et des

enzymes de dimensions différentes (Takahashi et Miyazaki-Imamura, 2008) (Figure 14).

À guise d’exemple, la silice mésoporeuse ordonnée offre d'excellentes possibilités pour

l'immobilisation d'enzymes, surtout par liaison covalente, en raison de la disponibilité de

groupes silanols bien définis. Ces groupes fournissent des sites réactifs pour la

fonctionnalisation et offrent des propriétés de surface appropriées, permettant de

contrôler la position et la densité du biocatalyseur immobilisé avec précision (Lee et al.,

2009).

32

En effet, cette attention attribuée à ces matériaux est due au fait qu’ils possèdent:

Une large surface active (surface externe et à l’intérieur des pores);

Une uniformité de structure bien ordonnée;

Une taille de pores contrôlables (2 nm < Ø < 50 nm) (Kim et al., 2006).

Figure 14. Comparaison de la taille des pores de certains matériaux nanoporeux et la taille moyenne moléculaire de certaines enzymes couramment utilisés (Humphrey et

Wright, 2004).

La forme et la taille de ces matériaux aident beaucoup l’immobilisation des enzymes. Or,

les MCM-41, les FSM-16 et la SBA-15 sont parmi les premiers matériaux utilisés comme

supports d’enzymes depuis les années 90. Cependant, de nos jours, il y a une multitude

de supports utilisés pour l’immobilisation des enzymes tels que : la SBA-15 (avec sa

forme hexagonale qui est utilisée comme un support pour différentes enzymes comme la

lipase et la trypsine) (Humphrey et Wright, 2004), les HMMS qui sont utilisés

efficacement comme supports pour les α-chymotrypsin et les lipases grâce à leur forme

particulière. Les HMMS sont des mésoporeux avec des pores allant jusqu’à 37 nm reliés

par des canaux de 13 nm (Kim et al., 2007) (Figure 15). Les MCF sont aussi utilisés

5 10 15 20 30 40 50 60 70 80 90 100 150 200

250 300 500 1000

Cyctochrome c

Trypsin

Lipase

Penicillin Acylase

Chloroperoxidase

Horseradish peroxidase

Diamètre de pore / Å

Zeolites Matériaux

macroporeux

MCF

FDU-5 MCM-48

SBA-1 MCM-41 SBA-15

Région mésoporeuse

(Diamètre de pore = 20 Å – 200 Å

33

largement pour l’immobilisation des enzymes, grâce à la forme sphérique et la taille de

leurs pores atteignant 22 nm (Schmidt-Winkel et al., 1999).

Le Tableau 7 résume les propriétés caractéristiques de différents matériaux

mésoporeux à base de silice utilisés pour encapsuler des enzymes (Lee et al., 2009).

Figure 15. Schéma représentatif de HMMS (Kim et al., 2007).

En effet, le choix approprié d’un support est critique. Les propriétés chimiques et

physiques du support (la structure chimique du support, sa porosité, la taille de ses

pores et sa morphologie), ainsi que la taille de l’enzyme et ses caractéristiques, doivent

tous être considérés pour faire un bon choix. Lors du choix du matériau, il faut aussi

prendre en considération la méthode d’immobilisation utilisée et vice-versa.

34

Tableau 7. Propriétés caractéristiques des différents matériaux de silice mésoporeuses utilisés pour encapsuler des enzymes

Matériaux

mésoporeux

Source de silice Description Diamètre des

pores (nm)

MCM - 41 TEOS, sodium

silicate

2D canaux hexagonaux 2-10

MCM-48 TEOS, sodium

silicate

Cubique 3D 2-4

FSM-16 Polysilicate kanemite 2D canaux hexagonaux ~ 4

SBA-1 TEOS Mésostructure cubique

3D

2-3

SBA-15 TEOS, sodium

silicate

2D canaux hexagonaux 5-30

SBA-16 TEOS, TMOS Cages sphériques 5-30

MCF TEOS Mousse cellulaire 10-50

HMS TEOS Mésostructure

désordonnée

2-0

MSU-X TEOS, TMOS Mésostructure

désordonnée

2-15

IBN-X TEOS Nanoparticules 5-20

PMOs (RO)3Si-R-Si(OR)3 2D ou 3D hexagonal 2-20

2.6.3. Méthode d’immobilisation des enzymes

Plusieurs méthodes d'immobilisation d'enzymes ont été utilisées depuis les années

1980. Chaque méthode a ses avantages et ses inconvénients, et le choix dépend de la

35

nature de l'enzyme cible et des conditions de la réaction. Toutefois, aucune méthode

d’immobilisation ne peut être généralisée pour toutes les enzymes et leurs applications.

En effet, il y a plusieurs méthodes d’immobilisation d’enzyme dont les plus utilisées sont

les suivants :

Adsorption : L'immobilisation d'enzymes par adsorption a été parmi les

premières méthodes d'immobilisation d'enzymes. Elle représente la méthode la

plus simple et la plus naturelle (sans produits chimiques) pour immobiliser des

enzymes sur des supports mésoporeux (Husain, 2010). Cette méthode consiste

à un attachement physique entre l’enzyme et le support par des forces de Van

Der Waals, des liaisons hydrogène, ou l'interaction hydrophile. Cet attachement

est obtenu suite au procédé suivant : le support mésoporeux est mis en

suspension dans une solution d'enzyme pour une certaine durée, habituellement

pour une nuit, ensuite on sépare le support de la solution par centrifugation. En

général, les enzymes immobilisées préparées par adsorption ont tendance à se

desorber du support, en raison de l'interaction relativement faible (Humphrey et

Wright, 2004).

Liaison covalente : L’immobilisation des enzymes par liaison covalente est la

technique la plus fréquemment associée au terme « enzyme immobilisée »

(Bowers et Carr, 1980). En effet, une liaison covalente d'une enzyme à un

support est basée sur une réaction chimique entre les résidus d'acides aminés

actifs situés sur la surface de l'enzyme et la partie fonctionnalisée du support, ou

inversement (Cao, 2006), comme illustré dans la Figure 16. Cette méthode

d'immobilisation d'enzymes, fournit habituellement de plus forts liens entre

l’enzyme et le support, comparée à d’autres méthodes d’immobilisation

d’enzymes telles que l’immobilisation par adsorption. Ainsi, le détachement de

l'enzyme de la matrice utilisée est souvent minimisé (Cao, 2006). Cependant,

les méthodes covalentes sont relativement coûteuses et compliquées. Les

rendements d'activité peuvent être faible en raison de l'exposition de l'enzyme à

des conditions sévères et parfois, le site actif des enzymes peut être modifié par

l'intermédiaire des réactions chimiques utilisées pour créer la liaison covalente

(Husain, 2010).

36

Figure 16. Immobilisation covalente de l'enzyme sur un support: (A) des résidus d'acide aminé actif; (B) fonctionnalité de liaison du support; (C) support; (D) espace (Cao, 2006).

Encapsulation : Par définition, l’encapsulation d'une enzyme est la formation

d'une barrière similaire à une membrane physique semi-perméable autour

d’une préparation enzymatique (Cao, 2006). Par exemple, l'encapsulation

des enzymes dans des sol-gel est basée sur la condensation des

précurseurs de silice autour des molécules enzymatiques, de sorte qu'un

réseau poreux est formé dans lequel la protéine est piégée au hasard (Figure

17) (Urrego et al., 2010). L’encapsulation de l'enzyme exige des conditions

extrêmement bien contrôlées (Husain, 2010).

Figure 17. Représentation de l’immobilisation des enzymes par encapsulation.

Réticulation «cross-linking» (Figure 18): la réticulation est une méthode simple

et efficace pour immobiliser des enzymes sur des surfaces mésoporeuses

avec une grande stabilité, car elle peut empêcher le détachement des

enzymes lors de la lixiviation, et par conséquent améliorer la stabilité

37

enzymatique. La réticulation est basée sur la formation de liaisons covalentes

entre les molécules d'enzyme, au moyen de réactifs bi-ou multifonctionnels,

conduisant à des agrégats réticulés en tridimensionnels. En raison de la

réticulation, très peu de désorption se produit et par conséquent un meilleur

attachement de l'enzyme est observé. Un avantage supplémentaire de

préparations d'enzymes réticulées, est qu'il n'y a pas d'exigence pour le

support pour l'immobilisation d’enzymes (Husain, 2010).

La réticulation est mieux utilisée en conjonction avec l'une des autres

méthodes. Elle est principalement utilisée comme un moyen de stabiliser les

enzymes adsorbées et empêcher leur détachement. Cependant, la

réticulation peut provoquer des changements considérables dans le site actif

des enzymes, et également des limitations de diffusion accentués, qui

peuvent entraîner une perte importante de l'activité. La perte de l'activité

enzymatique se produit également lors de la réticulation de l'enzyme en

utilisant des réactifs bifonctionnels ou multifonctionnels. Cette méthode

présente un contrôle difficile de la taille des agrégats, une accessibilité

difficile des substrats aux noyaux d'agrégats, et un manque de résistance

mécanique de l'enzyme réticulée (Zhao, 2006). Le réactif le plus couramment

utilisé pour la réticulation comprend du glutaraldéhyde (GA). On peut citer

d'autres réactifs utilisés pour la réticulation, notamment le bis-diazobenzidine-

2,2-disulfonique, diazobenzidine, l'hexaméthylène diisocyanate (López-

Gallego et al., 2005).

La réticulation implique généralement un processus en deux étapes :

Premièrement, des molécules enzymatiques sont adsorbées à l'intérieur des

nanocanaux de la silice mésopoureuse (MPS). Deuxièmement, les enzymes

adsorbées sont réticulées par addition d'un agent de réticulation bifonctionnel

comme le glutaraldéhyde, afin de produire une charge enzymatique très

stable, et active. En effet, le glutaraldéhyde représente l'agent de réticulation

de choix car il est peu coûteux et facilement disponible en quantités

commerciales.

38

Figure 18. Représentation de l’immobilisation par réticulation «cross-linking» (Kim et al., 2008).

39

2.6.4. Immobilisation de β-galactosidase à partir de Aspergillus

oryzae

La majorité des systèmes d’immobilisation de β-galactosidase ont été développés dans

le but de réalisé l'hydrolyse du lactose; il y a eu quelques travaux concernant la

production de GOS. Il est important de noter que les méthodes d’immobilisation

favorables pour l'hydrolyse du lactose peuvent être différentes de celles de la production

des GOS.

La β-galactosidase à partir de Aspergillus oryzae a été immobilisée par plusieurs

procédés et sur une variété de matrices, y compris l’encapsulation, la réticulation,

l'adsorption, les liaisons covalentes ou la combinaison de ces méthodes (Tableau 8).

Étant donné que chaque méthode a ses propres avantages et inconvénients, le choix de

la méthode appropriée dépend de l'enzyme, de la matrice, de la réaction, des conditions

expérimentales et du réacteur.

40

Tableau 8. Différentes méthodes et différents supports d’immobilisation de β-galactosidase à partir de Aspergillus oryzae

Méthodes d’immobilisation Activité

enzymatique

* (%)

Références

Réticulation avec du glutaraldéhyde

sur des fibres composées de gélatine

et d'alginate de

56

Tanriseven & Dogan

(Zhang et al., 2001)

couplage avec carbodiimide à des

billes d'alginate 76

Dominguez et al.

(Domínguez et al., 1988)

Encapsulation dans l’alcool spongeux

(polyvinyl cryogel) --

Rossi et al. (Parhi et al.,

2008)

encapsulation dans des billes

d'alginate de cobalt réticulée avec du

glutaraldéhyde

83

Ates & Mehmetoglu (Lee

et al., 2005)

micro-encapsulation dans des billes

d'alginate 64

Dashevsky (Dashevsky,

1998)

encapsulation dans de la gélatine et

réticulée avec la transglutaminase 8–46

Fuchsbauer et

al.(Fuchsbauer et al., 1996)

adsorption sur du chlorure de

polyvinyle (PVC)

adsorption sur membrane de gel de

silice

--

Bakken & Hill Jr (Bakken

et al., 1990)

adsorption sur la célite

liaison covalente de chitosane

agrégation réticulé par le

2

18,4

13.5

Gaur et al. (Gaur et al.,

2006)

41

glutaraldéhyde

liaison covalente dans les mousses de

polyuréthane --

Hu et al. (Hu et al., 1993)

la liaison covalente à la toile de coton 55

Albayrak et al. (Albayrak

et Yang, 2002)

Liaison covalente sur des supports

siliceux macroporeux 48

Bernal.C et al.(Bernal et

al., 2014)

Liaison covalente sur des

microsphères de chlorure de vinyle

amino-Fonctionné avec le couplage de

glutaraldéhyde

80

Mohy Eldin et al.(Mohy

Eldin et al., 2014)

encapsulation dans des nanoparticules

de silice agrégées --

Wu. et al. (Wu et al., 2013)

Liaison covalente sur des méso-

macroporeux silices greffées par des

groupements glyoxyl

--

Bernal.c et al.(Bernal et al.,

2013)

Liaison covalente sur la surface des

nanoparticules d'argent fonctionnalisé

via le glutaraldéhyde

--

Ansari. et al. (Ansari et al.,

2012)

Adsorption sur la résine Duolite A568 --

Gürdaş. et al. (Güleç et al.,

2010)

Adsorption sur des nanoparticules

d'oxyde de zinc 73

Husain. et al. (Husain et

al., 2011)

*Activité enzymatique : c’est le pourcentage de formation de produit par rapport au

substrat initial.

42

2.7. Conclusion

Les oligosaccharides prennent de plus en plus une place dans notre alimentation grâce

à leurs effets prouvés bénéfiques pour la santé humaine. En effet, ils existent

naturellement dans les fruits et les légumes mais ils peuvent aussi être synthétisés soit

par voie chimique ou bien par voie enzymatique. La voie enzymatique reste toujours un

meilleur choix comparé à la voie chimique pleine d’inconvénients. Le lactosucrose est un

trisaccharide non digestible favorable au développement de la flore intestinale,

synthétisé par le biais de levansucrase, de fructofuranosidase ou de β-galactosidase en

présence de lactose et de sucrose. La principale limite de la méthode enzymatique est

son coût élevé. Pour diminuer ce coût, on a recours à l'immobilisation des enzymes sur

des supports pour les réutiliser ultérieurement. La méthode d’immobilisation ainsi que la

nature de support affectent considérablement la réaction catalytique et son rendement.

43

Chapitre 3. Hypothèses et objectifs de

recherche

3.1. Hypothèses du travail

D'après la revue de littérature, nous émettons les hypothèses suivantes pour

synthétiser le lactosucrose par catalyse hétérogéne.

1) La β-galactosidase pourrait être immobilisée sur différents supports siliceux

mesoporeux sans perdre son activité et par conséquent le lactosucrose peut être

synthétisé avec l’enzyme immobilisée par catalyse hétérogène.

2) La taille et la forme des pores des supports pourraient avoir des effets sur

l’immobilisation et l’activité des enzymes ainsi que la cinétique de la réaction.

3.2. Objectifs de travail

3.2.1. Objectif principal

L’objectif principal de ce travail est de produire du lactosucrose avec une approche

biotechnologique verte basée sur la catalyse hétérogène en utilisant l’enzyme β–

galactosidase supportée sur des matériaux inorganiques à base de silice.

3.2.2. Objectifs spécifiques

L’objectif général de ce sujet de recherche engendre plusieurs autres objectifs

spécifiques. Ces objectifs peuvent être représentés comme suit :

1) Synthétiser et caractériser les différents matériaux mésoporeux;

2) Optimiser les conditions d’immobilisation de β–galactosidase sur des matériaux

inorganiques à base de silice;

3) Synthétiser le lactosucrose avec la β-galactosidase immobilisée;

4) Réutiliser des biocatalyseurs plusieurs fois tout en gardant l’activité et la stabilité

d’enzyme.

45

Chapitre 4. Matériels et méthodes

4.1. Matériels biologiques

β-Galactosidase synthétisée à partir d’Aspergillus oryzae (Sigma-Aldrich).

Elle hydrolyse le lactose en ses composants monosaccharides ; glucose et

galactose. Elle catalyse également la transglycosylation de glucose. Une

unité de β-Galactosidase hydrolyse 1,0 µmole de lactose par minute à pH de

4,5 à 30°C. Chaque milligramme d’enzyme contient 8 unités de β-

Galactosidase.

Albumine de sérum bovine (BSA) : pureté ≥98%, Sigma-Aldrich.

4.2. Produits chimiques

D-(+)-lactose monohydrate, Sigma-Aldrich.

Saccharose, Sigma-Aldrich.

Fructose: (pureté > 98%), Sigma-Aldrich.

D-(+)-Glucose, Sigma-Aldrich.

D-(+)-Galactose, Sigma-Aldrich.

Tétraéthylorthosilicate, précurseur de silice (TEOS; pureté > 98%), Sigma-

Aldrich.

Pluronic P123 (acide) : Surfactant (agent structurant) (EO20PO70EO20),

Sigma-Aldrich.

1,3,5-triisopropylbenzène (TIPB) : pureté > 95%, Sigma-Aldrich.

1,3,5-triméthylbenzène (TMB) : pureté > 96%, Sigma-Aldrich.

Acide chlorhydrique (HCl, 36-38%), Fisher Scientific.

Chlorure de potassium (KCl, 99-100%), BDH Inc.

Hydrogénophosphate de potassium (K2HPO4, ≥98.0 %). Fisher Scientific.

Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4, ≥99.0%), Sigma-Aldrich.

Glutaraldehyde (GA, Grade I, 25% dans H2O), Sigma-Aldrich.

Acide bicinchoninique (BCA) : pureté ≥98%), Sigma-Aldrich.

Carbonate de sodium (Na2CO3, ≥99.5%), Sigma-Aldrich.

Bicarbonate de sodium (NaHCO3, ≥99.7%), Fisher Scientific.

46

Tartrate de sodium (C4H4Na2O6, ≥99.0%), Fisher Scientific.

Soude en pastille : (NaOH, pureté ≥ 97%), Laboratoire Mat.

Sulfate de cuivre pentahydraté (CuO4S·5H2O, ≥98.0%), Fisher Scientific.

Chlorure de sodium (NaCl, ≥99.0%), Sigma-Aldrich.

4.3. Équipements

Verreries de laboratoire.

Balances (maximum de 210 g, déviation = 0,1 mg).

Agitateurs magnétiques (Corning Inc., Fisher Scientific)

pH-mètre (Accumet, Fisher Scientific)

Étuves (Maximum de 275°C), Fisher Scientific.

Four à calcination, programmable, Vulcan 3-550 PD NEY USA.

Diffractomètre de rayon X (Ultima III, Rigaku, Japan)

Spectrophotomètre d’absorption UV visible, Genesys 20.

Équipement complet de physisorption Autosorb 1 (Quantachrome, Florida,

USA).

Système HPLC Waters (Millipore Corp., Milford, Mass. U.S.A).

Spectromètre de masse TQD (Waters).

Un microscope électronique à transmission JEM-3010 (JEOL, Japon).

4.4. Méthodologie

4.4.1. Réaction enzymatique avec l’enzyme libre (approche

homogène)

La synthèse du lactosucrose a été réalisée à partir du lactose et du saccharose en tant

que substrats, en présence de β-galactosidase en tant que catalyseur.

Le lactose et le saccharose avec différentes proportions, ont été dissous dans 50 mL de

solution aqueuse. Ensuite, une concentration bien déterminée de β-galactosidase a été

ajoutée à cette solution. Le mélange enzyme/substrats est placé à l’étuve à différentes

températures pendant des intervalles de temps variés allant jusqu’à 60 heures.

47

Le but de l’expérience est d’étudier la stabilité et l’influence des conditions opératoires

sur le rendement enzymatique et la cinétique de réaction. La synthèse a été effectuée

avec différentes concentrations de substrats, selon deux rapports molaires différents de

donneur/accepteur (lactose/saccharose). Les combinaisons sont résumées dans le

Tableau 9.

L’optimisation des paramètres expérimentaux (concentration d’enzyme, pH, et T°) a été

effectuée en utilisant le rapport des substrats (1 :1) à une concentration de 30% (m/v) de

chacun de ces derniers (lactose et saccharose), en variant les paramètres

expérimentaux comme suit:

Quatre concentrations différentes d’enzyme (1, 4, 6 et 10 U/mL).

Trois pH différents (7 ; 5 ; 3,5).

Trois températures différentes (30°C, 40°C, 50°C).

Tableau 9. Les conditions opératoires de la biosynthèse de lactosucrose à partir de lactose et de saccharose

Réaction

Rapport molaire 1 :1

Réaction


Lactose

(g/100ml)

Saccharose

(g/100ml)

Lactose

(g/100ml)

Saccharose

(g/100ml)

A 15 15 D 50 25

B 30 30 E 30 15

C 50 50 F 15 7,5

Au cours de l'incubation, 100 µL des échantillons ont été prélevés à des intervalles de

temps bien définis. Ces quantités prélevées ont été diluées 100 fois, et chauffées à

100°C pendant 10 minutes pour désactiver l'enzyme. Afin d’identifier et de quantifier les

produits, tous les échantillons ont été analysés par Chromatographie en phase liquide à

haute performance (HPLC).

48

4.4.2. Les analyses HPLC

La teneur en saccharides des échantillons a été déterminée en utilisant un appareil

HPLC Waters (Millipore Corp., Milford, Mass. U.S.A) comprenant un détecteur à indice

de réfraction (modèle 2142, LKB, Bromma). La colonne (Waters Sugar-Pack-I, Waters,

Millipore Corp.) était maintenue à une température de 90ºC. La phase mobile

isocratique, constituée d’une solution d’EDTA (50mg/L), est assurée avec un débit de

0.5 mL/min. L’identification ainsi que la quantification ont été faites en comparaison

avec des solutions standards à différentes concentrations connues. L’appareil est équipé

d’un injecteur automatique, fixé à 50µL par injection.

4.4.3. Calculs des rendements

Durant ce travail, l’évolution des produits formés et des substrats consommés est définis

comme:

La conversion du lactose (%) :

(%))(.

)()(.(%).

int

int

gLactose

glactoseglactoseLacCon

ial

tial (1)

La conversion du saccharose (%) :

(%))(.

)()(.(%).

int

int

gSaccharose

gsaccharosegsaccharoseSaccCon

ial

tial (2)

Le rendement en GOS (%) :

(%))(.

)((%).Rendement

int gLactose

gGOSGOS

ial

(3)

4.4.4. Purification et caractérisation des produits formés

4.4.4.1. UPLC-MS

Pour l'isolement de GOS inconnus produits au cours de la synthèse, la réaction a été

arrêtée après 20 heures. Le biocatalyseur a été désactivé par l'ébullition de la solution

pendant 10 min. Les échantillons n’ont subi aucune dilution au préalable, pour avoir une

concentration très élevée lors de séparation des pics par UPLC. Par la suite, les pics

séparés sont analysés par spectrométrie de masse (MS). L'analyse MS a été réalisée

49

sur un spectromètre de masse TQD (Waters) équipé d'une interface electrospray Z-

spray. L'acquisition des données a été réalisée avec le logiciel MassLynx 4.1 (Waters).

4.4.4.2. Analyse du lactosucrose par résonance magnétique nucléaire

Les structures chimiques des galactooligosaccharides biosynthétisés ont été identifiées

par résonance magnétique nucléaire unidimensionnelle (1D, 1H-RMN). Les spectres

RMN ont été enregistrés à température ambiante (25°C) sur un spectromètre Bruker

Avance 500 MHz spectromètre III (Bruker Ltd, Rheinstetten, Allemagne), équipé d'une

tête de sonde Bruker 5 mm TXI avec gradient de l'axe Z, en opérant à 500 MHz. Les

échantillons de galactooligosaccharides purifiés ont été dissous dans de l'eau deutérée

(D2O). Les spectres 1H-RMN sont obtenus avec l'accumulation de 128 balayages par

une largeur d'impulsion de 45°, temps d'acquisition de 2,0 s et un retard de recyclage de

1 s. Les spectres 1H -RMN ont été acquis à travers une fenêtre spectrale de 9 ppm. Les

déplacements chimiques 1H ont été référencés au tétraméthylsilane TMS (δ 0,00 ppm)

comme étalon externe. Les valeurs des déplacements chimiques (δ) sont données en

partie par million (ppm) et les constantes de couplage (J) sont données en hertz (Hz).

Les pics ont été signalés comme singulet (s), doublet (d), triplet (t), doublet dédoublet

(dd) ou multiplet (m), afin de faciliter la lecture et la compréhension. Le traitement des

données acquises a été réalisée en utilisant les logiciels: Topspin 2.1 (Bruker Ltd,

Rheinstetten, Allemagne), et aussi Mestre-C Lite et MestReNova (Mestrelab Research,

Escondido, Californie, USA).

4.4.5. La synthèse des supports

Dans le but d’étudier l’effet de la taille et la forme des pores des supports, ainsi leur

surfaces spécifiques sur l’immobilisation et l’activité des enzymes, nous avons choisi

sept différents supports ayant des tailles de pores et des surfaces spécifiques

différentes.

4.4.5.1. Synthèse du support mésoporeux SBA-15

La méthodologie de synthèse de la SBA-15 a été mise au point par Zhao et ses

collègues (Zhao et al., 1998). La SBA-15 de forme hexagonale a été synthétisée en

milieu acide en utilisant comme agent structurant (tensioactif) le poly (éthylène glycol)-

poly (propylène glycol)-poly (éthylène glycol), EO20PO70EO20, qui est un copolymère

(Pluronic 123).

50

Dans une synthèse typique, et afin de produire environ 10 g de la SBA-15 calciné, 20 g

de Pluronic 123 a été dissous dans 600 mL d'une solution de HCl (2 N) à température

ambiante, sous agitation magnétique, pendant 3 h. Une fois le tensioactif est solubilisé,

la solution obtenue est chauffée lentement jusqu'à atteindre 40°C, puis 37 g de

tetraethoxysilane, TEOS (précurseur de silice) sont ajoutés goutte à goutte à la solution.

Le mélange réactionnel résultant reste sous agitation à 40°C pendant 24 h. Par la suite,

le mélange est versé dans une bouteille L-Pyrex et est transféré vers une chambre de

four sans agitation pendant 24 h à 100°C pour le vieillissement de la synthèse de la

SBA-15. Le produit final a été récupéré par filtration, lavé plusieurs fois avec l'eau et

l'éthanol, et séché à température ambiante. Finalement, la poudre obtenue est calcinée

dans un four programmable à 540°C pendant 5 heures avec un pas de 5°C/min

(Belkacemi et al., 2006).

4.4.5.2. Synthèse de nanomateriaux en forme de barre (Rod-like) ‘’S2.9’’ et

en forme de vésicule (Vesicle-like) ‘’S34.8’’

Le mode de préparation est similaire à celui de la SBA-15, mais avec quelques

modifications. Tout d'abord, 1 g de P123 a été dissous dans un mélange de 8,5 mL de

H2O et 30 g de solution aqueuse de HCl (2 M). La solution résultante a été agitée à

température ambiante jusqu'à ce qu’elle devienne limpide. Ensuite, des quantités

spécifiées de TIPB (1,3,5-triisopropylbenzène) ont été ajoutées à cette solution, avec

des rapports molaires (TIPB: P123) de 2,9: 1 (pour la ‘’S2.9’’) et 34,8: 1 (pour la

‘’S34.8’’). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 18h. Puis, 2,1 g de

TEOS ont été ajoutés à ces solutions sous agitation pendant 8 min, et le tout a été

maintenu sous des conditions statiques à 35°C pendant 24 h. Par la suite, ces deux

solutions ont été transférées dans un autoclave revêtu de téflon, maintenu à 130°C

pendant 24h. Enfin, des précipités blancs ont été filtrés et lavés avec de l'eau, séchés à

température ambiante, puis calcinés à 500°C pendant 6 h à une vitesse de chauffage de

1°C/min dans un four tubulaire afin d’éliminer les résidus organiques (Zhou et al., 2007).

4.4.5.3. Synthèse des MCF (Mesocellular Siliceous Foams)

Dans une synthèse typique, 2 g de P123 ont été dissous dans une solution aqueuse de

75 mL de HCl (1,6 M) à température ambiante. Par la suite, 2 g de TMB (1,3,5-

triméthylbenzène) ont été ajoutés. Après au moins 45 minutes à une température de 35-

40°C, 4,4 g de TEOS ont été ajoutés. Le mélange est maintenu à cette température (35-

51

40°C) sous agitation pendant 20 h. Puis il a été transféré vers une étuve à 100°C

pendant 24 h pour le vieillissement. Le solide obtenu est filtré puis lavé et séché à

température ambiante pendant 24 h. Finalement, il est calciné à 500°C pendant 8 h à

une vitesse de chauffe de 5°C/min (Schmidt-Winkel et al., 1998).

4.4.5.4. Synthèse de LP-FDU-12

La synthèse de ce type de matériaux a été effectuée selon le protocole suivant : 0,5 g de

P123, 0,6g de TMB et 2,5g de KCl ont été dissout dans 30 mL de HCl (2M). Après 2 h

d’agitation, 2,08 g de TEOS ont été ajoutés à la solution. Ensuite, la solution a été mise

sous agitation à une basse température (10°C, 15°C et température ambiante) pendant

24h. Lors de vieillissement, le mélange a été transféré vers une température de 100°C

pendant 24 h. Finalement, les matériaux ont été filtrés, lavés et séchés à température

ambiante avant la calcination à 550°C/5h à une vitesse de chauffe de 2°/min (Fan et al.,

2005, Kruk et Hui, 2008).

4.4.6. Caractérisations des supports

4.4.6.1. Analyses BET

Les isothermes d'adsorption / désorption des échantillons calcinés (supports

synthétisés) ont été obtenues en utilisant un analyseur d'adsorption volumétrique

(modèle Autosorb-1, Quantachrome Instruments, Boyton Beach, FL) à 77 K (-196°C).

Avant l'analyse d'adsorption, les échantillons ont été dégazés pendant 22 h à 300°C.

Le volume total des pores a été estimé à partir de la quantité adsorbée à 0,99 de

pressions relatives P/P0. Les distributions des tailles des pores du matériau ont été

calculées en utilisant la branche de désorption des isothermes d'adsorption/désorption

d’azote (N2), en appliquant la méthode Barrett-Joyner-Halenda, BJH (pour la SBA-15,

‘’S.9’’, ‘’S34.8’’ et les FDU-12) (Zhao et al., 1998, Zhou et al., 2009). Par contre la

méthode BJH n’est pas calibrée pour le calcul des tailles de pores sphériques larges

(FDU-12) qui conduit à une sous-estimation de diamètre des pores, (Huang et Kruk,

2012). D’autre part, la méthode Broekhoff-de Boer–Frenkel-Halsey-Hill, BdB–FHH a été

utilisée dans le cas MCF (Desch et al., 2014).

52

4.4.6.2. Diffraction des rayons X (DRX)

Les structures ordonnées des supports sont déterminées par diffractométrie de rayons X

(DRX). Les diffractogrammes des poudres des supports synthétisés ont été obtenus en

utilisant un appareil DRX Ultima III de Rigaku, Japon, avec le rayonnement Cu Ka (λ =

1.5406 Å). Les diffractogrammes de poudre aux petits angles ont été acquis à une

vitesse de 0,5°/min dans la plage 2θ de 0,6 à 3° de balayage.

4.4.6.3. Analyses de Microscopie Électronique à Transmission (MET)

Les analyses de microscopie électronique à transmission (MET) ont été réalisées avec

un appareil JEM-3010 (JEOL, Japon) fonctionnant à une tension d'accélération de 200

kV. Les échantillons des supports ont été suspendus dans le méthanol et traités par

ultrasons pendant 10 min. Ensuite, la suspension (5 µL) a été disposée uniformément,

puis elle a été séchée sur une grille de nickel. Cette analyse donne une idée sur la taille

et la forme des pores du matériau, ainsi que sa structure.

4.4.7. Immobilisation de β-Galactosidase

4.4.7.1. Immobilisation ‘Cross-linking’

La méthode ‘cross-linking’ utilisée pour l’immobilisation de β-Galactosidase suit le

protocole suivant : 10 mg du support siliceux ont été mélangés avec 1,5 mL de β-

galactosidase libre dans une solution tampon (tampon de phosphate de sodium 10 mM)

de concentration de 4 g/L. Le mélange a été agité au vortex pendant 30 secondes,

soumis à une sonication pendant 5 secondes, et puis incubé à température ambiante

sous agitation (250 rpm). Après une incubation de 20 min (phase d’adsorption), les

échantillons ont été brièvement lavés par un tampon de phosphate de sodium 100 mM,

puis incubés dans le même tampon contenant 0,1% de glutaraldéhyde (GA) à 200 rpm

pendant 30 min. Après le traitement avec le GA, les échantillons ont été lavés par un

excès de tampon de phosphate à 100 mM et stockés à 4°C (Kim et al., 2008).

Afin d’étudier la capacité de rétention de différents matériaux, l’immobilisation a été

effectuée avec 4 différentes concentrations de β-Galactosidase par rapport à la quantité

des supports (25, 60, 75 et 100% massique), 3 pH différents (3,5 ; 5 et 7) ainsi que 3

concentrations de glutaraldhyéde (0,1%, 1% et 2% v/v).

53

4.4.7.2. Rétention d’enzymes par les supports

Les enzymes non retenues sur les supports après chaque lavage ont été mesurées par

la méthode BCA (Smith et al., 1985) (méthode de dosage colorimétrique des protéines).

La concentration totale en protéines se manifeste par un changement de couleur de la

solution d'échantillon du vert au pourpre. Cette couleur pourpre absorbe fortement la

lumière à une longueur d'onde de 562 nm.

La solution de BCA de couleur verte, est composée de 50 volumes de réactif A et 1

volume de réactif B. Cette solution est stable pour une durée bien déterminée, environ

8h.

Le réactif A est composé de plusieurs produits à des concentrations bien

précises : 1% d’acide bicinchoninique, 2% de carbonate de sodium, 0,16% de

tartrate de sodium, 0,4% de soude, et 0,95% de bicarbonate de sodium.

Cette solution est fortement alcaline (pH = 11,25).

Le réactif B est composé de 4% de sulfate de cuivre pentahydraté.

La quantité de protéine présente dans une solution peut être quantifiée par une

spectrométrie d’absorption UV, calibrée avec des solutions protéiques de concentration

connue au préalable (Tableau 10).

Tableau 10. Préparation des standards à concentration protéique connue

Blanc 1 2 3 4 5

Étalon sérum albumine bovine à

1 mg/mL en NaCl 0,15 mol/L

0 µL 20 µL 40 µL 60 µL 80 µL 100 µL

Eau 100 µL 80 µL 60 µL 40 µL 20 µL 0 µL

Réactif Cu2+

/BCA du jour 2 mL

Quantité de protéines par tube

réactionnel

0 µL 20 µg 40 µg 60 µg 80 µg 100 µg

Les standards ainsi que les solutions à doser sont incubés pendant 2 h à température

ambiante ou 30 min à 37°C afin de favoriser la réaction, et par conséquent, mettre en

relief le changement de couleur. Ensuite, les échantillons sont placés dans des cuvettes

en plastique translucide de 1 cm de largeur, sur 3,5 cm de longueur compatible avec le

spectrophotomètre d’absorption UV visible, Genesys 20. A l’aide ce dernier, des

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=fr&prev=/search%3Fq%3Dbca%2Bprotein%2Bassay%26biw%3D1366%26bih%3D652&rurl=translate.google.ca&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/PH&usg=ALkJrhgFZ3e_kIdrjJqycjTxoZQPHuqj5w

54

mesures d’absorbance, de transmittance (%), et de concentration (ppm, g/L, mg/ml)

peuvent être effectuées, à une longueur d’onde située entre 325 nm et 1100 nm. La

concentration en ppm des échantillons a été déterminée pour une longueur d’onde

optimale de 562 nm.

En se basant sur les concentrations des protéines dosées, la charge d’enzyme finale

immobilisée dans la silice a été calculée à partir de la différence entre la quantité initiale

de β-galactosidase et la quantité d’enzymes non retenues sur les supports, dosées dans

les solutions de lavage.

4.4.8. Réaction enzymatique avec l’enzyme immobilisée

(approche hétérogène)

Une fois que la préparation enzymatique est immobilisée sur les différents matériaux,

elle est placée dans une solution aqueuse de 50 mL à des concentrations équimolaires

de saccharose et de galactose. Cette réaction a été incubée, pendant 28h, à une

température de 40°C et un pH=5.

Durant ce temps, des prélèvements de 100 µL de chaque échantillon ont été prélevés et

dilués 100 fois. Ensuite, pour d’arrêter la réaction, les prélèvements ont été chauffés à

100°C pendant 10min. La même procédure est appliquée avec l’approche homogène.

La régénération et le recyclage des biocatalyseurs (β-galactosidase immobilisée sur

différents matériaux siliceux) ont été effectués en récupérant la matrice enzymatique par

filtration à la fin de chaque cycle et en la réintroduisant dans une nouvelle réaction avec

les mêmes conditions.

Tous les échantillons ont été analysés par chromatographie phase liquide à haute

performance, HPLC (voir la section 4.4.2).

55

4.4.9. Analyses statistiques

En utilisant la procédure ANOVA du logiciel SAS (1987), une étude statistique est

effectuée afin de déterminer s'il existe une différence significative entre les différents

paramètres étudiés, et si possible, quel est le paramètre le plus efficace dans cette

étude. Dans la plupart du temps, le plan factoriel en utilisant le test de Tukey est effectué

(Joiner et Rosenblatt, 1971).

57

Chapitre 5. Résultats et discussions

5.1. Réaction enzymatique

La réaction enzymatique a été étudiée selon deux approches: homogène (enzyme libre)

et hétérogène (enzyme immobilisée). La première approche consiste à étudier l’effet de la

concentration de l’enzyme libre, l’effet des différentes concentrations de substrats

(lactose et saccharose), ainsi que l’effet du pH et de la température sur la production du

lactosucrose. Par la suite, les conditions optimisées en phase homogène sont appliquées

à la réaction en phase hétérogène après optimisation des conditions d’immobilisation.

5.1.1. Identification des produits par HPLC, spectrométrie de

masse et par la RMN du proton

Suite à une réaction enzymatique utilisant le saccharose et le lactose en présence de la

β-galactosidase libre, un échantillon du milieu réactionnel a été prélevé puis a subit des

analyses par HPLC, spectrométrie de masse et par la RMN du proton pour pouvoir

procéder à l’identification des produits obtenus.

Comme il est anticipé la formation du glucose, du galactose, du fructose et des

oligosaccharides (GOS) comme le lactosucrose et la présence aussi d’une partie du

saccharose et du lactose qui n’a pas réagi dans le milieu réactionnel, il tout à fait naturel

de vérifier leur temps de rétention par HPLC en utilisant des standards purs.

Cependant, comme les standards du lactosucrose et d’autres GOS ne sont pas

commercialement disponibles, des méthodes puissantes d’identification de structure

chimique comme la spectrométrie de masse et la RMN du proton (1H-RMN) ont été

utilisées pour cette fin après une étape préalable de purification.

La Figure 19 présente le chromatogramme des standards disponibles utilisés comme

référence pour des fins d’identification avec leur temps de rétention des sucres simples et

les disaccharides comme le lactose et le saccharose.

Les temps de rétentions des standards sont présentés en minutes, comme suit :

saccharose (7,838 min), lactose (8,169 min), glucose (9,770 min), galactose (10,677 min) et

58

fructose (11,316 min). Quatre différentes concentrations de chaque solution ont été

préparées afin de tracer leurs courbes d’étalonnage. Les concentrations croissantes

utilisées sont les suivantes 0,05g/L ; 0,125g/L ; 0,5g/l et 1g/L.

Figure 19. Chromatogramme des solutions standards des sucres (0,5g/L chaque standard). Avec : a) saccharose, b) lactose, c) glucose, d) galactose, e) fructose.

59

Figure 20. Chromatogramme typique des substrats et des produits formés par transgalactosilation et hydrolyse.

60

Glc Fru Glc Gal

LactoseSaccharose

B-Galactosidase

d'Aspergillus oryzae

Glc Fru Glc Gal

Lactose

+

Glc FruGal ++ +

FruGlc Gal

Lactosucrose Tetrahexose

+

GOS I (produit désiré) GOS II (produits secondaire)

B-Galactosidase

d'Aspergillus oryzae

Etape d'hydrolyse

Etape de transglycosylation

Saccharose

Figure 21. Mécanisme proposé pour la biosynthèse de lactosucrose avec la β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae.

61

Dans l’espoir d’identifier les pics inconnus attribués à la présence des GOS (I et II). Les

produits de la réaction ont été fractionnés par UPLC et les produits dus aux pics GOS I et

GOS II ont été récupérés puis concentrés par évaporation avec un évaporateur rotatif et

ont été sujets aux analyses de spectrométrie de masse et par 1H-RMN et 13C-RMN.

En effet, Le spectre de masse du GOS I tel que montré par la Figure 22 montre la

fragmentation majeure [M-2H] 2- du lactosucrose déprotoné à m/z=502 (504-2) qui

correspond à la masse moléculaire exacte du la molécule ciblée du lactosucroce avec la

distribution isotopique. Ces résultats ont été confirmés par les analyses RMN du proton et

du carbon de l’échantillon qui révèlent la structure désirée du lactosucrose avec une très

haute pureté.

Figure 22. Spectre MS du GOS I.

m/z

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950

1000

% 2

ZANE

IB_M

AI14

_PIC

2_2

1 (0

.002

)Sc

an E

S-

5.43

e650

2.7

178.

6

211.

734

0.9

245.

638

2.2

443.

056

6.2

601.

1

62

La structure du composé GOS I a été élucidée par l’analyse 1H-RMN et 13C-RMN.

L’analyse 13C-RMN révèle 18 pics correspondant à des carbones incluant des carbones

de sucres anomériques vers les déplacements chimiques de 105.80, 92.81 et 106.80

ppm et 4 carbones methylene oxylés vers les déplacements chimiques de 62.70, 61.39.,

61.76 et 64.39 ppm, indiquant la présence de trois hexoses dans la structure du composé

(Figure 23).

Figure 23. Spectre 13C-RMN du GOS I.

L’analyse 1H-RMN confirme que les 3 hexoses consistent en des galactopyranose,

glucopyranose et un fructopyranose (Figure 24). Les résultats de ces analyses

suggèrent que le composé en question est un O--galactopyranosyl-(1→4)-O--D-

glucopyranosyl-(1→2)--D-fructofuranoside, communément appelé lactusucrose. Les

assignements entiers des spectres 1H-RMN sont montrés dans le Tableau 11.

63

Figure 24. Spectre 1H- RMN du GOS I.

O O

O

O

O

OH HO

OH

OH

OH

OHHO

HO

HO

HO

OH

64

Tableau 11. Récapitulatif des déplacements chimiques du GOS I analysé par résonance magnétique nucléaire (1H-RMN) et identifié comme du lactosucrose.

O O

O

O

O

OH HO

OH

OH

OH

OHHO

HO

HO

HO

OH

1

23

4

6

51'2'

3'4'

5'

6'

1''

2''3''

4''

5''

6''

lactosucrose

C18H32O16

Mol. Wt.: 504,44

1H RMN (500 MHz, D2O, 25°C):

1H-RMN

Fructose

Position des

protons

(ppm) Nature du pic J (Hz) Nombre de protons

associés au pic

1 5.26 T 3.1 1H

2 4.06-4.03 Dd 8.5, 3.5 1H

3 5.06 D 3.5 1H

4 - - - -

5 4.16 S 2H

6 4.18 S 2H

65

Glucose

1’ 5.40 D 4.1 1H

2’ 4.33-4.24 M 1H

3’ 3.54-3.48 M 1H

4’ 4.52-4.46 M 1H

5’ 4.44 D 6.5 1H

6’ 4.35 D 7.4 2H

Galactose

1’’ 5.24 D 3.9 1H

2’’ 4.02-3.84 M 1H

3’’ 3.42-3.36 M 1H

4’’ 3.74-3.57 M 1H

5’’ 3.29 T 9.1 1H

6’’ 3.76 D 3.0 2H

Donc toutes ces analyses confirment que le composé GOS I correspond à la présence du

lactosucrose.

Le composé GOS II a été analysé par spectrométrie de masse. Son Spectre MS est

montré dans la Figure 25.

66

Figure 25. Spectre MS du GOS II.

m/z

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950

1000

%

3

ZA

NE

IB_M

AI1

4_P

IC1_2 1

(0.0

02)

Scan E

S-

3.7

8e6

664.5

340.7

200.1

173.4

227.1

322.2

503.7

428.3

367.4

588.2

732.2

687.2

800.7

754.5

890.9

843.8

816.6

869.6

965.2

905.7

67

Cette analyse révèle que le GOS II s’identifie à un tetrahexose dont m/z = 664.5

5.2. Réaction enzymatique en phase homogène

5.2.1. La cinétique de la réaction enzymatique

La Figure 26 montre une cinétique typique de la réaction enzymatique, qui représente la

conversion du lactose et du saccharose conduisant à la formation des oligosaccharides

sous l’effet biocatalytique de β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae. Dans les premières

24 heures, le taux de formation des GOS a augmenté, avec une diminution rapide de la

concentration du lactose et une diminution moyenne de la concentration du saccharose.

En effet, cette différence de diminution est due à la contribution du lactose dans la

formation des GOS et dans la formation des monosaccharides après hydrolyse. Par

contre, le saccharose contribue majoritairement à la formation de tetrahexose . Il est clair

que la transgalactosylation domine au début de la réaction, favorisant ainsi la production

des GOS avec un rendement élevé. Cependant, l'hydrolyse des GOS formés prend forme

au fur et à mesure de l’avancement de la réaction. On remarque que la concentration en

GOS diminue après 24 heures de réaction, alors que les concentrations du glucose et du

galactose continuent à augmenter avec une conversion en glucose supérieure à celle en

galactose. En même temps, on observe que la quantité des disaccharides continue à

diminuer, ce qui s’explique par l’hydrolyse de ces disaccharides en monosaccharides

(glucose, galactose et fructose). Quand on a laissé la réaction se poursuivre, seuls les

produits d'hydrolyse (glucose et galactose) et le saccharose étaient retrouvés dans la

solution du produit final (Annexe1). Cette diminution des oligosaccharides formés peut

être attribuée à une inhibition compétitive de l’enzyme par le glucose et le galactose issus

de l’hydrolyse. Albayrak et Yang (Albayrak et Yang, 2002) ont confirmé que les

monosaccharides formés par l’hydrolyse de lactose (glucose et galactose) ne sont pas

avantageux pour la formation des GOS, en particulier du lactosucrose. Il faut donc

essayer d’enlever ces monosaccharides du milieu réactionnel à fur et à mesure pour

déplacer l’équilibre vers la synthèse des oligosaccharides. En effet, l’effet inhibiteur de

galactose sur la β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae est souvent démontré majoritaire

beaucoup plus que celui du glucose.(Boon et al., 2000, Park et al., 1979)

68

Figure 26. Cinétique de la réaction de conversion des substrats et la formation des produits.

5.2.2. Effet de la concentration enzymatique

L’étude de l’effet de concentration enzymatique sur la synthèse des GOS catalysée par

une préparation commerciale de β-galactosidase à partir de A. oryzae (Sigma-Aldrich) a

été réalisée avec un mélange réactionnel de disaccharides à des concentrations

identiques (300 g/L de lactose, et 300 g/L de saccharose),(Li et al., 2009) avec des

concentrations enzymatiques différentes (1U / ml de solution, 4U / ml de solution, 6U / ml

de solution et 10U / ml de solution) pendant 60 heures.

0

50

100

150

200

250

300

350

0 10 20 30 40 50 60 70

Co

ncen

trati

on

(g

/L)

Temps (h)

saccharose (g/l)

lactose (g/l)

glucose (g/l)

galactose (g/l)

fructose (g/l)

GOS I

GOS II

Total GOS

69

Figure 27. Effet de la concentration d'enzyme sur la production du lactosucrose.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 10 20 30 40 50 60 70

Co

ncen

trati

on

(g

/l)

Temps (h)

Lactosucrose1U/ml

Lactosucrose4U/ml

Lactosucrose6U/ml

Lactosucrose10U/ml

70

Figure 28. Effet de la concentration d'enzyme sur la production du tetrahexose.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 10 20 30 40 50 60 70

Co

nc

en

tra

tio

n (

g/L

)

Temps (h)

Tetrahexose 1U/ml

Tetrahexose 4U/ml

Tetrahexose 6U/ml

Tetrahexose 10U/ml

71

Figure 29. Effet de la concentration d'enzyme sur la bioconversion du lactose.

Les Figure 27Figure 28 et Figure 29Erreur ! Source du renvoi introuvable. montrent,

que l’augmentation de la concentration d’enzyme de 1 à 6 U/mL entraine une

augmentation dans la production des oligosaccharides et dans la conversion de lactose

ainsi qu’une augmentation dans la vitesse de la réaction (Li et al., 2009). Quand la

concentration en enzymes est augmentée à 10U/mL, on observe une diminution de la

production des GOS qui serait due à une inhibition de la réaction de transgalactosylation

pour la synthèse des GOS par la concentration trop élevée de l’enzyme ou par la

formation des produits eux-mêmes.

Les courbes de formation du lactosucrose, à part celles avec une concentration

enzymatique de 1U/mL, présentent des maximas de production après 24 h de temps de

réaction. Au-delà de ce temps la production en se produit diminue. La courbe

représentative de la concentration 1U/mL montre une augmentation quasi-linéaire avec

le temps de réaction qui fait penser que la cinétique de transgalactosylation pour ce

produit n’est pas inhibée à ce niveau de concentration de l’enzyme.

Avec une concentration de 4U/mL, le temps nécessaire pour atteindre le maximum de

concentration du lactosucrose (64,4 g/l) était de 48h et de 36h dans le cas du tetrahexose

(12,8 g/l). Cependant, ce temps est réduit jusqu’à 24h pour la synthèse du lactosucrose

0

50

100

150

200

250

300

350

0 10 20 30 40 50 60 70

Co

nc

en

tra

tio

n (

g/L

)

Temps (h)

lactose 1U/ml

lactose 4U/ml

lactose 6U/ml

lactose 10U/ml

72

avec les concentrations 6U/mL et 10U/mL dont les quantités maximales produites sont

respectivement 76,3 g/l et 63,7 g/l. La concentration enzymatique de 6U/mL est la

concentration optimale de synthèse des GOS avec la meilleure vitesse de réaction et le

meilleur rendement des GOS estimé à 30,6% (avec une composition de 84% du

lactosucrose et 16% du tetrahexose).

-Selon les courbes de transformation du lactose, la conversion du lactose évolue

l’augmentation de la concentration d’enzyme. Ceci prouve que la réaction de conversion

du lactose est bien favorisée par la concentration enzymatique de 10U/mL et elle est

totale (100% de conversion de lactose) à partir de 60 heures. Néanmoins, les résultats

présentés ci-dessus montrent que la concentration de 10U/mL vient en deuxième position

après les 6U/mL dans la synthèse des GOS. A partir de ces observations, nous pouvons

conclure que la concentration de 10U/mL contribue plus que les autres concentrations

enzymatiques dans la réaction d’hydrolyse de lactose en déplaçant l'équilibre de la

réaction de β-galactosidase à l'hydrolyse plutôt qu’à la transglycosylation. La

concentration de 10U/mL peut avoir donc, un effet inhibiteur dans la formation des GOS

de par son activité d’hydrolyse qui serait favorisée à ce niveau de concentration. Cette

activité élevée d’hydrolyse peut être attribuée à la disponibilité d’un nombre très élevé de

sites enzymatiques libres à 10U/mL, qui favorisent et accélèrent la formation des GOS, et

par la suite leur hydrolyse rapide ainsi que l’hydrolyse du lactose (Figure 30 et Figure

31). Alors, qu’avec les concentrations faibles de 1U/mL, la vitesse de production des

GOS est faible où aucune formation du tetrahexose n’est observée avant 24 h de

reaction. L’hydrolyse pour l’obtention des monosaccharides étant nécessaire pour la

formation du tetrahexose, d’où l’apparition tardive de ce dernier avec la concentration

enzymatique 1U/mL.

Ces résultats confirment que la concentration en enzyme 6U/mL et le temps de réaction

de 24 heures sont les conditions optimales pour la réaction de transgalactosylation,

favorisant la synthèse des GOS et limitant la réaction d’hydrolyse de lactose. Dans ces

conditions optimales, la conversion du lactose et de saccharose étaient respectivement :

75% et 29%.

73

Figure 30. La formation de galactose (produit d'hydrolyse de lactose) avec différentes concentrations d'enzyme.

Figure 31. La formation de glucose (produit d'hydrolyse de lactose avec différentes concentrations d'enzyme.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 20 30 40 50 60 70

Co

nce

ntr

atio

n (

g/L)

Temps (h)

galactose (g/l) 1U

galactose (g/l) 4U

galactose (g/l) 6U

galactose (g/l) 10U

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 20 40 60

Co

nce

ne

trat

ion

(g/

L)

Temps (h)

glucose (g/l) 1U

glucose (g/l) 4U

glucose (g/l) 6U

glucose (g/l) 10U

74

5.2.3. Effet de concentration des substrats

Afin de déterminer le rapport molaire optimal du donneur / accepteur de galactosyls, ainsi

que la concentration favorable des substrats pour la production du lactosucrose et du

tetrahexose, on a utilisé différentes concentration de saccharose (50% ; 30% ; 25% ; 15%

et 7,5%) et de lactose (50% ; 30% ; 15%) avec deux ratios molaires de lactose /

saccharose; 1:1 et 2:1 (Tableau 12). Les réactions sont effectuées à 30°C, à pH=5 et

avec la concentration d’enzyme optimisée de 6U/mL.

Tableau 12. Les différentes concentrations de saccharose et de lactose étudiées pour la biosynthèse de lactosucrose

Réaction


Réaction


Lactose

(g/100mL)

Saccharose

(g/100mL)

Lactose

(g/100mL)

Saccharose

(g/100mL)

A 15 15 D 50 25

B 30 30 E 30 15

C 50 50 F 15 7,5

Les concentrations initiales du saccharose (Figure 32 et Figure 33) et du lactose (Figure

34 et Figure 35) affectent clairement le rendement en GOS totaux. En balayant les

différentes concentrations des deux sucres, on remarque que le meilleur rendement est

celui à 30% pour les deux rapports molaires. La concentration de 50% du lactose avec

les deux ratios molaires occupe la deuxième position en termes de rendement des GOS.

Cela s’explique par la réaction d’hydrolyse et la saturation des sites enzymatique, vu

l’accumulation des substrats et leur disponibilité pour l’hydrolyse. La concentration de

15%, avec les deux rapports molaires, s’est révélée insuffisante et faible par rapport à la

concentration de l’enzyme. Ce rendement faible observé en GOS s’explique par la

formation des GOS sur des sites enzymatiques et l’hydrolyse rapide des autres GOS déjà

formés par d’autres sites enzymatiques.

75

Figure 32. Effet de la concentration initiale de lactose avec le rapport molaire des substrats 1:1 sur la production des GOS totaux.

Figure 33. Effet de la concentration initiale de saccharose avec le rapport molaire des substrats 2:1 sur la production des GOS totaux.

0

5

10

15

20

25

30

35

0 10 20 30 40 50

Re

nd

em

en

t d

e G

OS

% de conversion de saccharose

50%

30%

15%

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60 70

Re

nd

em

en

t d

e G

OS

% de conversion de saccharose

25%

15%

7,50%

76



0

5

10

15

20

25

30

35

0 20 40 60 80 100

Re

nd

em

en

t d

e G

OS

%conversion de lactose

50%

30%

15%

0

5

10

15

20

25

30

0 20 40 60 80 100

Ren

de

me

nt

GO

S

%conversion de lactose

50%

30%

15%

77

En effet, le rendement maximal du lactosucrose (24% correspondant à une production de

73 g/l) a été obtenu au rapport molaire de 1:1 au bout de 24 heures (Figure 36). Cette

production présente 1,3 fois (4/3) la quantité obtenue avec les rapports molaires 2:1. Ces

résultats sont en concordance avec les résultats de (Li et al., 2009). et (Mussatto et

Mancilha, 2007), qui confirment que l’optimisation du rendement en lactosucrose

nécessite la présence de réactifs initiaux (lactose et saccharose) en concentrations

équimolaires. Cette relation entre l’équimolarité des substrats et le rendement en

lactosucrose peut être justifiée par une faible activité d'hydrolyse par rapport à une

activité élevée de transgalactosylation dans ces conditions. Concernant le rendement en

tetrahexose (Figure 37), la concentration en lactose à 30% donne un meilleur rendement

mais avec un rapport molaire de 2:1 cette fois. Le rendement maximal du tetrahexose

(5,38%) est 1,25 (5/4) fois plus élevé que celui obtenu avec un rapport molaire de 1:1. Le

rapport molaire affecte la cinétique de la réaction et de formation du tetrahexose qui est

produit plus rapidement (on passe de 24h pour un rapport molaire de 1:1 à 16 heures

pour un rapport de 2:1). Ces résultats peuvent s’expliquer par la formation des

monosaccharides (glucose, galactose et fructose) lors de la réaction d’hydrolyse,

favorisant la production du tetrahexose. Cependant, lorsque la concentration de lactose

dépasse les 30%, la formation de ces produits secondaires (les monosaccharides)

devient plus élevée (Figure 38 et Figure 39), et donc plus compétitive et inhibitrice à la

production des GOS (particulièrement du lactosucrose) (Albayrak et Yang, 2002, Boon et

al., 2000, Li et al., 2009).

78

Figure 36. Effet de la concentration des réactifs initiaux sur le rendement du lactosucrose.

Figure 37. Effet de la concentration des réactifs initiaux sur le rendement du tetrahexose.

0

5

10

15

20

25

30

35

0 5 10 15 20 25 30

Re

nd

em

en

t la

cto

su

cro

se

(%

)

Temps (h)

Rendement GOS I %(50% - 1:1)






0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25 30

Ren

de

men

t t

etr

ah

exo

se (

%)

Temps (h)

Rendement GOS II % (50% -1:1)






79

Figure 38. Effet de la concentration et les rapports molaires sur la formation du galactose.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20 25 30

Gal

acto

se g

/L

Temps (h)

galactose (g/l)(50%-1:1)





galactose (g/l)(15%- 2:1)

80

Figure 39. Effet de la concentration et les rapports molaires sur la formation du glucose.

5.2.4. Effet du pH

La Figure 40 montre l’effet de pH, qui semble minime, sur la conversion de lactose ainsi

que la production totale des GOS (Figure 41). Le changement de pH entre 7 ; 5 et 3,5

affecte la vitesse de la réaction de conversion de lactose plus que la formation de GOS,

ce qui est en accord avec la littérature (Vera et al., 2011).

En effet, le pH 5 présente le meilleur taux de conversion de lactose et de rendement en

lactosucrose et tetrahexose (Figure 40 et Figure 41), ensuite on trouve les pH 7 et 3,5

avec presque les mêmes rendements de transformation.

Ces résultats s’expliquent par le point isoélectrique de l’enzyme qui constitue le point

pour lequel l’enzyme est électriquement neutre. A l’approche de celui-ci, l’activité de

l’enzyme diminue considérablement, ce qui est le cas pour la β–galactosidase. Le pH=3,6

est indiqué par (Bernal et al., 2014) comme le point isoélectrique de la β-galactosidase

isolée à partir de l’Aspergillus oryzae. D’où, le rendement le plus faible au pH =3,5 en

GOS. Le rendement à pH=7 est plus faible que celui à pH=5 car il s’agissait d’un pH

neutre et la β-galactosidase a une activité favorisée avec des pH un peu plus acides

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30

Glu

cose

(g/

L)

Temps (h)

glucose (g/l)(50%-1:1)





glucose (g/l)(15%- 2:1)

81

mais aussi un peu loin du point isoélectrique. Ces résultats sont en accords avec les

résultats de (Freitas et al., 2011), qui annoncent que le pH 4,8 fournit la meilleure activité

et stabilité enzymatique avec les β–galactosidases (Aspergillus oryzae).

Figure 40. Effet du pH sur la conversion de lactose.

0

50

100

150

200

250

300

350

0 5 10 15 20 25 30

co

nc

en

tra

tio

n g

/l

temps (h)

lactose (g/l) pH 7

lactose (g/l) pH 5

lactose (g/l)pH 3,5

82

Figure 41. Effet du pH sur le rendement en GOS totaux.

5.2.5. Effet de la température

Afin de déterminer l’effet de la température sur la conversion du lactose et la production

de GOS, la biosynthèse a été effectuée à trois températures différentes (30°C ; 40°C et

50°C). En utilisant les paramètres déjà optimisés; avec une concentration de 60% de

lactose et saccharose ayant un rapport équimolaire, pH=5 et une concentration

enzymatique de 6 U/mL.

Comme le montre la Figure 42, la vitesse de conversion du lactose dépend étroitement

de la température, incluant la transformation par hydrolyse ainsi que la production des

GOS. Un excellent rendement est atteint à 40°C et ce rapidement, (au bout de 12

heures), mais le rendement optimal est observé à 30°C après 24 heures (Figure 43). La

réaction à 40°C est très efficace pour former les GOS en 12 heures seulement.

Cependant, à cette température l’enzyme est très active pour l’hydrolyse aussi, ce qui

conduit à l’hydrolyse des produits formés par la suite.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 25 30

co

nc

en

tra

tio

n g

/l

temps (h)

Total GOS pH 7

Total GOS pH 5

Total GOS pH 3,5

83

A une température de 30°C, l’hydrolyse est minimale, ce qui conduit à une production

optimale en GOS. La formation du lactosucrose est optimale à 30°C (Figure 44), et est

accompagnée par une activité d’hydrolyse minimale. Cependant l’hydrolyse est maximale

à 40°C, ce qui par contre favorise la production du tetrahexose (Figure 45), suite à la

formation des monosaccharides nécessaires à son synthèse.

Il est très important de mentionner que la synthèse du lactosucrose n’est pas beaucoup

affectée par l’augmentation de la température (même à 50 °C), ce qui est en

concordance avec les résultats cités par Albayrak et Yang(Albayrak et Yang, 2002) et par

Vera et al(Vera et al., 2011). Cependant, le rendement du tetrahexose subi une chute

significative à 50°C. Ceci peut être attribué à l’inhibition totale de l’activité d’hydrolyse

enzymatique, et donc l’absence des monosaccharides nécessaires à la formation du

tetrahexose. Toutefois, la température de réaction est critique pour la synthèse

enzymatique. Des résultats similaires ont été rapportés par (Li et al., 2009)concernant

l’effet de la température sur les produits de β-galactosidase.

Figure 42. Effet de la température sur la conversion du lactose.

0

50

100

150

200

250

300

350

0 5 10 15 20 25 30

La

cto

se

(g

/L)

Temps (h)

lactose (g/l) 30°C

lactose (g/l) 40°C

lactose (g/l) 50°C

84

Figure 43. Effet de la température sur la formation des GOS.

Figure 44. Effet de la température sur le rendement en lactosucrose.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 25 30

Re

nd

em

en

t G

OS

%

Temps (h)

Total GOS 30°C

Total GOS 40°C

Total GOS 50°C

0

5

10

15

20

25

30

0 20 40 60 80 100

Ren

de

me

nt

lac

tos

uc

ros

e %

% Conversion lactose

30°C

40°C

50°C

85

Figure 45. Effet de la température sur le rendement en tetrahexose.

5.2.6. Conclusion

Ces résultats indiquent que la formation des différents oligosaccharides par la même

enzyme ne dépend pas seulement de l’enzyme, mais aussi des conditions de la réaction

qui peuvent favoriser la synthèse d’un ou de plusieurs produits.

Après optimisation des paramètres réactionnels (concentration d’enzyme, concentration

et ratios molaires des substrats, pH et température), nous avons effectué la biosynthèse

de lactosucrose à partir du lactose et du saccharose avec l’action enzymatique de β-

Galactosidase d’Aspergillus oryzae, dans les conditions optimisées (6U/mL, une

concentration équimolaire (1 :1) de saccharose (30%) et de lactose (30%), pH= 5 et

T°= 40°C). Sous ces conditions optimales, nous avons obtenu un rendement de 27,47%

des GOS avec une composition d’environ 84% du lactosucrose (68,2 g/L) et 16% du

tetrahexose (13,3 g/L), c’est-à-dire un rendement de 23% en lactosucrose. Ce rendement

obtenu est supérieur à celui atteint par (Li et al., 2009), et confirment la formation de

lactosucrose à une concentration de 50.4 g/L (rendement de 17%), après 4h de réaction

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 20 40 60 80 100

Re

nd

em

en

t te

tra

he

xo

se

%

% Conversion lactose

30°C

40°C

50°C

86

en utilisant la β-D-Galactosidase de Bacillus circulans. L’activité observée dans le présent

travail avec la β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae s’est révélée plus sélective en

trisaccharides, par rapport à celle déjà obtenue précédemment dans la littérature pour la

bioconversion de lactose (Albayrak et Yang, 2002, Gaur et al., 2006, Güleç et al., 2010,

Huerta et al., 2011, Neri et al., 2011).

87

5.3. Réaction enzymatique en phase hétérogène

Dans cette section, on discute, séparément, la synthèse et la caractérisation des

matériaux et l’étude de la rétention d’enzyme (β-galactosidase d’A. oryzae) sur les

différents matériaux préparés. Ensuite, on étudie l’activité catalytique de chaque

biocatalyseur sur la réaction de transglycosylation, ainsi que leurs performances après

recyclage.

5.3.1. Caractérisation des matériaux

5.3.1.1. SBA-15

5.3.1.1.1. Analyse de la surface BET

Les isothermes d'adsorption/désorption d'azote et la distribution correspondante des

tailles des pores obtenus sont présentées dans la Figure 46. Le support siliceux (SBA-

15) présente une surface specifique BET de ≈ 901.9 m2/g, un volume total des pores de

1.31cm3/g, ainsi qu’un diamètre de pore moyen d’environ 6.8 nm. Ces résultats sont

comparables aux résultats rapportés dans la littérature pour ce type de matériaux

(Belkacemi et al., 2006, Zhao et al., 1998). L’isotherme de ces matériaux est de type IV

avec une hystérèse de type H1, qui caractérise les matériaux mésoporeux (Lynch, 2001).

88

Figure 46. Les isothermes d'adsorption/désorption d'azote pour la SBA-15. La figure insérée représente la distribution de la taille des pores.

5.3.1.1.2. Analyse par diffraction des rayons X (DRX)

Le diffractogramme (DRX) obtenu aux petits angles pour la SBA-15 synthétisée (Figure

47), montre un pic majeur de diffraction (100) à l’angle 2θ = 1,0°, confirmant une

structure ordonnée de ce matériau. On observe également la présence de deux petits

pics supplémentaires à 2θ = 1,6° et 2θ = 1,8°, caractéristiques des diffractions (110) et

(200), respectivement, affirmant une structure mésoporeuse hexagonale (Belkacemi et

al., 2006, Zhao et al., 1998).

89

1 2 3

2 Thêta (degrés)

I (u. a.)

SBA-15100

110 200

Figure 47. Le diffractogramme (DRX) obtenu aux petits angles obtenus pour la SBA-15.

5.3.1.1.3. Microscopie Électronique à Transmission (MET)

Les images MET de la SBA-15 (Figure 48) sont en concordance avec les résultats DRX

et BET. Ils confirment la forme hexagonale et la mésostructure ordonnée du matériau.

Les images obtenues montrent des mailles répétitives avec une taille des pores d’environ

7nm, ainsi que des canaux assemblés en grappes parallèles visibles lorsqu’on change

l’angle du vue. Ces résultats sont satisfaisants et sont comparables avec les travaux de

(Zhao et al., 1998) et aussi avec ceux rapporté par (Belkacemi et al., 2006).

90

Figure 48. Micrographes MET de la SBA-15 observé de différents angles.

5.3.1.2. Mousse mésocellulaire (MCF)


Les isothermes d'adsorption / désorption d'azote et la distribution correspondante de la

taille des pores obtenus sont présentés dans la Figure 49. Les calculs ont été réalisés à

l’aide du model de BdB-FHH (Méthode d'analyse de la porosité de Broekhoff de Boer,

Frenkel Halsey Hill) (Desch et al., 2014). L’aire de la surface BET calculée est de ≈ 487.2

m2/g, le volume total des pores est considérablement large environ 0.52 cm3/g, et le

diamètre de pore large est d’environ 20.0 nm. L’isotherme de la MCF est de type IV avec

une boucle hystérèse large de type H2. Ces résultats montrent la présence des pores

sphériques.

91

Figure 49. Les isothermes d'adsorption/désorption d'azote pour la MCF. La figure insérée représente la distribution de la taille des pores.


Le diffractogramme des rayons X de la MCF aux petits angles montre des pics bien

résolus (Figure 50). Ces derniers donnent l’information sur la forme structurale et

sphérique de matériau. Le diffractogramme montre deux pics majeurs à 2θ = 0,7° et deux

petits pics à 2θ = 1,0° et à 2θ = 1,2°.Ces résultats sont en concordance avec ceux

obtenus par (Schmidt-Winkel et al., 1999) Cette structure est révélée sphérique

monodispersée, ce qui a été prouvé avec des simulations de ces diffractogrammes

(Feigin et al., 1987).

92

1 2 3 4

I (u. a.)

2 Thêta (degrés)

MCF

Figure 50. Le diffractogramme (DRX) obtenu aux petits angles obtenus pour la MCF.


Les images MET (Figure 51) affirment la forme sphérique obtenue par les analyses DRX

et la structure ordonnée du matériau. On distingue bien des sphères creuses de

diamètres ≈ 20 nm. en concordance avec la morphologie observée par (Schmidt-Winkel

et al., 1999)

93

Figure 51. Micrographe d’électron de transmission de la MCF (20 nm).

94

5.3.1.3. Nanomatériaux sous forme de barres (rod-like) S-2,9 et sous forme

de vésicules (vesicle-like) S-34,8


Les isothermes d'adsorption / désorption d'azote et la distribution correspondante des

tailles de pores obtenues sont présentées dans la Figure 52 (S-2,9) et la Figure 53

(S-34,8). Les calculs ont été réalisés à l’aide du model de Barrett-Joyner-Halenda (BJH)

(Zhou et al., 2009) pour la S-2,9 et pour la S-34,8. Le model BJH pour ce matériau donne

une taille moyenne des pores de 3,8 nm largement au-deçà de la taille réelle observée

par le TEM. L’aire de la surface BET résultante est de 376 ,7 m2/g pour la S-2,9 et de

458,1 m2/g pour la S-34.8, le volume total des pores est de 0.60 cm3/g pour la S-2,9 et

0,62 cm3/g pour la S-34,8. Le diamètre des pores est de 7,7 nm pour la S-2,9 et

d’environ 17 nm pour la S-34,8. L’isotherme de la S-2,9 est de type IV avec une boucle

d’hystérèse de type H1, qui est similaire à celle de la SBA-15. Par contre, la S-34,8

présente une large boucle d’hystérèse.

Figure 52. Les isothermes d'adsorption/désorption d'azote pour la S-2.9. La figure insérée représente la distribution de la taille des pores.

95

Figure 53. Les isothermes d'adsorption/désorption d'azote pour la S-34,8. La figure insérée représente la distribution de la taille des pores.


Pour la synthèse de ce matériau deux concentrations de TIPB sont utilisées: une petite

quantité dont le rapport molaire TIPB:P123=2,9:1 (noté S-2,9) et une quantité importante

avec un rapport molaire de TIPB:P123=34,8:1 (noté S-34,8).

Les diffractogrammes des deux matériaux ne sont pas très différents. Le matériau ayant

une faible concentration en TIPB, le S-2,9 (Figure 54) présente un diffractogramme avec

quatre pics caractéristiques à 2θ ≈ 0,7° (100), à 2θ ≈ 1,3° (110), à 2θ ≈ 1,5° (200), et à 2θ

≈ 2,0° (210).Ces pics reflètent la structure mésoporeuse ordonnée hexagonale du

matériau synthétisé dans le cadre de ce travail.

La grande quantité de TIPB introduite dans le deuxième matériau a conduit à une

modification au niveau de la structure du matériau (Figure 55). Un pic de diffraction bien

résolu est observé à 2θ ≈ 0,5 (001) et un autre petit pic est observé à 2θ = 0,9 (002)

après l’analyse DRX du matériau S-34,8.

Tous ces résultats sont en concordance avec les résultats obtenus par Zhou et ses

collègues (Zhou et al., 2007, Zhou et al., 2009)

96

1 2 3

I (u. a.)

2 Thêta (degrés)

TIPB:P123 / 2,9:1 (S-2,9)100

110

200

210

Figure 54. Le diffractogramme (DRX) obtenu aux petits angles pour S-2,9.

97

0 1 2 3

2 Thêta (degrés)

I (u. a.)

TIPB:P123 / 34,8:1 (S-34,8)

001

002

Figure 55. Le diffractogramme (DRX) obtenu aux petits angles pour S-34,8.


Les images MET des deux matériaux montrent clairement la morphologie ainsi que la

structure de ces deux matériaux. On distingue, à partir de la Figure 56 la structure

hexagonale ordonnée du premier matériau ainsi que la forme de barres d’où la

nomination silice mésoporeuse en forme de barres (Rod-like). Selon les images MET la

taille de diamètre des pores est d’environ 7-8nm. Cependant, l’ajout excessif de TIPB a

mené à un changement radical aussi bien au niveau de la forme qu’au niveau de la

structure de la silice. La forme de barres et de mailles hexagonales se transforme en

forme de vésicules en forme ‘ de rondelles d’oignon’ (Figure 57), avec des couches de

silices régulièrement espacées (entre 16-17nm). Ces résultats sont très satisfaisants, ils

sont similaires à ceux présentés par Zhou et son groupe de recherche (Zhou et al., 2007,

Zhou et al., 2009).

98

Figure 56. Micrographe MET des silices sous forme de barres (S2,9 – 7,7 nm).

Figure 57. Micrographe MET des silices sous forme des vésicules (S-34,8 – 16,7 nm).

99

5.3.1.4. Les LP-FDU-12


Les isothermes d'adsorption / désorption d'azote et la distribution correspondante des

tailles de pores obtenues sont présentées dans les Figure 58, Figure 59 et Figure 60,

respectivement, la S-10-100, la S-15-100 et la S-T-100. Une tentative de calculs a été

faite à l’aide du model de BdB-FHH. Cependant, ce modèle ne converge pas pour ces

matériaux. La méthode BJH ne permet pas non plus d’estimer la distribution de la taille

des pores. Les aires de surface BET obtenues sont, respectivement, de ≈ 690 m2/g, de ≈

378 m2/g et de ≈ 632 m2/g pour la S-10-100, la S-15-100 et la S-T-100. Le volume total

des pores est de 0,72 cm3/g, 0,49 cm3/g et 0,61 cm3/g pour la S-10-100, la S-15-100 et

la S-T-100, respectivement. Aussi un diamètre de pore large d’environ 24 nm, 20 nm et

un plus modeste de 7,5 nm pour la S-10-100, la S-15-100 et la S-T-100, respectivement

a été obtenu. Les isothermes obtenues sont de type IV avec des boucles hystérèses de

type H2. Ces résultats montrent des propriétés texturales très intéressantes.

Figure 58. Les isothermes d'adsorption/désorption d'azote pour la S-10-100.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Volu

me a

dsorb

é (

cm

3/g

)

P/P0

Adsorption

Désorption

100

Figure 59. Les isothermes d'adsorption/désorption d'azote pour la S-15-100.

Figure 60. Les isothermes d'adsorption/désorption d'azote pour la S-T-100.

0

50

100

150

200

250

300

350

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Vo

lum

e a

dso

rbé

(cm

3/g

)

P/P0

Adsorption

Desorption

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Vo

lum

e a

dso

rbé

(cm

3/g

)

P/P0

Adsorption

Désorption

101


Le diffractogramme (DRX) obtenu aux petits angles pour la S-10-100 (Figure 61)

montrent des pics à 2θ ≈ 0,8°; 0,9°; 1,1°; 1,2° et à 2θ ≈ 1.6° qui caractérisent les

diffractions (311), (331), (331), (442), et (644), respectivement. Le diffractogramme

représentant la S-15-100 (Figure 62), montre un pic majeur de diffraction (111) à l’angle

2θ = 0,3°, ainsi qu’un pic similaire est observé avec la S-T-100 (Figure 63) à environ 2θ ≈

0,5°, on observe aussi un petit pic caractérisant la diffraction (331) à 2θ ≈ 0.6° et à 2θ ≈

0.9° pour la S-15-100 et la S-T-100, respectivement, confirmant une structure

mésoporeuse cubique ordonnée de ces matériaux (Fan et al., 2005).

1 2 3

I (u. a.)

2 Thêta (degrés)

S-10-100311

331 333 442

644

Figure 61. Le diffractogramme (DRX) obtenu aux petits angles obtenus pour la S-10-100.

102

0 1 2 3

2 Thêta (degrés)

I (u. a.)

S-15-100111

331

Figure 62. Le diffractogramme (DRX) obtenu aux petits angles obtenus pour la S-15-100.

103

1 2 3

2 Thêta (degrés)

I (u. a.)

S-T-100111

331

Figure 63. Le diffractogramme (DRX) obtenu aux petits angles obtenus pour la S-T-100.


Les images MET montrent une excellente structure cubique de ces matériaux, qui sont en

concordance avec les résultats obtenus par les analyses DRX. Ces images (Figure 64,

Figure 65 et Figure 66) montrent des unités cellulaires larges qui sont 24 nm pour les

silices mésoporeuses S-10-100 et de 20 nm pour les silices mésoporeuses S-15-100.

Mais des unités plus étroites ont été observées pour les silices mésoporeuses S-T-100

de l’ordre de 8 nm. Ces résultats sont en concordance avec les dimensions estimées à

l’aide des isothermes d’absorption/désorption de l’azote.

104

Figure 64. Micrographe MET de la S-10-100 (24 nm).

Figure 65. Micrographe MET de la S-15-100 (19-20 nm).

Figure 66. Micrographe MET de la S-T-100 (7,5 nm).

105

Le tableau suivant résume les résultats obtenus par analyse BET des différents

matériaux synthétisés.

Tableau 13. Les propriétés texturales des supports synthétisés.

Matériaux La surface BET

(m2/g)

Volume des pores

VP (cm3 g-1)

Taille des pores D

(nm)

SBA-15 901,9 1,31 6,8

MCF 487,2 0,52 20,0

S-2.9 376,7 0,60 7,7

S-34.8 458,1 0,62 16,9

S-10-100 689,9 0,72 24,0

S-15-100 378,4 0,49 19,5

S-T-100 632,4 0,61 7,5

5.3.2. Immobilisation de β-galactosidase

Afin d’étudier la rétention de β-galactosidase sur les matériaux on a utilisé la méthode

BCA (Smith et al., 1985) décrite en détail dans la partie 4.4.6.2 pour déterminer la

quantité d’enzyme immobilisée.

Dans cette partie on a essayé d’immobiliser l’enzyme sur les sept matériaux synthétisés

avec trois pH différents : neutre (pH=7) et acide (pH=3,5 et pH=5). Ensuite, on a utilisé

différentes concentrations d’enzyme pour voir la capacité de rétention maximale de

chaque matériau : 250µg d’enzyme/mg de matériaux (25%) ; 600 µg d’enzyme/mg de

matériaux (60%) ; 750 µg d’enzyme/mg de matériaux (75%) et 1000 µg d’enzyme/mg de

matériaux (100%) ainsi que l’effet de la concentration de glutaraldéhyde utilisé (0,1%; 1%

et 2%).

106

5.3.2.1. Effet de pH sur la rétention des enzymes

La représentation graphique de l’effet du pH sur l’immobilisation de β-galactosidase ainsi

que le test d’ANNOVA avec la procédure glm de SAS (Figure 67 et Figure 68) montrent

une différence significative (F<0,0001) entre le pH 7 et les autres pH (Annexe2). Le pH 5

offre une rétention légèrement meilleure que le pH 3,5 pour la majorité des matériaux

(Figure 67). Cependant, cette différence reste statistiquement non significative. De plus,

il est observé que travailler à pH=5 défavorise l’hydrolyse des sucres due à une forte

acidité (pH=3,5) (Parhi et al., 2008). Ce qui est en surcroît un avantage pour la formation

des GOS.

Figure 67. Effet du changement de pH sur la rétention des matériaux.

Ces résultats s’expliquent par le point isoélectrique du matériau et de l’enzyme.

Effectivement, les pH=3,6 et pH=4,6 sont rapportés dans la littérature comme étant des

valeurs de références de pI de la β-galactosidase à partir de l’A.oryzae (Ansari et Husain,

2010, Bernal et al., 2014). En effet, l’enzyme est chargée positivement, à un pH < pI et

chargée négativement à un pH > pI. Souvent, le pI de la surface du support siliceux est

supposé être au voisinage de 2 (Vinu et al., 2004), sauf qu’il existe des matériaux siliceux

ayant des pI supérieurs à 2, comme le montre les résultats obtenus par Hudson et ses

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

% d

e r

éte

nti

on

pH=7

pH=3,5

PH=5

107

collègues (Hudson et al., 2005) qui rapportent que le pI de la SBA-15 est d'environ 3,7 ±

0,3.

Figure 68. Distribution de rétention présentée par la procédure glm de SAS.

De plus, plusieurs facteurs contrôlent l’immobilisation de l’enzyme. En effet, des forces

impliquées dans la physisorption de la β-galactosidase sur la silice mésoporeuse comme

les laissons de van der Waals, les interactions par liaisons hydrogène, les interactions

électrostatiques entre les résidus d'acides aminés à la surface de la β-galactosidase et

les groupes silanol sur la surface des matériaux mésoporeux peuvent avoir un rôle

prépondérant (Zhou et al., 2009).

Ces dernières ont un impact très important sur l’immobilisation : lorsque le pH de la

solution est supérieur au pI de l’enzyme, la surface de la protéine devient chargée

négativement et donc une répulsion électrostatique s’exerce entre la β-galactosidase

chargée négativement et le support de silice mésoporeuse (groupes silanol également

chargés négativement), ce qui réduit la quantité de β-galactosidase adsorbée sur le

matériau. A un pH proche du point isoélectrique, la charge nette de l’enzyme est de zéro

(neutre) et donc l'interaction électrostatique entre les molécules protéiques est la plus

108

basse possible, et entraine par conséquent une diminution de la répulsion électrostatique

entre les β-galactosidases (Yiu et Wright, 2005). Les supports maximale d’enzyme

lorsque la valeur de pH de la solution est proche du pI de la protéine, ce qui est en

accord avec les résultats rapportés dans la littérature (Salis et al., 2005, Yiu et Wright,

2005).

En se basant sur ces résultats, tout au long du reste de travail, on va utiliser le pH 5

optimisé pour l’immobilisation de β-galactosidase et la réaction de synthèse des GOS.

5.3.2.2. Effet de la concentration d’enzyme sur la quantité immobilisée lors

de la rétention

Pour étudier l’effet de la concentration d’enzyme sur la rétention avec chaque matériau,

on a utilisé :

Quatre quantités d’enzymes : 250, 600, 750 et 1000 µg d’enzyme/mg de

matériaux

pH optimisé de 5

Concentration initiale de 0,1% de GA.

Selon la Figure 69, les réponses de rétention observées diffèrent d’un matériau à un

autre. Cette différence s’explique par la présence de différentes formes de matériaux

siliceux, ainsi que des diamètres et volumes poreux distincts. D’après les résultats du test

d’ANNOVA appliqué pour les différentes quantités de β-galactosidases, on remarque une

différence significative des interactions entre les matériaux et l’enzyme à des

concentrations différentes. Ceci empêche de faire directement des comparaisons entre

les différentes quantités d’enzymes. Par conséquent, on a eu besoin d’étudier l’effet de la

concentration d’enzyme pour chacun des matériaux, à part (Annexe 3).

On remarque que la concentration d’enzyme à 25% présente le taux de rétention le plus

faible pour la plupart des matériaux, sauf dans le cas des MCF. Pour ce dernier, la

différence de rétention en présence de différentes concentrations d’enzyme est non

significative, comme le montrent les analyses d’ANNOVA en utilisant le test de Tukey

(Tableau 14). Ces résultats affirment que la MCF est capable de retenir la même quantité

d’enzyme (entre 93% et 94%) indépendamment de sa concentration. Pour le reste des

matériaux, une différence significative entre les concentrations d’enzyme est mise en

évidence par le test de Tukey.

109

La MCF retient 94,2% d’enzyme avec la plus faible concentration d’enzyme (25%) par

rapport à une rétention de 84,5% pour la S 2,9 et de 88,0% pour la S 34,8 et la S-15-100.

La rétention optimale de la MCF à cette faible concentration est due à l’adsorption des

enzymes à l’intérieur des pores du matériau (MCF). Ces pores ont une habilité supérieure

à retenir ces protéines grâce à leur forme de mousse. En plus, la forme et la taille des

pores favorisent la formation des agrégats qui les protègent contre les conditions de

lavage (lavage avec HCl ou lavage avec l’eau). Ceci n’est pas le cas avec les autres

matériaux ayant des pores cylindriques uniformes.

Figure 69. Effet de la quantité d’enzyme sur l’immobilisation et la rétention des matériaux.

Même si la concentration d’enzyme à 25% de matériaux est la plus faible en termes de

rétention pour 86% des matériaux (6 matériaux sur 7), elle présente toujours un taux de

rétention satisfaisant (de 84% à 91% de rétention) en comparaison avec des résultats

rapportés dans la littérature (Kim et al., 2007, Kim et al., 2008, Lee et al., 2005).

Dans le cas de la SBA-15, la meilleure rétention est observée avec la concentration

d’enzyme de 75% (Figure 69). Mais en quantité d’enzyme immobilisée, la SBA-15 est

capable de retenir plus de 910 µg d’enzyme/mg, ce qui représente ~ 92 % de la quantité

d’enzyme ajoutée. Cette capacité de rétention est due, essentiellement, à la grande

75

80

85

90

95

100

MCF SBA-15 S 2,9 S 34,8 S-15-100 S-10-100 S-T-100

% R

éte

nti

on

25%

60%

75%

100%

110

surface spécifique de la SBA-15 (901,9 m2/g), mais aussi à la rétention au niveau des

pores relativement étroits (Taille des pores=6,8 nm) par rapport à la taille de l’enzyme (β-

galactosidase=110 KDa).

Tableau 14. Résultats du test du Tukey pour la MCF et la concentration d’enzyme

1

Groupement de Tukey

Moyenne rep Ez

A 94,16 3 25

A 94,06 3 75

A 93,50 3 60

A 93,16 3 100

LA S 2,9 (Tableau 15), la S 34,8 (Tableau 16) et la S-T-100 (Tableau 17) présentent la

même réponse que la SBA-15, avec un meilleur taux de rétention à 75% et une

concentration maximale d’enzyme en µg/mg de matériau de 947,6 ; 957 et 946,

respectivement. Dans le cas de la S 2,9, ces résultats sont attribués, en grande partie, à

sa surface spécifique. Ceci est dû à la taille de ses pores qui ne dépasse pas 7,7 nm.

Dans le cas de la S-T-100, qui présente une rétention similaire à celle de la S 2,9, les

résultats sont plutôt attribués à la forme et la taille de ses pores (7,5 nm), vu que ce

matériau dispose d’une surface spécifique plus petite que la S 2,9. En ce qui concerne la

S 34,8, la rétention est plus importante, essentiellement grâce à sa structure

mésoporeuse particulière mais aussi pour la forme et la taille de ses pores (16,7 nm) qui

semblent très efficaces pour l’immobilisation d’enzyme. En effet, les courbures des méso-

canaux de la silice et la flexibilité inter-coque résultant de la grande taille des pores

empêchent l’enzyme de s’échapper (Zhou et al., 2009).

111

Tableau 15. Résultats du test de Tukey pour la S 2,9 et la concentration d’enzyme

Les moyennes avec la même lettre ne sont pas significativement différentes

Groupement de Tukey

Moyenne rep GA

A 94,86 3 75

A 94,76 3 100

B A 90,50 3 60

B 84,43 3 25

Tableau 16. Résultats du test de Tukey pour la S 34,8 et la concentration d’enzyme


Groupement de Tukey

Moyenne rep Ez

A 96,80 3 75

A 95,73 3 100

A 94,46 3 60

B 88,90 3 25

112

Tableau 17. Résultats du test de Tukey pour la S-T-100 et la concentration d’enzyme


Groupement de Tukey

Moyenne rep Ez

A 96,46 3 75

A 94,63 3 100

A 94,60 3 60

B 87,40 3 25

Les S-10-100 et S-15-100 ont presque la même forme, la même taille des pores et la

même surface. Ceci explique pourquoi ils se comportent de la même façon et montrent

un meilleur pourcentage de rétention à 60% et une rétention de 940 µg d’enzyme/mg de

matériau (Tableau 18 et Tableau 19). Cette rétention est due particulièrement à la taille

des pores de ces deux matériaux : 24 nm et 19,5 nm, respectivement.

Tableau 18. Résultats du test de Tukey pour la S-15-100et la concentration d’enzyme


Groupement de Tukey

Moyenne rep Ez

A 96,53 3 60

B 94,46 3 100

B 94,40 3 75

C 88,73 3 25

Tableau 19. Résultats du test de Tukey pour la S-10-100 et la concentration d’enzyme


113

Groupement de Tukey

Moyenne rep GA

A 95,56 3 60

B A 94,46 3 100

B 94,20 3 75

C 91,73 3 25

Pour conclure, la majorité des silices synthétisées au cours de notre étude montre une

capacité de rétention remarquable qui atteint 95%. Les matériaux sont capables de

retenir presque leur poids en enzyme. Ces résultats sont très encourageants pour tester

l’activité de chaque biocatalyseur (enzyme supportée).

5.3.2.3. Effet de la concentration de Glutaraldéhyde (GA) sur la rétention des

enzymes immobilisées

Dans cette partie, on a utilisé trois concentrations de GA : 0,1%, 1% et 2% de la solution

tampon ajoutée, afin d’étudier l’effet de la concentration de GA sur la rétention des sept

matériaux. Ces concentrations sont utilisées à un pH=5 et une concentration d’enzyme

de 75% avec les sept matériaux examinés dans cette étude.

Les analyses d’ANNOVA avec la procédure glm de SAS montrent qu’il y a une interaction

significative entre les matériaux et les concentrations de GA. Donc, on ne peut pas

conclure directement, et il faut passer par l’étude de chaque matériau séparément. Mais il

est clair selon la Figure 70 que la totalité des matériaux présente une meilleure rétention

avec la concentration 0,1% (Annexe4).

Les analyses statistiques avec le test Tukey de chaque matériau confirment que le

pourcentage 0,1% de GA est la meilleure concentration pour la rétention de β-

galactosidase, par rapport aux autres concentrations. Dans le cas de la S 34,8, il n’y a

pas de différence significative entre les trois traitements. Ceci est probablement dû à son

unique forme de vésicule (Tableau 20).

Trevisan et ses collègues (Trevisan et al., 1997) montrent que l’augmentation de la

concentration de GA entraîne une diminution de l’activité et même une désactivation de

114

l’enzyme, mais elle assure une meilleure stabilité. Donc, il s’agit d’un compromis entre

l'effet sur l'activité enzymatique dégénérative et sur le renforcement de la structure

protéique qui affecte la rétention de l’enzyme.

Figure 70. Effet de la concentration de GA sur l’immobilisation et la rétention des enzymes par les différents matériaux.

Tableau 20. Résultats du test de Tukey pour la S 34,8 et les concentrations de GA


Groupement de Tukey

Moyenne rep GA

A 81,86 3 1

A 81,80 3 0.1

A 78,80 3 2

70

75

80

85

90

95

100

MCF SBA-15 S 2,9 S 34,8 S-15-100 S-10-100 S-T-100

% R

éte

nti

on

0,1%

1%

2%

115

5.3.3. Réaction de transglycosylation avec l’enzyme immobilisée

Dans cette partie, on a étudié la réponse de chaque matériau vis-à-vis de la réaction de

transglycosylation pour la formation du lactosucrose et du tetrahexose, tout en la

comparant d’une part à la réaction en phase homogène, et d’autre part aux différents

matériaux entre eux. La réaction a été effectuée dans les conditions déjà optimisées.

Dans un premier lieu on fixe un pH de 5 et une température de 40°C ainsi qu’une

concentration d’enzyme de 100% qui a été optimisée durant le processus de rétention.

Dans un second lieu, on va utiliser une concentration enzymatique de 60% pour pouvoir

comparer les différentes approches : hétérogène (enzyme immobilisée) et homogène

(enzyme libre).

5.3.3.1. Réactivité de la β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée

sur la MCF

La MCF est un support siliceux ayant des pores sphériques interconnectés, de tailles

uniformes atteignant 20 nm avec une surface spécifique de 487.2 m2/g. Ce matériau a

montré une rétention d’enzyme de 93,2% à pH acide (pH=5) avec une concentration

de 100% en enzyme.

La Figure 71 montre une formation du lactosucrose dépassant les 75 g/L (25%) (Avec

une concentration de 100% en enzyme) ainsi que la présence du glucose avec une

quantité de 94,8 g/l, ensuite on trouve la formation du fructose qui ne cesse

d’augmenter en fonction du temps, ainsi qu’une formation faible du tetrahexose (11,6

g/l après 24h de réaction) et du galactose (9,2 g/l après 24h de réaction). En effet,

l’enzyme révèle une réactivité très importante après son immobilisation sur la MCF.

Cette réactivité peut être due au taux très important d’enzymes immobilisées et leur

disponibilité pour effectuer la réaction de transglycosylation, ainsi que les phénomènes

de transfert de matière qui se trouveraient favorisés par des pores larges de la MCF.

D’un autre côté, la forme mousseuse exceptionnelle ainsi que la surface spécifique

importante de la MCF favorisent considérablement les interactions entre les matrices

protéiques de l’enzyme conduisant à la formation des agrégats responsables de

l’activité catalytique, ainsi que leur rôle dans l’amélioration de la rétention de ce

matériau.

116

Avec une concentration enzymatique de 60%, la MCF montre une rétention de 93,5%.

La formation maximale du lactosucrose sous ces conditions réactionnelles est de 69,5

g/L (23%), ce qui représente une concentration supérieure à celle obtenue avec

l’enzyme en solution à pH 5 (un maximum de 62,8 g/L (21%)) comme le montre la

Figure 72. Cependant, il est bien clair selon la Figure 72 que la vitesse de réaction de

formation du lactosucrose est plus élevée dans le cas de la réaction en phase

homogène et cela peut être expliqué par l’accessibilité améliorée des substrats aux

sites actifs de l’enzyme en solution par rapport à celle qui est immobilisée. On

remarque aussi la grande différence entre l’approche hétérogène et homogène

concernant la formation du glucose et du galactose. Dans le cas de la phase

homogène, il y avait une production de 105,2 g/L de glucose et de 69,6 g/L de

galactose contre une production correspondante de 74,4 g/L de glucose et 8,7 g/L de

galactose en phase hétérogène. Cette différence peut être attribuée à la réaction

d’hydrolyse du lactose qui a été majoritaire dans la phase homogène d’où la

production intense des monosaccharides galactose et glucose. Cette réaction

indésirable est limitée dans le cas de l’enzyme immobilisée. Ces résultats montrent

une sélectivité importante de ce biocatalyseur (MCF) qui permet d’augmenter la

synthèse du lactosucrose, tout en limitant la réaction d’hydrolyse du lactose.

117

Figure 71. Cinétique de la réaction de formation des GOS catalysée par β-galactosidase immobilisée sur la MCF comme support à une concentration enzymatique de 100%.

0

50

100

150

200

250

300

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n (

g/L)

Temps (h)

Saccharose (g/L)

Lactose (g/L)

Glucose (g/L)

Galactose (g/L)

Fructose (g/L)

Lactosucrose (g/L)

Tetrahexose (g/L)

118

Figure 72. Comparaison entre les produits de la réaction avec enzymes immobilisées sur la MCF et les produits de la réaction avec des enzymes en solution à une concentration

enzymatique de 60%.


sur la SBA-15

La SBA-15 est un support mésoporeux siliceux avec une forme hexagonale ayant une

taille de pore de 6,8 nm, et une surface très importante de 901.9 m2/g. Cette surface

exceptionnellement large assure une rétention de 91,9% à un pH=5 avec une

concentration enzymatique de 100%.

Au cours de la réaction enzymatique utilisant la β-Galactosidase immobilisée sur la

SBA-15, la formation des produits ne reflète pas cette rétention enzymatique (91,9%

avec une concentration d’enzyme de 100%), surtout avec des pores de très petite

taille, comparée à la taille de la β-galactosidase. Une telle rétention s’explique par la

surface externe importante de la SBA-15. En effet, le maximum de production de

lactosucrose par la SBA-15 à une concentration d’enzyme de 100% est de 17,1 g/l

(5,8 %) (Figure 73 et Figure 74 ). Pandya et ses collègues (Pandya et al., 2005)

confirment que l’enzyme est immobilisée uniquement sur la surface externe dans le

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n (

g/l)

Time (h)

glu-MCF

gal-MCF

fru-MCF

GOS I-MCF

GOS II-MCF

glu-E libre

gal-E libre

fru-E libre

GOS I-E libre

GOS II-E libre

119

cas de la SBA-15. Ceci conduit à une formation faible des agrégats enzymatiques

responsables de l’activité catalytique, ce qui implique une activité faible.

Figure 73. Cinétique de la réaction de formation des GOS catalysée par β-galactosidase supportée sur la SBA-15 à une concentration d’enzyme de 100%.

Figure 74. Cinétique des produits formés au cours de la réaction catalysée par β-galactosidase supportée sur la SBA-15 à une concentration d’enzyme de 100%.

0

50

100

150

200

250

300

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n g

/L

Temps (h)

Saccharose (g/L)

Lactose (g/L)

Glucose (g/L)

Galactose (g/L)

Fructose (g/L)

Lactosucrose (g/L)

Tetrahexose (g/L)

0

5

10

15

20

25

30

35

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n g

/L

Temps (h)

Glucose (g/L)

Galactose (g/L)

Fructose (g/L)

Lactosucrose (g/L)

Tetrahexose (g/L)

120

Avec une concentration enzymatique de 60% (Figure 75), la SBA-15 offre un

rendement plus faible (18% en lactosucrose) comparé à celui obtenu avec l’approche

homogène. Cependant, il est important de mentionner que, tout au long de la réaction

avec l’enzyme immobilisée, ni le galactose ni le tetrahexose ne se forment. En effet, le

galactose est un produit d’hydrolyse de lactose et son absence montre que la réaction

de transglycosylation domine dans ces conditions expérimentales. L’absence du

tetrahexose confirme que la SBA-15 montre une très haute sélectivité vis-à-vis la

production du lactosucrose.

Figure 75. Comparaison entre les produits de la réaction avec enzymes immobilisées sur la SBA-15 et les produits de la réaction avec des enzymes en solution à une



sur la S-2.9

Le support siliceux S 2,9 présente une surface BET de 376.7 m2/g et une taille des

pores de 7,7 nm. Ces caractéristiques permettent à la ‘S 2,9’ de retenir 94,76% de

l’enzyme, mais entraine cependant une activité catalytique très limitée (Figure 76 et

Figure 77). Un rendement faible en lactosucrose qui ne dépasse pas 3,5% (production

maximal de 10,5 g/L du lactosucrose) et qui est attribué à l’immobilisation d’enzyme

restreinte à la surface externe du matériau (Pandya et al., 2005).

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n g

/l

Temps (h)

glu-SBA-15

gal-SBA-15

fru-SBA-15

GOS I-SBA-15

GOS II-SBA-15

glu-E libre

gal-E libre

fru-E libre

GOS I-E libre

GOS II-E libre

121

Cependant, une sélectivité très intéressante est observée, une absence de formation

de galactose qui montre que la transglycosylation emporte la totalité de la réaction,

afin de favoriser la synthèse de lactosucrose.

La Figure 78 montre une large différence entre le rendement de β-galactosidase en

solution à 60% et celle immobilisée sur la ‘S 2,9’. En effet, le rendement en

lactosucrose formé avec l’enzyme immobilisée est de 7,1% par rapport à celle produite

avec l’enzyme libre.

Figure 76. Cinétique de la réaction de formation des GOS catalysée par β-galactosidase supportée sur la ‘S 2,9’ à une concentration d’enzyme de 100%.

0

50

100

150

200

250

300

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n g

/L

Temps (h)

Saccharose (g/L)

Lactose (g/L)

Glucose (g/L)

Galactose (g/L)

Fructose (g/L)

Lactosucrose (g/L)

Tetrahexose (g/L)

122

Figure 77. Cinétique des produits formés au cours de la réaction catalysée par β-galactosidase supportée sur la ‘S 2,9’ à une concentration d’enzyme de 100%.

Figure 78. Comparaison entre les produits de la réaction avec enzymes immobilisées sur la ‘S 2,9’ et les produits de la réaction avec des enzymes en solution à une concentration

enzymatique de 60%.

0

5

10

15

20

25

30

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n g

/L

Temps (h)

Glucose (g/L)

Galactose (g/L)

Fructose (g/L)

Lactosucrose (g/L)

Tetrahexose (g/L)

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n g

/l

Temps h

glu-S 2,9

gal-S 2,9

fru-S 2,9

GOS I-S 2,9

GOS II-S 2,9

glu-E libre

gal-E libre

fru-E libre

GOS I-E libre

GOS II-E libre

123


sur la S-34.8

La silice avec la structure en forme d’oignons (S 34,8) montre une capacité très

particulière pour la rétention des enzymes qui peut atteindre jusqu’à 95%, ainsi qu’une

activité importante pour la réaction dans l’approche hétérogène. Cela est dû

principalement à sa forme qui piège l’enzyme à l’intérieur des pores, et à la taille élevée

de ses pores (16.9 nm) ainsi qu’une surface de BET considérable de 458.1 m2/g.

La Figure 79 ainsi que la Figure 80 (avec une concentration de 100% en enzyme)

montrent une formation importante du lactosucrose qui dépasse les 54 g/L (18%), ainsi

que la présence du tetrahexose avec une quantité considérable de 11 g/L (4%). En effet,

l’enzyme révèle une réactivité importante suite à son immobilisation sur la ‘S 34,8’. Cette

réactivité peut être attribuée au taux très important d’enzymes immobilisées et leur

disponibilité pour effectuer la réaction de transglycosylation, De plus, la forme en vésicule

et la taille des pores ainsi que la surface spécifique importante du support, contribuent

considérablement à l’amélioration du transfert de matière et par conséquent l’accessibilité

des substrats aux sites catalytiques actifs sur la matrice enzymatique.

La vitesse de formation des produits avec l’enzyme immobilisée à 60% de concentration

enzymatique est plus faible que celle avec l’enzyme libre (Figure 81). En effet, la réaction

en approche hétérogène atteint son maximum de production de lactosucrose (45,9 g/L du

lactosucrose, 15,5%) après 28 heures de réaction. Tandis que ce maximum de

production (62,8 g/L du lactosucrose, 21,2 %) est atteint après seulement 12 heures de

réaction en approche homogène. Ceci est dû à une meilleure accessibilité des substrats

aux sites actifs de l’enzyme libre, ce qui améliore la cinétique de transglycosylation.

La Figure 81 montre une formation faible de glucose et de galactose dans le cas de

l’approche hétérogène par rapport à celle produite avec l’approche homogène. Cette

formation est probablement due à la réaction d’hydrolyse du lactose. Cette réaction

secondaire est limitée dans le cas des enzymes immobilisées sur la S 34,8.

124

Figure 79. Cinétique de la réaction de formation des GOS catalysée par β-galactosidase supportée sur la ‘S 34,8’ à une concentration d’enzyme de 100%.

Figure 80. Cinétique des produits formés au cours de la réaction catalysée par β-galactosidase supportée sur la ‘S 34,8’ à une concentration d’enzyme de 100%.

0

50

100

150

200

250

300

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n g

/L

Temps (h)

Saccharose (g/L)

Lactose (g/L)

Glucose (g/L)

Galactose (g/L)

Fructose (g/L)

Lactosucrose (g/L)

Tetrahexose (g/L)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n g

/L

Temps (h)

Glucose (g/L)

Galactose (g/L)

Fructose (g/L)

Lactosucrose (g/L)

Tetrahexose (g/L)

125

Figure 81. Comparaison entre les produits de la réaction avec enzymes immobilisées sur la ‘S 34,8’ et les produits de la réaction avec des enzymes en solution à une



sur la S-10-100

Le support siliceux S-10-100 est un support à base de la SBA -15 gonflée avec l’ajout de

TMB. Suite à ce gonflement, on obtient un matériau avec une taille des pores de 24 nm

et une surface de BET très importante de 689.9 m2/g. Des caractéristiques très

favorables conduisant à une rétention de 94,46% de β-galactosidase à pH= 5 et une

concentration d’enzyme de 100%.

Dans ces conditions réactionnelles, 51 g/L (17 %) du lactosucrose et 10 g/L (4 %) du

tetrahexose sont obtenus après 28 heures de réaction ainsi que la formation du

galactose, du glucose et deu fructose suite à la réaction d’hydrolyse (Figure 82 et Figure

83). Ce rendement considérable des galacto-oligosaccharides est favorisé principalement

par la taille considérable des pores de la S-10-100 ainsi que sa surface spécifique

importante.

La Figure 84 présente une comparaison entre les produits formés lors des deux

approches homogène et hétérogène de la réaction à 60% de concentration d’enzyme.

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n g

/l

Temps (h)

glu-S 34,8

gal-S 34,8

fru-S 34,8

GOS I-S 34,8

GOS II-S 34,8

glu-E libre

gal-E libre

fru-E libre

GOS I-E libre

GOS II-E libre

126

Cette figure montre aussi une vitesse de réaction très élevée et une sélectivité faible dans

le cas de l’utilisation de l’enzyme libre.

Figure 82. Cinétique de la réaction de formation des GOS catalysée par β-galactosidase supportée sur la ‘S-10-100’ à une concentration d’enzyme de 100%.

0

50

100

150

200

250

300

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n (

g/L)

Temps (h)

Saccharose (g/L)

Lactose (g/L)

Glucose (g/L)

Galactose (g/L)

Fructose (g/L)

Lactosucrose (g/L)

Tetrahexose (g/L)

127

Figure 83. Cinétique des produits formés au cours de la réaction catalysée par β-galactosidase supportée sur la ‘S-10-100’ à une concentration d’enzyme de 100%

Figure 84. Comparaison entre les produits de la réaction avec enzymes immobilisées sur la ‘S-10-100’ et les produits de la réaction avec des enzymes en solution à une


0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n (

g/L)

Temps (h)

Glucose (g/L)

Galactose (g/L)

Fructose (g/L)

Lactosucrose (g/L)

Tetrahexose (g/L)

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30

Co

nce

ntr

atio

n g

/l

Temps (h)

glu-S-10-100

gal-S-10-100

fru-S-10-100

GOS I-S-10-100

GOS II-S-10-100

glu-E libre

gal-E libre

fru-E libre

128


sur la S-15-100

Le support siliceux S-15-100 est une SBA-15 gonflée par l’ajout de TMB afin d’obtenir

des pores plus large (19,5 nm) et des formes irrégulières (hexagonales déformées). La S-

15-100 a réussi à retenir 94,44% de l’enzyme à 100% de concentration.

Les Figure 85 et Figure 86 montrent une concentration considérable du lactosucrose (43

g/L, 14,5 %) dans le cas de la réaction hétérogène. Elles montrent aussi une sélectivité

importante, surtout au niveau de la formation minime du galactose. Cette sélectivité est

illustrée dans la Figure 87, où 14 g/L du galactose sont formés par la voie hétérogène à

une concentration de 60% d’enzyme, contre 69,5 g/L de galactose formés par l’enzyme

en solution. Ces résultats peuvent être expliqués, d’une part, par la taille des pores de la

silice, et d’autre part, par l’amélioration de la stabilité de la matrice enzymatique vis-à-vis

des conditions de la réaction de transgalactosylation, grâce à l’immobilisation des

enzymes à l’intérieur et à la surface du support siliceux.

Figure 85. Cinétique de la réaction de formation des GOS catalysée par β-galactosidase supportée sur la ‘S-15-100’ à une concentration d’enzyme de 100%.

0

50

100

150

200

250

300

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n g

/L

Temps (h)

Saccharose (g/L)

Lactose (g/L)

Glucose (g/L)

Galactose (g/L)

Fructose (g/L)

Lactosucrose (g/L)

Tetrahexose (g/L)

129

Figure 86. Cinétique des produits formés au cours de la réaction catalysée par β-galactosidase supportée sur la ‘S-15-100’ à une concentration d’enzyme de 100%.

Figure 87. Comparaison entre les produits de la réaction avec enzymes immobilisées sur la ‘S-15-100’ et les produits de la réaction avec des enzymes en solution à une


0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n g

/L

Temps (h)

Glucose (g/L)

Galactose (g/L)

Fructose (g/L)

Lactosucrose (g/L)

Tetrahexose (g/L)

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30

Co

ncn

trat

ion

g/l

Temps (h)

glu-S-15-100

gal-S-15-100

fru-S-15-100

GOS I-S-15-100

GOS II-S-15-100

glu-E libre

gal-E libre

fru-E libre

GOS I-E libre

GOS II-E libre

130


sur la S-T-100

La S-T-100 est un autre support à base de la SBA -15 gonflée avec l’ajout de TMB. Ce

matériau présente une surface de BET très importante de 632,4 m2/g, avec une taille des

pores de 7,5 nm. Ces caractéristiques et surtout l’aire spécifique élevée, sont très

favorables, pour avoir une rétention importante de 96,46 % de β-galactosidase à pH= 5 et

une concentration d’enzyme de 100%.

Cette rétention (avec 100% d’enzyme) très élevée a donné un rendement faible de 3,4

g/L (1,2 %) en lactosucrose, ainsi que 1,8g/L (0.59 %) du tetrahexose. Cette production

est comparable avec celle obtenue par la SBA-15 et la S-2.9, mais reste néanmoins plus

faible qu’elles, à cause de leurs pores étroits. On observe aussi une production minimale

du galactose (Figure 88 et Figure 89) suite à une réaction d’hydrolyse minimale dans

ces conditions opératoires.

La Figure 90 montre une grande différence entre la production des GOS en comparant

les deux phases catalytiques homogène (enzyme libre) et hétérogène (enzyme

immobilisée). Une production plus élevée est observée avec l’enzyme libre avec une

cinétique rapide. On remarque aussi une formation très élevée du glucose et du

galactose dans le cas de l’approche homogène par rapport à celle produite dans

l’approche hétérogène, ce qui peut être attribué à une limitation de la réaction d’hydrolyse

du lactose après immobilisation.

131

Figure 88. Cinétique de la réaction de formation des GOS catalysée par β-galactosidase supportée sur la ‘S-T-100’ à une concentration d’enzyme de 100%.

Figure 89. Cinétique des produits formés au cours de la réaction catalysée par β-galactosidase supportée sur la ‘S-T-100’ à une concentration d’enzyme de 100%.

0

50

100

150

200

250

300

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n g

/L

Temps (h)

Saaccharose (g/L)

Lactose (g/L)

Glucose (g/L)

Galactose (g/L)

Fructose (g/L)

Lactosucrose (g/L)

Tetrahexose (g/L)

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15 20 25 30

Co

nce

ntr

atio

n g

/L

Temps (h)

Glucose (g/L)

Galactose (g/L)

Fructose (g/L)

Lactosucrose (g/L)

Tetrahexose (g/L)

132

Figure 90. Comparaison entre les produits de la réaction avec enzymes immobilisées sur la ‘S-T-100’ et les produits de la réaction avec des enzymes en solution à une


Les résultats obtenus avec l’enzyme supportée sur les différents matériaux siliceux, ainsi

que ceux obtenus avec l’approche homogène utilisant l’enzyme libre, sont rassemblés

dans le Tableau 21, qui présente les différentes proportions obtenues en termes du

lactosucroseI et du tetrahexose ainsi que les GOS totaux.

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30

Co

nce

ntr

atio

n g

/l

Temps (h)

glu-S-T-100

gal-S-T-100

fru-S-T-100

GOS I-S-T-100

GOS II-S-T-100

glu-E libre

gal-E libre

fru-E libre

GOS I-E libre

GOS II-E libre

133

Tableau 21. Résultats récapitulatifs des rendements en galacto-oligosaccharides (lactosucrose et tetrahexose) obtenus avec l’enzyme immobilisée sur les différents matériaux

Concentration d’enzyme 100% Concentration d’enzyme 60%

Lactosucrose g/L

(%)

Tetrahexose g/L

(%)

Total GOS

(%)

Lactosucrose g/L

(%)

Tetrahexose g/L

(%)

Total GOS

(%)

E/MCF 75,2

(25,33%)

11,0

(3,68%)

86,1

(29,02%)

69,5

(23,41%)

11,5

(3,87%)

80,9

(27,28%)

E/SBA-15 17,1

(5,78%)

1,0

(0,33%)

18,1

(6,11%)

11,5

(3,87%)

00,0 11,5

(3,87%)

E/S 2,9 10,5

(3,52%)

3,9

(1,33%)

14,4

(4,86%)

4,5

(1,50%)

1,5

(0,5%)

5,9

(2%)

E/S 34,8 54,6

(18,40%)

11,2

(3,78%)

65,8

(22,18%)

45,9

(15,46%)

10,8

(3,62%)

56,6

(19,09%)

E/S-10-100 51,9

(17,48%)

9,7

(3,61%)

61,5

(20,75%)

40,5

(13,66%)

9,9

(3,32%)

50,4

(16,99%)

E/S-15-100 43,0

(14,48%)

10,7

(3,61%)

53,7

(18,09%)

37,9

(12,78%)

10,6

(3,58%)

48,6

(16,37%)

E/S-T-100 3,4

(1,15%)

1,8

(0,59%)

5,2

(1,75%)

3,1

(1,03%)

1,4

(0,47%)

4,5

(1,5%)

Approche

Homogène

63,7

(21,47%)

10,6

(3,58%)

74,3

(25,06%)

62,8

(21,16%)

13,4

(4,53%)

76,2

(25,69%)

134

5.3.3.8. Comparaison entre la réactivité des matériaux

Le Tableau 21 illustre la production de β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée

sur chaque matériau en lactosucrose et en tetrahexose pour les deux concentrations

d’enzyme (100% et 60%). Tous les matériaux présentent une production en GOS plus

élevée avec une concentration enzymatique de 100% par rapport à 60%. Ce constat

s’explique par la rétention plus élevée des enzymes à la concentration de 100%, ce qui

implique leur disponibilité pour la réaction, en augmentant le nombre de sites actifs.

Les Figure 91 et 92 (avec une concentration enzymatique de 100%) montrent que la

MCF présente le meilleur taux de conversion de lactose (75% de conversion), ainsi que le

meilleur biocatalyseur pour la production du lactosucrose et du tetrahexose. En effet, les

larges pores de la MCF et sa forme mousseuse font d’elle un support plus approprié pour

accueillir confortablement l'enzyme dans ses pores, en plus de faciliter l’accès des

substrats aux sites actifs de l’enzyme et faciliter un transfert de matière favorable.

En deuxième position, on trouve la S 34,8 suivie de la S-10-100 et de la S-15-100 avec

des taux de conversion du lactose très proches et une allure similaire comme illustrée

dans les Figure 91 etFigure 92. Dans la littérature (Chouyyok et al., 2009, Kannan et

Jasra, 2009), l'activité de l'enzyme immobilisée sur différents supports siliceux dépend

étroitement de la taille des pores, vu qu’un diamètre large permet un meilleur transfert de

matière. De plus, la structure des matériaux et leurs surfaces affectent le transfert de

matière et donc l’activité de l’enzyme. Chouyyok et ses collègues (Chouyyok et al., 2009)

confirment que la structure de la MCF en cellules sphériques est plus appropriée pour un

bon transfert de matière et pour l’activité enzymatique, par rapport aux structures de la

SBA-15 et la MCM-41 cylindriques longues.

135

Figure 91. Conversion de lactose en fonction du rendement en lactosucrose de différents matériaux.

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60 70

Re

nd

em

en

t la

cto

sucr

ose

(%

)

Coversion de lactose %

MCF

SBA-15

S 2,9

S 34,8

S-15-100

S-10-100

S-T-100

136

Figure 92. Conversion de lactose en fonction de rendement en tetrahexose de différents matériaux.

5.3.4. Activité des biocatalyseurs synthétisé après recyclage

Dans cette section, on étudie un paramètre important en catalyse hétérogène : la stabilité

des biocatalyseurs. Il s’agit de mesurer l’activité de chaque biocatalyseurs (β-

Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée sur la silice) après son recyclage. Pour

avoir une idée plus large sur la performance de ces biocatalyseurs, on a décidé

d’effectuer la réaction de transglycosylation en présence de biocatalyseurs régénérés. On

a donc déterminé les rendements en GOS, jusqu'au 5ème cycle.

La Figure 93 montre une désactivation minimale du biocatalyseur (β-Galactosidase

d’Aspergillus oryzae immobilisée sur la SBA-15). On rappelle que la SBA-15 présente

une activité modeste (18,1%) à cause de ses pores étroits, donc l’enzyme active est

immobilisée à l’extérieur. Donc à cause de cette immobilisation faible, on observe une

baisse d’activité qui passe à 14,7% (en GOS totaux) après un 5ème recyclage du

biocatalyseur.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 10 20 30 40 50 60 70

Re

nd

em

en

t Te

trah

exo

se (

%)

Coversion de lactose %

MCF

SBA-15

S 2,9

S 34,8

S-15-100

S-10-100

S-T-100

137

Pour la MCF (Figure 94), une activité très importante a été observée atteignant 86,08 g/l

de GOS totaux. Cette activité a été pratiquement maintenue après plusieurs recyclages

du biocatalyseur. On a observé seulement environ 8,1% (en GOS totaux) de perte en

activité avec ce matériau, accompagnée de 86,1% de rendement en GOS. Ceci montre

encore une fois que c’est un excellent choix de support pour immobiliser la β-

Galactosidase d’Aspergillus oryzae, grâce à ses propriétés texturales uniques. Elles

permettent une accessibilité favorable à la formation d’agrégats qui sont résistants, d’une

part, aux conditions opératoires de lavage lors du processus de recyclage de ce

biocatalyseurs, et d’autre part, à l’effet de l’environnement acide du milieu réactionnel.

Les autres biocatalyseurs à base des matériaux similaires, ayant des diamètres de pores

entre 17 et 20 nm, maintiennent leurs activités catalytiques avec des pertes légères de

15,4% pour la S-34,8 (Figure 95), de 13,15% pour la S-10-100 (Figure 96) et de 13,80%

pour la S-15-100 (Figure 97), accompagnées des rendements de 65,8, de 61,6 et de

53,7 g/L, respectivement.

Une perte considérable de 33,19% (en GOS totaux) en activité illustrée dans la Figure

98, s’ajoute à un rendement faible en production des GOS 14,42%, et font du S-2,9 un

support inadéquat pour immobiliser l’enzyme de taille encombrante (β-Galactosidase

d’Aspergillus oryzae). Cette perte est principalement attribuée au faible diamètre des

pores de ce matériau, ce qui limite l’accessibilité à l’enzyme, et par conséquent

défavorise la formation des agrégats protéiques responsables de l’activité catalytique. Ce

comportement est analogue à la S-T-100 (Figure 99), qui présente aussi une grande

perte près de plus que la moitié (54,70%) et qui présentait déjà une production faible de

5,20 g/L en GOS.

.

138

Figure 93. La production en lactosucrose et en tetrahexose par β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée sur la SBA-15 pour 5 cycles successifs.

Figure 94. La production en lactosucrose et en tetrahexose par β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée sur la MCF pour 5 cycles successifs.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

Lactosucrose Tetrahexose GOS totaux

Co

nce

ntr

atio

n (

g/L)

Cycle 1

Cycle 2

Cycle 3

Cycle 4

Cycle 5

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Lactosucrose tetrahexose GOS Totaux

Co

nce

ntr

atio

n (

g/L)

Cycle 1

Cycle 2

Cycle 3

Cycle 4

Cycle 5

139

Figure 95. La production en lactosucrose et en tetrahexose par β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée sur la S-34.8 pour 5 cycles successifs.

Figure 96. La production en lactosucrose et en tetrahexose par β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée sur la S-10-100 pour 5 cycles successifs.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Lactosucrose Tetrahexose GOS Totaux

Co

nce

ntr

atio

n (

g/L)

Cycle 1

Cycle 2

Cycle 3

Cycle 4

Cycle 5

0

10

20

30

40

50

60

70


Co

ncn

trat

ion

(g/

L) Cycle 1

Cycle 2

Cycle 3

Cycle 4

Cycle 5

140

Figure 97. La production en lactosucrose et en tetrahexose par β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée sur la S-15-100 pour 5 cycles successifs.

Figure 98. La production en lactosucrose et en tetrahexose par β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée sur la S-2.9 pour 5 cycles successifs.

0

10

20

30

40

50

60


Co

nce

ntr

atio

n (

g/L)

Cycle 1

Cycle 2

Cycle 3

Cycle 4

Cycle 5

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18


Co

nce

ntr

atio

n (

g/L)

Cycle 1

Cycle 2

Cycle 3

Cycle 4

Cycle 5

141

Figure 99. La production en lactosucrose et en tetrahexose par β-Galactosidase d’Aspergillus oryzae immobilisée sur la S-T-100 pour 5 cycles successifs.

0

1

2

3

4

5

6

7


Co

nce

ntr

atio

n (

g/L)

Cycle 1

Cycle 2

Cycle 3

Cycle 4

Cycle 5

143

Conclusion générale

Lors de cette étude, on a réussi à synthétiser deux galacto-oligosaccharides, dont le

plus important est le lactosucrose. La synthèse de ce dernier était catalysée par la β-

galactosidase à partir d’Aspergillus oryzae par bioconversion de lactose et de

saccharose. Deux approches ont été utilisées pour la biosynthèse de lactosucrose, une

approche homogène et une approche hétérogène.

Dans l’approche homogène, l’effets du pH, de la température, de la concentration

d’enzyme ainsi que des substrats a été étudiées et ensuite optimisées pour obtenir un

rendement de 25% en lactosucrose avec une concentration équimolaire de 60% entre

les substrats, un pH de 5, une température de 40°C, et 6U/mL d’enzymes.

Dans l’approche hétérogène, sept différents matériaux siliceux ont été synthétisés. Ces

matériaux ont servi à immobiliser la β-galactosidase en utilisant le glutaraldhéyde (GA)

comme agent de réticulation. Malgré les différences en diamètres des pores (variant de

6,8 à 24,0 nm), en formes de pores, ainsi qu’en formes de supports (hexagonale,

sphérique, forme de barre, forme d’oignon, etc.), les matériaux montrent une très bonne

rétention de l’enzyme utilisée dépassant les 90% avec des résultats très proches pour

les différents matériaux. Une telle rétention est due principalement à la taille et la forme

des pores, à la surface spécifique de chaque matériau et au positionnement des

enzymes lors de l’adsorption (à l’intérieur des pores ou à la surface).

L’effet de la taille et de la forme des pores, ainsi que la structure des matériaux a été

mise en relief lors de la réaction enzymatique. En effet, l'activité de l'enzyme immobilisée

sur les différents supports de silice est résumée dans l’ordre suivant :

S-T-100 < S 2,9 < SBA-15 < S-15-100 < S-10-100 < S 34,8 < MCF

La MCF montre une très bonne activité enzymatique, grâce à sa forme particulière ainsi

que la taille de ses pores. Cette activité dépasse celle obtenue par l’enzyme libre. Par

contre, la SBA-15 montre une activité modeste, mais avec une excellente sélectivité

envers le lactosucrose.

L’approche hétérogène montre une sélectivité très importante par rapport à l’approche

homogène. D’une part, l’approche hétérogène favorise la réaction de

144

transgalactosylation, donc la formation des GOS, et d’autre part, elle limite la réaction

d’hydrolyse des substrats. Ces deux propriétés sont ainsi très intéressantes et donnent

plus d’efficacité aux biocatalyseurs ainsi synthétisés.

Le recyclage et la réutilisation des différents biocatalyseurs ont été effectués en 5 cycles

successifs, et révèlent une performance très élevée de ces biocatalyseurs avec des

performances légèrement plus faibles pour certains matériaux.

Suite à cette étude, d’autres méthodes d’immobilisation sont envisagées comme

perspectives. Principalement, l’immobilisation d’enzymes par des liaisons covalentes en

modifiant des fonctionnalités des matériaux afin d’améliorer plusieurs paramètres, tels

que la rétention, la formation des agrégats enzymatiques ainsi que l’amélioration de leur

résistances vis-à-vis des conditions opératoires de synthèse et de recyclage.

Il est à noter aussi d’étudier d’autres matériaux qui présentent des fonctionnalités

différentes de celle de la silice.

145

Références bibliographiques

Aider, M., De Halleux, D., 2007. Isomerization of lactose and lactulose production: review. Trends in Food Science & Technology 18 (7), 356-364.

Albayrak, N., Yang, S.-T., 2002. Production of galacto-oligosaccharides from lactose by Aspergillus oryzae β-galactosidase immobilized on cotton cloth. Biotechnology and Bioengineering 77 (1), 8-19.

Ansari, S.A., Husain, Q., 2010. Lactose hydrolysis by β galactosidase immobilized on concanavalin A-cellulose in batch and continuous mode. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 63 (1–2), 68-74.

Ansari, S.A., Satar, R., Alam, F., Alqahtani, M.H., Chaudhary, A.G., Naseer, M.I., Karim, S., Sheikh, I.A., 2012. Cost effective surface functionalization of silver nanoparticles for high yield immobilization of Aspergillus oryzae β-galactosidase and its application in lactose hydrolysis. Process Biochemistry 47 (12), 2427-2433.

Ashish K Sharma, V.A., Rajesh Kumar2, Himanshu Chaurasia1, Deepti Chaurasia1, Peeyush Bhardwaj, 2011. Prebiotics: A Review of Therapeutic Potential. INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICAL INNOVATIONS 1 (3), 28-40.

Bakken, A.P., Hill, C.G., Amundson, C.H., 1990. Use of novel immobilized β-galactosidase reactor to hydrolyze the lactose constituent of skim milk. Biotechnology and Bioengineering 36 (3), 293-309.

Bauman, D.E., Mather, I.H., Wall, R.J., Lock, A.L., 2006. Major Advances Associated with the Biosynthesis of Milk. Journal of Dairy Science 89 (4), 1235-1243.

Belkacemi, K., Boulmerka, A., Arul, J., Hamoudi, S., 2006. Hydrogenation of Vegetable Oils with Minimum trans and Saturated Fatty Acid Formation Over a New Generation of Pd-catalyst. Topics in Catalysis 37 (2-4), 113-120.

Bernal, C., Sierra, L., Mesa, M., 2014. Design of β-galactosidase/silica biocatalysts: Impact of the enzyme properties and immobilization pathways on their catalytic performance. Engineering in Life Sciences 14 (1), 85-94.

Bernal, C., Urrutia, P., Illanes, A., Wilson, L., 2013. Hierarchical meso-macroporous silica grafted with glyoxyl groups: opportunities for covalent immobilization of enzymes. New Biotechnology 30 (5), 500-506.

Boon, M.A., Janssen, A.E.M., Van 't Riet, K., 2000. Effect of temperature and enzyme origin on the enzymatic synthesis of oligosaccharides. Enzyme and Microbial Technology 26 (2-4), 271-281.

Bornscheuer, U.T., 2008. Industrial Biotransformations. In, Biotechnology Set. Wiley-VCH Verlag GmbH, pp. 275-294.

Bowers, L., Carr, P., 1980. Immobilized enzymes in analytical chemistry. In, Advances in Biochemical Engineering, Volume 15. Springer Berlin Heidelberg, pp. 89-129.

Cao, L., 2006. Covalent Enzyme Immobilization. In, Carrier-bound Immobilized Enzymes. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, pp. 169-316.

Champ, M., Langkilde, A.-M., Brouns, F., Kettlitz, B., Collet, Y.L.B., 2003. Advances in dietary fibre characterisation. 1. Definition of dietary fibre, physiological relevance, health benefits and analytical aspects. Nutrition Research Reviews 16 (01), 71-82.

Choi, H.-J., Kim, C.S., Kim, P., Jung, H.-C., Oh, D.-K., 2004. Lactosucrose Bioconversion from Lactose and Sucrose by Whole Cells of Paenibacillus polymyxa Harboring Levansucrase Activity. Biotechnology Progress 20 (6), 1876-1879.

146

Chouyyok, W., Panpranot, J., Thanachayanant, C., Prichanont, S., 2009. Effects of pH and pore characters of mesoporous silicas on horseradish peroxidase immobilization. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 56 (4), 246-252.

Crittenden, R.G., Playne, M.J., 1996. Production, properties and applications of food-grade oligosaccharides. Trends in Food Science & Technology 7 (11), 353-361.

Dashevsky, A., 1998. Protein loss by the microencapsulation of an enzyme (lactase) in alginate beads. International Journal of Pharmaceutics 161 (1), 1-5.

Daude, D., Remaud-Simeon, M., Andre, I., 2012. Sucrose analogs: an attractive (bio)source for glycodiversification. Natural Product Reports 29 (9), 945-960.

Desch, R.J., Kim, J., Thiel, S.W., 2014. Interactions between biomolecules and an iron-silica surface. Microporous and Mesoporous Materials 187, 29-39.

Domínguez, E., Nilsson, M., Hahn-Hägerdal, B., 1988. Carbodiimide coupling of β-galactosidase from Aspergillus oryzae to alginate. Enzyme and Microbial Technology 10 (10), 606-610.

Emaga, T.H., Rabetafka, N., Blecker, C.S., Paquot, M., 2012. Kinetics of the hydrolysis of polysaccharide galacturonic acid and neutral sugars chains from flaxseed mucilage. Biotechnology, Agronomy and Society and Environment 16 (2), 139-147.

End, N., Schöning, K.-U., 2004. Immobilized Biocatalysts in Industrial Research and Production. In: Kirschning, A. (Ed.), Immobilized Catalysts. Springer Berlin Heidelberg, pp. 273-317.

End, N., Schöning, K.-U., 2004. Immobilized Catalysts in Industrial Research and Application. In: Kirschning, A. (Ed.), Immobilized Catalysts. Springer Berlin Heidelberg, pp. 241-271.

Falahati, M., Saboury, A., Shafiee, A., Ma’mani, L., Moosavi-Movahedi, A., 2012. Immobilization of superoxide dismutase onto ordered mesoporous silica nanoparticles and improvement of its stability. Journal of the Iranian Chemical Society 9 (2), 157-161.

Fan, J., Yu, C., Lei, J., Zhang, Q., Li, T., Tu, B., Zhou, W., Zhao, D., 2005. Low-Temperature Strategy to Synthesize Highly Ordered Mesoporous Silicas with Very Large Pores. Journal of the American Chemical Society 127 (31), 10794-10795.

Feigin, L.A., Svergun, D.I., Taylor, G., 1987. Determination of the Integral Parameters of Particles. In: Taylor, G. (Ed.), Structure Analysis by Small-Angle X-Ray and Neutron Scattering. Springer US, pp. 59-105.

Freitas, F.F., Marquez, L.D.S., Ribeiro, G.P., Brandão, G.C., Cardoso, V.L., Ribeiro, E.J., 2011. A comparison of the kinetic properties of free and immobilized Aspergillus oryzae β-galactosidase. Biochemical Engineering Journal 58–59 (0), 33-38.

Fuchsbauer, H.L., Gerber, U., Engelmann, J., Seeger, T., Sinks, C., Hecht, T., 1996. Influence of gelatin matrices cross-linked with transglutaminase on the properties of an enclosed bioactive material using β-galactosidase as model system. Biomaterials 17 (15), 1481-1488.

Fujita, K., Hara, K., Hashimoto, H., Kitahata, S., 1990. Transfructosylation Catalyzed by β-Fructofurariosidase I from Arthrobacter sp. K-1(Biological Chemistry). Agricultural and biological chemistry 54 (10), 2655-2661.

Fusako, T., KAZUHITO, R., KAWAKAMI., Y., FUJIMURA., Y., UCHIDA., J., OKU., K., OKA., M., YONEYAMA., M., 1996. Effect of 4G-β -D-galactosylsucrose (lactosucrose) on fecal microflora in patients with chronic inflammatory bowel disease. Journal of Gastroenterol 31, 33-39.

147

Gänzle, M.G., 2012. Enzymatic synthesis of galacto-oligosaccharides and other lactose derivatives (hetero-oligosaccharides) from lactose. International Dairy Journal 22 (2), 116-122.

Gänzle, M.G., 2011. Lactose and Oligosaccharides | Lactose: Derivatives. In: Fuquay, J.W. (Ed.), Encyclopedia of Dairy Sciences (Second Edition). Academic Press, San Diego, pp. 202-208.

Gänzle, M.G., Haase, G., Jelen, P., 2008. Lactose: Crystallization, hydrolysis and value-added derivatives. International Dairy Journal 18 (7), 685-694.

Gaur, R., Pant, H., Jain, R., Khare, S.K., 2006. Galacto-oligosaccharide synthesis by immobilized Aspergillus oryzae β-galactosidase. Food Chemistry 97 (3), 426-430.

Guerrero, C., Vera, C., Plou, F., Illanes, A., 2011. Influence of reaction conditions on the selectivity of the synthesis of lactulose with microbial β-galactosidases. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 72 (3-4), 206-212.

Guimarães, P.M.R., Teixeira, J.A., Domingues, L., 2010. Fermentation of lactose to bio-ethanol by yeasts as part of integrated solutions for the valorisation of cheese whey. Biotechnology Advances 28 (3), 375-384.

Güleç, H., Gürdaş, S., Albayrak, N., Mutlu, M., 2010. Immobilization of Aspergillus oryzae β-galactosidase on low-pressure plasma-modified cellulose acetate membrane using polyethyleneimine for production of galactooligosaccharide. Biotechnology and Bioprocess Engineering 15 (6), 1006-1015.

Hamed, R.B., Gomez-Castellanos, J.R., Henry, L., Ducho, C., McDonough, M.A., Schofield, C.J., 2013. The enzymes of [small beta]-lactam biosynthesis. Natural Product Reports 30 (1), 21-107.

Han, W.-C., Sun-Ho Byun, Mi-Hyun Kim, Eun Hwa Sohn, Jung Dae Lim, Byung Hun Um, Chul Ho Kim, Soon Ah Kang, and Ki-Hyo Jang, 2009. Production of Lactosucrose from Sucrose and Lactose by a Levansucrase from Zymomonas mobilis. Journal of Microbiology and Biotechnology 19, 1153–1160.

Honda K1, M.T., Kuroki F, Iida M, Oka M, Sawatani I, 1999. Protective effect of lactosucrose on intracolonic indomethacin-induced small-intestinal ulcers in rats. Scandinavian Journal of Gastroenterology 34 (3), 264-269.

Hu, Z.-C., Korus, R., Stormo, K., 1993. Characterization of immobilized enzymes in polyurethane foams in a dynamic bed reactor. Applied Microbiology and Biotechnology 39 (3), 289-295.

Huang, L., Kruk, M., 2012. Synthesis of ultra-large-pore FDU-12 silica using ethylbenzene as micelle expander. Journal of Colloid and Interface Science 365 (1), 137-142.

Hudson, S., Magner, E., Cooney, J., Hodnett, B.K., 2005. Methodology for the Immobilization of Enzymes onto Mesoporous Materials. The Journal of Physical Chemistry B 109 (41), 19496-19506.

Huerta, L.M., Vera, C., Guerrero, C., Wilson, L., Illanes, A., 2011. Synthesis of galacto-oligosaccharides at very high lactose concentrations with immobilized β-galactosidases from Aspergillus oryzae. Process Biochemistry 46 (1), 245-252.

Humphrey, H.P., Wright, P.A., 2004. Nanoporous materials as supports for enzyme immobilization. In: Lu, G.Q.Z., X.S. (Ed.), Nanoporous Materials - Science and Engineering. World Scientific, pp. 849-872.

Husain, Q., 2010. β Galactosidases and their potential applications: a review. Critical Reviews in Biotechnology 30 (1), 41–62.

Husain, Q., Ansari, S.A., Alam, F., Azam, A., 2011. Immobilization of Aspergillus oryzae β galactosidase on zinc oxide nanoparticles via simple adsorption mechanism. International Journal of Biological Macromolecules 49 (1), 37-43.

148

Hussein, H.S., Flickinger, E.A., Fahey, G.C., 1999. Petfood Applications of Inulin and Oligofructose. The Journal of Nutrition 129 (7), 1454S-1456s.

Irazoqui, G., Giacomini, C., Batista-Viera, F., Brena, B.M., Cardelle-Cobas, A., Corzo, N., Jimeno, M.L., 2009. Characterization of Galactosyl Derivatives Obtained by Transgalactosylation of Lactose and Different Polyols Using Immobilized β-Galactosidase from Aspergillus oryzae. Journal of Agricultural and Food Chemistry 57 (23), 11302-11307.

Ito, M., Kimura, M., 1993. Influence of Lactose on Faecal Microflora in Lactose Maldigestors. Microbial Ecology in Health and Disease 6 (2), 73-76.

Joiner, B.L., Rosenblatt, J.R., 1971. Some Properties of the Range in Samples from Tukey's Symmetric Lambda Distributions. Journal of the American Statistical Association 66 (334), 394-399.

Kannan, K., Jasra, R.V., 2009. Immobilization of alkaline serine endopeptidase from Bacillus licheniformis on SBA-15 and MCF by surface covalent binding. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 56 (1), 34-40.

Kawase, M., Pilgrim, A., Araki, T., Hashimoto, K., 2001. Lactosucrose production using a simulated moving bed reactor. Chemical Engineering Science 56 (2), 453-458.

Kim, J., Jia, H., Lee, C.-w., Chung, S.-w., Kwak, J.H., Shin, Y., Dohnalkova, A., Kim, B.-G., Wang, P., Grate, J.W., 2006. Single enzyme nanoparticles in nanoporous silica: A hierarchical approach to enzyme stabilization and immobilization. Enzyme and Microbial Technology 39 (3), 474-480.

Kim, M.I., Kim, J., Lee, J., Jia, H., Na, H.B., Youn, J.K., Kwak, J.H., Dohnalkova, A., Grate, J.W., Wang, P., Hyeon, T., Park, H.G., Chang, H.N., 2007. Crosslinked enzyme aggregates in hierarchically-ordered mesoporous silica: A simple and effective method for enzyme stabilization. Biotechnology and Bioengineering 96 (2), 210-218.

Kim, M.I., Kim, J., Lee, J., Shin, S., Na, H.B., Hyeon, T., Park, H.G., Chang, H.N., 2008. One-dimensional crosslinked enzyme aggregates in SBA-15: Superior catalytic behavior to conventional enzyme immobilization. Microporous and Mesoporous Materials 111 (1–3), 18-23.

Kosikowski, F.V., 1979. Whey Utilization and Whey Products. Journal of Dairy Science 62 (7), 1149-1160.

Kruk, M., Hui, C.M., 2008. Synthesis and characterization of large-pore FDU-12 silica. Microporous and Mesoporous Materials 114 (1-3), 64-73.

Lee, C.H., Lin, T.S., Mou, C.Y., 2009. Mesoporous materials for encapsulating enzymes. Nano Today 4 (2), 165-179.

Lee, J., Kim, J., Kim, J., Jia, H., Kim, M.I., Kwak, J.H., Jin, S., Dohnalkova, A., Park, H.C., Chang, H.N., Wang, P., Grate, J.W., Hyeon, T., 2005. Simple synthesis of hierarchically ordered mesocellular mesoporous silica materials hosting crosslinked enzyme aggregates. Small 1 (7), 744-753.

Li, W., Xiang, X., Tang, S., Hu, B., Tian, L., Sun, Y., Ye, H., Zeng, X., 2009. Effective Enzymatic Synthesis of Lactosucrose and Its Analogues by β-d-Galactosidase from Bacillus circulans. Journal of Agricultural and Food Chemistry 57 (9), 3927-3933.

López-Gallego, F., Betancor, L., Mateo, C., Hidalgo, A., Alonso-Morales, N., Dellamora-Ortiz, G., Guisán, J.M., Fernández-Lafuente, R., 2005. Enzyme stabilization by glutaraldehyde crosslinking of adsorbed proteins on aminated supports. Journal of Biotechnology 119 (1), 70-75.

Luckarift -Heather, R., Spain- Jim, C., 2008. Continuous-Flow Applications of Silica-Encapsulated Enzymes. In, Biomolecular Catalysis. American Chemical Society, pp. 243-253.

149

Lynch, J., 2001. ANALYSE PHYSICO-CHIMIQUE DES CATALYSEURS INDUSTRIELS: MANUEL PRATIQUE DE CARACTÉRISATION. In: Bartling, S., Friesike, S. (Eds.), Opening Science. Springer International Publishing.

Marriott, B., 2000. Functional Foods: an Ecologic Perspective. Am J Clin Nutr 71(6 Suppl), 1728S-1734S.

Martínez-Villaluenga, C., Cardelle-Cobas, A., Corzo, N., Olano, A., Villamiel, M., 2008. Optimization of conditions for galactooligosaccharide synthesis during lactose hydrolysis by β-galactosidase from Kluyveromyces lactis (Lactozym 3000 L HP G). Food Chemistry 107 (1), 258-264.

Mawson, A.J., 1994. Bioconversions for whey utilization and waste abatement. Bioresource Technology 47 (3), 195-203.

McDonald, N., Novembre 2006. Profil sectoriel: le fromage. Agriculture et agroalimentaire canada; Centre canadien d’information laitière (CCIL); Euromonitor, Dairy Products in Canada, février 2006; Faostat; Global Trade Atlas, novembre 2006; Commission canadienne du lait, Ingrédients laitiers; Statistique Canada.

Menrad, K., 2003. Market and marketing of functional food in Europe. Journal of Food Engineering 56 (2–3), 181-188.

Mizote, A., Taniguchi, Y., Takei, Y., Koya-Miyata, S., Kohno, K., Iwaki, K., Kurose, M., Oku, K., Chaen, H., Fukuda, S., 2009. Lactosucrose Inhibits Body Fat Accumulation in Rats by Decreasing Intestinal Lipid Absorption. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 73 (3), 582-587.

Mohy Eldin, M.S., El-Aassar, M.R., El. Zatahry, A.A., Al-Sabah, M.M.B., 2014. Covalent Immobilization of β-Galactosidase onto Amino-Functionalized Polyvinyl Chloride Microspheres: Enzyme Immobilization and Characterization. Advances in Polymer Technology 33 (1), n/a-n/a.

Mu, W., Chen, Q., Wang, X., Zhang, T., Jiang, B., 2013. Current studies on physiological functions and biological production of lactosucrose. Applied Microbiology and Biotechnology 97 (16), 7073-7080.

Mussatto, S.I., Mancilha, I.M., 2007. Non-digestible oligosaccharides: A review. Carbohydrate Polymers 68 (3), 587-597.

Neri, D.F.M., Balcão, V.M., Cardoso, S.M., Silva, A.M.S., Domingues, M.D.R.M., Torres, D.P.M., Rodrigues, L.R.M., Carvalho, L.B., Teixeira, J.A.C., 2011. Characterization of galactooligosaccharides produced by β-galactosidase immobilized onto magnetized Dacron. International Dairy Journal 21 (3), 172-178.

Ohkusa, T.O., Yoshinori; Sato, Chifui; Mikuni, Katsuhiko; Ikeda, Hiroshi, 1995. Long-term ingestion of lactosucrose increases Bifidobacterium sp in human fecal flora. Digestion 56, 415–420.

Oliveira, C., Guimarães, P.M.R., Domingues, L., 2011. Recombinant microbial systems for improved β-galactosidase production and biotechnological applications. Biotechnology Advances 29 (6), 600-609.

Pandya, P.H., Jasra, R.V., Newalkar, B.L., Bhatt, P.N., 2005. Studies on the activity and stability of immobilized α-amylase in ordered mesoporous silicas. Microporous and Mesoporous Materials 77 (1), 67-77.

Panesar, P.S., Kennedy, J.F., 2012. Biotechnological approaches for the value addition of whey. Critical Reviews in Biotechnology 32 (4), 327-348.

Panesar, P.S., Kumari, S., Panesar, R., 2010. Potential applications of immobilized β-galactosidase in food processing industries. Enzyme Research 2010.

150

Panesar, P.S., Panesar, R., Singh, R.S., Kennedy, J.F., Kumar, H., 2006. Microbial production, immobilization and applications of β-D-galactosidase. Journal of Chemical Technology & Biotechnology 81 (4), 530-543.

Parhi, P., Manivannan, V., Kohli, S., McCurdy, P., 2008. Synthesis and characterization of M3V2O8 (M = Ca, Sr and Ba) by a solid-state metathesis approach. Bulletin of Materials Science 31 (6), 885-890.

Park, Y.K., De Santi, M.S.S., Pastore, G.M., 1979. Production and characteriza of β-galactosidase from aspergillus oryzae. Journal of Food Science 44 (1), 100-103.

Pereira-Rodríguez, Á., Fernández-Leiro, R., González-Siso, M.I., Cerdán, M.E., Becerra, M., Sanz-Aparicio, J., 2012. Structural basis of specificity in tetrameric Kluyveromyces lactis β-galactosidase. Journal of Structural Biology 177 (2), 392-401.

Qiang, X., YongLie, C., QianBing, W., 2009. Health benefit application of functional oligosaccharides. Carbohydrate Polymers 77 (3), 435-441.

Richmond, M.L., Gray, J.I., Stine, C.M., 1981. Beta-Galactosidase: Review of Recent Research Related to Technological Application, Nutritional Concerns, and Immobilization. Journal of Dairy Science 64 (9), 1759-1771.

Sako, T., Matsumoto, K., Tanaka, R., 1999. Recent progress on research and applications of non-digestible galacto-oligosaccharides. International Dairy Journal 9 (1), 69-80.

Salis, A., Meloni, D., Ligas, S., Casula, M.F., Monduzzi, M., Solinas, V., Dumitriu, E., 2005. Physical and Chemical Adsorption of Mucor javanicus Lipase on SBA-15 Mesoporous Silica. Synthesis, Structural Characterization, and Activity Performance. Langmuir 21 (12), 5511-5516.

Schmidt-Winkel, P., Lukens, W.W., Zhao, D., Yang, P., Chmelka, B.F., Stucky, G.D., 1999. Mesocellular Siliceous Foams with Uniformly Sized Cells and Windows. Journal of the American Chemical Society 121 (1), 254-255.

Schmidt-Winkel, P., Lukens, W.W., Zhao, D., Yang, P., Chmelka, B.F., Stucky, G.D., 1998. Mesocellular Siliceous Foams with Uniformly Sized Cells and Windows. Journal of the American Chemical Society 121 (1), 254-255.

Seki, N., Saito, H., 2012. Lactose as a source for lactulose and other functional lactose derivatives. International Dairy Journal 22 (2), 110-115.

Sheik-Asraf, S., Gunasekaran, P., 2010. Current trends of ß-galactosidase research and application. Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology, 2 (Antonio Mendez Vilas (Ed.)), 880-890.

Siso, M.I.G., 1996. The biotechnological utilization of cheese whey: A review. Bioresource Technology 57 (1), 1-11.

Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., Klenk, D.C., 1985. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry 150 (1), 76-85.

Smithers, G.W., 2008. Whey and whey proteins—From ‘gutter-to-gold’. International Dairy Journal 18 (7), 695-704.

Smithers, G.W., John Ballard, F., Copeland, A.D., de Silva, K.J., Dionysius, D.A., Francis, G.L., Goddard, C., Grieve, P.A., McIntosh, G.H., Mitchell, I.R., Pearce, R.J., Regester, G.O., 1996. New Opportunities from the Isolation and Utilization of Whey Proteins. Journal of Dairy Science 79 (8), 1454-1459.

Takahashi, H., Miyazaki-Imamura, C., 2008. Enzyme Stabilization Involving Molecular Evolution and Immobilization in Mesoporous Materials. In, Biomolecular Catalysis. American Chemical Society, pp. 61-75.

151

Terada, A., Hara, H., Oishi, T., Matsui, S., Mitsuoka, T., Nakajyo, S., Fujimori, I., Hara, K., 1992. Effect of Dietary Lactosucrose on Faecal Flora and Faecal Metabolites of Dogs. Microbial Ecology in Health and Disease 5 (2), 87-92.

Teramoto, F., Rokutan, K., Kawakami, Y., Fujimura, Y., Uchida, J., Oku, K., Oka, M., Yoneyama, M., 1996. Effect of 4G-β-D-galactosylsucrose (lactosucrose) on fecal microflora in patients with chronic inflammatory bowel disease. Journal of Gastroenterology 31 (1), 33-39.

Teramoto, F., Rokutan, K., Sugano, Y., Oku, K., Kishino, E., Fujita, K., Hara, K., Kishi, K., Fukunaga, M., Morita, T., 2006. Long-Term Administration of 4G-β -D-Galactosylsucrose (Lactosucrose) Enhances Intestinal Calcium Absorption in Young Women: A Randomized, Placebo-Controlled 96-wk Study. Journal of Nutritional Science and Vitaminology 52 (5), 337-346.

Torres, D.P.M., Gonçalves, M.d.P.F., Teixeira, J.A., Rodrigues, L.R., 2010. Galacto-Oligosaccharides: Production, Properties, Applications, and Significance as Prebiotics. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 9 (5), 438-454.

Trevisan, H.C., Bergamo, E.P., Contiero, J., Hojo, O., Mont, R., 1997. β-galactosidase immobilization on controlled pore silica. Brazilian Journal of Chemical Engineering 14 (4), 315-319.

Urrego, S., Serra, E., Alfredsson, V., Blanco, R.M., Díaz, I., 2010. Bottle-around-the-ship: A method to encapsulate enzymes in ordered mesoporous materials. Microporous and Mesoporous Materials 129 (1–2), 173-178.

Urrutia, P., Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A.O., Wilson, L., Illanes, A., Plou, F.J., 2013. Detailed Analysis of Galactooligosaccharides Synthesis with β-Galactosidase from Aspergillus oryzae. Journal of Agricultural and Food Chemistry 61 (5), 1081-1087.

Vera, C., Guerrero, C., Illanes, A., 2011. Determination of the transgalactosylation activity of Aspergillus oryzae β-galactosidase: effect of pH, temperature, and galactose and glucose concentrations. Carbohydrate Research 346 (6), 745-752.

Vilain, A.-C., 2010. Qu'est-ce que le lait ? = What's milk? Revue française d'allergologie 50 (3), 124-127.

Vinu, A., Murugesan, V., Tangermann, O., Hartmann, M., 2004. Adsorption of Cytochrome c on Mesoporous Molecular Sieves: Influence of pH, Pore Diameter, and Aluminum Incorporation. Chemistry of Materials 16 (16), 3056-3065.

Wu, Z., Wang, Z., Guan, B., Wang, X., Zhang, Y., Xiao, Y., Zhi, B., Liu, Y., Li, Z., Huo, Q., 2013. Improving the properties of [small beta]-galactosidase from Aspergillus oryzae via encapsulation in aggregated silica nanoparticles. New Journal of Chemistry 37 (11), 3793-3797.

Yiu, H.H.P., Wright, P.A., 2005. Enzymes supported on ordered mesoporous solids: a special case of an inorganic-organic hybrid. Journal of Materials Chemistry 15 (35-36), 3690-3700.

Zhang, N., Cao, J., Peng, Z., 2001. Characteristics of β-D-fructofurannosidase in Organic Solvent-water Biphasic System. Food and Fermentation Industries.

Zhang Ning, Cao Jinsong, Zhiying, P., 2001. Characteristics of β-D-fructofurannosidase in Organic Solvent-water Biphasic System. Food and Fermentation Industries.

Zhang Ning, Cao Jinsong, Zhiying, P., 2001. Characteristics of β-D-fructofurannosidase in Organic Solvent-water Biphasic System. Food and Fermentation Industries 49, 122-127.

Zhao, D., Feng, J., Huo, Q., Melosh, N., Fredrickson, G.H., Chmelka, B.F., Stucky, G.D., 1998. Triblock Copolymer Syntheses of Mesoporous Silica with Periodic 50 to 300 Angstrom Pores. Science 279 (5350), 548-552.

152

Zhao, X., 2006. Synthesis and characterization of a novel hyaluronic acid hydrogel. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition 17 (4), 419-433.

Zhou, G., Chen, Y., Yang, J., Yang, S., 2007. From cylindrical-channel mesoporous silica to vesicle-like silica with well-defined multilamella shells and large inter-shell mesopores. Journal of Materials Chemistry 17 (27), 2839-2844.

Zhou, G., Chen, Y., Yang, S., 2009. Comparative studies on catalytic properties of immobilized Candida rugosa lipase in ordered mesoporous rod-like silica and vesicle-like silica. Microporous and Mesoporous Materials 119 (1–3), 223-229.

Zhou, Q.Z.K., Chen, X.D., 2001. Effects of temperature and pH on the catalytic activity of the immobilized β-galactosidase from Kluyveromyces lactis. Biochemical Engineering Journal 9 (1), 33-40.

153

Annexes

Annexe 1 : La présence de glucose et de galactose seulement à la fin de la réaction (l’hydrolyse de tous les

produits)

154

Annexe 2: Les résultats de SAS pour l’effet de pH sur la rétention des matériaux.

Fichier de données phm

Obs mat pH rep ret

1 1 5.0 1 93.7

2 1 5.0 2 94.1

3 1 5.0 3 94.1

4 1 7.0 1 77.0

5 1 7.0 2 58.6

6 1 7.0 3 69.7

7 1 3.5 1 89.2

8 1 3.5 2 90.9

9 1 3.5 3 90.8

10 2 5.0 1 80.5

11 2 5.0 2 89.8

12 2 5.0 3 85.0

13 2 7.0 1 63.7

14 2 7.0 2 67.4

15 2 7.0 3 67.4

16 2 3.5 1 85.2

17 2 3.5 2 85.2

18 2 3.5 3 89.5

19 3 5.0 1 93.7

20 3 5.0 2 95.3

21 3 5.0 3 89.1

22 3 7.0 1 72.1

23 3 7.0 2 78.0

24 3 7.0 3 80.0

25 3 3.5 1 90.2

155

Obs mat pH rep ret

26 3 3.5 2 89.9

27 3 3.5 3 91.3

28 4 5.0 1 96.7

29 4 5.0 2 96.8

30 4 5.0 3 89.9

31 4 7.0 1 73.0

32 4 7.0 2 57.9

33 4 7.0 3 69.8

34 4 3.5 1 95.6

35 4 3.5 2 94.0

36 4 3.5 3 92.8

37 5 5.0 1 98.8

38 5 5.0 2 91.8

39 5 5.0 3 99.4

40 5 7.0 1 78.2

41 5 7.0 2 76.7

42 5 7.0 3 71.9

43 5 3.5 1 88.9

44 5 3.5 2 90.6

45 5 3.5 3 89.8

46 6 5.0 1 90.4

47 6 5.0 2 94.4

48 6 5.0 3 96.2

49 6 7.0 1 77.2

50 6 7.0 2 75.4

51 6 7.0 3 81.0

52 6 3.5 1 91.5

53 6 3.5 2 90.7

54 6 3.5 3 92.9

55 7 5.0 1 87.6

56 7 5.0 2 93.7

156

Obs mat pH rep ret

57 7 5.0 3 96.8

58 7 7.0 1 62.6

59 7 7.0 2 76.5

60 7 7.0 3 78.4

61 7 3.5 1 89.9

62 7 3.5 2 91.2

63 7 3.5 3 90.2

Comparaisaon des materiaux en fonction du pH

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

rep 3 1 2 3

mat 7 1 2 3 4 5 6 7

pH 3 3.5 5 7

Number of Observations Read 63

Number of Observations Used 63


The GLM Procedure

Dependent Variable: ret

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 20 6186.002222 309.300111 17.45 <.0001

Error 42 744.560000 17.727619

Corrected Total 62 6930.562222

R-Square Coeff Var Root MSE ret Mean

0.892569 4.948258 4.210418 85.08889

157

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F

mat 6 438.793333 73.132222 4.13 0.0024

pH 2 5430.653651 2715.326825 153.17 <.0001

mat*pH 12 316.555238 26.379603 1.49 0.1671

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

mat 6 438.793333 73.132222 4.13 0.0024

pH 2 5430.653651 2715.326825 153.17 <.0001

mat*pH 12 316.555238 26.379603 1.49 0.1671

158


The GLM Procedure

159


The GLM Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for ret

Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally has a higher Type II error rate than REGWQ.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 42

Error Mean Square 17.72762

Critical Value of Studentized Range 4.37776

Minimum Significant Difference 6.1441

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N mat

A 87.744 9 6

A

A 87.344 9 5

A

A 86.622 9 3

A

B A 85.211 9 7

B A

B A 85.167 9 4

B A

B A 84.233 9 1

B

B 79.300 9 2

160


The GLM Procedure


The GLM Procedure


Alpha 0.05






Tukey Grouping Mean N pH

161


Tukey Grouping Mean N pH

A 92.752 21 5

A

A 90.490 21 3.5

B 72.024 21 7

Vérification de la normalité des résidus

The UNIVARIATE Procedure Variable: rret

Moments

N 63 Sum Weights 63

Mean 0 Sum Observations 0

Std Deviation 1.00803226 Variance 1.01612903

Skewness -0.7307808 Kurtosis 1.56679638

Uncorrected SS 63 Corrected SS 63

Coeff Variation . Std Error Mean 0.12700013

Basic Statistical Measures

Location Variability

Mean 0.00000 Std Deviation 1.00803

Median 0.14544 Variance 1.01613

Mode -1.33807 Range 5.37167

Interquartile Range 1.03749

Note: The mode displayed is the smallest of 4 modes with a count of 2.

162

Tests for Location: Mu0=0

Test Statistic p Value

Student's t t 0 Pr > |t| 1.0000

Sign M 3.5 Pr >= |M| 0.4500

Signed Rank S 103 Pr >= |S| 0.4851

Tests for Normality


Shapiro-Wilk W 0.944001 Pr < W 0.0064

Kolmogorov-Smirnov D 0.13323 Pr > D <0.0100

Cramer-von Mises W-Sq 0.214887 Pr > W-Sq <0.0050

Anderson-Darling A-Sq 1.226921 Pr > A-Sq <0.0050

Quantiles (Definition 5)

Quantile Estimate

100% Max 2.491910

99% 2.491910

95% 1.367157

90% 0.959919

75% Q3 0.649642

50% Median 0.145442

25% Q1 -0.387846

10% -1.338068

5% -1.483510

1% -2.879756

0% Min -2.879756

Extreme Observations

Lowest Highest

Value Obs Value Obs

-2.87976 58 1.19263 57

-2.86036 5 1.36716 11

-2.61796 32 1.71622 60

163


Lowest Highest

Value Obs Value Obs

-1.48351 55 1.77439 31

-1.41564 38 2.49191 4

Stem Leaf # Boxplot

2 5 1 0

2

1 78 2 |

1 0224 4 |

0 6677888889 10 +-----+

0 000122222333344444 18 *--+--*

-0 444333222111100 15 +-----+

-0 77 2 |

-1 4333100 7 |

-1 5 1 |

-2

-2 996 3 0

----+----+----+----+

Normal Probability Plot

2.75+ +

| +++*+

| ++*+*

| +++*+**

| +********

| ********

| *******+

| ***+++

| **+****

| +++++

| +++++

-2.75++ * * *

+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+

-2 -1 0 +1 +2

164

Annexe 3 : Résultats de SAS pour l’effet de Concentration d’enzyme sur la rétention

Fichier de données Ezm

Obs mat Ez rep ret

1 1 25 1 93.2

2 1 25 2 95.2

3 1 25 3 94.1

4 1 60 1 94.0

5 1 60 2 93.7

6 1 60 3 92.8

7 1 75 1 94.4

8 1 75 2 93.6

9 1 75 3 94.2

10 1 100 1 93.6

11 1 100 2 91.8

12 1 100 3 94.1

13 2 25 1 90.5

14 2 25 2 91.8

15 2 25 3 93.2

16 2 60 1 89.8

17 2 60 2 93.8

18 2 60 3 91.5

19 2 75 1 94.6

20 2 75 2 94.0

21 2 75 3 92.8

22 2 100 1 93.6

23 2 100 2 91.5

24 2 100 3 90.4

25 3 25 1 82.6

26 3 25 2 86.1

165

Obs mat Ez rep ret

27 3 25 3 84.6

28 3 60 1 85.3

29 3 60 2 93.6

30 3 60 3 92.6

31 3 75 1 96.1

32 3 75 2 94.2

33 3 75 3 94.3

34 3 100 1 95.6

35 3 100 2 94.8

36 3 100 3 93.9

37 4 25 1 87.5

38 4 25 2 90.2

39 4 25 3 89.0

40 4 60 1 96.7

41 4 60 2 93.9

42 4 60 3 92.8

43 4 75 1 97.2

44 4 75 2 96.3

45 4 75 3 96.9

46 4 100 1 95.9

47 4 100 2 96.5

48 4 100 3 94.8

49 5 25 1 88.2

50 5 25 2 88.7

51 5 25 3 89.3

52 5 60 1 96.7

53 5 60 2 97.3

54 5 60 3 95.6

55 5 75 1 93.7

166

Obs mat Ez rep ret

56 5 75 2 93.2

57 5 75 3 93.3

58 5 100 1 94.7

59 5 100 2 93.9

60 5 100 3 94.8

61 6 25 1 92.1

62 6 25 2 91.4

63 6 25 3 91.7

64 6 60 1 96.2

65 6 60 2 95.1

66 6 60 3 95.4

67 6 75 1 94.2

68 6 75 2 93.9

69 6 75 3 94.5

70 6 100 1 95.0

71 6 100 2 93.9

72 6 100 3 94.5

73 7 25 1 83.1

74 7 25 2 87.9

75 7 25 3 91.2

76 7 60 1 96.8

77 7 60 2 94.5

78 7 60 3 92.5

79 7 75 1 97.7

80 7 75 2 96.1

81 7 75 3 95.6

82 7 100 1 95.8

83 7 100 2 94.0

84 7 100 3 94.1

167

Comparaisaon des materiaux en fonction de Ez

The GLM Procedure


Class Levels Values

rep 3 1 2 3

mat 7 1 2 3 4 5 6 7

Ez 4 25 60 75 100




The GLM Procedure



Model 27 684.1995238 25.3407231 10.09 <.0001

Error 56 140.6400000 2.5114286



0.829494 1.702244 1.584749 93.09762


mat 6 78.0478571 13.0079762 5.18 0.0003

Ez 3 352.6376190 117.5458730 46.80 <.0001

mat*Ez 18 253.5140476 14.0841138 5.61 <.0001


mat 6 78.0478571 13.0079762 5.18 0.0003

Ez 3 352.6376190 117.5458730 46.80 <.0001

mat*Ez 18 253.5140476 14.0841138 5.61 <.0001

169


The GLM Procedure


The GLM Procedure


Alpha 0.05





170

Means with the same letter

are not significantly different.


A 93.9917 12 6

A

A 93.9750 12 4

A

A 93.7250 12 1

A

A 93.2833 12 5

A

A 93.2750 12 7

A

B A 92.2917 12 2

B

B 91.1417 12 3

171


The GLM Procedure

172


The GLM Procedure



Alpha 0.05







Tukey Grouping Mean N Ez

A 94.8000 21 75

A

A 94.1524 21 100

A

A 93.8381 21 60

B 89.6000 21 25

173


The GLM Procedure

Level of

mat

Level of

Ez

N ret

Mean Std Dev

1 25 3 94.1666667 1.00166528

1 60 3 93.5000000 0.62449980

1 75 3 94.0666667 0.41633320

1 100 3 93.1666667 1.20968315

2 25 3 91.8333333 1.35030861

2 60 3 91.7000000 2.00748599

2 75 3 93.8000000 0.91651514

2 100 3 91.8333333 1.62583312

3 25 3 84.4333333 1.75594229

174

Level of

mat

Level of

Ez

N ret

Mean Std Dev

3 60 3 90.5000000 4.53100430

3 75 3 94.8666667 1.06926766

3 100 3 94.7666667 0.85049005

4 25 3 88.9000000 1.35277493

4 60 3 94.4666667 2.01080415

4 75 3 96.8000000 0.45825757

4 100 3 95.7333333 0.86216781

5 25 3 88.7333333 0.55075705

5 60 3 96.5333333 0.86216781

5 75 3 93.4000000 0.26457513

5 100 3 94.4666667 0.49328829

6 25 3 91.7333333 0.35118846

6 60 3 95.5666667 0.56862407

6 75 3 94.2000000 0.30000000

6 100 3 94.4666667 0.55075705

7 25 3 87.4000000 4.07308237

7 60 3 94.6000000 2.15174348

7 75 3 96.4666667 1.09696551

7 100 3 94.6333333 1.01159939

175

Vérification de l'homogénéité des variances

Plot of rret*pret. Legend: A = 1 obs, B = 2 obs, etc.

rret |

|

5.0 +

|

|

| A

2.5 + A

| A A B

| A A B A A

| A A BA AA BA AA A

0.0 + A AA AE D AF DA AA AAB

| A A AB EC AA AAA

| A A AB A A

| A

-2.5 +

| A

| A

|

-5.0 +

|

--+----------+----------+----------+----------+----------+---------

-+--

82.5 85.0 87.5 90.0 92.5 95.0

97.5

pret

176


The UNIVARIATE Procedure

Variable: rret

Moments

N 84 Sum Weights 84









Median 0.01288 Variance 1.01205

Mode -0.43794 Range 6.95549






Sign M 0.5 Pr >= |M| 1.0000

Signed Rank S 15 Pr >= |S| 0.9462

Tests for Normality



Kolmogorov-Smirnov D 0.105473 Pr > D 0.0212

Cramer-von Mises W-Sq 0.252547 Pr > W-Sq <0.0050

Anderson-Darling A-Sq 1.538443 Pr > A-Sq <0.0050

177


Quantile Estimate

100% Max 2.9367624

99% 2.9367624

95% 1.6229476

90% 1.0562040

75% Q3 0.4250577

50% Median 0.0128805

25% Q1 -0.4379383

10% -1.0562040

5% -1.4168591

1% -4.0187275

0% Min -4.0187275


Lowest Highest

Value Obs Value Obs

-4.01873 28 1.62295 17

-3.32318 73 1.70023 76

-1.62295 78 1.72599 40

-1.46838 16 2.39578 29

-1.41686 25 2.93676 75

178

Stem Leaf # Boxplot

2 9 1 0

2 4 1 0

1 6677 4 0

1 000134 6 |

0 56666789 8 |

0 00011111122222333334444 23 +--+--+

-0 4444444443332221111000 22 +-----+

-0 877777555 9 |

-1 431110 6 |

-1 65 2 |

-2

-2

-3 3 1 *

-3

-4 0 1 *

----+----+----+----+---


2.75+ *+

| +*+++

| ***+*

| ++***

| +++****

| ********

| *********

-0.75+ ****+++

| ******++

| *++++

| +++++

|+

| *

|

-4.25+ *

+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+

-2 -1 0 +1 +2

179

Annexe 4 : Résultats de SAS pour l’effet de GA sur la rétention des enzymes

Fichier de données GAm

Obs mat GA rep ret

1 1 0.1 1 90.0

2 1 0.1 2 90.8

3 1 0.1 3 92.0

4 1 1.0 1 79.2

5 1 1.0 2 77.6

6 1 1.0 3 75.6

7 1 2.0 1 71.8

8 1 2.0 2 71.6

9 1 2.0 3 77.6

10 2 0.1 1 85.4

11 2 0.1 2 82.0

12 2 0.1 3 86.6

13 2 1.0 1 78.6

14 2 1.0 2 80.0

15 2 1.0 3 79.2

16 2 2.0 1 87.0

17 2 2.0 2 81.6

18 2 2.0 3 83.8

19 3 0.1 1 93.4

20 3 0.1 2 91.0

21 3 0.1 3 91.6

22 3 1.0 1 82.6

23 3 1.0 2 82.6

24 3 1.0 3 78.6

25 3 2.0 1 79.0

26 3 2.0 2 80.4

180

Obs mat GA rep ret

27 3 2.0 3 82.6

28 4 0.1 1 81.4

29 4 0.1 2 81.6

30 4 0.1 3 82.4

31 4 1.0 1 83.0

32 4 1.0 2 80.6

33 4 1.0 3 82.0

34 4 2.0 1 77.0

35 4 2.0 2 78.4

36 4 2.0 3 81.0

37 5 0.1 1 90.0

38 5 0.1 2 91.4

39 5 0.1 3 94.6

40 5 1.0 1 84.2

41 5 1.0 2 85.0

42 5 1.0 3 86.8

43 5 2.0 1 83.8

44 5 2.0 2 84.6

45 5 2.0 3 89.0

46 6 0.1 1 91.0

47 6 0.1 2 91.2

48 6 0.1 3 92.0

49 6 1.0 1 87.8

50 6 1.0 2 86.2

51 6 1.0 3 88.2

52 6 2.0 1 78.8

53 6 2.0 2 85.8

54 6 2.0 3 86.6

55 7 0.1 1 91.4

181

Obs mat GA rep ret

56 7 0.1 2 88.2

57 7 0.1 3 91.8

58 7 1.0 1 86.6

59 7 1.0 2 89.0

60 7 1.0 3 87.8

61 7 2.0 1 83.0

62 7 2.0 2 84.4

63 7 2.0 3 86.0

Comparaisaon des materiaux en fonction du GA

The GLM Procedure


Class Levels Values

rep 3 1 2 3

mat 7 1 2 3 4 5 6 7

GA 3 0.1 1 2




The GLM Procedure



Model 20 1576.816508 78.840825 18.80 <.0001

Error 42 176.106667 4.193016


182


0.899535 2.422705 2.047685 84.52063


mat 6 541.7942857 90.2990476 21.54 <.0001

GA 2 660.7098413 330.3549206 78.79 <.0001

mat*GA 12 374.3123810 31.1926984 7.44 <.0001


mat 6 541.7942857 90.2990476 21.54 <.0001

GA 2 660.7098413 330.3549206 78.79 <.0001

mat*GA 12 374.3123810 31.1926984 7.44 <.0001

183


The GLM Procedure

184


The GLM Procedure


Alpha 0.05








A 87.7111 9 5

A

B A 87.5778 9 7

B A

B A 87.5111 9 6

B

B C 84.6444 9 3

C

D C 82.6889 9 2

D

D 80.8222 9 4

D

D 80.6889 9 1

185


The GLM Procedure

186


The GLM Procedure



Alpha 0.05







Tukey Grouping Mean N GA

A 89.0381 21 0.1

B 82.9143 21 1

B

B 81.6095 21 2

187


The GLM Procedure

Level of

mat

Level of

GA

N ret

Mean Std Dev

1 0.1 3 90.9333333 1.00664459

1 1 3 77.4666667 1.80369990

1 2 3 73.6666667 3.40783411

2 0.1 3 84.6666667 2.38607069

2 1 3 79.2666667 0.70237692

2 2 3 84.1333333 2.71538825

3 0.1 3 92.0000000 1.24899960

3 1 3 81.2666667 2.30940108

3 2 3 80.6666667 1.81475435

188

Level of

mat

Level of

GA

N ret

Mean Std Dev

4 0.1 3 81.8000000 0.52915026

4 1 3 81.8666667 1.20554275

4 2 3 78.8000000 2.02977831

5 0.1 3 92.0000000 2.35796522

5 1 3 85.3333333 1.33166562

5 2 3 85.8000000 2.80000000

6 0.1 3 91.4000000 0.52915026

6 1 3 87.4000000 1.05830052

6 2 3 83.7333333 4.29107601

7 0.1 3 90.4666667 1.97315314

7 1 3 87.8000000 1.20000000

7 2 3 84.4666667 1.50111070

Vérification de l'homogénéité des variances


The UNIVARIATE Procedure

Variable: rret

Moments

N 63 Sum Weights 63






189




Median -0.07975 Variance 1.01613

Mode -1.59496 Range 5.30326






Sign M -2.5 Pr >= |M| 0.6147

Signed Rank S -4 Pr >= |S| 0.9784

Tests for Normality



Kolmogorov-Smirnov D 0.056991 Pr > D >0.1500

Cramer-von Mises W-Sq 0.030067 Pr > W-Sq >0.2500

Anderson-Darling A-Sq 0.201602 Pr > A-Sq >0.2500


Quantile Estimate

100% Max 2.3525731

99% 2.3525731

95% 1.7145872

90% 1.2360977

75% Q3 0.7974824

50% Median -0.0797482

25% Q1 -0.7177342

10% -1.1962236

190


Quantile Estimate

5% -1.5152166

1% -2.9506849

0% Min -2.9506849


Lowest Highest

Value Obs Value Obs

-2.95068 52 1.55509 39

-1.59496 24 1.71459 54

-1.59496 11 1.71459 16

-1.51522 17 1.91396 45

-1.35572 56 2.35257 9

191

Stem Leaf # Boxplot

2 4 1 |

1 6779 4 |

1 02223 5 |

0 56677888899 11 +-----+

0 01124444 8 | + |

-0 44222222211100 14 *-----*

-0 98777766 8 +-----+

-1 42221110 8 |

-1 665 3 |

-2 |

-2 |

-3 0 1 |

----+----+----+----+


2.25+ +++*+

| ***+*

| ****+

| ******

| +*****

| *******

| *****

| *+****

| *+**+

| +++++

|+ *

-3.25+

+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+

-2 -1 0 +1 +2

Biosynthèse du lactosucrose à partir du lactose et du saccharose ...

Documents

Transcript of Biosynthèse du lactosucrose à partir du lactose et du saccharose ...