1. INTRODUCTION Previous studies suggested that stimulation of 1- adrenoceptors enhances proliferation not only in somatic cells such as vascular muscle cells or adventitial but also in undifferentiated stem cells such as mouse induced pluripotent stem cells. 1-Adrenoceptors are Gq coupled receptors. Other Gq-coupled receptors such as angiotensin type 1 receptor are known to enhance cell growth in undifferentiated stem cells 2. INTRODUCTION Theres a lot of studies that have shown the mechanism proliferation of iPS, However, it remains unclear whether a signaling pathway downstream of Gq-coupled receptors is involved in proliferation of human iPS cells. In addition, no studies have shown whether human iPS cells express 1-adrenoceptors or AT1 receptor. 3. ANGIOTENSINE T1 RECEPTOR AT 1 4. ANGIOTENSINE T1 RECEPTOR AT 1 Vasoconstriction Aldosterone and vasopressin secretion Vascular smooth muscle cells proliferation Cardiac contractility Human cultured breast epithelial cells 5. ALPHA 1- ADRENOCEPTOR 6. ALPHA 1- ADRENOCEPTOR 7. STEM CELL Stem cells are a class of undifferentiated cells that are able to differentiate into specialized cell types. Commonly, stem cells come from two main sources: Embryos formed during the blastocyst phase of embryological development (embryonic stem cells) Adult tissue (adult stem cells). 8. OBJECTIVE To reveal the expression of alpha 1- adrenoceptor and AT1 receptor in human IPS cells and their involvement in DNA synthesis. To future regenerative therapy. 9. MATERIALES Y METODOS L-fenilefrina agonista selectivo de los alfa 1 adrenoceptor 5methylurapidil antagonista selectivo de los receptores adrenrgicos 1a cloroetilclonidina antagonista selectivo de los receptores adrenrgicos 1b pyridine-6- carboxylic acid antagonista selectivo del receptor angiotensina 2 inhibidor de la PKC factor de crecimiento epidrmico recombinante humano (EGF) 10. MATERIALES Y METODOS La prazosina antagonista de los receptores adrenrgicos 1 El candesartn un antagonista selectivo del receptor AT1 Telmi-sartan antagonista selectivo del receptor AT1 Bisin- dolylmaleimide I un inhibidor de la PKC LY294002 (2 - (4- morpholi-nilo)-8-fenil-1 (4H) - benzopiran-4- ona) inhibidor PI3K 11. CULTIVOS DE CLULAS IPS HUMANAS Las Clulas iPS humanas se expandieron en MEFs tratadas en placas de cultivo recubiertas con gelatina al 0,1% a 37 C en un entorno de 5% de CO2. El medio de cultivo contiene 20% de suero knock out , 0,1 mM de aminocidos no esenciales (Invitrogen) penicilina y estreptomicina (Invitrogen), 500ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos recombinante humano BFGF. 12. Para eliminar MEFs contaminadas, las colonias de clulas iPS se pasaron hasta 4 veces sin clulas alimentadoras en placas de cultivo de 60 mm recubiertas con Matrigel. las colonias de clulas se despegaron utilizando tripsina 0,25% de EDTA y luego se re-sembraron en placas a una densidad de 1,5 x 10(5) clulas/cm2. Despus de la incubacin durante 24 h, el medio de cultivo fue reemplazado por un medio de cultivo sin bFGF. 13. INMUNOFLUORESCENCIA luego de 24 h, las clulas fueron re-sembradas en portaobjetos revestidos con Matrigel y se fijaron con 4% de paraformaldehdo a 41C durante 30 min. Luego se les aadio 10% de suero bovino fetal en PBS, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-1- adrenoceptores en PBS a 4C durante la noche. Los portaobjetos se incubaron con anticuerpo anti-IgG conjugado con Alexa Fluor 594 (1:200; Invitrogen) en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. (5 PBS) 14. BrdU fue el enfoque utilizado para controlar la sntesis de ADNc. el ensayo inmunoenzimtico ELISA se realiz usando marcaje BrdU y kit de deteccin III para detectar la incorporacin de BrdU en el ADN celular. luego de 24 h de re-recubrir en Matrigel , las clulas se cultivaron en el medio de cultivo sin bFGF por 24 h y se trataron con o sin L-fenilefrina o Ang II. luego de 24 h de realizado el tratamiento, se aadi BrdU al medio de cultivo y se incorpora en el ADN recin sintetizado durante 2 h INCORPORACIN DE BrdU 15. Despus de la fijacin de clulas, se aadi un ac marcado con peroxidasa para BrdU. En el paso final, se aadi el sustrato de peroxidasa y la enzima catalizo la escisin de este, produciendo un producto coloreado. 16. WESTERN BLOT luego del tratamiento, las clulas fueron lisadas y luego centrifugadas, Los extractos de protenas se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno con un equipo de transferencia semiseca. se aplicaron anticuerpos en diluciones en PBS que contena suero de albmina bovina: a1a, b, d - adrenoceptor anti-humano,tecnologia de sealizacioncelular, Gq de conejo anti-humano. 17. Se aadi el respectivo anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa, y las protenas inmunorreactivas se visualizaron utilizando ECL Western Blotting Detection Kit. La densidad de las bandas se normaliz utilizando - actina como estndar interno. 18. ARN CORTO DE INTERFERENCIA Clulas iPS fueron transfectadas con los ARN interferentes cortos (siRNAs) mediante el uso de un agente de transfeccin. Un controlador siRNA, fue desarrollado para minimizar los efectos de off- target. Luego de la transfeccion las clulas crecieron por 24 hr y luego estimuladas con o sin l-phenylephrina, Ang 2. 19. RESULTADOS: FIG.1 20. RESULTADOS: FIG.1 21. RESULTADOS Efectos de los agonistas y antagonistas de los receptores 1-adrenergicos en la sntesis de DNA en clulas humanas iPS 22. RESULTADOS Efectos de los antagonistas de los receptores de angiotensina (AngII) en la sntesis de DNA en clulas humanas iPS 23. RESULTADOS 24. RESULTADOS 25. RESULTADOS: FIG.4 Relacion de la PKC, PI3K/Akt, y MEK/ERK en la sintesis de DNA de celulas humanas iPS inducidas por I- fenilefrina o AngII 26. RESULTADOS: FIG.5 Efectos de la Gq siRNA en la sntesis de DNA y la fosforilacion de Akt o p44/42 MAPK en clulas humanas iPS tratadas con I- fenilefrina o AngII 27. RESULTADOS: FIG.5 Efectos de la Gq siRNA en la sntesis de DNA y la fosforilacion de Akt o p44/42 MAPK en clulas humanas iPS tratadas con I- fenilefrina o AngII 28. RESULTADOS: FIG.5 Efectos de la Gq siRNA en la sntesis de DNA y la fosforilacion de Akt o p44/42 MAPK en clulas humanas iPS tratadas con I- fenilefrina o AngII 29. DISCUSSION: RESULTS 1 Han et al., 2007 Showed that AngII-stimulated DNA synthesis may be mediated by AT1 receptor dependent ERK and PI3K/Akt pathways in mouse ES cells Landgraf et al., 2010 Reported that mouse and human ES cell express muscarinic acetylcholine receptors (mAchRs) Wessler et al., 2012 Showed that acetylcholine was released from mouse ES cells 30. DISCUSSION: RESULTS 2 Han et al., 2006 Reported that PKC activation may be involved in mouse ES cell proliferation 31. DISCUSSION: RESULTS 3 Kim et al.,2009; Jirmanova et al., 2002; Lee et al., 2009; Paling et al.,2004. It is suggested that the MEK/ERK and the PI3K/Akt pathways are involved in the proliferation of mouse ES cells and iPS cells. 32. DISCUSSION: RESULTS 4 Heo and Han, 2006 The activation of Gq-couple receptors promotes PKC activation Zhao et al., 2005; Leon et al., 2011; Tang et al., 2012 Reported that PKC may be a key regulator of ERK activation induced by various stimuli 33. CONCLUSION 1. The results of this study validate that stimulation of 1-adrenoceptors or AT1 receptor may lead to a significant increase in human iPS cell proliferation via Gq-coupled receptor signaling pathways. 2. It is important to establish the methodology by which iPS cells can be produced in large quantities, because iPS cells may be used as a future source for regenerative therapy. 3. Understanding the physiological role of Gq-coupled receptors, such as 1-adrenoceptor or AT1 receptor in human iPS cells may be useful in the development of better culture conditions. 4. This improvment can be a step forward the new technics of treatment with regenerative therapy 34. MAPA CONCEPTUAL: ANGELICA MARIA SERNA 35. MAPA CONCEPTUAL: ANA ISABEL VALLEJO 36. GRACIAS