Beispiele aus Protein- und Chromatography Lebensmittelanalytik

34
FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen New Definition of Process Gas Chromatography FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen – Beispiele aus Protein- und Lebensmittelanalytik Bernhard Lendl Institut für Chemische Technologien und Analytik, TU Wien, Österreich

Transcript of Beispiele aus Protein- und Chromatography Lebensmittelanalytik

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

New Definition ofProcess Gas

Chromatography

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen –Beispiele aus Protein- und

Lebensmittelanalytik

Bernhard Lendl

Institut für Chemische Technologien und Analytik, TU Wien, Österreich

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Elektromagnetisches Spektrum

E = h*ν = h*c/λ

Infrarot: - Nahes IR: 0.7µm – 2.5 mm- Mittleres IR: 2.5 – 25 µm

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Informationsgehalt von Infrarot Spektren

Funktionelle Gruppen, FingerprintIdentifizierung von Substanzen/Strukturelementen

Quantitative Analyse auch Simultanbestimmungen

Inter- und Intramolekulare WechselwirkungenSekundärstrukturen von Proteinen

Messung von Bio-ligand Wechselwirkungen

Zugang zu “latenten Variablen”z.B. Oktanzahl; Art der Weinsorte; Krebs ja/nein;

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Beispiel: Quantitative Multianalytbestimmung

-0,005

0

0,005

0,01

0,015

0,02

80010001200140016001800

Wavenumber

Abs

orba

nce Glucose

ButanolButyrateAcetateAcetone

0

10

20

30

40

50

0 10 20 30 40 500

2

4

6

8

10

12

14

Glu

cose

(g/l)

Time (hours)

Opt

ical

den

sity

(arb

.u.),

Pro

duct

s (g

/l)

GlucoseButanol

Optical density

Acetone

Butyrate

Acetate

On-line Fermentationsüberwachung

Durch MultivariateKalibration ist eine reagenzfreie Multianalytbestimmung(einfach) realisierbar!

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Beispiel: Bestimmung von latenten VariablenKlassifizierung von Rotweinen - Konzept

C 18

C 18

C 18

C 18

1. Conditioning2. Sample loading

3. Washing4. Elution

1 µL of wine extract

Solid Phase Extraction FTIR Spectroscopy(Attenuated Total Reflection)

A. Edelmann, J. Diewok and B. Lendl J. Agr. Food Chem, 49 (2001) 1139- 1145

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Klassifizierung von Rotweinen – Ergebnisse

Hierarchical clustering

0.5

0.0

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

BF1

BF2

BF6

BF5

BF4

BF3

CS

1C

S3

CS

2C

S4

CS

7C

S6

CS

8M

E1M

E2M

E3

PN

1P

N2

PN

3P

N5

PN

6P

N8

PN

4P

N7

SL1

SL3ZW

1ZW

5ZW

6ZW

4ZW

2

ZW3

SL2

SL4

SL5

SL6

SL7

dist

ance

[arb

itrar

y un

its]

wavelength selection

ZW

SL

BF

ME

CS

PN

Wavenumber [1/cm]1800

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

14001600 1200 1000 800

Abso

rban

ceSpektren der Extrakte

ZW: Zweigelt, SL: St. Laurent, BF: BlaufränkiscME:Merlot, CS: Cabernet Sauvignon,PN: Pinot Noir

Bsp für „latente“ Information

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Die „Optische Zunge“

Idee: Entwicklung eines „objetiven“Geschmacksensors zur Unterstützung

sensorischer Analysen

Adstringenz die Fähigkeit eines Weines, ein rauhes, pelzigesMundgefühl zu verursachen

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen Flavanoide Ellagi-(Gallo)tannins

Quellen von Tanninen in Wein

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Flavanoide(Procyanidins “grape” tannins)

Ellagi-(Gallo)tannins(“wood” tannins)

1 Glucose; 2 Ellagic acid 3 Gallic acid; 4 Tannic acid5 Ellagitannins

1 Catechin; 2 Epicatechin3 Grape seed tannins

FTIR Spektren der Tanninbausteine

wavenumber [cm-1]

100011001200130014001500

arbitaryunits

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

1

2

3

a)

wavenumber [cm-1]

100011001200130014001500

arbitraryunits

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

4

b)

1

2

3

5

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Bestimmung der Adstringenz - Konzept

1. Immobilisierung von prolin-reichen Proteinen (gelatin) auf einem inerten Substrat(agarose beads)

Modellierung der Tannin-Protein Wechselwirkung

Pump

Selection valve

µ-Beads

FTIR

Waste

WaterPC

Sample, Reagents

Spacer

CaF windows2

Sample InSample Out

Beads

IR-Beam

2 In-situ Beobachtung derWechselwirkung zwischenWeintanninen und Proteinenmit FTIR Spectroskopie

3 Quantifizierung derWechselwirkung

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Selektivität des Durchflusssensors

time [sec]0 100 200 300 400 500

Are

a [a

.u.]

0

2

4

6

8

10

12

14

fructose glycerol

tartraric acid

Keine Wechselwirkung

Pump

Selection valve

µ-Beads

FTIR

Waste

WaterPC

Sample, Reagents

Automatisiertes FliesssystemZur definierten und reproduzierbaren Sensor – Analyte Interaktion

Verhalten von Alkoholen, Zuckern, org. Säuren

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

10g/L in H2O

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Selektivität des Durchflusssensors

Pump

Selection valve

µ-Beads

FTIR

Waste

WaterPC

Sample, Reagents

Automatisiertes FliesssystemZur definierten und reproduzierbaren Sensor – Analyte Interaktion

Wechselwirkung

Verhalten von Tanninen

time [sec]0 100 200 300 400 500

Are

a [a

.u.]

0

2

4

6

8

10

12

14

tannic acid

0.5 g/L in H2O

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Datensatz bei Analyse eines Rotweins

3D: Wellenzahl/Absorption/Zeit)

wavenumber [cm-1]

10001200140016001800

Abso

rban

ce U

nits

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

„Traces“ als f(Zeit)Spektren

time [sec]0 100 200 300 400 500

Are

a [a

.u.]

0

10

20

30

40

50

60

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Standardaddition zu Rotwein

wavenumber [cm-1]

10001200140016001800

Abso

rban

ce U

nits

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

Procyanidinsexample for a „grape“ tanninInfrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Red wine was spiked with0.25 – 2g/L tannic acid

Tannic acidexample for a „wood“ tannin

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

Standardaddition zu Rotwein

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Messung unterschiedlicher Rotweine

A) Cabernet Sauvignon(1 month in new oak),

B) Merlot table wine (2 years)C) Zweigelt during fementationD) Zweigelt

(9 month aged in new oak andtannin treatment)

E) grape seed tannin 0.5 g/Lin 10% ethanolic solution

F) Blauer Portugieser(9 month, tannin treatment,already bottled).

JACS, (2002) 124, 14741-14747

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Follow up einer japanischen Gruppe

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

Material bei Dr. Hashimoto, Mie University, Japan

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Enzymatischen Hydrolyse von BSA mitProteinase K

Sekundärstruktur: 67% α-Helix,10% β-Turn23% Extended chain,kein β-sheet

Erwärmung von BSA:Bis 50°C reversible KonformationsänderungenEntfalten der α-Helix irreversibel von 52 - 60°CWeitere Temperaturerhöhung:Beginn einer β-AggregationAb 70°C Gelbildung

Proteinase KFamilie der Subtilisin ProteinasenKeine besonderen Selektivität für best. ASHohe Aktivität bei 50 – 60°C

Die enzymatische Reaktion erfordert eineerhöhte Temperatur

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Experimentelle Bedingungen – Daten

15201540156015801600162016401660168017000

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

Wavenumber (cm-1)

Abs

orba

nce

30 mg/ml BSA0.5 mg/ml Proteinase KT = 60°CPhosphatpuffer pD 7.4Reaktionszeit: 320 min

50 µm CaF2Spectr.Res.: 2 cm-1

FTIR Spektren spiegeln Vorgänge der enzymatischenHydrolyse wider

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

2DCoS – Konzept

( ) ( )2121 ,, νννν Ψ+Θ i

( ) ( )ϖϖπ 2

01

1 YiYT

+= ∫∞

Zeitaufgelöste Spektren Zeit/Druck/Temperatur,..

Korrelationsanalyse

Spektrale Variable

I. Noda Lecture 2DCoS-3, 2005

Ermittlung von Korrelation im experimental Datensatz

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

2DCoS - Output

I. Noda Lecture 2DCoS-3, 2005

Correlation Maps

Spectral variable, ν1

Spe

ctra

lvar

iabl

e, ν

2

Spectral variable, ν1

Spe

ctra

lvar

iabl

e, ν

2

Synchronous map Asynchronous mapInfrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Multivariate Curve Resolution (MCR-ALS)

Konzept: Modellierung der experimentellen Datenmatrix D

D = CST + E

• Multikomponentensysteme können sehr oft mit Hilfe eines linearenadditiven Models bestehend aus gewichteten Beiträgen vonEinzelkomponenten beschreiben werden

• Einzige Bedingung: Lineare Struktur des Datensatzes

D(r × c) ist die originale Datenmatrix C(r × n) und ST(n×c) enthalten reinen Variationen der Komponenten bezüglich der Reihen (r) und Spalten (s) von D(r × c)E(r × c) ist die Fehlermatrix

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Multivariate Curve Resolution

ci...concentration profiles with time si...spectra of pure substances

= ++c1

s1T

c3

s3T

c2

s2T

=C

ST

exp. dataD

ν

t =

ci...concentration profiles with time si...spectra of pure substances

= ++c1

s1T

c1

s1T

c3

s3T

c2

s2T

=C

ST

exp. dataD

exp. dataD

exp. dataD

ν

t = + E

+ E

Graphische Darstellung

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

2DCoS vs. MCR-ALS

Zwei komplementäre Ansätze welche hilfreich sind dynamischeDatensätze besser verstehen zu lernen

2DCoS: Sucht Korrelationen im Datensatz

Output: synchrone und asynchroneKorrelationsmappeverlangt Erfahrung im Lesen der Korrelationsmappen

MCR-ALS: Modellierung des Datensatzes

Output: Spektren und Konzentrationsprofile derKomponentenerfordert Definition der (Anzahl) der Komponentenobjektive Kriterien zur Beurteilung des Erfolgs der MCR Analyse

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

MCR-ALS Analyse I

0 50 100 150 200 250 3000

5

10

15

20

25

30

Time (min)

Con

cent

ratio

n (m

g/m

l)

(a)

15201540156015801600162016401660168017000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

Wavenumbers (cm-1)

Abs

orba

nce

(b)1594 1/cm

Laut PCA erklären 2 Komponenten 99,99 % der spektralen Varianz=> Annahme von 2 Komponenten

1651 1/cmInfrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

2DCoS Analyse

(a)W

aven

umbe

r(cm

-1)

Wavenumber (cm-1)155016001650

1520

1540

1560

1580

1600

1620

1640

1660

1680

(b)

Wav

enum

ber(

cm-1

)

1520

1540

1560

1580

1600

1620

1640

1660

1680

Wavenumber (cm-1)155016001650

Synchrone Mappe Asynchrone Mappe

Nach „Noda Rules“ : 1654/1641 , 1594/1675 , 1616Syn + / asyn - => ν1 nach ν2

1654

1641

1675

15941654: α-Helix1641: ungeordnet Str.1594: Carboxylat1675: β-turn1616: β-Faltblatt

Offensichtlich mehr als 2 Komponenten!!

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Blick auf die Residualmatrix E

E (r,c) = D – (CST) Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

(a)W

aven

umbe

r (cm

-1)

Wavenumber (cm-1)155016001650

1520

1540

1560

1580

1600

1620

1640

1660

1680

(b)

Wav

enum

ber (

cm-1

)

Wavenumber (cm-1)155016001650

1520

1540

1560

1580

1600

1620

1640

1660

1680

Stärkste Bande bei 1616 1/cm

1654

1616=> 2 weitere Komponenten

Blick auf die Residualmatrix E mit 2DCoS

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

MCR-ALS Analyse IIAnnahme von 3 Komponenten, PCA erklärt nun 99,999 %Analyse eines einzigen Experiments

15201540156015801600162016401660168017000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

Wavenumbers (cm-1)

Abs

orba

nce

(b)

0 50 100 150 200 250 3000

5

10

15

20

25

30

Time (min)

Con

cent

ratio

n (m

g/m

l)(a)

Scheinbar 2 Produkte: Zwischenprodukt sowie EndproduktDies ist jedoch von einem chemischen Standpunkt ausgesehen sehr unwahrscheinlich!

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

MCR – ALS von Experiment ohne Enzym

Nur temperaturinduzierte Effekte sichtbar

15201540156015801600162016401660168017000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006

0.007

0.008

0.009

0.01(b)

Wavenumbers (cm-1)

Abs

orba

nce

0 20 40 60 80 100 120 140 1600

5

10

15

20

25

30

Time (min)

Con

cent

ratio

n (m

g/m

l)(a)

Denaturierung durch Temp. erhöht Anteil an ungeordneten Strukturen:Amid I: 1654 -> 1651Auch leichte Erhöhung des Anteils in β-Faltbalttagregation:Schultern bei 1616 (stark) und 1685 entstehen

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Matrix Erweiterung

Simultane Analyse von mehreren Experimenten

Exp. mitEnzym

Exp. ohneEnzym

Exp. withEnzymeExp. mitEnzyme

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Ergebnis MCR-ALS Matrix Erweiterung

Natives AlbuminEntfaltete Albumin (ungeordneteStrukturen Verschiebung Richtung 1641)sowie β-FaltblattReaktionsprodukt

0 50 100 150 200 250 3000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Time (min)

Con

cent

ratio

n (m

g/m

l)

(a)

0 50 100 150 200 250 3000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Time (min)

Con

cent

ratio

n (m

g/m

l)

(b)

0 50 100 150 200 250 3000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Time (min)

Con

cent

ratio

n (m

g/m

l)

(c)

15201540156015801600162016401660168017000

0.005

0.01

0.015(d)

Wavenumber (cm-1)

Abs

orba

nce

30 mg/ml Albumin0.5 mg/ml Enzym

30 mg/ml Albumin

Anal. Chem. 78 (2006) 3257-3264

50 mg/ml Albumin0.5 mg/ml Enzym

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Zusammenfassung

„Take home messages“

Breite Anwendungsmöglichkeiten der FTIR Spektroskopie zur quantitativen als auch qualitativen Analyse

(Erstaunlich) hoher Informationsgehalt in MIR Spektren welcher durch moderne Datenauswertetechniken auch leicht zugänglich ist

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin

FTIR Spektroskopie an dynamischen Systemen

Danksagung

Maria JoseAyora Canada

Ana Dominguez Vidal Andrea Edelmann

Bruker Optics,insb. Frau Dr. Dietl für die nette und immer hilfreicheBetreuung unserer Aktivitäten auf dem Gebiet derIR- und Raman- Spektroskopie

Infrarotspektroskopie

Weinsortenbestimmung

Optische Zunge

2DCoS vs. MCR

Enzymat. Hydrolyse von Albumin