Baza Genetica Moleculara in Talasemii

61
BAZA GENETICA MOLECULARA A SINDROAMELOR TALASEMICE Asist. Univ. Dr. Rodica TALMACI 2015

description

talasemii

Transcript of Baza Genetica Moleculara in Talasemii

  • BAZA GENETICA MOLECULARA A SINDROAMELOR TALASEMICE Asist. Univ. Dr. Rodica TALMACI2015

  • Molecula de hemoglobin este un tetramer format din 4 grupri hemice (hem) i globina constituit din 2 perechi de lanuri polipeptidice.Pe perioada dezvoltrii, la om se sintetizeaz mai multe tipuri de Hb, implicnd 6 tipuri de lanuri polipeptidice: , , , , , i .Moleculele hemoglobinelor sunt constituite din asocierea a 2 lanuri tip cu:2 lanuri n hemoglobina A (adult major) 96-98%2 lanuri n hemoglobina A2 (adult minor) 1-3%2 lanuri n hemoglobina F (fetal) 0,5-1%2 lanuri n hemoglobina E (embrionar)HEMOGLOBINELE NORMALEHemoglobina embrionar (HbE):Gower I - 22Portland - 22Gower II - 22Hemoglogina fetal (HbF) - 22 Hemoglobina adult (HbA) - 22 Hemoglobina 2 adult (HbA2) - 22Tipurile de lanuri globinice sintetizate la diferite etape de dezvoltare Molecula tetramerica de Hb

  • Inainte de natere, cnd sinteza catenelor nceteaz, iar locul de sintez a Hb se deplaseaz n mduva osoas, sunt sintetizate catenele i (Hb A) mpreun cu cteva polipeptide de tip (Hb A2). HEMOGLOBINA ADULTALocul de sintez a lanurilor globinice pe durata dezvoltrii HbA2 (22)

  • CE SUNT SINDROAMELE TALASEMICE ?Talasemiile reprezinta un grup de boli genetice, caracterizate prin scaderea cantitatii de hemoglobina. Sediul hemoglobinei se afla in eritrocite. Daca hemoglobina este scazuta eritrocitele sunt mai mici si mai goale. Este ceea ce se numeste anemie hipocroma si microcitara.

  • HEMOGLOBINOPATIICALITATIVECANTITATIVESINDROAMELE TALASEMICEHEMOGLOBINE ANORMALE

  • Molecula integrala de hemoglobina este un tetramer 22. http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/chr11.html BAZA GENETICA MOLECULARA A TALASEMIEIMutatii produse in aceste gene determina aparitia talasemiilor. In prezent, in gena -globinei, se cunosc aproape 300 de mutaii ce determina transformarea in gene talasemice.

  • CLASIFICAREA GENETICA A TALASEMIILORIN FUNCTIE DE GENA AFECTATA:1. .-TALASEMIE2. .-TALASEMIE3. .-TALASEMIE4. .-TALASEMIE

  • CE ESTE -TALASEMIA ?DEFECTE GENETICE IN GENELE -GLOBINICE PRODUC -TALASEMIA

  • MUTATII CE DETERMINA - TALASEMIAbbbbbb

  • MUTATII IN PROMOTORUL GENEI -GLOBINAATAAAACCAATCCACACCCCCTCACCC-31-76-93-108GGCGGTT-globina

  • ADNARNmADNARNmNormalMutantEROARE DE SPLICING IN GENA GLOBINEI: IVS I -110 situs acceptor nouIVS1 +110 G>A

  • FORMELE HETEROZIGOTE DE TALASEMIE: Talasemia minima/silentioasa ++/ NTalasemia minora +/N sau 0/N MANIFESTARILE FENOTIPICE (CLINICE)IN b-TALASEMIE FORMELE HOMOZIGOTE DE TALASEMIE: Talasemia intermediara +/+ sau 0/+ Talasemia major 0/0

  • HomozigotHeterozigot compus =Dublu heterozigotHeterozigot

  • Daca ambii parinti sunt purtatori de gena -globinica defecta exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa se nasca un copil cu -talasemie majora sau anemie Cooley.

  • Fenotip -talasemie majora

  • CE ESTE -TALASEMIA ?Daca o persoana are o singura gena -globinica defecta (din cele patru), aceasta nu va avea nici un fel de manifestare clinica. Aceasta situatie se numeste conditie de purtator silentios de -talasemie. Diagnosticul este pus numai prin teste genetice si este mai curand un diagnostic deductiv la o persoana aparent sanatoasa care are un copil cu -talasemie.Daca persoana are doua gene -globinice defecte, atunci diagnosticul va fi de -talasemie minora. De regula, nu exista manifestari clinice, iar in hemograma aceasta va avea o anemie usoara hipocroma microcitara. De obicei, pacientul este gresit diagnosticat cu anemie prin lipsa de fier. Diagnosticul corect implica mai multa experienta din partea hematologului, deoarece inclusiv electroforeza de hemoglobina este normala. Genele alfa defecte pot fi situate pe acelasi cromozom (pozitie cis) sau pe fiecare cromozom din pereche (pozitie trans). Daca un parinte are -talasemie minora cu genele defecte in pozitie cis (situate pe acelasi cromozom), iar celalat parinte are conditia de purtator silentios (o singura gena este defecta), exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa se nasca un copil cu trei gene -talasemice defecte, adica boala Hb H. Daca ambii parinti au -talasemie minora cu genele defecte in pozitie cis (pe acelasi cromozom) exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa apara -talasemia majora, in care toate genele -globinice sunt defecte, adica Hemoglobina Bart - Hidrops Fetalis si produsul de conceptie nu este viabil si va muri in uter.DEFECTE GENETICE IN GENELE -GLOBINICE PRODUC -TALASEMIA

  • DELETII -TALASEMICE

  • Daca ambii parinti au -talasemie minora cu genele defecte in pozitie trans (pe cromozomi diferiti) copiii lor vor mosteni -talasemie minora.

  • Daca ambii parinti au -talasemie minora cu genele defecte in pozitie cis (pe acelasi cromozom) exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa apara -talasemia majora, in care toate genele -globinice sunt defecte, adica Hemoglobina Bart - Hidrops Fetalis si produsul de conceptie nu este viabil si va muri in uter.

  • VARIANTE TALASEMICE -TALASEMIAConditia de -talasemie rezulta prin reducerea sintezei lanturilor - si -globinice si se caracterizeaza printr-o cantitate crescuta de Hb F, un nivel de Hb A2 normal sau scazut si un indice MCV scazut. Gena -globina, ce controleaza productia de lanturi - este localizata foarte aproape de gena - pe cromozomul 11. Daca o gena este indepartata din cromozom in urma unei deletii, atunci si cealalta gena poate fi afectata. In functie de deletia produsa in cromozomi, se pot distinge: Macedonia Sicilia Lepore-talasemia homozigota este similaracu -talasemia, dar simptomele sunt maiusoare. Majoritatea pacientilor supravietuiescpana la viata adulta cu necesitati minime detransfuzie.-talasemia heterozigota este similara cu-talasemia minora, dar simptomele tind safie mai putin severe.Hemoglobina LEPORE este un amestec in productia de lanturi non-. Capatul N-terminal al proteinei contine secventa aminoacidica a lantului -globinic, iar capatul C-terminal contine secventa aminoacidica a lantului -globinic. Exista mai multe variante de Hb Lepore, in functie de lungimea segmentelor fuzionate: Washington, Hollandia, Baltimore.In Hb Lepore homozigota nu exista productie normala de lanturi -globinice sau -globinice. Aspectele clinice si hemograma sunt identice cu cele de -talasemie majoraIn Hb Lepore heterozigota aspectele clinice si de laborator sunt identice cu cele de -talasemie minora

  • DIAGNOSTICUL MOLECULAR IN TALASEMII

  • PRINCIPALII INDICI HEMATOLOGICI IN -TALASEMIA HETEROZIGOTA

  • TESTELE DE GENETICA MOLECULARA IN TALASEMIESTRATEGIA DE INVESTIGARE A MUTATIILOR TALASEMICE se refera la cautarea modificarilor produse in genele globinice normale ce au dus la transformarea lor in gene talasemice.-talasemiile si -talasemiile sunt consecinta unor deletii ale genelor globinice, in timp ce -talasemiile sunt produse ca rezultat al mutatiilor punctiforme aparute in ADN la nivelul acestor gene -globinice. In scopul identificarii mutatiilor -talasemice se procedeaza la urmatoarea etape:Recoltarea de sange periferic extractie ADN din sange amplificare prin PCR a genelor de investigatPrin metode de biologie moleculara se realizeaza identificarea mutatiilor produse la nivelul genelor de interes. Aceste metode ne indica exact mutatia produsa in gena studiata, fiind si metode de verificare, absolut necesare intr-un diagnostic molecular.

  • SINDROAMELE TALASEMICE-talasemie-talasemie-talasemie-talasemie-talasemie

  • EXTRACTIE

    ADNgena de interesPCRcu primeri specifici DETECTIEprin motoda electroforetica >106 copiiADN genomicSCHEMA DE REALIZARE A DIAGNOSTICULUI MOLECULAR

  • EXTRACTIE ADNETAPE:Liza celularaLiza nuclearaDeproteinizarePrecipitare ADNPurificare ADNObtinere ADN genomic concentrat, foarte pur

  • Replicarea ADN semiconservativaPrincipul PCR: Sinteza unei regiuni ADN prin refacerea structurii dublu catenare pe baza complementaritatii nucleotidelor: A (adenina) T (timina)G (guanina) C (citozina)PRINCIPIUL PCR (Polymerase Chain Reaction)

  • REACTIA DE POLIMERIZARE IN LANT PCR 3 ETAPE:ADN genomicgena de intereshttp://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html

  • REACTIA DE POLIMERIZARE IN LANT PCR 3 ETAPE:ADN genomicgena de intereshttp://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html

    1. Denaturare 90-95oC 1 min

  • REACTIA DE POLIMERIZARE IN LANT PCR 3 ETAPE:ADN genomicgena de intereshttp://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html

    1. Denaturare 90-95oC 1 min2. Alinierea primerilor 55-65oC - 0,5 min3. Polimerizare 72oC 2 min

  • Amestec de reactie PCR:ADN (template)Amestec tampon PCR: Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, MgCl2Primer F (forward)Primer R (reverse)Nucleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)ADN polimeraza (Taq DNA polynerase)

  • PCRPolymerase Chain Reaction

  • AMPLIFICAREA EXPONENTIALA

  • DETECTIE PRIN ELECTROFOREZA IN GEL DE AGAROZA

  • Toate genele globinice au o structur similar. Secvenele codificatoare se afl n 3 exoni, separai de 2 introni .Structura genei -globinei - secvena nucleotidic Fiecare gen deasemenea, are secvene promotoare 5', regiuni netranslate 5' (5' UTR) i 3' (3' UTR).STRUCTURA GENELOR GLOBINICE

  • METODE DE IDENTIFICARE A MUTATIILOR -TALASEMICE ELECTROFOREZA IN GEL CU GRADIENT DE DENATURARE (DGGE) Amplificare seriata a fragmentelor -globinice: Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IVElectroforeza fragmentelor F, I, II, III, IV in gel de poliacrilamidaAMPLIFICARE SPECIFICA A ALELELOR MUTANTE (ARMS-PCR)Electroforeza in gel de agaroza ANALIZA SITUSULUI DE RESTRICTIE IN FRAGMENTE DE AMPLIFICARE PCR (PCR-RFLP)Electroforeza in gel de agaroza Amplificarea fragmentelor genice -globinice urmata de restrictie enzimatica

  • ELECTROFOREZA N GEL CU GRADIENT DE DENATURARE (DGGE) Amplificare seriat a fragmentelor -globinice: Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IVAMPLIFICARE SPECIFIC A ALELELOR MUTANTE (ARMS-PCR)ANALIZA SITUSULUI DE RESTRICIE N FRAGMENTE DE AMPLIFICARE PCR (PCR-RFLP)Electroforeza fragmentelor F, I, II, III, IV n gel de poliacrilamid cu gradient de denaturare Electroforeza n gel de agaroz Electroforeza n gel de agaroz Amplificarea fragmentelor genice -globinice urmat de restricie enzimaticMETODE DE IDENTIFICARE A MUTAIILOR -TALASEMICE

  • ELECTROFOREZA N GEL CU GRADIENT DENATURANT (DGGE)In urmatoarea etapa se realizeaza electroforeza fragmentelor amplificate in DGGE.

    In functie de modelul electroforetic obtinut avem informatia despre prezenta sau absenta unei mutatii in fragmentul analizat si locul genic al mutatiei.Daca utilizam probe control, prin compararea modelelor electroforetice, obtinem informatia privind mutatia exacta.Scanarea intregii gene -globinice pentru identificarea mutatiilorIntr-o prima etapa se amplifica seriat 5 fragmente ce compun intreaga gena -globinica

  • DGGEGena -globinei a fost mprit n 5 fragmente diferite (Fr. F, Fr. I, Fr. II, Fr. III, Fr. IV), ce acoper ntreaga regiunea de codificare i secveele de flancare 5' i 3'. Cele mai frecvente mutaii identificate n fragmentul F:Mutatia 87 (C-G) - ++Polimorfismul +20 (C-T) lincat cu mutaia IVS II-745 (C-G) - +Polimorfismul cd2 (C-T)

  • DGGECele mai frecvente mutaii identificate in fragmentul I:cd 6 (-A) - 0Polimorfismul +20 (C-T) lincat cu mutaia IVS II-745 (C-G) - +Polimorfismul cd 2 (C-T)

  • DGGECele mai frecvente mutatii identificate infragmentul II:IVS I-1 (G-A) - 0IVS I-6 (T-C) - +IVS I-110 (G-A) - +cd 39 (C-T) - +

  • DGGECele mai frecvente mutatii produse in fragmnetul IV:mutaia n semnalul de poliadenilare (AATAAA-AATGAA) - +mutatia +1480 (C-G) - +

  • ELECTROFOREZA N GEL CU GRADIENT DE DENATURARE (DGGE) Amplificare seriat a fragmentelor -globinice: Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IVAMPLIFICAREA SELECTIV A ALELELOR MUTANTE (ARMS-PCR)ANALIZA SITUSULUI DE RESTRICIE N FRAGMENTE DE AMPLIFICARE PCR (PCR-RFLP)Electroforeza fragmentelor F, I, II, III, IV n gel de poliacrilamid cu gradient de denaturare Electroforeza n gel de agaroz Electroforeza n gel de agaroz Amplificarea fragmentelor genice -globinice urmat de restricie enzimaticMETODE DE ANALIZ A MUTAIILOR -TALASEMICE

  • AMPLIFICAREA SELECTIV A ALELELOR SPECIFICEMetoda se aplica pentru identificarea mutaiilor punctiforme cunoscute. In amplificarea PCR se utilizeaza un primer care prezinta aceeasi secventa de nucleotide cu ADN matrita, cu exceptia nucleotidului terminal 3. Acesta este complementar cu nucleotidul modificat prin mutatie. Taq-polimeraza necesita o complementaritate perfecta a primerului la capatul 3' pentru a putea realiza polimerizarea. Astfel, alela dorita este intens amplificata. In cazul neamplificarii rezultatul este nepotrivirea dintre ADN matrita si oligonucleotidul primer.Pentru a confirma aceasta conditie, in amestecul de reactie se introduc 2 primeri control care amplifica un fragment de alta dimensiune.

  • ELECTROFOREZA N GEL CU GRADIENT DE DENATURARE (DGGE) Amplificare seriat a fragmentelor -globinice: Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IVAMPLIFICAREA SELECTIV A ALELELOR MUTANTE (ARMS-PCR)ANALIZA SITUSULUI DE RESTRICIE N FRAGMENTE DE AMPLIFICARE PCR (PCR-RFLP)Electroforeza fragmentelor F, I, II, III, IV n gel de poliacrilamid cu gradient de denaturare Electroforeza n gel de agaroz Electroforeza n gel de agaroz Amplificarea fragmentelor genice -globinice urmat de restricie enzimaticMETODE DE ANALIZ A MUTAIILOR -TALASEMICE

  • ENZIME DE RESTICTIEEcoRI (Escherichia coli)

  • ANALIZA SITUSULUI DE RESTRICIE PRIN METODA PCR - RFLPPrin stabilirea polimorfismului lungimii fragmentelor de restrictie ne dam seama daca s-a produs mutatia cautata. Unele mutaii punctiforme pot crea sau desfiina un situs de restricie n secvena ADN. Aceste mutatii pot fi identificate prin analiza situsului de restricie.

  • SECVENTIEREA ADNMetoda prin care se poate afla secventa in baze azotate a unui fragment ADN de interes

  • REAL TIME PCR

  • REAL TIME PCR GENOTYPINGDetectie prin metoda Melting Curve AnalysisIVS I-110 mutation

  • IDENTIFICAREA DELEIILOR - Si -TALASEMICE GENICE GLOBINICE PRIN METODA GAP-PCRMetoda GAP-PCR se aplica in identificarea deletiilor genice mari. Metoda se bazeaza pe tehnica de amplificare PCR cu 3 primeri specifici pentru fiecare deletie. Acestia sunt utilizati in aceeasi reactie de amplificare, conducand la amplificarea unui singur produs specific deletiei si o banda control, de marime diferita, corespunzatoare alelei normale. 0 MED-I (17,5 kb) / +(3.7 kb) = Boala Hb H-talasemia MED-I/ MED-I/ 20,5/ MED-I/ 20,5/ deleia Macedonia (11,5 kb) -talasemia

  • STUDIUL TALASEMIEI IN ROMANIA SPECTRUL MUTATIILOR -TALASEMICE IDENTIFICATE IN ROMANIA-talasemia MED/N 3.7/N0 MED-I (17,5 kb) / +(3.7 kb) = Boala Hb H/N-talasemia deleia Macedonia (11,5 kb)deleia Lepore

  • O NOUA MUTATIE IN SITUSUL CAP AL GENEI -GLOBINEI - MUTATIA CAP+3 (A-T)

  • Probele de material fetal se obtin prin AMNIOCENTEZA sau prelevare de probe din VILOZITATILE CORIALE. Ambele pot fi efectuate numai in centre specializate sub control ecografic.Amniocenteza se efectueaza dupa saptamana a 15-a de sarcina prin recoltarea de 10-15 ml de lichid amniotic. Biopsia din vilozitatile coriale se poate efectua in saptamana 10-12 de sarcina prin recoltare de fragmente foarte mici de tesut cu origine fetala.TESTAREA PRENATALA PENTRU TALASEMIEADNul extras din lichid amniotic sau vilozitati coriale este analizat prin metodele moleculare pentru identificare i caracterizare de mutaii -talasemice prezente n genotip.Prin aceste metode se stabileste diagnosticul de homozigot (bolnav) sau heterozigot (purtator) al -talasemiei, se identifica mutatia exacta prezenta la fat si se anticipeaza fenotipul sau.Pentru cuplurile la care diagnosticul de talasemie minora a fost pus la ambii parinti, dupa ce partenera a ramas insarcinata, se recomanda efectuarea testelor de genetica moleculara la fat pentru a identifica prezenta mutatiilor talasemice.

  • PRIMUL CAZPattern-uri DGGE in fragmentul I.1-ADN mama (N), 2-ADN tata (pozitiv), 3-ADN bunic (pozitiv), 4-ADN fetal pozitiv pentru mutatia IVS II-745 (C-G), 5-ADN bunica (N).SCANAREA GENICA PENTRU IDENTIFICARE DE MUTATIIPattern-uri DGGE in fragmentul II.

    1-ADN bunica (N),2, 3-ADN fetal pozitiv pentru mutatia IVS I-110 (G-A),4-ADN mama (pozitiv),5-ADN control negativ. Allela IVS II-745Alela NormalaAllela IVS I-110

    Alela Normala

  • REZULTATE

    GENOTIPFENOTIPFETUSHomozigot IVS I-110 (G-A) / IVS II-745 (C-G).+/ +MAMAheterozigot IVS I-110 (G-A) / N.+/ ATATALheterozigot IVS II-745 (C-G) / N.+/ ABUNICUL PATERNheterozigot IVS II-745 (C-G) / N.+/ ABUNICA PATERNANormal.A/ A

  • AL DOILEA CAZPattern-uri DGGE in fragmentul I.1-ADN control negativ,2-ADN fetal din proba de lichid amniotic (pozitiv-contaminare),3-ADN control pozitiv pentru polimorfism cd 2 in stare heterozigota,4-ADN mama (pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA + polimorfism cd 2 in trans),5-ADN fetal din proba CVS, pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in stare homozigota,6-ADN tata (pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in stare heterozigota,7-ADN control pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in stare heterozigota,8-AND control pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in stare homozigota.SCANAREA GENICA PENTRU IDENTIFICARE DE MUTATIIAlela normala

    Alela -talasemica cd 8 (-AA)

  • REZULTATE

    GENOTIPFENOTIPFETUSHomozigot cd 8 (-AA) / cd 8 (-AA).0/ 0MAMAheterozigot cd 8 (-AA)/ N.0/ ATATAheterozigot cd 8 (-AA)/ N.0/ A

  • RESULTS

    GENOTYPEPHENOTYPEFETUSHomozygot IVS I-110 (G-A) / IVS II-745 (C-G).+/ +MOTHERheterozygot IVS I-110 (G-A) / N.+/ AFATHERheterozygot IVS II-745 (C-G) / N.+/ AFETUSHomozygot CD 8 (-AA) / CD 8 (-AA).0/0MOTHERheterozygot CD 8 (-AA)/N.0/AFATHERheterozygot CD 8 (-AA)/N.0/AFETUSHomozygot IVS I-110 (G-A) / IVS II-745 (C-G).+/ 0MOTHERHeterozygot IVS II-745 (C-G) / N.+/ AFATHERHeterozygot IVS I-110 (G-A) / N

    .0/ A

  • ********************************************************