Basta Anastasia- CD spectroscopy

ΒΙΟΑΝΑΛΥΣΗ, Μ.Δ.Ε. ΣΤΙΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ: ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΚΑΙ ΝΑΝΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

1

ΒΙΟΑΝΑΛΥΣΗΜ.Δ.Ε. Στις Φαρμακευτικές Επιστήμες: Βιομηχανική

Φαρμακευτική και Νανοτεχνολογία


2

Φασματοσκοπία Κυκλικού Διχρωισμού(CD Spectroscopy)

Μπάστα ΑναστασίαΧημικός


3

ΕΝΟΤΗΤΕΣ1) Φασματοσκοπία2) Κυκλικός Διχρωισμός3) Αρχή λειτουργίας4) Χρήσιμοι Τύποι5) Εφαρμογή στη Βιοανάλυση6) Προετοιμασία Δείγματος- Λήψη φάσματος7) Επεξεργασία Φάσματος8) Χρησιμότητα στη Βιοανάλυση9) Συγγενείς Τεχνικές10) Παραδείγματα-Εργασίες


4

1. Φασματοσκοπία


5

Γιατί φασματοσκοπία;

Μελέτης της επίδραση της

ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας

Πληροφορίες για τη δομή ή/και τον

ποσοτικό προσδιορισμό

φασματοσκοπική εξέταση

μέτρηση έντασης απορρόφησης/

εκπομπής/σκέδασης


6

Φθορισμού

Ακτίνων Χ

Φλογοφωτομετρία◦ Ατομικής Εκπομπής◦ Ατομικής Απορρόφησης

Υπερύθρων (IR)

Πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR)

Κυκλικού Διχρωισμού

και άλλες

Κοινές Τεχνικές Φασματομετρίας


7

2. Κυκλικός Διχρωισμός


8

Είναι η διαφορά στην απορρόφηση αριστερόστροφου κυκλικά πολωμένου φωτός (L-CPL) και δεξιόστροφου κυκλικά πολωμένου φωτός (R-CPL) και προκύπτει όταν ένα μόριο περιέχει ένα ή περισσότερα χειρόμορφα χρωμοφόρα (ομάδες που απορροφούν το φως).

Τι είναι ο κυκλικός διχρωισμός;


9


Πόλωση Το επίπεδο ταλάντωσης του ηλεκτρικού πεδίου του φωτός είναι το ίδιο για όλα τα φωτόνια


10

Είναι η διαφορά στην απορρόφηση αριστερόστροφου κυκλικά πολωμένου φωτός (L-CPL) και δεξιόστροφου κυκλικά πολωμένου φωτός (R-CPL) και προκύπτει όταν ένα μόριο περιέχει ένα ή περισσότερα χειρόμορφα χρωμοφόρα (ομάδες που απορροφούν το φως).



11


Ισομερή:Ίδιος μοριακός τύπος-διαφορετική

διευθέτηση

Χειρικά/Χειρόμορφα


12

L-CPL R-CPL

Η διαφορά στην απορρόφηση του αριστερόστροφα και δεξιόστροφα κυκλικού πολωμένου φωτός είναι η βάση του κυκλικού διχρωισμού. * Η γωνία στροφής εξαρτάται από την ένωση και τη συγκέντρωσή της


13

3. Αρχή Λειτουργίας


14

Φασματοφωτόμετρο Κυκλικού Διχρωισμού


15

Αρχή Λειτουργίας


16

Το φως από την πηγή ακτινοβολίας (UV ή ορατό φως) προσπίπτει πάνω σε με έναν πολωτή ο οποίος περιέχει ένα πολωτικό φίλτρο.

Όταν το φως προσπέσει σε ένα πολωτικό φίλτρο θα εξέλθει γραμμικά πολωμένο με επίπεδο ταλάντωσης καθορισμένο από το υλικό του φίλτρου (γραμμικά πολωμένο παράλληλα στο επίπεδο πόλωσης του πλακιδίου (υλικό φίλτρου)).

Ένας πολωτής επιτρέπει την πλήρη διέλευση όλων των κυμάτων φωτός που είναι πολωμένα στο ίδιο επίπεδο με τον υλικό του πολωτικού φίλτρου και ανακόπτει όλα τα κύματα που είναι πολωμένα κάθετα στο επίπεδο του υλικού του πολωτικού φίλτρου.

Πολωτικό φίλτρο


17

Ο μονοχρωμάτορας είναι μια συσκευή, που περιλαμβάνει ένα διαχωριστή μηκών κύματός (φράγμα περίθλασης ) σε αντίθεση με ένα φίλτρο, που αποκόπτει συγκεκριμένα μήκη.

Επιπλέον ένας μονοχρωμάτορας περιλαμβάνει σχισμές εισόδου και εξόδου και κατάλληλους καθρέπτες.

Μονοχρωμάτορας


18

PEM Φωτο-ελαστικός διαμορφωτής (ΡΕΜ) : ένα πιεζοηλεκτρικό στοιχείο στερεωμένο σε

ένα μπλοκ συντηγμένου διοξειδίου του πυριτίου (silica) .

Σε κατάσταση ηρεμίας: το μπλοκ του πυριτίου δεν είναι δι-διαθλαστικό *δι-διαθλαστικό: διαιρεί μία ακτίνα σε δύο συνιστώσες

Το πιεζοηλεκτρικό στοιχείο ταλαντώνεται στη συχνότητα συντονισμού του (50 kHz): προκαλεί stress στο διοξείδιο του πυριτίου με τέτοιο τρόπο ώστε να καθίσταται δι-διαθλαστικό.

Το εναλλασσόμενο stress μετατρέπει το λιωμένο στοιχείο πυριτίου σε μια quarter-wave πλάκα.

Παράγεται αριστερά και, στη συνέχεια, δεξιά κυκλικά πολωμένο φως.

http://www.cabrillo.edu/~jmccullough/Applets/Flash/Optics/CircPol.swf

http://www.cabrillo.edu/~jmccullough/Applets/Flash/Optics/CircPol.swf


19

Από την άλλη πλευρά της θέσης του δείγματος υπάρχει ένας ανιχνευτής.

PMT Detector

Απουσία κυκλικά διχροϊκού δείγματος, το φως που προσπίπτει στον ανιχνευτή είναι σταθερό

Παρουσία κυκλικά διχροϊκού δείγματος, η καταγεγραμμένη ένταση του φωτός θα είναι διαφορετική για δεξί και αριστερό-CPL.

Χρησιμοποιώντας ένα ενισχυτή συντονισμένο στη συχνότητα του ΡΕΜ, είναι δυνατόν να μετρηθεί η διαφορά στην ένταση μεταξύ των δύο κυκλικών πολώσεων (VAC).

Η μέση συνολική ένταση του φωτός σε πολλές ταλαντώσεις PEM (VDC) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να μετρηθεί το σήμα του ενισχυτή ,ώστε να ληφθούν υπόψιν και οι σχετικές διακυμάνσεις

Τα δύο σήματα μπορούν να καταγραφούν και από αυτούς το σήμα μπορεί εύκολα να υπολογιστεί.


20

PMT Detector

Χρησιμοποιώντας ένα ενισχυτή συντονισμένο στη συχνότητα του ΡΕΜ, είναι δυνατόν να μετρηθεί η διαφορά στην ένταση μεταξύ των δύο κυκλικών πολώσεων (vAC).

Η μέση συνολική ένταση του φωτός σε πολλές ταλαντώσεις PEM (vDC) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να μετρηθεί το σήμα του ενισχυτή ,ώστε να ληφθούν υπόψιν και οι σχετικές διακυμάνσεις.

* G :παράγοντας βαθμονόμησης που αφορά είτε ελλειπτικότητα είτε διαφορική απορρόφηση

Τελικό σήμα:


21

4. Χρήσιμοι Τύποι


22

Κυκλικός Διχρωισμός (ΔA) :

ΔA= ALCP - ARCP

ALCP ,ARCP : απορρόφηση αριστερόστροφα και δεξιόστροφα κυκλικά πολωμένου φωτός αντίστοιχα

Τυπολόγιο


23

Λαμβάνοντας υπόψιν το μήκος της κυψελίδας και την συγκέντρωση της ένωσης μπορούμε να μιλήσουμε για μοριακό κυκλικό διχρωισμό (Δε).

Δε =εLCP -εRCP = ΔA/(C x l)

εLCP και εRCP συντελεστές μοριακής απόσβεσης για LCP και RCP αντίστοιχα

C= μοριακή συγκέντρωση l= μήκος κυψελίδας σε cm

Τυπολόγιο


24

Ο κυκλικός διχρωισμός μπορεί να εκφραστεί και σε βαθμούς ελλειπτικότητας (θ).

Τυπολόγιο

** Ελλειψοειδούς πολωμένο φως είναι φως που δεν είναι πλήρως κυκλικά πολωμένο, αλλά, αντίθετα, έχει ελλειπτικό σχήμα.


25

Το γραμμικά πολωμένο φως έχει 0 βαθμούς ελλειπτικότητας (θ), ενώ το LCP ή RCP έχει+ ή - 45 βαθμούς αντίστοιχα.

ΔA = θ/32.982

[θ] = 100xθ/(Cxl)

Αντίστοιχα, η μοριακή ελλειπτικότητα θα είναι:

Τυπολόγιο


26

5. Εφαρμογή στη Βιοανάλυση


27

Ισχυρή και απλή τεχνική, γρήγορη και εύκολη

Πληροφορίες για τη δομή του μορίου (δευτεροταγής και τριτοταγής δομή των πρωτεϊνών)

CD φασματοσκοπία


28

Οι πρωτείνες αποτελούνται από αμινοξέα που (με την εξαίρεση της γλυκίνης) είναι οπτικά ενεργά καθώς έχουν ασύμμετρο άτομο C.

Τα στοιχεία της δευτεροταγούς δομής (α-έλικα, β πτυχωτή επιφάνεια) επιβάλλουν επιπλέον χειρομορφία στο μόριο της πρωτεΐνης.

Πρόσθετες ομάδες που συνδέονται σε μια πρωτεΐνη (π.χ. ομάδα της αίμης κ.ο.κ.)

Πλευρικές ομάδες των αμινοξέων (κυρίως η τρυπτοφάνη και η τυροσίνη)

Που οφείλεται ο κυκλικός διχρωϊσμός στις πρωτεΐνες;


29

Με τη χρήση της CD μπορεί κανείς να εκτιμήσει το βαθμό της διαμορφωτικής τάξης (τι ποσοστό από τις πρωτεΐνες του δείγματος είναι σε α-έλικα ή / και β-δομή)


30

CD φασματοσκοπίαα-ελικοειδείς πρωτεΐνες: έχουν αρνητικές ζώνες στα 222 nm και 208 nm και μία θετική ζώνη στα 193 nm.

Πρωτεΐνες με β-δομή : έχουν αρνητικές ζώνες στα 218 nm και θετικές ζώνες στα 195 nm.

Πρωτεΐνες που εκλείπουν δευτεροταγούς δομής δεν θα έχουν καμία κορυφή πάνω από τα 210 nm.


31

Είδη


32

6. Στην πράξη...


33

Οι περισσότερες πρωτεΐνες και πεπτίδια απαιτούν τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος ώστε να μην μετουσιωθούν.

Θα πρέπει να αποφευχθεί η χρήση οπτικά ενεργών διαλυμάτων. Η CD λαμβάνει χώρα σε υψηλής διαφάνειας κυψελίδες χαλαζία ώστε να ελαχιστοποιηθεί η παρεμπόδιση.

Η κυψελίδα επιλέγεται κατάλληλα με βάση τη συγκέντρωση του δείγματος.

Προετοιμασία των δειγμάτων

Πάχος κυψελίδας (cm) Συγκέντρωση διαλύματος (mg/mL)

0.01 - 0.02 0.2 – 1.00.1 0.05 – 0.21 0.005 – 0.01


34

Συλλογή φάσματος τυφλού (αέρας): Ιδανικά θα πρέπει να είναι ευθεία πάνω στον άξονα x με μηδενική απορρόφηση.

Συλλογή φάσματος νερού.

Συλλογή φάσματος buffer ίδιας συγκέντρωσης με αυτό που χρησιμοποιείται για το δείγμα. Σε αυτό το βήμα φαίνεται εάν το buffer είναι κατάλληλο για τη μέτρηση,αφού το φάσμα του θα πρέπει να αλληλοεπικαλύπτεται με το φάσμα του νερού χωρίς πειραματικό σφάλμα.

Συλλογή φάσματος δείγματος: Για καλύτερη ακρίβεια η μέτρηση λαμβάνεται τρεις φορές.

Για πρωτεΐνες η μέτρηση λαμβάνεται πολλές φορές και δεν πρέπει να μεταβάλλεται με το χρόνο.

Διαδικασία Συλλογής Φάσματος CD


35

CD spectra of blank and water (left), buffer (center), and sample (right). Lysozyme in 10 mM sodium phosphate pH 7.


36

7. Επεξεργασία Φάσματος


37

Μπορεί να θεωρηθεί ότι

το CD φάσμα (ή η ελλειπτικότητα) μιας πρωτεΐνης είναι γραμμικός συνδυασμός των φασμάτων που δίνουν τα στοιχεία δευτεροταγούς δομής της

δηλαδή ισχύει:


38

Στην πραγματικότητα βέβαια το πρόβλημα που τίθεται είναι το αντίστροφο:

Έχουμε στη διάθεσή μας το CD φάσμα μιας πρωτεΐνης και καλούμαστε να προσδιορίσουμε τη διαμόρφωσή της

Για να γίνει κάτι τέτοιο αρκεί να επιλεχθούν τρεις τιμές από το CD φάσμα της πρωτεΐνης (και να λυθεί ένα σύστημα 3 εξισώσεων με τρείς αγνώστους ( )).


39

Η βέλτιστη προσαρμογή στα πειραματικά δεδομένα επιτυγχάνεται με τον κατάλληλο συνδυασμό των τριών πρότυπων καμπύλων που αποκαλύπτει την αναλογία, στη δευτεροταγή δομή της πρωτεΐνης, των δομικών στοιχείων που αυτές περιγράφουν.


40

8. Χρησιμότητα στη Βιοανάλυση


41

ΧρησιμότηταΤα φάσματα CD των

πρωτεϊνών αντιπροσωπεύουν μοναδικά διαμόρφωση τους.

Παρακολούθηση δομικών αλλαγών σε δυναμικά

συστήματα

Μελέτη της κινητικής της πρωτεΐνης

Χρήση CD σε έρευνες σταθερότητας

πρωτεΪνών και μοντέλων αλληλεπίδρασης


42

Αν μεταβληθεί το pH ή τη θερμοκρασία συμβαίνει μετουσίωση της πρωτεΐνης (δηλ. η πρωτεΐνη χάνει τη λειτουργικότητά της αποδιατασσόμενη). Όμως η αποδιατεταγμένη πρωτεΐνη έχει διαφορετικό CD φάσμα από το φάσμα που έχει η λειτουργική μορφή.

Μπορεί έτσι να επιλεχθεί ένα ορισμένο μήκος κύματος (και πιο συγκεκριμένα εκείνο στο οποίο η διαφορά στην ελλειπτικότητα είναι μέγιστη) και να μελετηθεί πως αλλάζει η τιμή της ελλειπτικότητας ως συνάρτηση της θερμοκρασίας (ή του pH).


43

9. Συγγενείς Τεχνικές


44

VCD φασματοσκοπία

Η παλμική CD φασματοσκοπία (VCD) χρησιμοποιεί IR φως για να καθορίσει τις 3D δομές πεπτιδίων, νουκλεϊκών οξέων, και υδατανθράκων. Έχει χρησιμοποιηθεί για να δείξει το σχήμα και τον αριθμό των ελίκων που βρίσκονται σε Α-,Β- και Ζ-DNA.

Είναι μια σχετικά νέα τεχνική και έχει τη δυνατότητα να είναι ένα πολύ ισχυρό εργαλείο.

Η επίλυση των φασμάτων απαιτεί εκτεταμένους μαθηματικούς υπολογισμούς, καθώς και υψηλές συγκεντρώσεις και πρέπει να εκτελείται σε νερό.

Συγγενείς τεχνικές


45

Συγγενείς τεχνικές ΜCD φασματοσκοπία

Η μαγνητική CD φασματοσκοπία (ΜCD) δεν απαιτεί το δείγμα να διαθέτει οπτική δραστικότητα, επειδή αυτή επάγεται με την εφαρμογή μαγνητικού πεδίου παράλληλα προς το φως.

Είναι χρήσιμη για τη λήψη λεπτομερών πληροφοριών σχετικά με την ηλεκτρονιακή δομή του απορροφώντος μέρους.

Είναι ισχυρή μέθοδος για τη μελέτη των μαγνητικών ιδιοτήτων των υλικών και έχει πρόσφατα χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση της ένωσης σιδήρου-αζώτου, του ισχυρότερου γνωστού μαγνήτη


46

Συγγενείς τεχνικές Φασματοσκοπία γραμμικού διχρωισμού (LD)

Τεχνική στην οποία μετράται η διαφορά μεταξύ της απορρόφησης κάθετα και παράλληλα πολωμένου φωτός. Σε αυτή την τεχνική το επίπεδο της πόλωσης του φωτός

δεν περιστρέφεται. Η LD φασματοσκοπία χρησιμοποιείται για τον

προσδιορισμό του προσανατολισμού των οπτικά ενεργών ομάδων στο χώρο.


47

CD NMR

Μελέτη μορίων οποιουδήποτε μεγέθους Υπάρχει όριο μοριακού μεγέθους

Τα πειράματα είναι γρήγορα: Η μέτρηση μονοχρωματικής ακτινοβολίας απαιτεί milliseconds

Δεν υπάρχει συνθήκη σταθερή για κάθε μέτρηση

Μοναδική ευαισθησία στην ασυμμετρία της δομής του δείγματος

Απαιτούνται ειδικές συνθήκες για την διαφοροποίηση των εναντιομερών

Μπορεί να δουλέψει με πολύ μικρές συγκεντρώσεις, αλλάζοντας το μήκος της κυψελίδας μέχρι να επιτευχθεί ευδιάκριτη απορρόφηση

Υπάρχει όριο στην ευαισθησία του οργάνου.

Ο συνολικός χρόνος είναι λίγος (χρήση UV) επιτρέποντας έτσι να μελετηθούν δυναμικά συστήματα και κινητική.

Ο συνολικός χρόνός είναι μεγάλος, η χρήση των ραδιοκυμάτων δίνει το μέσο όρο όλων των δυναμικών συστημάτων.

Μόνο ποιοτική ανάλυση των δεδομένων είναι δυνατή Μπορεί να δειξαχθεί και ποσοτική ανάλυση για την εκτίμηση της χημικής σύστασης.

Δεν παρέχει δομική ανάλυση ατομικού επιπέδου Πολύ ισχυρό εργαλείο για την ατομική ανάλυση, παρέχει εξαιρετικές πληροφορίες για τους χημικούς δεσμούς στο σύστημα.

Το παρατηρηθέν φάσμα δεν είναι αρκετό για τον ισχυρισμό ύπαρξης μιας και μόνο πιθανής δομής

Το φάσμα NMR είναι δίνει πληροφορίες-κλειδί για την απόδοση μοναδικής δομής.

Σύγκριση τεχνικών


48

10. Παραδείγματα - Εργασίες


49

Applications of Circular Dichroism for Structural Analysis of Gelatin and Antimicrobial PeptidesRamamourthy Gopal , Jin Soon Park, Chang Ho Seo and Yoonkyung ParInt. J. Mol. Sci. 2012, 13, 3229-3244; doi:10.3390/ijms13033229

Abstract: Circular dichroism (CD) is a useful technique for monitoring changes in the conformation of antimicrobial peptides or gelatin. In this study, interactions between cationic peptides and gelatin were observed without affecting the triple helical content of the gelatin, which was more strongly affected by anionic surfactant. The peptides did not adopt a secondary structure in the presence of aqueous solution or Tween 80, but a peptide secondary structure formed upon the addition of sodium dodecyl sulfate (SDS). The peptides bound to the phosphate group of lipopolysaccharide (LPS) and displayed an alpha-helical conformation while (KW)4 adopted a folded conformation. Further, the peptides did not specifically interact with the fungal cell wall components of mannan or laminarin. Tryptophan blue shift assay indicated that these peptides interacted with SDS, LPS, and gelatin but not with Tween 80, mannan, or laminarin. The peptides also displayed antibacterial activity against P. aeruginosa without cytotoxicity against HaCaT cells at MIC, except for HPA3NT3-analog peptide. In this study, we used a CD spectroscopic method to demonstrate the feasibility of peptide characterization in numerous environments. The CD method can thus be used as a screening method of gelatin-peptide interactions for use in wound healing applications.

Παράδειγμα 1ο


50

Figure 1. Effects of peptides on Circular dichroism (CD) spectra of gelatin in the wavelength region from 250–190 nm. Gelatin solution was treated with peptides at an increasing molar ratio of gelatin to peptide from 11:1 to 11:3 and incubated for 10 min at 25 °C. (A) (KW)4; (B) HPA3NT3-analog; (C) NRC-16; (D) Magainin-II; and (E) Reduced glutathione (GSH). CD spectra of 0.1% gelatin in the absence of peptides (solid line). Peptide concentrations were as follows: 50 µM (dotted line), 100 µM (dashed line), and 200 µM (dashed-dotted line). (F) CD spectra of gelatin in the absence (solid line) or presence of 1 mM SDS (dotted line), 5 mM SDS (dashed line), and 10 mM SDS (dashed dotted line).


51

Figure 2. CD spectra of peptides in aqueous solution (dashed line) as well as in the presence of 0.1% Tween 80 (dotted line) and 30 mM sodium dodecyl sulfate (SDS) (solid line). (A) (KW)4; (B) HPA3NT3-analog; (C) NRC-16; and (D) Magainin-II.


52

Figure 3. CD spectra of peptides in the presence of 0.1% mannan (dashed line), 0.1% laminarin (dotted line), and 0.1% lipopolysaccharide (LPS) (solid line). (A) (KW)4; (B) HPA3NT3-analog; (C) NRC-16; and (D) Magainin-II.


53

ConclusionThe native structure of gelatin was not altered upon treatment with peptides. Therefore, changes in the structural properties of gelatin upon interaction with peptides assist the preparation of gelatin-peptide sheets. In this study, the tested peptides showed antimicrobial activity, which suggests that they might be useful in the development of a topical application for wound sites. Among them, (KW)4 possesses a simple composition with microbial selective properties, making it economically viable for many applications, including inhibition of bacterial infection at wound sites


54

Monitoring protein aggregation during thermal unfolding in circular dichroism experiments

Sangeeta Benjwal,1,3 Shikha Verma,2,3 Klaus-Heinrich Röhm,2 and Olga GurskyProtein Sci. 2006 Mar; 15(3): 635–639. doi: 10.1110/ps.051917406Abstract: Thermal unfolding monitored by spectroscopy or calorimetry is widely used to determine protein stability. Equilibrium thermodynamic analysis of such unfolding is often hampered by its irreversibility, which usually results from aggregation of thermally denatured protein. In addition, heat-induced protein misfolding and aggregation often lead to formation of amyloid-like structures. We propose a convenient method to monitor in real time protein aggregation during thermal folding/ unfolding transition by recording turbidity or 90° light scattering data in circular dichroism (CD) spectroscopic experiments. Since the measurements of turbidity and 90° light scattering can be done simultaneously with far- or near-UV CD data collection, they require no additional time or sample and can be directly correlated with the protein conformational changes monitored by CD. The results can provide useful insights into the origins of irreversible conformational changes and test the linkage between protein unfolding or misfolding and aggregation in various macromolecular systems, including globular proteins and protein–lipid complexes described in this study, as well as a wide range of amyloid-forming proteins and peptides.

Παράδειγμα 2ο


55

Figure 1. Thermal unfolding and aggregation of wild type and mutant EcA2 monitored by CD and turbidity. (A) CD melting curves, Θ222(T), recorded at 222 nm report on α-helical unfolding. (B) Turbidity (dynode voltage) melting curves, V(T), recorded at 285 nm report on the heat-induced increase in the particle size due to protein aggregation. A reduction in V(T) of the WT observed upon heating >70°C reflects precipitation of the heat-unfolded protein. The data in A and B are shifted along the Y-axis to avoid overlap. Sample conditions are described in the text; heating rate is 80 K/h.


56

Figure 2. Thermal denaturation and fusion of L34P apoC-1:DMPC complexes monitored by far-UV CD and 90° light scattering. (A) Heating and cooling CD data, Θ222(T), which were recorded upon heating at a rate of 80 K/h (▪) and 11 K/h (□), report on protein unfolding and dissociation from the lipoprotein. (B) Light scattering data, which were recorded at 222 nm simultaneously with the CD data in A, report on the increase in the particle size due to fusion. Horizontal arrows indicate shifts in the heating curves upon reduction in the scan rate from 80 (•) to 11 (○) K/h; vertical arrows indicate the onset of the protein refolding (A) and lipoprotein reconstitution (B) upon cooling. Protein and lipid concentrations are 20 μg/mL and 80 μg/mL, respectively.


57

Conclusion: Our results demonstrate that monitoring heat-induced changes in turbidity or light scattering in CD experiments can provide valuable insights into the origins of irreversibility in protein unfolding, such as protein aggregation or lipoprotein fusion described in this work. The proposed approach should be particularly useful for correlating heat-induced microscopic and macroscopic changes, such as β-sheet folding and formation of fibrillar aggregates, in a variety of amyloidogenic proteins, and thereby help to dissect protein misfolding and aggregation during amyloid fiber formation. Since turbidity and light scattering can be recorded simultaneously with CD, the approach requires no additional time or sample and facilitates very accurate correlation of the protein conformational changes and aggregation. This helps to find out whether the protein aggregation occurs during or after the unfolding, and thereby determine whether the unfolding is amenable to equilibrium thermodynamic analysis.


58

CD φασματοσκο

πία

Ομοιότητες πρωτεϊνών

wild-type και μεταλλαγμέν

ων

Έκταση μετουσίωσης από αλλαγή

στη θερμοκρασία ή

το χημικό περιβάλλον

Δομικές μεταβολλές

κατά τη συμπλοκο-

ποίηση

Συνοψίζοντας...


59

Ευχαριστώ για την προσοχή σας

Basta Anastasia- CD spectroscopy

Documents

Transcript of Basta Anastasia- CD spectroscopy