Bactérias de Gram negativo produtoras de β-lactamases e...
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Universidade de Lisboa Faculdade de Ciências Departamento de Biologia Animal Bactérias de Gram negativo produtoras de β-lactamases e mecanismos moleculares implicados na expressão da resistência à tigeciclina Stephanie Vieira Barbosa Dissertação Mestrado em Biologia Humana e Ambiente 2013
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Universidade de Lisboa
Faculdade de Ciências
Departamento de Biologia Animal
Bactérias de Gram negativo produtoras de β-lactamases e
mecanismos moleculares implicados na expressão da
resistência à tigeciclina
Stephanie Vieira Barbosa
Dissertação
Mestrado em Biologia Humana e Ambiente
2013
2013
Bactérias de Gram negativo produtoras de β-lactamases e
mecanismos moleculares implicados na expressão da
resistência à tigeciclina
Stephanie Vieira Barbosa
Universidade de Lisboa
Faculdade de Ciências
Departamento de Biologia Animal
Dissertação
Mestrado em Biologia Humana e Ambiente
Orientadores
Professora Doutora Manuela Caniça, Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge
Professora Doutora Maria Teresa Rebelo, Departamento de Biologia Animal, Faculdade de
Ciências, Universidade de Lisboa
2013
Agradecimentos
i
Agradecimentos
À Doutora Manuela Caniça, por me receber no laboratório, proporcionando a
realização desta tese de mestrado, assim como pela orientação, disponibilidade e
conhecimentos partilhados, que tanto acrescentou na minha formação.
À Doutora Eugénia Ferreira, pela orientação e contribuição no laboratório,
bem como pela boa disposição que tornou a rotina mais agradável.
À Doutora Teresa Rebelo, pelo acompanhamento e disponibilidade
demonstrada.
À Doutora Vera Manageiro pela paciência e pela enorme ajuda no
desenvolvimento das práticas laboratoriais, que tanto contribuiu na conclusão deste
trabalho.
À Daniela Dias por toda a ajuda prestada no laboratório e partilha de
conhecimentos, principalmente na parte final deste trabalho.
À Constança Simões e Joana Almeida pela amizade, pelos bons momentos e
por me ajudarem nos momentos que eu precisei.
Aos meus pais, por todo amor e apoio constante, apesar das centenas de
quilómetros que nos separam.
À minha família por todo apoio, principalmente à minha irmã Cássia pelo
momentos compartilhados e pela paciência ao longo deste ano.
Aos meus amigos, que sabem quem são, pela amizade, incentivo e por terem
acreditado sempre em mim.
À Doutora Manuela Caniça e ao Instituto Nacional da Saúde Dr. Ricardo
Jorge pelas condições de trabalho que me proporcionaram e colaboração prestada sem
as quais não seria possível a realização deste trabalho.
Resumo
ii
Resumo
A emergência de bactérias de Gram negativo com resistência aos antibióticos,
particularmente, as produtoras de β-lactamases, tem vindo a comprometer as opções de
tratamento disponíveis. Este trabalho teve como objetivo avaliar a suscetibilidade e
caracterizar os mecanismos de resistência à tigeciclina, pela ação de bombas de efluxo,
em 211 isolados de Gram negativo, assim como esclarecer a atividade in vitro deste
antibiótico em bactérias com suscetibilidade diminuída a outras classes de antibióticos,
sobretudo β-lactâmicos, e com eventual produção de β-lactamases.
Os testes de suscetibilidade permitiram identificar 73% de isolados suscetíveis à
tigeciclina e 89% com multirresistência, dos quais 70% eram suscetíveis à tigeciclina.
Verificou-se ainda uma percentagem elevada de suscetibilidade à colistina e amicacina,
bem como de suscetibilidade diminuída aos antibióticos β-lactâmicos, com exceção dos
carbapenemes.
A caracterização molecular dos mecanismos de resistência aos antibióticos β-
lactâmicos, permitiu identificar a produção de β-lactamases: penicilinases, ESBLs da
família CTX-M [CTX-M-15-(tipo), CTX-M-1, CTX-M-32 e CTX-M-14], TEM (TEM-
4, TEM-10), SHV (SHV-2, SHV-12, SHV-55) e GES (GES-7), bem como
carbapenemases (KPC-3) e AmpC (CMY-2, DHA-1, MIR-tipo); 65% destes isolados
apresentaram suscetibilidade à tigeciclina.
A caracterização molecular dos mecanismos implicados na resistência à
tigeciclina, permitiu identificar no gene ramR de 9 dos 20 isolados de Klebsiella
pneumoniae com suscetibilidade diminuída àquele antibiótico, uma deleção, uma
inserção e de uma a quatro mutações pontuais num mesmo gene, contribuindo para a
sobre-expressão da bomba de efluxo AcrAB. No gene marR de 12 isolados de
Escherichia coli (5 com e 6 sem suscetibilidade diminuída à tigeciclina), foram
detetadas duas mutações pontuais, que sugerem estar associadas à resistência a diversos
antibióticos, podendo contribuir para fenótipos de multirresistência.
Este estudo evidencia diversidade de β-lactamases, sobretudo ESBL, e
emergência de carbapenemases em isolados de Gram negativo. No entanto, estes
isolados mantêm uma importante suscetibilidade aos cabapenemes, colistina, amicacina
e tigeciclina.
Palavras-chave: tigeciclina, Gram negativo, β-lactamase, bomba de efluxo
Abstract
iii
Abstract
The emergence of antibiotic resistant Gram negative bacteria, particularly β-
lactamase-producing bacteria, seriously compromises the efficacy of the treatment
options available. This study aimed to evaluate the antimicrobial susceptibility, and to
characterize the tigecycline resistance due to efflux pump production, in a collection of
211 Gram negative clinical isolates. Moreover, it meant to clarify the in vitro activity of
tigecycline against isolates resistant to other antibiotic classes, such as β-lactams,
eventually related to β-lactamase production.
Susceptibility testing evaluation identified 73% of tigecycline susceptible
isolates, and 89% of multidrug resistance, among which 70% were susceptible to this
antibiotic. Although there was a high prevalence of β-lactam resistance, carbapenems
were still effective against the majority of the isolates studied, as well as colistin and
amikacin.
Globally, molecular characterization allowed the detection of penicillinases,
ESBLs from families CTX-M [CTX-M-15-(type), CTX-M-1, CTX-M-32 and CTX-M-
14], TEM (TEM-4, TEM-10), SHV (SHV-2, SHV-12, SHV-55) and GES (GES-7), as
well as carbapenemases (KPC-3) and AmpC β-lactamases ( CMY-2, DHA-1, MIR-
tipo); among those, 65% were susceptible to tigecycline.
The molecular analyses of tigecycline resistance mechanisms revealed one
deletion, one insertion and one to four point mutations in the ramR gene that might
contribute to the overexpression of AcrAB efflux pump, in 9 out of 20 Klebsiella
pneumoniae isolates showing reduced susceptibility. Considering the analyses of the
marR gene from 12 Escherichia coli isolates (5 with and 6 without tigecycline
resistance), two point mutations were detected, which might be accountable for the
resistance to several antimicrobial classes, contributing to multidrug resistance
scenarios.
This study showed a great diversity of β-lactamases, such as ESBL, and the
emergence of carbapenemases in Gram negative bacteria. Nevertheless, the studied
isolates still showed decisive susceptibility patterns to carbapenems, colistin, amikacin
and tigecycline.
Key-words: tigecycline, Gram negative, β-lactamases, efflux pump
Índice
iv
Índice
Agradecimentos .............................................................................................................................. i
Resumo .......................................................................................................................................... ii
Abstract ........................................................................................................................................ iii
Índice de Figuras .......................................................................................................................... vi
Índice de Tabelas ......................................................................................................................... vii
I. Introdução .................................................................................................................................. 1
1. Antibióticos e Resistências ........................................................................................................ 1
1.1.Classes de Antibióticos ........................................................................................................... 1
1.2.Mecanismos de resistência aos antibióticos ............................................................................ 2
1.2.1 Resistência Intrínseca ........................................................................................................... 3
1.2.2. Resistência Adquirida ......................................................................................................... 3
2. Antibióticos β-lactâmicos .......................................................................................................... 4
2.1. Mecanismo de ação dos antibióticos β-lactâmicos ................................................................. 7
2.2. Mecanismos de resistência aos antibióticos β-lactâmicos ...................................................... 7
2.2.1. β-lactamases ........................................................................................................................ 8
2.2.1.1 Classificação de β-lactamases ........................................................................................... 9
2.2.1.2. Família TEM .................................................................................................................. 10
2.2.1.3. Família SHV ................................................................................................................... 11
2.2.1.4. Família CTX-M .............................................................................................................. 11
2.2.1.5. Família OXA .................................................................................................................. 12
2.2.1.6. β-lactamases AmpC........................................................................................................ 13
2.2.1.7. Carbapenemases ............................................................................................................. 14
3. Tigeciclina ............................................................................................................................... 15
3.1. Estrutura química e mecanismo de ação da tigeciclina ........................................................ 16
3.2. Espetro de ação da tigeciclina .............................................................................................. 17
3.3. Resistência à tigeciclina ....................................................................................................... 18
3.3.1. Bomba de efluxo AcrAB-TolC da família RND ............................................................... 19
4. Objetivos ................................................................................................................................. 23
II. Material e Métodos ................................................................................................................. 24
1.Isolados bacterianos ................................................................................................................. 24
2. Caracterização fenotípica: suscetibilidade aos antibióticos .................................................... 25
2.1. Método de microdiluição ..................................................................................................... 25
2.1.1. Preparação da solução-mãe dos antibióticos ..................................................................... 25
2.1.2. Preparação das concentrações dos antibióticos ................................................................. 26
Índice
v
2.1.3. Preparação das diluições dos antibióticos na microplaca .................................................. 26
2.1.4. Preparação do inóculo bacteriano...................................................................................... 27
2.2. Método de difusão por disco ................................................................................................ 28
2.3. Método de E-teste................................................................................................................. 29
2.4. Teste de sinergia com meropeneme ..................................................................................... 29
3. Caracterização genotípica: mecanismos de resistência aos antibióticos ................................. 30
3.1. Extração de DNA ................................................................................................................. 30
3.2. Pesquisa de genes que codificam β-lactamases .................................................................... 31
3.3. Pesquisa de genes implicados na resistência à tigeciclina.................................................... 34
3.4. Eletroforese em gel de agarose e visualização de DNA ....................................................... 35
3.5. Purificação dos produtos de PCR ......................................................................................... 35
3.6. Sequenciação nucleotídica ................................................................................................... 36
4. Caracterização bioquímica: β-lactamases ............................................................................... 36
4.1. Extração de β-lactamases ..................................................................................................... 37
4.2. Teste do Nitrocefin ............................................................................................................... 37
4.3. Gel de focagem isoelétrica ................................................................................................... 37
4.3.1. Preparação do gel de migração .......................................................................................... 37
4.3.1.1. Migração ........................................................................................................................ 38
4.3.1.2. Preparação do gel de revelação ...................................................................................... 38
III. Resultados ............................................................................................................................. 39
1. Avaliação da suscetibilidade de bactérias de Gram negativo aos antibióticos ........................ 39
1.1. Suscetibilidade a 8 classes de antibióticos ........................................................................... 39
1.2. Suscetibilidade à tigeciclina ................................................................................................. 42
1.3. Análise da multirresistência ................................................................................................ 47
2. Caracterização genotípica dos isolados produtores de β-lactamases ...................................... 49
2. 1. ESBLs, PMAβ e penicilinases ............................................................................................ 49
2. 2. Carbapenemases .................................................................................................................. 56
3. β-lactamases de diferentes famílias produzidas por bactérias de Gram negativo com ou sem
suscetibilidade à tigeciclina ......................................................................................................... 57
4. Contribuição da bomba de efluxo AcrAB-TolC na atividade da tigeciclina ........................... 59
4.1. Análise da sequência nucleotídica do gene marR em E. coli ............................................... 59
4.2. Análise da sequência nucleotídica do gene ramR em K. pneumoniae ................................. 59
IV. Discussão .............................................................................................................................. 62
V. Bibliografia ............................................................................................................................. 74
Índice de Figuras
vi
Índice de Figuras
Figura 1 - Estrutura química dos antibióticos β-lactâmicos (Adaptado de Martín et al., 2010;
Nordmann et al., 2012). ................................................................................................................. 5
Figura 2 - Estrutura química dos inibidores de β-lactamases (Adaptado de Nordmann et al.,
2012). ............................................................................................................................................ 5
Figura 3 - Classificação das ß-lactamases relacionando o perfil do substrato e dos inibidores de
ß-lactamases com a sua estrutura molecular. Cb, carbapenemes; Cf, cefalosporinas de primeira
geração; CA, ácido clavulânico; EDTA, ácido etilenodiaminotetracético; Esc, Cefalosporina de
espectro alargado; M, monobactamos; Pn, penicilinas (Adaptado de Bush, 2013). ................... 10
Figura 4 - Estrutura química da tigeciclina (A) e da minociclina (B) (Dean et al. 2003) ........... 17
Figura 5 - Estrutura do sistema de efluxo AcrAB-TolC em E.coli (Adaptado de Alvarez-Ortega
et al., 2013). ................................................................................................................................. 20
Figura 6 - Organização genética do locus marAB em E. coli ; PmarI e PmarII, promotores
(Alekshun e Levy, 1999). ............................................................................................................ 21
Figura 7 - Via de regulação da bomba de efluxo AcrAB: a proteina RamR reprime a expressão
do gene ramA que codifica o activador trancripcional acrAB. (Adaptado de Yamasaki et al.,
2013). .......................................................................................................................................... 22
Figura 8 - Distribuição, pelos hospitais de origem, de 211 isolados que constituem a amostra do
estudo. ......................................................................................................................................... 24
Figura 9 - Representação da diluição seriada dos antibióticos na microplaca ............................ 27
Figura 10 - Esquema utilizado para interpretação dos resultados obtidos no teste de sinergia com
meropeneme para deteteção de metalo-β-lactamases, carbapenemases de classe A ou D e β-
lactamases AmpC (cromossómicas ou plasmídicas). BOR, ácido borónico; CLOX, cloxacilina.
..................................................................................................................................................... 30
Figura 11 - Distribuição de 199 isolados suscetíveis e não suscetíveis à tigeciclina por grupo
etário dos doentes. TG, tigeciclina; S, sucetíveis; I/R, suscetibilidade diminuída; (Não
contempla 12 (6%) dos isolados do estudo, cuja idade dos doentes se desconhece). ................. 43
Figura 12 - Distribuição do (A) número de isolados e (B) percentagem, de acordo com a
suscetibilidade à tigeciclina, multirresistência e produção de β-lactamases; OXA: OXA-1-tipo
(n=9); ND, mecanismo de resistência não detetado ou sobrexpressão de β-lactamases (n=16). a
Isolados cuja produção de ESBL CTX-M (isoladamente ou com coexpressão de KPC ou
PMAβ) não implicou a eventual pesquisa da presença de outros genes blaESBL. TGC,
tigeciclina; S, suscetível; I/R, suscetibilidade diminuída; MDR, multirresistente. ..................... 58
Figura 13 - Alinhamento das sequências do gene ramR com a sequência de referência
(Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578 (CP000647)) do nucleótido G401
ao
nucleótido G480
, representando a deleção nucleotídica do nucleótido G411
ao nucleótido A421
no
isolado TG93. .............................................................................................................................. 60
Figura 14 - Alinhamento das sequências do gene ramR com a sequência de referência
(Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578 (CP000647)) do nucleótido G1 ao
nucleótido G80
, representando a inserção de 2 nucleótidos entre o nucleótido 50 e 51 no isolado
TG70. .......................................................................................................................................... 60
Índice de Tabelas
vii
Índice de Tabelas
Tabela 1 - Representação de antibióticos, mecanismos de ação e alvos moleculares (Chopra et
al., 2002; Murray et al., 2007; Tenover, 2006) ............................................................................. 2
Tabela 2 - Classificação das cefalosporinas e exemplos de antibióticos (Murray et al., 2007). ... 6
Tabela 3 - Origem de genes que codificam β-lactamases AmpC (Adaptado de Livermore e
Woodford, 2006) ......................................................................................................................... 14
Tabela 4 - Antibióticos, concentrações das soluções-mãe, solventes e potência dos antibióticos.
..................................................................................................................................................... 25
Tabela 5 - Antibióticos, concentração da solução CIM, diluentes e concentrações testadas na
determinação da concentração inibitória mínima. ....................................................................... 26
Tabela 6 - Sequência de primers para pesquisa de diferentes genes bla utilizados no PCR e na
sequênciaçãoa, tamanho dos respetivos fragmentos e temperatura de hibridação. ...................... 32
Tabela 7 - Sequência e tamanho dos primers ramR e marAB e as condições utilizadas nas
reações de amplificação. ............................................................................................................. 35
Tabela 8 - Suscetibilidade de 211 isolados de Gram negativo a antibióticos de diferentes classes.
..................................................................................................................................................... 41
Tabela 9 - Intervalo de concentrações inibitórias mínimas (CIM) nas quais 50% (CIM50) e 90%
(CIM90) dos isolados foram inibidos por 7 antibióticos de 4 classes diferentes, em relação ao
total de isolados (n=211) e à suscetibilidade ou suscetibilidade diminuída à tigeciclina. ........... 44
Tabela 10 - Distribuição de 187 isolados com multirresistência aos antibióticos, em 211 isolados
de Gram negativo, realçando os perfis com e sem suscetibilidade diminuída à tigeciclina, por
espécie bacteriana. ....................................................................................................................... 48
Tabela 11 - Genótipo de 177 isolados, de diferentes espécies, com suscetibilidade diminuída à
cefotaxima, detetados como possíveis produtores de ESBL por métodos fenotípicos: β-
lactamases expressas, perfil de resistência aos antibióticos β-lactâmicos e distribuição por
hospital a b
. ................................................................................................................................... 51
Tabela 12 - Genótipo de 2 isolados com suscetibilidade diminuída à cefotaxima, produtores de
ESBL, mas sem evidência fenotípica de produção de ESBL: β-lactamases expressas, perfil de
resistência aos antibióticos β-lactâmicos e distribuição por hospital. ......................................... 53
Tabela 13 - Genótipo de 32 isolados com ou sem suscetibilidade diminuída à cefotaxima, sem
evidência fenotípica e genotípica de produção de ESBL: β-lactamases expressas, perfil de
resistência aos antibióticos β-lactâmicos e distribuição por hospital. ......................................... 55
Tabela 14 - Isolados produtores de carbapenemase de classe A (KPC-3) .................................. 56
Tabela 15.β-lactamases identifcadas nos 211 isolados estudados, com e sem blaCTX-M. ............ 57
Tabela 16 - Mutações nucleotídicas no gene marR da estirpe de referência e de 12 isolados
clínicos e respetivas substituições aminoacídicas. ...................................................................... 59
Tabela 17 - Mutações nucleotídicas no gene ramR da estirpe de referência MGH 78578
(CP000647) e de 20 isolados clínicos e respetivas substituições aminoacídicas encontradas. ... 61
Introdução
1
I. Introdução
1. Antibióticos e Resistências
A descoberta e o desenvolvimento dos antibióticos no início do século XX –
com a introdução das sulfonamidas nos anos 30 e da penicilina nos anos 40 – foi um
marco importante na história da medicina. Desde então foram descobertas várias classes
de antibióticos, quer de origem natural, quer sintética: aminoglicosídeos, glicopeptídeos,
macrólidos, fluoroquinolonas, entre outras (Van Hoek et al., 2011). Contudo, as
bactérias desenvolveram mecanismos de resistência aos antibióticos, resultante,
essencialmente, da utilização inapropriada e indiscriminada dos antibióticos. Isto deve-
se à pressão seletiva, que resulta do uso, sem controlo, de antibióticos, tanto a nível
clínico, como ao nível comercial, proporcionando a seleção e predominância de
microrganismos resistentes (Rice, 2009). A emergência e a prevalência destes
microrganismos constitui uma das mais importantes ameaças à saúde pública, a nível
mundial, com extensivas implicações na morbilidade e mortalidade, assim como no
aumento dos custos em saúde e cuidados médicos (Fraise, 2006).
1.1. Classes de Antibióticos
As classes de antibióticos utilizados no tratamento de infeções por bactérias são
determinadas de acordo com os alvos em que atuam e com os mecanismos de ação que
determinam (Tabela 1). Os antibióticos podem exercer uma atividade bactericida ou
bacteriostática, podendo ser classificados da seguinte forma: anti-parietais, quando
inibem a síntese de peptidoglicano da parede celular; anti-membranares, quando alteram
a permeabilidade da membrana celular; inibidores da síntese proteica, associando-se a
alvos ribossomais; inibidores da síntese dos ácidos nucleicos; e anti-metabólitos,
quando alteram o metabolismo energético da célula bacteriana (Murray et al., 2007;
Tenover, 2006).
A classe dos β-lactâmicos e glicilciclinas, com maior relevância para o presente
trabalho, encontram-se descritas com mais detalhe nos tópicos 2 e 3, respetivamente.
Introdução
2
Tabela 1 - Representação de antibióticos, mecanismos de ação e alvos moleculares (Chopra et al., 2002; Murray et
al., 2007; Tenover, 2006)
Antibióticos/Classe Mecanismo de ação Alvo molecular Exemplos de
antibióticos
β-lactâmicos Inibição da síntese de
peptidoglicano
Transpeptidases,
carboxipeptidases Penicilinas
Glicopeptídeos Inibição da síntese de
peptidoglicano Peptidoglicano
Vancomicina,
teicoplanina
Aminoglicosídeos Inibição da síntese proteica Subunidade 30S do
ribossoma
Gentamicina,
Amicacina,
Kanamicina
Fluoroquinolonas Inibição da síntese de DNA DNA Girase e
DNA topoisomerase IV
Ácido nalidíxico
Ciprofloxacina
Macrólidos Inibição da síntese proteica Subunidade 50S do
ribossoma Eritromicina
Polimixinas
Rompimento da estrutura
fosfolipídica da membrana
celular
Fosfolípidos da membrana
celular Colistina
Fosfomicinas Inibição da síntese de
peptidoglicano
UDP-N-acetilglucosamina
enolpiruvato transferase Fosfomicina
Nitrofuranos
Inibição da descarboxilação
oxidativa do piruvato a
acetil-coenzima A
Acetil-coenzima A Nitrofurantoína
Sulfonamidas Inibição da síntese do ácido
fólico Dihidropteroato sintetase Sulfametoxazol
Trimetoprim Inibição da síntese do ácido
fólico Dihidrofolato redutase Trimetoprim
Tetraciclinas Inibição da síntese proteica Subunidade 30S do
ribossoma
Minociclina;
Doxiciclina
Glicilciclinas Inibição da síntese proteica Subunidade 30S do
ribossoma Tigeciclina
1.2. Mecanismos de resistência aos antibióticos
Apesar da diversidade de classes e mecanismos de ação dos antibióticos, as
bactérias desenvolveram estratégias de resistência a estes compostos (Barbosa e Levy,
2000a). Os mecanismos de resistência aos antibióticos incluem: alteração do local de
Introdução
3
ação do antibiótico; alteração da permeabilidade da membrana celular, impedindo a
entrada e ação do antibiótico nas células bacterianas; ativação de bombas de efluxo na
célula bacteriana, conduzindo à expansão do antibiótico para o exterior antes de
alcançar o local alvo; aumento da produção da enzima alvo e inativação do antibiótico
por ação enzimática (Van Hoek et al., 2011; Tenover, 2006). De realçar que a
resistência das bactérias pode ser intrínseca ou adquirida.
1.2.1 Resistência Intrínseca
A resistência intrínseca, é transmitida apenas verticalmente, de geração em
geração, fazendo parte das propriedades inatas, fenotípicas de microrganismos de uma
mesma espécie (Alekshun e Levy, 2007). As bactérias de Gram negativo, por exemplo,
são intrinsecamente resistentes aos glicopeptídeos. Isto resulta da incapacidade de
difusão via canais de porina na membrana externa celular, uma vez que a molécula é
muito grande (Woodford e Ellington, 2007).
1.2.2. Resistência Adquirida
Por outro lado, a resistência adquirida ocorre quando populações de bactérias
inicialmente suscetíveis se tornam resistentes a um antibiótico. O aumento da
prevalência da resistência aos antibióticos está, assim, principalmente associado à
aquisição e disseminação de genes de resistência aos antibióticos pela ação seletiva e
pela pressão do antibiótico utilizado (Tenover, 2006). As bactérias podem adquirir
resistência aos antibióticos, quer modificando o seu genoma por mutação, quer por
diferentes sistemas de transferência genética (Levy e Marshall, 2004; Tenover, 2006).
A resistência adquirida por meio de mutação e seleção denomina-se evolução
vertical, pois as bactérias com novas mutações, responsáveis pela resistência, são
selecionadas pela utilização dos antibióticos e estes eliminam as bactérias suscetíveis,
enquanto as resistentes sobrevivem e disseminam (Tenover, 2006).
A resistência adquirida pode ainda resultar da aquisição de elementos genéticos,
tais como os plasmídeos, transposões e integrões, que permitem a transferência de DNA
no genoma ou ainda entre células bacterianas, facilitando a transmissão e disseminação
de genes de resistência aos antibióticos através de mecanismos genéticos (Levy e
Introdução
4
Marshall, 2004). A transferência genética denominada evolução horizontal constitui o
principal meio de difusão de genes de resistência, que pode ocorrer entre isolados da
mesma espécie ou entre isolados de diferentes espécies ou géneros (Woodford e
Ellington, 2007). A transferência genética entre as bactérias pode ocorrer de diferentes
formas: transformação, conjugação e transdução. A transformação é um mecanismo
pelo qual o DNA libertado por uma bactéria (dadora) é captado e incorporado por outras
bactérias (recetoras). Na conjugação há contacto físico bactéria-bactéria e o material
genético é transferido através de pilis de uma célula (dadora) para a outra (recetora). A
transdução é um processo que consiste na transferência de genes de resistência por
intermédio de um bacteriófago (Alekshun e Levy, 2007; Barbosa e Levy, 2000a;
Tenover, 2006). Através destes mecanismos de troca genética muitas bactérias podem
tornar-se resistentes a várias classes de antibióticos; se a resistência ocorrer em 3 ou
mais classes de antibióticos estruturalmente diferentes, trata-se de bactérias
multirresistentes, as quais constituem a causa de maior preocupação, tanto a nível
hospitalar como a nível da comunidade (Levy e Marshall, 2004).
2. Antibióticos β-lactâmicos
Os antibióticos β-lactâmicos são a classe mais variada de antibióticos, sendo
amplamente utilizada em todo o mundo devido à sua eficácia terapêutica, baixa
toxicidade e propriedades farmacocinéticas (Livermore e Woodford, 2006; Suárez e
Gudiol, 2009). É um grupo de antibióticos com a característica comum de exibir um
anel ß-lactâmico na sua estrutura molecular (Fig.1). Esta classe divide-se em diferentes
grupos: penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, inibidores de ß-lactamases (ácido
clavulânico, sulbactam e tazobactam), carbapenemes e monobactamo (Drawz e
Bonomo, 2010; Murray et al., 2007).
As penicilinas têm como estrutura básica um núcleo pename bicíclico com um
anel tiazolidina (com um átomo de enxofre), um anel β-lactâmico e uma cadeia lateral
ligada ao grupo amina (Fig. 1). As penicilinas são frequentemente produzidas por
espécies Penicillium e Aspergillus e são classificadas de acordo com o espetro de
atividade (Liras e Martín, 2006; Martín et al., 2010).
Introdução
5
Figura 1 - Estrutura química dos antibióticos β-lactâmicos (Adaptado de Martín et al., 2010; Nordmann et al., 2012).
A penicilina G e a penicilina V pertencem ao grupo das penicilinas naturais,
tendo sido a penicilina G (Benzilpenicilina) a primeira a ser desenvolvida. A partir desta
produziram-se novas estruturas e, consequentemente, descobriram-se novos antibióticos
β-lactâmicos, atualmente utilizados na clínica médica (Drawz e Bonomo 2010). As
penicilinas dividem-se em diferentes subgrupos: as penicilinas resistentes às
penicilinases (p.e. oxacilina e cloxacilina), aminopenicilinas (p.e. amoxicilina),
carboxipenicilinas (p.e. ticarcilina) e ureidopenicilinas (p.e. piperacilina).
Os inibidores de β-lactamases são compostos associados a alguns antibióticos β-
lactâmicos de forma a inativar as β-lactamases e potenciar a ação do antibiótico. O
ácido clavulânico, o sulbactam e o tazobactam (Fig. 2) são inibidores de β-lactamases
irreversíveis, frequentemente utilizados na prática clínica (Murray et al., 2007).
Figura 2 - Estrutura química dos inibidores de β-lactamases (Adaptado de Nordmann et al., 2012).
As cefalosporinas constituem outro grupo de antibióticos β-lactâmicos, tendo, no
entanto, maior atividade sobre as bactérias de Gram negativo em comparação com as
penicilinas. O anel β-lactâmico encontra-se associado a um anel di-hidrotiazina (Fig.1).
Introdução
6
São derivados do ácido 7-aminocefalosporânico, obtidos inicialmente do fungo
Cephalosporium. Os antibióticos deste grupo encontram-se classificados em quatro
gerações, de acordo com o espetro de atividade e período de introdução na prática
clínica (Tabela 2) (Murray et al., 2007).
As cefamicinas (cefoxitina, cefotetan) (Fig.1) são semelhantes às cefalosporinas,
contudo, apresentam mais estabilidade à hidrólise mediada pelas β-lactamases, devido à
substituição de um radical de oxigénio no local do enxofre no anel dihidrotiacina
(Murray et al., 2007).
Tabela 2 - Classificação das cefalosporinas e exemplos de antibióticos (Murray et al., 2007).
Classificação de cefalosporinas Exemplos de antibióticos
Cefalosporinas de 1ª geração Cefazolina; Cefalotina; Cefapirina; Cefradina
Cefalosporinas de 2ª geração Cefaclor; Cefuroxima
Cefalosporinas de 3ª geração Cefixima; Cefotaxima; Cefriaxona;
Ceftazidima; Cefoperazona; Cefpodoxima
Cefalosporinas de 4ª geração Cefepima; Cefpiroma
Os carbapenemes (imipeneme, meropeneme, ertapeneme e doripenem)
constituem um grupo de antibióticos β-lactâmicos com amplo espetro de ação,
frequentemente utilizados para o tratamento de infeções graves e infeções causadas por
isolados produtores de β-lactamases de espetro alargado (ESBL - Extended-Spectrum ß-
Lactamase) (Patel e Bonomo, 2013). Como característica comum deste grupo de
antibióticos, o anel tiazolidina contém um átomo de carbono no local do átomo de
enxofre (Liras e Martin, 2006). Por fim, os monobactamos (aztreonam) (Fig.1) são
compostos que apresentam uma estrutura monocíclica e possuem um espetro de ação
reduzido, sendo ativos apenas em bactérias aeróbias de Gram negativo e inativos em
bactérias de Gram positivo e anaeróbias (Liras e Martin 2006; Murray et al., 2007).
Deste modo, as modificações nos radicais R e R' da cadeia lateral determinam o
espetro de ação dos antibióticos β-lactâmicos, as propriedades farmacocinéticas e a
resistência às β- lactamases.
Introdução
7
2.1. Mecanismo de ação dos antibióticos β-lactâmicos
Os antibióticos ß-lactâmicos atuam na fase parietal da biossíntese do
peptidoglicano. O peptidoglicano é o principal constituinte da parede celular, sendo
constituído por cadeias de 10 a 65 resíduos de dissacarídeos formados por moléculas de
N-acetilglucosamina (NAG) intercaladas com moléculas de ácido N-acetilmurâmico
(NAM). As proteínas de ligação à penicilina (PBPs, Penicillin-binding proteins) são
enzimas (p.ex., transpeptidases, transglucosidases, carboxipeptidases), da família das
serina proteases, que catalisam a síntese dos polímeros de peptidoglicano na parede
celular, conferindo rigidez às bactérias. Assim, os antibióticos β-lactâmicos atuam
através da ligação às PBPs específicas da parede celular bacteriana, visto que possuem
grande afinidade para estas proteínas. Este mecanismo resulta na acilação das PBPs,
tornando-as incapazes de realizar a reação de transpeptidação, a principal etapa na
síntese do peptidoglicano. Este mecanismo ativa as autolisinas que degradam a parede
celular e causam a destruição das células (Murray et al., 2007). Como resultado, a
parede celular das bactérias entra em citólise, ou morte celular, devido à pressão
osmótica (Van Hoek et al., 2011).
2.2. Mecanismos de resistência aos antibióticos β-lactâmicos
Os mecanismos de resistência aos antibióticos ß-lactâmicos incluem (1)
produção de ß-lactamases, que constitui o principal mecanismo de resistência em
bactérias de Gram negativo, (2) a alteração no local alvo de ligação, (3) diminuição da
permeabilidade da membrana celular, e ainda (4) sistemas de bombas de efluxo (Drawz
e Bonomo, 2010).
A resistência mediada pela alteração no local alvo de ligação resulta de
alterações no sítio ativo das PBPs, o que pode determinar a diminuição da afinidade e
aumento de resistência aos antibióticos β-lactâmicos. Este mecanismo é raro em
bactérias de Gram negativo, sendo principalmente encontrado em bactérias de Gram
positivo (Livermore e Woodford, 2006).
As porinas, proteínas de membrana externa (OMP, Outer membrane protein),
são canais membranares das bactérias de Gram negativo que atuam como canal de
Introdução
8
entrada dos antibióticos β-lactâmicos. Assim, alterações na expressão ou perda de
porinas podem diminuir a permeabilidade dos antibióticos β-lactâmicos na célula. No
entanto, este mecanismo não é suficiente para conferir resistência, sendo geralmente
encontrado em associação com a produção de β-lactamases (Drawz e Bonomo, 2010).
A resistência mediada por bombas de efluxo é outro mecanismo, que consiste
num sistema de transporte ativo intrínseco ou adquirido. Ao serem expressas, as bombas
de efluxo são capazes de bombear diversos antibióticos do citoplasma para fora da
célula. Desta forma, em muitos casos, estão associados a fenótipo de multirresistência
em isolados de Gram negativo (Piddock, 2006). A resistência mediada pelas bombas de
efluxo pode derivar de alterações nos genes repressores e/ou hiperexpressão dos seus
reguladores transcricionais. Este mecanismo confere, geralmente, baixos níveis de
resistência aos antibióticos, pois mesmo possuindo múltiplos antibióticos como
substratos, podem não conferir elevado nível de resistência. Contudo, a diminuição da
concentração intracelular do antibiótico permite à bactéria sobreviver até que sejam
selecionadas bactérias com mutações que podem determinar níveis de resistência
clinicamente importantes (Webber e Piddock, 2003).
2.2.1. β-lactamases
A hidrólise dos antibióticos ß-lactâmicos pelas ß-lactamases é o mecanismo de
resistência mais comum a esta classe de antibióticos em bactérias de Gram negativo
(Bush e Jacoby, 2010). Estas enzimas podem ser classificadas em penicilinases,
específicas para as penicilinas, cefalosporinases, que hidrolisam preferencialmente as
cefalosporinas, carbapenemases que inativam os carbapenemes, ou ainda ß-lactamases
de espetro alargado (ESBLs) capazes de hidrolisar as penicilinas, as cefalosporinas de
primeira, segunda e terceira geração e o aztreonam (Van Hoek et al., 2011; Nordmann
et al., 2012).
As ß-lactamases desempenham assim um papel crucial na seleção da terapia
mais adequada, visto que as penicilinas, as cefalosporinas e os carbapenemes são
frequentemente incluídos no tratamento de várias doenças infeciosas (Bush e Jacoby
2010). Estima-se que existem, pelo menos, 1.300 ß-lactamases descritas em isolados
clínicos (Bush, 2013).
Introdução
9
As ESBLs são enzimas de grande relevância, uma vez que se tem verificado
uma ampla disseminação a nível mundial nas últimas décadas. Atualmente, existe uma
grande variedade de ESBLs, derivando, a maioria, das β-lactamases TEM-1, TEM-2 e
SHV-1, após introdução de substituições aminoacídicas no sítio ativo. Os genes bla
ESBL são geralmente adquiridos por mecanismos de transferência genética, associados
a elementos genéticos móveis, como os plasmídeos (Paterson e Bonomo, 2005). Já se
encontram descritas centenas de ESBLs diferentes, sendo a maioria das famílias CTX-
M, TEM e SHV.
2.2.1.1 Classificação de β-lactamases
As ß-lactamases são classificadas de acordo com a sua homologia na sequência
de aminoácidos (classificação de Ambler) e de acordo com a preferência por um
determinado substrato e perfil de inibição (classificação de Bush e Jacoby) (Bush e
Jacoby, 2010). Segundo a classificação de Ambler as β-lactamases dividem-se em
quatro classes: A, B, C e D (Figura 3). Aquelas que pertencem às classes A, C e D são
denominadas β-lactamases-serina, pois possuem um resíduo de serina no centro ativo
para facilitar a catálise e aquelas que pertencem à classe B contêm um ião de zinco,
sendo designadas de metalo-β-lactamases (Jacoby e Munoz-Price, 2005). A
classificação de Bush divide as ß-lactamases em três grupos (1-3). Os grupos 1 e 2 são
β-lactamases-serina e o grupo 3 são metalo-β-lactamases. As β-lactamases do grupo 1,
associadas à classe C, hidrolisam as cefalosporinas e são resistentes à ação dos
inibidores de β-lactamases. O grupo 2, que inclui as classes A e D, representa o grupo
com vários subgrupos e com uma ampla variedade de enzimas com diferentes perfis de
substratos (Figura 3). O grupo 3 engloba as metalo β-lactamases da classe B de Ambler.
Estas enzimas hidrolisam todos os antibióticos β-lactâmicos, à exceção dos
monobactamos (Bush e Jacoby, 2010).
Introdução
10
Figura 3 - Classificação das ß-lactamases relacionando o perfil do substrato e dos inibidores de ß- lactamases com a
sua estrutura molecular. Cb, carbapenemes; Cf, cefalosporinas de primeira geração; CA, ácido clavulânico; EDTA,
ácido etilenodiaminotetracético; Esc, Cefalosporina de espetro alargado; M, monobactamos; Pn, penicilinas
(Adaptado de Bush, 2013).
Atualmente, tem-se verificado uma emergência de ESBLs, sobretudo da família
CTX-M (classe A de Ambler), de ß-lactamases AmpC (classe C de Ambler) mediada
por plasmídeos e de carbapenemases (das classes A, B e D de Ambler), nomeadamente
da família KPC, IMP e VIM, produzidas por Enterobacteriaceae e por outras bactérias
de Gram negativo (Bush, 2013; Van Hoek et al., 2011; Jacoby, 2009).
2.2.1.2. Família TEM
As enzimas TEM pertencem à classe A de Ambler e aos grupos funcionais 2b,
2be e 2br segundo a classificação de Bush e Jacoby (Fig.3) (Bush e Jacoby, 2010). No
início da década de 60 foi descrita na Grécia a primeira β-lactamase TEM-1 mediada
por plasmídeos, num isolado de Escherichia coli. A sua designação advém de
Temoniera, nome do paciente a quem foi detetada a enzima pela primeira vez. Esta
enzima disseminou-se por todo o mundo, anos depois da sua descrição, sendo a mais
encontrada em bactérias de Gram negativo. A enzima TEM-1 é uma penicilinase, que
tem como substrato as penicilinas e cefalosporinas de primeira geração, como a
cefalotina e cefaloridina (Bradford, 2001).
Introdução
11
A enzima TEM-2 foi a primeira enzima derivada de TEM-1 a ser descrita.
Ambas apresentam o mesmo perfil hidrolítico, contudo TEM-2 tem um promotor mais
ativo e um ponto isoelétrico (pI) de 5,6 diferente do TEM-1, com pI de 5,4. A enzima
TEM-3, reportada em 1989, foi a primeira enzima derivada de TEM-1 a exibir o
fenótipo de ESBL. Desde então, foram descritas outras enzimas derivadas de TEM,
entre as quais β-lactamases resistentes aos inibidores (IRT, Inhibitor Resistant TEM) e
ESBLs, representando estas últimas a maioria (Bradford, 2001; Paterson e Bonomo,
2005). Atualmente existem mais de 200 β-lactamases TEM, principalmente ESBLs
(Jacoby, 2012).
2.2.1.3. Família SHV
As β-lactamases SHV estão incluídas na classe A de Ambler e nos subgrupos
funcionais 2b, 2be e 2br de Bush e Jacoby (Bush e Jacoby, 2010). As enzimas desta
família derivam da enzima SHV-1. Esta β-lactamase possui 68% de homologia com a
sequência aminoacídica de TEM-1 e apresenta uma estrutura semelhante (Jacoby e
Munoz-Price, 2005). A enzima SHV-1 é, frequentemente, codificada por genes
cromossómicos em Klebsiella pneumoniae (Bradford, 2001).
Ao contrário das β-lactamases TEM, as alterações no gene blaSHV, que dão
origem às variantes de SHV ocorrem em menor número de posições aminoacídicas
diferentes. A maioria das variantes de SHV, conferindo um fenótipo ESBL, são
caracterizadas pela substituição de uma serina por uma glicina na posição 238. Outras
variantes de SHV, relacionadas com SHV-5, possuem também a substituição de uma
lisina por glutamato na posição 240. A maioria das enzimas derivadas de SHV-1 possui
fenótipo de ESBLs, contudo sete variantes estão descritas como β-lactamases resistentes
aos inibidores. Globalmente, foram já descritas 182 variantes de β-lactamases SHV
(Jacoby, 2012).
2.2.1.4. Família CTX-M
As enzimas da família CTX-M têm origem em genes cromossómicos de espécies
de Kluyvera spp. e têm como substratos as cefalosporinas de terceira geração,
preferencialmente a cefotaxima. Ao contrário das enzimas da família TEM e SHV,
Introdução
12
hidrolisam mais a cefotaxima do que a ceftazidima (Bradford, 2001; Paterson e
Bonomo, 2005; Jacoby e Munoz-Price, 2005). As β-lactamases CTX-M pertencem à
classe A de Ambler e subgrupo funcional 2be de Bush e Jacoby (Bush e Jacoby, 2010).
A enzima CTX-M-1 foi inicialmente descrita na década de 80 na Alemanha,
tendo sido identificada num isolado clínico de E. coli (Bauernfeind et al., 1990).
Posteriormente, verificou-se uma expansão das enzimas desta família em várias partes
do mundo e em vários isolados clínicos, sobretudo em membros da família das
Enterobacteriaceae (Bonnet, 2004). Estas β-lactamases são classificadas em diferentes
grupos, tendo em conta a homologia nas sequências de aminoácidos: grupo CTX-M-1,
CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9, CTX-M-25 e o grupo KLUC (Bonnet, 2004;
D'Andrea et al., 2013).
As ESBLs da família CTX-M representam β-lactamases importantes, as quais
têm sido encontradas em muitos isolados, quer em ambiente hospitalar, quer na
comunidade, e, atualmente, têm sido fonte de preocupação dada a sua rápida expansão
pelo mundo, inclusive em Portugal (Bush, 2013; Cantón e Coque, 2006; Manageiro et
al., 2012a; Mendonça et al., 2007). Considera-se que a emergência destas enzimas em
vários locais está associada à aquisição e disseminação de plasmídeos com genes
blaCTX-M (Bonnet, 2004). Atualmente, tem-se verificado um predomínio de ESBLs
CTX-M-14 e, sobretudo, CTX-M-15, a nível mundial (Bush e Fisher, 2011).
2.2.1.5. Família OXA
As β-lactamases OXA pertencem à classe D de Ambler e aos grupos funcionais
2de e 2df de Bush e Jacoby. Esta família consiste num grupo heterogéneo, de várias
enzimas (Bush, 2013). No subgrupo 2de estão incluídas as oxacilinases, caracterizadas
pela elevada atividade hidrolítica à oxacilina e cloxacilina, com exceção dos
carbapenemes. Estão incluídas neste grupo enzimas derivadas de OXA-10 (com
fenótipo ESBL), entre as quais OXA-10, -11, -14, -15, -16, e -17 (Bradford, 2001; Bush
e Jacoby, 2010). A maioria das β-lactamases OXA, embora hidrolisando fracamente a
cefotaxima, ceftriaxona e aztreonam, conferem suscetibilidade diminuída a esses
antibióticos e fenótipo de ESBL (Paterson e Bonomo, 2005). As ESBL tipo OXA são
encontradas, particularmente, em Pseudomonas aeruginosa e ainda em
Enterobacteriaceae, embora em menor frequência (Bradford, 2001).
Introdução
13
As oxacilinases com atividade hidrolítica aos carbapenemes estão incluídas no
subgrupo funcional 2df, capazes de hidrolisar as amino- e as carboxipenicilinas. Estas
têm sido, frequentemente, encontradas em Acinetobacter spp., com um aumento em
isolados de Enterobacteriaceae, principalmente de OXA-48 (Patel e Bonomo, 2013;
Bush e Jacoby, 2010). Inativam eficientemente as penicilinas, cefalosporinas de
primeira geração, antibióticos β-lactâmicos combinados com inibidores de β-
lactamases, com exceção das cefalosporinas de espetro alargado. Contudo, a variante
OXA-163, que apresenta uma baixa atividade de carbapenemase, hidrolisa estas
cefalosporinas. A maioria das enzimas desta família apresenta baixa suscetibilidade aos
inibidores de β-lactamases (ácido clavulânico e EDTA), mas são inibidas in vitro pelo
cloreto de sódio (NaCl) (Patel e Bonomo, 2013; Nordmann et al., 2012). Já se
encontram descritas mais de 250 variantes de oxacilinases, com uma minoria exibindo
baixo nível de hidrólise aos carbapenemes (Patel e Bonomo, 2013).
2.2.1.6. β-lactamases AmpC
As β-lactamases AmpC hidrolisam as penicilinas, as oximino-cefalosporinas,
aztreonam (variável) e a cefoxitina e não são inibidas pelo ácido clavulânico (Jacoby e
Munoz-Price, 2005; Jacoby, 2009). Estas enzimas pertencem à classe C de Ambler e
aos subgrupos funcionais 1 e 1e de Bush e Jacoby. No entanto, as enzimas do subgrupo
1e, designadas por AmpC de espetro alargado (ESAC, Extended-spectrum AmpC),
apresentam maior atividade hidrolítica às cefalosporinas de terceira geração do que as
do subgrupo 1 (Bush, 2013). As β-lactamases AmpC são importantes cefalosporinases
codificadas por genes cromossómicos em algumas espécies de Enterobacteriaceae
(Enterobacter spp., Citrobacter freundii, M. morganii e E. coli) e P. aeruginosa. Têm
sido também muito descritas β-lactamases AmpC mediadas por plasmídeos (PMAβ,
Plasmid-Mediated AmpC β-Lactamases) em Enterobacteriaceae (E. coli, Klebsiella
spp., Salmonella spp. e Proteus mirabilis) (Livermore e Woodford, 2006; Jacoby,
2009). As PMAβ derivam de genes ampC cromossómicos de diferentes espécies
(Tabela. 3) (Jacoby e Munoz-Price, 2005).
Introdução
14
Tabela 3 - Origem de genes que codificam β-lactamases AmpC (Adaptado de Livermore e Woodford, 2006)
Classe Origem Exemplos
CIT Citrobacter freundii CMY-2 a CMY-7; LAT-1,-3,-4
ENT Enterobacter spp. ACT-1; MIR-1
FOX Aeromonas spp. FOX-1 a FOX-5
MOX Aeromonas spp. MOX-1, MOX-2; CMY-1 e CMY-8
DHA Morganella morgani DHA-1, DHA-2
ACC Hafnia alvei ACC-1
A expressão de AmpC pode ser constitutiva, como por exemplo, em E. coli, ou
indutiva, como em E. cloacae, C. freundii, M. morganii e P. aeruginosa, sendo os
níveis de produção da enzima dependentes do grau de expressão do gene ampC (Jacoby,
2009). A expressão de AmpC cromossómica pode estar desreprimida em isolados com
gene ampC cromossómico indutível, devido a mutações nos genes reguladores (p.e.
ampD e ampR), resultando na hiperprodução, estável, de AmpC (Jacoby, 2009; Jacoby
e Munoz-Price, 2005). A expressão das PMAβ pode também ser indutiva, conferindo
resistência semelhante à das AmpC cromossómicas, no entanto, o nível de resistência
depende do nível de enzima expressa, bem como da presença de outros mecanismos de
resistência (Jacoby, 2009).
2.2.1.7. Carbapenemases
As carbapenemases constituem um grupo diverso de enzimas que têm emergido
e que se tem tornado num facto preocupante, uma vez que hidrolisam os carbapenemes,
último recurso, em muitos casos, no tratamento de infeções. Além de hidrolisarem os
carbapenemes, hidrolisam as cefamicinas e as oximino-cefalosporinas (Alekshun e
Levy, 2007; Jacoby e Munoz-Price, 2005).
As carbapenemases estão distribuídas em três classes de β-lactamases de
Ambler: classe A, B e D (Patel e Bonomo, 2013). Atualmente, as β-lactamases KPC
(classe A), as metalo-β-lactamases, como VIM, IMP, e NDM (classe B), e a
carbapenemase OXA-48 (classe D), mediada por plasmídeos, representam as
carbapenemases com maior importância clínica em Enterobacteriaceae (Tzouvelekis et
al., 2012; Nordmann et al., 2012).
As enzimas NmcA/IMI, SME, e KPC são as principais carbapenemases da
classe A de Ambler. Hidrolisam as penicilinas, cefalosporinas, carbapenemes e o
Introdução
15
aztreonam e são inibidas in vitro pelo ácido clavulânico e tazobactam. A enzima GES
também pertence à classe A, contudo, foi inicialmente designada como uma β-lactamase
ESBL clássica, uma vez que a enzima GES-1 não hidrolisa os carbapenemes.
Posteriormente, foram identificadas outras variantes (p.e., GES-2, GES-4, GES-5, GES-
6, GES-11 e GES-14), com atividade hidrolítica fraca, mas significativa sobre os
carbapenemes (Nordmann et al., 2012). Todas as carbapenemases apresentam
capacidade de hidrolisar as cefalosporinas de terceira geração e os carbapenemes devido
a uma substituição aminoacídica no sítio ativo (nas posições 104 e 170). Atualmente, as
β-lactamases KPC representam as carbapenemases de classe A, com maior importância
clínica. Em 1996, foi identificada a primeira KPC (KPC-2) num isolado de K.
pneumoniae, na Carolina do Norte, nos Estados Unidos da América (Patel e Bonomo,
2013; Nordmann et al., 2012). Desde então, já foram identificadas doze variantes de
KPC (KPC-2 a KPC-15), verificando-se uma maior predominância das variantes KPC-2
e KPC-3 (Patel e Bonomo, 2013).
As enzimas do tipo IMP, VIM e NDM representam as principais
carbapenemases do grupo das metalo-β-lactamases; em Enterobacteriaceae, são as que
possuem maior distribuição geográfica. As metalo-β-lactamases conferem resistência a
todas as penicilinas, cefalosporinas e carbapenemes, à exceção do aztreonam, não sendo
hidrolisadas pelos inibidores de β-lactamases (Patel e Bonomo, 2013; Nordmann et al.,
2012).
Como referido anteriormente (capítulo 2.2.1.5), a enzima OXA-48, pertence à
classe D de Ambler e tem atividade hidrolítica sobre os carbapenemes. Desde a sua
primeira descrição na Turquia, a enzima OXA-48, tem sido identificada em países
Africanos e do sul da Europa, o que se torna preocupante devido à sua rápida
disseminação (Nordmann et al., 2012).
3. Tigeciclina
A tigeciclina é um antibiótico recente e o primeiro composto sintético da nova
classe de antibióticos glicilciclinas disponibilizado para uso clínico (Stein e Craig,
2006). Foi desenvolvida através da pesquisa de compostos mais ativos, a partir da
Introdução
16
estrutura química das tetraciclinas, de forma a contornar os principais mecanismos de
resistência a esta classe de antibióticos (Doan et al., 2006; Seputiene et al., 2010).
Em 2005, a tigeciclina (Tygacil®) foi aprovada, pela FDA (Food and Drug
Administration), para utilização no tratamento de infeções complicadas da pele, tecidos
moles e intra-abdominais. Em 2009, foi também aprovada pela FDA para o tratamento
de pneumonia bacteriana adquirida na comunidade (Stein e Babinchak, 2013; Sun et al.,
2012; Sader et al., 2013).
A utilização de tigeciclina é aconselhada apenas em adultos, estando a duração
do tratamento dependente da gravidade e local da infeção, bem como da forma como o
doente reage ao antibiótico, podendo variar entre 5 a 14 dias. O tratamento consiste na
administração da tigecilina por via intravenosa, devendo inicialmente ser administrada
uma dose de 100 mg e, nos dias seguintes, doses de 50 mg de 12 em 12 horas
(Babinchak et al., 2005).
3.1. Estrutura química e mecanismo de ação da tigeciclina
A tigeciclina (Fig.4A) deriva estruturalmente da minociclina (Fig.4B),
antibiótico pertencente à classe das tetraciclinas, por uma substituição na posição D-9,
conferindo-lhe um amplo espetro de atividade (Peterson, 2008).A cadeia lateral N-
alquilo glicilamido, na posição 9 do átomo de carbono da tigeciclina confere-lhe
propriedades ao nível da atividade biológica, tal como o aumento da solubilidade
lipídica, o bloqueio do efluxo da tigeciclina para o exterior da célula e ainda o aumento
da afinidade ao local de ligação no ribossoma (Seputiene et al 2010).
A tigeciclina é um antibiótico bacteriostático, pois inibe a síntese de proteínas
bacterianas através da sua união à subunidade 30S do ribossoma bacteriano. Este
mecanismo impede a entrada da RNA aminoacil-transferase no local de ligação A do
ribossoma (Petersen et al., 1999). Apesar da tigeciclina apresentar um mecanismo de
ação semelhante às tetraciclinas, possui uma afinidade cinco vezes superior para o
ribossoma (Bauer et al., 2004).
Introdução
17
Figura 4 - Estrutura química da tigeciclina (A) e da minociclina (B) (Dean et al. 2003)
3.2. Espetro de ação da tigeciclina
A tigeciclina exibe um mecanismo de ação semelhante às tetraciclinas,
apresentando, no entanto, atividade em isolados que possuem genes responsáveis por
mecanismos de resistência mediados por bombas de efluxo e proteção do ribossoma,
que os tornam resistentes às tetraciclinas. A título de exemplo, um estudo de Petersen et
al. (1999) demonstrou que a tigeciclina tem a capacidade de contornar a resistência
mediada pelos determinantes tet(M) e tet(O), que promovem proteção ribossomal, e
pelos determinantes tet(A-E) e tet(K), que promovem a ação de bombas de efluxo sobre
as tetraciclinas.
A tigeciclina apresenta um amplo espetro de ação in vitro, sendo ativa sobre uma
grande variedade de microrganismos de Gram positivo e de Gram negativo, quer
aeróbios, quer anaeróbios, quer da comunidade quer de origem nosocomial (Betriu et
al., 2006; Bouchillon et al., 2005; Castanheira et al., 2008; Goldstein et al., 2006).
Assim, a tigeciclina tem ação sobre isolados de Gram positivo, como
Staphylococcus aureus, nomeadamente S. aureus resistente à meticilina (MRSA,
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus), Streptococcus pneumoniae (incluindo
resistentes à penicilina), Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium e
Enterococcus faecalis, nomeadamente resistentes à vancomicina (Betriu et al., 2006;
Cercenado et al., 2003; Dowzicky e Chmelarová, 2011; Norskov-Lauritsen et al.,
2009). Isolados de Gram negativo, tais como E. coli, K. pneumoniae, Enterobacter spp.
Citrobacter spp. e Serratia marcescens têm apresentado suscetibilidade à tigeciclina
(Betriu et al., 2006; Bouchillon et al., 2005; Castanheira et al., 2008; Roy et al., 2013;
Souli et al., 2006).
Introdução
18
Adicionalmente, este antibiótico possui ação antimicrobiana em bactérias com
resistência a outros antibióticos, sobretudo aos β-lactâmicos, nomeadamente em
Enterobacteriaceae produtoras de ESBL (Bouchillon et al., 2005; Roy et al., 2013),
bem como de β-lactamases AmpC (Bouchillon et al., 2005), carbapenemases e metalo-
β-lactamases (Castanheira et al., 2008; Souli et al., 2006), ou multirresistentes aos
antibióticos (Gupta et al., 2012).
3.3. Resistência à tigeciclina
Apesar do espetro de ação da tigeciclina e da sua capacidade de contornar os
mecanismos de resistência a outras classes de antibióticos, já foram descritos casos de
microrganismos com suscetibilidade diminuída a este antibiótico. As P. aeruginosa são
intrinsecamente resistentes à tigeciclina (Dean et al., 2003; Sun et al., 2012). De igual
modo, isolados de Burkholderia cepacia e isolados da família Proteeae, tais como,
Proteus spp., Providencia spp. e Morganella morganii apresentam geralmente
suscetibilidade diminuída a este antibiótico (Ruzin et al., 2005; Sun et al., 2012). Além
disso, tem-se verificado a aquisição de resistência à tigeciclina em Acinetobacter
baumannii (Peleg et al., 2007 Ruzin et al., 2007) e em outros isolados da família das
Enterobacteriaceae, como E. coli, K. pneumoniae e Enterobacter spp. (Keeney et al.,
2008; Ruzin et al. 2005; Veleba et al., 2013).
Os mecanismos de resistência à tigeciclina não estão bem esclarecidos, mas, de
forma geral, a resistência tem sido atribuída à ação de bombas de efluxo da família
RND (Resistance-Nodulation-Division), regulada por genes localizados ao nível do
cromossoma; estas bombas são, frequentemente, associadas à multirresistência aos
antibióticos (Pérez et al., 2012; Sun et al., 2012). O sistema de efluxo mais descrito em
P. aeruginosa é o MexXY-OprM (Dean et al., 2003). Em A. baumannii foi reportado
uma diminuição da suscetibilidade à tigeciclina associada ao sistema de efluxo
AdeABC (Peleg et al., 2007). O sistema de efluxo AcrAB está associado à
suscetibilidade diminuída à tigeciclina em P. mirabilis, E. coli, K. pneumoniae, M.
morganii e Enterobacter spp. (Keeney et al., 2007; Keeney et al., 2008; Ruzin et al.
2005; Veleba et al., 2013; Visalli et al., 2003). A hiperprodução da bomba de efluxo
SdeXY, da família RND, está associada à suscetibilidade diminuída à tigeciclina em S.
marcescens (Hornsey et al., 2010).
Introdução
19
Além do mecanismo de resistência à tigeciclina associado às bombas de efluxo,
foi, recentemente, identificada uma proteína Tet(X) monoxigenase, dependente da
flavina, que confere resistência às tetraciclinas e à tigeciclina em bactérias anaeróbias,
como Bacteroides, através da hidroxilação da região-seletiva de tetraciclinas para 11a-
hidroxi-tetraciclinas, reduzindo a atividade antimicrobiana. Adicionalmente, a
tigeciclina representa um substrato da hidroxilação dependente, quer de NADPH
(nicotinamida adenina difosfato), quer de oxigénio por parte da proetína Tet(X)
(Volkers et al., 2011). É de realçar que, até a atualidade, esta proteína não foi observada
noutras bactérias aeróbias e/ou anaeróbias isoladas em meio clínico; no entanto, se os
genes que a codificam forem integrados em elementos genéticos móveis, pode
disseminar-se para outras bactérias (Linkevicius et al., 2013).
3.3.1. Bomba de efluxo AcrAB-TolC da família RND
A bomba de efluxo AcrAB-TolC da família RND constitui um mecanismo de
resistência com relevância clínica, uma vez que confere resistência a múltiplos
antibióticos utilizados no tratamento de infeções humanas, incluindo os β-lactâmicos,
fluoroquinolonas, macrólidos, tetraciclinas, clorafenicol e trimetoprim, encontrando-se
bastante distribuída em bactérias de Gram negativo (Alekshun e Levy, 1999; Piddock,
2006). Em Enterobacteriaceae, conferem ainda resistência a uma variedade de
compostos tóxicos, como detergentes, corantes e desinfetantes (Pérez et al., 2012).
A bomba de efluxo AcrAB é formada por três subunidades: AcrB, uma proteína
na membrana interna, que atua expelindo substâncias para o exterior; TolC, uma porina
da membrana externa, e AcrA, uma proteína que liga a bomba à porina (Fig.5). As três
subunidades da bomba de efluxo permitem a expulsão de compostos diretamente a
partir do citoplasma para o ambiente externo, contribuindo para o aumento da
resistência aos antibióticos. Este sistema de efluxo utiliza um gradiente de protões na
membrana como fonte de energia (Pérez et al., 2012).
Introdução
20
Figura 5 - Estrutura do sistema de efluxo AcrAB-TolC em E.coli (Adaptado de Alvarez-Ortega et al., 2013).
A expressão da bomba de efluxo AcrAB é regulada por proteínas da família
AraC, os quais conferem resistência aos antibióticos e desinfetantes, aumentado a
expressão daquela bomba. Os reguladores transcricionais da família AraC são: MarA,
SoxS, RamA e Rob (Alekshun e Levy, 1999; Rosenblum et al., 2011). Atualmente, tem
sido descrito que este sistema AcrAB-TolC está envolvido na suscetibilidade diminuída
à tigeciclina, nalgumas espécies de Gram negativo.
A expressão da bomba de efluxo pode ser desreprimida pela sobre-expressão dos
reguladores transcricionais, como MarA em E. coli e RamA em K. pneumoniae.
Mutações no gene acrR, repressor da bomba de efluxo AcrAB, ou ainda mutações no
genes marR e ramR (repressores de marA e ramA, repetivamente) podem também
desencadear um aumento da expressão da bomba de efluxo. Por sua vez, o aumento da
atividade da bomba de efluxo AcrAB, pode conferir um fenótipo de multirresistência
(Keeney et al., 2008; Ruzin et al., 2005; Hentschke et al., 2010).
A suscetibilidade diminuída à tigeciclina, mediada pela bomba de efluxo
AcrAB, em E. coli, está associada a mutações no repressor marR, desencadeando a
sobre-expressão da proteína MarA e da bomba de efluxo (Keeney et al., 2008). O
operão marAB em isolados de E. coli é constituído pelos genes marA, marB e o gene
marR, repressor de MarA, que regulam a expressão da bomba de efluxo AcrAB
(Alekshun e Levy, 1999). A expressão do operão marAB e marC é controlada por
promotores independentes, PmarII e PmarI, respetivamente (Fig.6). Os genes marR e
Introdução
21
marA codificam o repressor e o regulador transcricional MarR (144 resíduos de
aminoácidos) e MarA (127 resíduos de aminoácidos), respetivamente. O gene marB
(codifica 72 resíduos de aminoácidos) tem uma função desconhecida, bem como o
marC (codifica 201 resíduos de aminoácidos). Assim, MarR reprime a expressão de
MarAB através da ligação em dois sítios no operador MarO, podendo a sua inativação
resultar na expressão constitutiva de MarAB, dependendo dos níveis de expressão dos
reguladores transcricionais, como MarA (Alekshun e Levy, 1999).
Figura 6 - Organização genética do locus marAB em E. coli ; PmarI e PmarII, promotores (Alekshun e Levy, 1999).
Em K. pneumoniae, Enterobacter cloacae e Enterobacter aerogenes a
diminuição da suscetibilidade à tigeciclina tem sido associada à sobre-expressão da
proteína RamA, homóloga da proteína MarA (Hentschke et al., 2010; Keeney et al.,
2007; Ruzin et al., 2005; Veleba et al., 2013). A sobre-expressão de MarA e RamA,
designadas de reguladores positivos, desencadeiam o aumento da atividade da bomba
de efluxo AcrAB, conferindo um fenótipo de multirresitência à outras classes de
antibióticos (Keeney et al., 2008 Ruzin et al., 2005; Rosenblum et al., 2011; Hentschke
et al., 2010).
Para além disso, mutações no gene ramR (repressor de ramA) têm sido descritas
como uma via de aquisição de resistência à tigeciclina em K. pneumoniae, E. cloacae e
E. aerogenes, que leva a sobre-expressão de RamA e da bomba de efluxo AcrAB
(Hentschke et al., 2010; Veleba et al., 2013). O gene ramR está localizado a montante
do gene ramA e codifica a proteína da família de repressores transcricionais TetR
(Fig.7). O local de ligação do RamR localiza-se a montante do gene ramA e esta região
abrange uma parte do promotor de ramA. A proteína RamR liga-se então à região
intergénica, entre o ramR e o ramA, e RamA liga-se na região a montante do acrAB.
Introdução
22
Deste modo RamR reprime o gene ramA, o qual codifica a proteína RamA que ativa os
genes da bomba de efluxo AcrAB (Yamasaki et al., 2013).
Figura 7 - Via de regulação da bomba de efluxo AcrAB: a proteina RamR reprime a expressão do gene ramA que
codifica o activador trancripcional, RamA, do acrAB. (Adaptado de Yamasaki et al., 2013).
Objetivos
23
4. Objetivos
Tendo em conta que a tigeciclina é um antibiótico, recentemente, desenvolvido
com o intuito de tentar ultrapassar o problema da resistência aos antibióticos, este
trabalho teve como objetivo avaliar a suscetibilidade e caracterizar os mecanismos de
resistência à tigeciclina em 211 isolados de Gram negativo provenientes de doentes, em
Portugal. Pretendeu-se igualmente esclarecer a ação da tigeciclina em bactérias com
resistência, sobretudo aos antibióticos β-lactâmicos, ou multirresistentes de forma a
compreender a possibilidade da tigeciclina constituir uma alternativa nestes casos.
Assim, o presente trabalho teve como objetivos específicos:
i. Avaliar a suscetibilidade da tigeciclina em isolados de Gram negativo
ii. Determinar a suscetibilidade de isolados de Gram negativo a outras classes
de antibióticos, nomeadamente β-lactâmicos (aminopenicilinas,
carboxipenicilinas, ureidopenicilinas, cefalosporinas da 1ª, 2ª, 3ª e 4ª
geração, monobactâmicos, carbapenemes), fluoroquinolonas,
aminoglicosídeos, trimetoprim-sulfametoxazol, colistina, fosfomicina e
nitrofuranos.
iii. Pesquisar e identificar os genes bla associados à resistência aos antibióticos
β-lactâmicos, orientada pela leitura interpretativa dos testes de
suscetibilidade.
iv. Caracterizar molecularmente a resistência à tigeciclina, através da pesquisa e
identificação de mutações nos genes ramR e marR em isolados estudados de
E. coli e K. pneumoniae, predominantemente, com suscetibilidade diminuída
à tigeciclina.
Material e Métodos
24
II. Material e Métodos
1. Isolados bacterianos
Para a realização do presente trabalho foram estudados 211 isolados de Gram
negativo, reunidos em 2011 e 2013 no Laboratório Nacional de Referência da
Resistência aos Antimicrobianos (LNR-RA) do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo
Jorge, tendo como proveniência diversos hospitais nacionais (Fig. 8). Os isolados
estudados foram os seguintes: Escherichia coli (n=101), Klebsiella pneumoniae (n=70),
Citrobacter freundii (n=4), Enterobacter cloacae (n=12), Enterobacter aerogenes
(n=4), Morganella morganii (n=10), Proteus mirabilis (n=7) e Serratia marcescens
(n=3). A identificação preliminar dos isolados foi realizada nas instituições hospitalares
de proveniência. Sempre que necessário, foi utilizado o método API20E®
, com leitura
em 24 horas, no LNR-RA para confirmar a identificação dos isolados estudados.
Figura 8 - Distribuição, pelos hospitais de origem, de 211 isolados que constituem a amostra do estudo.
0
10
20
30
40
50
60
A B C D E F G H I J L M N
Núm
ero
de
iso
lad
os
Hospitais
Material e Métodos
25
2. Caracterização fenotípica: suscetibilidade aos antibióticos
2.1. Método de microdiluição
O método de microdiluição em caldo foi realizado para determinar a
suscetibilidade de 211 isolados em estudo aos seguintes antibióticos: tigeciclina
(Pfizer), colistina (Sigma), ciprofloxacina (Bayer), imipinem (Merck), cefoxitina
(Fluka), ceftazidima (GSK), cefotaxima (Sanofi) e cefotaxima (Sanofi) em combinação
com ácido clavulânico (Cipan). Assim, a determinação da concentração inibitória
mínima (CIM) foi realizada através dos passos descritos a seguir.
2.1.1. Preparação da solução-mãe dos antibióticos
A solução-mãe de cada um dos antibióticos, para a determinação da CIM, foi
preparada de acordo com a concentração final descrita na Tabela 4. Para cada
antibiótico, a quantidade necessária para a solução-mãe foi calculada de acordo com a
potência e pureza do mesmo e dissolvidos em solventes adequados (Tabela 4),
utilizando a fórmula descrita a seguir:
Peso (mg) = Volume (ml) x Concentração (μg/ml)
Potência (μg/mg)
Os antibióticos em pó foram pesados numa balança analítica (AE200, Mettler).
Após a preparação da solução-mãe na concentração estabelecida (Tabela 4), esta foi
esterilizada por filtração (Acrodisc® syringe filters, Pall corporation) e acondicionada
em eppendorf a -80ºC até o uso.
Tabela 4 - Antibióticos, concentrações das soluções-mãe, solventes e potência dos antibióticos.
Antibiótico Solução-mãe (mg/L) Solvente Potência (%)
Cefotaxima 2048 Água 90,1
Ceftazidima 2048 Carbonato de Sódio 84,6
Cefoxitina 2048 Água 99,4
Imipeneme 2048 Tampão Fosfato [0,01M] pH 7,2 50,0
Ciprofloxacina 1024 Água + hidróxido de sódio [0,1M] 93,6
Tigeciclina 1024 Água 99,7
Colistina 2048 Água 78,6
Ácido Clavulânico 4mg/ml Tampão Fosfato [0,1M] pH 6 95,5
Material e Métodos
26
2.1.2. Preparação das concentrações dos antibióticos
Após a obtenção da solução-mãe foi preparada a solução CIM (utilizadas
diretamente no teste), que corresponde a uma concentração acima da maior
concentração a ser testada. Assim, esta solução CIM (Tabela 5) foi preparada a partir da
solução-mãe com um diluente específico para cada antibiótico.
Tabela 5 - Antibióticos, concentração da solução CIM, diluentes e concentrações testadas na determinação da
concentração inibitória mínima.
Antibiótico Solução CIM
(mg/L)
Diluente Concentrações
testadas (μg/mL)
Cefotaxima 128 Água 1 – 64
Ceftazidima 128 Água 1 – 64
Cefoxitina 256 Água 2 – 128
Imipeneme 1024 Tampão Fosfato [0,01M] pH 7,2 0,25 – 512
Ciprofloxacina 16 Água 0 125 – 8
Tigeciclina 32 Água 0,25 – 16
Colistina 64 Água 0,5 – 32
Ácido Clavulânico 40 mg/mL Tampão Fosfato [0,1M] pH 6
2.1.3. Preparação das diluições dos antibióticos na microplaca
O meio de Mueller-Hinton (INSA) foi distribuído (100 µL) em cada um dos 96
poços da microplaca com o auxílio de um aparelho de microdiluição (Precision TM
BioTek, Winooski, USA). Para a tigeciclina utilizou-se meio de Mueller-Hinton fresco
(<12 h) (Bradford et al. 2005). De seguida, com aquele aparelho de microdiluição foi
realizada a diluição seriada dos antibióticos nas microplacas, que já possuiam meio de
Mueller-Hinton (Fig. 9). Assim, foram adicionados 100 µL da solução CIM, do
antibiótico a testar, nos poços da primeira fila e diluído de forma seriada, pipetando 100
µL da primeira fila para a segunda e, assim sucessivamente, até à penúltima fila,
rejeitando, por fim, os 100 µL. A última fila foi utilizada como controlo negativo.
Material e Métodos
27
Figura 9 - Representação da diluição seriada dos antibióticos na microplaca.
2.1.4. Preparação do inóculo bacteriano
A partir de uma cultura bacteriana pura, em gelose simples (INSA), fez-se uma
suspensão em meio de Mueller-Hinton (108
UFC/mL) com uma turvação de 0,5 na
escala de McFarland (Dade Behring, MicroScan®
Turbidity Meter). Para a determinação
da CIM, a suspensão de 0,5 McFarland foi diluída na proporção de 1:20 (5x106
UFC/mL), à exceção da suspensão a ser testada pela combinação cefotaxima/ácido
clavulânico, a qual foi diluída a 1:10 (1x107
UFC/mL) e adicionada, numa microplaca,
com a solução de ácido clavulânico (40µg/mL) preparada a partir da solução-mãe do
ácido clavulânico (Tabela 4), ficando assim uma concentração final de 5x106
UFC/mL.
Após o preparo das suspensões bacterianas, cada poço, de uma microplaca, já contendo
as diluições de antibiótico (referido em 2.1.3), foi inoculado com 10 µL da cultura
diluída (5x104UFC/mL) com o aparelho de microdiluição, com exceção dos poços da
última fila (controlo negativo). O controlo de qualidade foi realizado com Escherichia
coli ATCC 25922.
Após incubação a 37ºC, durante 18 horas, as placas foram lidas num local
iluminado e a CIM foi determinada de acordo com a observação de crescimento
bacteriano nos poços da microplaca. A interpretação dos resultados foi efetuada
utilizando as normas do Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de
Material e Métodos
28
Microbiologie (2013) (CASFM 2013), pela análise comparativa das concentrações
críticas (mg/L) obtidas e as aí referidas.
2.2. Método de difusão por disco
O método de difusão por disco foi realizado para complementar a avaliação da
suscetibilidade aos antibióticos efetuados por CIM, para os mesmos 211 isolados.
Foram ensaiados 23 antibióticos (carga do disco): amoxicilina (25µg),
amoxicilina/ácido clavulânico (20+10µg), ticarcilina (25µg), piperacilina (25µg),
piperacilina/tazobactam (25µg), cefalotina (25µg), cefuroxima (30µg), ceftriaxona
(30µg), cefpodoxima (10µg), cefixima (10µg), cefepima (30µg), aztreonam (30µg),
ertapeneme (10µg), meropeneme (10µg), ácido nalidíxico (30µg), norfloxacina (5µg),
pefloxacina (5µg), kanamicina (30µg), gentamicina (15µg), amicacina (30µg),
fosfomicina (50µg), nitrofuranos (300µg) e trimetoprim/sulfametoxazol
(1,25+23,75µg).
Para realização deste método o inóculo foi preparado a partir de duas a cinco
colónias isoladas após cultura em meio de gelose simples (INSA), ressuspendidas em
2,5 mL de soro fisiológico, de modo a obter uma turvação de 0,5 na escala de
McFarland (Dade Behring, MicroScan®
Turbidity Meter), e diluídas a 1:100 em soro
fisiológico, num volume total de 10mL. O inóculo foi espalhado uniformemente, por
inundação, em duas placas quadradas (120 x 120 mm) com meio de Muller-Hinton agar
(INSA), para cada estirpe. Os discos de antibióticos escolhidos foram aplicados no meio
inoculado, com um dispensador automático.
De forma a identificar mecanismos específicos de resistência utilizaram-se
discos impregnados com inibidores de β-lactamases: ácido clavulânico, cloxacilina,
ácido borónico e EDTA. Para tal, adicionou-se um disco de imipeneme com 5μL de
uma solução de EDTA 0,5M (750 μg) e um disco branco com 3,5μL de ácido borónico
(300 μg) para pesquisa de metalo-β-lactamases e carbapenemases do grupo A,
respetivamente. A pesquisa de cefalosporinases AmpC foi realizada com a utilização de
um disco branco impregnado com 4,2μL de cloxacilina (750 μg) e a produção de β-
lactamases de espetro alargado através da combinação amoxicilina/ácido clavulânico
(20 + 10 μg). Os discos foram aplicados nas placas com o auxílio de uma pinça estéril.
Em seguida as placas foram invertidas e incubadas em estufa a 37ºC, por um
período de 18 horas. Após incubação, os halos de inibição dos antibióticos ensaiados
Material e Métodos
29
foram lidos com auxílio de uma régua e os valores obtidos (em milímetros) foram,
igualmente, interpretados de acordo com as normas do Comité de l’Antibiogramme de
la Société Française de Microbiologie (CASFM, 2013).
2.3. Método de E-teste
O método de E-teste® (BioMérieux) PM-PML (cefepima/ combinação de
cefepima com ácido clavulânico) foi utilizado para confirmar a produção de ESBL por
alguns isolados em estudo. Para tal, o inóculo foi preparado a partir de colónias isoladas
em gelose simples (INSA) e ressupendidas em 2,5 mL de soro fisiológico estéril, de
modo a obter um padrão de 0,5 McFarland (Dade Behring, MicroScan®
Turbidity
Meter). A suspensão foi inoculada por espalhamento à superfície da placa de Muller-
Hinton (INSA), com uma zaragatoa esterilizada. De seguida, adicionou-se uma tira de
E-teste® (BioMérieux) com um gradiente de concentração de cefepima (0,25-16 µg/ml)
(PM) numa extremidade e no outro lado com um gradiente de cefepima (0,064-4 µg/ml)
em combinação com ácido clavulânico com uma concentração de 4µg/ml. Após um
período de incubação de 18 horas, a interpretação foi feita com base na observação da
elipse de inibição de crescimento produzida e a determinação do valor da CIM que
correspondeu à concentração de antibiótico presente no local onde a elipse interceptou a
tira. Um resultado positivo para produção de ESBL consiste na deformação da elipse no
PM, ou uma CIM PM ≥0,25 com o valor da razão da CIM da PM e da CIM de PML ≥8.
2.4. Teste de sinergia com meropeneme
Foi realizado o teste de sinergia com meropeneme para os isolados (das espécies
K. pneumoniae, E. coli e E. aerogenes) com suscetibilidade diminuída aos
carbapenemes, sugerindo a possibilidade de produção de carbapenemases das classes A,
B e/ou D e/ou produção de cefalosporinases (classe C) associadas a impermeabilidade.
A suspensão bacteriana foi preparada utilizando colónias isoladas em gelose
simples (INSA) dos isolados clínicos selecionados, e diluídas em soro fisiológico
estéril, de modo a obter uma turvação de 0,5 na escala de McFarland (Dade Behring,
MicroScan®
Turbidity Meter). A solução obtida foi diluída a 1:10 e inoculada, por
espalhamento à superfície de uma placa de Muller-Hinton (INSA), com uma zaragatoa
Material e Métodos
30
esterilizada. De seguida, foram aplicados quatro discos de meropeneme (10µg, Biorad)
a uma distância de 30mm entre si, tendo sido adicionadas as seguintes soluções (a três
dos discos): 750µg de EDTA (5µl de uma solução 0,5M), 600µg de ácido borónico (7µl
de uma solução 0,5M) e 750µg de cloxacilina (6µl de uma solução 0,25M). Adicionou-
se ainda um disco branco com EDTA (5µl de uma solução 0,5M) no centro da placa
(Fig. 9), a fim de averiguar o efeito do inibidor sozinho na espécie bacteriana. As placas
foram incubadas a 37ºC, durante 18h. Posteriormente, foram medidos e registados os
diâmetros dos halos de inibição para cada um dos discos e para cada uma das estirpes
analisadas e os resultados foram interpretados de acordo com o esquema apresentado na
Figura 10.
Figura 10 - Esquema utilizado para interpretação dos resultados obtidos no teste de sinergia com meropeneme para
deteteção de metalo-β-lactamases, carbapenemases de classe A ou D e β-lactamases AmpC (cromossómicas ou
plasmídicas). BOR, ácido borónico; CLOX, cloxacilina.
3. Caracterização genotípica: mecanismos de resistência aos
antibióticos
3.1. Extração de DNA
A extração de DNA de 211 isolados em estudo foi efetuada pelo método de
fervura. Para tal, uma porção de cultura pura de 18 horas em gelose simples (INSA) foi
inoculada em 750µl de água bidestilada estéril e centrifugada durante 5 minutos, a
10000 rpm (2K15, Sigma). Após centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e o pellet
Material e Métodos
31
ressuspendido em 500 µl de água bidestilada estéril, e seguido de nova centrifugação
nas mesmas condições. Após desprezar-se o sobrenadante, o pellet foi ressuspendido em
100µl de água bidestilada estéril e fervido (100ºC) em banho-maria, durante 15min.
Por fim, a amostra foi centrifugada (10000rpm/5min) e o sobrenadante (extrato de
DNA) recolhido para um eppendorf.
3.2. Pesquisa de genes que codificam β-lactamases
Os resultados dos testes de suscetibilidade aos antibióticos orientaram a pesquisa
e identificação molecular dos genes associados ao fenótipo obtido. Assim, utilizando a
técnica de reação da polimerase em cadeia (PCR, Polymerase Chain Reaction), foram
detetados os genes de interesse, que codificam para a resistência aos β-lactâmicos.
Nos isolados com fenótipo de ESBL, sugerida pela suscetibilidade diminuída ou
resistência à cefotaxima e com sinergia com o ácido clavulânico foi pesquisada a
presença do gene blaCTX-M por PCR simples. Em 15 isolados em que não se detetou o
gene blaCTX-M foi pesquisada a presença dos genes de resistência blaTEM, blaSHV, blaOXA
e ampC (este último detetado apenas por constituir um controlo interno da espécie E.
coli) por PCR multiplex. Em 34 isolados suscetíveis ou resistentes à cefotaxima e sem
sinergia com o ácido clavulânico foi igualmente pesquisada a presença dos genes
blaTEM, blaSHV, blaOXA e ampC por PCR multiplex e ainda o gene blaGES por PCR
simples. Em 30 isolados, selecionados aleatoriamente na amostra, das espécies K.
pneumoniae, E. coli e Enterobacter spp., com suscetibilidade diminuída à cefoxitina,
foram ainda pesquisados sete outros genes, que codificam β-lactamases plasmídicas da
família AmpC (PMAβ): blaMOX, blaCIT, blaDHA, blaACC, blaMIR, blaFOX e blaACT. O gene
blaACT foi detetado por PCR simples e os restantes genes por PCR multiplex. Nos
isolados que apresentaram suscetibilidade diminuída aos carbapenemes e resultado
positivo para carbapenemase de classe A e D no teste de sinergia com meropeneme,
pesquisou-se a presença dos genes blaKPC, blaSME, blaOXA-48, blaGES e blaNMC, por PCR
multiplex.
Os primers, o tamanho dos fragmentos de amplificação e a temperatura de
hibridação de todos os genes bla pesquisados estão descritos na Tabela 6, tendo os
mesmos sido desenhados no LNR-RA, a apartir de sequências publicadas no EMBL ou
a partir de primers previamente publicados por outros autores.
Material e Métodos
32
Tabela 6 - Sequência de primers para pesquisa de diferentes genes bla utilizados no PCR e na sequênciaçãoa,
tamanho dos respetivos fragmentos e temperatura de hibridação.
Gene Primer Sequência (5’→3’) Tamanho do fragmento (pb) Temperatura de
hibridação
blaCTX-M CTXiF TTTGCGATGTGCAGTACCAGTAA 543
55°C CTXiR CGATATCGTTGGTGGTGCCATA
blaCTX-M-15 CTX-M-1Fa ATGGTTAAAAAATCACTGCG 869
55°C CTX-M-15Ra ACCGTCGGTGACGATTTTAG
CTX-M-15Fa AGAATAAGGAATCCCATGGTT 903
55°C CTX-M-1Ra CCGTTTCCGCTATTACAA
blaCTX-M-14 CTXG3Fa CTGATGTAACACGGATTGACC 871
55°C CTX14Ra CGATTTATTCAACAAAACCAG
blaTEM P1b TACGATACGGGAGGGCTTAC 716
56°C P2 a b TTCCTGTTTTTGCTCACCCA
FINa ATTCTTGAAGACGAAAGGGC 1091
56°C DEBa ATGAGTAAACTTGGTCTGAC
blaSHV SHVF b TCAGCGAAAAACACCTTG 471
56°C SHVR b TCCCGCAGATAAATCACCA
SHV1059 a TTAGCGTTGCCAGTGCTC 911
56°C SHV149P a CGCTTCTTTACTCGCCTTTA
ampC AmpCF b CCCCGCTTATAGAGCAACAA 634
56°C AmpCR b TCAATGGTCGACTTCACACC
blaOXA OXAF b TATCTACAGCAGCGCCAGTG 199
56°C OXA R b CGCATCAAATGCCATAAGTG
blaGES GES -Fa AAAGCAGCTCAGATCGGTGT 891
61°C GES - Ra AATTCGTCACGTTCTACGGC
GES-Fi c AAAGCAGCTCAGATCGGTGT 707
56°C
GES-Ri c AACCAATCAGCAGGAACAC
blaKPC KPC –Fa c ATGTCACTGTATCGCCGTCTAG 888
56°C KPC -Ra c AGAGCCTTACTGCCCGTTG
KPC_istB_fw a GCTACCGCTTGAAGGACAAG Variável
( 1800)
60°C
KPC_tnpA_rev a GTCAATGCCAAGACCCATCC
blaNMC/IMI NMC/IMI F c TTACAATATAGCGACAATGG 457
56°C
NMC/IMI R c TTACTTTATCCTCATGCTTG
blaSME SME F c CAGATGAGCGGTTCCCTTTA 509
56°C
SME R c AACCCAATCAGCAGGAACAC a primers utilizados em sequenciação; b primers utilizados em PCR multiplex para pesquisa de genes blaESBL; c primers utilizados em
PCR multiplex para pesquisa de genes que codificam carbapenemases de classe A e D; d primers utilizados em PCR multiplex para
pesquisa de genes que codificam PMAβ.
Material e Métodos
33
Tabela 6 - (Continuação)
Gene Primer Sequência (5’→3’) Tamanho do fragmento (pb) Temperatura
de
hibridação
blaOXA-48 OXA-48 -F c ATGCGTGTATTAGCCTTATC 140
56°C OXA-48 -R c CCTAAACCATCCGATGTG
blaMOX MOXM – Fd GCTGCTCAAGGAGCACAGGAT 520
64°C MOXM - Rd CACATTGACATAGGTGTGGTGC
blaCIT CITM - F d TGGCCAGAACTGACAGGCAAA 462
64°C CITM- R d TTTCTCCTGAACGTGGCTGGC
CMYG2F a TTACGGAACTGATTTCATG 1143 56°C
CMYG2R a TCGTCAGTTATTGCAGC
blaDHA DHAM-Fd AACTTTTCACAGGTGTGCTGGGT 405
64°C DHAM-Rd CCGTACGCATACTGGCTTTGC
DHA1Aa CTGATGAAAAAATCGTTATC 1141
56°C DHA1B a ATTCCAGTGCACTCAAAATA
blaACC ACCM-Fd ACCAGCCTCAGCAGCCGGTTA 346
64°C ACCM-Rd TTCGCCGCAATCATCCCTAGC
blaMIR EBCM-Fd CAGTTCTGCATTCGCCGCAC 802
64°C EBCM-Rd CACCTTGTTATCACTGCCTCCGAC
EBCFa AAATCCCTAAGCTGTGCCCTGCTG 1137
EBCRa TTACTGCAGCGCGTCGAGGAT
blaFOX FOXM-Fd GGACTCATCGCCAGTATTCCAACC 286
64°C FOXM-Rd AACTTCAGCAGATCCGCCGAAC
blaACT ACT-Fa GATGATGACTAAATCCCTTTGCTG 1127
63.1°C ACT-Ra AAATACGGTATGCCGCCTC
a primers utilizados em sequenciação; b primers utilizados em PCR multiplex para pesquisa de genes blaESBL; c primers utilizados em PCR
multiplex para pesquisa de genes que codificam carbapenemases de classe A e D; d primers utilizados em PCR multiplex para pesquisa
de genes que codificam PMAβ.
Para as reações de PCR simples foi preparada uma mistura de reação na câmara
de fluxo laminar (Holton) com os seguintes reagentes: tampão (1x, Quiagen), dNTPs
(0,2 mM de dATP, dCTP, dGTP e dTTP, Roche Diagnostics), cloreto de magnésio (3
mM, Quiagen), Q solution (1x, Quiagen), primers específicos (Tabelas 6), Taq
polimerase (0,6 unidades, Bioline) e água bidestilada, estéril e apirogénica (Labesfal) de
forma a perfazer um total de 24 μl. Para os PCR multiplex foi utilizado um protocolo
semelhante, mas com alteração na concentração de cada dNTP: 0,5mM. De seguida,
adicionou-se 1 μl de DNA (numa concentração final de 4 ng/μl) à mistura de reação. As
amplificações foram realizadas num termociclador (C1000 Thermocycler, Bio-Rad). De
acordo com as temperaturas de hibridação de cada primer e com o tamanho do
fragmento amplificado, os programas das reações diferiram entre si.
Material e Métodos
34
3.3. Pesquisa de genes implicados na resistência à tigeciclina
Nos isolados das espécies K. pneumoniae e E. coli, com suscetibilidade
diminuída à tigeciclina, amplificaram-se os genes ramR e marR, respetivamente. Os
primers para os genes ramR e marR foram desenhados, para este estudo, no LNR-RA a
partir de sequências publicadas (Hentschke et al., 2010; Keeney et al., 2008).
As condições de amplificação dos genes ramR e marR foram otimizados pela
primeira vez, no presente estudo. Assim, inicialmente foram testados intervalos de
temperatura para realizar o PCR (gradiente de temperatura), utilizando um
termociclador (C1000 Thermocycler, Bio-Rad), com a possibilidade de efetuar esse
gradiente, de forma a determinar a temperatura ótima de hibridação para cada um dos
genes. Além disso, foi realizado um PCR com um gradiente de cloreto de magnésio
(MgCl2) (1,5-5mM) de forma a detetar a concentração ótima de MgCl2 que
corresponderia à melhor amplificação, com a temperatura de hibridação previamente
escolhida no PCR com gradiente de temperatura, para cada um dos genes. Para o gene
ramR utilizou-se a temperatura de hibridização de 48 ºC e para o gene marR 54 ºC. Foi
escolhida a concentração de 3mM e 2,5mM de MgCl2 para amplificação dos genes
marR e ramR, respetivamente.
Para as reações de amplificação, por PCR simples, do gene marR foram
padronizadas para 25μL de volume total com os seguintes reagentes: 13,7 μL de água
bidestilada, estéril e apirogénica (Labesfal), 0,2 μL de dNTPs (0,2 mM de dATP, dCTP,
dGTP e dTTP, Roche Diagnostics) 2,5μL de tampão (1x, Quiagen), 1,5μL de MgCl2 (3
mM, Quiagen), 0,5 μL de cada primer (20 μM) (Tabela 7), 5 μL de Q solution (1x,
Quiagen), 0,1μL de Taq polimerase (0,6 unidades, Bioline) e, por fim, 1μL de DNA.
Para as reações de amplificação por PCR simples do gene ramR, foram utilizadas as
mesmas condições usadas para o gene marR, com uma diferença no volume de água
bidestilada (14,2 μL) e MgCl2 (1 μL; 2,5 mM, Quiagen).
Com a padronização dos parâmetros da reação de amplificação do gene marR e
ramR, foram efetuadas as reações de PCR com as condições descritas na Tabela 7, para
posterior análise da sequência nucleotídica. As amplificações e sequenciação foram
realizadas num termociclador (C1000 Thermocycler).
Material e Métodos
35
Tabela 7 - Sequência e tamanho dos primers ramR e marAB e as condições utilizadas nas reações de amplificação.
Gene Primers 5' - 3' Desnaturação
inicial
Nº de
ciclos Ciclos
Extensão
final
Tamanho do
fragmento
marAB marR-F GCAACTAATTACTTGCCAGG 94º C 5min 30 94º C 30s
54º C 30s
72º C
1min15s
72º C
10min
1162bp
marB-R AAGGTGGGAAGTTAATAAGC
ramR RamR-F ACTCATTATTAGGAAAGCGATG 94º C 5min 30 94º C 30s
48º C 45s
72º 1min
72º C
10min
725bp
RamR-R AGTGTTTCCGGCGTCATTAG
3.4. Eletroforese em gel de agarose e visualização de DNA
Os produtos amplificados de cada reação foram submetidos à eletroforese em gel
de agarose a 1% (Agarose Multi-Purpose, BIOLINE) em TAE 1x (0,04M tris-acetato,
0,001M EDTA), ao qual se adicionou SYBR®Safe (Invitrogen life Science
Technologies). O volume de amostra aplicado no gel foi de 7 μl, adicionados de 2 μl de
tampão (0,25% de azul de bromofenol, 0,25% xileno-cianol e 30% glicerol). A
eletroforese decorreu durante 35min, a 120V para os produtos de PCR simples e durante
45min a 120V para os produtos dos PCRs multiplex. Após migração dos produtos de
PCR, o gel foi visualizado sob luz ultravioleta num transiluminador (Bio-Rad Gel Doc
2000). Os isolados com genes de resistência evidenciaram um fragmento de DNA com
o tamanho (pb) previsto (ao serem desenhados os primers), tendo sido confirmado pelos
controlos positivos.
3.5. Purificação dos produtos de PCR
De forma a eliminar o excesso de reagentes (primers, dNTPs, Taq polimerase)
não utilizados na reação de amplificação, foi efetuada a purificação dos produtos de
PCR antes da realização da reação de sequenciação. Para tal, foi utilizado o método
ExoSAP-IT (Usb®), que tem a atividade enzimática, inicialmente, de uma exonuclease
e, posteriormente, de uma fosfatase alcalina. Assim, a reação de purificação foi
realizada com 2l do reagente ExoSAP-IT adicionados a 5l de produto de PCR. A
reação decorreu num termociclador (C1000 Thermocycler, Bio-Rad) com a ação das
Material e Métodos
36
enzimas a 37ºC, durante 15 minutos, numa fase inicial, seguida da sua inativação, a
80ºC, durante 15 minutos, numa fase final.
3.6. Sequenciação nucleotídica
Os produtos de PCR purificados foram sequenciados, de modo a determinar a
composição da sequência nucleotídica e identificar os genes detetados por PCR. Para
cada produto de PCR fez-se uma mistura de sequenciação com 1l de BigDye
Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystem), 0,4 μl do primer específico
para o gene em estudo (Tabelas 6 e 7), 1 μl de DNA purificado e 7,6 μl de água
bidestilada, estéril e apirogénica (Labesfal), de modo a perfazer um volume final de
10l. A reação de sequenciação decorreu num termociclador (Mastercycler Pro,
Eppendorf) durante 23 ciclos, com as seguintes condições: desnaturação das cadeias de
DNA a 96ºC, durante 10 s, hibridação dos primers a 56ºC, durante 5 s, e extensão a
60ºC, durante 5 min. De seguida, os produtos sequenciados foram enviados à Unidade
de Tecnologia e Inovação do INSA, para remoção dos terminadores por precipitação
alcoólica, migração no sequenciador automático (ABI PRISM
3100, Applied
Biosystem) e registo das sequências (eletroferogramas).
A análise e interpretação das sequências nucleotídicas dos genes bla e dos genes
ramR e marR obtidas foram, posteriormente, realizadas no LNR-RA, recorrendo ao
software Bionumerics Applied Maths versão 3.5. O alinhamento das sequências
nucleotídicas obtidas para o gene marR, foi realizada, incluindo a sequência de
referência de E. coli K-12 MG1655 wild-type, recorrendo ao programa bioinformático
CLC DNA Workbench 5.6. As sequências nucleotídicas do gene ramR foram também
alinhadas com a sequência de referência de Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae
MGH 78578 (CP000647), recorrendo ao mesmo programa bioinformático.
4. Caracterização bioquímica: β-lactamases
Realizou-se a focagem isoelétrica para confirmar a expressão de β-lactamases
codificadas pelos genes amplificados, em isolados selecionados aleatoriamente na
amostra em estudo.
Material e Métodos
37
4.1. Extração de β-lactamases
A extração de β-lactamases, para posterior realização da focagem isoelétrica, foi
realizada pela inoculação, em 15mL de Brain Heart Infusion (BHI) (INSA), de uma
colónia isolada em meio de gelose simples (INSA). A suspensão bacteriana obtida, foi
incubada a 37ºC, com agitação, durante 18h e, de seguida, centrifugada a 10000rpm, a
4ºC, durante 15min (2K15 Sigma). Após centrifugação, o sobrenadante foi rejeitado e o
pellet foi ressuspendido em 1mL de água destilada estéril e agitado num vortex®. De
seguida, a suspensão foi sonicada (num tubo envolto em gelo), durante 1min30seg com
um sonicador (UP 200S, Dr. Hielscher, GmbH). A suspensão obtida foi, então,
centrifugada a 16000rpm, a 4ºC, durante 30min. Por fim, o sobrenadante (β-lactamase)
foi transferido para um eppendorf, e conservado a -20ºC, para posterior aplicação e
migração no gel de focagem.
4.2. Teste do Nitrocefin
Para analisar a atividade enzimática da β-lactamase, adicionou-se 5µL de cada
amostra a 5µL de Nitrocefin (Oxoid). O resultado positivo resulta da degradação do
Nitrocefin pela enzima, com alteração da cor inicial (amarelo) para vermelho.
4.3. Gel de focagem isoelétrica
4.3.1. Preparação do gel de migração
Inicialmente, duas placas de vidro (para realização do gel de migração) foram
tratadas com Repel-Silane (Pharmacia). Adicionou-se, numa das placas, o
GelBond®PAG Film (Amersham Pharmacia Biotech AB), com a parte hidrófila para
cima. De seguida, a outra placa foi assente por cima daquele filme (segura à primeira
placa, por meio de molas). O gel de migração foi preparado num volume de 31,1mL
com os seguintes reagentes: 3,75mL ReadySol IEF 40% (Pharmacia Biotech), 2mL
Ampholine® (pH 7,0-9,0) (Amersham Pharmacia Biotech AB), 24 mL água destilada,
85µL persulfato de amónia 10% (Merck) e 50 µL de TEMED (N,N,N’,N’-
Material e Métodos
38
tetrametiletilenodiamina) (Merck). Após preparação da solução, esta foi injetada entre
duas placas vidros. A polimerização foi efectuada por exposição à luz, durante 25min.
4.3.1.1. Migração
Após o período de polimerização, o gel foi colocado numa plataforma de
migração (Multiphor II, Amersham Pharmacia Biotech), e refrigerado por um banho à
temperatura de 12ºC (Multitemp III, Amersham Pharmacia Biotech). Posteriormente, os
pedaços de papel de filtro (Amersham Biosciences AB), que exerceram a função de
suporte para a aplicação de 5l de extratos enzimáticos, foram colocados no gel
(ânodo). Finalmente, aplicaram-se duas tiras de papel de filtro (Amersham Pharmacia
Biotech AB) no gel: uma embebida em H3PO4 1M (ânodo) e outra embebida em NaOH
1M (cátodo). Estas tiras permitiram o contato entre o gel e os eléctrodos. A duração da
migração foi de 1 hora, com uma voltagem de 1500V, intensidade de 30mA e potência
de 30W. Em paralelo com as amostras em estudo, foram aplicados no gel os seguintes
extratos de β-lactamases de referência, isto é, controlos de migração, com pIs
conhecidos: E. coli R111 (TEM-1, pI 5,4), E. coli 5753 (CTX-M-15, pI 8,9), E. coli
Guer (IRT-2, pI 5,2), E. coli Soler (AmpC, pI 9,2) e K. pneumoniae 6884 (SHV-1, pI
7,6).
4.3.1.2. Preparação do gel de revelação
A preparação do gel de revelação foi efetuada da seguinte forma: aquecimento
de 14,7mg/mL de agar (Difco) e 4,9mg/mL de amido (Difco) dissolvidos em 70mL de
tampão fosfato 0,1M, pH 6. Após arrefecimento da solução, adicionou-se 0,13mg/mL
de penicilina G (Wyeth) e 3mL de uma solução de iodo composta por 20mg/mL de iodo
(Sigma) e por 530mg/mL de iodeto de potássio (Merck). Seguidamente, injetou-se o gel
entre duas placas de vidro, previamente aquecidas para evitar a polimerização do gel e
colocou-se no frio para solidificar. Após migração das amostras no gel de migração,
colocou-se o gel de revelação sobre o primeiro. A revelação da presença do extrato
enzimático no gel de migração foi possível devido à hidrólise enzimática da penicilina
G pela -lactamase, a qual origina ácido penicilinóico; este promove a redução do iodo
na presença do amido, descorando o gel de revelação. Através da comparação com as
enzimas de referência determinou-se o(s) pI(s) em cada amostra.
Resultados
39
III. Resultados
1. Avaliação da suscetibilidade de bactérias de Gram negativo aos
antibióticos
1.1. Suscetibilidade a 8 classes de antibióticos
O teste de suscetibilidade foi efetuado em 211 isolados de Gram negativo. Os
resultados da suscetibilidade de todos os antibóticos ensaiados estão descritos na Tabela
8. Dentro do grupo dos antibióticos β-lactâmicos verificou-se uma elevada percentagem
de suscetibilidade diminuída a vários antibióticos ensaiados. Assim, todos os isolados
em estudo apresentaram suscetibilidade diminuída à amoxicilina; 95 e 97%
apresentaram suscetibilidade diminuída a outras penicilinas: ticarcilina e piperacilina,
respetivamente. Verificou-se que 91% e 53% dos 211 isolados eram ser não suscetíveis
às combinações amoxicilina/ácido clavulânico e piperacilina/tazobactam,
respetivamente. De forma geral, os isolados apresentaram suscetibilidade diminuída às
cefalosporinas de primeira (98%), segunda (98%) e terceira geração (90-95%). Os
isolados apresentaram menor percentagem de suscetibilidade diminuída (69%) à
cefalosporina de quarta geração, em relação às outras cefalosporinas. Verificou-se ainda
menor atividade antimicrobiana da cefoxitina (71%) e do aztreonam (85%) para os
isolados estudados. Os carbapenemes foram os antibióticos que apresentaram maior
atividade in vitro na classe dos β-lactâmicos ensaiados, tendo, portanto, os isolados
evidenciado uma maior suscetibilidade a estes antibióticos; no entanto de entre todos os
carbapenemes ensaiados, os isolados apresentaram uma maior percentagem de
suscetibilidade diminuída (13%) ao ertapeneme. Nas espécies bacterianas estudadas, a
suscetibilidade diminuída ao imipeneme encontra-se distribuída da seguinte forma: 6%
das K. pneumoniae (4/70), 50% das M. morganii (5/10), 5% Enterobacter spp./C.
freundii (1/20), e 29% dos P. mirabilis (2/7).
Em relação às fluoroquinolonas, os isolados apresentaram baixa percentagem de
suscetibilidade (78-88% de suscetibilidade diminuída). Na classe dos aminoglicosídeos,
os antibióticos menos eficazes in vitro foram a kanamicina (73%) seguida da
gentamicina (57%). Os isolados apresentaram maior percentagem de suscetibilidade à
amicacina (91%), neste grupo. Os nitrofuranos e a fosfomicina apresentaram boa
atividade in vitro. Já em relação à combinação trimetoprim/sulfamidas verificou-se que
Resultados
40
69% dos isolados apresentavam suscetibilidade diminuída. A colistina foi um dos
antibióticos para os quias os 211 isolados apresentaram menor percentagem de
suscetibilidade diminuída (14%), bem como a tigeciclina (27%).
A análise das CIM50 e CIM90 de, pelo menos, um antibiótico de cada classe
ensaiada para as várias espécies bacterianas estudadas, encontra-se na Tabela 9. Como
se pode verificar a menor CIM90 da tigeciclina é de 1mg/L para E. coli, Enterobacter
spp./C. freundii, sendo superior em K. pneumoniae (4mg/L). Em relação à
ciprofloxacina, a CIM90 foi >8mg/L para todas as espécies e CIM50 e CIM90 de 32 a
>64mg/L nas cefalosporinas de terceira geração, com exceção da CIM50 da ceftazidima
para P. mirabilis e M. morganii (CIM50 4mg/L e CIM50 8mg/L, respetivamente). Já a
CIM50 e CIM90 do imipeneme foi igual para E. coli e K. pneumoniae (≤0,25mg/L e
0,5mg/L, respetivamente), tendo aquele antibiótico menor atividade in vitro nos
isolados de M. morganii (CIM50 2 mg/L e CIM90 4mg/L) e P. mirabilis (CIM50 2 mg/L
e CIM90 16mg/L), mas atividade superior in vitro em S. marcescens (CIM50 ≤0,25mg/L
e CIM90 ≤0,25mg/L).
Resultados
41
Tabela 8 - Suscetibilidade de 211 isolados de Gram negativo a antibióticos de diferentes classes.
Antibióticos
Suscetibilidade
diminuída
Suscetibilidade
Nº % Nº %
β-lactâmicos
Amoxicilina 211 100 0 0
Ticarcilina 205 97 6 3
Piperacilina 201 95 10 5
Amoxicilina + CLAV 191 91 20 9
Piperacilina + TAZ 111 53 100 47
Cefalotina 207 98 4 2
Cefuroxima 206 98 5 2
Cefotaxima a 201 95 10 5
Ceftazidima a 201 95 10 5
Cefpodoxima 201 95 10 5
Ceftriaxona 190 90 21 10
Cefixima 193 91 18 9
Cefepima 145 69 66 31
Cefoxitina a 150 71 61 29
Aztreonam 180 85 31 15
Imipeneme a 12 6 199 94
Ertapeneme 28 13 183 87
Meropeneme 6 3 205 97
Fluroquinolonas
Ácido nalidíxico 165 78 46 22
Norfloxacina 185 88 26 12
Pefloxacina 151 72 60 28
Ciprofloxacina a 176 83 35 17
Aminoglicosídeos
Kanamicina 154 73 57 27
Gentamicina 120 57 91 43
Amicacina 20 9 191 91
Polimixinas
Colistina a 29 14 182 86
Glicilciclinas
Tigeciclina a 56 27 155 73
Outras classes
Nitrofuranos 63 30 148 70
Fosfomicina 21 10 190 90
Trimetoprim/Sulfamidas 145 69 66 31 a Suscetibilidade determinada pelo método de microdiluição (a suscetibilidade aos restantes antibióticos
foi determinada pelo método de difusão por disco); CLAV, Ácido clavulânico; TAZ, tazobactam.
Resultados
42
1.2. Suscetibilidade à tigeciclina
A atividade in vitro da tigeciclina (expressa em CIM50 e CIM90) para as
diferentes espécies obtida pelo método de microdiluição, está igualmente analisada na
Tabela 9. Aí comparou-se a suscetibilidade do total dos isolados em relação aos
isolados suscetíveis à tigeciclina e com suscetiblidade diminuída a este antibiótico.
Assim, no total de isolados, 73% eram suscetíveis à tigeciclina (Tabela 8), representado
por 93% dos isolados de E. coli, 90% de Enterobacter spp./C. freundii, 57% de K.
pneumoniae, 33% de S. marcescens e, por fim, 20% de M. morganii (Tabela 9).
Nos isolados suscetíveis à tigeciclina verificou-se que a CIM50 para este
antibiótico variou de 0,5 a 1mg/L e a CIM90 foi de 1mg/L nos isolados de E. coli, K.
pneumoniae, Enterobacter spp./C. freundii, M. morganii e S. marcescens. Entre os
antibióticos β-lactâmicos testados nesses isolados suscetíveis à tigeciclina, o imipeneme
foi o antibiótico que apresentou melhor atividade in vitro com CIM50 e CIM90 baixas
(CIM50 ≤0,25 e CIM90 ≤0,25 a 1mg/L), à exceção da espécie M. morganii (CIM50 0,5
mg/L e CIM90 4mg/L). No que diz respeito às cefalosporinas de terceira geração,
verificaram-se valores de CIM90 entre 32 mg/L e >64mg/L, relativamente próximos dos
valores de CIM50 entre 32 mg/L e 64mg/L, excetuando-se um valor de CIM50 8 mg/L
para P. mirabilis. A cefoxitina apresentou também baixa atividade in vitro nesses
isolados, com CIM90 32 mg/L - >128mg/L, assim como a ciprofloxacina com valores de
CIM90 de 4 mg/L a >8mg/L. Relativamente à colistina, foi observada uma atividade in
vitro superior a outros antibióticos testados nos isolados de E. coli e K. pneumoniae
com CIM90 ≤0,25 mg/L e 1mg/L, respetivamente.
A suscetibilidade diminuída à tigeciclina foi observada em 27% dos 211 isolados
em estudo (Tabela 8). De entre estes, 100% dos P. mirabilis apresentaram CIM50 e
CIM90 de 8mg/L. Para as outras espécies com suscetibilidade diminuída à tigeciclina
este antibiótico apresentou CIM50 de 2 mg/L, exceto M. morganii com 4mg/L, e
evidenciou uma CIM90 de 2mg/L para isolados de E. coli e S. marcescens, 8mg/L para
K. pneumoniae e Enterobacter spp./C. freundii e 16mg/L para M. morganii. Ainda nos
isolados com suscetibilidade diminuída à tigeciclina, a atividade in vitro das
cefalosporinas de terceira geração (CIM90 32->64mg/L) e da cefoxitina (CIM90 64-
>128mg/L) foi menor do que para os restantes antibióticos, sendo, no entanto,
semelhantes as CIM90 dos isolados suscetíveis à tigeciclina. O imipeneme apresentou,
Resultados
43
geralmente, uma maior atividade in vitro do que os restantes antibióticos,
nomeadamente para isolados de E. coli, K. pneumoniae e S. marcescens com CIM90
≤0,25 mg/L e em Enterobacter spp./C. freundii com CIM90 0,5mg/L, valores, qualquer
deles, de suscetibilidade. Em isolados de M. morganii e P. mirabilis observaram-se
valores mais elevados de CIM90 4 e 16mg/L, respetivamente. A ciprofloxacina
apresentou CIM90 >8mg/L, para todas as espécies, com exceção de Enterobacter spp./
C. freundii (CIM90 0,25mg/L). Relativamente à colistina, foi observada uma elevada
atividade in vitro apenas nos isolados de K. pneumoniae e Enterobacter spp./C. freundii
com CIM90 de 1mg/L, correspondendo a valores de suscetibilidade.
Ainda em relação aos isolados suscetíveis e não suscetíveis à tigeciclina,
analisou-se a sua distribuição de acordo com a idade do doente em que foram obtidos
(Fig. 11), tendo-se verificado que os isolados não suscetíveis foram, sobretudo,
provenientes de doentes com idade ≥65 anos (22%). Foram ainda isolados de doentes do
grupo etário15-64 anos (3 %), do grupo etário 1-9 anos (1 %) e 0% em indivíduos com
idade < 1 ano e no grupo etário 10-14 anos. Desconhece-se a idade dos doentes de 6%
dos isolados estudados.
Figura 11 - Distribuição de 199 isolados suscetíveis e não suscetíveis à tigeciclina por grupo etário dos doentes. TG,
tigeciclina; S, sucetíveis; I/R, suscetibilidade diminuída; (Não contempla 12 (6%) dos isolados do estudo, cuja idade
dos doentes se desconhece).
Os isolados suscetíveis à tigeciclina estavam distribuídos em todas as faixas
etárias, com uma maior frequência também em doentes com idade ≥ 65 anos (52%)
(Fig. 11).
0
10
20
30
40
50
60
TGC S (n=149) TGC I/R (n=50)
Per
cen
tag
em
<1 ano (n=5)
1-9 anos (n=8)
10-14 anos (n=2)
15-64 anos (n=37)
≥65 anos (n=147)
Resultados
44
Tabela 9 - Intervalo de concentrações inibitórias mínimas (CIM) nas quais 50% (CIM50) e 90% (CIM90) dos isolados foram inibidos por 7 antibióticos de 4 classes diferentes, em relação ao total
de isolados (n=211) e à suscetibilidade ou suscetibilidade diminuída à tigeciclina.
E. coli CIM (mg/L)
Total de isolados (n=101) Tigeciclina Suscetível (n=94) Tigeciclina I/R (n=7) Breakpoints
SFM
Interpretação
Interpretação
Interpretação
Antibióticos CIM50 CIM90 Range %S %IR CIM50 CIM90 Range %S %IR CIM50 CIM90 Range %S %IR S R
CAZ 32 64 ≤1 - >64 6% 94% 32 64 ≤1 - >64 6% 94% 32 32 8 - 32 0% 100% ≤1 >4
CTX >64 >64 ≤1 - >64 5% 95% >64 >64 ≤1 - >64 5% 95% 64 64 32 - 64 0% 100% ≤1 >2
FOX 16 32 ≤2 - >128 23% 77% 16 32 ≤2 - >128 24% 76% 32 128 16 - 128 0% 100% ≤8 >32
IMP ≤0,25 0,5 ≤0,25- 1 100% 0% ≤0,25 0,5 ≤0,25- 1 100% 0% ≤0,25 ≤0,25 ≤0,25 - ≤0,25 100% 0% ≤2 >8
CIP >8 >8 ≤0,125- >8 10% 90% >8 >8 0,125- >8 11% 89% >8 >8 >8 - >8 0% 100% ≤0,5 >1
TGC 0,5 1 ≤0,25 - 2 93% 7% 0,5 1 ≤0,25 - 1 100% 0% 2 2 2 - 2 0% 100% ≤1 >2
COL ≤0,5 ≤0,5 ≤0,5- >32 97% 3% ≤0,5 ≤0,5 ≤0,5-32 98% 2% ≤0,5 8 ≤0,5 - 8 86% 14% ≤2 >2
K. pneumoniae CIM (mg/L)
Total de isolados (n=70) Tigeciclina Suscetível (n=40) Tigeciclina I/R (n=30) Breakpoints
SFM
Interpretação
Interpretação
Interpretação
Antibióticos CIM50 CIM90 Range %S %IR CIM50 CIM90 Range %S %IR CIM50 CIM90 Range %S %IR S R
CAZ 32 64 2 - >64 0% 100% 32 64 2 - >64 0% 100% 32 64 32 - 64 0% 100% ≤1 >4
CTX >64 >64 ≤1 - >64 3% 97% >64 >64 ≤1 - >64 3% 98% >64 >64 ≤1 - >64 3% 97% ≤1 >2
FOX 8 128 4 - >128 51% 49% 8 128 4 - >128 58% 43% 16 64 4 - 128 43% 57% ≤8 >32
IMP ≤0,25 0,5 ≤0,25- 256 94% 6% ≤0,25 0,5 ≤0,25 - 256 90% 10% ≤0,25 ≤0,25 ≤0,25- 1 100% 0% ≤2 >8
CIP >8 >8 ≤0,125- >8 14% 86% >8 >8 ≤0,125- >8 23% 78% >8 >8 0,5 - >8 3% 97% ≤0,5 >1
TGC 1 4 ≤0,25 - 16 57% 43% 1 1 ≤0,25 - 1 100% 0% 2 8 2 - 16 0% 100% ≤1 >2
COL ≤0,5 1 ≤0,5- 8 96% 4% ≤0,5 1 ≤0,5 - 4 95% 5% ≤0,5 1 ≤0,5 - 8 97% 3% ≤2 >2
Resultados
45
Tabela 9 - (Continuação)
Enterobacter spp./C. freundii CIM (mg/L)
Total de isolados (n= 20) Tigeciclina Suscetível (n=18) Tigeciclina I/R (n=2) Breakpoints
SFM
Interpretação Interpretação
Interpretação
Antibióticos CIM50 CIM90 Range %S %IR CIM50 CIM90 Range %S %IR CIM50 CIM90 Range %S %IR S R
CAZ 64 >64 16- >64 0% 100% 64 >64 16 - >64 0% 100% >64 >64 >64 - >64 0% 100% ≤1 >4
CTX >64 >64 8 - >64 0% 100% >64 >64 8 - >64 0% 100% >64 >64 >64 - >64 0% 100% ≤1 >2
FOXb 128 >128 32 - >128 0% 100% 128 >128 32 - >128 0% 100% 128 > 128 128 - >128 0% 100% ≤8 >32
IMP ≤ 0,25 0,5 ≤0,25- 16 95% 5% ≤0,25 1 ≤0,25 - 16 94% 6% ≤0,25 0,5 ≤0,25- 0,5 100% 0% ≤2 >8
CIP 0,25 >8 ≤0,125- >8 60% 40% 0, 25 >8 ≤0,125- >8 56% 44% ≤0,125 0,25 ≤0,125 - 0,25 100% 0% ≤0,5 >1
TGC 0,5 1 ≤0,25 - 8 90% 10% 0,5 1 ≤0,25 - 1 100% 0% 2 8 2 – 8 0% 100% ≤1 >2
COL ≤ 0,5 4 ≤0,5- 32 85% 15% ≤0,5 32 ≤0,5 - 32 83% 17% ≤0,5 1 ≤0,5 – 1 100% 0% ≤2 >2
M.morganii CIM (mg/L)
Total de isolados( n=10) Tigeciclina Suscetível (n=2) Tigeciclina I/R (n=8) Breakpoints
SFM
Interpretação
Interpretação
Interpretação
Antibióticos CIM50 CIM90 Range %S %IR CIM50 CIM90 Range %S %IR CIM50 CIM90 Range %S %IR S R
CAZ 8 32 ≤1 - >64 20% 80% 8 >64 8 - >64 0% 100% 8 32 ≤1 – 32 25% 75% ≤1 >4
CTX 32 >64 ≤1 - >64 20% 80% 4 >64 4 - >64 0% 100% 32 >64 ≤1 - >64 25% 75% ≤1 >2
FOX 32 >128 32 - >128 0% 100% 32 >128 32 - >128 0% 100% 32 >128 32 - >128 0% 100% ≤8 >32
IMP 2 4 0,5 - 4 50% 50% 0,5 4 0,5 - 4 50% 50% 2 4 1-4 50% 50% ≤2 >8
CIP 8 >8 ≤0,125- >8 30% 70% 4 8 4-8 0% 100% 8 >8 ≤0,125- >8 38% 63% ≤0,5 >1
TGC 4 8 1-16 20% 80% 1 1 1 - 1 100% 0% 4 16 2 – 16 0% 100% ≤1 >2
COL b
>32 >32 32 - >32 0% 100% 32 >32 32 - >32 0% 100% >32 >32 >32 - >32 0% 100% ≤2 >2
Resultados
46
Tabela 9 - (Continuação)
P. mirabilis CIM (mg/L)
Total de isolados (n=7)a Breakpoints
SFM
Interpretação
Antibióticos CIM50 CIM90 Range %S %IR S R
CAZ 4 32 ≤1 - >32 29% 71% ≤1 >4
CTX 64 >64 ≤1 - >64 14% 86% ≤1 >2
FOX 32 64 4 - 64 43% 57% ≤8 >32
IMP 2 16 1 -16 71% 29% ≤2 >8
CIP >8 >8 2 - >8 0% 100% ≤0,5 >1
TGC 8 8 4-8 0% 100% ≤1 >2
COL b
>32 >32 32 - >32 0% 100% ≤2 >2
S. marcescens CIM (mg/L)
Total de isolados (n= 3) Tigeciclina Suscetível (n=1) Tigeciclina I/R (n=1) Breakpoints
SFM
Interpretação
Interpretação
Interpretação
Antibióticos CIM50 CIM90 Range %S %IR CIM50 CIM90 Range %S %IR CIM50 CIM90 Range %S %IR S R
CAZ 32 64 32 - 64 0% 100% 32 32
0% 100% 32 64 32 - 64 0% 100% ≤1 >4
CTX 64 >64 64 - >64 0% 100% 64 64
0% 100% 64 >64 64 - >64 0% 100% ≤1 >2
FOX 64 128 32 - 128 0% 100% 128 128
0% 100% 32 64 32-64 0% 100% ≤8 >32
IMP ≤0,25 ≤0,25 ≤0,25- ≤0,25 100% 0% ≤0,25 ≤0,25
100% 0% ≤0,25 ≤0,25 ≤0,25- ≤0,25 100% 0% ≤2 >8
CIP 4 >8 1 - >8 0% 100% 4 4
0% 100% 1 >8 1 - >8 0% 100% ≤0,5 >1
TGC 2 2 1 - 2 33% 67% 1 1
100% 0% 2 2 2 - 2 0% 100% ≤1 >2
COL b
>32 >32 >32 - >32 0% 100% >32 >32
0% 100% >32 >32 >32 - >32 0% 100% ≤2 >2 a Coincide com o número de isolados com suscetibilidade diminuída à tigeciclina (n=7);
b Resistência natural; CAZ, ceftazidima; CTX, cefotaxima; FOX, cefoxitina; IMP,
imipeneme; CIP, ciprofloxacina; TGC, tigeciclina; COL, colistina; S, suscetível, I, intermédio; R, resistente; SFM, Sociedade Francesa de Microbiologia.
Resultados
47
1.3. Análise da multirresistência
Do total de 211 isolados, 89% eram multirresistentes. Foi observado que em
todas as espécies existiam isolados multirresistentes: 88% de E. coli, 97% de K.
pneumoniae, 50% de Enterobacter spp./C. freundii e 100% de M. morganii, P.
mirabilis, e S. marcescens. Na Tabela 10 estão representados os diferentes perfis de
multirresistência detetados nas várias espécies bacterianas estudadas, realçando os que
apresentavam ou não suscetibilidade à tigeciclina. Aí se verifica que todos os perfis de
multirresistência apresentavam suscetibilidade diminuída aos antibióticos β-lactâmicos
e à maioria às fluoroquinolonas, seguida dos aminoglicosídeos. Embora tenham sido
observados mais perfis de multirresistência com suscetibilidade diminuída à tigeciclina
(n=20) do que perfis de multirresistência de isolados suscetíveis à tigeciclina (n=17), há
uma maior percentagem (70%) de isolados multirresistentes com suscetibilidade à
tigeciclina.
Nos isolados suscetíveis à tigeciclina, o perfil de multirresistência predominante
incluiu suscetibilidade diminuída aos β-lactâmicos, às fluoroquinolonas,
aminoglicosídeos e à associação trimetoprim/sulfamidas, encontrado em E. coli (37%;
33/89 isolados), K. pneumoniae (19%; 13/68 isolados) e Enterobacter spp./C. freundii
(50%; 5/10 isolados). Este perfil foi também observado em conjunto com a
suscetibilidade diminuída à tigeciclina em E. coli (4%; 4/89 isolados) e K. pneumoniae
(19%; 13/68 isolados). A multirresistência aos β-lactâmicos, fluoroquinolonas,
aminoglicosídeos foi encontrada apenas em E. coli (34%, 30/89 isolados) e foi também
observada em conjunto com suscetibilidade diminuída à tigeciclina apenas num isolado
de E. coli.
Foi ainda detetado outro perfil de multirresistência que incluiu suscetibilidade
diminuída aos β-lactâmicos, às fluoroquinolonas, aos aminoglicosídeos, à associação
trimetoprim/sulfamidas e nitrofuranos, predominante em K. pneumoniae (28%; 19/68
isolados) e encontrada num isolado de E. coli (1%; 1/89 isolados), tendo sido também
observado em associação com suscetibilidade diminuída à tigeciclina apenas em K.
pneumoniae (15%; 10/68 isolados). Em P. mirabilis, M. morganii e S. marcescens a
multirresistência estava, sobretudo, associada à suscetibilidade diminuída à tigeciclina.
Resultados
48
Tabela 10 - Distribuição de 187 isolados com multirresistência aos antibióticos, em 211 isolados de Gram negativo,
realçando os perfis com e sem suscetibilidade diminuída à tigeciclina, por espécie bacteriana.
Fenótipo de
multirresistência (187/211)a
E.coli
(89/101)a
K. pneumoniae
(68/70)a
Enterobacter
spp./C. freundii
(10/20)a b
M. morganii
(10/10)a
P. mirabilis
(7/7)a
S. marcescens
(3/3)a
Suscetibilidade à tigeciclina (131/187)
L A N
1
L A S 3 2
L Q A 30
L Q A C FS
1
L Q A FS 1
L Q A S 33 13 5
L Q A S C 2 1
L Q A S C FS
1
L Q A S C N
1
1
L Q A S FS 2
L Q A S FS N
2
L Q A S N 1 19 1
L Q FS 1
L Q N 1
L Q S 6
L Q S C
1
L Q S N 2
Suscetibilidade diminuída à tigeciclina (56/187)
L C FS N T
1
L C N T
1
L N T
1
L Q A C FS N T
1 1
L Q A S C FS N T
2 2
L Q A S C FS T
1
L Q A S C N T
2 2
L Q A S C T 1
L Q A S FS N T
2
L Q A S FS T
1
L Q A S N T
10
L Q A S T 4 13
L Q A T 1
L Q C FS N T
1
L Q C N T
1
L Q N T
1 1
L Q S C FS N T
1
L Q S C N T
1
1
L Q S N T
2
L Q S T 1
a Isolados multirresistentes/ total de isolados em estudo. b Integra 8/16 isolados de Enterobacter spp. e 2/4 isolados de C. freundii
Os perfis em negrito representam os perfis de multirresistência que são comuns em isolados com e sem
suscetibilidade diminuída à tigeciclina; A, aminoglicosídeos (kanamicina, gentamicina, amicacina); C, colistina; FS,
Resultados
49
fosfomicina; N, nitrofuranos; L, β-lactâmicos; Q, fluoroquinolonas (Ácido nalidíxico, norfloxacina, pefloxacina,
ciprofloxacina); S, trimetoprim/sulfamidas; T, tigeciclina.
Para além destes perfis em comum, com e sem suscetibilidade à tigeciclina,
foram ainda observados outros perfis de multirresistência, em isolados das diferentes
espécies, embora em menor frequência, sendo os perfis representados maioritariamente
pela suscetibilidade diminuída aos aminoglicosídeos e às fluoroquinolonas.
2. Caracterização genotípica dos isolados produtores de β-lactamases
Os resultados dos testes fenotípicos orientaram a pesquisa de genes bla
implicados na suscetibilidade diminuída aos antibióticos β-lactâmicos. Os perfis de
suscetibilidade aos antibióticos β-lactâmicos ensaiados foram relacionadas com os
genótipos obtidos e respetivas β-lactamases identificadas, assim como a distribuição
pelos hospitais de proveniência (Tabelas 11, 12 e 13).
2. 1. ESBLs, PMAβ e penicilinases
Foram identificados 84% de isolados com suscetibilidade diminuída à
cefotaxima e sinergia com ácido clavulânico e/ou resultado positivo no E-teste
PM/PML, indicativo da produção de ESBL (Tabela 11). Assim, a presença deste
fenótipo conduziu, principalmente, à pesquisa de genes blaCTX-M, tendo sido detetados
161 genes blaCTX-M (Tabela 11) que codificavam a β-lactamase CTX-M. Globalmente,
foram identificadas 137 enzimas CTX-M-15 e CTX-M-15-tipo, distribuídas em todas as
espécies estudadas, com predominância em E. coli (55%) e em K. pneumoniae (38%).
Foram ainda identificadas outras β-lactamases CTX-M do grupo 1: CTX-M-1 (2%) em
E. coli e CTX-M-32 (2%) em E. coli e P. mirabilis. Do grupo 9 foi identificada a ESBL
CTX-M-14 (5%) apenas em E. coli. As enzimas AmpC plamídicas identificadas, DHA-
1 e CMY-2, foram detetadas em isolados de K. pneumoniae e E. coli, respetivamente.
Em ambas verificou-se ainda a produção de CTX-M e fenótipo de suscetibilidade
diminuída às penicilinas, cefalosporinas de primeira, segunda, terceira e quarta geração,
ao aztreonam, cefoxitina e inibidores de β-lactamases.
Foi efetuada a pesquisa de genes que codificam enzimas PMAβ em 26 dos 28
isolados de E. coli e K. pneumoniae com suscetibilidade diminuída à cefoxitina, no
entanto, não foram obtidos resultados positivos.
Na ausência de genes blaCTX-M foram, então, pesquisadas outras famílias de
genes bla, nomeadamente, da família TEM e SHV. Assim, foram detetados genes
Resultados
50
blaTEM, entre os quais a maioria codificavam penicilinases TEM-1, TEM-1-tipo e num
isolado, TEM-2. De facto, num isolado de P. mirabilis, com fenótipo ESBL foram
apenas identificadas as penicilinases TEM-1 e TEM-2. Foi também identificada a
produção de duas ESBLs da família TEM, TEM-10 em P. mirabilis e TEM-4 em E.
coli. A ESBL TEM-4 era co-produzida com a penicilinase TEM-1, o que foi confirmado
pela identificação de duas enzimas, uma com pI 5,9 e outra com pI 5,4 (respetivamente),
por focagem isoelétrica.
Da família SHV, foram identificadas penicilinases parentais, entre as quais
SHV-1, SHV-1-tipo e SHV-11. A presença de algumas destas β-lactamases foi
demonstrada na focagem isoelétrica com pI de 7,6. Foram também identificados genes
blaSHV que codificavam ESBL, nomeadamente SHV-2, SHV-12 e SHV-55. Em alguns
casos, a expressão das enzimas SHV-12 e SHV-55 foi observada pela focagem
isoelétrica dos extratos dos isolados respetivos, tendo-se identificado um pI de 8,2. As
enzimas ESBL da família SHV foram encontradas em K. pneumoniae, E. coli, E.
cloacae, C. freundii e S. marcescens.
Resultados
51
Tabela 11 - Genótipo de 177 isolados, de diferentes espécies, com suscetibilidade diminuída à cefotaxima, detetados como possíveis produtores de ESBL por métodos fenotípicos: β-lactamases
expressas, perfil de resistência aos antibióticos β-lactâmicos e distribuição por hospital a b.
Genótipoc (Nº de isolados) β-lactamasesd (Nº isolados) e
Perfil de resistência aos
β- lactâmicos
Código de
Hospitais
Número de
isolados
E. coli
blaCTX-M (10) CTX-M-1 (3)/ CTX-M-14 (1)/ CTX-M-15-tipo (3)/ CTX-M-15 (3) P C1 C2 C3 C4 M (I) B, D, E, G,
H, N 10
blaCTX-M (62)/ blaCTX-M+blaCMY (1) CTX-M-1 (1)/ CTX-M-14 (5)/ CTX-M-15-tipo (36)/ CTX-M-15 (18)
CTX-M-32 (1)/ CTX-M-15+ CMY-2 (1) P C1 C2 C3 C4 M F (I)
A, B, C, D,
E, F, G, H, L,
M, N
63
blaCTX-M (1) CTX-M-15 (1) f P C1 C2 C3 C4 M F I C G 1
blaCTX-M (8) CTX-M-14 (1)/ CTX-M-15 (1)/ CTX-M-15-tipo (5) P C1 C2 C3 (F) (I)
B, F, L 8
blaCTX-M (7)/ blaSHV + ampC (1)/
blaTEM + blaSHV + ampC (2)
CTX-M-15 (1)/ CTX-M-15-tipo (6)/ SHV-12 (1)/
SHV-12 + TEM-1-tipo (2) P C1 C2 C3 M (F) I B, G, H 10
blaSHV + ampC (3) SHV-12 (3) g P C1 C2 C3 M F, L 3
blaTEM + ampC (1) TEM-1 + TEM-4 h P C1 C2 C3 M F L 1
K. pneumoniae
blaTEM+blaSHV (1) TEM-1-tipo + SHV-2 (1) P C1 C2 C3 H 1
blaCTX-M (9) CTX-M-15 (2) f / CTX-M-15-tipo (7) f P C1 C2 C3 C4 M F (I) C B, G, L 9
blaCTX-M (47)/ blaCTX-M+blaDHA (1)
blaSHV(1)
CTX-M-15 (13)/ CTX-M-15-tipo (27)/
CTX-M-15-tipo + DHA-1 (1)/SHV-1 + SHV-12 (1) i P C1 C2 C3 C4 M (F) I
B, D, F, G,
H, J, L 49
blaCTX-M (2) CTX-M-15 (1) P C1 C2 C3 (F) I F 2
blaCTX-M(1)/ blaTEM+blaSHV(2) CTX-M-15 (1)/ TEM-1-tipo+SHV-11+SHV-12 (1) j/
TEM-1-tipo + SHV-1+ SHV-55 (1) l P C1 C2 C3 M (F) I B, G, N 3
Resultados
52
Tabela 11 - (Continuação)
Genótipo c (Nº de isolados) β-lactamases d (Nº isolados) Perfil de resistência aos
β-lactâmicos
Código de
Hospitais
Número de
isolados
Enterobacter spp. /C. freundii
blaCTX-M +blaTEM +blaKPC+ blaOXA (1 E. aerogenes) CTX-M-15-tipo+KPC-3-tipo m +TEM-1-tipo+OXA-1-tipo n (1) P C1 C2 C3 C4 M F I C B, H 1
blaCTX-M (1 E. aerogenes/ 1 C. freundii ) CTX-M-15-tipo (2) P C1 C2 C3 C4 M F I H 2
blaSHV+blaOXA (1 E. cloacae)/
blaTEM+blaSHV +blaOXA+ blaMIR (1 E. cloacae)
SHV-12+ OXA-1-tipo (1) /
TEM-1-tipo+OXA-1-tipo+SHV-12 + MIR-tipo o (1) P C1 C2 C3 M F I C H 2
P. mirabilis
blaCTX-M (2) CTX-M-32 (2) P C1 C2 C3 H 2
blaTEM (1) TEM-1 + TEM-2 P C1 C2 C3 F D 1
blaTEM (1) TEM-10 P C1 C2 C3 C4 M B 1
blaCTX-M (2) CTX-M-15-tipo (1)/ CTX-M-15 (1) P C1 C2 C3 C4 M F I (C) B, M 2
M. morganii
blaCTX-M (1) CTX-M-15-tipo (1) P C1 C2 C3 F I H 1
blaCTX-M (1) CTX-M-15-tipo (1) P C1 C2 C3 F I C F 1
blaCTX-M (2) CTX-M-15 (1)/ CTX-M-15-tipo (1) P C1 C2 C3 M F I C H, M 2
S. marcescens
blaCTX-M (1)/ blaTEM + blaSHV (1) CTX-M-15-tipo (1)/ TEM-1 + SHV-12 (1) P C1 C2 C3 C4 M F I B, H 2 a Isolados com sinergia entre cefotaxima e cefotaxima em combinação com ácido clavulânico ou b Isolados apenas com sinergia entre cefepima e cefepima em associação com ácido clavulânico. c Pesquisa efetuada por PCR; d Identificação obtida após sequenciação nucleotídica; e Isolados com sinergia entre cefotaxima e cefotaxima em combinação com ácido clavulânico, cujo fenótipo ESBL, uma vez justificado pela produção de CTX-M, não implicou a eventual
pesquisa de outros genes blaESBL. f Isolados com suscetibilidade diminuída aos carbapenemes, mas sem produção de carbapenemase, justificada pelo teste de sinergia negativo entre meropeneme e ácido borónico, cloxacilina e
EDTA e pela ausência de β-lactamase por focagem isoelétrica; g pI 8,2 (expressão de SHV-12) determinado em um isolado; h pI 5,4 + 5,9 (expressão de TEM-1 e TEM-4, respetivamente); i pI 7,6 e 8,2 (expressão de SHV-1 e SHV-12, respetivamente); j pI 5,4 + 7,6 + 8,2 (expressão de TEM-1, SHV-11 e SHV-12, respetivamente); l pI 5,4 + 7,6 + 8,2 (expressão de TEM-1, SHV-1 e SHV-55);
Resultados
53
m Testes fenotípicos positivos que justifiquem produção de KPC: teste de sinergia positiva entre meropeneme e ácido borónico; caracterização bioquímica por focagem isoelétrica: pI 6,7. n pI 5,4+6,7+7,4+8,9 (co-expressão de β-lactamases TEM-1, KPC-3, OXA-1-tipo e CTX-M-15, respetivamente); o pI 8,2 (Co-expressão de SHV-12 e MIR-tipo); P, penicilinas (amoxicilina, ticarcilina e piperacilina); C1, cefalosporina de primeira geração (cefalotina); C2, cefalosporina de segunda geração (cefuroxima); C3, cefalosporinas de terceira
geração (cefotaxima, ceftazidima, cefpodoxima, ceftriaxona, cefixima); C4, cefalosporina de quarta geração (cefepima); M, monobactamo (aztreonam); F, cefoxitina; I, inibidores de β-
lactamases (amoxicilina com ácido clavulânico e piperacilina com tazobactam); Presença variável de fenótipo não suscetível está indicado entre parênteses.
Tabela 12 - Genótipo de 2 isolados com suscetibilidade diminuída à cefotaxima, produtores de ESBL, mas sem evidência fenotípica de produção de ESBL: β-lactamases expressas, perfil de
resistência aos antibióticos β-lactâmicos e distribuição por hospital.
Genótipoa (Nº de isolados) β-lactamasesb Perfil de resistência aos
β-lactâmicos
Código de
Hospitais
Número de
isolados
E. cloacae
blaSHV+blaGES+blaOXA SHV-12 + GES-7 + OXA-1-tipo (1) P C1 C2 C3 C4 M F I C H 1
C. freundii
blaTEM+blaSHV+blaOXA SHV-12 + TEM-1-tipo + OXA-1-tipo (1) P C1 C2 C3 M F I H 1
aPesquisa efetuada por PCR; bIdentificação obtida após sequenciação nucleotídica.
P, penicilinas (amoxicilina, ticarcilina e piperacilina); C1, cefalosporina de primeira geração (Cefalotina); C2, cefalosporina de segunda geração (cefuroxima); C3, cefalosporinas de terceira
geração (cefotaxima, ceftazidima, cefpodoxima, ceftriaxona, cefixima); C4, cefalosporina de quarta geração (cefepima); M, monobactamo (aztreonam); F, cefoxitina; I, inibidores de β-
lactamases (amoxicilina com ácido clavulânico e piperacilina com tazobactam);
Resultados
54
O fenótipo predominante nestes isolados, sobretudo produtores de β-lactamases
CTX-M ou co-expressando predominantemente β-lactamases TEM e SHV (Tabela 11)
mostrou suscetibilidade diminuída as penicilinas, cefalosporinas de primeira, segunda,
terceira e quarta geração, aztreonam, cefoxitina (variável) e combinação
amoxicilina/ácido clavulânico e combinação piperacilina/tazobactam (variável), tendo
sido detetado, principalmente, em isolados de E. coli e K. pneumoniae. Estes isolados
tiveram como proveniência diversos hospitais em Portugal.
Foram ainda identificados dois isolados (E. cloacae e C. freundii) expressando a
ESBL da família SHV: a β-lactamase SHV-12. No entanto, E.cloacae co-expressava a
β-lactamase GES-7 (Tabela 12). Estes isolados não apresentaram fenótipo de ESBL,
nem no método de microdiluição (sinergia entre cefotaxima e ácido clavulânico), nem
no E-teste® (BioMérieux) PM/PML, mas apresentaram suscetibilidade diminuída à
maioria dos β-lactâmicos e foram isoladas no mesmo hospital (H).
Foram também identificados isolados (n=32) para os quais não se observou
qualquer evidência fenotípica ou genotípica de produção de ESBL (Tabela 13): 16
expressavam as enzimas TEM-1-tipo, SHV-36, SHV-1-tipo e/ou OXA-1-tipo, tendo
revelado resistência ao grupo das penicilinas. Nos restantes dezasseis isolados não foi
detectado nenhum gene bla pesquisado. Estes isolados (E. aerogenes, C. freundii, M.
morganii e S. marcescens) estão, essencialmente, distribuídos no hospital H. Com
exceção de cinco, a suscetibilidade diminuída às cefalosporinas de primeira e segunda
geração foi verificada em todos os isolados deste grupo, também representado na tabela
13. A determinação do pI nos isolados anteriormente referidos, permitiu identificar a
produção de MIR-tipo em dois isolados de E. cloacae, o que corresponde a uma β-
lactamase cromossómica desta espécie.
Resultados
55
Tabela 13 - Genótipo de 32 isolados com ou sem suscetibilidade diminuída à cefotaxima, sem evidência fenotípica e genotípica de produção de ESBL: β-lactamases expressas, perfil de
resistência aos antibióticos β-lactâmicos e distribuição por hospital.
Genótipoa (Nº de isolados) β-lactamasesb Perfil de resistência aos
β-lactâmicos
Código de
Hospitais
Número de
isolados
E. coli
blaTEM+ blaampC (4) TEM-1-tipo (4) P B, D, E 4
blaTEM+blaampC+blaOXA (1) TEM-1-tipo + OXA-1-tipo (1) P C1 C2 C3 F I E 1
K. pneumoniae
blaTEM+blaSHV+blaKPC (4) TEM-1+ SHV-36 + KPC-3 -tipo c d (4) P C1 C2 C3 C4 M F I C B, D 4
blaSHV (2) SHV-1-tipo (2) P C1 C2 C3 F I H 2
Enterobacter spp. C. freundii
ND (1 E. cloacae/ 2 C. freundii) – P C1 C2 C3 (M) F I H 3
ND (2 E. aerogenes + 7 E. cloacae)/ blaMIR (1 E. cloacae) MIR-tipo (1) e P C1 C2 C3 M F I C B, H 10
M. morganii
blaOXA (1)/ ND (2) OXA-1-tipo (1) P C1 C2 C3 F I D, I, M 3
ND (1) – P C1 C2 C3 F I C H 1
blaOXA (1) OXA-1-tipo (1) P C1 C2 C3 M F I C B 1
blaOXA (1) OXA-1-tipo (1) P C1 F I D 1
P. mirabilis
blaTEM TEM-1-tipo P C1 C2 F I C M 1
S. marcescens
ND – P C1 C2 C3 M F I H 1
aPesquisa efetuada por PCR; b Identificação obtida após sequenciação nucleotídica; c Testes fenotípicos que justifiquem produção de KPC: teste de sinergia positiva entre meropeneme e ácido borónico; pI 6,7. d pI 5,4+6,7+7,6 (co-expressão de β-lactamases TEM-1, KPC-3 e SHV-36, respetivamente); e pI 8,0 (expressão de MIR-tipo);
ND, mecanismo de resistência não detetado ou sobrexpressão de β-lactamases;
Resultados
56
P, penicilinas (amoxicilina, ticarcilina e piperacilina); C1, cefalosporina de primeira geração (Cefalotina); C2,
cefalosporina de segunda geração (cefuroxima); C3, cefalosporinas de terceira geração (cefotaxima, ceftazidima,
cefpodoxima, ceftriaxona, cefixima); C4, cefalosporina de quarta geração (cefepima); M, monobactamo (aztreonam);
F, cefoxitina; I, inibidores de β-lactamases (amoxicilina com ácido clavulânico e piperacilina com tazobactam);
Presença variável de fenótipo não suscetível está indicado entre parênteses.
2. 2. Carbapenemases
Do grupo de isolados selecionados (n=15) com suscetibilidade diminuída aos
carbapenemes (ertapeneme), uma vez realizado o teste de sinergia com meropeneme,
apenas cinco (4 K. pneumoniae e 1 E. aerogenes) revelaram sinergia com um dos
inibidores, nomeadamente entre o meropeneme e o ácido borónico. Estes isolados
apresentaram suscetibilidade diminuída aos carbapenemes e aos restantes antibióticos β-
lactâmicos testados e eram provenientes dos hospitais B e D. Foi identificado o gene
blaKPC, em todos os isolados, e detetado um pI de 6,7, o qual corresponde à
carbapenemase KPC-3. A identificação específica por sequênciação permitiu confirmar
a presença de blaKPC-3 e, portanto, a produção de KPC-3; a sequênciação nucleotídica
permitiu ainda estudar o ambiente genético do gene blaKPC-3 e identificar o gene istB a
montante e o tnpA a jusante. Foram ainda identificadas outros genes bla que
codificavam as β-lactamases TEM-1 e SHV-36 em K. pneumoniae e CTX-M-15, TEM-
1 e OXA-1-tipo em E. aerogenes (Tabela 14).
Tabela 14 - Isolados produtores de carbapenemase de classe A (KPC-3)
Isolados CTX CAZ FOX IMP CIP COL TGC Outras β-lactamases
TG139 K. pneumoniae >64 >64 128 128 ≤ 0,125 ≤ 0,5 1 TEM-1; SHV-36
TG142 E. aerogenes >64 64 >128 16 2 ≤ 0,5 1 TEM-1; CTX-M-15; OXA-1-tipo
TG144 K. pneumoniae >64 >64 128 128 ≤ 0,125 ≤ 0,5 1 TEM-1; SHV-36
TG146 K. pneumoniae >64 >64 >128 256 ≤ 0,125 1 0,5 TEM-1; SHV-36
TG148 K. pneumoniae >64 >64 128 128 ≤ 0,125 ≤ 0,5 1 TEM-1; SHV-36
CTX, cefotaxima; CAZ, ceftazidima; FOX, cefoxitina; IMP, imipeneme; CIP, ciprofloxacina; TGC, tigeciclina.
Globalmente, nos 211 isolados estudados, possuindo ou não genes blaCTX-M,
foram identificadas 151 β-lactamases CTX-M, entre as quais CTX-M-15(-tipo), CTX-
M-1 e CTX-M-32 do grupo 1 e ainda CTX-M-14 do grupo 9 (Tabela 15).
Resultados
57
Adicionalmente, foram identificadas, nestes isolados, outras β-lactamases,
nomeadamente, KPC-3, CMY-2, DHA-1, TEM-1 e uma OXA-1-tipo.
Nos isolados blaCTX-M negativos foram identificados outros genes bla,
codificando 23 β-lactamases da família TEM, sendo duas ESBL (TEM-4 e TEM-10) e
24 β-lactamases da família SHV, em que 9 eram penicilinases e 15 ESBL (SHV-2,
SHV-12 e SHV-55). Ainda nestes isolados foram identificados genes que codificavam
as β-lactamases KPC-3, MIR-tipo e OXA-1-tipo (Tabela 15).
Tabela 15.β-lactamases identificadas nos 211 isolados estudados, com e sem blaCTX-M.
β-lactamases em:
Genótipo: blaCTX a positivo Nº
(n=156)
Genótipo: blaCTX negativo
Nº
(n=61)
CTX-M-15 (-tipo) 137 TEM-1 (-tipo) 20
CTX-M-1 4 TEM-2 1
CTX-M-32 3 TEM-4 1
CTX-M-14 7 TEM-10 1
KPC-3 1 SHV-1 (-tipo) 4
TEM-1 1 SHV-11 1
CMY-2 1 SHV-36 4
DHA-1 1 SHV-2 1
OXA-1-tipo 1 SHV-12 13
SHV-55 1
KPC-3 4
MIR-tipo 2
OXA-1-tipo 8 a Isolados em que o fenótipo foi justificado pela presença de blaCTX-M, não tendo sido pesquisados mais
genes blaESBL .
3. β-lactamases de diferentes famílias produzidas por bactérias de Gram
negativo com ou sem suscetibilidade à tigeciclina
Ao relacionar os mecanismos de resistência aos antibióticos β-lactâmicos por
produção de β-lactamases constatou-se que, de forma geral, os isolados produtores
daquelas enzimas, principalmente ESBL, têm multirresistência aos antibióticos, quer
nos isolados com suscetibilidade diminuída à tigeciclina, quer nos suscetíveis à
tigeciclina (Fig. 12 A e B). Os isolados produtores de CTX-M apresentavam, na grande
maioria, suscetibilidade à tigeciclina e multirresistência. Cerca de 25% dos isolados
produtores de CTX-M-15(-tipo) e CTX-M-14, apresentaram suscetibilidade diminuída a
tigeciclina e fenótipo de multirresistência. Os isolados produtores de CTX-M-32 eram
maioritariamente (65%) não suscetíveis à tigeciclina.
A tigeciclina apresentou atividade in vitro importante na maioria dos isolados
com SHV, quer nos produtores de penicilinases (SHV-1-tipo, SHV-11 e SHV-36) quer
nos produtores de ESBL (SHV-2, SHV-12 e SHV-55). Relativamente aos isolados
produtores de TEM, verificou-se que, na sua maioria, eram suscetíveis à tigeciclina,
Resultados
58
contudo o isolado produtor de ESBL TEM-10 apresentou suscetibilidade diminuída a
este antibiótico. De realçar ainda que a tigeciclina apresentou atividade in vitro elevada
nos isolados produtores de KPC-3, GES-7 e de OXA. Em relação aos isolados em que
se detetou MIR-tipo, um era suscetível e outro não suscetível à tigeciclina, sendo ambos
multirresistentes.
A
B
Figura 12 - Distribuição do (A) número de isolados e (B) percentagem, de acordo com a suscetibilidade à tigeciclina,
multirresistência e produção de β-lactamases; OXA: OXA-1-tipo (n=9); ND, mecanismo de resistência não detetado
ou sobrexpressão de β-lactamases (n=16). a Isolados cuja produção de ESBL CTX-M (isoladamente ou com
coexpressão de KPC ou PMAβ) não implicou a eventual pesquisa da presença de outros genes blaESBL. TGC,
tigeciclina; S, suscetível; I/R, suscetibilidade diminuída; MDR, multirresistente.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
% d
e is
ola
do
s
TGC I/R MDR
TGC S MDR
Resultados
59
4. Contribuição da bomba de efluxo AcrAB-TolC na atividade da tigeciclina
A suscetibilidade diminuída à tigeciclina está associada às mutações nos genes
repressores ramR e marR em K. penumoniae e E. coli, respetivamente. Neste sentido,
amplificaram-se estes genes e procedeu-se à análise da sequência nucleotídica.
4.1. Análise da sequência nucleotídica do gene marR em E. coli
De forma a elucidar o mecanismo associado à suscetibilidade diminuída à
tigeciclina em E. coli, selecionaram-se os sete isolados com suscetibilidade diminuída
para amplificação do gene marR. Foi possível obter a amplificação do gene em cinco
isolados. Adicionalmente, amplificou-se o gene marR em sete isolados de E. coli
suscetíveis à tigeciclina. Todos os isolados selecionados apresentaram suscetibilidade
diminuída à ciprofloxacina (CIM >8mg/L), com exceção dos isolados TG60 e TG177.
Todas as sequências nucleotídicas do gene marR obtidas foram alinhadas e comparadas
com a sequência de referência E.coli K-12 MG1655. Das 8 mutações nucleotídicas
encontradas no gene marR dos isolados estudados, apenas 2 resultaram em substituições
aminoacídicas (Tabela 16): Gly103Ser e Tyr137His. Com exceção do isolado 60, foram
detetadas as mesmas 6 mutações silenciosas e as mesmas 2 mutações pontuais no gene
marR de todos os isolados, em comparação com a sequência de referência.
Tabela 16 - Mutações nucleotídicas no gene marR da estirpe de referência e de 12 isolados clínicos e respetivas
substituições aminoacídicas.
Enzima Nucleótido (aminoácido) Nº
48 186 189 207 276
307
(103) 360
409
(137)
marR(U00096) C G A A C G(Glu) C T(Tyr) 1
TG60 a C G A A C G C T 1
marRb T A G G T A(Ser) T C(His) 11
a Isolado suscetível à tigeciclina e à ciprofloxacina. bSequência do gene marR de onze idolados, incluindo cinco isolados com suscetibilidade diminuída à tigeciclina
(TG48, TG81, TG127, TG164, TG172) e seis suscetíveis à tigeciclina (TG2, TG5, TG9, TG31, TG56, TG60,
TG177), todas resistentes à ciprofloxacina, com exceção de uma (TG177).
4.2. Análise da sequência nucleotídica do gene ramR em K. pneumoniae
Dos 30 isolados de K. pneumoniae com suscetibilidade diminuída à tigeciclina
obteve-se amplificação do gene ramR em 20. Foi realizado o alinhamento de todas as
sequências nucleotídicas do gene ramR em comparação com a sequência de referência
Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578 (CP000647). Não foi detetada
Resultados
60
nunhuma mutação nucleotídica no gene ramR de 11 isolados (TG68, TG76, TG82,
TG149, TG169, TG193, TG194, TG201, TG202, TG205, TG208), em comparação com
a sequência de referência (Tabela 17). No gene ramR do isolado TG3 foram detetadas
duas mutações pontuais que resultaram em duas substituições aminoacídicas Ala20Thr
e Arg148His. Foram também encontradas duas mutações pontuais no gene de dois
isolados, TG42 (Lys63Thr) e TG136 (Glu78Thr) que resultaram num codão STOP
prematuro. No gene do isolado TG136, foi detetada outra substituição aminoacídica,
Ala19Val, a qual foi identificada também nos isolados TG166 e TG93. Neste último
isolado, foi ainda identificada a deleção (Fig. 13) do nucleótido G411
ao nucleótido A421
,
o que alterou o quadro de leitura a partir do aminoácido Val138
(sendo este a substituição
aminoacídica Val138Ile) até ao codão STOP. No gene ramR do isolado TG70 foi
identificada a inserção entre o nucleótido 50 e 51, o que causou alteração no quadro de
leitura da proteína (Fig. 14); este gene apresentou ainda, uma substituição aminoacídica,
Ile141Thr, também encontrada nos genes ramR dos isolados TG112 e TG155. No gene
ramR do isolado TG209 foram identificadas várias mutações silenciosas (n=18), assim
como quatro substituições aminoacídicas Thr18Ala, Glu53Lys, Thr69Met e His186Asn,
em comparação com a sequência de referência.
Figura 13 - Alinhamento das sequências do gene ramR com a sequência de referência (Klebsiella pneumoniae subsp.
pneumoniae MGH 78578 (CP000647)) do nucleótido G401 ao nucleótido G480, representando a deleção nucleotídica
do nucleótido G411 ao nucleótido A421 no isolado TG93.
Figura 14 - Alinhamento das sequências do gene ramR com a sequência de referência (Klebsiella pneumoniae subsp.
pneumoniae MGH 78578 (CP000647)) do nucleótido G1 ao nucleótido G80, representando a inserção de 2
nucleótidos entre o nucleótido 50 e 51 no isolado TG70.
Resultados
61
Tabela 17 - Mutações nucleotídicas no gene ramR da estirpe de referência MGH 78578 (CP000647) e de 20 isolados clínicos e respetivas substituições aminoacídicas encontradas.
a Codão STOP (TAG).
d, Deleção entre o nucleótido G411
e nucleótido G421
, alterando o quadro de leitura desde aí.
i, Inserção de dois nucleótidos entre o nucleótido 50 e 51, alterando o quadro de leitura da proteína
A, Adenina; C, Citosina; G, Guanina; T, Timina; Ala, Alanina; Arg, Arginina; Asn, Asparagina; Glu, Ácido Glutâmico; His, Histidina; Ile, Isoleucina; Lys, Lisina; Met,
Meteonina; Thr, Treonina; Val, Valina.
Isolado Nucleótido (aminoácido)
50 52
(18)
56
(19)
58
(20) 78 87 114 117 126
157
(53) 171 183
187
(63) 204
206
(69) 207
232
(78) 234 312 348 369 411
422
(141) 435 441
443
(148) 456 486 537
556
(186)
ramRCP00067 A(Thr) C(Ala) G(Ala) A G T G A G(Glu) G G A(Lys) C C(Thr) A G(Glu) G A C A G T(lle) G C G(Arg) C C C C(His)
TG3
A(Thr)
A(His)
TG42
Ta
TG68
TG70 i
C(Thr)
TG76
TG82
TG93
T(Val)
d
TG112
C(Thr)
TG136
T(Val)
T
a
TG149
TG155
C(Thr)
TG166
T(Val)
TG169
TG193
TG194
TG201
TG202
TG205
TG208
TG209 G(Ala)
C A G T G A(Lys) A C
G T(Met) G
A G G G
A T
T T T A(Asn)
Discussão
62
IV. Discussão
A emergência de bactérias de Gram negativo com resistência aos antibióticos
tem comprometido o tratamento de infeções causadas por estes agentes patogénicos, o
que tem constituído um importante desafio, tanto a nível clínico como da comunidade
(Rice, 2009). A resistência aos antibióticos β-lactâmicos mediada pela produção de β-
lactamases representa uma preocupação acrescida, visto que este grupo de antibióticos é
muito utilizado na prática clínica (Bush, 2013), contribuindo decisivamente para o
aparecimento de fenótipos de multirresistência. Neste contexto, a introdução de novas
classes de antibióticos tem permitido controlar a disseminação de bactérias resistentes.
A tigeciclina, uma glicilciclina, é um antibiótico recentemente desenvolvido que
constitui uma alternativa importante no tratamento de infeções causadas por bactérias
resistentes ou multirresistentes (Fraise, 2006). Esta constatação suscitou a realização
deste trabalho, uma vez que se pretendeu avaliar a atividade in vitro da tigeciclina em
bactérias de Gram negativo com resistência aos antibióticos, sobretudo em bactérias
produtoras de β-lactamases.
Assim, avaliou-se a suscetibilidade de 211 isolados de Gram negativo de forma a
compreender o fenótipo destas bactérias face a diferentes antibióticos, analisando
também a presença de multirresistência. Os resultados demonstraram que a maioria (90-
95%) dos isolados não eram suscetíveis às cefalosporinas de terceira geração (com
CIM90 entre 32 e >64mg/L para cefotaxima e ceftazidima). Os carbapenemes,
particularmente o meropeneme, constituíram a categoria de antibióticos menos afetado
nesta classe, com 3-13% de suscetibilidade diminuída. Este facto foi também verificado
em estudos realizados em Portugal (Mendonça et al., 2007; Mendonça et al., 2009),
tendo sido, nestes casos, observado que bactérias de Gram negativo resistentes às
cefalosporinas de terceira geração permaneciam, naquela data (em 1999 e de 2004 a
2006), suscetíveis aos carbapenemes, sugerindo que estes antibióticos podiam ser
utilizados como terapêutica em infeções causadas por isolados produtores de ESBL.
Desde a introdução das fluoroquinolonas, estas tornaram-se num dos grupos
mais utilizados na prescrição, a nível mundial, tendo-se verificado, no entanto, um
aumento progressivo da resistência a esta classe em bactérias de Gram negativo,
particularmente no que se refere à resistência mediada por plasmídeos, especificamente
Discussão
63
pela ação de determinantes Qnr, de bombas de efluxo proteicas, QepA e OqxAB, ou da
inativação enzimática conferida por Aac(6´)-Ib-cr (Rodríguez-Martínez et al., 2011). No
presente trabalho, identificou-se uma elevada percentagem (72-88%) de isolados com
suscetibilidade diminuída às fluoroquinolonas e uma CIM90 >8mg/L para a
ciprofloxacina, em todas as espécies bacterianas estudadas. Esta diminuição da
suscetibilidade em relação a estudos prévios em Portugal (CIM90 >2mg/L, 90% com
suscetibilidade diminuída em E. coli, e 0% a 3,8% de isolados com suscetibilidade
diminuída em K. pneumoniae) poderá dever-se à presença dos referidos mecanismos
plasmídicos (Mendonça et al., 2007; Mendonça et al., 2009).
No que diz respeito aos aminoglicosídeos, classe de antibióticos utilizada com
frequência no tratamento de bactérias de Gram negativo (Mingeot-Leclercq et al.,
1999), detetou-se suscetibilidade diminuída na maioria dos isolados (57-73%), com
exceção da amicacina para a qual foram detetados apenas 9% de isolados com
suscetibilidade diminuída. Grande parte dos isolados estudados (69%) apresentou ainda
suscetibilidade diminuída à associação trimetoprim/sulfamidas. Os isolados revelaram-
se predominatemente suscetíveis à fosfomicina e aos nitrofuranos, sendo estes
antibióticos frequentemente utilizados no tratamento de infeções urinárias (Ruxer et al.,
2006). No que se refere à colistina, os isolados apresentaram também elevados níveis de
suscetibilidade (96%), com exceção de M. morganii, P. mirabilis e S. marcescens
(CIM90 >32mg/L), bactérias naturalmente resistentes a este antibiótico (CASFM, 2013).
De facto, a colistina é um antibiótico que, atualmente, tem vindo a ser utilizado como
alternativa no tratamento de infeções causadas por bactérias de Gram negativo com
multirresistência aos antibióticos, especialmente em P. aeruginosa, A. baumannii e K.
pneumoniae (Giamarellou e Poulakou, 2009).
Globalmente, verificou-se que 89% dos isolados apresentaram multirresistência
aos antibióticos, tendo-se detetado vários perfis de multirresistência, incluindo,
principalmente, suscetibilidade diminuída aos antibióticos β-lactâmicos, às
fluoroquinolonas, aos aminoglicosídeos e à combinação trimetoprim/sulfamidas. Estes
resultados estão de acordo com aqueles apresentados no relatório anual da Rede
Europeia de Vigilância da Resistência Antimicrobiana (EARS-Net, 2011; EARS-Net,
2012) relativa a 2010 e 2011, a qual refere este perfil de resistência (antibióticos β-
lactâmicos, fluoroquinolonas e aminoglicosídeos) como um dos mais preocupantes na
Europa, para isolados de E. coli e K. pneumoniae com origem invasiva (líquido
cefalorraquidiano e sangue).
Discussão
64
Como referido anteriormente, com o aumento da resistência bacteriana aos
antibióticos e ausência de investigação na conceção de novos agentes antimicrobianos, a
tigeciclina representa uma nova alternativa terapêutica (Gupta et al., 2012; Livermore,
2011). Globalmente, este estudo demonstrou que 73% dos isolados estudados eram
susceptíveis à tigeciclina. Estes estão representados por 93% de E. coli, 90% de
Enterobacter spp./C. freundii, 57% de K. pneumoniae, 33% S.marcescens e 20% M.
morganii.
Um estudo multicêntrico Europeu referente à vigilância da ação da tigeciclina
(T.E.S.T, Tigecycline Evaluation and Surveillance Trial) em bactérias de Gram
negativo, de diferentes hospitais da Europa (2004-2009), revelou que os isolados
apresentavam suscetibilidade diminuída à maior parte dos antibióticos ensaiados, com
exceção da tigeciclina, carbapenemes e amicacina (Andrasevic e Dowzicky, 2012), cuja
tendência é semelhante à encontrada neste estudo. No entanto, analisada a
suscetibilidade da tigeciclina em função da espécie bacteriana, nos 211 isolados
estudados, evidenciaram-se níveis mais elevados de suscetibilidade nos isolados de E.
coli e Enterobacter spp./C. freundii com CIM90 de 1mg/L (valor na gama da
suscetibilidade). Globalmente, E. coli tem sido descrita como mais suscetível à
tigeciclina (CIM90 0,25 a 0,5mg/L) (Andrasevic e Dowzicky 2012; Huang et al., 2012;
Nørskov-Lauritsen et al., 2009; Sader et al., 2013; Zhang et al., 2004), em relação ao
valor de CIM90 1mg/L obtido neste estudo. De facto, tem sido descrita uma baixa
frequência de suscetibilidade diminuída à tigeciclina em isolados de E. coli na Europa
(Grandesso et al., 2010; Sader et al., 2013), representando apenas 7% do total de
isolados neste estudo (CIM90 2mg/L). Estes isolados suscetíveis à tigeciclina
mostraram-se ainda suscetíveis ao imipeneme e não suscetíveis às fluoroquinolonas e
cefalosporinas de terceira geração, como observado por outros autores (Nørskov-
Lauritsen et al 2009; Zhang et al., 2004).
Ainda no grupo dos isolados suscetíveis à tigeciclina, mas das espécies de
Enterobacter spp./C. freundii verificou-se que 90% eram suscetíveis áquele antibiótico
e as suas CIMs variavam entre ≥0,25 e 8mg/L, tendo-se constatado valores semelhantes
no estudo T.E.S.T com isolados obtidos no período de 2004-2007 (Nørskov-Lauritsen et
al 2009). Verificou-se ainda baixa frequência de suscetibilidade diminuída ao
imipeneme com CIM90 0,5mg/L, o que corrobora os resultados obtidos naquele estudo
Europeu (Andrasevic e Dowzicky, 2012). Considerando a totalidade dos isolados de
Enterobacter spp. foram detetados apenas dois isolados com suscetibilidade diminuída à
Discussão
65
tigeciclina, também exibindo uma baixa frequência na Europa, nomeadamente no Reino
Unido (Andrasevic e Dowzicky, 2012; Woodford et al., 2007).
Na presente investigação foi observada CIM90 4mg/L para a tigeciclina no total
de K. pneumoniae, sendo esta uma diluição superior às CIM90 descritas em estudos
recentemente realizados (Andrasevic e Dowzicky, 2012; Huang et al., 2012; Nørskov-
Lauritsen et al 2009). É de realçar que as CIMs para a tigeciclina em K. pneumoniae
foram superiores aos valores observados para as espécies acima referidas, tal como
descrito por Souli et al. (2006). De facto, nos últimos anos verificou-se um aumento da
ocorrência de isolados de K. pneumoniae com suscetibilidade diminuída à tigeciclina
(Woodford et al., 2007; Vázquez et al., 2008). De forma similar, neste estudo, 43% dos
isolados apresentaram suscetibilidade diminuída com CIM90 8mg/L. Adicionalmente, a
frequência dos isolados de K. pneumoniae com suscetibilidade diminuída às
cefalosporinas de terceira geração e às fluoroquinolonas foi baixa (97% a 100%) em
isolados suscetíveis, tal como descrito por Andrasevic e Dowzicky (2012) e Nørskov-
Lauritsen et al. (2009). No que se refere ao imipeneme constatou-se uma elevada
suscetibilidade, com resultados similares aos estudos acima referidos (CIM90 0,5mg/L).
Relativamente aos isolados de S. marcescens com suscetibilidade diminuída às
cefalosporinas de terceira geração (CIM90 >64mg/L) apenas 33% do total apresentou
suscetibilidade à tigeciclina, com CIM90 de 2mg/L, como reportado por Kresken et al.,
(2011) na Alemanha. No que diz respeito a M. morganii, tem sido demonstrado que
estes isolados não são geralmente suscetíveis à tigeciclina, com valores de CIM 1-
8mg/L (Stein e Craig, 2006; Zhang et al., 2004). Neste estudo, os valores de CIM
variaram entre 1 e 16mg/L, com CIM90 8mg/L. Por último, a tigeciclina não se mostrou
ativa em isolados de P. mirabilis, com CIM90 8mg/L, uma vez que terá, de acordo com
alguns autores (Visalli et al., 2003), suscetibilidade diminuída intrínseca a este
antibiótico, havendo ainda estudo prévios nos Estados Unidos da América e na China
que corroboram estes resultados (Gales e Jones, 2000; Zhang et al., 2004).
Pelo exposto, pode afirmar-se que os isolados de Gram negativo em estudo com
resistência aos antibióticos são, maioritariamente, suscetíveis à tigeciclina. Contudo, a
vigilância da suscetibilidade deste antibiótico em Portugal é da maior relevância,
especificamente em K. pneumoniae, uma vez que esta espécie apresenta os níveis de
resistência mais elevados a este antibiótico, sendo ainda uma importante causa de
infeções nosocomiais (Hentschke et al., 2010). Esta monitorização é também importante
Discussão
66
no caso dos isolados de E. coli, uma vez que ainda é o principal agente de infeções
urinárias, intra-abdominais e da pele a nível mundial (Linkevicius et al., 2013).
A incidência da suscetibilidade diminuída à tigeciclina, por grupo etário,
permitiu verificar que a sua maior frequência ocorria em doentes com idade ≥65 anos.
Tal pode resultar de a idade potenciar o risco e a suscetibilidade às infeções, uma vez
que os doentes deste grupo etário estão mais vulneráveis e estão mais sujeitos a
hospitalizações, pois, na realidade, 54% das infecções hospitalares surgem em doentes
com mais de 65 anos (Swartz, 1994).
O presente trabalho teve ainda como objectivo analisar a suscetibilidade
diminuída à tigeciclina em relação à suscetibilidade a outros antibióticos. Assim, uma
percentagem elevada (70%) dos isolados de Gram negativo com multirresistência eram
suscetíveis à tigeciclina, principalmente isolados de E. coli, K. pneumoniae e
Enterobacter spp./C. freundii, como anteriormente descrito na Índia e na Grécia (Gupta
et al., 2012; Souli et al., 2006). Os 30% de isolados com multirresistência e
suscetibilidade diminuída à tigeciclina eram, sobretudo, das espécies K. pneumoniae, P.
mirabilis, M. morganii e S. marcescens. Ainda neste âmbito, um estudo realizado na
Grécia reportou 7,9% de suscetibilidade diminuída num total de 152 isolados de
Enterobacteriaceae com multirresistência (Falagas et al., 2010). O amplo espetro de
atividade da tigeciclina tem levado a várias investigações clínicas, de forma a que possa
ser utilizada no tratamento de infeções nosocomiais ou adquiridas na comunidade (Stein
e Babinchak 2013).
Considerando as implicações clínicas da resistência aos antibióticos β-
lactâmicos e a sua contribuição em fenótipos de multirresistência, foram também
investigados os mecanismos associados a essa resistência, nomeadamente a produção de
β-lactamases.
A prevalência de isolados produtores de β-lactamases tem vindo a aumentar e
está presente em vários países Europeus. A suscetibilidade diminuída às cefalosporinas
de terceira geração resulta, muitas vezes, da produção de ESBL da família CTX-M,
entre os isolados de E. coli e K. pneumoniae, nomeadamente na Europa (Cantón et al.,
2008). Também nesta investigação, foram detetados 161 genes blaCTX-M em isolados
com suscetiblidade diminuída às cefalosporinas de terceira geração e com sinergia ao
ácido clavulânico, essencialmente em E. coli e K. pneumoniae, a maioria identificados
como blaCTX-M-15 e bla CTX-M-15-tipo. Esta evidência mostra a persistência de isolados com
este mecanismo de resistência em Portugal, pois previamente tinha sido observada uma
Discussão
67
maior frequência daqueles genes nestas espécies, expressando, portanto, um fenótipo
ESBL associado à produção de CTX-M-15 (Machado et al., 2007; Mendonça et al.,
2007; Mendonça et al., 2009). Foram ainda detetadas outras enzimas CTX-M do grupo
1, tais como CTX-M-1 e CTX-M-32, sendo esta última detetada em P. mirabilis, para
além de E. coli. Quanto às enzimas CTX-M do grupo 9, nomeadamente CTX-M-14,
foram identificadas em isolados de E. coli. Esta enzima CTX-M-14 já foi igualmente
descrita em E.coli nos estudos de Mendonça et al. (2007) e Manageiro et al. (2012a),
também aqui demonstrando a sua permanência em Portugal, nomeadamente em meio
hospitalar.
Os isolados produtores de ESBL CTX-M apresentaram, maioritariamente,
fenótipo de suscetibilidade diminuída às cefalosporinas de terceira geração e ao
aztreonam. A prevalência da β-lactamase CTX-M adquiriu proporções endémicas em
muitos países, tendo sido encontrada em muitos dos isolados estudados neste estudo
(76%). Deste modo, e tal como já sublinhado por Bonnet (2004), deve ser dada atenção
ao aumento da prevalência de β-lactamases CTX-M, pois pode estar associado à
disseminação de genes blaCTX-M mediada por plasmídeos ou outros elementos genéticos
móveis, bem como à disseminação de clones específicos (nomeadamente, epidémicos
e/ou locais) (Livermore et al., 2007).
Na família SHV as enzimas ESBL são, frequentemente, encontradas em isolados
de K. pneumoniae. Contudo, têm sido também evidenciadas em E. coli, Enterobacter
spp., C. freundii, S. marcescens e M. morganii (Choi et al., 2007; Voets et al., 2012),
sendo a enzima SHV-12 a mais prevalente nesta família e identificada, neste estudo, em
E. coli, E. aerogenes, E. cloacae, C. freundii e S. marcescens, para além de K.
pneumoniae. A enzima SHV-55 foi observada pela primeira vez em Portugal em K.
pneumoniae por Mendonça et al., (2006), tendo também sido identificada neste estudo
num isolado de K. pneumoniae. Foi ainda encontrada a ESBL SHV-2 em K.
pneumoniae, a qual foi também reportada previamente em estudos portugueses
(Machado et al., 2007; Mendonça et al., 2009).
Da família TEM, foram detetadas duas ESBL, TEM-10 num isolado de P.
mirabilis e TEM-4 num isolado de E. coli. A enzima TEM-10 já foi encontrada em P.
mirabilis noutros países, como França, Estados Unidos, África do Sul (Bonnet et al.,
1999), não tendo sido reportada nesta espécie, em Portugal, a nosso conhecimento.
Outras enzimas não ESBL foram detetadas neste estudo, como as penicilinases
TEM-1 e TEM-1-tipo, SHV-1 e SHV-1-tipo, SHV-11 e SHV-36 em isolados com
Discussão
68
suscetibilidade diminuída às penicilinas, isoladamente ou em coprodução com outras β-
lactamases. Foram identificadas as enzimas TEM-1 e TEM-2 num isolado com fenótipo
de ESBL, o que sugere a sobre-expressão destas enzimas parentais (TEM-1 e/ou TEM-
2) e/ou a produção de uma β-lactamase de uma família não pesquisada que justifique o
fenótipo de ESBL; este fenótipo ESBL poderá ainda sugerir a expressão de enzimas
parentais em associação com perda de porinas (Wu et al., 2001).
Entre os isolados produtores de SHV-12 foi ainda identificado um isolado de E.
cloacae que co-expressava a ESBL GES-7, a qual, originalmente, foi identificada num
isolado clínico de E. cloacae, na Grécia (Kartali et al., 2002). Desde então, já foi
também descrita noutras espécies e países, como por exemplo, em K. pneumoniae no
Brasil e em Portugal (Dropa et al., 2010; Manageiro et al., 2012b), sendo esta, no
entanto, a primeira descrição de GES-7 em E. cloacae, em Portugal.
As carbapenemases KPC encontram-se disseminadas em vários hospitais e áreas
no mundo, sendo predominantemente encontradas em K. pneumoniae (Endimiani et al.,
2009; Patel e Bonomo, 2013). Foram identificados, neste estudo, cinco enzimas KPC-3,
em quatro isolados de K. pneumoniae e num isolado de E. aerogenes. Dos cinco
isolados, verificou-se menor CIM (16mg/L) ao imipeneme em E. aerogenes. Bratu et al.
(2005) reportaram valores similares em E. aerogenes produtor de KPC-3, no entanto,
têm sido descritos valores superiores em K. pneumoniae (Endimiani et al.,2009), tal
como observado neste estudo (CIM imipeneme 128 e 256mg/L). Valores de CIM
elevados para o imipeneme, em K. pneumoniae, podem dever-se ao aumento da
expressão da β-lactamase KPC em associação com a perda de OMPs (p.e. OmpK-35) na
membrana externa dos isolados de K. pneumoniae, como reportado por Endimiani et al.
(2009). A distribuição de carbapenemases KPC em várias espécies e regiões tem sido
associada à disseminação dos genes que codificam estas enzimas por plasmídeos (Patel
e Bonomo, 2013). Posteriormente, seria interessante efetuar a conjugação destas estirpes
de forma a determinar se o seu suporte genético é plasmídico e, no caso de serem
obtidos transconjugantes, qual o tipo de plasmídeo.
Num grupo de dez isolados produtores de ESBL CTX-M, com suscetibilidade
diminuída ao ertapeneme não foi observada qualquer evidência da produção de
carbapenemases pelos testes efetuados. A diminuição da suscetibilidade aos
carbapenemes em Enterobacteriaceae pode estar associada à produção de ESBL
combinada com a diminuição de permeabilidade. Tal acontece devido à alteração ou
Discussão
69
regulação de porinas, alteração das PBPs, ou ainda por ação de bombas de efluxo (Patel
e Bonomo, 2013).
Os genes AmpC mediados por plasmídeos têm sido identificados a nível
mundial, em isolados nosocomiais e adquiridos na comunidade, sendo facilmente
detetados em Enterobacteriaceae. As β-lactamases CMY-2 são as mais prevalentes e
amplamente disseminadas (Jacoby, 2009). O gene blaDHA-1 e o gene blaCMY-2 foram
recentemente encontrados, em Portugal, nos isolados clínicos de K. pneumoniae e E.
coli respetivamente (Manageiro et al., 2012a). Neste estudo, foram também
identificadas as enzimas, DHA-1 e CMY-2, nas mesmas espécies. Em ambas havia co-
produção da enzima CTX-M. Adicionalmente, num grupo de isolados de E. coli e K.
pneumoniae com suscetibilidade diminuída à cefoxitina não foram detetados genes que
codificassem β-lactamases AmpC mediadas por plasmídeos, atribuindo-se este fenótipo
à possível perda de porinas. A enzima AmpC MIR-1 é cromossómica em isolados de E.
cloacae (Jacoby, 2009). A focagem isoelétrica revelou pI 8 e 8,2, respetivamente, em
dois isolados de E. cloacae estudados, que correspondiam à enzima MIR-1 identificada.
Estes isolados exibiram suscetibilidade diminuída a todas as cefaloprinas de espetro
alargado, com exceção do cefepima. Já Conceição et al., (2004), que reportou os
primeiros isolados de E. cloacae produtores de MIR-1, em Portugal, identificou um
fenótipo semelhante. Num dos isolados produtor de MIR-tipo, detetou-se coexpressão
com a enzima SHV-12, tal como foi também observado num estudo realizado na Coreia
do Sul (Lee et al., 2003).
No que diz respeito à suscetibilidade à tigeciclina em isolados produtores de β-
lactamases os dados reportados pelo estudo T.E.S.T (Nørskov-Lauritsen et al., 2009)
revelaram que a tigeciclina foi um dos antibióticos com maior atividade in vitro em
isolados de E. coli e K. pneumoniae produtores de ESBL. Sader et al. (2013)
verificaram resultados semelhantes. No presente estudo, a maioria dos isolados
produtores de CTX-M apresentavam multirresistência aos antibióticos, tal como em
isolados do período 2004-2006, recolhidos em Portugal (Mendonça et al., 2007).
Verificou-se a suscetibilidade da tigeciclina em grande parte dos isolados produtores de
CTX-M-15(-tipo), CTX-M-1 e CTX-M-14. Em relação, aos isolados produtores de
CTX-M-32 a maioria não eram suscetíveis à tigeciclina, tal como o isolado produtor de
TEM-10. Isto resulta do facto de 67% das enzimas CTX-M-32 detetadas serem
produzidas por P. mirabilis, bem como TEM-10, pois esta espécie bacteriana tem
suscetibilidade diminuída intrínseca à tigeciclina (Visalli et al., 2003). De um modo
Discussão
70
geral, os isolados produtores de penicilinases e ESBL SHV, bem como de penicilinases
TEM, mostraram-se suscetíveis à tigeciclina.
Os isolados produtores de carbapenemases constituem uma preocupação, pois
possuem resistência a praticamente todos os antibióticos β-lactâmicos, tendo,
frequentemente, multirresistência aos antibióticos (Patel e Bonomo, 2013). Contudo, a
utilização da tigeciclina recebeu destaque, recentemente, por ter sido uma das únicas
alternativas (além da colistina) no tratamento de infeções causadas por um isolado de E.
coli produtor de NDM-1 (Kumarasamy et al., 2010). É de salientar a suscetibilidade da
tigeciclina nos isolados produtores de KPC-3, neste estudo, com CIM50 e CIM90 de
1mg/L (gama de suscetibilidade), o que está de acordo com os estudos realizados
anteriormente por Castanheira et al. (2008) e Sader et al. (2013).
Nos 16 isolados sem evidência fenotípica e genotípica da produção de ESBL, a
resistência às cefalosporinas de terceira geração poderá dever-se a uma sobre-expressão
de penicilinases e/ou β-lactamases cromossómicas, bem como, eventual produção de β-
lactamases não pesquisadas.
Os resultados do presente estudo sugerem que a tigeciclina poderá representar
uma alternativa em casos de infeções causadas por isolados produtores de ESBL,
principalmente CTX-M, e ainda nos casos de isolados com resistência aos
carbapenemes e produtores de KPC.
Alterações nucleotídicas nos repressores marR e ramR têm sido identificadas
como uma via de aquisição de suscetiblidade diminuída à tigeciclina, em E. coli e K.
pneumoniae, respetivamente, levando à sobre-expressão da bomba de efluxo AcrAB
(Hentschke et al., 2010; Keeney et al., 2008). Neste sentido, e considerando a
importância da tigeciclina no tratamento de infeções por bactérias multirresistentes,
estudaram-se as sequências nucleotídicas daqueles genes, de forma a compreender os
mecanismos associados à resistência observada.
No que se refere ao gene marR, embora os isolados de E. coli estudados tenham
apresentado variações ao nível da sua suscetibilidade à tigeciclina, todos os isolados à
exceção de um (TG60), apresentaram alterações nucleotídicas responsáveis pelas
substituições aminoacídicas G103S e Y137H na proteína MarR. O isolado TG60,
suscetível quer à tigeciclina quer à ciprofloxina, apresentou uma sequência wild-type.
Discussão
71
De acordo com um trabalho realizado por Kim et al. (2004), que incidiu no
estudo de mutações no gene marR, foram também deduzidas as substituições
aminoacídicas G103S e Y137H e realçada a sua associação com o aumento da
resistência à ciprofloxacina. De facto, no presente estudo, os isolados com estas
substituições aminoacídicas revelaram CIM >8mg/L à ciprofloxacina, com exceção de
uma (TG177), a qual era apenas resistente à norfloxacina. A bomba de efluxo AcrAB
funciona como um mecanismo de defesa em E. coli, cuja expressão pode resultar da
indução por antibióticos ou ainda por mutações no gene marR, conferindo resistência às
fluoroquinolonas (Goldman et al., 1996). Embora as mutações encontradas, no presente
estudo, possam estar associadas à resistência às fluoroquinolonas, a resistência à
tigeciclina pode resultar de uma via dependente do operão marAB, tal como a
hiperexpressão do ativador transcricional MarA (Keeney et al., 2008). Desta forma, são
necessários mais estudos para analisar a expressão do operão marAB, ou mesmo da
bomba de efluxo AcrAB. No entanto, sugere-se que, conferindo, esta bomba de efluxo,
resistência a múltiplos antibióticos (Piddock, 2006), a expressão deste operão poderá ser
mais elevada nos isolados com suscetibilidade diminuída à tigeciclina, do que nos
isolados suscetíveis, independentemente de alterações no gene marR. Por outro lado, a
proteína MarA, ativador do operão marAB, induz a expressão de mais de sessenta genes
responsáveis pelo fenótipo de mar, tal como respostas ao stress e também resistência a
múltiplos antibióticos, incluindo o sistema de efluxo AcrAB-TolC (Alekshun e Levy,
1997; Barbosa e Levy, 2000b), o que sugere outras vias de aquisição de resistência.
As proteínas SoxS e Rob representam também reguladores transcricionais da
bomba de efluxo AcrAB, e o aumento da expressão dessas proteínas em E.coli, via
operão marAB, está também associado à expressão daquela bomba (Alekshun e Levy,
1997). A bomba de efluxo AcrAB é ainda regulada pelo repressor local AcrR, pelo que
mutações neste repressor estão implicadas na resitência à tigeciclina (Linkevicius et al.,
2013). Deste modo, poderão existir diferentes vias de aquisição de suscetibilidade
diminuída à tigeciclina em E. coli, por outro mecanismo de resistência, ou outra bomba
de efluxo.
Relativamente aos isolados de K. pneumoniae, foram analisadas as sequências
nucleotídicas do gene ramR em 20 dos trinta isolados com suscetibilidade diminuída à
tigeciclina, tendo-se identificado uma deleção, uma inserção e diversas mutações
silenciosas e pontuais. Em dois isolados foram identificados codões STOP prematuros
Discussão
72
nas posições Lys63 e Glu78, resultando na proteína RamR truncada e não funcional. De
facto, Hentschke et al. (2010) demonstraram a inserção de um codão STOP prematuro
(Lys14) que resultou na alteração da funcionalidade da proteína RamR, alterando a via
de regulação de AcrAB em K. pneumoniae, o que estava na origem da resistência à
tigeciclina, ciprofloxacina e cloranfenicol. No presente estudo foi também identificada
uma deleção do nucleótido G411 ao nucleótido A421 e uma inserção de dois
nucleótidos GC entre os nucleótidos 50 e 51 do gene ramR nos isolados TG93 e TG70,
respetivamente, causando uma alteração na grelha de leitura destas proteínas, o que
sugere a sua total perda de função. Já Veleba et al. (2013), relacionou alterações na
grelha de leitura do gene ramR com a interferência na estrutura funcional da proteína,
estando, dessa forma, relacionado com o aumento da expressão do ramA e da bomba de
efluxo AcrAB.
Foram ainda identificadas 8 substituições aminoacídicas em RamR, em
diferentes isolados, nomeadamente Thr18Ala, Ala19Val, Ala20Thr, Glu53Lys,
Thr69Met, Ile141Thr Arg148His e His186Asn, estando três, Thr18Ala, Ala19Val e
Ala20Thr (detetadas nos isolados TG3, TG93, TG136, TG166 e TG209) localizadas no
sítio de ligação ao DNA. Assim, susbtituições aminoacídicas nestas posições podem
induzir modificações estruturais no sítio de ligação ao DNA deste repressor
transcripcional, resultando na diminuição da afinidade (Yamasaki et al., 2013). As
substituições Ala19Val, Ile141Thr e His186Asn já foram descritas em isolados de K.
pneumoniae resistentes à tigeciclina (Rosenblum et al., 2011), enquanto que, a nosso
conhecimento, as restantes substituições aminoacídicas foram descritas neste estudo
pela primeira vez.
Estes dados sugerem que as alterações no gene ramR, identificadas no presente
estudo, podem estar associadas à suscetibilidade diminuída à tigeciclina. Seria ainda
interessante estudar, posteriormente, a expressão da proteína RamA, o regulador
transcricional da bomba de efluxo AcrAB, ou mesmo a expressão da bomba de efluxo
nos isolados em que se detetaram tais mutações.
No entanto, em onze isolados não se detetou qualquer mutação na sequência
nucleotídica do gene ramR. Num estudo de Roy et al., (2013), apesar dos isolados
apresentarem suscetiblidade diminuída à tigeciclina, como no presente estudo, não
foram, igualmente, identificadas quaisquer alterações neste gene. Num outro estudo
realizado com K. pneumoniae, foi verificada a sobre-expressão da proteína RamA na
Discussão
73
ausência de alterações no gene ramR (Rosenblum et al., 2011), pelo que seria
interessante, complementar este estudo, posteriormente, estudando a expressão de
RamA nos isolados que não se detetou qualquer alteração. A resistência à tigeciclina
poderá ainda dever-se à presença de mutações no ativador trancricional do gene ramA
ou no repressor da bomba de efluxo AcrAB, AcrR (Rosenblum et al., 2011; Schneiders
et al., 2003).
De realçar que, recentemente, foi identificada uma nova proteína da família
AraC, designada de RarA, que controla as bombas de efluxo AcrAB e OqxAB e confere
fenótipo de multirresistência em K. pneumoniae (Veleba et al., 2012). Este regulador,
RarA, está também implicado na resistência à tigeciclina em isolados de K. pneumoniae
(Veleba e Schneiders, 2012). Portanto, a proteína RarA, ou mesmo a bomba de efluxo
OqxAB, podem constituir uma via alternativa de resistência à tigeciclina nos isolados
em que não se detetaram quaisquer alterações no gene ramR. Adicionalmente, é
provável que existam outros sistemas de efluxo a condiconar a suscetiblidade à
tigeciclina, em E. coli e K. pneumoniae, para além do AcrAB-TolC, uma vez que a
expressão dos genes reguladores (marA, soxS e ramA) pode influenciar outros sistemas,
tais como alteração da expressão de porinas ou outros sistemas de efluxo (Bratu et al.,
2009).
Globalmente, este estudo demonstra que a tigeciclina representa ainda uma
alternativa terapêutica viável no tratamento de infeções causadas por bactérias de Gram
negativo multirresistentes, particularmente as produtoras de ESBL. Porém, a
suscetíbilidade diminuída apresentada por 43% dos isolados de K. pneumoniae realça a
importância da monitorização da atividade da tigeciclina in vitro, uma vez que as
opções de tratamento são limitadas nas infeções causadas por esta espécie bacteriana,
quando resistentes, multirresistentes e/ou produtoras de β-lactamases. A investigação de
outros mecanismos de resistência à tigeciclina, como a produção da proteína TetX, seria
também uma mais valia, bem como o estudo de outros intervenientes na via de
regulação da bomba de efluxo AcrAB, tais como Rob, SoxS, RamA, e RarA. É de
salientar que, apesar de neste trabalho terem sido estudados alguns mecanismos de
resistência à tigeciclina e a outros antibióticos de elevada importância clínica, muitos
outros ficaram por estudar dada a vastidão do tema.
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Anexos
a
![Aula 06 Bactérias...outra e se agregam para formar corpos de frutificação de até 500 micrômetros de comprimento e contendo aproximadamente 100 000 células bacterianas.[56] Nesses](https://static.fdocument.org/doc/165x107/607c951f7c9836513576c59b/aula-06-bactrias-outra-e-se-agregam-para-formar-corpos-de-frutificao-de.jpg)
