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CHRISTIAN GOMES DA SILVA RAMOS β β LISBOA 2002

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CHRISTIAN GOMES DA SILVA RAMOS

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LISBOA

2002

II

INSTITUTO NACIONAL DE SAÚDE Dr. RICARDO JORGE

CENTRO DE BACTERIOLOGIA

UNIDADE DE RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS

Estudo dos Padrões de Resistência aos ββββ-Lactâmicos e Inibidores de

ββββ-Lactamasesem Estirpes de Escherichia coli Uropatogenicas Isoladas

em Animais

Por

CHRISTIAN GOMES DA SILVA RAMOS

Relatorio de Estágio realizado no âmbito do

Programa de estágios profissionais financiados

pelo Prodep III, medida 3, acção 2

Orientador: Doutora Maria Manuela Marin Caniça (INSA)

Coordenador: Doutora Lígia Oliveira Martins (ULHT; ITQB, UNL)

III

AGRADECIMENTOS

Manifesto o meu reconhecimento à Doutora Maria Manuela Marin Caniça pelo seu

rigor ciêntifíco e sentido crítico e pelo seu empenho em criar as condições necessárias à

realização deste trabalho.

À Doutora Maria Constânça Pomba Palma Féria pela sua orientação ciêntifica e

inestimável apoio e estímulo, e preciosa ajuda na intrepertação das MIC’s.

À Doutora Lígia Oliveira Martins pelas inúmeras horas dispendidas nas revisão do

manuscrito, assim como por todo o incentivo e disponibilidade demonstrados.

À Drª. Marta Teresa Costa pela identificação das estirpes de E. coli, preciosa ajuda na

realização e intrepertação das MIC’s.

À Engª. Mónica Ferreira pela orientação concedida no âmbito da detecção de ESBL’s.

Ao Prof. José Gonçalves e Prof. José Duarte Correia, assim como toda a equipe do

Departamento de Patologia Clínica da Faculdade de Medicina Veterinária da

Universidade Técnica de Lisboa, os meus agradecimentos pela oportunidade, interesse e

amizade que me proporcionaram.

À Doutora Eugénia Ferreira, Doutora Paula Lavado, Engº. Ricardo Dias e D. Deolinda

Louro, da Unidade de Resistência aos Antibióticos, C.B., INSA, agradeço a convivência

amigável e o bom ambiente de trabalho.

Um muito obrigado também para todos os que, durante a realização deste trabalho, me

privilegiaram com a sua amizade.

IV

ÍNDICE

Página 1 Objectivos 1 2 Introdução 2 2.1 Escherichia coli 2 2.2 Estirpes patogénicas de E. coli 3 2.3 Potenciais Fontes de Estirpes Patogénicas 4 3 O uso da Antibioterapia em infecções causadas por E. coli 4 4 As β-Lactaminas 4 4.1 Modos de acção das β-Lactaminas 4 5 Principios da Resistência aos Antibióticos 7 5.1 A Epidemiologia da Resistência Antimicrobiana 7 5.2 Factores associados ao aumento da resistência aos antibióticos 7 5.3 Mecanismos moleculares de resistência aos antibióticos 8 5.4 Transferência genética da resistência aos antibióticos 10 5.5 Mecanismos bioquímicos de resistência aos antibióticos 11 6 Resistência às β-Lactaminas 12 6.1 β-Lactamases do tipo TEM e SHV 14 6.2 β-Lactamases de Espectro Estendido (ESBL) 16 6.3 Cefalosporinases 17 6.4 Oxacilinases 17 6.5 Resistência não enzimática 18 7 Métodos de detecção de β-Lactamases 18 8 Material e Métodos 19 8.1 Estirpes Bacterianas 19 8.2 Determinação da susceptibilidade às β-Lactaminas 20 8.3 Pesquisa de ESBL 20 9 Resultados 20 10 Discussão 25 11 Conclusão 28 12 Referências Bibliográficas 30

ÍNDICE DE TABELAS

Página Tabela 1 Padrões de susceptibilidade 21 Tabela 2 Actividades in vitro 22 Tabela 3 Percentagem de inibição 23 Tabela 4 Valores de MIC’s 24 Tabela 5 Teste sinergia 25

V

ÍNDICE DE QUADROS

Página Quadro 1 Classificação de β-lactamases 13 Quadro 2 Substituições de aminoácidos nas IRT 15

ÍNDICE DE FIGURAS

Página Fig. 1 Estrutura das Penicilinas e Cefalosporinas 5 Fig. 2 Parede celular bacteriana 6 Fig. 3 Interacção das β-Lactaminas com as bactérias 6 Gráfico 1 Padrões de resistência 26

VI

Sumário

O Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge é um Laboratório do Estado que se

encontra sob a tutela do Ministério da Saúde.

Neste Laboratório efectuam-se diversos tipos de análises e realizam-se actividades de

investigação científica relacionadas com a Saúde Humana.

No Centro de Bacteriologia, um dos sete centros deste Instituto, situa-se a Unidade de

Resistência aos Antibióticos que se dedica, em exclusivo, à investigação científica.

A sua actividade caracteriza-se, essencialmente, pela realização de estudos sobre os

mecanismos de resistência aos antibióticos e epidemiologia de estirpes clínicas de

diversas espécies bacterianas importantes para a saúde pública.

A equipe deste laboratório é constituida por três investigadores doutorados, um técnico

e dois licenciados.

VII

RESUMO

Introdução: O aparecimento de resistência aos antibióticos mais comuns tem-se revelado um problema crescente a nível mundial. Estirpes de E. Coli uropatogenicas têm demonstrado uma evolução no aumento da resistência, ao longo dos últimos anos. O âmbito deste estudo recaiu na determinação dos perfis de resistência às β-lactaminas em estirpes de E. coli uropatogenicas, isoladas em animais, maioritariamente, cães. Alguns estudos referem que estas estirpes apresentam potencial zoonótico, sendo indistinguiveis das estirpes de origem Humana. Métodos: Estudaram-se 45 estirpes de E.coli, quanto a sua susceptibilidade à amoxicilina-AML, Co-amoxiclave-AMC, ticarcilina-TIC, meciliname-MEC, cefoxitima-FOX, cefixima-CFM, cefuroxima-CXM, cefotaxima-CTX, ceftazidima-CAZ, ceftriaxona-CRO e aztreoname-ATM, através da determinação da Concentração Inibitória Mínima (MIC) pelo método da microdiluição. A pesquisa de ESBL foi realizada através do teste de sinergia pelo método de microdiluição usando CAZ/clavulatanato, CRO/clavulanato e CTX/clavulanato. Resultados: 57.8% das estirpes foram resistêntes à AML, mas apenas 28.6% eram resistentes à AMC. Determinou-se que, 53.3% e 24.4% das estirpes eram resistentes à TIC e MEC, respectivamente. A CRO, CTX e CAZ apresentaram um padrão de inibição semelhante, com 2.2%, 2.2% e 4.5% dos isolados apresentaram resistência para a ceftriaxona, cefotaxima e ceftazidima, respectivamente. Os níveis de resistência para a CXM, CFM e FOX foram de 4.4%, 9.1% e 8.9%, respectivamente. Neste estudo verificou-se um aumento da resistência às β-lactaminas, onde, pela sua elevada resistência, aprofundou-se um pouco mais o estudo sobre uma estirpe (1953), a qual apresentava resistência a todos os antibióticos testados. Conclusão: Assim, como mecanismos de resistência mais prováveis, pensa-se que a estirpe 1953 seja produtora de uma β-lactamase TEM-1 (resistência à amoxicilina, ticarcilina e amoxicilina potenciada com ácido clavulânico), uma β-lactamase AmpC (resistência à cefoxitima, cefixima, ceftazidima, cefuroxima, ceftriaxona e aztreoname) e uma β-lactamase OXA-3 ou alterações nas PBP-2, mecanismos igualmente prováveis (resistência ao meciliname). Embora estes mecanismos pareçam bastente prováveis, é necessário recorrer a técnicas como a focagem isoelectrica, PCR-RFLP e PFGE para obter a confirmação, uma vez que também existe a probabilidade de se tratar de uma ou várias novas enzimas, ou mutações desconhecidas. Este trabalho mostra os efeitos da pressão selectiva imposta pelos antibióticos usados em animais, os quais têm contribuido para um aumento das resistências.

1

1. OBJECTIVOS

O trabalho que serviu de base à realização deste relatório teve por objectivo contribuir

para uma melhor compreensão dos padrões de resistências aos antibióticos β-

Lactâmicos por parte de estirpes de Escherichia coli uropatogénicas isoladas de

infecções em Cães, Gatos, Porcos e Cavalos.

Este trabalho pertende ilucidar alguns dos mecanismos de resistência mais comuns, de

modo a permitir uma maior eficiência terapêutica, assim como demonstrar algumas

tendências na aquisição de novos mecânismos de resistência.

Pertende-se ainda, realçar a importância da vigilância da resistência aos antibióticos em

estirpes de origem veterinária, uma vez que existem evidências fortes que sugerem o

potencial zoonótico de inúmeras espécies bacterianas, incluindo a Escherichia coli.

2

2. INTRODUÇÃO

A expressão fenotípica da resistência exibida por algumas estirpes de

Enterobactereaceae é por vezes difícil de detectar pelos métodos de rotina existentes

nos Laboratórios clínicos. Fenotipos pouco vulgares ou díficeis de detectar são

frequentes em estirpes de Enterobactereaceae produtoras de β-Lactamases de Espectro

Estendido (ESBL) ou resistentes aos inibidores das β-Lactamases (IRT) combinados

com β-Lactaminas (Caniça, M. 2001, comunicação pessoal)

A caracterização fenotípica comporta os dados clínicos e epidemiológicos clássicos,

acompanhando a estirpe desde a sua origem. Este estudo baseia-se na determinação da

Concentração Inibitória Miníma (MIC) para as β-Lactaminas de maior uso clínico.

Existem ainda, poucos estudos publicados sobre as susceptibilidades às β-Lactaminas e

combinações β-Lactamina/inibidor de β-Lactamase em estirpes clínicas de E. coli

isoladas de animais (Féria et al, 2002), sendo por isso necessário aprofundar os nossos

conhecimentos nesta linha de estudos.

2.1 Escherichia coli A Escherichia coli foi isolada, pela primeira vez, em 1885 por Theodor Eschrich, um

bacteriologista alemão, sendo considerada um habitante natural do tracto intestinal. T.

Eschrich atribuiu a esta bactéria o nome de Bacterium coli (bacterium = forma de

bastonete, coli = colon, o seu habitat natural). Posteriormente, o nome do género foi

alterado para Escherichia em homenagem ao seu “descobridor” (Neidhardt et al, 1996).

A estrutura e função de E coli é, geralmente, considerada um arquétipo para todos os

organismos vivos. Escherichia coli é bastante conhecido e estudado, principalmente

porque é extremamente fácil de manipular em laboratório. O seu crescimento é rápido,

apresentando requisitos nutricionais simples, exibindo uma fisiologia e bioquímica

deveras interessantes. No entanto, foi algo diferente que tornou útil esta bactéria, em

termos de biologia molecular: “sexo”, mais precisamente, o processo de conjugação

bacteriana, o qual foi descoberto nesta bactéria, em 1946, por Joshua Lederberg e

3

Eduard Tantum. Aquando da sua descoberta, a conjugação assemelhava-se bastante à

reprodução sexual em eucariótas (Madigan, Martinko & Parker, 1996).

A maioria das estirpes de E. coli não são patogénicas, antes pelo contrário, são

comensais, sintetizando vitamina K (única fonte) e B12. As estirpes patogénicas

produzem sintomas semelhantes aos de uma salmonelose, podendo por vezes,

dependendo da estirpe, chegar a induzir morte (Neidhardt et al, 1996; Madigan,

Martinko & Parker, 1996).

2.2 Estirpes patogénicas de E. coli

Existem fundamentalmente dois grupos de E. coli patogénicos, as estirpes

Enterotoxigénicas (ETEC) e as Enteropatogénicas (EPEC).

Estirpes de Escherichia coli Enterotoxigénicas

Trata-se de estirpes enterovirulentas, que apresentam uma etiologia semelhante à

Cólera. A doença provocada é conhecida como gastroenterite, vulgarmente chamada de

“diarreia do viajante”. Os sintomas clínicos mais frequentes incluem fortes diarreias,

cãibras abdominais, febres baixas a moderadas e náuseas. Estudos demonstraram que

são necessárias 107 a 109 células de ETEC para induzir sintomas. Provavelmente, será a

dose necessária para uma colonização do intestino delgado, por forma a produzir toxina

em quantidade suficiente, de modo a provocar os sintomas, os quais se manifestam em

cerca de 24h. A sua presença é facilmente distinguível das estirpes não patogénicas,

pois as ETEC apresentam características imunoquímicas marcadamente distintas. Estas

estirpes não estão correlacionadas directamente com nenhum tipo específico de

alimento, sendo transmitidas fundamentalmente por águas contaminadas, especialmente

em países em vias de desenvolvimento (Andrews, 1996).

Estirpes de Escherichia coli Enteropatogénicas

Estas estirpes não são produtoras de toxinas excretáveis, mas antes, de toxinas celulares,

denominadas de verotoxinas. São extremamente potentes, sendo necessária uma dose

muito pequena para despoletar sintomas. Os mais comuns são a diarreia associada a

hemorragia e elevadas febres, os quais se manifestam em cerca de 16 a 20h. Este tipo de

diarreia deve-se à acção das verotoxinas, as quais provocam uma destruição do epitélio

do lúmen intestinal. Estas estirpes podem ser encontradas, principalmente, em carnes

4

cruas de vaca e frango, e outros alimentos sujeitos a contaminação fecal, estando

associadas a uma taxa de mortalidade de 50%. Para proceder à análise de EPEC é

necessário seguir protocolos diferentes dos usados para a pesquisa de E. coli não

patogénicas, uma vez que as primeiras apresentam características bioquímicas atípicas

(Andrews, 1996).

2.3 Potenciais fontes de estirpes patogénicas

A evidência da presença de estirpes patogénicas em animais domésticos ainda não se

encontra confirmada. Ainda assim, diversos factores apontam para a possível zoonose

(Carter, GR, Chengappa, MM, Roberts, AW, 1995). Bacon, R. et al demonstraram que

em virtude do mau uso de antibióticos, foi promovida a selecção de estirpes de

Salmonella Thyphimurium DT 104 multirresistentes, em carcaças de animais de

produção. 2.7% em 521 isolados apresentavam resistência à Ampicilina, Cloranfenicol,

Estreptomicina, Sulfonamidas e Tetraciclina (Bacon, RT, Sofos, JN, Belt, KE, Smith,

GC, 1999)

3. O uso da Antibioterapia em infecções causadas por E. coli A primeira abordagem para a quimioterapia antibacteriana de Enterobactereaceae, em

animais, geralmente inclui, no que diz respeito às β-lactaminas, a Amoxicilina e

Amoxicilina potenciada com ácido Clavulânico (Co-amoxiclave). Como segunda

escolha utiliza-se a Cefuroxima, a Cefotaxima e a Ceftazidima. Em último recurso,

dentro desta família, o Aztreoname e o Imipeneme (Hawkey, PM, Lewis, DA, 1989).

4. As ββββ-Lactaminas

As β-lactaminas constituem uma família que se caracteriza quimicamente pela presença

de uma função amida no anel β-lactamico (fig. 1). Este encontra-se frequentemente

associado a outro anel, Tiazolina ou Di-hidrotiazolina, para as Penicilinas e

Cefalosporinas, respectivamente (Levy, 1992).

4.1 Modo de acção das ββββ-lactaminas

As β-lactaminas são agentes bactericidas, actuando fundamentalmente em bactérias em

crescimento activo (Vaz-Pato, 1989).

5

A penetração das β-lactaminas depende da estrutura celular das bactérias alvo. Nas

bactérias gram positivas, o constituinte maioritário da parede celular é o peptidoglicano,

ao contrario de gram negativas, as quais possuem estruturas bastante mais complexas na

parede celular (Madigan, Martinko & Parker, 1996). Na face exterior da membrana

citoplasmática existem proteínas envolvidas na síntese do peptidoglicano, conhecidas

como transpeptidases ou PBP (Penicillin Binding Proteins) (Vaz-Pato, 1989).

Fig 1

Estrutura química das penicilinas e cefalosporinas.

A semelhança estrutural entre o substrato nativo das PBP e o anel β-lactâmico permite a

ligação covalente deste às PBP, inactivando-as e, consequentemente, induzindo a lise

bacteriana (Abraham, 1981). As figuras 2 e 3 descrevem este processo.

As PBP 1, 2 e 3 são transpeptidases e transglicosidases, enquanto as PBP 4, 5 e 6 têm a

actividade de D,D-carboxipeptidases. Apenas a inactivação das PBP 1, 2 ou 3 induz

morte celular (Vaz-Pato, 1989).

6

Fig 2

Esquema representativo dos tipos de parede celular bacteriana.

Fig 3

Esquema representativo da interacção das β-lactaminas com bactérias gram-positivas

(A) e gram-negativas (B).

7

5. Princípios da Resistência aos antibióticos

5.1 A Epidemiologia da Resistência Antibacteriana

O aparecimento da resistência aos antibióticos mais comuns tem-se revelado um

problema crescente a nível mundial (Farrar, 1985; Holmberg, Solomon & Blake, 1987;

McGowan, 1987a; O’Brien, 1987).

O aumento da prevalência da resistência aos antibióticos em meio hospitalar tem sido

atribuida a: (1) alterações na frequência relativa de “bactérias resistentes”, tais como

Pseudomonas; (2) elevado número de doentes imunodeprimidos; e (3) variação nas

práticas de administração de antibióticos (McGowan, 1987).

A importância clínica do aumento do número de microorganismos resistentes aos

antibióticos pode ser ilustrada pelo facto de infecções provocadas por bactérias

resistentes estarem frequentemente associadas a doença prolongada, hospitalizações

frequentes e prolongadas e uma taxa de mortalidade elevada (Holmberg, Solomon &

Blake, 1987).

5.2 Factores associados ao aumento da resistência aos antibióticos

É geralmente aceite entre os peritos, que o aumento da resistência aos antibióticos nas

comunidades hospitalares está directamente relacionada com a administração de

antibióticos (Young, 1986).

McGowan realçou sete critérios que demonstram a ligação entre o uso hospitalar de

antibióticos e o aumento das resistências: (1) a resistência é mais prevalente em estirpes

hospitalares; (2) durante os surtos, os doentes com estirpes resistentes têm maior

probabilidade de já terem recebido antibioterapia; (3) mudanças na prescrição da

antibióticos induziu alterações nos padrões de resistência; (4) zonas hospitalares com

maior uso de de antibióticos, tais como UCI, apresentam maior prevalência de estirpes

resistêntes; (5) o uso prolongado de terapia antibacteriana induziu amentos na

resistência; (6) doses de antibiótico elevadas aumentam o risco de superinfecções e (7)

8

devem ser propostam modelos biológicos para correlacionar causa efeito (McGowan,

1987).

A introdução de antibióticos em rações para animais, em doses sub-terapêuticas, induziu

a selecção de microorganismos resistentes (Levy, 1985). Holmberg et al demonstraram

que o desenvolvimento de infecções graves com Salmonella Newport multirresistente

estava associado com o uso prévio de antibióticos, o qual constitui uma pressão

selectiva para o crescimento de estirpes resistentes (Holmberg et al, 1984).

A zoonose de Salmonella’s resistentes foi identificada em 38 surtos investigados pelo

Center for Disease Control (CDC), entre 1971 e 1983 (Holmberg, Wells & Cohen,

1984). Bactérias como E. coli podem também passar dos animais para o Homem na

ausência de selecção antibacteriana (Marshall, Petrowski & Levy, 1990). A colonização

gastrointestinal com estas estirpes pode persistir durante vários meses, podendo assim

ocorrer transferência de determinantes genéticos de resistência (Livrelli et al , 1988).

5.3 Mecanismos moleculares de resistência aos antibióticos

Os principais mecanismos genéticos de resistência aos antibióticos são: (1) resistência

intrínseca; (2) mutação cromossomal; (3) plasmídica; (4) mediada por transposões; (5)

mediada por integrões e (6) tolerância.

Resistência intrínseca

A resistência intrínseca indica a resistência natural aos antibióticos, característica de

muitas bactérias a certos antibióticos. Este tipo de resistência pode resultar da presença

de uma barreira de premeabilidade (Hancook & Woodruff, 1988; Nikaido & Vaara,

1985), por modificação dos locais alvo dos antibióticos (Spratt & Cromie, 1988) ou pela

indução de genes reprimidos na presença de antibiótico (O’Brien, 1987).

Mutação cromossomica

As mutações cromossomicas são alterações na sequência de DNA dos cromossomas

bacterianos, as quais podem resultar na síntese de proteínas alteradas, novas proteínas,

ou ainda, alterações na quantidade de proteína produzida. Têm sido detectadas mutações

num elevado número de genes, incluindo os genes da PBP, da RNA polimerase, DNA

9

girase, proteínas ribossomais, sistemas energéticos bacterianos e sistemas de transporte.

Geralmente, estas mutações estão associadas a uma diminuição na virulência (Reynolds,

1984).

Plasmídeos

Os plasmídeos são moléculas de DNA circular, extracromossomal, com capacidade de

replicação autónoma. Os plasmídeos de resistência podem ser encontrados numa grande

diversidade de bactérias, uma vez que este é facilmente transmitido a bacterias da

mesma espécie, ou de outras espécies, através de conjugação e transformação. Estas

moléculas podem codificar diversas proteínas importantes na replicação, factores de

fertilidade, resistência a metais tóxicos, bacteriofagos e antibióticos, adesão celular,

virulência, entre outros (Madigan, Parker &Martinko, 1996; Lewin, 1996).

Transposões

Os transposões são sequências de DNA linear, com tamanho molecular compreendido

entre 2.5 Kb e 23 Kb, que possuem a capacidade de se transferir de uma molecula de

DNA para outra (Darnell et al, 1995).

Os transposões diferem dos plasmídeos basicamente em dois modos: não possuem

capacidade de replicação autónoma e, consequentemente, têm que estar integrados em

plasmídeos ou bacterifagos do cromossoma hospedeiro, e não necessitam de grande

homologia de modo a se inserirem numa sequência de DNA. Os transposões contêm

sempre sequências repetidas, directas ou inversas, ou ainda duplicações da sequência

alvo. Algumas destas sequências invertidas (sequências de inserção – IS) são capazes de

movimento independente (Lewin, 1996).

Integrões

Os integrões assemelham-se aos transposões, mas não posuem sequências terminais

repetidas, nem codificam as proteínas necessárias para a sua transposição. Estes podem

ser caracterizados pela presença de sequências específicas para o alvo de integração.

Apresentam a capacidade de adquirir diversos genes para a resistência aos antibióticos,

e de os expressar através de promotores próprios (intrínsecos) (Stokes & Hall, 1989).

10

Tolerância

A tolerância é definida como um rácio entre a Concentração Bactericida Mínima (BMC)

e a Concentração Inibitória Mínima (MIC) igual ou superior a 32. Este tipo de

resistência pode ser caracterizado pela inibição do crescimento sem lise celular. A

tolerância encontra-se fundamentalmente em gram-positivos, possivelmente devido a

alterações nas autolisinas (deGroot, 1991).

5.4 Transferência genética da resistência aos antibióticos

Existem quatro processos distintos de transferência de genes de um microorganismo

para outro. Estes são a Conjugação, Transformação, Transducção e Transposição.

Conjugação

A conjugação é um processo pelo qual o DNA é transferido por contacto celular, de um

dador para um receptor. Genes que codificam resistência a antibióticos encontram-se

frequentemente em plasmídeos conjugativos. Estes encontram-se largamente

distribuidos, disseminando facilmente para diferentes espécies bacterianas (Davies &

Smith, 1978).

Transformação

A transformação é um processo onde o DNA do dador é integrado no cromossoma do

receptor. Este é um mecanismo muito eficiente de transferência genética (Madigan,

Parker & Martinko, 1996; Lewin, 1996).

Transducção

Na transducção a transferência genética é mediada por bacteriofagos. Os bacterifagos

são pequenos vírus, os quais replicam como parasitas intracelulares obrigatórios nas

bactérias (Madigan, Parker & Martinko, 1996; Lewin, 1996).

Transposição

A transposição é um mecanismo de transferência mediado por transposões, envolvendo

tanto plasmídeos conjugativos, como não conjugativos, e cromossomas (Lupski, 1987).

11

5.5 Mecanismos bioquímicos de resistência a antibióticos

Existem quatro mecanismos fundamentais, os quais serão apenas brevemente discutidos

nesta secção.

Modificação dos locais alvo

Mutações nos genes das PBP podem diminuir a sua afinidade para os antibióticos β-

lactâmicos, conferindo alguma resistência. A resistência às Quinolonas e à Novobiocina

pode surgir através de mutações no gene gyrA, o qual codifica para uma girase. No caso

da RNA polimerase possuir mutações, é provável que exista resistência à Rifampicina.

A resistência aos Aminoglicosídeos está intimamente ligada a mutações no rRNA,

enquanto a resistência aos Macrólidos depende, principalmente, da metilação do rRNA

por intremédio de enzimas codificadas em plasmídeos (Reynolds, 1984).

Acumulação reduzida de antibiótico

Este tipo de resistência pode ser intrínseco ou adquirido. Exemplo de resistência

intrínseca é a incapacidade de certos antibióticos difundirem através das porinas da

membrana externas das bactérias gram-negativas (Nikaido & Vaara, 1985; Nikaido,

1988).

Bactérias como a Pseudomonas aeruginosa exibem uma premeabilidade extremamente

reduzida para antibióticos hidrofílicos. Isto é reflexo de diferenças substânciais nas

características das porinas (Hancock & Woodruff, 1988; Livermore, 1988).

Os genes plasmídicos podem codificar proteínas membranares (Tet A, B e C), as quais

funcionam como bombas de efluxo de extrusão da Tetraciclina, à custa de ATP. A

Tetraciclina, geralmente, inibe a síntese proteíca bacteriana, interagindo com a

subunidade ribossomal 30s. Mutações cromossomais em proteínas transportadoras ou

porinas, podem resultar numa permeabilidade reduzida da parede celular (Bryan, 1989;

Hancock & Woodruff, 1988).

12

A este mecanismo tem sido associada a resistência a vários antibióticos, nomeadamente,

aminoglicosideos, quinolonas, cloranfenicol, tetraciclinas e β-lactâmicos (deGroot,

1991).

Inactivação do antibiótico

Este mecanismo de resistência consiste na inactivação do antibiótico por intermedio de

enzimas. Existem três grupos principais de enzimas: (1) enzimas inactivadoras de

aminoglicosideos; (2) cloranfenicol acetil transferases e (3) β-Lactamases. Estas últimas

serão discutidas em mais detalhe em pontos posteriores.

A cloranfenicol acetil transferase (CAT) encontra-se em plasmídeos ou transposões, e

cataliza a desacetilação do cloranfenicol com a Coenzima A (CoA). O composto

resultante é inactivo na inibição da sintese proteíca (Bajanca-Lavado, 1996).

As enzimas de modificação de aminoglicosideos são de três tipos: (1) acetiltransferases,

(2) adeniltransferases e (3) fosfotransferases. Os aminoglicosideos ligam-se às

subunidades ribossomais 30s e 50s, induzindo um “missreading” transducional e a

inibição do alongamento das cadeias peptidicas (Bryan, 1988).

Desvio metabólico

A resistência exibida aquando a existência de um desvio metabólico caracteriza-se pela

síntese de um local alvo alternativo, para o antibiótico. Este é o principal mecanismo de

resistência às Sulfonamidas e ao Trimetoprime.

A resistência a este último antibiótico é consequência da síntese de uma dihidropteroato

sintetase alterada, a qual, geralmente, encontra-se em plasmídeos (deGrott, 1991).

6. Resistência às ββββ-lactaminas

A resistência enzimática aos antibióticos β-lactâmicos é mediado por β-Lactamases, as

quais hidrolizam o anel β-lactâmico, inactivando o antibiótico.

13

Ao longo dos anos têm surgido vários esquemas de classificação. No entanto, pareçe

que o esquema proposto por Bush et al em 1995 é o que se apresenta mais coeso. Esta

classificação baseia-se nos substractos e perfis de inibição (Ferreira, 2000).

Quadro I: Esquema da classificação das β-Lactamases (Bush et al, 1995)

Grupo Classe Molecular

Substratos preferênciais

Inibida por Àcido

Clavulânico

Enzimas representativas

1 C Cefalosporinas Não AmpC; MIR-1 2a A Penicilinas Sim Penicilinases 2b A Penicilinas,

Cefalosporinas Sim TEM-1, TEM-2, SHV-1

2be A Penicilinas, Cefalosporinas de largo espectro e

espectro estendido

Sim TEM-3 a TEM-26, SHV-2 a SHV-6

2br A Penicilinas -- TEM-30 a TEM-36, TRC-1

2c A Penicilinas, Carbenicilinas

Sim PSE-1, PSE-3, PSE-4

2d D Penicilinas, Oxacilinas

-- OXA-1 a OXA-11

2e A Cefalosporinas Sim AmpC 2f A Penicilinas,

Cefalosporinas, Carbapenémes

Sim NMC-A, Sme-1

3 B β-lactâmicos em geral

---- L1, CcrA

4 Não determinado

Penicilinas ---- Penicilinases

Adaptado de Ferreira, 2000.

Esta classificação deriva directamente da sequência nucleotídica dos genes que

codoficam as diferentes β-Lactamases. As classes A, C e D possuem um resíduo de

serina no centro activo, enquanto a classe B tem 4 átomos de zinco. As enzimas da

classe A são muito activas contra a benzilpenicilina. As β-Lactamases de Espectro

Estendido (ESBL) pertencem a esta classe. As ESBL para além da benzilpenicilina,

também inactivam diversas cefalosporinas e monobactamos.

As enzimas da classe B são igualmente activas contra as benzilpenicilinas e

cefalosporinas, inactivando ainda os carbapenémes.

14

As β-Lactamases da classe C, conhecidas por AmpC, na maioria dos casos são

indutíveis, mas algumas mutações podem provocar a sobreexpressão.

A classe D é composta por enzimas do tipo OXA, as quais hidrolizam a oxacilina (Fluit

et al, 2001).

6.1 ββββ-Lactamases do tipo TEM e SHV

A β-lactamase TEM foi a primeira a ser descrita, em 1965, por Kliebe et al, em E. coli,

o que demonstra o quanto recentes são estas enzimas (Kliebe et al, 1985).

As enzimas TEM-1, TEM-2 e SHV-1 encontram-se bastante difundidas, e atacam

cefalosporinas de espectro reduzido e penicilinas (Appelbaun et al, 1986).

O nível de resistência depende da quantidade de enzima produzida, a qual pode ter

variações até 150 vezes entre diversas estirpes, o que reflete a quantidade de genes ou, a

eficiência dos promotores (Wu, Shanon & Philips, 1994).

A produção de TEM ou SHV, mesmo em pequenas quantidades, confere resistência à

ampicilina, amoxicilina, ticarcilina e carbenicilina, com MIC’s superiores as 256 µg/ml,

comparadas com 1 a 4 µg/ml em E. coli não produtoras de β-lactamase (Wu, Shanon &

Philips, 1994; Livermore, 1995).

Devido ao aumento das resistências às penicilinas, foram desenvolvidas moléculas

inibidoras das β-Lactamases, as quais funcionam como “protectoras” do antibiótico.

Entre os inibidores mais comuns encontram-se o ácido clavulânico, o sublactâme e o

tazobactâme (Ferreira, 2000).

Estudos recentes correlacionam a resistência em estirpes de E. coli à hiperprodução de

TEM não modificada, modificação em proteínas de membrana e modificação nas

enzimas do tipo TEM. Estas últimas, embora pertençam à família TEM, são conhecidas

como TEM resistentes aos inibidores (IRT) (Belaaouaj et al, 1994; Chaïbi et al, 1999).

15

As IRT diferem das TEM-1 e TEM-2 parentais em uma, duas ou três substituições de

aminoácidos em locais diferentes.

Quadro II: Substituições de aminoácidos nas β-Lactamases IRT

Posição do aminoácidoa na sequênciab β-Lactamasec Nome

alternativo 39 69 165 182 244 261 274 276 pI

TEM-1 Gln Met Trp Met Arg Val Arg Asn 5.4 TEM-30=TEM-41 IRT-2 Ser 5.2

TEM-31 IRT-1 Cys 5.2 TEM-32 IRT-3 Ile Thr 5.4 TEM-33 IRT-5 Leu 5.4 TEM-34 IRT-6 Val 5.4 TEM-35 IRT-4 Leu Asp 5.2 TEM-36 IRT-7 Val Asp 5.2 TEM-37 IRT-8 Ile Asp 5.2 TEM-38 IRT-9 Val Leu 5.2 TEM-39 IRT-10 Leu Arg Asp 5.4 TEM-40 IRT-161,

IRT-11 Ile 5.4

TEM-44 IRT-13 Lys Ser 5.4 TEM-45 IRT-14 Leu Gln 5.2 TEM-51 IRT-15 His 5.2

aAla, alanina; Asn, asparagina; Arg, arginina; Asp, ácido aspártico; Cys, cisteína; Gln, glutamina; His, histidina; Ile, isoleucina; Leu, leucina; Lys, lisina; Ser, serina; Thr, treonina; Trp, triptofano; Val, valina. bComforme os sistema de numeração ABL de Ambler et al cClassificação das β-Lactamases TEM Adaptado de Chaïbi et al, 1999

Belaaouaj et al em 1994 descreveram uma β-lactamase de pI 5.2, derivada de uma

TEM, com a substituição de dois aminoácidos, a qual é resistente à combinação

amoxicilina/ácido clavulânico (AMC), sendo classificada como IRT (Belaaouaj et al,

1994; Brun et al, 1994).

Sabe-se que os genes blaIRT, embora inicialmente exclusivos de E. coli, encontram-se

também em K. pneumoniae e P. mirabilis (Bret et al, 1996; Lemozy et al, 1995). O

fenotipo de resistência das IRT, por si só, proporciona resistência às combinações β-

lactamina/inibidor. Contudo, mutações no promotor dos genes blaIRT conduz a uma

expressão mais elevada da enzima, elevando os valores de resistência (Caniça et al,

1997).

16

Os genes blaIRT podem apresentar mutações que afectem as propriedades cinéticas das

enzimas, alterando os locais de ligação, quer da β-lactamina, quer do inibidor (Knox et

al, 1995; Caniça et al, 1996).

Um estudo conclui que as IRT com 2 substituições são resultado de uma evolução

convergente, uma vez que, cada substituição de aminoácidos, per si, traduz-se num

fenótipo de resistência (Caniça et al, 1998).

Uma mutação particular causadora de fenótipo IRT pode ser encontrada em dois

“frameworks” genéticos distintos, tal como duas mutações IRT diferentes podem estar

presentes em “framewoks” genéticos idênticos.

Assim, pensa-se que as IRT tiveram uma evolução convergente, uma vez que, embora

as mutações ocorressem em diferentes “frameworks” genéticos, todas conferem um

fenótipo IRT idêntico (Caniça et al, 1997).

As estirpes produtoras de IRT são resistentes a todas as combinações β-

lactâmico/inibidor, mas são menos resistentes que as TEM-1 às cefalosporinas de 1ª e 2ª

geração (C1G e C2G), continuando susceptíveis às cefalosporinas de espectro estendido

(Livermore, 1995).

6.2 ββββ-Lactamases de Espectro Estendido (ESBL)

As ESBL derivadas de TEM e SHV caracterizam-se pela capacidade de atacar as

cefalosporinas de espectro estendido, monobactâmos e penicilinas. A resistência ao

Aztreoname é variável dentro da família. A sinergia entre as C3G e as combinações β-

lactâmico/inibidor também é característica das ESBL (Livermore, 1995).

As ESBL não relacionadas com TEM e SHV são raras, mas encontram-se entre as mais

potentes da classe e podem vir a ter uma importância crescente num futuro próximo.

Estas enzimas conferem resistência a todas as cefalosporinas, ao aztreoname e às

penicilinas, sendo susceptíveis aos carbapenémes e cefamicinas (Livermore, 1995).

17

Este tipo de β-Lactamases existe fundamentalmente em Acinetobacter e P. aeruginosa.

No entanto, sabe-se que pode ocorrer troca de material genético entre estas espécies e as

Enterobactereaceae (Fluit, 2001).

6.3 Cefalosporinases (AmpC)

As enzimas AmpC existem desde muito antes da era dos antibióticos (Livermore,

1995). O gene da cefalosporinase cromossomal, ampC, em E. coli é regulado por um

promotor fraco e um atenuador da transcrição (Jaurin et al, 1981; Olsson et al, 1983;

Nelson & Elisha, 1999).

Estirpes com o gene nativo produzem baixas quantidades de enzima, e são susceptíveis

à ampicilina. Contudo, em algumas estirpes de E. coli, esta enzima é hiperproduzida,

conduzindo a um fenótipo de resistência ao Cefoxitime e susceptibilidade reduzida às

oximinocefalosporinas.

Estudos sobre a base molecular da hiperprodução de AmpC demonstram que algumas

estirpes hiperprodutoras possuem várias cópias do gene ampC, enquanto outras

apresentam mutações ao nível do promotor e/ou atenuador, resultando numa transcrição

mais eficiente. A aquisição de promotores fortes de Shigella sp. também foi descrito

como uma causa de hiperprodução de AmpC em E. coli (Nelson, 1999).

As mutações no atenuador, embora impliquem resistência, não conferem níveis

elevados, ao contrário das mutações no promotor. Estas últimas podem corresponder a

um aumento transcripcional até 120 vezes em relação ao nível de transcrição

constitutivo (Caroff et al, 2000).

Nos últimos dez anos têm sido descritas várias cefalosporinases plasmidícas em E. coli

e outras espécies. Pensa-se, que esta transição pode estar associada a integrões e

transposões, e de certo modo constitui um risco elevado de disseminação de resistência

(Ferreira, 2000).

6.4 Oxacilinases

18

As β-Lactamases do grupo 2d são caracterizadas pela elevada taxa de hidrolise da

Oxacilina e baixa susceptibilidade à inibição pelo ácido clavulânico (Mugnier et al,

1998). Algumas destas enzimas, não derivadas de ESBL, apresentam uma actividade de

largo espectro. As OXA têm sido descritas crescentemente em E. coli. Contudo, ainda

são raras (Danel et al, 1999).

Enquanto algumas oxacilinases diferem apenas por uma substituição num aminoácido

(caso da OXA-1 e OXA-4, OXA-11 e OXA-14), outras demonstram elevada homologia

aminoacídica (OXA-1, OXA-5, OXA-7 e OXA-10), sendo que a maioria apenas

apresenta uma similaridade de aminoácidos entre 20 a 30% (Naas et al, 1998).

6.5 Resistência não enzimática

No caso da resistência aos β-lactâmicos, esta é devido fundamentalmente a

modificações nas PBP. Em E. coli as PBP-1 ligam-se essencialmente à cefaloridina. As

PBP-2 ligam-se ao meciliname, ao ácido clavulânico e tienamicina, e as PBP-3 à

piperacilina, mezlocilina e aztreoname. A inibição das PBP-1a e PBP-1b conduz a um

efeito bactericida, enquanto a inibição das PBP-2 e PBP-3 produz um efeito

bacterióstatico (Vaz-Pato, 1989; Percival, 1992).

7. Métodos de detecção de ββββ-Lactamases

A determinação da susceptibilidade aos antibióticos em isolados clínicos é crucial para

o sucesso da antibioterapia em infecções bacterianas.

Uma identificação inequívoca da presença de determinada β-lactamase em

Enterobactereaceae implica a sequenciação do gene ou proteína. No entanto, o tipo de

enzima pode ser inferido a partir dos dados da susceptibilidade (Livermore, 1995, 2001;

M’Zali, 2000).

Os testes directos podem ser usados em E. coli, mas a sua utilidade é reduzida, uma vez

que, a questão que se coloca não é se é produzida β-lactamase, mas antes, que tipo de β-

lactamase é produzida (Livermore, 2001).

19

O teste com Nitrocefin é um dos mais comuns e sensíveis para a maioria das β-

Lactamases. A β-lactamase hidrolisa o nitrocefin (uma cefalosporina cromogénica),

provocando uma alteração da côr, de amarelo para vermelho. A hidrolise da penicilina a

ácido penicilinóico reduz o iodo, produzindo uma descoloração do complexo iodo-

amido. Este é o princípio básico dos testes iodométricos. A detecção de ESBL não é

óbvia, e a determinação da susceptibilidade não é convergente, uma vez que ainda não

existe consenso sobre os valores limíte entre resistência e susceptibilidade (Livermore,

1995, 2001).

As ESBL podem ser inferidas através da avaliação do sinergismo entre C3G e

inibidores de β-Lactamases (frequentemente usa-se o ácido clavulânico), uma vez que

as ESBL são inibidas (Livermore, 1995). O E-teste permite também a detecção de

ESBL, mas como todos os outros, apresenta limitações intrepertativas (M’Zali, 2000).

8. MATERIAL E MÉTODOS

8.1 Estirpes bacterianas

Foram isoladas 45 estirpes de E. coli (28 de cães, 7 de suínos, 6 de gatos, 3 humanas e 1

de equíno) e enviadas para a Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica

de Lisboa. Todos os isolados foram provinientes de pacientes com bacteriúria

significativa e sintomas claros de Infecção do Tracto Urinário (ITU).

As estirpes foram isoladas em Columbia suplementado com 5% de sangue de carneiro

(bioMerieux, França).

Os isolados foram identificados com o sistema API 20E (bioMerieux, França).

As estirpes foram guardadas em meio BHI com 20% glicerol, e congeladas a –70º C,

para estudos posteriores.

20

As estirpes E. coli ATCC 25922, E. coli R111 (TEM-1), E. coli Sal (IRT-1), E. coli

Guer (IRT-2), E. coli P37 (IRT-14), e um isolado caracterizado por Féria, C. et al, 2002,

E. coli 434 (AmpC+TEM-1), foram usadas como estirpes de referência na determinação

das MIC’s.

8.2 Determinação da susceptibilidade às ββββ-Lactaminas

A determinação das MIC’s foi realizada pelo método da microdiluição, adaptado dos

métodos propostos por Courvalin et al, 1985, e pela American Society for

Microbiology, 1998 (Féria et al, 2002).

Os pós de antibiótico e inibidor de β-lactamases usados nos ensaios para determinação

das MIC’s foram fornecidos pelos seguintes fabricantes: Clavulanato de sódio (Atral-

Cipan), Ticarcilina (GlaxoSmithKlineBeecham), Meciliname (Leo Pharmaceutical

Products), Ceftazidima (GlaxoWellcome), Ceftriaxona (Roche Pharmaceuticals),

Cefotaxima (HoeschstMarionRoussel), Aztreoname (Bristol-Myers Squibb),

Amoxicilina (Sigma), Cefuroxima e Cefixima (Atral-Cipan).

O ácido clavulânico foi usado numa concentração fixa de 2 µg/ml com amoxicilina

diluida em série aritmética de factor 2.

8.3 Pesquisa de ESBL

A pesquisa de ESBL foi realizada pelo teste de sinergia entre o ácido clavulânico e os

seguintes antibióticos: Cefotaxima, ceftriaxona e ceftazidima (Féria et al, 2002).

9. RESULTADOS

Os padrões de resistência de 45 estirpes de E. coli uropatogenicas, relativamente a 10 β-

lactaminas e a uma combinação β-lactamina/inibidor de β-lactamase, encontram-se na

tabela 1.

21

57.8% das estirpes estudas apresentavam resistência à amoxicilina, mas apenas 28.6%

eram resistentes à combinação amoxicilina/ácido clavulânico. Determinou-se que,

53.3% e 24.4% das estirpes eram resistentes à ticarcilina e meciliname,

respectivamente. A ceftriaxona, cefotaxima e ceftazidima apresentaram um padrão de

inibição semelhante, onde apenas 2.2%, 2.2% e 4.5% dos isolados apresentaram

resistência para a ceftriaxona, cefotaxima e ceftazidima, respectivamente.

Os níveis de resistência para a cefuroxima, cefixima e cefoxitima são ligeiramente mais

elevados do que para as cefalosporinas anteriores, situando-se em 4.4%, 9.1% e 8.9%,

respectivamente.

A nível global, das 45 estirpes estudadas, nota-se uma elevada resistência para a

amoxicilina e ticarcilina, uma percentagem de resistência média para o meciliname e

amoxicilina potênciada com ácido clavulânico, e baixas percentagens de resistência para

a cefoxitima, cefuroxima, ceftazidima e cefixima (tabela 1). Apenas um isolado

apresentou resistência para o aztreoname, cefotaxima e ceftriaxona.

Tabela 1:Padrões de susceptibilidade aos antibióticos em isolados de E. coli uropatogenicas

MIC (µµµµg/ml)

Breakpointa Método da Microdiluiçãob

Antibiótico S R S I R

Amoxicilina ≤4 >16 16 (35.5) 3 (6.7) 26 (57.8)

Co-amoxiclavec ≤4 >16 12 (28.6) 14 (42.8) 12 (28.6)

Meciliname ≤2 >8 27 (60) 7 (15.6) 11 (24.4)

Cefuroxima ≤8 >32 11 (24.5) 32 (71.1) 2 (4.4)

Cefoxitima ≤8 >32 26 (57.8) 15 (33.3) 4 (8.9)

Ceftazidima ≤4 >32 42 (95.5) 0 2 (4.5)

Ceftriaxona ≤4 >32 44 (97.8) 0 1 (2.2)

Cefotaxima ≤4 >32 40 (89) 4 (8.8) 1 (2.2)

Cefixima ≤1 >2 30 (68) 10 (22.7) 4 (9.1)

Aztreoname ≤4 >32 39 (86.7) 5 (11.1) 1 (2.2)

22

Ticarcilina ≤16 >64 15 (33.4) 6 (13.3) 24 (53.3)

aBreakpoints e susceptibilidades intrepertados com base nas recomendações do Comité do Antibiograma, da Sociedade Francesa de Microbiologia; bNúmero de isolados (%); cO clavulanato foi usado numa concentração fixa de 2 µg/ml.

23

Tabela 2. Actividades in vitro de 11 antibióticos contra isolados uropatogénicos de E. coli (n = 45)

Percentagens cumulativas de inibição das estirpes estudadas em mg/L

Antibiótic

o

<0.01

5

0.01

5

0.0

3

0.0

6

0.12

5

0.2

5

0.

5

1 2 4 8 1

6

32 64 12

8

25

6

51

2

102

4

204

8

409

6

>409

6

AML 0 1

1

3

3

3

8

4

2

4

2

42 44 56 58 60 75 90 100

AMC 0 2

1

3

5

4

8

6

5

7

3

73 79 83 85 90 92 100

TIC 0 4 4 6 6 2

1

3

1

4

0

46 46 48 52 65 67 75 83 100

MEC 0 6 21 44 48 52 5

6

5

8

7

3

8

1

9

0

92 94 96 98 10

0

CAZ 2 4 11 15 26 49 83 8

7

9

4

9

4

9

6

9

6

96 96 96 10

0

CRO 2 4 15 52 77 85 88 9

6

9

6

9

6

9

6

9

6

96 98 10

0

CTX 2 8 10 29 67 77 77 7

9

8

8

9

0

9

4

9

6

98 10

0

24

CXM 0 2 2 5 1

2

2

4

7

7

9

3

93 93 10

0

CFM 0 5 5 7 19 66 8

9

8

9

8

9

8

9

9

1

93 96 96 10

0

FOX 0 2 9 9 11 1

5

3

2

6

5

8

9

9

1

91 91 95 10

0

ATM 0 2 12 25 65 82 8

4

8

4

8

6

9

2

9

7

10

0

AML: Amoxicilina; AMC: Amoxicilina potênciada com ácido clavulânico; TIC: Ticarcilina; MEC: Meciliname; CAZ: Ceftazidima; CRO:

Ceftriaxona; CTX: Cefotaxima; CXM: Cefuroxima; CFM: Cefixima; FOX: Cefoxitime; ATM: Aztreoname.

25

As MIC50 e MIC90 encontram-se descritas na tabela 3.

A ticarcilina foi o antibiótico que apresentou valores mais elevados , de 256 e >4096

µg/ml, para as MIC50 e MIC90, respectivamente.

A ceftriaxona situa-se no extremo oposto, com valores de MIC50 e MIC90 de 0.06 e 1

µg/ml.

Tabela 3: Percentagens de inibição a 50% e a 90% de 11 antibióticos

Antibiótico MIC50 MIC90

AML 128 2048

AMC 8 512

TIC 256 >4096

MEC 0.5 16

CAZ 0.25 2

CRO 0.06 1

CTX 0.125 4

CXM 8 16

CFM 0.5 16

FOX 4 16

ATM 0.25 8

É possível ver que as MIC90 para as cefalosporinas se encontra abaixo dos valores

críticos, em termos de resistência, assim como para o aztreoname e meciliname.

A amoxicilina e a ticarcilina apresentam valores de MIC50 na gama resistente, enquanto

a amoxicilina potenciada com ácido clavulânico, tem um valor intermédio.

A tabela 4 resume as MIC’s obtidas para as estirpes que apresentaram um padrão de

resistência mais elevado, assim como, para os padrões usados e enzimas citadas na

bibliografia.

26

Tabela 4: MIC’s de estirpes de E. coli uropatogenicas.

MIC’c em µµµµg/ml

Estirpes AML AMC TIC MEC FOX CFM CXM CTX CAZ CRO ATM

180 256 256 256 0.5 2 32 8 1 8 0.5 16

199 128 128 16 0.125 128 64 128 8 2 0.5 8

339 2048 64 2048 8 4 0.5 16 0.125 0.5 0.06 0.25

1074 4096 64 >4096 1 8 1 8 0.125 0.5 0.06 1

1187 4096 64 >4096 8 4 ≤0.03 8 2 0.5 0.03 0.25

1953 4096 512 >4096 4096 256 256 128 128 256 128 64

E939 4096 16 >4096 1024 4 0.5 8 0.125 0.03 0.125 0.25

ATCC25922 4 4 4 0.06 1 0.5 4 0.25 0.25 0.03 0.25

TEM-1 2048 128 >2048 4 ND ND ND 2 0.5 0.06 0.25

IRT-1 128 4 128 ≤0.125 0.5 ND ND 0.015 0.25 0.015 0.25

IRT-2 1024 512 1024 8 2 0.25 ND 0.015 0.25 0.03 0.25

IRT-14 2048 1024 2048 0.25 4 ND ND 0.015 0.25 0.06 0.06

TEM-1

+ AmpC

>2048 >2048 >2048 4 ND ND ND 32 64 64 32

OXA-1a 512 128 >2048 2 ND ND ND 0.06 0.125 0.06 0.25

SHV-1b 1024 4 >2048 1 ND ND ND 0.06 0.125 0.06 0.5

SHV-1 +

AmpCc

2048 4 >2048 4 ND ND ND 0.06 0.5 0.06 0.5

AmpCd 256 256 64 256 ND ND ND 2 2 0.5 8

IRT-4e 2048 1024 512 0.125 2 ND ND 0.06 0.06 ND 0.03

TEM-10 +

SHV-1f

>128 ND ND ND ND ND ND 16 >128 32 ND

ND-não determinado; a(Danel et al, 1999); b(Rice et al, 2000); c(Goni-Urriza et al, 2000); d(Nelson & Elisha, 1999); e(Brun et al, 1994); f(Yang et al, 1998)

A partir dos resultados obtidos pode notar-se que existem duas estirpes, a 199 e a 1953,

as quais apresentam valores de MIC, para as cefalosporinas, algo elevados. A estirpe

1953 apresenta também uma elevada resistência ao meciliname e ao aztreoname.

A NCCLS refere que quando existe sinergia (Fractional Inibitory Concentration ≤0.5)

entre uma cefalosporina e um inibidor de β-Lactamases, a enzima envolvida no

fenomeno de resistência poderá ser uma ESBL.

27

Tabela 5: Resultados do teste de sinergia em isolados de E. coli e estirpes padrão

MIC’s em µg/ml

Estirpes CTX/CA CAZ/CA CRO/CA FIC

1953 1 0.5 32 11.2

199 4 4 1 3

TEM8 4 0.5 4 2.8

TEM-3 0.125 1 0.125 0.42

TEM-1+AmpC 0.5 2 1 1.2

HB101 4 2 64 23.3

FIC≤0.5-sinergia; 0.5≤FIC≤4-indiferença; FIC>4-antagonismo CA – ácido clavulânico

10. Discussão

Neste estudo notou-se um aumento da resistência à amoxicilina, Co-amoxiclave,

meciliname, ceftazidima, ceftriaxona, cefotaxima, aztreoname e ticarcilina, que para os

quais, sobre isolados do mesmo tipo de amostras, em junho de 2001 se cifravam em

36.1%, 19.4,%, 13.9%, 1.4%, 1.4%, 0%, 0% e 34.7%, respectivamente (Féria et al,

2002).

Deve realçar-se que as estirpes incluídas neste estudo foram isoladas maioritáriamente

em 2001, no entanto, foram incluidas estirpes de 1998 (2), 1999 (7) e 2002 (5), pelo que

estes valores são meramente indicativos.

É contudo, importante verificar a tendência do aumento da resistência de estirpes de

origem veterinária (gráfico 1), o que vem reforçar a ideia lançada por Féria et al, onde é

bem patente a importância da vigilância da resistência antimicrobiana em veterinária em

animais de produção e companhia, uma vez que estes entram em contacto directo com o

Homem, podendo vir a tornar-se um problema de saúde pública.

28

Um estudo realizado em Espanha, em 1998, com isolados de E. coli proviniêntes de

vacas leiteiras revela que 2.1% das estipes eram resistentes à cefuroxima, o que

fortalece a ideia de uma evolução na resistência às cefalosporinas (Orden et al, 1999).

Gráfico 1: Padrões de resistência das estirpes estudadas

Padrões de resistencia de isolados de E. coli uropatogenicos (n=45)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Amoxici

lina

Co-amox

iclav

ec

Mec

ilinam

e

Cefurox

ima

Cefoxit

ima

Ceftaz

idima

Ceftria

xona

Cefotax

ima

Cefixim

a

Aztreo

name

Ticarci

lina

Antibióticos testados

Perc

enta

gem

de

Res

iste

ncia

S

I

R

A estirpe 1953 apresenta resistência para os 11 antibióticos testados.

As enzimas tipo IRT apresentam sensibilidade à ceftazidima, cefotaxima, ceftriaxona,

meciliname e aztreoname (Caniça et al, 1994; Ferreira, 2000).

Um estudo realizado em Portugal determinou que enzimas do tipo TEM-10 apresentam

MIC’s >32 µg/ml para a ceftazidima, >256µg/ml para o aztreoname, 8 µg/ml para a

cefuroxima e 2 µg/ml para a cefotaxima. A susceptibilidade à ceftazidima é

restabelecida pelo ácido clavulânico, indicando que se trata de uma ESBL (Barroso et

al, 2000).

Yang et al determinaram que isolados clínicos de E. coli produtores de TEM-43 têm

MIC >128 µg/ml para a ceftazidima, 32 µg/ml para a cefotaxima, 4 µg/ml para a

cefoxitima e >128 µg/ml para o aztreoname (Yang et al, 1998).

29

Altos níveis de resistência à ceftazidima e à sua combinação com o ácido clavulânico

podem ser resultado da produção de TEM-50, embora estas enzimas sejam raras (Rice

et al, 2000).

Um fenotipo de resistência à ampicilina, ticarcilina, cefotaxima, ceftazidima e

aztreoname pode ser resultado da presença de uma OXA-19, uma enzima derivada da

OXA-10 (Mugnier et al, 1998).

Outras enzimas da familia OXA, como a OXA-17 e OXA-20, induzem perfis de

resistência semelhantes, no entanto, estas enzimas são muito raras em E. coli,

encontrando-se principalmente em Pseudomonas (Mugnier et al, 1998; Danel et al,

1999; Naas et al, 1998). Além disso, estas enzimas encontram-se frequentemente

associadas a integrões, os quais ainda são raros em E. coli (Naas et al, 1998).

As enzimas AmpC têm sido descritas em plasmídeos conjugativos de Klebsiella e,

menos frequentemente, em E. coli (Marchese et al, 1998). Dentro deste grupo, existem

vários sub-grupos, de acordo com a cefalosporina maioritariamente degradada. Por

exemplo, as FOX-3 e FOX-4 degradam preferencialmente a cefoxitima (Bou et al,

2000), enquanto a CTX-M-16 liga-se com maior afinidade à cefotaxima (Bonnet et al,

2001).

Siu et al descrevem a existência concomitante de SHV-5 e TEM-1 em diversos isolados

clínicos de E. coli, as quais conferem um perfil de resistência semelhante à presença de

uma ESBL (Siu et al, 1999).

Embora seja necessário recorrer a métodos como a focagem isoelectrica, PCR-RFLP,

PFGE e sequenciação, para determinar a ou as enzimas envolvidas no fenómeno de

resistência, é possível inferir as enzimas apartir do padrão da resistência (Livermore,

1995, Livermore, 2001).

Contudo, é necessário considerar a hipotese de existirem outros mecanismos de

resistência não enzimática, de modo a não subestimar o potencial infeccioso das

estirpes. Porém, estes mecanismos são raros em E. coli, e não implicam elevados níveis

de resistência (Livermore, 1995).

30

Comparando o fenotipo determinado para a estirpe 1953 com os dados disponíveis na

bibliografia, tudo indica que esta estirpe possua pelo menos duas β-Lactamases

distintas: uma TEM-1, (devido à presença de de vários plasmídeos multicópias ou

devido à existência de hiperexpressão resultante de mutações no promotor) e uma

AmpC hiperproduzida (desreprimida).

Já foi descrita em Portugal, uma estirpe de E. coli, proveniente de um cão, a qual

apresentava um perfil de resistência semelhante, mas os valores de MIC eram algo

inferiores e, era intermédia para o meciliname (Féria et al, 2002).

No entanto, atendendo a que, alterações das porinas e a impermiabilidade devido à

presença de bombas de extrusão são muito raras em E. coli, para além da presença de

TEM-1 e AmpC, o terceiro mecanismo provável, será uma alteração nas PBP-2, facto

evidenciado pela resistência ao meciliname (Vaz-Pato, 1989; Sougakof & Jarlier, 2000).

Igualmente provável será a existência de uma OXA-3, a qual explicaria a resistência ao

meciliname (Sougakof & Jarlier, 2000).

Assim, a estirpe 1953 terá três mecanismos essenciais de resistência às β-Lactaminas:

(1) Produção de TEM-1, (2) hiperexpressão de AmpC e (3) alterações nas PBP-2 ou

produção de OXA-3.

11. CONCLUSÃO

A ITU em cães causada por estirpes resistêntes pode provocar a fácil disseminação

destas na comunidade canina fundamentalmente, devido ao comportamento social

destes animais. Por outro lado, a Organização Mundial de Saúde relatou em 2001 um

aumento do número de animais de estimação nos países Europeus (Sociedade Protectora

dos Animais, 2002).

31

O contacto íntimo entre os animais de estimação e o Homem, o aumento da resistência

em estirpes de E. coli e o crescente número de estudos sugerindo a zoonose, contribuem

para um aumento da preocupação relativamente à Saúde Pública.

Não existe qualquer evidência que demonstre que as estirpes de E. coli encontradas no

ambiente sejam diferentes da Humanas, antes pelo contrário, clones de E. coli

Humanos, animais e ambientais foram demonstrados como indistinguíveis. Sabe-se

também que E. coli é o principal portador de factores de resistência multipla

transferíveis, na flora fecal Humana (österblad et al, 2000).

As descargas no ambiente de estirpes resistentes e antibióticos provenientes de

hospitais, explorações pecuárias e agricolas têm aumentado. Os rios, como principais

receptores dos efluentes urbanos e, principais fontes de água, quer para as populações

Humanas, como para as explorações agricolas e pecuárias, podem contribuir para a

manutenção ou mesmo aumento dos níveis de resistência nas Enterobactereaceae

(Go�i-Urriza et al, 2000).

Um biofilme é uma população de células a crescer numa superficie, dentro de uma

matriz de exopolissacarideos. Esta matriz pode restringir a difusão de moléculas

nomeadamente, antibióticos, elevando os níveis de resistência (Lewis, 2001; Anderl,

Franklin & Stewart, 2000).

Existem duas teorias que consubstânciam o aumento da resistência devido à presença de

biofilmes: (1) apenas as camadas superficiais do biofilme se encontram expostas a

concentrações letais de antibiótico devido à barreira difusional, a qual limita o

transporte do antibiótico para o biofilme (Anderl, Franklin & Stewart, 2000); (2) a

difusão retardada permite uma acção mais rápida de enzimas como as β-Lactamases,

destruindo mais rapidamente o antibiótico (Lewis, 2001).

De acordo com um relatório publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde, nos Estados

Unidos da América, mais de 60% de todas as infecções bacterianas são causadas por

biofilmes, onde se inclui a ITU (Lewis, 2001).

32

Considerando que os dados de susceptibilidade in vitro podem estar a ser erroneamente

correlacionados com o comportamento bacteriano in vivo, subestimando a presença de

biofilmes, é possível que muitas prescrições de terapia antibacteriana apenas contribuam

para um aumento dos níveis de resistência (Blondeau & Vaughan, 2000).

A resistência aos antibióticos revela-se como uma ameça crescente para a Saúde

Pública, sendo necessário aperfeiçoar os sistemas de vigilância epidemiológica, de

modo a permitir a identificação, caracterização e conteção de doenças infecciosas e o

aumento da taxa de resistência.

12. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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