Autoinmunidad en la Diabetes Mellitus

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Sesion de Actaualización sobre el papel de los diversos marcadores de Autoinmunidad en la Diabetes Mellitus

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  • AUTOINMUNIDAD EN LA

    DIABETES MELLITUS

    PERSPECTIVA DESDE EL

    LABORATORIO

    M Teresa Herrera del Rey

    Unidad de Gestin Clnica de Laboratorios

    HH.UU Virgen del Roco Sevilla

  • I ) Diabetes tipo 1:

    A. Inmunomediada

    B. Idioptica

    II ) Diabetes tipo 2

    III) Otros tipos especficos:

    1.- Defectos genticos de la funcin de la clula (MODY, mitocondrial)

    2.- Defectos genticos de la accin de la insulina

    3.- Enfermedades del pncreas exocrino

    4.- Endocrinopatas

    5.- Inducida por frmacos

    6.- Infecciones

    7.- Formas no comunes de diabetes inmunomediada

    8.- Otros sndromes genticos asociados ocasionalmente con diabetes

    IV ) Diabetes gestacional

    CLASIFICACIN ETIOLGICA DE DIABETES MELLITUS

  • DIABETES TIPO 1 AUTOINMUNE

  • En 1998 se presentan los resultados del estudio UKPDS:

    Seguimiento de 5000 pacientes con DM tipo 2 durante 20 aos. Relacin entre control intensivo de glucemia y morbi-mortalidad.

    HALLAZGO: 7.5-10% de los pacientes diagnosticados de DM tipo 2 presentaron autoanticuerpos positivos ( anti- GAD e IA-2 ), no obesos y

    con pocas manifestaciones de sndrome metablico.

    Edad < 50 aos

    Sntomas agudos

    IMC

  • T1D onset

  • PREDICCIN RIESGO DIABETES

    Marcadores genticos Sistema de antgenos humanos

    HLA: DR3/4 y DQ2/8 (2,4% desarrollan ICAs + antes de los 5 aos) (No defecto gentico sino variantes de genes)

    Pruebas metablicas Test tolerancia glucosa Hemoglobina glicosilada (>6,5%) Medicin de autoanticuerpos

  • AUTOANTICUERPOS EN LA DIABETES

    ANTI ISLOTES PANCRETICOS (ICA)

    ANTI INSULINA

    ANTI GLUTAMATO DESCARBOXILASA (GADA)

    ANTI TIROSINA FOSFATASA (IA-2)

    TRANSPORTADOR ESPECFICO DE Zn T8

  • ANTICUERPOS CONTRA ANTGENOS DEL CITOPLASMA DE LAS CLULAS DE LOS ISLOTES PANCRETICOS (ICA)

    Descubiertos en 1974 (Bottazzo et al. Lancet)

    Positivos en aprox. 80% pacientes con diabetes mellitus

    (DM) tipo1 recin diagnosticada

    Disminuyen conforme merma el funcionamiento de los

    islotes

    Tipo IgG

  • Inmunofluorescencia indirecta (IFI)

    Conjugado

    anti-hIgG /

    fluorocromo

    Analito

    Ej.: ICA

    Luz

    UV

    Tejido

    Ej.: Pncreas Islotes Acinos

  • Deteccin de ICA mediante inmunofluorescencia

    indirecta sobre un corte de pncreas.

  • ANTI INSULINA IAA

    Anticuerpos frente a la insulina (previo a la

    administracin de insulina)

    Palmer et al (1983) describieron la presencia

    de anticuerpos contra la insulina en el 50% de

    pacientes de diagnstico reciente (RIA)

    Su frecuencia estaba asociada a la edad:

    nios, sobre todo menores de 10 aos (RIA)

  • Informes contradictorios sobre su prevalencia y

    valor pronstico que parecen debidos a la diferente

    metodologa utilizada para su medicin

    Los que se miden por RIA se encuentran ms

    vinculados a la enfermedad

    Los que se miden por ELISA no sirven para el

    diagnstico de la Diabetes Mellitus, s para el

    diagnstico de las hipoglucemias autoinmunes.

    ANTI INSULINA IAA

  • ANTI DESCARBOXILASA DEL CIDO GLUTMICO (GAD)

    Especficos contra enzima glutamato

    decarboxilasa, sntesis del neurotransmisor

    inhibidor cido gamma-amino-butrico (GABA)

    Dos genes GAD:

    GAD1: se traduce en protena GAD67 (islotes de ratn)

    GAD2 (cromosoma 10): protena GAD65 (islotes cl. humanos)

  • ANTI DESCARBOXILASA DEL CIDO GLUTMICO (GAD)

    Ms del 70% de los pacientes de reciente

    diagnstico tienen niveles positivos despus 10

    aos

    El GAD debe ser considerado como la primera

    herramienta de screening.

    En DM tipo 2 distinguen a los pacientes que

    necesitan insulina (LADA) (Van Deutekom y cols.

    Diabet Med.2088;25:117-25)

  • ANTI TIROSINA FOSFATASA DE MEMBRANA IA-2

    ICA-512

    Glicoprotena transmembrana perteneciente a la

    familia de las protenas tirosina fosfatasa, localizada

    en los grnulos secretores densos de las clulas

    endocrinas secretoras de protenas y las neuronas

    Favorece unin de los grnulos secretores al cito-

    esqueleto: activa transporte celular y la exocitosis

  • ANTI TIROSINA FOSFATASA DE MEMBRANA IA-2

    Son los de mayor valor predictivo positivo (VPP)

    Su presencia en la fase preclnica en nios predice

    progresin a diabetes clnica (Grise y cols.

    Diabetologia 2010; 53:517-524)

    Mtodo de determinacin: RIA y ELISA

  • Inmunoanlisis con reactivos marcados

    - Con compuestos radiactivos:

    RIA heterogeneo competitivo

    IRMA heterogeneo no competitivo

    - Con enzimas: Enzimoinmunoanlisis Peroxidasa, fosfatasa alcalina, Glucosa 6-fosfato, deshidrogenasa, B- galactosidasa...

    Ventajas ELISA

    Disponibles comercialmente

    Se pueden conjugar por tcnicas simples

    Tienen varios sustratos

    No se utiliza radiactividad (problema de desechos,etc)

  • En nuestro laboratorio realizamos como apoyo al diagnstico del

    debut diabtico:

    Ac. Anti GAD

    Ac. IA-2

    Mtodo de determinacin

    mediante ELISA en

    microplaca.

    Analizador Triturus (Grifols)

  • IA-2

    Incubacin 16-20 h

    IA2 - biotina

    Lavado

    Streptavidina -

    Peroxidasa

    TMB

    Streptavidina -

    Peroxidasa

    Streptavidina -

    Peroxidasa

    Lavado

    450 nm

    A - [C] ELISA IA-2

  • MODELOS ELISA

    MATRIZ

    Pocillo de la

    micro placa

    INSULINA

    Analito: IAA

    anti-IgG

    humana

    conjugado

    con

    peroxidasa

    Mab anti-IgG

    humana

    Conjugado

    anti-rIg /

    peroxidasa

    ELISA convencional aELISA (amplificado)

    Ag

    absorbido

    a la

    superficie

    Sustrato tetra metil

    bencidina (TMB)

  • Expresin de Trx-GAD en E. coli

    Obtencin de la

    fraccin

    intracelular soluble

    Trx-GAD-biotina Biotinilacin

    Determinacin de GADA

    Marcacin de la Trx-GAD recombinante con biotina

    ELISA Ag-especfico (Ae-ELISA)

    Trx-GAD

    Trx-GAD-biotina

    Avidina-Px

    Purificacin

    Thio-Bond

    Resin

    *

    Trx-GAD *

    GADA

    Se utiliza como

    LIGANDO un

    CONJUGADO

    GADA65-BIOTINA

    (IA-2-BIOTINA)

  • Funcin: transportar zinc desde el citoplasma

    de las clulas beta al interior del grnulo de

    secrecin

    Es el principal autoantgeno descubierto en los

    ltimos 10 aos

    Transportador de Zn T8

  • Especfico de clulas beta

    Aporta informacin complementaria al

    resto de los autoanticuerpos, aumentando

    el porcentaje de deteccin

    Mtodo de determinacin: RIA y ELISA

    Transportador de Zn T8

  • IAA: RESULTADOS DISCORDANTES ENTRE RIA

    Y ELISA

    La comparacin frecuente de los mritos relativos de los

    mtodos radiactivos y enzimticos es bsicamente errnea, ya

    que los principios que rigen estos ensayos son diferentes

    R. Ekins, 1980

  • Conocer la prevalencia de auto-anticuerpos anti-GAD, anti-IA-2 y anti-insulina en el debut de la diabetes mellitus en nuestro medio, medidos mediante tcnica ELISA.

    Valorar su papel como apoyo diagnstico.

    OBJETIVOS

  • MATERIAL Y METODOS

    Estudio observacional descriptivo para determinacin de prevalencia y valoracin de pruebas diagnsticas

    Muestra 111 pacientes debut diabtico: 61 DM tipo 1 (incluye 12 casos DM tipo LADA (Latente Autoinmune del Adulto), 50 DM tipo 2. Grupo control de 64 personas no diabticas.

    Enzimoinmunoanlisis en micro placa: Glutamic Acid Decarboxylase (GAD) Autoantibody ELISA kit from RSR (RSR Limited), IA-2 Autoantibody ELISA versin 2 kit from RPR y AESKULISA Insulin-G (AESKU DIAGNOSTICS) para IAA.

    Criterio (+): GADA >5 U/ml, IA-2 >7,5 U/ml e IAA >15 U/ml.

    Anlisis estadsticos mediante paquete PASW Statistics versin 18.

  • RESULTADOS

  • PREVALENCIA AUTOANTICUERPOS EN DIABETES MELLITUS DE INICIO

    RESULTADOS

    0,0

    10,0

    20,0

    30,0

    40,0

    50,0

    60,0

    70,0

    80,0

    %

    Figura 1. Grfico de frecuencias

    Anti-GAD 78,7 2,0 7,8

    Anti-IA2 31,7 4,0 3,1

    IAA 10,3 6,0 1,7

    DM 1 DM 2 Control

  • VALORES MEDIANAS AUTOANTICUERPOS

    Muestra Medianas (U/ml) Percentil 25-75

    Control 2.59 1.88 3.54

    GAD DM 1 108.00 4.56 304.00

    DM 2 1.84 1.54 2.64

    Control 5.16 4.56 5.70

    IA2 DM 1 6.05 5.28 264.50

    DM 2 5.21 4.73 5.73

    Control 2.22 1.39 4.05

    IAA DM 1 3.17 2.04 5.75

    DM 2 3.72 1,69 5.84

    GAD IA2 IAA

    Control - DM 1 P< 0.0001 P< 0.0001 P = 0.0309

    Control - DM 2 P = 0.0176 P = 0.3269 P = 0.0196

    DM 1 - DM 2 P< 0.0001 P = 0.0002 P = 0.5850

    0

    20

    40

    60

    80

    100

    120

    Grfico 2. Medianas

    CONTROL 2,58 5,16 2,22

    DM 1 108 6,05 3,17

    DM 2 1,83 5,26 3,84

    GAD IA2 IAA

    RESULTADOS

  • CURVAS ROC (RECEIVER

    OPERATING

    CHARACTERISTICS)

    RESULTADOS

  • La diabet