Aus dem Institut für Zelluläre und Molekulare Physiologie

der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. Christoph Korbmacher

Funktionelle Charakterisierung der βV348M-Mutation des

epithelialen Natriumkanals (ENaC)

Inaugural-Dissertation zur

Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der

Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Daniel Söll

aus

Bayreuth

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. Jürgen Schüttler

Referent: Priv.-Doz. Dr. med. Robert Rauh

Korreferent: Prof. Dr. med. Christoph Korbmacher

Tag der mündlichen Prüfung: 05. Juni 2013

Meiner Familie

Inhalt

1. Zusammenfassung 1

1.1 Hintergrund und Ziele 1

1.2 Methoden 1

1.3 Ergebnisse 1

1.4 Praktische Schlussfolgerungen 2

2. Summary 3

2.1 Background and Aim of the Study 3

2.2 Methods 3

2.3 Results 3

2.4 Conclusion 3

3. Einleitung 4

3.1 Zystische Fibrose (CF) 4

3.2 Struktur von ENaC 5

3.3 Lokalisation und Funktion von ENaC 7

3.4 Pathophysiologie des Lungenphänotyps bei CF 10

3.5 Zielsetzung der Arbeit: funktionelle Charakterisierung der βV348M-

Mutation 12

4. Material und Methoden 13

4.1 Xenopus laevis Oozyten als heterologes Expressionssystem 13

4.2 Lösungen und Chemikalien 15

4.3 cRNA-Herstellung 16

4.4 Isolation und Injektion der Oozyten 16

4.5 Elektrophysiologische Methoden 18

4.5.1 Zwei-Elektroden-Spannungsklemme 18

4.5.2 Messablauf 19

4.6 Proteinnachweis 20

4.6.1 Nachweis membranständiger Proteine durch Biotinylierung 20

4.6.2 Proteinnachweis durch Western Blot 22

4.7 Statistik 23

5. Ergebnisse 24

5.1 Die βV348M-Mutation stimuliert den ENaC-vermittelten Na+-Strom 24

5.2 Der stimulatorische Effekt der βV348M-Mutation ist vom Na+-Gehalt

der Oozyten weitgehend unabhängig 26

5.3 Die βV348M-Mutation erhöht die mittlere Po von ENaC 27

5.4 Chymotrypsin stimuliert αβγENaC mehr als αβV348MγENaC 30

5.5 Die βV348M-Mutante wird durch S3969 weniger aktiviert als der

Wildtyp 32

5.7 Verschiedene Mutationen an βV348 36

5.7.1 Aminosäure-Mutationen zeigen unterschiedliche Effekte auf die ENaC-Funktion 36

5.7.2 Effekte der Mutationen auf die Proteinexpression 38

5.7.3 Proteolytische Aktivierung der mutierten Kanäle mit Chymotrypsin 41

6. Diskussion 43

6.1 Xenopus laevis Oozyten als heterologes Expressionssystem 43

6.2 Einflüsse der cRNA-Qualität 44

6.3 Einfluss der intrazellulären Na+-Konzentration 45

6.4 Mittlere Po 45

6.5 Proteolytische Kanalaktivierung mit Chymotrypsin 47

6.6 ENaC-Aktivator S3969 48

6.7 Weitere βV348-Mutanten und ENaC-Modell 49

6.8 Klinische Relevanz der βV348M-Mutation 52

7. Schlussfolgerung 54

8. Literaturverzeichnis 55

9. Abbildungsverzeichnis 62

10. Abkürzungsverzeichnis 63

10.1 Abkürzungen 63

10.2 Nomenklatur der Aminosäuren 65

10.3 Einheiten 65

11. Vorveröffentlichungen 66

12. Anhang 67

13. Danksagung 68

14. Lebenslauf 70

1

1. Zusammenfassung

1.1 Hintergrund und Ziele

Bei einigen Patienten mit atypischer zystischer Fibrose (CF) ist nur ein oder

kein Allel des „cystic fibrosis transmembrane conductance regulator“ (CFTR)-

Gens mutiert, das einen Chloridkanal kodiert. Mutationen des epithelialen Na+-

Kanals (ENaC) könnten zur Pathophysiologie der CF in diesen Patienten

beitragen. Das Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung einer

Mutation in der β-Untereinheit von ENaC (βV348M), die kürzlich in einem

Patienten mit CF-ähnlichen Symptomen identifiziert wurde.

1.2 Methoden

αβγENaC (Wildtyp) und αβV348MγENaC (βV348M-Mutante) wurden in Xenopus

laevis Oozyten als heterologem Expressionssystem exprimiert. Die ENaC-

Aktivität wurde durch die Messung des Amilorid-sensitiven Ganzzellstroms

(ΔIAmi) mit der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme bestimmt. Die Expression

von ENaC in der Zellmembran wurde durch Biotinylierung, Western Blot und

densitometrische Auswertung der Signale untersucht.

1.3 Ergebnisse

ΔIAmi erwies sich in αβV348MγENaC exprimierenden Oozyten um durchschnittlich

~40% höher als in αβγENaC exprimierenden Oozyten. Während die Expression

in der Zellmembran von Wildtyp und Mutante ähnlich war, zeigte sich eine

erhöhte mittlere Offenwahrscheinlichkeit (Po) des Wildtyps gegenüber der

Mutante (~0,33 vs. ~0,24). Diesem Ergebnis entsprechend war die

proteolytische Aktivierung durch Chymotrypsin im mutierten Kanal gegenüber

dem Wildtyp reduziert (~3-fach vs. ~4,2-fach). Der stimulatorische Effekt des

ENaC-Aktivators S3969 auf den mutierten Kanal war im Vergleich zum Wildtyp

in ähnlicher Weise reduziert (~2,6-fach vs. ~3,5-fach). Die funktionelle

Expression verschiedener βV348-Mutanten in Oozyten in Verbindung mit der

Computer-gestützten Analyse eines virtuellen ENaC-Modells lässt vermuten,

dass die βV348M-Mutation die Po des Kanals durch die Destabilisierung des

geschlossenen Kanal-Zustands erhöht.

2

1.4 Praktische Schlussfolgerungen

Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass der funktionssteigernde Effekt der

βV348M-Mutation zu einer unangemessen hohen Resorption von Natrium und

Flüssigkeit im Respirationstrakt führt und dadurch zur Pathophysiologie der CF-

Symptomatik bei betroffenen Patienten beiträgt.

3

2. Summary

2.1 Background and Aim of the Study

In some patients with atypical cystic fibrosis (CF) only one or no allele of the

cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene is affected

which codes for a chloride channel. Mutations of the epithelial sodium channel

(ENaC) may contribute to the pathophysiology in these patients. The aim of the

present study was to functionally characterize a mutation in the β-subunit of

ENaC (βV348M) recently identified in a patient with severe CF-like symptoms.

2.2 Methods

Wild-type (wt) αβγENaC or mutant αβV348MγENaC was expressed in Xenopus

laevis oocytes and ENaC function was assessed by measuring the amiloride

sensitive whole-cell current (ΔIami) with two-electrode voltage-clamp. ENaC cell

surface expression was evaluated by biotinylation, Western Blot and

subsequent densitometric analysis of the signals.

2.3 Results

ΔIami was on average ~40% higher in mutant ENaC than in wt ENaC expressing

oocytes. Whereas surface expression of wt and mutant ENaC were similar,

average channel open probability (Po) of wt ENaC was higher than that of

mutant ENaC (~0.33 vs. ~0.24). In agreement with that result, proteolytic

activation by chymotrypsin was reduced in mutant ENaC compared to that of wt

ENaC (~3fold vs. ~4.2fold). Similarly, the ENaC activator S3969 stimulated

mutant ENaC currents to a lesser degree than wt ENaC currents (~2.6fold vs.

~3.5fold). Functional expression of different βV348 mutants in oocytes in

combination with computational channel modeling suggests that the βV348M

mutation increases channel Po by destabilizing the closed channel state.

2.4 Conclusion

The findings indicate that the gain-of-function effect of the βV348M mutation

may contribute to CF pathophysiology by inappropriately increasing sodium and

fluid absorption in the respiratory tract.

4

3. Einleitung

3.1 Zystische Fibrose (CF)

Die Zystische Fibrose (Mukoviszidose) stellt die häufigste letale genetische

Erkrankung der hellhäutigen Bevölkerung dar. Sie wird autosomal rezessiv

vererbt und beruht im Regelfall auf zwei mutierten Allelen des CFTR-Gens [39,

57]. Das CFTR-Gen kodiert für einen Cl--Kanal in diversen Epithelien [63].

Mutierte CFTR-Kanäle verursachen letzten Endes eine geringere Leitfähigkeit

für Cl-, was den transepithelialen Chloridtransport beeinträchtigt. Dies hat in

sekretorischen Epithelien zur Folge, dass die epithelialen Sekrete eine erhöhte

Viskosität aufweisen, was zu den Symptomen der CF beiträgt, die auch als

Mukoviszidose bezeichnet wird.

Zu den pulmonalen Symptomen der CF zählen chronische Bronchitiden und

Pneumonien mit irreversiblem Umbau des Lungengerüsts. Dieser Umbau wird

durch die chronische Besiedlung des zähen Schleims in der Lunge mit

Pseudomonas aeruginosa und/oder Staphylococcus aureus verursacht. Zum

CF-Symptomkomplex gehören auch gastrointestinale Symptome wie ein

Mekoniumileus, Darmobstruktionen, Diarrhö, Obstipation und Leber- und

Gallenwegsdysfunktionen (Leberzirrhose, Gallensteine). Außerdem kommt es

häufig zur exokrinen aber auch endokrinen Pankreasinsuffizienz, was zur

Proteinmangelernährung, Gedeihstörung (auch durch die chronische

Lungenaffektion verstärkt) und Diabetes mellitus führen kann. Auch eine durch

abnorme Sekretbildung in den Samenwegen verursachte Infertilität bei

männlichen Patienten zeigt eine hohe Prävalenz [52]. Hierbei handelt es sich

um ein breites Symptomspektrum, dass von Patient zu Patient sehr heterogen

ausgeprägt ist. Es gibt Patienten, die fast alle klassischen Symptome

aufweisen, während andere nur eine sehr milde Verlaufsform zeigen [18].

In den Ausführungsgängen der Schweißdrüsen führt eine gestörte CFTR-

Funktion zu einer verminderten Chloridresorption und dadurch zu einer

erhöhten Chloridkonzentration im Schweiß. Die Bestimmung der

Chloridkonzentration im Schweiß gehört daher zur Diagnostik bei Verdacht auf

CF. Man unterscheidet zwei unterschiedliche Entitäten der CF. Bei einer

Chlorid-Konzentration über 60 mmol/l spricht man von klassischer bzw.

typischer CF, bei einer Konzentration von 30-60 mmol/l (Borderline) oder sogar

5

unter 30 mmol/l (Normalbereich) von nicht-klassischer oder atypischer CF,

wenn gleichzeitig in mindestens einem Organsystem für die CF typische

Symptome auftreten. Die Einteilung in diese Kategorien gestaltet sich aber

aufgrund des Kontinuums an Symptomen schwierig [18]. Die Diagnose CF wird

mit Tests auf Mutationen im CFTR-Gen gesichert [18].

Die große Heterogenität an Symptomen und eine schwache Genotyp-Phänotyp

Beziehung ließen die Existenz von modifizierenden Genen („Modifier genes“) in

der Pathogenese der CF vermuten [17]. So konnten die für die β- und γ-

Untereinheit des epithelialen Natrium Kanals (ENaC) kodierenden Gene als

potentielle „Modifier“-Gene identifiziert werden [67].

Typische CF-Symptome können auch dann auftreten, wenn im CFTR-Gen kein

oder nur ein Allel eine Mutation aufweist [18, 51]. In manchen Patienten mit

einer milden Ausprägung der Krankheit wurde eine solche Konstellation der

Gene gefunden [3, 64].

Dies führte zu der Fragestellung, ob diese Patienten Mutationen in den für

ENaC kodierenden Genen aufwiesen. Tatsächlich konnten bei Patienten mit

atypischer CF und keinem [3, 64] oder nur einem [3] betroffenen CFTR-Allel

Mutationen in den für ENaC kodierenden Genen identifiziert werden.

3.2 Struktur von ENaC

Der epitheliale Natriumkanal (ENaC) gehört zur Familie der nicht

spannungsabhängigen ENaC/Degenerin-Ionenkanäle [38]. Er besteht aus den

drei Untereinheiten α, β und γ [38, 56]. Die Homologien der Aminosäurenketten

der Untereinheiten belaufen sich auf ca. 30-40% [11, 38, 56]. Strukturell bilden

die drei Untereinheiten vermutlich ein Heterotrimer in der Zellmembran aus

(Abb. 1). Das lässt sich von der erst veröffentlichten Kristallstruktur des

verwandten „acid sensing Ion channel 1“ (ASIC 1) ableiten [10, 35, 68]. Die

Untereinheiten besitzen eine Länge von 669 (α), 640 (β) bzw. 649 (γ)

Aminosäuren und gliedern sich in jeweils zwei Transmembrandomänen, eine

ausgedehnte extrazelluläre Schleife und jeweils einen intrazellulär gelegenen

Amino (N)- und Carboxy (C)-Terminus [38]. Interessanterweise existiert beim

Menschen im Gegensatz zu Maus und Ratte eine zusätzliche δ-Untereinheit,

deren Funktion jedoch noch weitestgehend ungeklärt ist [30, 73].

6

Abb. 1: Struktur von ENaC in der Zellmembran. ENaC ist als Heterotrimer, bestehend aus α-

(rot), β- (gelb), und γ-Untereinheit (blau), dargestellt. M1 bzw. M2 kennzeichnen die

Transmembrandomänen, N und C entsprechend Amino(N)- bzw.- Carboxy(C)-Terminus der

Untereinheiten.

Der Versuch, ENaC zu kristallisieren, gelang bis heute nicht, so dass dessen

Struktur noch nicht endgültig geklärt werden konnte.

Auf Homologie basierende Modellberechnungen, die sich an der bekannten

Kristallstruktur des aus der gleichen Ionenkanal-Familie wie ENaC stammenden

ASIC 1 Ionenkanals orientieren [35, 68], liefern die bisher beste molekulare

Darstellung der Kanalstruktur von ENaC.

Für die vorliegende Arbeit wurde ein entsprechendes Homologie-Modell von

Prof. Heinrich Sticht (Abteilung für Bioinformatik, Institut für Biochemie,

Universität Erlangen-Nürnberg) entworfen, das den Kanal vermutlich im

geschlossenen Zustand darstellt. In diesen Berechnungen wurde insbesondere

die molekulare Mikrodomäne in der Umgebung der Aminosäure V348 der β-

Untereinheit analysiert, die im Fokus dieser Arbeit steht. Die strukturelle

Analyse des aus einem Trimer der Untereinheiten α, β und γ bestehenden

ENaC-Modell lässt vermuten, dass V348 der β-Untereinheit in einer

kugelförmigen Domäne, der sogenannten „palm“-Domäne liegt. Die „Palm“-

Region befindet sich in der Nähe der Zellmembran (Abb. 2).

7

Abb. 2: ENaC-Modell (mod. nach [55]). A, Trimer aus den drei Untereinheiten α, β und γ in

der geschlossenen Konformation. Die β-Untereinheit ist blau gefärbt, die Aminosäuren V348

und M90 sind im Kalottenmodell dargestellt. B, Struktur der β-Untereinheit. Der Aufbau in

Domänen ist farblich hervorgehoben. Die verschiedenen ENaC-Domänen sind entsprechend

der von Stockand et al. [68] verwendeten Terminologie benannt und folgendermaßen gefärbt:

Transmembran-Domäne (rot), „Palm“-Domäne (gelb), „β-Ball“-Domäne (braun), „Finger“-

Domäne (Magenta), „Knuckle“-Domäne (cyan), und „Thumb“-Domäne (grün).

3.3 Lokalisation und Funktion von ENaC

ENaC wird in vielen unterschiedlichen Geweben des menschlichen Körpers

exprimiert. So lässt sich zum Beispiel in Epithelzellen Na+-resorbierender

Gewebe eine starke Expression von ENaC nachweisen, wie im distalen Kolon

[20, 25] oder in Schweiß- [61] und Speicheldrüsen [20].

ENaC wird außerdem in der apikalen Membran der Tubuluszellen des

Aldosteron-sensitiven distalen Nephron (ASDN) der Niere exprimiert. Das

ASDN umfasst den Endabschnitt der Pars convoluta des distalen Tubulus, den

Verbindungstubulus und das Sammelrohr. Dort ist ENaC entscheidend am

transepithelialen Na+-Transport beteiligt (Abb. 3). Voraussetzung für die Na+-

Resorption ist der primär aktive Transport von Na+-Ionen über die basolaterale

Membran ins renale Interstitium durch die Na+/K+-ATPase. Im Gegenzug

transportiert die Na+/K+-ATPase K+-Ionen aus dem Interstitium in die Zellen.

A B

8

ROMK

Abb. 3: Von ENaC vermittelter Na+-Transport durch eine Hauptzelle im ASDN.

Die K+-Ionen rezirkulieren aus der Zelle ins Interstitium über basolaterale

Kaliumkanäle, wodurch ein negatives Membranpotential aufrecht erhalten wird.

Die niedrige intrazelluläre Na+-Konzentration und das negative

Membranpotential generieren den elektrochemischen Gradienten für den

ENaC-vermittelten Einstrom der Na+-Ionen aus dem Tubuluslumen in die

Tubuluszelle. Dabei ist die Aktivität von ENaC ratenlimitierend für die Na+-

Resorption und ist daher von entscheidender Bedeutung für die Feinregulation

des Na+-Haushaltes und des extrazellulären Flüssigkeitsvolumens und somit für

die langfristige Einstellung des arteriellen Blutdrucks [1, 28, 38, 59]. Aufgrund

des Na+-Einstroms depolarisiert die apikale Membran, was eine „Lumen-

negative“ transepitheliale Potentialdifferenz zur Folge hat, die umso negativer

ist, je aktiver ENaC ist. Diese transepitheliale Potentialdifferenz fördert die

parazelluläre Resorption von Cl- Ionen und die Sekretion von K+-Ionen über

apikale Kaliumkanäle vom Typ des „renal outer medullary“-Kaliumkanals

(ROMK) [50, 75]. Im Endeffekt kommt es bei einer entsprechenden Aktivität von

ENaC zu einer Resorption von Na+- und Cl--Ionen und bei entsprechender

Wasserpermeabilität aufgrund der osmotischen Triebkraft auch zu einer

Wasserresorption [38].

9

Die physiologische Bedeutung von ENaC in der Niere wird durch zwei

genetische Erkrankungen unterstrichen, das Liddle-Syndrom und den

Pseudohypoaldosteronismus Typ I (PHA 1). Die Ursachen dieser

Fehlfunktionen liegen jeweils in Mutationen in einem der für die ENaC-

Untereinheiten kodierenden Gene. Die Erkrankungen sind zwar selten, zeigen

aber direkt, dass molekulare Dysfunktionen in ENaC gravierende

Krankheitssymptome nach sich ziehen können.

Das Liddle-Syndrom stellt eine Form der sekundären arteriellen Hypertonie dar,

welche ursächlich auf einer funktionssteigernden Mutation, einer sog. “gain-of-

function“-Mutation, in ENaC beruht und dadurch zu gesteigerter Na+- und

Wasser-Resorption führt. Auch eine Hypokaliämie und metabolische Alkalose

ist bei den betroffenen Patienten nachzuweisen [65].

Der PHA I wird dagegen durch funktionseinschränkende Mutationen, sog. “loss-

of-function“-Mutationen, in ENaC ausgelöst und führt dadurch zu beträchtlichem

renalen Salzverlust. Dieser geht mit einer Hyperkaliämie, metabolischer

Azidose und arterieller Hypotension einher [13, 38].

Im respiratorischen Epithel ist ENaC ebenfalls von entscheidender Bedeutung

für die Salz- und Flüssigkeitsresorption [7, 26, 34, 70]. ENaC reguliert dadurch

die Höhe und Viskosität des das Lungenepithel bedeckenden Flüssigkeitsfilms,

der sogenannten „Airway surface liquid“ (ASL). Die ASL besteht aus einer die

Zilien umgebenden flüssigen bzw. gelartigen Schicht, dem sogenannten

„periciliary layer“ (PCL), und dem darauf schwimmenden Mukus. Diese

Schleimschicht schützt vor Austrocknung. Außerdem werden in ihr inhalierte

Partikel und Bakterien „gefangen“. Diese werden dann zusammen mit dem

Schleim von den Zilien des Respirationsepithels zum Pharynx transportiert, wo

der Schleim durch Husten oder Schlucken aus dem Respirationstrakt entfernt

wird. Diesen Prozess nennt man mukoziliäre Clearance und er sorgt für die

Reinigung von inhalierten Partikeln [8].

Das Volumen der ASL ist für die mukoziliäre Clearance entscheidend. Es wird

von CFTR und ENaC in entgegengesetzter Weise reguliert (Abb. 4). Die Cl--

Sekretion mittels CFTR und in geringerem Ausmaß mittels auswärts

gleichrichtenden Ca2+-aktvierten Cl--Kanälen erhöht die Osmolarität der ASL

und fördert dadurch die Flüssigkeitssekretion. ENaC wirkt diesem Effekt von

CFTR entgegen, indem mittels Na+-Resorption und osmotisch folgender

Wasser-Resorption die Höhe der ASL gesenkt wird [6, 12].

10

Abb. 4: Regulation und Fehlregulation der ASL. Links ist die physiologische Situation mit

normaler CFTR- und ENaC-Funktion dargestellt. Die für die Ausprägung des CF-

Lungenphänotyps typische Verringerung der Höhe der ASL kann auf einer CFTR-Unterfunktion

(Mitte) oder auf einer ENaC-Überfunktion (rechts) beruhen.

3.4 Pathophysiologie des Lungenphänotyps bei CF

Die exakte Regulation der Höhe der ASL ist eine wichtige Voraussetzung für

eine angemessene Abwehrfunktion der Lunge. Die Abnahme des

Wassergehalts der ASL führt zur Reduktion der Höhe der ASL und zur Bildung

eines visköseren Mukus. Zusätzlich wird die Zilienbewegung behindert. Die

Folge ist eine Verschlechterung der mukoziliären Clearance [42], wodurch die

chronische Besiedlung mit pathogenen Keimen begünstigt wird, was zur

Pathophysiologie der pulmonalen Symptome bei Patienten mit zystischer

Fibrose (CF) maßgeblich beiträgt. So wurde in Zellkulturen von menschlichen

Epithelzellen des Respirationstraktes von gesunden Spendern eine Höhe des

PCL von etwa 7 µm nachgewiesen, was interessanterweise der Höhe von

„gestreckten“ Zilien entspricht. Der PCL von Epithelzellen von CF-Patienten war

dagegen stark reduziert (~3 µm) [49].

Am häufigsten liegt der Ausbildung von pulmonalen Symptomen bei CF eine

Verringerung der CFTR-Funktion zugrunde (Abb. 4). Defekte CFTR-Kanäle

reduzieren die Cl--Sekretion und dadurch die Höhe der ASL. Seit der

erfolgreichen Klonierung von CFTR und dem Nachweis, dass CFTR die

Funktion eines Chloridkanals hat, wird CF als Krankheit angesehen, die

hinsichtlich der pulmonalen Symptomatik vor allem auf einer gestörten Cl--

Sekretion beruht.

11

Nach neueren Erkenntnissen kann aber auch eine erhöhte ENaC-Funktion zur

pulmonalen Pathophysiologie von CF beitragen [5, 6]. Eine vermehrte ENaC-

Aktivität im respiratorischen Epithel führt durch gesteigerte Na+- und

Flüssigkeitsresorption zur Verringerung der ASL (Abb. 4). So zeigten Mall et al.

[47] in transgenen Mäusen, in denen eine Überexpression der β-Untereinheit

von ENaC induziert wurde, dass eine Überfunktion von ENaC zu einer CF-

ähnlichen Lungenaffektion mit verminderter ASL und fehlerhaftem Mukus-

Transport führt. Interessanterweise konnte in diesen Mäusen durch präventive

Behandlung mit Amilorid die Morbidität und Mortalität gesenkt werden [76].

Diesem Effekt liegt vermutlich die Hemmung von ENaC durch Amilorid, einem

spezifischem ENaC-Inhibitor (Abb. 3), zugrunde. Ganz ähnliche Effekte wurden

auch in Knock-out Mäusen für die Ubiquitin-Ligase Nedd4-2 entdeckt, die

physiologischerweise ENaC degradiert. Eine gesteigerte ENaC-Expression war

auch hier die Ursache für die Ausbildung einer CF-ähnlichen Lungenaffektion,

die ebenfalls durch präventive Amilorid-Applikation gemildert werden konnte

[41]. Diese Befunde unterstützen die Hypothese, dass auch „gain-of-function“-

Mutationen von ENaC zur Pathophysiologie der CF beitragen können.

Von Mutesa et al. wurde in Ruanda, wo die CF aufgrund der Ähnlichkeit der

Symptome zu anderen häufigen Krankheitsbildern wie der Malnutrition eher

unterdiagnostiziert wird, eine Genanalyse der für die verschiedenen ENaC-

Untereinheiten kodierenden Sequenzen durchgeführt [51]. Die Genanalyse von

Mutesa et al. umfasste 60 Kinder, die alle an CF-ähnliche Symptomen litten,

aber nur ein oder gar kein mutiertes CFTR-Allel aufwiesen. Bei den Patienten,

die nur ein mutiertes CFTR-Allel besaßen, wurden mehrere

Sequenzänderungen in den Genen der ENaC-Untereinheiten detektiert. Dabei

fiel vor allem eine Missense-Mutation bei einem 13-jährigen Patienten auf. Sein

CF-Phänotyp zeigte sich vor allem in einer ausgeprägten Lungenbeteiligung im

Sinne der Besiedelung mit Pseudomonas aeruginosa und rezidivierenden

respiratorischen Infektionen. Die Krankheit manifestierte sich bei ihm auch in

Form von gastrointestinalen Symptomen, Gedeihstörung, Diabetes mellitus und

Proteinmangelernährung. Der Schweißtest war mit einer Chloridkonzentration

von 94 mmol/l deutlich im pathologischen Bereich, was für eine typische CF

spricht. Die genetische Konstellation mit nur einem betroffenen CFTR-Allel stellt

sich jedoch als atypisch dar.

12

3.5 Zielsetzung der Arbeit: funktionelle Charakterisierung der

βV348M-Mutation

Die Missense-Mutation des Patienten wurde in einer hoch konservierten Region

der extrazellulären Schleife der β-Untereinheit von ENaC an Position 348

gefunden (Abb. 2 und 5), an der Valin zu Methionin mutiert war. Die βV348M-

Mutation wurde in keinem anderen Patienten und auch keiner Person des

Kontrollkollektivs gefunden, so dass eine funktionelle Relevanz wahrscheinlich

ist.

Da bei dem Patienten nur eine Mutation in einem Allel des CFTR-Gens

nachgewiesen wurde, aber schwere Symptome der CF auftraten, war es Ziel

dieser Arbeit, die bei ihm nachgewiesene βV348M-Mutation von ENaC im

Oozytenexpressionsmodell funktionell zu charakterisieren.

Abb. 5: Aminosäuresequenzen verschiedener Spezies der Region um βV348. Die Zahlen

geben Beginn und Ende des dargestellten Ausschnittes der Aminosäurekette der β-Untereinheit

beginnend vom N-Terminus an.

Mensch 341 ETSIGVLVDKLQRMG 355

Maus 339 ETSIGVLVDKLQRKG 353

Ratte 339 ETSIGVLVDKLQRKG 353

Meerschweinchen 342 ETSIGVLVDKLQRMG 356

Kaninchen 342 ETSIGVLVDKLQRKG 356

Riesenpanda 347 ETSIGVLVDKLERKG 361

Rind 342 ETSIGVLVDKLQRKG 356

Xenopus laevis 361 ETSISVLVDQLEHME 375

Xenopus tropicalis 360 ETSIAVLVDQLEHME 374

13

4. Material und Methoden

4.1 Xenopus laevis Oozyten als heterologes Expressions-

system

In früheren Jahren wurde der afrikanische Krallenfrosch Xenopus laevis (Abb.

6) als Versuchstier zum Schwangerschaftsnachweis verwendet. Dazu wurde

den Weibchen der Urin von fraglich schwangeren Frauen injiziert. Eine Eiablage

der Weibchen durch im Urin enthaltenes humanes Choriongonadotropin

kennzeichnete den positiven Test [24]. Da dieser Test in den 40er Jahren in

Apotheken zum Schwangerschaftsnachweis durchgeführt wurde, wurde der

Frosch als „Apothekerfrosch“ bekannt. Heute werden vor allem die Oozyten von

Xenopus laevis in der Forschung verwendet.

Gurdon et al. [29] konnten 1971 zum ersten Mal zeigen, dass injizierte exogene

mRNA in den Oozyten die Bildung der dafür kodierenden Proteine im

Zytoplasma der Oozyte zur Folge hat. Hierauf konnten etliche Signalkaskaden

mit Hilfe dieses Systems analysiert werden. Mit elektrophysiologischen

Methoden wurden schließlich ligandengesteuerte und spannungsabhängige

Ionenkanäle untersucht [4, 69].

Dabei eignet sich das Expressionssystem zur systematischen Untersuchung

der Beziehung von Funktion und Struktur der Ionenkanäle durch den Vergleich

von Wildtyp-Proteinen mit verschiedenen durch positionsgerichtete Mutagenese

hergestellten Mutanten [16].

Abb. 6: Xenopus laevis, der afrikanische Krallenfrosch.

14

Die Entwicklungsstufen der Oozyten werden nach Dumont in sechs Stadien

eingeteilt [21]. Diese unterscheiden sich anhand der Größe und Pigmentierung

der Oozyten, wobei in der vorliegenden Arbeit nur die Stadien V und VI für die

Messungen herangezogen wurden. In Stadium V und VI ist die morphologische

Zweiteilung in einen animalen und einen vegetativen Pol gut erkennbar (Abb.

7). Die vegetative Hemisphäre ist dabei hell gefärbt, während die animale

Hemisphäre durch eingelagertes Melanin dunkel gefärbt ist [16]. Bei Oozyten

des Stadiums VI fällt ein nicht pigmentierter Äquatorialring auf, der die beiden

Pole voneinander trennt.

Abb. 7: Xenopus laevis Oozyten im Reifestadium V und VI nach Dumont.

15

4.2 Lösungen und Chemikalien

Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Lösungen sind in Tabelle 1 und 2

aufgeführt. Die Lösungen wurden vor Verwendung frisch hergestellt. ND96 und

OR2 wurden aus einer autoklavierten 10-fach Stammlösung zubereitet.

Tabelle 1: Lösungen für Präparation und Inkubation der Oozyten

OR2 ND9 ND96

NaCl (mM) 82,5 9 96

KCl (mM) 2 2 2

MgCl2 (mM) 1 1 1

HEPES (mM) 5 5 5

NMDG-Cl (mM) 87

CaCl2 (mM) 1,8 1,8

Einstellung auf pH 7,4 mit NaOH Tris Tris

Tabelle 2: Lösungen für Biotinylierung und Western Blot

Biotinylierungs

-puffer Glycin-Puffer Lysis-Puffer

Triethanolamin (mM) 10

NaCl (mM) 150 500

CaCl2 (mM) 2

EZ-link sulfo-NHS-SS-

Biotin 1 mg/ml

Glycin (mM) 192

Tris-Cl (mM) 25 50

EDTA (mM) 5

pH 9,5 7,5 7,4

16

Für die Versuche der Kanalaktivierung wurde 2-(Trimethylammonium)-ethyl-

methan-thiosulfonsäure-bromid (MTSET; Toronto Research Chemicals,

Toronto, Kanada), Chymotrypsin (Sigma, Taufkirchen) und S3969 [46]

verwendet. S3969 wurde wie zuvor in der Literatur beschrieben synthetisiert

[32, 46].

4.3 cRNA-Herstellung

Die für die α-, β- und γ-Untereinheit von ENaC kodierende Volllängen-cDNA

war in den pcDNA3.1-Vektor (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) integriert.

Die Plasmide wurden mit dem Restriktionsenzym Not I (New England Biolabs,

Ipswich, Massachusetts, USA) linearisiert und nach Aufreinigung mit dem

QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden) als Matrize für die cRNA-

Synthese eingesetzt. Diese wurde mit einem mMESSAGEmMASCHINE Kit T7

(Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornien, USA) durchgeführt, wobei die in

den Vektor integrierte Promotorsequenz des Bakteriophagen T7 als Promotor

für die in vitro Synthese der ENaC-cRNAs diente. Die resultierende cRNA

wurde mit einem NucleoSpin RNA II Kit (Macherey-Nagel, Düren) aufgereinigt

und in nukleasefreiem Wasser aufgenommen. Nach Messung ihrer

Konzentration wurde die fertige cRNA bei -80°C aufbewahrt.

Mittels positionsgerichteter Mutagenese (QuickChange II Site-directed

Mutagenesis Kit, Stratagene, Amsterdam, Niederlande) wurden verschiedene

Mutationen in β-ENaC eingefügt: βS520C, βV348M mit zusätzlicher S520C-

Mutation, βV348M, βV348del, βV348G, βV348L, βV348W, βV348K, βV348D,

βV348E, βV348Q. Die Mutationen wurden per Sequenzanalyse bestätigt.

4.4 Isolation und Injektion der Oozyten

Nachdem die Frösche mit 0,2% MS222 (Sigma) anästhesiert worden waren,

wurden die Oozyten durch partielle Ovariektomie von weiblichen erwachsenen

Xenopus laevis Fröschen gewonnen. Für die Ovariektomie wurde die

Bauchdecke des Frosches durch eine etwa 1 cm lange Inzision eröffnet, die

nach der Entnahme durch Einzelknopfnähte verschlossen wurde. Die Frösche

wurden danach einen Tag in einem separaten Becken außerhalb der

Sammelaquarien gehalten. Bis zur nächsten Oozytenentnahme wurde ein

17

Intervall von mindestens 12 Wochen eingehalten. Die Ovarialläppchen wurden

mechanisch eröffnet und die Oozyten mittels enzymatischem Verdau mit

Kollagenase Typ 2 (CLS2, Biochrom, Berlin, Deutschland; 600-700 U/ml, 3-4h

bei 19°C) aus dem Ovargewebeverband und aus der sie umgebenden

Follikelepithelzellschicht gelöst. Die Kollagenase war hierfür in OR2-Lösung

gelöst. Um die letzten Reste der Follikelepithelzellschicht und die Kollagenase

zu entfernen, wurden die Oozyten nochmals 15 Minuten in Kollagenase-freier

OR2-Lösung geschwenkt.

Oozyten der Stadien V-VI wurden unter dem Stereomikroskop selektiert, wobei

gleichmäßige Pigmentierung und Größe entscheidende Auswahlkriterien

darstellten (Abb. 7). Mit Hilfe eines Mikroinjektors (Nanoject II automatic

injector, Drummond, Broomall, Pennsylvania, USA) wurden die selektierten

Oozyten mit 0,5 ng/ENaC-Untereinheit cRNA injiziert. Hierfür wurden mit Hilfe

eines Mikroelektroden-Pullers (Sutter P-97, Science Products, Hofheim)

Glaskapillaren zu Injektionskapillaren mit langen Spitzen ausgezogen. Diese

wurden unter dem Mikroskop mit einer feinen Pinzette auf einen Durchmesser

von ca. 10-20 μm abgebrochen. Zur gleichmäßigen Druckübertragung durch

den Injektor wurden die Injektionskapillaren mit Mineralöl befüllt. Nach Auftauen

der cRNA-Lösung wurde diese in eine Hämatokritkapillare pipettiert, aus der sie

dann luftblasenfrei in die Injektionskapillare aufgezogen wurde. Die Oozyten

wurden in eine mit ND96 gefüllte Injektionskammer gelegt und die

Injektionskapillare etwa im 45°-Winkel in die Oozyten eingestochen. Pro Oozyte

wurden 46 nl cRNA-Lösung injiziert.

Nach der Injektion wurden die Oozyten in der Regel in einer Lösung mit

niedrigem Na+-Gehalt (ND9) bei 19°C inkubiert. In einigen Versuchen wurden

die Oozyten in einer Lösung mit hohem Na+-Gehalt (ND96) inkubiert. Um

unerwünschtes Bakterienwachstum zu verhindern, wurde den Lösungen 100

U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin zugesetzt.

18

4.5 Elektrophysiologische Methoden

4.5.1 Zwei-Elektroden-Spannungsklemme

Die ENaC-Expression in den Oozyten wurde in der Regel zwei Tage nach

cRNA-Injektion mit der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme quantifiziert. Der

schematische Aufbau der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme ist in Abb. 8

dargestellt.

Mit einer intrazellulären Elektrode wird das Potenzial der Zelle abgeleitet und

über einen Differenzverstärker mit einem vorgegebenen Haltepotenzial

verglichen. Weicht das Zellpotenzial vom Haltepotenzial ab, wird über eine

zweite intrazelluläre Elektrode ein depolarisierender oder hyperpolarisierender

Ausgleichsstrom appliziert, bis das Zellpotenzial dem Haltepotenzial entspricht.

Über endogene und heterolog exprimierte Ionenkanäle fließen Ladungen ab,

die die Zelle erneut vom Haltepotenzial entfernen. Um dies zu verhindern

müssen folglich kontinuierlich Ausgleichsströme appliziert werden, die diesem

Ladungsfluss entsprechen. Die Messung dieser Ausgleichsströme in An- und

Abwesenheit eines spezifischen Kanalblockers ermöglicht die Quantifizierung

von Strömen durch heterolog exprimierte Ionenkanäle.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein OC 725C-Verstärker (Warner Instruments

Corp., Hamden, Conneticut, USA) verwendet, der über ein Interface (LIH 1600,

HEKA, Lambrecht) mit einem Computer verbunden war. Die Ansteuerung des

Verstärkers sowie die Datenerfassung erfolgten per Software (Pulse 8.67,

HEKA). Zusätzlich wurden Strom- und Spannungsdaten auf einem

Zweikanalschreiber (BD12E, Kipp & Zonen, Gengenbach Messtechnik,

Reichenbach/Fils) auf Papier dokumentiert. Die Elektroden bestanden aus mit

einem Mikroelektroden-Puller (Sutter P-97, Science Products, Hofheim)

gezogenen, spitzen Glaskapillaren, die mit 3M KCl-Lösung gefüllt wurden.

Vervollständigt wurde jede Elektrode durch das Eintauchen eines mit dem

Verstärker verbundenen chloridierten Silberdrahtes (Ag/AgCl-Elektrode). Die

nach Eintauchen in die Badlösung gemessenen Elektrodenwiderstände lagen

zwischen 0,3 und 3 MΩ.

19

Abb. 8: Prinzip der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme.

4.5.2 Messablauf

Um elektromagnetische Störeinflüsse zu verhindern, wurden die Messungen in

einem von einem Faradayschen Käfig umgebenen Messstand durchgeführt.

Alle Geräte waren geerdet. Die Experimente wurden bei Raumtemperatur

durchgeführt. Die Oozyten wurden in der Mitte einer schmalen Messkammer

positioniert, in der sie kontinuierlich mit Lösung superfundiert wurden. Die

Messlösungen befanden sich in Behältnissen über der Messkammer und

wurden über Silikonschläuche und ein elektromagnetisches Klappensystem

(ALA BPS 8, gesteuert über ein TIB 14 Interface, beide HEKA) zur

Messkammer geleitet. Eine pneumatische Vakuumpumpe (Ejektor SEG,

Schmalz, Glatten) sorgte für kontinuierliches Absaugen der Badlösung.

Unter stereomikroskopischer Kontrolle wurden Strom- und Spannungs-

elektrode über Mikromanipulatoren in die Zelle eingestochen und ein

Haltepotentzial von -60 mV angelegt. Abb. 9A zeigt zwei typische Stromkurven

ENaC exprimierender Oozyten. Die Oozyten wurden konstant mit einer

Flussrate von 2-3 ml/min superfundiert. Die Versuche begannen unter

Superfusion mit 2 μM Amilorid-haltiger ND96-Lösung, um ENaC spezifisch zu

blockieren und somit einen vorzeitigen Na+-Einstrom in die Zellen zu

20

verhindern. Die Amilorid-Superfusion wurde solange durchgeführt, bis sich ein

stabiles Ausgangsniveau des Ganzzellstroms einstellte. Anschließend wurde

Amilorid durch Superfusion mit Amilorid-freier ND96-Lösung aus der

Messkammer ausgewaschen. Nach Auswaschen von Amilorid zeigt sich

zunächst eine einwärts gerichtete Stromkomponente, die von einer teilweisen

Inhibition gefolgt ist, der sogenannten Na+-„self-inhibition“. Dieses Phänomen

hängt von der extrazellulären Na+-Konzentration ab und lässt sich auch durch

rasche Erhöhung der extrazellulären Na+-Konzentration auslösen. Es beruht auf

einer Erniedrigung der Offenwahrscheinlichkeit (Po) von ENaC binnen

Sekunden [14]. Um gegebenenfalls eine unspezifische Veränderung des

Basalstroms („Baselinedrift“) zu erkennen, wurde nach dem Auswaschen von

Amilorid erneut 2 μM Amilorid-haltige ND96-Lösung in die Messkammer

gegeben. Aus der Differenz der Ströme in An- und Abwesenheit von Amilorid

wurde der Amilorid-sensitive Ganzzellstrom ΔIAmi bestimmt (Abb. 9A). ΔIAmi stellt

dabei ein Maß für den durch ENaC vermittelten Einwärtsstrom und damit die

Aktivität von ENaC dar. In nicht injizierten nativen Oozyten ließ sich keine

Amilorid-sensitive Stromkomponente nachweisen.

4.6 Proteinnachweis

4.6.1 Nachweis membranständiger Proteine durch Biotinylierung

Um den an der Zelloberfläche exprimierten Anteil an ENaC isoliert vom

intrazellulär exprimierten Anteil nachzuweisen, können Zellmembranproteine

mit einem zellmembranimpermeablen Biotin-Analogon markiert werden. Diese

Markierung basiert auf kovalenten Bindungsreaktionen zwischen primären

Amingruppen entweder von Lysinresten oder endständiger α-Aminogruppen der

Membranproteine mit den Biotin-Analoga [23]. Biotin besitzt die Eigenschaft

auch hochaffin an Streptavidin und dessen Analoga binden zu können, die sich

wiederum mit sogenannten „Beads“ koppeln lassen. Dabei handelt es sich um

kleine Kügelchen, die den Streptavidin-Biotin-Komplexen eine größere Masse

geben. Dadurch können die Biotin-Streptavidin-Komplexe durch Zentrifugation

von den restlichen, nicht biotinylierten intrazellulären Proteinen abgetrennt

werden und somit ausschließlich biotinylierte Oberflächenproteine separat

nachgewiesen werden.

21

Für die Biotinylierungsversuche in dieser Arbeit wurden jeweils 30 Oozyten pro

untersuchter Gruppe verwendet. Alle Versuchsschritte wurden auf Eis

durchgeführt. Zuerst wurden die Oozyten dreimal in ND96 gewaschen.

Anschließend wurden die Oozyten 15 Minuten lang unter milder Badbewegung

in 1 mg/ml Biotin in Biotinylierungspuffer inkubiert. Um die

Biotinylierungsreaktion zu stoppen und ungebundenes Biotin zu entfernen,

wurden die Oozyten zweimal 5 Minuten lang in Glycin-Puffer bei pH 7,5

gewaschen. Hierauf wurden die Oozyten durch fünfmaliges Aufsaugen durch

eine feine Kanüle (27 Gauge) in Lysis-Puffer lysiert. Zur Vermeidung eines

Proteinabbaus war der Lysis-Puffer mit einer Mischung von Protease-

Inhibitoren („Complete Mini EDTA-free“ protease inhibitor cocktail tablets,

Roche Diagnostics, Mannheim) versetzt. Die Lysate wurden anschließend 10

Minuten bei 1000g zentrifugiert, um Zelldetritus und Zellkerne zu entfernen. Die

Überstände wurden in 1,5 ml-Reaktionsgefäße überführt. Nach Zugabe der

Detergenzien 1% Triton X-100 und 1% Igepal CA-630 (Sigma) wurden die

Überstände für 20 Minuten auf Eis inkubiert und 100 μl Immunopure

immobilized Neutravidin Beads (Pearce, Rockford, Illinois, USA) hinzugefügt,

die vorher durch dreimaliges Aufnehmen in 1 ml Lysis-Puffer und

anschließendem Pelletieren bei 1000g im Lysis-Puffer äquilibriert wurden. Bei

den Neutravidin Beads handelt es sich um ein chemisches Streptavidin-

Analogon, das mit hoher Affinität an Biotin bindet. Die Lysate wurden mit den

Neutravidin Beads über Nacht bei 4°C über Kopf rotierend in Bewegung

gehalten, um die biotinylierten Oberflächenproteine an die Neutravidin Beads zu

koppeln. Nach dieser Inkubation wurden die Reagenzgefäße erneut bei 1000g

3 Minuten lang zentrifugiert, um die mit Biotin-Neutravidin-Komplexen

markierten Oberflächenproteine in Form des Pellets von den nicht-biotinylierten,

intrazellulären Proteinen im Überstand abzutrennen. Das Pellet wurde

anschließend dreimal mit Lysis-Puffer gewaschen.

Zur Kontrolle, ob alle Biotinmoleküle an Neutravidin-Beads gebunden hatten,

wurde aus dem Überstand ein sogenannter „Dot Blot“ angefertigt. Dazu wurde 1

μl des Überstands, in dem sich keine biotinylierten Proteine mehr befinden

sollten, auf eine Nitrozellulose-Membran pipettiert und dort mit

Meerrettichperoxidase gekoppeltem Streptavidin markiert. Die Bindung der

Meerrettichperoxidase wurde dann per Chemilumineszenz nachgewiesen. Die

Experimente wurden nur dann weitergeführt, wenn auf der Membran nahezu

22

kein Signal nachzuweisen war, folglich nahezu alle biotinylierten Proteine an

Neutravidin Beads gebunden hatten und durch Zentrifugation abgetrennt

worden waren. Als Positivkontrolle mit Nachweis eines starken

Chemilumineszenz-Signals diente ein analog durchgeführter „Dot-Blot“ der

biotinylierten Proteine vor Zugabe der Neutravidin Beads.

4.6.2 Proteinnachweis durch Western Blot

Zu den durch die Neutravidin-Beads in Form des Pellets isolierten

Membranproteinen wurden 100 μl eines 2-fach Natriumdodecylsulfat-

Polyacrylamidgelelektrophorese(SDS-PAGE)-Probenpuffers (Rotiload 1, Roth,

Karlsruhe, Deutschland) gegeben. Zur Trennung der Proteine von den Beads

wurden die Proben 5 Minuten bei 95°C erhitzt und 3 Minuten bei 16000g

zentrifugiert. Danach wurde der Überstand auf 8% bzw. 10% SDS-PAGE-Gele

aufgetragen, um die Proteine der Größe nach aufzutrennen. In analoger Weise

wurden auch die aufbewahrten intrazellulären Proteine auf das Gel

aufgetragen, um ebenfalls per Western Blot analysiert zu werden. Zur

Größenanalyse wurde zusätzlich ein „Molekulargewichtsstandard“ (Prestained

Protein Molecular Weight Marker, Fermentas, St. Leon-Rot) aus farblich

markierten Proteinen mit definiertem Molekulargewicht im Gel aufgetrennt. Die

der Größe nach getrennten Proteine wurden hierauf auf eine Polyvinyliden-

Difluorid-Membran durch ein halbtrockenes („semidry“) Elektro-Blotverfahren

transferiert. Dort wurden die Proteine durch eine Antikörper-vermittelte Reaktion

spezifisch nachgewiesen. Für diese Nachweisreaktion wurde die Membran mit

Kaninchen-anti-human-β-ENaC-Antikörper [30, 44] in einer Verdünnung von

1:10000 versetzt. Diese wurden wiederum mittels Meerrettich-Peroxidase-

gekoppelter Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper in einer Verdünnung von 1:50000

nachgewiesen (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg), deren Bindung in einer

Chemilumineszenzreaktion sichtbar gemacht werden konnte. Hierfür wurde

„Amersham ECL Plus“ (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) verwendet. Ein

Imager (Stella 3200, Raytest, Straubenhardt) detektierte die Intensität der

Chemilumineszenzsignale. Dadurch konnten die nachzuweisenden Proteine

qualitativ und vor allem quantitativ densitometrisch ausgewertet werden.

Zum Nachweis, dass keine intrazellulären Proteine durch Biotin markiert

worden waren, wurden sowohl die aus der Membran stammenden als auch die

23

intrazellulären Proteine mit Antikörpern gegen das ausschließlich intrazellulär

vorkommende Protein β-Aktin in einer Verdünnung von 1:5000 inkubiert

(Sigma). Die Experimente wurden nur dann in die Auswertung eingeschlossen,

wenn in den Western Blots der Membranproteine kein β-Aktin-Signal, bei den

intrazellulären Proteinen dagegen als Positivkontrolle ein starkes β-Aktin-Signal

zu sehen war.

Die quantitative Auswertung der Western Blot Aufnahmen erfolgte mit der

Software ImageJ 1.38x (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland,

USA). Dazu wurden die integrierten Intensitätssignale der einzelnen

Proteinbanden auf den unmittelbar benachbarten Hintergrund korrigiert.

4.7 Statistik

Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler (SEM) dargestellt. Die

statistische Auswertung der Daten erfolgte mit der Software GraphPad Prism

4.03 für Windows (Graph Pad Software, San Diego, Kalifornien, USA). Bei

abhängigen Stichproben wurde der gepaarte t-Test verwendet, bei

unabhängigen Stichproben der ungepaarte t-Test, bei Mehrfachvergleichen

ANOVA mit Dunnett’s Multiple Comparison Test. Die Ergebnisse wurden als

signifikant angenommen, falls die Irrtumswahrscheinlichkeit kleiner 0,05 war.

Die Irrtumswahrscheinlichkeiten wurden wie folgt gekennzeichnet: * p<0,05,

** p<0,01, *** p<0,001. Die Zahlen in oder über den Säulen der Abbildungen

geben die Anzahl n der individuell gemessenen Oozyten an, N die Anzahl

verschiedener Oozyten-Batches, die verwendet wurden.

24

5. Ergebnisse

5.1 Die βV348M-Mutation stimuliert den ENaC-vermittelten Na+-

Strom

Um zu untersuchen, ob die βV348M-Mutante einen stimulatorischen Effekt auf

ENaC ausübt, wurden αβγENaC und αβV348MγENaC in Xenopus laevis Oozyten

exprimiert und mit der Zweielektroden-Spannungsklemme der Amilorid-

sensitive Ganzzellstrom (ΔIami) an Tag 1, 2 und 3 nach der Injektion gemessen.

Abb. 9A zeigt typische Stromkurven einer αβγENaC und einer αβV348MγENaC

exprimierenden Oozyte bei einem Haltepotential von -60 mV. Die Versuche

beginnen in Anwesenheit des spezifischen ENaC-Blockers Amilorid, um eine

vorzeitige Natriumbeladung der Oozyten zu verhindern. Nach Auswaschen von

Amilorid erscheint eine einwärts gerichtete Stromkomponente, die durch den

Einstrom von Na+ hervorgerufen wird. Reapplikation von Amilorid führt den

Strom auf das Ausgangsniveau zurück. Die Differenz der Stromwerte in An- und

Abwesenheit von Amilorid entspricht dem ENaC-vermittelten Na+-Strom ΔIAmi.

In fünf unterschiedlichen Oozyten-Batches ließ sich an αβγENaC

exprimierenden Oozyten einen Tag nach Injektion der cRNA ein ΔIAmi von 0,81

± 0,09 μA (n=60) messen (Abb. 9B). An Tag 2 stieg ΔIAmi 2,7-fach auf 2,19 ±

0,16 μA (n=60), gefolgt von einem weiteren Anstieg an Tag 3 auf 2,66 ± 0,33

μA (3,1-fach im Vergleich zu Tag 1, n=57). αβV348MγENaC exprimierende

Oozyten zeigten an Tag 1 lediglich einen nicht signifikant höheren ΔIAmi (0,99 ±

0,12 µA, n=53) als αβγENaC exprimierende Oozyten. An Tag 2 stieg ΔIami 3,1-

fach auf 3,05 ± 0,29 µA (n=62), gefolgt von einem weiteren Anstieg an Tag 3

auf 3,64 ± 0,47 µA (3,7-fach im Vergleich zu Tag 1, n=57). Somit war an Tag 2

und Tag 3 ein signifikanter stimulatorischer Effekt der βV348M-Mutante von

39,3% bzw. 36,8% im Vergleich zu Wildtyp-ENaC zu verzeichnen.

Da sich der stimulatorische Effekt der βV348M-Mutante an Tag 2 nach der

Injektion als besonders robust erwies, wurden alle weiteren Messungen zu

diesem Zeitpunkt durchgeführt. Um auszuschließen, dass der stimulatorische

Effekt der βV348M-Mutation lediglich auf Unterschieden der cRNA-Qualität

beruhte, wurden die Versuche mit drei verschiedenen cRNA-Batches

durchgeführt. In insgesamt 34 Versuchen mit Oozyten von 34 unterschiedlichen

Fröschen zeigte sich ein signifikanter stimulatorischer Effekt der Mutante auf

25

ΔIAmi von 38% (αβγENaC: 4,03 ± 0,14 µA, αβV348MγENaC: 5,57 ± 0,22 µA, Abb.

9C). Die Ergebnisse demonstrieren somit einen „gain-of-function“-Effekt der

βV348M-Mutante auf die ENaC-Funktion.

10s

wt

1µA

Ami

IAmi

V348M

IAmi

1 2 30

1

2

3

4

5

6

***

wt

V348M

N=5

n=53-62

Tag nach Injektion

I A

mi (

no

rma

lisie

rt)

wt V348M0

1

2

3

4

5

6 ***N=34

331 332

I A

mi (

µA

)

A

B C

Abb. 9: Die βV348M-Mutation stimuliert den ENaC-vermittelten Na+-Strom (mod. nach

[55]). Oozyten wurden mit cRNA für αβγENaC (wt) oder αβV348MγENaC (V348M) injiziert (0,5

ng/Untereinheit) und der Amilorid-sensitive Strom (ΔIAmi) mit der Zwei-Elektroden-

Spannungsklemme detektiert. A, Repräsentative Ganzzell-Stromkurven einer αβγENaC

exprimierenden Oozyte (links) bzw. einer αβV348MγENaC exprimierenden Oozyte (rechts) bei

einem Haltepotential von -60mV. Die Anwesenheit von Amilorid (2 μM) in der Badlösung ist

durch schwarze Balken gekennzeichnet. B, ΔIAmi von αβγENaC und αβV348MγENaC

exprimierenden Oozyten an Tag 1, 2 und 3 nach Injektion. Jeder Datenpunkt repräsentiert den

Mittelwert aus 53-62 individuellen Oozyten aus fünf unterschiedlichen Oozyten-Batches. Die

Messwerte der individuellen Experimente wurden auf den Mittelwert der jeweiligen Wildtyp-

Kontrolle an Tag 1 normalisiert. C, Zusammenfassung aller Experimente an Tag 2 nach

Injektion. Ungepaarter t-Test.

26

5.2 Der stimulatorische Effekt der βV348M-Mutation ist vom

Na+-Gehalt der Oozyten weitgehend unabhängig

Von einer durch Kellenberger et al. untersuchten ENaC-Mutante, die bei

betroffenen Patienten ein Liddle Syndrom verursacht, ist bekannt, dass sich der

stimulatorische Effekt der „gain-of-function“-Mutante im Vergleich zum Wildtyp

erst nach Inkubation der Oozyten in einer Lösung mit hohem Na+-Gehalt und

dadurch gesteigerter intrazellulärer Na+-Konzentration zeigt [36]. Daher sollte

untersucht werden, ob der stimulatorische Effekt der βV348M-Mutation durch

Inkubation der Oozyten in einer Lösung mit hohem Na+-Gehalt (ND96)

vergrößert wird.

Auch in ND96 inkubierte Oozyten zeigten einen messbaren ΔIAmi (Abb. 10). Im

Vergleich zu Oozyten, die in einer Lösung mit niedrigem Na+-Gehalt (ND9)

inkubiert wurden, war ΔIAmi geringer. ΔIAmi des Wildtyps belief sich dabei auf

1,39 ± 0,19 μA, während die Mutante einen etwa 54% größeren ΔIAmi von 2,14

± 0,27 μA aufwies. Der stimulatorische Effekt der Mutante war nach Inkubation

mit ND96 etwas größer als nach Inkubation mit ND9. Im Vergleich zur Liddle-

Mutante nach Inkubation mit einer Lösung mit hohem Na+-Gehalt, die unter

diesen Bedingungen eine etwa 3-fache Steigerung von ΔIAmi im Vergleich zu

Wildtyp-ENaC zeigte [36], war der stimulatorische Effekt der βV348M-Mutation

allerdings deutlich geringer.

Die Auswirkung der intrazellulären Na+-Konzentration auf den stimulatorischen

Effekt der βV348M-Mutante ist also viel weniger ausgeprägt als bei der Liddle-

Mutation und wurde im Folgenden daher nicht weiter untersucht.

Abb. 10: Der stimulatorische Effekt der βV348M-Mutation ist vom Na+-Gehalt der Oozyten

weitgehend unabhängig. ΔIAmi von αβγENaC (wt) und αβV348MγENaC (V348M) exprimierenden

Oozyten wurde nach Inkubation in ND96 2 Tage nach cRNA-Injektion (0,5 ng/Untereinheit)

gemessen. Ungepaarter t-Test.

wt V348M0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 *N=6

58 58

I A

mi (

µA

)

27

5.3 Die βV348M-Mutation erhöht die mittlere Po von ENaC

Die Effekte von „gain-of-function“-Mutationen können prinzipiell auf drei

unterschiedlichen Mechanismen beruhen. Dabei können die Anzahl der in der

Membran exprimierten Kanäle, die Einzelkanalleitfähigkeit oder die

Offenwahrscheinlichkeit Po erhöht sein. Veränderungen der

Einzelkanalleitfähigkeit von humanem ENaC durch Mutationen wurden

allerdings bisher nicht beschrieben.

Zur Bestimmung der mittleren Po wurde in der β-Untereinheit von Wildtyp-ENaC

und auch der βV348M-Mutante an Position 520 das an dieser Stelle

vorkommende Serin durch Cystein substituiert. Bindung des Sulfhydryl-

Reagenz MTSET an dieses nahe der Porenregion von ENaC gelegene Cystein

erhöht die Po auf nahe 1. Dies geschieht durch das Einfügen einer positiven

Ladung und eine daraus resultierende Destabilisierung des Geschlossen-

Zustands des Kanals. [37, 66].

Abb. 11A zeigt repräsentative Stromkurven der Aktivierung mit MTSET (1mM)

sowohl einer αβS520CγENaC als auch einer αβV348M,S520CγENaC exprimierenden

Oozyte. Nach Auswaschen von Amilorid zeigt sich eine einwärts gerichtete

Stromkomponente, die durch Applikation von MTSET noch vergrößert wird. Der

Einwärtsstrom erreicht nach etwa fünf Minuten ein Plateau.

In αβS520CγENaC exprimierenden Oozyten zeigte sich im Mittel aller

untersuchten Oozyten ein ΔIAmi von 4,12 ± 0,33 µA (Abb. 11B). Applikation von

MTSET erhöhte ΔIAmi auf 16,29 ± 0,86 µA, was einer 4,0-fachen Steigerung

entspricht (Abb. 11BC). Unter der Annahme, dass MTSET die Po aller Kanäle

auf 1 setzt, ergibt sich somit für αβγENaC eine mittlere Po von 0,25 vor

Applikation von MTSET.

αβV348M,S520CγENaC exprimierende Oozyten wiesen einen ΔIAmi von 5,88 ± 0,47

μA auf, was einer Stimulation von 43% gegenüber dem ΔIAmi des Wildtyps

entspricht und den stimulatorischen Effekt der Mutante in diesen Experimenten

bestätigt. MTSET erhöhte ΔIAmi auf 16,40 ± 1,03 µA und war somit 2,8-fach

gesteigert (Abb. 11BC). Unter der Annahme, dass MTSET die Po aller Kanäle

auf 1 setzt, ergibt sich somit eine mittlere Po der Mutante von 0,36. Die durch

die βV348M-Mutation verursachte Erhöhung der Po belief sich folglich auf 44%

und entspricht somit dem in diesen Experimenten gefundenen stimulatorischen

Effekt auf ΔIAmi.

28

Interessanterweise liegt ΔIAmi von αβS520CγENaC und αβV348M,S520CγENaC

exprimierenden Oozyten nach MTSET-Stimulation auf gleichem Niveau (Abb.

11B). Dies deutet darauf hin, dass sich die Anzahl der Kanäle in der Membran

zwischen Wildtyp und Mutanten nicht unterscheidet.

Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass eine Erhöhung der Po

entscheidend zum stimulatorischen Effekt der βV348M-Mutante beiträgt.

29

wt

2 µA

60s

Ami AmiMTSET

V348MAmi AmiMTSET

0

5

10

15

20

25

wt V348M

- +MTSET

- +

******

I A

mi (

µA

)

wt V348M0

1

2

3

4

N=3

23 23

***

I A

mi+

MT

SE

T/

I Am

i-in

itia

l

B C

A

Abb. 11: Die βV348M-Mutation erhöht die mittlere Po von ENaC (mod. nach [55]). Oozyten

wurden mit cRNA für αβS520CγENaC (wt) oder αβV348M,S520CγENaC (V348M) injiziert (0,5

ng/Untereinheit). Zur maximalen Erhöhung der Po wurden die Kanäle mit MTSET (1 mM)

aktiviert. A, Repräsentative Ganzzell-Stromkurven von αβS520CγENaC (links) bzw.

αβV348M,S520CγENaC (rechts) exprimierenden Oozyten. Die Anwesenheit von Amilorid (2 µM,

schwarzer Balken) bzw. MTSET (weißer Balken) ist entsprechend gekennzeichnet. B,

Zusammenfassung von zu A analog durchgeführten Experimenten aus drei unterschiedlichen

Oozyten-Batches. Zwei durch eine Linie verbundene Datenpunkte repräsentieren eine

individuell gemessene Oozyte, deren ΔΙAmi vor MTSET-Stimulation durch eine Linie mit dem

zugehörigen ΔΙAmi nach MTSET-Stimulation verbunden ist. Die weiße Säule repräsentiert den

Mittelwert von ΔΙAmi aller Oozyten vor MTSET-Stimulation, die schwarze Säule den Mittelwert

von ΔΙAmi nach MTSET-Stimulation. C, Relative Aktivierung von ΔIAmi durch MTSET dargestellt

als Quotient aus ΔIAmi nach (ΔIAmi+MTSET) und vor (ΔIAmi-initial) MTSET-Aktivierung. Gepaarter

(B) und ungepaarter (C) t-Test.

30

5.4 Chymotrypsin stimuliert αβγENaC mehr als αβV348MγENaC

Die proteolytische Aktivierung von ENaC spielt eine bedeutende Rolle in der

Kanalregulation von ENaC [60]. Daher sollte überprüft werden, ob die βV348M-

Mutation die Aktivierung von ENaC durch Proteasen beeinflusst. Zu diesem

Zweck wurden Versuche durchgeführt, in denen der Kanal mit Hilfe der

Serinprotease Chymotrypsin aktiviert wurde. Chymotrypsin aktiviert ENaC dabei

durch einen bisher nicht völlig aufgeklärten Mechanismus.

Der Versuchsablauf erfolgte analog zur Stimulation mit MTSET. Dabei wurde

die maximale Stimulation durch Chymotrypsin (2 μg/ml) nach etwa fünf Minuten

erreicht.

Abb. 12A zeigt repräsentative Stromkurven der Aktivierung mit Chymotrypsin

sowohl einer αβγENaC als auch einer αβV348MγENaC exprimierenden Oozyte.

Nach Auswaschen von Amilorid zeigt sich eine einwärts gerichtete

Stromkomponente, die durch Applikation von Chymotrypsin noch vergrößert

wird.

In αβγENaC exprimierenden Oozyten zeigte sich im Mittel aller untersuchten

Oozyten ein ΔIAmi von 3,46 ± 0,24 µA. Applikation von Chymotrypsin

vergrößerte ΔIAmi auf 13,40 ± 0,85 µA, was einer 3,9-fachen Steigerung

entspricht (Abb. 12BC). Dieser Effekt entspricht der Aktivierung durch MTSET

und zeigt, dass Chymotrypsin den Kanal ebenfalls vollständig aktiviert.

αβV348MγENaC exprimierende Oozyten wiesen einen ΔIAmi von 4,71 ± 0,33 μA

vor Chymotrypsin-Applikation auf, was einer Stimulation von 36% gegenüber

dem ΔIAmi des Wildtyps entspricht. Dies bestätigt den stimulatorischen Effekt

der Mutante in diesen Experimenten. Chymotrypsin erhöhte ΔIAmi auf 13,36 ±

0,85 µA nach Applikation von Chymotrypsin. Dies entspricht einer 2,8-fachen

Steigerung der Ströme und ist signifikant geringer als die Aktivierung des

Wildtyps durch Chymotrypsin (Abb.12 BC). Die Aktivierung der Mutante durch

Chymotrypsin liegt dabei im Bereich der Aktivierung durch MTSET und zeigt,

dass auch der mutierte Kanal in vollem Umfang durch Chymotrypsin aktivierbar

ist.

Interessanterweise gleichen sich ΔIAmi von αβγENaC und αβV348MγENaC

exprimierenden Oozyten nach Aktivierung durch Chymotrypsin (Abb. 12B). Dies

deutet, wie in den Versuchen mit MTSET, darauf hin, dass sich die Anzahl der

Kanäle in der Zellmembran zwischen Wildtyp und Mutante nicht unterscheidet.

31

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass sowohl Wildtyp- als auch βV348M-

ENaC durch Chymotrypsin aktiviert werden kann, der mutierte Kanal jedoch

signifikant geringer. Auch dieser Befund spricht dafür, dass die Mutation eine

Erhöhung der Po bewirkt.

wt

2 µA

60s

Ami AmiChymotrypsin

V348M

Ami AmiChymotrypsin

0

10

20

30

40

wt V348M

- +Chymotrypsin

- +

*** ***

I A

mi (

µA

)

wt V348M0

1

2

3

4

N=9

71 71

***

I Am

i+ch

ym

o/

I Am

i-in

itia

l

B C

A

Abb. 12: Chymotrypsin stimuliert αβγENaC mehr als αβV348MγENaC (mod. nach [55]).

Oozyten wurden mit cRNA für αβγENaC (wt) oder αβV348MγENaC (V348M) injiziert (0,5

ng/Untereinheit). Zur proteolytischen Aktivierung wurden die Kanäle mit Chymotrypsin (2 μg/ml)

stimuliert. A, Repräsentative Ganzzell-Stromkurven von αβγENaC (links) bzw. αβV348MγENaC

(rechts) exprimierenden Oozyten. Die Anwesenheit von Amilorid (2 µM, schwarzer Balken) bzw.

Chymotrypsin (weißer Balken) ist entsprechend gekennzeichnet. B, Zusammenfassung von zu

A analog durchgeführten Experimenten aus neun unterschiedlichen Oozyten-Batches. Zwei

durch eine Linie verbundene Datenpunkte repräsentieren eine individuell gemessene Oozyte,

deren ΔΙAmi vor Chymotrypsin-Stimulation durch eine Linie mit dem zugehörigen ΔΙAmi nach

Chymotrypsin-Stimulation verbunden ist. Die weiße Säule repräsentiert den Mittelwert von ΔΙAmi

aller Oozyten vor Chymotrypsin-Stimulation, die schwarze Säule den Mittelwert von ΔΙAmi nach

Chymotrypsin-Stimulation. C, Relative Aktivierung von ΔΙAmi durch Chymotrypsin dargestellt als

Quotient aus ΔΙAmi nach (ΔΙAmi+chymo) und vor (ΔΙAmi-initial) Chymotrypsin-Aktivierung.

Gepaarter (B) und ungepaarter (C) t-Test.

32

5.5 Die βV348M-Mutante wird durch S3969 weniger aktiviert als

der Wildtyp

Kürzlich wurde von Lu et al. [46] der neue ENaC-Aktivator S3969 vorgestellt.

Interessanterweise betonen Lu et al. die funktionelle Bedeutung der

Aminosäure βV348 für die Aktivierbarkeit durch den Aktivator. Nach Deletion

dieser Aminosäure ließ sich der Kanal nicht mehr durch den Aktivator

stimulieren. Daher sollte untersucht werden, ob die βV348M-Mutation den

stimulatorischen Effekt von S3969 reduziert.

Der Versuchsablauf erfolgte analog zur Stimulation mit MTSET bzw.

Chymotrypsin. Dabei wurde die maximale Stimulation durch S3969 (10 μM)

nach etwa drei bis vier Minuten erreicht.

Abb. 13A zeigt repräsentative Stromkurven einer αβγENaC und einer

αβV348MγENaC exprimierenden Oozyte. Nach Auswaschen von Amilorid zeigt

sich eine einwärts gerichtete Stromkomponente, die durch Applikation von

S3969 noch vergrößert wird.

In allen untersuchten αβγENaC exprimierenden Oozyten zeigte sich im Mittel

ein ΔIAmi von 6,81 ± 0,54 µA. Applikation von S3969 vergrößerte ΔIAmi auf 22,45

± 1,70 µA, was einer 3,3-fachen Steigerung entspricht (Abb. 13BC).

αβV348MγENaC exprimierende Oozyten wiesen einen ΔIAmi von 8,76 ± 1,03 μA

vor S3969-Applikation auf, was einer Stimulation von 29% gegenüber dem ΔIAmi

des Wildtyps entspricht. Dies bestätigt den stimulatorischen Effekt der Mutante

in diesen Experimenten. S3969 erhöhte ΔIAmi auf 20,91 ± 2,18 µA. Dies

entspricht einer 2,4-fachen Steigerung der Ströme und ist signifikant geringer

als die Aktivierung des Wildtyps durch S3969 (Abb. 13BC).

Interessanterweise gleichen sich ΔIAmi αβγENaC und αβV348MγENaC

exprimierender Oozyten nach Aktivierung durch S3969 (Abb. 13B). Dies deutet

erneut darauf hin, dass sich die Anzahl der Kanäle in der Membran zwischen

Wildtyp und Mutante nicht unterscheidet.

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass S3969 sowohl αβγENaC als auch

αβV348MγENaC aktiviert. Der etwas stärkere Effekt auf den Wildtyp-Kanal spricht

wiederum für eine erhöhte Po des mutierten Kanals. Das Ausmaß der

Aktivierung durch S3969 war aber insgesamt geringer als durch MTSET- und

Chymotrypsin-Applikation.

33

wt

5 µA

60s

Ami AmiS3969

V348MAmi AmiS3969

0

10

20

30

40

50

wt V348M

- +S3969

- +

******

I A

mi (

µA

)

wt V348M0

1

2

3

4N=5

40 40

***

I A

mi+

S3

96

9/

I Am

i-in

itia

l

B C

A

Abb. 13: Die βV348M-Mutante wird durch S3969 weniger aktiviert als der Wildtyp (mod.

nach [55]). Oozyten wurden mit cRNA für αβγENaC (wt) oder αβV348MγENaC (V348M) injiziert

(0,5 ng/Untereinheit). Die Kanäle wurden durch S3969 (10 μM) aktiviert. A, Repräsentative

Ganzzell-Stromkurven von αβγENaC (links) bzw. αβV348MγENaC (rechts) exprimierenden

Oozyten. Die Anwesenheit von Amilorid (2 µM, schwarzer Balken) bzw. S3969 (weißer Balken)

ist entsprechend gekennzeichnet. B, Zusammenfassung von zu A analog durchgeführten

Experimenten aus fünf unterschiedlichen Oozyten-Batches. Zwei durch eine Linie verbundene

Datenpunkte repräsentieren eine individuell gemessene Oozyte, deren ΔΙAmi vor S3969-

Stimulation durch eine Linie mit dem zugehörigen ΔΙAmi nach S3969-Stimulation verbunden ist.

Die weiße Säule repräsentiert den Mittelwert von ΔΙAmi vor S3969-Stimulation, die schwarze

Säule den Mittelwert von ΔΙAmi aller Oozyten nach S3969-Stimulation. C, Relative Aktivierung

von ΔIAmi durch S3969 dargestellt als Quotient aus ΔΙAmi nach (ΔΙAmi+S3969) und vor (ΔΙAmi-

initial) S3969-Aktivierung. Gepaarter (B) und ungepaarter (C) t-Test.

34

Aus diesem Grund sollte geklärt werden, ob S3969 im Gegensatz zu

Chymotrypsin den Kanal nicht vollständig aktiviert. Zu diesem Zweck wurden

αβγENaC exprimierende Oozyten mit Chymotrypsin (2μg/ml) und S3969 (10

μM) sequentiell stimuliert.

Abb. 14A zeigt zwei repräsentative Stromkurven aus diesen Experimenten. In

der linken Stromkurve wurde nach Auswaschen von Amilorid für etwa fünf

Minuten Chymotrypsin appliziert, bis der Einwärtsstrom ein Plateau ausbildete.

Unmittelbar folgend wurde zusätzlich S3969 in die Superfusionslösung

gegeben, um eine weitere Aktivierung durch S3969 feststellen zu können.

Hierbei ließ sich kein zusätzlicher Anstieg der Ströme durch S3969 beobachten.

An insgesamt 5 Oozyten ergab sich als Mittelwert für ΔIAmi vor Stimulation 10,28

± 1,38 μA, für ΔIAmi nach Chymotrypsin-Stimulation 27,22 ± 3,59 μA und für

ΔIami nach zusätzlicher Stimulation mit S3969 26,70 ± 3,66 μA.

Als Kontrollexperiment wurde die Reihenfolge der Zugabe von Chymotrypsin

und S3969 getauscht. Nach Auswaschen von Amilorid ließ sich ein ΔIAmi von

5,34 ± 0,87 μA messen. Anschließend erfolgte eine drei- bis vierminütige

S3969-Superfusion, die ΔIAmi auf 17,77 ± 1,55 μA steigerte. Zusätzliche

Stimulation durch Chymotrypsin erbrachte einen weiteren Anstieg von ΔIAmi um

8% auf 19,16 ± 1,99 μA (p= 0,11; Abb. 14A, rechte Stromkurve). Abb. 14B zeigt

die Zusammenfassung der Stromwerte aus beiden Versuchsanordnungen.

Die Ergebnisse zeigen einen nicht signifikanten Trend, dass S3969 im

Vergleich zu Chymotrypsin den Kanal nicht vollständig aktiviert. Dieser Trend

war bei jeder untersuchten Oozyte zu finden.

35

Abb. 14: Chymotrypsin aktiviert Wildtyp-ENaC stärker als S3969. Oozyten wurden mit

cRNA für αβγENaC injiziert (0,5 ng/Untereinheit). Zur Aktivierung der Kanäle wurde S3969 (10

μM) bzw. Chymotrypsin (2 μg/ml) alleine oder zusammen appliziert. A, Repräsentative

Ganzzell-Stromkurven von αβγENaC exprimierenden Oozyten. Die linke Stromkurve zeigt nach

Auswaschen von Amilorid (2 µM) die Aktivierung mit Chymotrypsin, der eine zusätzliche

Superfusion mit S3969 folgt. Die rechte Stromkurve zeigt den umgekehrten Fall: Wildtyp-ENaC

wird nach Auswaschen von Amilorid mit S3969 und hierauf zusätzlich mit Chymotrypsin

aktiviert. Die Anwesenheit von Amilorid und Chymotrypsin alleine oder zusammen ist

entsprechend gekennzeichnet. B, Zusammenfassung aller zu A analog durchgeführten

Messungen. Linkes Diagramm: Analog zur linken Stromkurve durchgeführte Experimente.

Rechtes Diagramm: Analog zur rechten Stromkurve durchgeführte Experimente. Jeder

Datenpunkt repräsentiert eine individuell gemessene Oozyte, deren ΔΙAmi vor Stimulation durch

eine Linie mit dem zugehörigen ΔΙAmi nach S3969- bzw. Chymotrypsin-Stimulation verbunden

ist. ΔΙAmi nach S3969- bzw. Chymotrypsin-Stimulation ist hierauf mit dem zugehörigen ΔΙAmi

nach Stimulation mit S3969 und gleichzeitig Chymotrypsin verbunden. Gepaarter t-Test.

Ami

IAmi

IAmi+Chymo IAmi+Chymo/S3969

Chymo Chymo/S3969

5 µA

60s

Ami

IAmi

IAmi+S3969 IAmi+S3969/Chymo

S3969 S3969/Chymo

Kontrolle

+ Chym

o

+ Chym

o/S3969

0

10

20

30

40

50 n=5

I A

mi (

A)

Kontrolle

+ S3969

+ S3969/Chym

o

0

5

10

15

20

25

n=5

I A

mi (

A)

A

B

Ami

IAmi

IAmi+Chymo IAmi+Chymo/S3969

Chymo Chymo/S3969

5 µA

60s

Ami

IAmi

IAmi+S3969 IAmi+S3969/Chymo

S3969 S3969/Chymo

Kontrolle

+ Chym

o

+ Chym

o/S3969

0

10

20

30

40

50 n=5

I A

mi (

A)

Kontrolle

+ S3969

+ S3969/Chym

o

0

5

10

15

20

25

n=5

I A

mi (

A)

A

B

A

B

36

5.7 Verschiedene Mutationen an βV348

5.7.1 Aminosäure-Mutationen zeigen unterschiedliche Effekte auf die

ENaC-Funktion

Die Methionin-Seitenkette an Position 348 der β-Untereinheit des mutierten

Kanals besitzt im Vergleich zu der an dieser Stelle im Wildtyp-Kanal

vorkommenden Valin-Seitenkette aufgrund der zusätzlichen -S-CH3-Gruppe

andere Größenverhältnisse. Daher wurden Versuche durchgeführt, um

herauszufinden, ob die Größe oder die Ladung der Aminosäureseitenkette an

Position 348 der β-Untereinheit systematisch die ENaC-Funktion verändert.

Hierfür wurden mit positionsgerichteter Mutagenese verschiedene Mutanten

generiert, die sich sowohl in Ladung als auch Größe der Aminosäuren-

Seitenkette (Abb. 15) unterschieden.

Dabei wurde Valin durch die viel kleinere Aminosäure Glycin (V348G), die

verzweigtkettige Aminosäure Leucin (V348L) oder die aromatische Aminosäure

Tryptophan (V348W) ersetzt. Zudem wurden sowohl die sich in ihrer Länge um

eine CH3-Gruppe unterscheidenden negativ geladenen Aminosäuren Aspartat

(V348D) und Glutamat (V348E), als auch die positiv geladene Aminosäure

Lysin (V348K) als Ersatz für das Valin verwendet. Als weitere Mutante wurde

das Amid Glutamin untersucht (V348Q). Außerdem wurde V348 deletiert

(V348del).

Abb. 15: Aminosäuren, die durch positionsgerichtete Mutagenese zur Generierung

verschiedener Mutanten eingesetzt wurden.

O

NH2 OH

O

NH2

NH2 OH

O

NH2

SOH

O

NH2

OH

O

NH2NH

OH

O O

OHOH

NH2

O

NH2

OH

OHOH

NH2O

O

O

O

NH2

NH2

OH

Lysin (K) Glycin (G)

O

NH2 OH

O

NH2

NH2 OH

O

NH2

SOH

O

NH2

OH

O

NH2NH

OH

O O

OHOH

NH2

O

NH2

OH

OHOH

NH2O

O

O

O

NH2

NH2

OH

Leucin (L)

O

NH2 OH

O

NH2

NH2 OH

O

NH2

SOH

O

NH2

OH

O

NH2NH

OH

O O

OHOH

NH2

O

NH2

OH

OHOH

NH2O

O

O

O

NH2

NH2

OH

Tryptophan (T)

O

NH2 OH

O

NH2

NH2 OH

O

NH2

SOH

O

NH2

OH

O

NH2NH

OH

O O

OHOH

NH2

O

NH2

OH

OHOH

NH2O

O

O

O

NH2

NH2

OH

Glutamat (E)

O

NH2 OH

O

NH2

NH2 OH

O

NH2

SOH

O

NH2

OH

O

NH2NH

OH

O O

OHOH

NH2

O

NH2

OH

OHOH

NH2O

O

O

O

NH2

NH2

OH

Glutamin (Q)

O

NH2 OH

O

NH2

NH2 OH

O

NH2

SOH

O

NH2

OH

O

NH2NH

OH

O O

OHOH

NH2

O

NH2

OH

OHOH

NH2O

O

O

O

NH2

NH2

OH

Aspartat (D)

O

NH2 OH

O

NH2

NH2 OH

O

NH2

SOH

O

NH2

OH

O

NH2NH

OH

O O

OHOH

NH2

O

NH2

OH

OHOH

NH2O

O

O

O

NH2

NH2

OH

Valin (V)

O

NH2 OH

O

NH2

NH2 OH

O

NH2

SOH

O

NH2

OH

O

NH2NH

OH

O O

OHOH

NH2

O

NH2

OH

OHOH

NH2O

O

O

O

NH2

NH2

OH

Methionin (M)

O

NH2 OH

O

NH2

NH2 OH

O

NH2

SOH

O

NH2

OH

O

NH2NH

OH

O O

OHOH

NH2

O

NH2

OH

OHOH

NH2O

O

O

O

NH2

NH2

OH

37

Für die Untersuchung der Effekte auf ΔIAmi der einzelnen Mutanten wurden

jeweils zwei unterschiedliche cRNA-Batches verwendet, die vergleichbare

Ergebnisse lieferten. Abb. 16 zeigt die Zusammenfassung dieser Versuche. Die

verschiedenen Mutanten sind dabei nach der Größe des Effekts auf ΔIAmi

angeordnet.

Dabei stimulierte die kleinste und ungeladene Aminosäure Glycin genauso wie

die größere und positiv geladene Aminosäure Lysin ΔIAmi stärker als die

βV348M-Mutation. Einen ebenfalls stimulatorischen, aber geringeren Effekt als

die βV348M-Mutation übten das ungeladene Leucin und das aromatische

Tryptophan auf ΔIAmi aus.

Das negativ geladene Glutamat hatte dagegen keinen Effekt auf die ENaC-

Funktion im Vergleich zum Wildtyp. Das ebenfalls negativ geladene Aspartat

zeigte sogar einen geringen inhibitorischen Effekt.

Interessanterweise bewirkte die Insertion der polaren Aminosäure Glutamin in

ähnlicher Weise wie die Deletion des Valins an Position 348 der β-Untereinheit

einen beinahe vollständigen Verlust der ENaC-Funktion.

Insgesamt ergab sich in den Versuchen der an Position 348 der β-Untereinheit

mutierten Kanäle kein systematischer Zusammenhang zwischen dem Effekt auf

ΔIAmi und Ladung oder Größe der Aminosäure.

Abb. 16: Aminosäure-Mutationen zeigen unterschiedliche Effekte auf die ENaC-Funktion

(mod. nach [55]). Die Oozyten wurden mit cRNA von Wildtyp-ENaC (wt) oder der

unterschiedlichen Mutanten (wie unter den Säulen angegeben) injiziert (0,5 ng/Untereinheit).

ΔIAmi wurde 2 Tage nach Injektion bestimmt. Um die Daten aus verschiedenen Batches Oozyten

zusammenzufassen, wurde ΔIAmi der Mutanten auf den durchschnittlichen ΔIAmi der

entsprechenden Wildtyp-ENaC (wt) exprimierenden Oozyten normalisiert. ANOVA mit Dunnett’s

Multiple Comparison Test gegen Wildtyp-Kontrolle.

V34

8G

V34

8K

V34

8M

V34

8L

V34

8W

V34

8E wt

V34

8D

V34

8Q

V34

8del

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

249178 749191 120121 92121 90

N=9-28***

******

*** ***

*

*** *** I

Am

i(n

orm

alis

iert

)

38

5.7.2 Effekte der Mutationen auf die Proteinexpression

Um zu untersuchen, ob die Effekte der Mutanten auf ΔIAmi auf einer veränderten

Proteinexpression des Kanals intrazellulär oder in der Membran beruht, wurde

in weiteren Versuchen parallel zur Bestimmung von ΔIAmi in Oozyten aus der

gleichen Präparation die Proteinexpression von β-ENaC bestimmt.

Die intrazelluläre Proteinexpression zeigte mit Ausnahme von V348Q und

V348del keine signifikanten Unterschiede zwischen Wildtyp und den

unterschiedlichen Mutanten (Abb. 17B). V348Q und V348del wurden signifikant

geringer exprimiert als der Wildtyp.

Die Proteinexpression in der Membran zeigte mit Ausnahme von V348Q und

V348del ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zwischen Wildtyp und den

unterschiedlichen Mutanten (Abb. 17C). V348Q und V348del wurden auch in

der Membran signifikant geringer exprimiert als der Wildtyp.

Die Effekte der Mutationen auf ΔIAmi lassen sich somit nicht durch Unterschiede

in der Proteinexpression intrazellulär oder in der Membran erklären, mit

Ausnahme von V348Q und V348del. Eine Erhöhung der in die Membran

integrierten ENaC-Moleküle scheint somit auch nicht zum „gain-of-function“-

Effekt der βV348M-Mutante beizutragen.

39

V34

8G

V34

8K

V34

8M

V34

8L

V34

8W

V34

8E wt

V34

8D

V34

8Q

V34

8del

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

**

4 48 44 48 444

*****

E

NaC

intrazellu

lär (n

orm

.)

V348G

V348K

V348M

V348L

V348W

V348E w

t

V348D

V348Q

V348d

el

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

*** 4 48 44 48 444** **

E

NaC

in M

em

bra

n (norm

.)

V34

8G

V34

8K

V34

8M

V34

8L

V34

8W

V34

8E wt

V34

8D

V34

8Q

V34

8del

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

8282 404040 4042 4242 42

N=4-8***

****** *****

******

I

Am

i(n

orm

.)

A

B

C

D

40

Abb. 17: Auswirkungen der unterschiedlichen Mutationen auf die βENaC-Expression

intrazellulär und in der Zellmembran (mod. nach [55]). Die Oozyten wurden mit cRNA von

Wildtyp-ENaC (wt) oder der unterschiedlichen Mutanten (wie angegeben) injiziert (0,5

ng/Untereinheit) und für zwei Tage inkubiert. Intrazelluläres und aus der Zellmembran

stammendes Protein wurden mit SDS-PAGE aufgetrennt und β-ENaC durch spezifische

Antikörper nachgewiesen. A, Repräsentative Western Blots. B und C, Experimente wie in A

wurden viermal durchgeführt und die Signale mittels densitometrischer Analyse quantifiziert. Die

Zahlen in den Säulen geben hier die Anzahl an untersuchter Oozyten-Batches an. D, ΔIAmi der

unter den Säulen gekennzeichneten βV348-Mutanten aus den Experimenten von B und C. Um

die Variabilität von Batch zu Batch zu korrigieren, wurden die Daten jeweils auf die

entsprechende Wildtyp-Kontrolle normalisiert. ANOVA mit Dunnett’s Multiple Comparison Test

gegen Wildtyp-Kontrolle.

41

5.7.3 Proteolytische Aktivierung der mutierten Kanäle mit Chymotrypsin

Da sich die verschiedenen Mutanten, mit Ausnahme der beiden stark

inhibitorischen Mutanten V348Q und V348del, in der Proteinexpression von β-

ENaC in der Membran nicht unterschieden, führen wahrscheinlich Unterschiede

der mittleren Po zu den veränderten ΔIAmi-Werten. Um dies nachzuweisen,

wurden die einzelnen Mutanten mit Ausnahme von V348Q und V348del (wegen

mangelnder Expression in der Zellmembran) mit Chymotryspin stimuliert. Wie

gezeigt (vgl. 5.4) aktiviert Chymotrypsin ΔIAmi maximal. Unterschiede der Po der

Mutanten können demnach durch Unterschiede in der relativen Aktivierung

durch Chymotrypsin erfasst werden. Der Versuchsablauf und die Auswertung

der Daten erfolgte wie in 5.4 beschrieben.

Die Ergebnisse sind in Abb. 18A zusammengefasst. ΔIAmi erreichte nach der

Aktivierung mit Chymotrypsin bei allen Mutanten ähnliche Werte, was die

ähnliche Expression der Mutanten in der Oberflächenmembran anzeigt. In Abb.

18B sind die relativen stimulatorischen Effekte gegen die normalisierten

„Baseline“-ΔIAmi-Werte vor Aktivierung mit Chymotrypsin aufgetragen. Die

Abbildung zeigt, dass ein höherer „Baseline“-ΔIAmi mit einer geringeren relativen

Aktivierung durch Chymotrypsin einhergeht. Dies deutet darauf hin, dass die bei

einigen Mutanten beobachteten höheren „Baseline“-ΔIAmi-Werte durch eine

erhöhte Po vor Chymotrypsin-Aktivierung verursacht werden.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Substitution von βV348 durch

andere Aminosäuren in den meisten Fällen die mittlere Po verändert. Nur im

Fall der stark inhibitorischen Mutanten V348Q und V348del wird der „loss-of-

function“-Effekt durch eine reduzierte Expression der Kanäle in der Membran

verursacht.

42

V34

8G

V34

8K

V34

8M

V34

8L

V34

8W

V34

8E wt

V34

8D

0

1

2

3

4

5

6- Chymotrypsin + Chymotrypsin

I A

mi (n

orm

alis

iert

)

N=3

0.5 1.0 1.5 2.02

3

4

5wt

V348M

V348G

V348L

V348W

V348K

V348D

V348E

IAmi (normalisiert)

Rela

tive

Aktivi

eru

ng

A

B

Abb. 18: Aktivierung der unterschiedlichen Mutanten mit Chymotrypsin (mod. nach [55]).

A, Wildtyp-ENaC (wt) und die unterschiedlichen Mutanten wurden in Oozyten exprimiert und

ΔIAmi mit der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme detektiert. ENaC wurde mit Chymotrypsin

aktiviert wie in Abb. 12A gezeigt. Die Daten stellen eine Zusammenfassung aus je 47 Oozyten

für Wildtyp- und βV348M-ENaC und je 21-24 Oozyten für die übrigen Mutanten dar. Um die

Variabilität von Batch zu Batch zu korrigieren, wurden die Daten auf den durchschnittlichen

ΔIAmi von Wildtyp exprimierenden Oozyten vor Chymotrypsin-Aktivierung normalisiert. B, Die

gleichen Daten wie in A. Die relative Aktivierung durch Chymotrypsin wurde gegen den auf den

Wildtyp normaliserten ΔIAmi vor Chymotrypsin-Aktivierung aufgetragen.

43

6. Diskussion

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Auswirkung einer Mutation der β-

Untereinheit von ENaC auf die Funktion des Kanals untersucht. Die Mutation

wurde in einem Patienten mit ausgeprägten Symptomen der zystischen Fibrose

entdeckt [51]. Insgesamt stellte sich ein stimulatorischer Effekt auf ΔIami von

etwa 40% heraus. Die funktionelle Charakterisierung wurde in Xenopus laevis

Oozyten als heterologem Expressionssystem durchgeführt.

6.1 Xenopus laevis Oozyten als heterologes Expressions-

system

Die Oozyten bieten wie jedes andere wissenschaftliche Modell Vor- und

Nachteile, so in Bezug auf die Handhabung der Oozyten und die

Interpretierbarkeit der Ergebnisse. Attraktiv machen das System zum einen der

große Durchmesser der Oozyten von etwa 1,1 mm (Stadium V und VI nach

Dumont), was die Handhabung der Zellen erleichtert [21]. Zum anderen weisen

die Oozyten einen gut ausgestatteten Proteinbiosyntheseapparat mit Proteinen,

Enzymen und Organellen auf, der für die embryonale Entwicklung zur

Verfügung steht, aber auch zur Expression exogener mRNA entsprechend

verwendet werden kann [45]. Ebenso laufen in der Oozyte posttranslationale

Modifikationen wie Glykosylierungen, Acetylierungen und Phosphorylierungen

auch von fremden Proteinen in korrekter Weise ab [16]. Die Oozyten sind dazu

befähigt, Proteine auch gemäß ihrer Funktion an die richtige Lokalisation zu

bringen, so dass integrale Membranproteine, wie Ionenkanäle, die

Oozytenmembran erreichen [16]. Dadurch bleiben die Eigenschaften von

Ionenkanälen nahezu unverändert, obwohl sie in fremden Zellen exprimiert

werden. Auch die Tatsache, dass weibliche Frösche das ganze Jahr über eine

Vielzahl von Oozyten aller Entwicklungsstufen beherbergen und auch die

Haltung der Frösche sich weitgehend unproblematisch gestaltet, gehört zu den

Vorteilen des Oozytenexpressionssystems.

Als Nachteile oder Einschränkungen des Systems sind zu nennen, dass Fälle

von nicht korrekt posttranslational modifizierten Proteinen beschrieben sind,

beispielsweise solcher, die sonst gewebespezifisch prozessiert werden [16].

Auch können durch die Defollikulierung bzw. Behandlung mit Kollagenase

44

Defekte in der Oozytenmembran entstehen, die sich ähnlich wie unspezifische

Ionenkanäle verhalten können. Diese können in gleicher Weise wie endogen

exprimierte Kanäle Störquellen für die Messung spezifischer Ströme darstellen

[16].

Fraglich bleibt auch, ob die Ausstattung der second-messenger-Systeme in der

Oozyte der von menschlichen Zellen entspricht, ob folglich Regulationen in

ähnlicher Weise wie im Menschen ablaufen können. Auch die oftmals sehr

heterogenen Ionenkonzentrationen, die sich in Oozyten finden lassen, könnten

für die Messung eine Störquelle darstellen [16, 74].

Generell stellt die heterologe Expression in Oozyten von Xenopus laevis zur

Untersuchung von Ionenkanälen wie ENaC ein gut etabliertes Verfahren dar.

6.2 Einflüsse der cRNA-Qualität

Unterschiede in der cRNA-Qualität können sich auf die Höhe der

Proteinexpression auswirken. Um Fehler zu vermeiden, die auf Unterschieden

der cRNA-Qualität beruhen, wurden in den Versuchen mehrere Batches cRNA

verwendet, um den stimulatorischen Effekt der βV348M-Mutante zu bestätigen.

Auch für alle anderen Mutanten wurden mehrere Batches cRNA angefertigt.

Desweiteren wurde die cRNA der Mutanten jeweils parallel zur entsprechenden

Wildtyp-cRNA synthetisiert, um die Variabilität der Qualität der cRNA möglichst

gering zu halten. Zusätzlich wurden der intrazelluläre und der aus der Membran

stammende Gehalt an β-ENaC von Wildtyp und βV348M-Mutante durch

Western Blot bestimmt, wobei sich eine ähnliche Proteinexpression zeigte.

Aufgrund dieser Maßnahmen ist davon auszugehen, dass der „gain-of-

function“-Effekt der βV348M-Mutation verlässlich nachgewiesen wurde.

Interessanterweise gab es zwei Mutationen (V348Q und V348del), die die

Proteinexpression sowohl intrazellulär als auch in der Zellmembran stark

beeinträchtigten. Als Grund für dieses Ergebnis kommt neben einer im

Vergleich zum Menschen unterschiedlichen Verwendung von bestimmten

Codons in Xenopus laevis Oozyten auch eine mögliche Erkennung als falsch

gefaltetes oder unreifes Protein mit anschließender Degradation in Frage. Der

Nachweis der reduzierten Proteinexpression als Ursache für den „loss-of-

function“-Effekt dieser Mutanten durch Western Blot bestätigt die Validität der in

dieser Arbeit verwendeten Methoden.

45

6.3 Einfluss der intrazellulären Na+-Konzentration

Bei der von Kellenberger et al. untersuchten Liddle-Mutation der β-Untereinheit

konnten in entsprechend injizierten Oozyten nach Inkubation mit Na+-armer

Lösung keine Steigerungen von ΔIAmi im Vergleich zum Wildtyp gefunden

werden [36]. Nach Inkubation in Na+-reicher Lösung und dadurch gesteigerter

intrazellulärer Na+-Konzentration zeigte sich dagegen ein im Vergleich zum

Wildtyp etwa 3-fach erhöhter ΔIAmi der Mutante. Diese Resultate sind Folge der

gestörten „Na+-Feedback-Inhibition“ bei Liddle-Mutanten. Normalerweise führt

die Inkubation in Na+-reicher Lösung (z.B. ND96) in mit ENaC-cRNA injizierten

Oozyten zu einer Reduktion der von ENaC-vermittelten Ströme im Vergleich zu

in Na+-armer Lösung (z.B. ND9) inkubierten Oozyten. Dieses Phänomen wird

durch eine reduzierte Expression der Kanäle in der Oberflächenmembran

verursacht [36, 43, 72]. Auch in den Versuchen dieser Arbeit wurde dieser

Effekt beobachtet. ΔIAmi war bei Wildtyp und βV348M-Mutante nach Inkubation

mit ND96 im Vergleich zur Inkubation mit ND9 stark verringert. Die Reduktion

der Expression von ENaC nach Inkubation in Na+-reicher Lösung fiel bei der

von Kellenberger et al. untersuchten Liddle-Mutante jedoch deutlich geringer

aus [36], was sich in einer Vergrößerung des „gain-of-function“-Effekts unter

diesen Bedingungen zeigte. Eine derartige Steigerung des stimulatorischen

Effekts auf ΔIAmi konnte bei der βV348M-Mutante gegenüber dem Wildtyp-Kanal

nach Inkubation der Oozyten in ND96 nicht gezeigt werden. Diese Ergebnisse

deuten darauf hin, dass bei der βV348M-Mutation im Gegensatz zu der von

Kellenberger et al. untersuchten Liddle-Mutation der Mechanismus der Na+-

Feedback-Inhibition für die Ausbildung des „gain-of-function“-Effekts keine Rolle

spielt. In der Tat bewirkt die Liddle-Mutation überwiegend eine Zunahme der

Oberflächenexpression des Kanals, wohingegen die Befunde dieser Arbeit

zeigen, dass die βV348M-Mutation vor allem die mittlere Po erhöht.

6.4 Mittlere Po

ENaC kann in mindestens zwei Zuständen in der Plasmamembran vorliegen,

nämlich als Kanal mit hoher Offenwahrscheinlichkeit (Po ~0,5), aber auch als

Kanal mit sehr niedriger Po von kleiner 0,05 als sog. „near-silent“-Kanal [9, 38,

58]. Aufgrund dieser Heterogenität der Po von ENaC lässt sich die mittlere Po

46

mit der Patch-Clamp-Technik nur schlecht abschätzen [28]. Zudem können

„near-silent“-Kanäle in der Patch-Clamp-Technik nur schwer erfasst werden

[19]. Die Größe des „gain-of-function“-Effekts der βV348M-Mutante im Vergleich

zum Wildtyp ließ außerdem nur einen geringen Unterschied der mittleren Po

erwarten, so dass für eine verlässliche Detektion dieses Unterschieds mit der

Patch-Clamp-Technik sehr viele Einzelmessungen notwendig gewesen wären.

Deshalb wurde die Bestimmung der Po mithilfe einer indirekten Methode

durchgeführt, der als Mechanismus die maximale Aktivierung von ENaC durch

MTSET zugrunde lag. Hierfür wurden βS520C-Mutanten von Wildtyp und

βV348M-ENaC hergestellt und mit MTSET aktiviert. Diese Methode wurde

bereits für die Untersuchung anderer ENaC-Mutanten erfolgreich eingesetzt

[30, 32].

Die Aktivierung mit MTSET zeigte eine gesteigerte mittlere Po der βV348M-

Mutante, die ausreicht, um den stimulatorischen Effekt der βV348M-Mutante

gegenüber dem Wildtyp vollständig zu erklären.

Falls die Stimulation allein auf einer Erhöhung der Po beruht, sollte die Anzahl

der Kanäle in der Zellmembran unverändert sein. Dies würde sich in ähnlichen

Werten von ΔIAmi des Wildtyps und der βV348M-Mutante nach maximaler

Stimulation mit MTSET widerspiegeln, die in den Experimenten auch tatsächlich

nachgewiesen werden konnten. Durch die unabhängige Methode der

Biotinylierung der Membranproteine konnten zudem gleiche Mengen an βENaC

in der Membran für Wildtyp und βV348M-Mutante nachgewiesen werden. Der

„gain-of-function“-Effekt der βV348M-Mutante beruht deshalb vermutlich allein

auf einer gesteigerten Po bei unveränderter Expression in der Zellmembran.

Ursächlich für die Erhöhung der mittleren Po der βV348M-Mutante könnte zum

einen eine im Vergleich zum Wildtyp geringere Anzahl von „near-silent“-

Kanälen in der Zellmembran sein, während aktive Kanäle entsprechend

vermehrt exprimiert sein könnten. Diese Möglichkeit wurde zum Beispiel bei der

αW493R-Mutante beschrieben [54]. Der stimulatorische Effekt dieser Mutante

belief sich auf einer 4-fachen Steigerung von ΔIAmi. Der im Vergleich dazu nur

geringe Unterschied der mittleren Po zwischen Wildtyp-ENaC und βV348M-

Mutante macht es jedoch unwahrscheinlich, dass die βV348M-Mutation die

mittlere Po durch eine deutliche Reduktion des Anteils an „near-silent“-Kanälen

in der Zellmembran steigert. Daher ist es wahrscheinlicher, dass eine

47

zusätzliche Po-Erhöhung schon aktiver Kanäle für den stimulatorischen Effekt

der βV348M-Mutante verantwortlich ist.

6.5 Proteolytische Kanalaktivierung mit Chymotrypsin

Sowohl endogene als auch exogene Proteasen können ENaC aktivieren, indem

sie den Kanal in der extrazellulären Schleife schneiden. Die Folge ist eine

Erhöhung der mittleren Po und weniger eine Erhöhung der Zahl n der in die

Membran integrierten Kanäle [27].

Serinproteasen, zu denen auch Trypsin und Chymotrypsin gehören, spalten

ENaC während der Kanal-Biosynthese oder an der Zelloberfläche in

extrazellulären Domänen der α- und γ-Untereinheit [33, 60]. Die geschnittenen

Kanäle stellen hierbei vermutlich die reiferen, aktiveren Kanäle dar.

In Oozyten aktiviert Trypsin makroskopische ENaC-Ströme in ähnlicher Weise

wie Chymotrypsin [19, 22, 32, 54]. Zu Beginn der Trypsin-Exposition entstehen

jedoch vorübergehend Calcium-aktivierte Chlorid-Leitfähigkeiten, die störende

einwärts gerichtete Stromkomponenten verursachen. Unter Chymotrypsin

lassen sich ähnliche Effekte nicht erkennen. Deshalb wurde es in der

vorliegenden Arbeit verwendet, um einen Unterschied in der proteolytischen

Aktivierbarkeit zwischen Wildtyp und Mutanten zu überprüfen [15, 19, 22].

Die Versuche der proteolytischen Aktivierung mit Chymotrypsin zeigten

ähnliche Effekte auf ΔIAmi wie die Bestimmung der mittleren Po mit MTSET. Dies

lässt darauf schließen, dass Chymotrypsin wie MTSET die Kanäle vollständig

aktiviert. Im Widerspruch zu diesen Ergebnissen konnte in einer Arbeit von

Diakov et al. [19] ENaC der Spezies Ratte (rENaC) in αβS518CγrENaC

exprimierenden Oozyten (entspricht αβS520CγENaC in humanem ENaC) nach

vorheriger Stimulation mit MTSET durch Trypsin noch weiter aktiviert werden.

Dies könnte daran liegen, dass Trypsin neben aktiven Kanälen auch „near-

silent“-Kanäle aktivieren kann, wie es für Chymotrypsin in „Outside-Out-

Patches“ von ENaC exprimierenden Oozyten gezeigt werden konnte [54].

Bisher war jedoch nicht hinreichend geklärt, ob MTSET ebenso „near-silent“-

Kanäle aktivieren kann. Die Ergebnisse von Diakov et al. [19] lassen vermuten,

dass MTSET ausschließlich aktive Kanäle aktivieren kann, „near-silent“-Kanäle

von der Aktivierung dagegen nicht erfasst werden. Dadurch könnte die mittlere

48

Po aller an der Zelloberfläche befindlichen Kanäle durch die Ermittlung mit

MTSET überschätzt werden.

Die ähnlichen stimulatorischen Effekte von MTSET und Chymotrypsin in der

vorliegenden Arbeit deuten jedoch darauf hin, dass auch MTSET „near-silent“-

Kanäle aktivieren kann. Die Diskrepanz zu den Ergebnissen von Diakov et al.

kann vermutlich durch Spezies-spezifische Unterschiede im Schaltverhalten

(„Gating“) von ENaC erklärt werden [37]. MTSET bindet mutmaßlich nur an die

offene Konformation des Kanals [37, 66]. Falls die Zeiten in offener

Konformation von humanem „near-silent“-ENaC länger sind als von „near-

silent“-ENaC der Ratte, könnte MTSET humanen ENaC besser aktivieren als

ENaC der Ratte. Vergleichende Untersuchungen der Öffnungszeiten von „near-

silent“-Kanälen von humanem ENaC und ENaC der Ratte sind bisher nicht

bekannt und technisch auch nur schwer durchführbar.

6.6 ENaC-Aktivator S3969

Lu et al. [46] fanden heraus, dass sich eine Spleiß-Variante von humanem β-

ENaC, in der die Aminosäure Valin an Position 348 der β-Untereinheit deletiert

war, nicht durch den neuen niedermolekularen ENaC-Aktivator S3969

aktivieren ließ. Somit könnte eine Mutation an dieser Stelle die Aktivierbarkeit

durch S3969 beeinflussen. Aus diesen Gründen wurde Wildtyp- und βV348M-

ENaC im Vergleich mit S3969 aktiviert.

Der stimulatorische Effekt von S3969 auf ΔIami Wildtyp-ENaC exprimierender

Oozyten war geringer als der von Chymotrypsin oder auch als der von MTSET

auf ΔIami von αβS520CγENaC exprimierenden Oozyten.

Außerdem ließ sich ΔIami nach Stimulation mit S3969 durch Chymotrypsin noch

weiter stimulieren. Für die zusätzliche Stimulation konnte zwar keine Signifikanz

nachgewiesen werden, was vermutlich an der geringen Anzahl von 5 Oozyten

pro untersuchter Gruppe lag, ein Trend zeigte sich aber in allen untersuchten

Oozyten. Dies spricht dafür, dass S3969 ENaC nur unvollständig stimulierte.

Der Grund hierfür könnte darin liegen, dass der maximale Effekt des Aktivators

erst bei einer Konzentration von 30 µM erreicht wird [46]. Im Rahmen dieser

Arbeit wurde jedoch eine 10 µM-Lösung verwendet.

Nach Lu et al. [46] ist die Anwesenheit von βV348 essentiell für den

stimulatorischen Effekt von S3969 auf ΔIami. In der vorliegenden Arbeit ließ sich

49

allerdings auch die βV348M-Mutante durch S3969 stimulieren. Die etwas

geringere relative Aktivierung im Vergleich zum Wildtyp lässt sich durch die

höhere mittlere Po der βV348M-Mutante plausibel erklären. Interessanterweise

ließen sich auch drei andere Mutanten, βV348K, βV348W und βV348E durch

S3969 stimulieren (Daten nicht gezeigt). Somit scheint das Valin an Position

348 der β-Untereinheit von ENaC nicht entscheidend für die aktivierende

Funktion von S3969 zu sein, sondern vielmehr die Anwesenheit einer

Aminosäure an dieser Stelle. Die Deletion von βV348 könnte dagegen die

Tertiärstruktur von ENaC derart verändern, dass eine Stimulation durch S3969

unmöglich wird.

6.7 Weitere βV348-Mutanten und ENaC-Modell

Um den molekularen Mechanismus der Po-Erhöhung der βV348M-Mutante zu

untersuchen, wurden Experimente mit verschiedenen Mutanten an Position 348

der β-Untereinheit durchgeführt. Interessanterweise führte der Austausch von

Valin durch einige andere Aminosäuren an dieser Stelle ebenfalls zu einer

Veränderung der ENaC-Ströme. Als Ursache hierfür stellte sich wie bei der

βV348M-Mutante eine Veränderung der mittleren Po bei gleicher Expression

von ENaC in der Zellmembran heraus. Ausnahmen waren die V348Q- und

V348del-Mutante, die keine entsprechende Expression in der Membran zeigten.

Zur Abschätzung der mittleren Po der Mutanten wurde die proteolytische

Aktvierung mit Chymotrypsin herangezogen und analog zur Aktivierung der

βV348M-Mutante mit Chymotrypsin durchgeführt. Der Kanal ließ sich durch

Chymotrypsin in gleicher Weise wie durch MTSET maximal stimulieren und

kann somit zur Bestimmung der Po herangezogen werden. Auf die Bestimmung

der Po durch Stimulation mit MTSET und der damit verbundenen Herstellung

zahlreicher weiterer Mutanten mit zusätzlicher βS520C-Mutation wurde deshalb

verzichtet.

Die Veränderung der Po durch die verschiedenen Mutanten konnte nicht einfach

durch Größe oder Ladung der Seitenkette der stimulierenden Aminosäuren

erklärt werden.

Aus diesem Grund wurde von Prof. Heinrich Sticht an einem zur Kristallstruktur

von ASIC homologen ENaC-Modell [68] die Mikrodomäne um die Aminosäure

V348 der β-Untereinheit im vermutlich geschlossenen Zustand des Kanals

50

analysiert [55]. Die Analyse zeigt, dass V348 nicht nur mit Aminosäuren aus der

eigenen „Palm“-Region, sondern auch mit dem am Verbindungsstück zwischen

„Palm“ und der β-„ball“-Domäne liegenden M90 (Methionin) interagiert (Abb. 2

bzw. 19A). Im Fall der kleinsten Aminosäure Glycin (V348G) lässt das Fehlen

der Seitenkette eine Lücke entstehen. Dadurch kommt es zu einem

Kontaktverlust zu M90, was wiederum die Stabilität der entsprechenden Region

herabsetzt (Abb. 19B). Eine Mutation zu Lysin (V348K) führt dagegen zu einer

räumlichen Kollision mit M90, außerdem zu einer elektrostatischen Abstoßung

von K350 (Lysin) (Abb. 19C). Kollisionen der Aminosäure 348 mit M90 sind in

ähnlicher Weise bei V348M (Abb. 19D), V348L (Leucin) und V348W

(Tryptophan) zu beobachten (Daten nicht gezeigt).

Alle bisher genannten Mutanten sind entweder durch den Bindungsverlust zu

M90 oder durch räumliche Kollisionen mit M90 charakterisiert. Beide Effekte

sind energetisch gesehen unvorteilhaft und destabilisieren vermutlich die

Interaktion von „Palm“-und β-„Ball“-Domäne. Sie erleichtern dadurch vermutlich

den Übergang in die offene Konformation des Kanals. Die auf diese Art

entstandene Erhöhung der Po könnte die Ursache für die ΔIAmi-steigernden

Effekte dieser Mutanten sein. Eine genauere strukturelle Interpretation dieses

Effekts kann jedoch erst nach Vorliegen der Kristallstruktur des offenen Kanals

erfolgen. Diese liegt momentan jedoch noch nicht vor.

Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Mutationen führt die Mutation zu

Glutamat (βV348E) oder Aspartat (βV348D) im Modell zur Ausbildung einer

neuen, stabilisierenden Salzbrücke mit K350 (Abb. 19E). Dieselbe Art von

Interaktion ist interessanterweise auch in der Kristallstruktur des homologen

ASIC 1-Kanals zu beobachten (Abb. 19F). Diese Mutanten stabilisieren durch

die Salzbrücke den geschlossenen Zustand von ENaC. Dies könnte die

Ursache dafür sein, dass die βV348E-Mutante keinen stimulatorischen Effekt

auf ΔIAmi zeigt, die βV348D-Mutante sogar einen leicht inhibitorischen Effekt.

Zusammenfassend stehen die Vorhersagen, die anhand des ENaC-Modells

getroffen wurden, im Einklang mit den experimentellen Befunden der

vorliegenden Doktorarbeit.

51

Abb. 19: Räumliche Effekte verschiedener βV348-Mutationen im ENaC-Modell (mod. nach

[55]). A, Position 348 der β-Untereinheit in der Struktur des Wildtyps: V348 ist grün dargestellt,

die räumlich anliegenden Aminosäuren samt Seitenketten sind im Kalottenmodell abgebildet.

Die Aminosäuren M90 und K350, die für die Interaktionen der Mutanten von Bedeutung sind,

sind markiert. B, Gleiche Ansicht wie in A, jetzt für die V348G-Mutation. Die Lücke, die durch

das Fehlen der Seitenkette von Glycin zwischen G348 (grün) und M90 entsteht, ist gut sichtbar.

C, Die V348K-Mutante resultiert in räumlichen Kollisionen mit M90 (roter Pfeil) und

elektrostatischer Abstoßung von K350 (brauner Pfeil). D, M348 verursacht Kollisionen mit M90

(roter Pfeil). E, D348 bildet eine neue Salzbrücke mit K350 (grüner Pfeil) aus. F, E278-R280

(Glutamat-Arginin) Salzbrücke in der Kristallstruktur des homologen ASIC 1-Ionenkanals.

Weitere benachbarte Aminosäuren von β348 wurden in den Feldern C bis F aus Gründen der

Übersichtlichkeit nicht abgebildet.

A B

D

C

E F

52

6.8 Klinische Relevanz der βV348M-Mutation

Der „gain-of function“-Effekt der βV348M-Mutante konnte auf eine Erhöhung der

Po zurückgeführt werden. Dieser Befund steht in Einklang mit dem

pathophysiologischen Konzept, dass bei betroffenen Patienten durch eine

ENaC-Überfunktion vermehrt Na+-Ionen und dadurch Flüssigkeit im

Respirationstrakt resorbiert werden. Durch Reduktion der ASL-Höhe und der

„mukoziliären Clearance“ könnten dann die typischen pulmonalen Symptome

der CF entstehen. In der Vergangenheit wurden bereits „gain-of-function“-

Mutationen in ENaC beschrieben, die bei Patienten mit CF-ähnlicher

Lungenaffektion entdeckt wurden und dort wahrscheinlich auf ähnliche Weise

pathophysiologisch relevant sind [3, 54, 64].

Die von Azad et al. [3] und Sheridan et al. [64] beschriebenen CF-Patienten

zeigten alle einen milderen Phänotyp. Mutesa et al. berichteten bei dem

Patienten, der die βV348M-Mutation in seinem Genom trägt, jedoch von einer

schweren Ausprägung seiner CF-ähnlichen Symptome [51]. Es ist deshalb

wahrscheinlich, dass neben dem stimulatorischen Effekt der βV348M-Mutation

noch andere Faktoren zum Phänotyp des Patienten beitragen.

Bei dem Patienten wurde zusätzlich eine F693L-CFTR-Mutation gefunden. Die

schwere Ausprägung der Symptome könnte folglich durch einen

synergistischen Effekt zwischen einer ENaC-„gain-of-function“-Mutation und

einer CFTR-„loss-of-function“-Mutation zustande kommen. Die F693L-Mutation

wurde jedoch als ein Polymorphismus beschrieben, von dem im Vergleich zu

Wildtyp-CFTR in COS1-Zellen kein Effekt auf den Reifungsprozess des Kanals

beschrieben wurde. Außerdem konnte im Oozytenexpressionssystem keine

Auswirkung auf die Chloridkanaleigenschaften der F693L-Mutante gezeigt

werden [71]. Aus diesem Grund ist es unwahrscheinlich, dass die F693L-

Mutation direkt krankheitsverursachend ist.

Interessanterweise berichten Mutesa et al. [51] von einem zweiten Patienten mit

schwerwiegenden CF-ähnlichen Symptomen, der neben dieser F693L-CFTR-

Mutation eine βG442V-ENaC-Mutation in seinem Genom trägt. Von der

βG442V-Mutation wurde berichtet, dass sie keine signifikanten Effekte auf

ENaC-vermittelte Na+-Ströme in Oozyten ausübt [2, 53].

53

Dieser Fall zeigt, dass Patienten mit einem CF-Phänotyp Mutationen in ENaC

und CFTR aufweisen können, die in Expressionsmodellen keine Auswirkungen

auf die gemessenen Ströme haben.

Im respiratorischen Epithel interagieren ENaC und CFTR auf komplexe Art und

Weise. Dabei führt die Aktivierung von CFTR zu einer Inhibition von ENaC über

bisher unbekannte Mechanismen [6, 12]. So könnte die F693L-CFTR-Mutation

zu einem Verlust der inhibitorischen Wirkung von CFTR auf ENaC führen und

dadurch zusätzlich die ASL-Höhe durch gesteigerte Na+-Resorption

vermindern.

Diese Überlegungen zeigen, wie komplex und unverstanden die Entstehung

des Lungenphänotyps bei CF ist. Dies wird auch dadurch verdeutlicht, dass

nicht in allen Patienten mit atypischer CF und keinem oder nur einem

betroffenen CFTR-Allel ENaC-Mutationen mit stimulierendem Effekt auf ΔIami im

Oozytenexpressionsmodell nachgewiesen wurden. Andere bei solchen

Patienten identifizierte Mutationen hatten keinen oder sogar inhibitorische

Effekte auf die ENaC-Funktion [3, 32, 64]. Deshalb ist eine im

Expressionssystem nachgewiesene Überfunktion von ENaC sicher nicht in allen

Patienten mit CF-artigen Symptomen ohne typische Mutationen in beiden CFTR

Allelen eine Erklärung für die Krankheitssymptome.

Es ergibt sich die Frage, wie die Regulation der Höhe der ASL in Patienten

ohne CFTR-Mutationen und mit ENaC-Mutationen ohne erkennbaren Effekt auf

die ENaC-Funktion gestört sein kann. Es ist denkbar, dass eine ENaC-Mutation

keinen Effekt auf die Kanalfunktion an sich ausübt, aber den inhibitorischen

Effekt von CFTR auf ENaC vermindert. Dies würde wiederum zu einer

gesteigerten Na+-Resorption führen, die sich aber in einfachen

Expressionsstudien nicht erkennen lässt. Dafür wären aufwändige

Koexpressionsstudien von CFTR mit Wildtyp-ENaC beziehungsweise dem

mutierten ENaC erforderlich. Zusätzlich könnten die ENaC-Mutationen einen

Effekt auf die Produktion, die Reifung oder den Transport von CFTR zur

Zellmembran ausüben, was zu einer verminderten Cl--Sekretion führen würde.

Beides würde letzten Endes in einer Reduktion der ASL resultieren.

Für die Gruppe der inhibitorischen Mutationen von ENaC ist es schwierig, ein

pathophysiologisches Modell abzuleiten. In diesem Zusammenhang sind

Mutationen in Patienten mit Pseudohypoaldosteronismus I (PHA I) zu nennen.

Auch bei ihnen wurde ein CF-ähnlicher Lungenphänotyp beschrieben [31, 48,

54

62]. Im Gegensatz zu CF-Patienten findet man bei manchen PHA I-Patienten

eine gesteigerte ASL-Höhe und eine erhöhte „mukoziliäre Clearance“ [40]. Die

Pathophysiologie dieser Konstellation ist allerdings noch unklar.

Generell könnte die Entwicklung CF-ähnlicher Symptome in der Lunge mit

Störungen der Regulation der ASL-Höhe jeglicher Art zusammenhängen

unabhängig von dem zugrunde liegenden molekularen Mechanismus und den

jeweils daran beteiligten Ionenkanälen. Um dies herauszufinden, ist weiterhin

intensive Forschung auf dem Gebiet der Pathophysiologie der CF notwendig.

7. Schlussfolgerung

Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die

βV348M-Mutation, die in einem Patienten mit schweren CF-ähnlichen

Symptomen gefunden wurde [51], die Aktivität von ENaC über eine erhöhte

mittlere Kanaloffenwahrscheinlichkeit (Po) steigert. Dieses Ergebnis steht mit

der Hypothese im Einklang, dass ein erhöhter Na+-Transport in respiratorischen

Epithelien durch eine vermehrte Flüssigkeitsresorption die „mukoziliäre

Clearance“ reduziert und dadurch CF-ähnliche Symptome in der Lunge

begünstigt. Zusätzlich zu diesem erhöhten Na+-Transport könnten andere

Faktoren zum ausgeprägten Phänotyp des von der Mutation betroffenen

Patienten beitragen. Aus diesem Grund sind weitere Arbeiten notwendig, um

die Rolle von ENaC in der Pathophysiologie der CF zu klären.

55

8. Literaturverzeichnis

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62

9. Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Struktur von ENaC in der Zellmembran. 6

Abb. 2: ENaC-Modell. 7

Abb. 3: Von ENaC vermittelter Na+-Transport im ASDN. 8

Abb. 4: Regulation und Fehlregulation des ASL. 10

Abb. 5: Aminosäuresequenzen verschiedener Spezies der Region um βV348.

12

Abb. 6: Xenopus laevis, der afrikanische Krallenfrosch. 13

Abb. 7: Xenopus laevis Oozyten im Reifestadium V und VI nach Dumont. 14

Abb. 8: Schematischer Aufbau der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme. 19

Abb. 9: Die βV348M-Mutation stimuliert den ENaC-vermittelten Na+- Strom.

25

Abb. 10: Der stimulatorische Effekt der βV348M-Mutation ist vom Na+- Gehalt der Oozyten unabhängig.

26

Abb. 11: Die βV348M-Mutation erhöht die mittlere Po von ENaC. 29

Abb. 12: Chymotrypsin stimuliert αβγENaC mehr als αβV348MγENaC. 31

Abb. 13: Die βV348M-Mutante wird durch S3969 weniger aktiviert als der Wildtyp.

33

Abb. 14: Chymotrypsin aktiviert Wildtyp-ENaC stärker als S3969. 35

Abb. 15: Aminosäuren, die durch positionsgerichtete Mutagenese zur Generation verschiedener Mutanten eingesetzt wurden.

36

Abb. 16: Aminosäure-Mutationen zeigen unterschiedliche Effekte auf die ENaC-Funktion.

37

Abb. 17: Auswirkungen der unterschiedlichen Mutationen auf die βENaC-Expression intrazellulär und in der Zellmembran.

39

Abb. 18: Aktivierung der unterschiedlichen Mutanten mit Chymotrypsin. 42

Abb. 19: Räumliche Effekte verschiedener βV348-Mutationen im ENaC-Modell.

51

63

10. Abkürzungsverzeichnis

10.1 Abkürzungen

Abb. Abbildung

Ami Amilorid

ASDN Aldosteron-sensitives distales Nephron

ANOVA Analysis of variance

ASIC Acid sensing ion channel

ASL Airway surface liquid

CF Cystic fibrosis (zystische Fibrose)

CFTR Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

COS1 CV1 Origin SV40-1 (von Affennierenzelllinie CV1

abgeleitete Zelllinie, mit Simian virus 40 transfiziert)

cRNA Complementary ribonucleic acid (komplementäre

Ribonukleinsäure)

DNA Desoxyribonucleic acid

EDTA Ethylendiamintetraacetat

ENaC Epithelial sodium channel (epithelialer Natrium-Kanal)

EZ-link Enzymgebunden

hENaC Humaner ENaC

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure

ΔIAmi Amilorid-sensitiver Strom

M1 Erste Transmembrandomaine der ENaC-Untereinheiten

M2 Zweite Transmembrandomaine der ENaC-Untereinheiten

MBS Modified Barth’s solution

mRNA Messenger ribonucleic acid

MS222 Tricain-methan-sulfonat Anästhetikum

MTSET 2-(Trimethylammonium)-ethyl-methan-thiosulfonsäure-

bromid

n Anzahl individueller Oozyten

64

N Anzahl Oozyten-Batches

Na+-K+-ATPase Aktive Natrium-Kalium-Pumpe

ND9 Oozytensuperfusionslösung mit 9 mmol/l NaCl

ND96 Oozytensuperfusionslösung mit 96 mmol/l NaCl

Nedd4-2 Neuronal precursor cell-expressed developmentally down-

regulated protein 4-2

NMDG N-methyl-D-glutamat

OR2 Oozyten-Ringer Lösung 2

PHA1 Pseudohypoaldosteronismus Typ 1

PCL Periciliary layer

Po Offenwahrscheinlichkeit

rENaC Epithelial sodium channel (epithelialer Natrium-Kanal) der

Spezies Ratte

RNA Ribonucleic acid

ROMK Renal outer medullary K+-channel

S3969 ENaC-Aktivator

SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese

SEM Standard error of the mean (Standardfehler)

sulfo-NHS-SS-

Biotin

Sulfosuccinimidyl-2-(biotinamido)-ethyl-1,3'-dithiopropionat

Tris Tris[hydroxymethyl]aminomethan

wt Wildtyp

65

10.2 Nomenklatur der Aminosäuren

Aminosäure Einbuchstabencode

Aspartat D

Glutamat E

Glutamin Q

Glycin G

Leucin L

Lysin K

Methionin M

Tryptophan T

Valin V

10.3 Einheiten

Einheit Bedeutung

A Ampère

°C Grad Celsius

g Gramm

g Mittlere Erdbeschleunigung (G=9,81 m/s2)

h Stunde

l Liter

m Meter

M Molar (mol/l)

mol Mol

Ω Ohm

U Units (Einheiten enzymatischer Aktivität)

V Volt

66

11. Vorveröffentlichungen

Soell D., Korbmacher C., Rauh R. (2010) ”A mutation in the β-subunit of the epithelial sodium channel (ENaC) identified in a patient with atypical cystic fibrosis has a gain-of-function effect”. Acta Physiol, Supp. 677, 198, Abstract P-TUE-24

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67

12. Anhang

Primersequenzen der Mutanten:

V348G (vorwärts): 5' CATCGGGGTACTCGGAGACAAGCTTCAGCG 3'

V348G (rückwärts): 5' CGCTGAAGCTTGTCTCCGAGTACCCCGATG 3'

V348K (vorwärts): 5'CGTCCATCGGGGTACTCAAAGACAAGCTTCAGCGCATG 3'

V348K (rückwärts): 5'CATGCGCTGAAGCTTGTCTTTGAGTACCCCGATGGACG 3'

V348M (vorwärts): 5'-CCATCGGGGTACTCATGGACAAGCTTCAGC-3'

V348M (rückwärts): 5'-GCTGAAGCTTGTCCATGAGTACCCCGATGG-3'

V348L (vorwärts): 5' CATCGGGGTACTCCTGGACAAGCTTCAG 3'

V348L (rückwärts): 5' CTGAAGCTTGTCCAGGAGTACCCCGATG 3'

V348W (vorwärts): 5' CCATCGGGGTACTCTGGGACAAGCTTCAGC 3'

V348W (rückwärts): 5' GCTGAAGCTTGTCCCAGAGTACCCCGATGG 3'

V348E (vorwärts): 5' CCATCGGGGTACTCGAAGACAAGCTTCAGCGC 3'

V348E (rückwärts): 5' GCGCTGAAGCTTGTCTTCGAGTACCCCGATGG 3'

V348D (vorwärts): 5' CATCGGGGTACTCGATGACAAGCTTCAGCGC 3'

V348D (rückwärts): 5' GCGCTGAAGCTTGTCATCGAGTACCCCGATG 3'

V348Q (vorwärts): 5' CCATCGGGGTACTCCAGGACAAGCTTCAGC 3'

V348Q (rückwärts): 5' GCTGAAGCTTGTCCTGGAGTACCCCGATGG 3'

V348del (vorwärts): 5'-CATCGGGGTACTCGACAAGCTTCAG-3'

V348del (rückwärts): 5' CTGAAGCTTGTCGAGTACCCCGATG 3'

S520C (vorwärts): 5'CGTCTGGCTGCTCTGCAATCTGGGTGGCCAG3'

S520C (rückwärts):5'CTGGCCACCCAGATTGCAGAGCAGCCAGACG3'

68

13. Danksagung

Ich danke meinem Doktorvater Prof. Dr. med. Christoph Korbmacher, dass er

mir diese Doktorarbeit an seinem Institut ermöglicht hat. Außerdem möchte ich

mich für die hervorragende Betreuung während meiner Zeit in der Physiologie

bedanken, was für mich nicht selbstverständlich ist.

Weiterhin möchte ich meinem Betreuer PD Dr. med. Robert Rauh für seine

große Hilfsbereitschaft und Geduld danken, mit denen er mir mit Rat und Tat

bei der Durchführung und Auswertung der Experimente zur Seite stand. Danke

für die immer zeitnahen Antworten auf aufkommende Fragen, für den

menschlichen Umgang und Gespräche über den Horizont der Arbeit hinaus.

Auch das ist für mich alles andere als selbstverständlich.

Vielen Dank an Sonja Mayer, Celine Grüninger, Jessica Rinke und Dipl.-Biol.

Ralf Rinke für zahlreiche Frosch-Operationen, für das geduldige Anleiten von

neuen Arbeitsmethoden, für etliche cRNA-Herstellungen, für das

selbstverständliche Beantworten aller aufkommenden Fragen, für die

Hilfsbereitschaft, wenn etwas nicht so lief wie gewünscht und für viele lustige

Praktikumsstunden.

Außerdem möchte ich mich für die gute Arbeitsatmosphäre am Institut

bedanken, ohne die mir die Arbeit nur halb so viel Spaß gemacht hätte. Dazu

haben auch Dr. Viatcheslav Nesterov, Dr. Alexej Diakov, Dr. rer. nat. Elena

Rudakova, Prof. Dr. med. Tillmann Volk, Dr. rer. nat. Bettina Krüger, Dr. rer.

nat. Marko Bertog, Dr. med. Michael Wagner, Dr. rer. nat. Silke Härteis und

Dipl.-Biol. Regina Nacken entscheidend dazu beigetragen, nicht zu vergessen

Claudia Ebner, Claudia Großkopf und Axel Günther.

Ein besonderer Dank gilt auch den anderen Doktoranden, die zur gleichen Zeit

Versuche am Institut durchführten. Insbesondere möchte ich mich bei

Christopher Friedrich bedanken, ohne den ich zur Durchführung meiner

Doktorarbeit nicht am physiologischen Institut gelandet wäre und durch den so

mancher langer Labortag kurzweiliger wurde. Danke für die schöne Zeit.

69

Ein großer Dank geht an meine Eltern Renate und Friedrich, an meine Frau

Veronika, meine Geschwister Dorothee, Tabea und Lena und an meine

gesamte Familie mit Freunden, die mich bei der Durchführung dieser Arbeit

unterstützt, ermutigt und in manchem Augenblick auch ertragen haben. Ohne

sie wäre diese Arbeit so nicht möglich gewesen.

Zuletzt möchte ich mich bei Gott bedanken, der mich durch Höhen und Tiefen,

die mit dieser Arbeit verbunden waren, getragen hat.

70

14. Lebenslauf

Persönliche Daten Name Daniel Söll

Geburtsdatum 30. August 1985

Geburtsort Bayreuth

Eltern Renate Söll, geb. Dippon Dr. med. Friedrich Söll

Geschwister Dorothee Langenbucher, geb. Söll Dipl.-Psych. Tabea Söll Lena Söll

Familienstand Verheiratet mit Veronika Söll, geb. Reichstein

Schulische Ausbildung 1991 – 1995 Volksschule St. Johannis in Bayreuth

1995 – 2004 Markgräfin-Wilhelmine-Gymnasium in Bayreuth

06/2004 Allgemeine Hochschulreife Note 1,0

Tätigkeiten zwischen Abitur und Beginn des Medizinstudiums 09/2004 – 04/2005 Englischsprachige Bibelschule der Fackelträger

„Bodenseehof“ in Fischbach/Friedrichshafen

06/2005-07/2005 Krankenpflegepraktikum im Stadtkrankenhaus Pegnitz (Innere Medizin)

Hochschulstudium 10/2005 - 11/2011 Studium der Humanmedizin an der FAU Erlangen-

Nürnberg

09/2007 Erster Teil der Ärztlichen Prüfung. Note: „sehr gut“ (1,5)

10/2011 Zweiter Teil der Ärztlichen Prüfung Note: „sehr gut“ (1,0)

11/2011 Approbation als Arzt

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Praktika und Famulaturen 03/2006 Krankenpflegepraktikum im Klinikum Kulmbach (Unfallchirurgie)

03/2007 Famulatur in der Sana Klinik Pegnitz Gastroenterologie und Kardiologie

03/2009-04/2009 Famulatur am Klinikum Nürnberg Nord Anästhesiologie

09/2009-10/2009 Famulatur am Klinikum am Europakanal Erlangen Neurologie und neurologische Rehabilitation

Famulaturen im ambulanten Bereich:

02/2010-03/2010 Gemeinschaftspraxis Dr. med. Leppik und Dr. med. Eberhardt, Erlangen

Kinder- und Jugendmedizin

03/2010 Praxis Dr. med. Friedrich Söll, Bayreuth Allgemeinmedizin Praktisches Jahr 08/2010-12/2010 Innere Medizin am Klinikum Bayreuth Fachbereiche: Nephrologie und Kardiologie

12/2010-03/2011 Anästhesiologie am Universitätsklinikum Erlangen

Einsatzkliniken: Neurochirurgie/Ophthalmologie Gynäkologie

Zahn-, Mund- und Kieferchirurgie

03/2011-07/2011 Chirurgie am Klinikum Bayreuth Fachbereiche: Viszeralchirurgie und Unfallchirurgie Promotion Seit 01/09 Doktorvater: Prof. Dr. med. Korbmacher,

Institut für zelluläre und molekulare Physiologie, FAU Erlangen-Nürnberg

Tätigkeit als Tutor am Institut für Zelluläre und Molekulare Physiologie (4 Semester)

05/2009-07/2009 Stipendium des SFB 423 (Collaborative Research Center, Kidney injury: pathogenesis and regenerative mechanisms, FAU Erlangen-Nürnberg)

04/09-08/10 Teilnahme am Doktorandenprogramm des SFB 423

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Kongressteilnahmen 03/2010 Postervorstellung: Joint Meeting of the

Scandinavian and German Physiological Societies, Kopenhagen, Dänemark

07/2010 Posterpreis: Summer School der

Doktorandenprogramme SFB 423 Universität Erlangen/SFB 699 Universität Regensburg, Hersbruck

10/2010 Postervorstellung: 3rd International SFB 423

Symposium "Molecular Targets in Renal Disease", Bamberg

Thema jeweils:

A mutation in the β-subunit of the epithelial sodium channel (ENaC) identified in a patient with atypical cystic fibrosis has a gain-of-function effect

D. Soell, C. Korbmacher, R. Rauh Aktuelle Beschäftigung Seit 04/12 Assistenzarzt Innere Medizin, Klinikum Bamberg,

Medizinische Klinik III (Nephrologie, Rheumatologie, Osteologie), Chefarzt PD Dr. med. Clemens Grupp

Stand Januar 2013