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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Atividade Imunoestimulante da β- 1,3 Glucana em Candidíase Vulvovaginal Experimental ALEIDA MARIA DA SILVA LIMA Orientadora: Profª Drª VALÉRIA SORAYA DE FARIAS SALES Co-orientador: Profº Drº GUILHERME MARANHÃO CHAVES Natal, RN 2012

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Atividade Imunoestimulante da β- 1,3 Glucana em Candidíase Vulvovaginal Experimental

ALEIDA MARIA DA SILVA LIMA

Orientadora: Profª Drª VALÉRIA SORAYA DE FARIAS SALES Co-orientador: Profº Drº GUILHERME MARANHÃO CHAVES

Natal, RN 2012

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ALEIDA MARIA DA SILVA LIMA

Atividade Imunoestimulante da β 1-3, Glucana em Candidíase Vulvovaginal Experimental

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para a obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas (Imunologia).

Natal, RN 2012

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CATALOGAÇÃO NA FONTE

L732a

Lima, Aleida Maria da Silva. Atividade imunoestimulante da β-1,3 glucana em candidíase

vulvovaginal experimental / Aleida Maria da Silva Lima. – Natal, 2012.

62f. Orientadora: Profa. Dra. Valéria Soraya de Farias Sales.

Coorientador: Prof Dr. Guilherme Maranhão Chaves

Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

1. β-Glucana – Dissertação. 2. Cândida albicans – Dissertação.

3. Candidíase vulvovaginal – Dissertação. I. Sales, Valéria Soraya de Farias. II. Chaves, Guilherme Maranhão. III. Título.

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RN-UF/BS-CCS CDU: 57.083:616.97(043.3)

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"Para realizar grandes conquistas, devemos

não apenas agir, mas também sonhar; não

apenas planejar, mas também acreditar"

( Anatole France )

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DEDICATÓRIA

Aos Meus Pais, Gleydson Bento e Lucinete Lima, por todo o amor e dedicação, acreditando nos meus sonhos e sempre me ensinando a ser uma pessoa melhor. Amo vocês.

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AGRADECIMENTOS

À Deus, primeiramente, que me deu sabedoria e paciência para seguir em frente e

não desistir nunca.

Aos Meus Irmãos e familiares (Larisa, Erick, Bentinho, Ritinha, Felipe, Tia Celina e

Tia Almerinda), os quais torceram por mim em todos os momentos da minha vida.

Aos Meus Amigos (Adriano, Keith, Larissa, Rominne, Eliz, Tony e Belinha), que

trouxeram alegria e paz, quando eu mais precisava. Sempre dizendo que eu era

capaz.

Às Minhas Amigas de Laboratório (Karina, Luanda, Bruna, Mariana e Sarah), que me

ajudaram todos os dias de experimentos, incluindo sábados e domingos. Fazendo

os dias mais leves, com as nossas conversas loucas e intermináveis, principalmente

nas segundas-feiras.

À Minha Orientadora (Valéria Sales), que não só me acrescentou conhecimentos

como também acreditou na minha capacidade.

Ao Meu Co-orientador (Guilherme Maranhão), que abriu as portas do seu laboratório

para mim, dando todo o apoio necessário.

À Professora Keyla Borges, que fez a análise histopatológica.

Às Professoras Iracilda e Danielle, que abriram as portas no Laboratório de

Imunologia Clínica, em Araraquara, para que eu pudesse fazer alguns experimentos.

À Professora Eveline Milan, por ter cedido a cepa mais virulenta, fazendo do

experimento um sucesso.

Aos Ausentes (Tio Francisco), que ficaria muito orgulhoso dessa conquista.

Àqueles (Mariana, Rafaela e Leo), que por ironia do destino, participaram dos meus

experimentos, dando apoio quando eu mais precisei.

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À CAPES, por ter financiado a minha bolsa durante todo o mestrado.

Ao estatístico Felipe Henrique, por toda paciência.

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RESUMO

LIMA AMS. Atividade Imunoestimulante da β 1-3, Glucana em Candidíase Vulvovaginal Experimental. Mestrado (Imunologia). Laboratório de Imunologia Clínica da Universidade Federal do Rio grande do Norte, Natal, 2012. A candisíase vulvovaginal (CVV) é uma doença inflamatória, no tecido vaginal, causada principalmente por leveduras patogênicas de Candida albicans. E atualmente CVV é um problema significativo na saúde da mulher. As β glucanas são polissacarídeos estruturais da parede celular da levedura Saccharomyces cerevisiae e existem vários relatos que demonstram o efeito imunomodulador desta estrutura em infecções bacterianas, virais, fúngicas e parasitárias. Sabendo disso, o presente estudo avaliou se a β-glucana tem atividade imunomoduladora em camundongos com candidíase vulvovaginal sob a influência do estrógeno. Os animais foram inoculados com C. albicans, por via intravaginal, e tratados com glucana, vaginal e intraperitonealmente, e os animais do grupo de controle receberam por via intraperitoneal, solução salina. Os animais tratados com glucana intraperitoneal e vaginal mostraram menor número de UFC, no fluido vaginal, em comparação com animais controles. No entanto, os resultados mais marcantes foram do intraperitoneal, confirmando com o histopatológico, porém sem diferença estatisticamente significante. Em relação ao influxo dos neutrófilos polimorfonucleares (PMNs), os grupos tratados com glucana mostraram maior infiltração desses. Além disso, observou-se que os animais tratados com glucana apresentaram uma maior quantidade de IFN-γ, no lavado vaginal, em comparação com o controle. Os dados sugerem que glucana pode ter uma atividade importante na proteção contra C. albicans. Palavras-chaves: β-Glucana, Candida albicans, Candidíase Vulvovaginal

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ABSTRACT

LIMA AMS. Immunostimulant Activity of β 1-3, Glucana in Experimental Vulvovaginal Candidiasis. MSc (Immunology). Laboratory of Clinical Immunology, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, 2012.

Vulvovaginal candidiasis (VVC) is an inflammatory disease, on vaginal tissue, caused mainly by pathogenic yeasts of Candida albicans. And actually, VVC is currently a significant problem in women's health. The β-glucans are structural polysaccharides of the cell wall of the fungi Saccharomyces cerevisiae and there are several reports that demonstrate the immunomodulatory effect this structure in infections of bacterial, viral, fungal and parasitic. Knowing this, the present study evaluated whether β-glucan has immunomodulatory activity in mice with vulvovaginal candidiasis under the influence of estrogen. The animals were inoculated with C. albicans, intravaginally, and treated with glucan, vaginally and intraperitoneally, and the control group animals received saline, intraperitoneally. The animals treated with intraperitoneal and vaginal glucan showed smaller number of the CFU, in the vaginal fluid, compared with control animals. However the results more marked was of the intraperitonel, confirmed with histopathological, but in neither case the results were statistically significant. Relative to influx of the polymorphonuclear neutrophilis (PMNs), the groups treated with glucan showed greater infiltration. Moreover, it was observed that animals treated with glucan showed a higher quantity of IFN-γ, in vaginal washed, compared with the control. The data suggest that glucan may have an important activity in protection against C. albicans.

Keywords: β-Glucan, Candida albicans and Vulvovaginal Candidiasis

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CARD: Domínio de Recrutamento e Ativação de Caspases

CR: Receptores de Complemento

CXCL: Quimiocina com duas cisteinas separadas por um aminoácido

CVV: Candidíase Vulvovaginal

CVVR: Candidíase Vulvovaginal Recorrente

CD: Grupamento de Diferenciação

C: Complemento

CE: Células Epiteliais

DCs: Células Dendríticas

ELISA: Ensaio Imunoenzimático

g: Grama

GM-CSF: Fator Estimulador de Colônias de Macrófagos e Granulócitos

IFN: Interferon

IL: Interleucina

Ig: Imunoglobulina

ITAM: Motivo Citoplasmático baseado na tirosina

LacCer: Receptor Lactosilceramida

MyD88: Gene de Resposta Primária de Diferenciação Mielóide 88

MHC: Complexo Principal de Histocompatibilidade

mg: Miligrama

mL: Mililitro

mM: Milimol

NF-κB: Fator Nuclear Kappa B

NK: CélulasNatural Killer

PRRs: Receptores de Reconhecimento Padrão

PAMPs: Padrões Moleculares Associados à Patógenos

PBS: Tampão Fosfato Salina

PAS: Ácido Periódico de Schiff

pH: Concentração hidrogeniônica

RM: Receptor de manose

reg: Regulatório

Sap: Proteinase Aspártica Secretada

TLR: Receptores semelhantes ao Toll

TNF: Fator de Necrose Tumoral

UFC: Unidades Formadoras de Colônia

YEPD: Extrato de Fungo, Peptona e Dextrose

μg: Micrograma

μL: Microlitro

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Modelo de interação do Zymosan com Dectina-1 e Toll-like ..................... 29

Figura 2: Glucana insolúvel pulverizada ................................................................... 35

Figura 3:Inoculação de Candida albicans, por via vaginal ........................................ 36

Figura 4:Placa de Elisa, na dosagem de IFN-γ ........................................................ 38

Figura 5: Células de C. albicans crescidas em Ágar Sabouraud dextrose após um

período de incubação de 48 horas, incubadas à temperatura de 37ºC. (Método Pour-

plate, contagem de UFC) .......................................................................................... 41

Figura 6:Detecção da citocina IFN-γ, no lavado vaginal de camundongos com

candidíase vulvovaginal por C. albicans, durante o experimento, nos dias 6, 9 e 10

após a inoculação. A citocina foi quantificada usando o pool do lavado vaginal dos

camundongos (três animais por pool). ...................................................................... 43

Figura 7: Análise histopatológica do tecido vaginal de camundongos controle (G1) (a

e b) e com glucana por via vaginal (G2) (c e d) infectados com C. albicans. (a) e (c):

Coloração com hematoxilina e eosina e (b) e (d): Coloração com Ácido periódico de

Schiff (PAS). (X400). Setas pretas: infiltração de células PMNs e setas brancas:

invasão de C. albicans. ............................................................................................. 46

Figura 8: Análise histopatológica do tecido vaginal de camundongos tratados com

glucana por via intraperitoneal (G3) infectado com C. albicans. (a e c): Coloração

com hematoxilina e eosina e (b e d): Coloração com Ácido periódico de Schiff (PAS).

(X400). Seta preta: infiltração de PMNs e seta branca: invasão de C. albicans. (a e

b): 8º dia e (c e d): 11º dia. ........................................................................................ 47

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Grupos de tratamento com glucana, no 4º e 7º dia após a inoculação ..... 36

Tabela 2: Comparação da média da diferença de UFC entre o 5° e o 2° dia, nos três

grupos, pelo do teste de Kruskal-Wallis: (log10 ufc, n=3).......................................... 41

Tabela 3: Comparação da média da diferença de UFC entre o 8° e o 2° dia, nos três

grupos, pelo do teste de Kruskal-Wallis: (log10 ufc, n=3).......................................... 42

Tabela 4: Comparação da média da diferença de UFC entre o 10° e o 2° dia, nos

três grupos, pelo do teste de Kruskal-Wallis: (log10, n=3) ........................................ 43

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SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO ............................................................................................... 14

1.1. Biologia e Fatores de Virulência da Candida albicans ............................. 14

1.2. Candidíase Vulvovaginal ......................................................................... 17

1.3. Epidemiologia da Candidíase Vulvovaginal- Mundo e Brasil ................... 18

1.4. Imunidade a C. albicans na Candidíase Vulvovaginal ............................. 19

1.5. Modelos Animais de Candidíase Vulvovaginal ........................................ 26

1.6. β-Glucana ................................................................................................ 27

2- OBJETIVOS ................................................................................................... 32

2.1. Objetivos Gerais ...................................................................................... 33

2.2. Objetivos Específicos ............................................................................... 33

3- MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 33

3.1. Animais .................................................................................................... 33

3.2. Microorganismos e Condições de crescimento ....................................... 33

3.3. Preparo do Inóculo................................................................................... 34

3.4. Extração e preparação da β, 1-3 Glucana ............................................... 34 3.5. PROTOCOLO EXPERIMENTAL (ANEXO II) .......................................... 35

3.5.1 Vulvovaginite Experimental ......................................................... 35 3.5.2. Tratamento com β,1-3 Glucana .................................................. 36 3.5.3. Monitoramento da infecção fúngica: Contagem de Unidades

Formadoras de Colônia (UFC) ........................................................................ 37

3.5.4. Lavado vaginal para dosagem de citocinas ............................... 37

3.6. Dosagem de citocina ............................................................................... 38 3.7. Estudo Histopatológico ............................................................................ 38

3.8. Estatística ............................................................................................... 39

4- RESULTADO ................................................................................................ 40

4.1. Infecção vulvovaginal por C. albicans .......................................................... 40 4.1.1. Contagem de UFC ................................................................................ 40 4.1.2. Dosagem de citocina, no lavado vaginal ............................................... 43 4.1.3. Análise histopatológica ......................................................................... 44

5- DISCUSSÃO .................................................................................................. 48

6- CONCLUSÃO ................................................................................................ 52

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA APÊNDICE I

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1. INTRODUÇÃO

1.1. Biologia e Fatores de Virulência de Candida albicans

Candida albicans é uma levedura pleomórfica que existe como comensal de

animais de sangue quente, incluindo seres humanos. Esta levedura coloniza as

superfícies das mucosas oral, da cavidade vaginal e do trato gastrointestinal

(JAYATILAKE; SAMARANAYAKE;SAMARANAYAKE,2005; MOLERO et al., 1998),

sendo ainda considerada um patógeno oportunista, agente causador da maioria dos

casos de candidíase (YANO et al., 2005). C. albicans pode existir sob três

morfologias distintas, como células de leveduras (blastoconídios), pseudohifas e

hifas verdadeiras (SU et al., 2007). Como comensal, este fungo,

assintomaticamente, coloniza a superfície epitelial, aparentemente, na forma de

blastoconídio (COSTA; FELIPE; GAZIRI,2008). Portanto, a sua patogenicidade está

relacionada em parte com a capacidade de transição de blastoconídios a hifas,

denominada de morfogênese, ocasionada em resposta a sinais ambientais, como

pH, temperatura dentre outros(SU et al., 2007).

A permanência da levedura como comensal do corpo humano deve-se a

vários fatores, tais como: a pele intacta, que é protegida por células queratinizadas;

a superfície mucosa; a presença de mucinas, de Imunoglobulina (Ig) A e de

numerosas bactérias que conferem proteção ao hospedeiro, alojando-se ao redor do

fungo, impedindo sua adesão. Modificações nestas barreiras naturais, como aquelas

causadas por antibioticoterapia, corticoterapia, quimioterapia, cirurgias,

cateterismos, sondas e cateteres, podem propiciar a invasão do fungo e o processo

infeccioso (COSTA; FELIPE; GAZIRI, 2008). Além disso, essa transição de

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colonização para infecção pode ocorrer devido a fatores que aumentam a virulência

do micro-organismo (CASSONE; DE BERNADIS; SANTONI, 2007).

Os fatores de virulência são expressos pelos fungos, na superfície da mucosa

e têm mostrado desempenhar um papel importante na infecção por estes micro-

organismos. Exemplos de fatores de virulência são as enzimas da família das

Proteinases Aspárticas Secretadas (Saps) e uma série de adesinas protéicas e

glicoprotéicas, que desempenham papel fundamental na patogenicidade de Candida

spp.. Como previamente mencionado, a expressão da virulência também é

promovida pela capacidade do fungo de formar hifas, segmentos em crescimento

que têm potencial propriedade de evasão do sistema imune (CASSONE; DE

BERNADIS; SANTONI, 2007). De acordo com Cassone et al. (1998), a presença de

tais “comensais” sobre a superfície da mucosa não passa despercebida, ou

simplesmente tolerada pelo hospedeiro, mas sim, fatores humorais e celulares tanto

da resposta imune inata como adaptativa restringem o crescimento do fungo e

neutralizam sua virulência.

Essa hipótese é sustentada por observações de Schaller et al. (2003), no

modelo de tecido epitelial vaginal reconstituído de humanos, no qual alguns

membros da família Sap (principalmente, Sap1 e Sap2) atacam e destroem a

arquitetura epitelial, eliminando as propriedades físicas e funcionais antifúngicas. Em

resposta a esse dano, os queratinócitos epiteliais produzem uma cascata de

citocinas inflamatórias (SCHALLER et al., 2005), dentre elas(fator de necrose

tumoral alfa (TNF-α), interleucina-10 (IL-10) e interferon gama (IFN-γ)), podendo

induzir uma resposta imune regulada e protetora, no hospedeiro normal(ROMANI,

2004).Um papel crítico pode ser desempenhado pelos anticorpos, que neutralizam a

virulência característica dos fungos. Como é o caso do anti-Sap2, anticorpo que

inibe a atividade e a aderência da Sap2, no tecido vaginal de ratos. Este mecanismo

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providencia forte proteção pré- e pós- desafio, em modelos de candidíase vaginal

em ratos (DE BERNARDIS et al., 2007). Todos esses achados sustentam a idéia da

importância do binômio virulência versus a imunidade do hospedeiro, na mucosa

vaginal e sugerem que o resultado do comensalismo é o equilíbrio entre as mesmas,

sendo que a doença resultaria da quebra desse equilíbrio (CASSONE; DE

BERNADIS; SANTONI, 2007).

A família Sap é constituída de 10 proteinases aspárticas cujas sequências,

propriedades bioquímicas e expressão in vitro e in vivo diferem de forma tão

marcante que constituem pelo menos três linhagens diferentes (WHEELER; FINK,

2006). As Sap1 a Sap3 têm um pH ótimo de atividade na faixa ácida (pH 3 a 5) e se

acredita serem expressas principalmente em infecções cutâneas e mucosas, tanto

experimentais como clínicas (NAGLIK et al., 2003). No entanto, as Sap4 a Sap6

requerem um pH neutro como ótimo de atividade e exibem expressão preferencial

nas infecções sistêmicas (NAGLIK; CHALLACOMBE; HUBE, 2003). Contudo, nos

modelos de infecção vaginal em camundongos BALB/c, Sap4 e Sap5 são também

expressas, fator este atribuído ao alto pH do fluído vaginal dos camundongos,

comparado ao dos ratos e mulheres (TAYLOR et al., 2005).

De fato, a candidíase vaginal em mulheres foi fortemente associada com altos

níveis da expressão de Sap in vitro por isolados vaginais de C. albicans, assim como

elevados níveis de Sap no fluído vaginal (DE BERNARDIS et al., 1990). Os estudos

mais recentes têm mostrado como é complexo o perfil de expressão das Sap in vivo

e como as diferentes Sap podem cooperar e afetar a expressão da virulência em

tempos diferentes durante a infecção por C.albicans (NAGLIK; CHALLACOMBE;

HUBE, 2003).

No entanto, baseando-se na consideração de todos os dados publicados,

Sap2 emergiu como uma proteína que desempenha um papel particularmente

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consistente na relação Candida spp e tecido vaginal, provavelmente maior que

qualquer outro atributo de virulência. A Sap2 apresenta maior especificidade ao

substrato das Sap, sendo capaz de hidrolisar proteínas estruturais do hospedeiro,

queratina da pele e do epitélio vaginal, e fatores humorais da imunidade inata e

adaptativa, incluindo proteínas do complemento e imunoglobulinas, sendo esses

altamente susceptíveis a atividade da Sap2 (HUBE., 2004). Além disso, a expressão

do gene da SAP2 (Sap2) está também relacionada com a infecção vaginal em ratos

(DE BERNARDIS et al., 1995).

As adesinas podem desempenhar tanto um papel direto na patogênese

promovendo a adesão do fungo ao tecido vaginal, como indireto exercendo uma

atividade de remodelação da parede celular necessária à transição em hifas. São

exemplos de adesinas a proteína glicosilfosfatidilinositol-ancoradas (SPELLBERG et

al., 2006) ou outras enzimas da parede celular, glucanase e/ou transglucosidase (DE

GROOT et al., 2004). Por exemplo, a manoproteína MP65 tem uma sequência típica

de uma enzima glucanase ou transglucosidase e recentemente foi mostrado estar

envolvida na adesão da C. albicans às células epiteliais vaginais e, ao mesmo

tempo, ser crítica para a formação de hifas (DE BERNARDIS et al., 2007). Não

surpreendentemente, todas as características de virulência descritas acima têm sido

associadas ao potencial de evasão do sistema imune dos fungos (WHEELER; FINK,

2006).

1.2. Candidíase Vulvovaginal

A candidíase vulvovaginal (CVV) é uma doença inflamatória causada por

leveduras patogênicas do gênero Candida, que pode apresentar diversas espécies,

porém a C. albicans é a responsável por cerca de 90% das infecções humanas.

Estima-se que três quartos de todas as mulheres adultas no mundo serão

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acometidas por candidíase vulvovaginal, em alguma época de sua vida, sendo

muitas vezes recorrente. A candidíase vulvovaginal recorrente (CVVR), caracterizada

por 3 ou 4 episódios de CVV por ano, ocorre em cerca de 25% das mulheres. Isto

provavelmente se deve à permanência de fatores predisponentes, à contaminação a

partir do sistema gastrintestinal, a partir do parceiro sexual não-tratado, ao

tratamento insuficiente ou inadequado, ao diagnóstico incorreto e a resistência de

algumas espécies de Candida aos antifúngicos disponíveis no mercado para

tratamento (BASTOS et al., 2003; CHEN et al., 2007). Por isso a CVV é atualmente

um relevante problema na saúde da mulher (ÁLVARES et al., 2007).

A CVV se caracteriza clinicamente pela ocorrência de prurido vulvar intenso,

leucorréia, dispareunia, disúria, edema e eritema vulvovaginal, sendo o prurido o

sintoma mais importante quando a CVV é comparada a vulvovaginites de outra

etiologia. Em alguns casos, é possível observar a presença de lesões satélites

vulvares, como escoriações (HOLANDA et al., 2007).

1.3. Epidemiologia da Candidíase Vulvovaginal

A CVV é um dos diagnósticos mais frequentes na prática diária em

ginecologia e sua incidência tem aumentado drasticamente, tornando-a a segunda

infecção genital mais freqüente nos Estados Unidos e no Brasil. A CVV representa

20% a 25% das leucorréias vaginais de natureza infecciosa, precedida apenas pela

vaginose bacteriana (CORSELO et al., 2003). Na Europa, é a primeira causa de

vulvovaginite (ZIARRUSTA, 2002). Cavalcante, Miranda e Portugal (2005) reforçam

em seu estudo a necessidade de valorizar a doença como importante causa de

comprometimento da saúde da mulher. Estima-se que aproximadamente 75% das

mulheres adultas apresentem pelo menos um episódio em sua vida, sendo que

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destas, 40% a 50% vivenciarão novos surtos e 5% atingirão o caráter recorrente

(CVVR) (MARDH et al., 2002).

1.4. Imunidade a C. albicans na Candidíase Vulvovaginal

A defesa do hospedeiro contra a infecção por Candida spp depende

daresposta imune inata e adaptativa. Embora cada uma possa contribuir de maneira

diversa nos diferentes sítios de infecção, a imunidade inata, por meio de macrófagos

e neutrófilos, domina a proteção contra a candidemia, enquanto que a imunidade

celular, predominantemente mediada por citocinas das células TCD4+, protege as

mucosas da infecção. Em relação à imunidade humoral, existem controvérsias entre

estudos clínicos e modelos de animais, havendo dados discordantes acerca do

papel efetivo dos anticorpos contra infecção por C. albicans (COSTA; FELIPE;

GAZIRI, 2008).

Até recentemente, pouco se sabia sobre as maneiras pelas quais os

neutrófilos e macrófagos, os principais intervenientes da imunidade inata,

reconheciam a C. albicans como micro-organismo patogênico, ou como se dava a

interação fungo-leucócito desencadeando a resposta inflamatória (MITCHISON,

1993). Somente nas últimas décadas, tornou-se claro que imunidade inata não

somente reconhece várias classes de micro-organismos, mas também inicia e

modula a subseqüente resposta adaptativa que é realizada pelas células B e T

através da interação com as células apresentadoras de antígenos (especialmente

células dendríticas (DC)) (HOEBE; JANSSEN; BEUTLER, 2004). A tarefa de

reconhecer o patógeno invasor e ativar a resposta do hospedeiro são realizadas

pelos receptores de reconhecimento padrão (PRRs), que são expressos

principalmente em células do sistema imune inato incluindo neutrófilos, monócitos,

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macrófagos e células dendríticas, reconhecendo os padrões moleculares associados

à patógenos (PAMPs), presentes na parede celular dos fungos (GOW et al., 2007;

COSTA;FELIPE; GAZIRI, 2008).

Os principais PAMPs da parede celular deC. albicans são β-glucanas, quitinas

e mananas. O receptor Dectina-1,Toll-likereceptor (TLR- receptores semelhantes ao

Toll) e o receptor de manoses (RM) são os principais PRRs responsáveis pelo

reconhecimento de componentes polissacarídeos da parede celular de C.

albicans(LI et al., 2009).

O Dectina-1 é o principal receptor para a β-glucana, induzindo a sinalização

intracelular via motivo citoplasmático baseado na tirosina (ITAM) através da via

envolvendo a quinase Syk, PLCγ2 e Card9 e através da via quinase Raf-1 (REID;

GOW; BROWN,2009; XU et al.,2009). A sinalização do dectina-1 é também

conhecida por mediar a ativação de calcineurina, uma proteína fosfatase, que

quando ativada é importante para o controle de infecções fúngicas em camundongos

e humanos (GREENBLATT et al., 2010). A indução dessas vias resulta na produção

de numerosas citocinas, incluindo Fator estimulador de colônias de macrófagos e

granulócitos (GM-CSF), TNF, da quimiocina CXCL2, IL-2, IL-10, IL-6, IL-23 e IL-1β,

bem como da liberação de ácido araquidônico e produção de prostaglandinas

(GOODRIDGE et al., 2009;ROSAS et al., 2008).O Dectina-2 não é muito conhecido,

mas esse receptor faz a ligação, preferencialmente, com hifas deC. albicans e induz

a produção de TNF-α e do antagonista do receptor de IL-1 (SATO et al., 2006).

Enquanto a produção de IL-10, IL-6 e IL-2 pode ser mediada diretamente pelo

dectina-1, a indução de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas requerem a

colaboração com o TLR2. (GANTNER et al., 2003)

Os principais TLRs envolvidos no reconhecimento deC. albicans são o TLR2,

TLR4, TLR6 e TLR9, que após a interação com o fungo, induzem a produção de

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citocinas pró-inflamatórias (AKIRA; HEMMI, 2003). O balanço entre os sinais

produzidos pelo TLR2 e TLR4 são cruciais para a regulação da resposta imune.

TLR4 pode estimular fortemente a produção de citocinas pró-inflamatórias através

de dois caminhos: um envolvendo o gene de resposta primária de diferenciação

mielóide 88 (MyD-88), que depende do Fator Nuclear Kappa B (NF-κB), liberando

citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas; e o outro envolvendo o Fator de

Regulação de Interferon 3 (IRF 3), liberando interferon tipo I, que induz a produção

secundária de citocinas do perfil Th-1 como o IFN-γ (NETEA et al., 2002). Em

contraste, muitos estudos têm demonstrado que embora a ligação do TLR2 possa

induzir a produção de citocinas pró-inflamatórias, este efeito é menor que o mediado

pela ligação do TLR4. Além disso, o TLR2 falha na indução da liberação de IL-12 e

IFN-γ, promovendo condições que são favoráveis a resposta do perfil Th-2 e T-

regulatória (T-reg) (RE; STROMINGER, 2001).A C. albicans induz a

imunossupressão através do TLR2, liberando IL-10 e isso leva a geração de células

T reg CD4+CD25+, com potencial supressor (BLANCO; GARCIA, 2008).

As superfícies endoteliais e epiteliais também têm PRRs, que reconhecem os

PAMPs de superfície de micro-organismos invasores e colonizadores como a

C.albicans. Em estudos ex vivo com cultura de tecido epitelial humano reconstituído

inoculado com células fúngicas, a expressão dos TLRs é semelhante em

experimentos in vivo (WEINDI et al., 2007). Usando esse modelo,foi visto que os

leucócitos polimorfonucleares (PMNs) ativam a resposta imune, mostrando diferença

na imunidade da mucosa oral e vaginal (SCHALLER et al., 2004; FIDEL, 2007).As

células epiteliais vaginais expressam TLR2 e TLR4 in vivo, e a presença de células

de C.albicans inativadas e zymosan (partícula da parede da levedura, contendo,

principalmente, polissacarídeos, sendo a β-glucana e mananas os principais

constituintes) induz a produção de citocinas pró-inflamtórias, quimiocinas e de β-

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defensinas 2, um componente antimicrobiano que também ocasiona a quimiotaxia

de células PMNs (PIVARCSI et al., 2005).

Os receptores de manoses presentes na superfície de macrófagos

reconhecem a superfície rica em manoses, sendo especialmente importantes na

fagocitose de C. albicans. A fagocitose da levedura, por meio do receptor de

manoses, resulta na produção de citocinas pró-inflamatórias, degradação do fungo,

estímulo de moléculas co-estimulatórias, expressão das moléculas do complexo

principal de histocompatibilidade (MHC) classe II e na estimulação da resposta

celular protetora T helper 1(Th1) (LI et al., 2009).

Após a fagocitose, os fagócitos usam muitos mecanismos oxidativos e não-

oxidativos que trabalham sinergicamente para destruir o fungo intra e

extracelularmente. Essas atividades são bastante influenciadas pelo estado de

ativação celular, que é controlado amplamente através da ativação por citocinas e

outros mediadores solúveis que podem aumentar (como o IFN-γ) ou suprimir (como

a IL-10) o mecanismo efetor antifúngico. Diferentes fagócitos variam na habilidade

para destruir o fungo ou restringir o seu crescimento, e essa atividade depende da

espécie do fungo envolvida. No tocante aC. albicans, por exemplo, neutrófilos são os

mais potentes efetores, seguidos pelos monócitos, macrófagos e as células

dendríticas (VONK et al., 2006).

A imunidade inata é o principal mecanismo de proteção contra candidíase

disseminada. Anormalidades quantitativas e qualitativas dos neutrófilos e monócitos

são associadas com candidíase sistêmica. Os doentes com linfoma, leucemia,

doença granulomatosa crônica, que resultam em neutropenia, aumentam o risco de

infecções disseminadas (BLANCO; GARCIA, 2008). De modo semelhante, os

neutrófilos PMN, também desempenham um papel importante na defesa contra a

candidíase vaginal, pois em um estudo realizado por Fidel et al. (2004), em mulheres

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com infecção vaginal experimental, foi observado considerável função efetora contra

C. albicans, mas não existem evidências em animais, que na ausência dessas

células aumente a susceptibilidade a candidíase vaginal.

As células dendríticas capturam antígenos nos tecidos periféricos e, quando

maduras, migram para as áreas de linfócitos T nos órgãos linfóides, providenciando

células T com sinalização adequada e específica. As DCs expressam vários TLRs, e

são principal conector dos sistemas imune inato e adaptativo. Estas células são

excepcionalmente hábeis em decodificar informações associadas a fungos e traduzi-

las em diferentes respostas imune dependente de células T (ROMANI; BISTONI;

PUCCETTI, 2002).

Na imunidade adaptativa, as células dendríticas que fagocitaram os

patógenos, podem ativar linfócitos antígenos específicos, que podem diferenciar-se

tanto em células T efetoras, como também em células T de memória,

proporcionando proteção imediata contra patógenos nos tecidos periféricos. O

tecido vaginal não contém um tecido linfóide organizado, mas parece ser altamente

sensível no local ou distal a imunização com antígenos de Candida nas mucosas, de

modo que uma resposta protetora antimicrobiana na região vaginal pode ser

facilmente alcançada (DE BERNARDIS et al., 2006). Os linfócitos estão

frequentemente presentes em fluidos de lavado vaginal de ratos, mas a sua

presença não tem correlação com a redução da carga fúngica vaginal, na

candidíase, corroborando com as diversas controvérsias em relação à atividade da

imunidade mediada por células (CMI) (WOZNIAK; WORMLEY; FIDEL, 2002).

Praticamente todos os fungos que infectam os homens induzem a liberação

de IL-12 pelos fagócitos e células dendríticas. A IL-12 é produzida de modo

morfotipo-dependente, através do uso de diferentes receptores de reconhecimento e

TLRs. A IL-12 juntamente com a IL-18, induzem IFN-γ, citocina chave no controle da

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infecção fúngica em camundongos e humanos (ROMANI; PUCCETTI; BISTONI,

1997). IFN-γ produzido pelas células T e células natural killer (NK), estimulam a

migração, aderência, fagocitose e morte oxidativa pelos neutrófilos e macrófagos, e

sustenta a reatividade das células Th1 pela sua capacidade de manter as células

TCD4+ responsivas a IL-12 (ROMANI, 2004).

Mais recentemente, investigadores relataram a participação da imunidade

adaptativa tipo Th17 no controle de infecções fúngicas, particularmente na

mucosa.Contudo,essa resposta parece ser relevante somente em lugares

específicos da mucosa e para patógenos específico. Deficiência na resposta Th17 é

relacionada a susceptibilidade a fungos,como é o caso da Síndrome de

Hiperimunoglobulina E (CONTI; GAFFEN, 2010). E também, a interação deC.

albicans com Dectina-1 e 2 e o RM induz a resposta Th17 (ROBINSON et al.,

2009;VON VEERDONK et al., 2009; LEIBUNDGUT- LANDMANN et al., 2007).

O mecanismo imune humoral por proteínas do complemento participa da

resposta a C. albicans, a qual ativa a cascata do complemento (C) pelas vias

clássicas e alternativas, com deposição de C3 na superfície nas células fúngicas. A

ativação do complemento facilita o recrutamento de fagócitos para tecidos infectados

e melhora sua atividade anticandida. Ratos de indução deficiente de C5 têm uma

propensão maior de desenvolver infecção disseminada (BLANCO; GARCIA, 2008).

O papel da imunidade humoral dependente de anticorpos contra a vaginite é incerto.

Em pacientes com CVVR, a presença de níveis normais ou até mesmo níveis

elevados de anticorpos da classe IgA e IgG candida-específicos, no soro ou nas

secreções vaginais sugere pouco ou nenhum papel protetor de anticorpos contra a

vaginite (FIDEL et al., 1997). Em camundongos, no entanto, anticorpos IgM e IgG3

contra manana de Candida foram mostrados por ter a proteção contra candidíase

sistêmica e infecções vaginais experimentais. Além disso, em um modelo de rato

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com candidíase vaginal, a infecção vaginal induziu a produção de anticorpos IgA

anti-Sap,os quais contribuíram para a proteção contra a infecção (WOZNIAK;

WORMLEY; FIDEL, 2002).

As células T vaginais foram recentemente caracterizadas e quantificadas na

lâmina própria no epitélio vaginal e no colo do útero em seres humanos. Há cerca de

240 linfócitos T por mm² no tecido epitelial vaginal (ILDGRUBEN; SJOBERG;

HAMMARSTROM, 2003). Em todos os casos as células T CD8 + parecem ser mais

numerosas do que as células TCD4+, onde a razão é aproximadamente 1,25,

diferentemente dos demais tecidos. A maioria das células T vaginais migram para o

epitélio vaginal, em resposta a um estímulo antigênico local e/ou quimiocinas

inflamatórias. A mesma tendência parece ser observada para as células B e células

plasmáticas secretoras de imunoglobulinas, que normalmente estão ausentes na

vagina saudável, mas são recrutadas para o tecido vaginal após a imunização

adequada (PUDNEY; QUAYLE; ANDERSON, 2005). Notavelmente, a relação de

células T CD4 e CD8 vaginais em mulheres saudáveis é mais semelhante a da

vagina do rato (DE BERNARDIS et al., 2000), do que a de camundongo (FIDEL et

al., 1999).

Uma função antimicrobiana crítica defensiva é desempenhada pelas células

epiteliais (CE), que envolve todo o trato reprodutivo. Estas células não só constituem

uma barreira mecânica, mas também funcionam como sentinelas que reconhecem e

processam antígenos, além de secretarem uma grande quantidade de mediadores

imunológicos (quimiocinas, citocinas, peptídeos de defesa), que orquestram a

imunidade inata e regulam a imunidade adaptativa (WIRA et al., 2005). Elas estão

sob a influência dos hormônios sexuais em um delicado equilíbrio, que permite a

manutenção da vigilância imunológica contra patógenos, fornecendo o grau de

tolerância imunológica necessária para aceitar sêmen e feto (WASSEN L;

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JERTBORN M, 2006).

Em particular, CE vaginais humanas têm demonstrado possuir atividade

intrínseca anti-Candida, sendo esta atividade menor nos pacientes com CVVR

comparado aos indivíduos saudáveis.Esta atividade tem se mostrado dependente de

estrógeno, sugerindo que o estrógeno permite a infecção vaginal, não só por

modificações histológicas conhecidas no tecido vaginal, mas também pela

diminuição do potencial inibitório das CE (FIDEL, 2005).

1.5. Modelos Animais de Candidíase Vulvovaginal

Modelos animais são úteis para o estudo de vários aspectos de

patogenicidade da Candida spp. e resposta imune anti-Candida, sob condições

possivelmente mimetizando a infecção humana. A Candidíase vulvovaginal

experimental é reproduzida especialmente em camundongos e ratos em condições

pseudoestrus (estrogeno-dependente), mas um modelo de primatas também está

sendo explorado (STEELE et al., 1999). Com a administração de estrógeno, o

epitélio vaginal fica mais espesso e totalmente queratinizado (KINSMAN; COLLARD,

1986), oferecendo subsequentemente um substrato para adesão da levedura,

crescimento e formação de biofilme (CHANDRA et al., 2001). Formação de

hifas, aderência e produção de Sap também são reforçadas pela produção da

camada de queratina. Além disso, o estrogéno diminui a imunidade mediada por

células (CMI) e reduz a infiltração de leucócitos (KINSMAN; COLLARD, 1986), o que

ajuda o crescimento de fungos e estabelecimento da infecção (TARRY et al., 2005).

Na verdade, infecções vaginais humanas ocorrem quase exclusivamente

durante os anos férteis e são extremamente raras no período pré-menarca e em

mulheres na pós-menopausa, e a prevalência e gravidade aumentam na semana

pré-menstrual (ECKERT, 2006), condições estas que são claramente influenciadas

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pelo estrógeno. Há portanto, um consenso que os modelos descritos anteriormente

são pouco representativos da doença humana e que o conhecimento da expressão

da virulência do fungo e a relação da resposta imune no modelo animal podem

ajudar apenas a entender o mecanismo da infecção por Candida e a imunidade em

mulheres. Duas advertências principais devem ser consideradas quando se faz

paralelo entre seres humanos e animais. Primeiro, C. albicans é um comensal na

vagina da maioria das mulheres, o que não acontece nos modelos animais com

camundongos e ratos. Assim, as mulheres são imunologicamente “marcadas” contra

os fungos, enquanto os animais não são. Em segundo lugar, a infecção vaginal

experimental em roedores é alcançada pela inoculação intravaginal direta de grande

quantidade de inóculo de fungos (geralmente 106 e 107 células), o que é improvável

ser o mecanismo típico de infecção humana, que provavelmente ocorre pelo influxo

de células fúngicas do reservatório intestinal (BLACK et al., 1998).

1.6. β-Glucana

As β-glucanas são polissacarídeos de peso molecular de aproximadamente

6.500 daltons (HASSID; JOSLYN; MC CREADY, 1941)e constituintes estruturais da

parede celular de leveduras, fungos filamentosos, alguns cereais, plantas e algas,

que se diferenciam pelo tipo de ligação entre as unidades de glicose da cadeia

principal e pelas ramificações que se conectam a essa cadeia (BROWN; GORDON,

2001). Na levedura Saccharomyces cerevisiae, a β-glucana é constituída por um

esqueleto linear central de unidades de glicose ligadas na posição β (1-3), com

cadeias laterais unidas em β(1-6), que ocorrem em diferentes intervalos e têm

tamanhos variados, sendo essa estrutura um potente imunoestimulante, pois ao ser

reconhecido pelo organismo desencadeia uma série de eventos na resposta imune

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(MAGNANI; CATRO-GÓMEZ, 2008).

A estrutura da β-1,3 glucana tem tamanho estimado de 1500 resíduos de

glicose e a β-1,6 glucana apresenta 150 a 200 resíduos. Na parede do S. cerevisiae,

são rearranjadas por ramificações introduzidas por glisosiltransferases (STRAFORD,

1994). Segundo Lee et al. (2002), a solubilidade em água depende do número de

resíduos de glicose unidos em β-1,6 das cadeias laterais e do grau de

polimerização. De acordo com Klis et al. (2002) o grau de polimerização de β-

1,3glucana pode variar com as condições em que a levedura se encontra.

Quanto à solubilidade em alcoóis, são encontradas duas frações de β-1,3,

sendo uma solúvel e outra insolúvel. A porção insolúvel contém 3 a 6% de

ramificações unidas em β-1,6 e representa o maior componente da parede, A porção

solúvel representa 15 a 20% e apresenta uma estrutura semelhante à insolúvel,

entretanto com maior número de ramificações β-1,6 (SHAHINIAN; BUSSEY, 2000).

As β-glucanas são reconhecidas pelo sistema imune inato dos vertebrados

através de receptores na superfície celular, principalmente de leucócitos, incluindo

macrófagos, neutrófilos e células natural killer (NK), como também receptores em

células não-imunes como as endoteliais e os fibroblastos (BROWN; GORDON,

2003).

As β-glucanas fúngica atuam como PAMPs, iniciando a resposta imune

quando em contato com os PRRS. Nos seres humanos, vários desses receptores

para a glucana foram identificados, tais como Dectina-1, receptores de complemento

3 (CR3), o receptor scavenger, lactosilceramida (LacCer) e o receptor Toll-like

(BROWN; GORDON, 2005).

O Dectina-1 é um dos principais receptores para zymosan nos macrófagos

(BROWN et al., 2002; GOW et al., 2007) e, de acordo com Gantner et al. (2003) é

necessária a interação das estruturas da parede da levedura com ambos os

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receptores Dectina-1 e TLR-2 para que exista a produção de citocinas pró-

inflamatórias. Dessa forma, o dectina-1 se ligaria a β-glucana e os outros

componentes da parede celular da levedura interagiriam com o receptor TLR-2. Ou

seja, existe um efeito de colaboração entre os receptores, pois através de TLR-2

ocorreria o estímulo do adaptador MyD88 para a ativação do fator NFκB, induzindo a

fagocitose e produção de TNF-α e IL-12.

Figura 1: Modelo de interação do Zymosan com Dectina-1 e Toll-like

FONTE: GANTNER et al.,2003

A glucana é capaz de induzir a hiperfuncionabilidade do sistema fagocitário

mononuclear pelo aumento da função fagocítica, da imunidade celular e humoral, da

produção de citocinas e dos fatores citotóxicos do macrófago. A glucana tem a

capacidade de influenciar o sistema imunológico do hospedeiro, regulando a

atividade celular por meio de interações entre macrófagos, células T e B, células NK,

granulócitos e fatores humorais. Esse polissacarídeo é capaz de modificar a

resposta a infecções em animais normais e imunossuprimidos bem como controlar o

crescimento de tumores (RIBEIRO; PASSETI; OGATA, 2005).

Existem diversos relatos que comprovam o efeito imunomodulatório da

glucana em infecções de origem bacteriana, viral, fúngica e parasitária (MAGNANI;

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CATRO-GÓMEZ, 2008). Esse fato pôde ser confirmado por Browder et al. (1984),

que avaliou a habilidade da glucana em aumentar a resistência à septicemia por C.

albicans, induzida experimentalmente no pós-operatório. Camundongos receberam

injeções endovenosas de glucana dias antes de serem submetidos à laparotomia em

branco e serem inoculados com organismos viáveis da levedura, enquanto que o

outro grupo só foi infectado, não tendo sido submetido à cirurgia. A glucana conferiu

proteção à infecção por C.albicans tanto nos animais operados (73% de sobrevida)

quanto nos não-operados (100% de sobrevida)

Em outro estudo, a associação de itraconazol e glucana, demonstrou uma

melhor eficácia no tratamento de cromoblastomicose refratária ao antifúngico, tendo

contribuído para a regressão das lesões dessa micose (AZEVEDO et al., 2006). De

acordo com Martins et al. (2007), ratos com esporotricose experimental tratados com

itraconazole glucana, por via oral e subcutânea, respectivamente, e outros tratados

somente com glucana, quando comparados com animais sem tratamento (controle),

apresentaram uma menor quantidade de unidades formadoras de colônia, nos

órgãos internos.

Para avaliar a capacidade protetora da vacina β-glucana-conjugada,

formulada com o adjuvante MF59, PIETRELLA et al. administrou a mesma por via

parenteral em camundongos com CVV por C.albicans. Pode se verificar que a

vacina conferiu significativa proteção, e esta foi associada com a produção de

anticorpos IgG anti-glucana no soro e no lavado vaginal dos animais (PIETRELLA et

al., 2010).

Sabendo-se que a glucana desempenha uma atividade imunomodulatória nas

infecções fúngicas, bacterianas e virais, evitando a progressão e melhorando o

prognóstico das mesmas, acredita-se que este polissacarídeo possa desempenhar

um papel importante na candidíase vulvovaginal, podendo levar a uma melhora na

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progressão da infecção. Esse fator torna-se de grande relevância, uma vez que a

incidência dessa infecção tem aumentado nos últimos tempos, as recidivas

constantes têm comprometido a qualidade de vida das mulheres e o tratamento é

dificultado pela resistência de algumas espécies de Candida aos antifúngicos

disponíveis no mercado para o seu tratamento.

Baseado nessas afirmações, esse trabalho tem como finalidade pesquisar um

novo imunomodulador para o tratamento da candidíase vulvovaginal.

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2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral: Avaliar a atividade imunoestimulante da β -1,3 glucana, na

candidíase vulvovaginal experimental.

2.2. Objetivos Específicos:

Avaliar a infecção vulvovaginal através da contagem de

unidades formadoras de colônias e análise histopatológica;

Avaliar a concentração da citocina IFN-γ no fluido vaginal dos

animais;

Averiguar o infiltrado celular inflamatório no tecido vaginal dos

animais.

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3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Animais

Foram utilizados camundongos fêmeas BALB/c (n= 54) com peso corporal de

21 a 35g e com 7 a 10 semanas de idade, os quais foram divididos em 3 grupos com

9 animais cada, sendo os experimentos feitos em triplicata. Os animais foram

alojados, no Biotério do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte, mantidos com controle de umidade, temperatura e com

alimentos e água ad libitum.

A eutanásia foi realizada com a administração de tiopental sódico 100mg/Kg,

por via intraperitoneal. As carcaças dos animais utilizados foram congeladas em

“freezer” e posteriormente recolhidas na coleta seletiva do Hospital Universitário

Onofre Lopes (HUOL).

Esse trabalho foi aprovado pela comissão de ética no uso de animais

(CEUA), com número do protocolo 029/2010 (Anexo I).

3.2. Micro-organismos e condições de crescimento

A levedura utilizada foi a cepa deC. albicans 351cv originalmente isolada da

secreção vaginal de pacientes apresentando sinais e sintomas de CVV, pertencente

ao banco de micro-organismos do Hospital Giselda Trigueiro e gentilmente cedida

pela Profª Eveline Milan. Previamente aos experimentos, células de C. albicans

foram reativadas em placas de Petri contendo Ágar-Sabouraud Dextrose (ASD)

(HIMEDIA®) adicionado de 50µg/mL de cloranfenicol, incubadas a 37ºC por 48

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horas, com pelo menos dois repiques sucessivos

3.3. Preparo do Inóculo

Previamente à inoculação nos animais, as células foram crescidas em YEPD

caldo (2% de glicose, 2% de peptona e 1% de extrato de levedura) por 18 horas a

37ºC, 200 rpm (Tecnal® TE-420, Brasil).As leveduras foram lavadas com salina-

tween (salina a 150 mM e tween 80 a 0,05%) e centrifugadas a 4ºC, numa rotação

de 3.000 rpm (High Speed Refrigrated Centrifuge, Supra 21K) por 5 minutos. Por

último, foram suspensas em salina-tween e quantificadas em hemocitômetro na

concentração de 5x 104 de células de C. albicans para uso posterior.

3.4. Extração e preparação da β- 1,3 glucana insolúvel

A β-1,3 glucana foi extraída a partir do fermento Fleischmann®

(Saccharomyces cerevisiae) pelo método de HASSID et al. (1941) com algumas

modificações, no Laboratório de Imunologia Clínica da Faculdade de Farmácia da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Análises químicas e de ressonância

magnética nuclear (RMN 1D e 2D) confirmaram que a linear β-1,3 glucana foi

purificada e não estava contaminada com outros carboidratos, proteínas e

componentes fenólicos. Após extração e pulverização, a glucana foi suspensa em

soro fisiológico a 0,9%, nas concentrações de 1mg/mL e 5mg/mL, sendo, em

seguida, sonicada numa rotação de 45 rpm por 40 segundos + 10 segundos em

gelo, seis vezes. Por último, as suspensões foram autoclavadas.

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Figura 2: Glucana insolúvel pulverizada

3.5. PROTOCOLO EXPERIMENTAL (Apêndice I)

3.5.1. Vulvovaginite experimental em camundongos

Os animais foram tratados com 0,1mg de Benzoato de Estradiol (Sigma®,

Brasil) em 0,1mL de Óleo Sésamo (Sigma®, Brasil), por via subcutânea. A

administração começou cinco dias previamente à inoculação com C. albicans, sendo

mantida durante 17 dias, mantendo o pseudoestrus, nos camundongos. Os animais

foram inoculados, no sexto dia de experimento, com 5x104blastoconídios de C.

albican sem 10 µL de salina-tween, por via vaginal. Após a inoculação, cada animal

foi colocado de cabeça para baixo durante um minuto para melhor penetração do

inoculo (Vulvovaginite adaptada de CHEN et al., 2007).

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Figura 3: Inoculação de Candida albicans, por via vaginal

3.5.2. Tratamento com β-1,3 glucana

Para o ensaio in vivo, os animais foram divididos em três grupos G1 (Controle), G2

(Glucana Vaginal) e G3 (Glucana Intraperitoneal). No 4º e 7º dia após a inoculação

com Candida, o grupo G1 recebeu 1 ml de Cloreto de sódio estéril a 0,9% e o grupo

G3 recebeu 1mg/mL de glucana em 1mL de cloreto de sódio estéril a 0,9%, ambos

por via intraperitoneal. Enquanto que o grupo G2 recebeu 5mg/mL de glucana em

40µL de cloreto de sódio estéril a 0,9%, por via vaginal.

Tabela 1: Grupos de tratamento com glucana, no 4º e 7º dia após a inoculação

TRATAMENTO COM GLUCANA

G1 (Controle) G2 (Vaginal) G3 (Intraperitoneal)

1mL de Cloreto de sódio a

0,9%, via intraperitoneal

5mg/mL de Glucana em

40µL de Cloreto de sódio a

0,9%, via vaginal

1mg/ml de Glucana em

1mL de Cloreto de sódio a

0,9%, via intraperitoneal

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3.5.3. Monitoramento da infecção fúngica: Contagem de Unidades Formadoras

de Colônias (UFC)

O monitoramento da infecção vulvovaginal foi realizado nos animais através

da coleta de fluido vaginal, no 2º dia após a inoculação (em todos os animais), no 5º,

8º e 10ºdia (em 3 animais de cada grupo).As cavidades vaginais dos camundongos

foram lavadas com 100μL de salina estéril, a qual foi aspirada e expirada por 20

segundos. Esse lavado vaginal foi diluído na concentração de 1:100 em 1mL de

salina, o qual foi transferido e homogeneizado em Ágar-Sabouraud Dextrose

adicionado de 50μg/mL de cloranfenicol, fundido à 50ºC. As placas de Petri foram

incubadas sob a temperatura de 37ºC por 48 horas, para posterior observação e

determinação das UFC.

Os camundongos foram considerados infectados, quando pelo menos uma

UFC estivesse presente na amostra vaginal, ou seja, uma contagem de >10³ UFC/

mL.

3.5.4. Lavado vaginal para dosagem de citocina

A lavagem da cavidade vaginal dos camundongos foi realizada no 6º, 9º e 11º

dia após a inoculação, nos três animais que passaram pela contagem de UFC no 5º,

8º e 10º, respectivamente. Em cada dia de lavagem os três animais de cada grupo

foram sacrificados e a lavagem vaginal foi conduzida imediatamente após a

eutanásia, usando 100μL de PBS estéril, pela injeção e aspiração por 30 a 40

segundos. Os fluidos coletados foram agrupados para cada grupo experimental e

centrifugados por 10 minutos em 14.000 rpm (High Speed Refrigrated Centrifuge,

Supra 21K) à 4ºC, sendo o sobrenadante estocado em -80ºC para posterior

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dosagem de citocina.

3.6. Dosagem da Citocina IFN-γ

Foi feito um “pool” do fluido vaginal coletado dos camundongos em diferentes

períodos durante a infecção, sendo centrifugado como descrito acima. A citocina

dosada foi o IFN-γ pelo método de ELISA (Ensaio Imunoenzimático), utilizando um

kit comercial (IFN- γ de camundongo, BD Biosciences. San Diego, USA), seguindo

todas as orientações do fabricante.

As ODs foram lidas no comprimento de 450 nm com uma leitora de

microplacas (Multiskan ascent, Labsystems), e os resultados, expressos em

picogramas por mililitros, foram comparados com os valores da curva padrão

específica para a citocina IFN-γ, indicado pelo fabricante. A sensibilidade desse teste

era de 0,762 pg/ml.

Figura 4: Placa de Elisa, na dosagem de IFN-γ

3.7. Estudo histopatológico

Após a coleta do lavado vaginal para a dosagem de citocinas, os animais

sacrificados passaram pela remoção do tecido vaginal, o qual foi imediatamente

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fixado em 10% (v / v) de formaldeído.

Em seguida, os tecidos vaginais passaram pela desidratação em etanol

graduado e diafanização com xileno. Essas peças foram incluídas em parafina e

microtomizadas em oito mm de espessura, para a confecção das lâminas. Por

último, algumas lâminas foram coradas com hematoxilina-eosina para avaliar o

infiltrado celular e outras com PAS (Ácido Periódico de Schiff) para avaliar a carga

fúngica, em microscópio de luz (OLIMPUS).

3.8. Análise Estatística

Foram utilizados os testes não-paramétricos, pois os dados não atenderam

as condições exigidas pelos testes paramétricos. O teste não-paramétrico usado foi

o Kruskal-Wallis, o qual testa a hipótese se há diferença significativa entre os

grupos, com a atribuição do valor-p de 5%. Os softwares utilizados foram o Excel

2007 para organização dos dados e o SPSS versão 17.0 para execução dos testes

estatísticos.

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4. RESULTADOS

4.1. Infecção Vulvovaginal por C. albicans

4.1.1.Contagem de UFC

Dois dias após a inoculação, realizou-se um lavado da cavidade vaginal de

todos os animais, o qual foi adicionado em ASD para a realização do método Pour-

plate, contagem das UFC (Figura 5). O lavado vaginal para o isolamento de C.

albicans além de assegurar que todos os animais estavam infectados com C.

albicans, confirmando o sucesso da infecção no modelo experimental, também foi

utilizado para avaliar a carga fúngica antes do tratamento com glucana. Para a

obtenção dos dados da contagem de UFC, nesse dia, foram feitas médias de três

animais por grupo, as quais foram utilizadas na comparação das médias dos

mesmos animais em dias seguintes, obtendo a diferença das médias nos grupos. Ou

seja, comparou-se o resultado das médias da contagem de UFC do segundo dia

após a inoculação com o do quinto dia (Tabela 2), com do oitavo (Tabela 3) e com do

décimo dia após a inoculação (Tabela 4), avaliando, assim, a evolução da infecção.

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Figura 5: Células de C. albicans crescidas em Ágar Sabouraud dextrose após um período

de incubação de 48 horas, incubadas à temperatura de 37ºC. (Método Pour-plate,

contagem de UFC)

De acordo com as Tabelas 2, 3 e 4, observou-se que todos os animais se

apresentaram infectados e mantiveram a infecção durante todo o período do

experimento. Observando a tabela 2, pode-se afirmar que, no quinto dia após a

inoculação, os animais tratados com glucana (G2 e G3) apresentaram uma menor

quantidade das UFC quando comparado com o controle (G1). No entanto, essa

diferença não foi considerada estatisticamente significante, apresentando um p> α

(0,05).

Tabela 2: Comparação da média da diferença de UFC entre o 5° e o 2° dia, nos três

grupos, através do teste de Kruskal-Wallis: (log10 ufc, n=3)

Grupo 2º 5º Diferença

Valor-p Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão

Controle (G1) 2,70 0,928 3,90 0,764 1,20 1,041

0,679 Vaginal (G2) 3,60 0,957 4,29 0,387 0,68 1,009

Intraperit. (G3) 3,19 0,510 4,02 0,525 0,83 0,629

Fonte: Levantamento de dados primários, AGOSTO/2011.

Assim como no quinto dia, no oitavo dia após a inoculação, também foi

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observada uma tendência de maior quantidade das UFC no grupo controle (G1),

quando comparado com os grupos tratados com glucana (Tabela 3).

Interessantemente, o grupo G3, tratado com glucana intraperitoneal, apresentou

uma diminuição das UFC.Com relação ao grupo G2, os animais tratados com

glucana, por via vaginal, apresentaram um aumento de UFC. Entretanto, a

quantidade de UFC foi menor que o grupo controle. Não houve diferença

estatisticamente significativa entre nenhum dos grupos avaliados.

Tabela 3: Comparação da média da diferença de UFC entre o 8° e o 2° dia, nos três

grupos, através do teste de Kruskal-Wallis: (log10 ufc, n=3)

Grupo 2º 8º Diferença

Valor-p Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão

Controle (G1) 2,56 0,999 4,04 0,839 1,48 1,668

0,086 Vaginal (G2) 2,78 0,786 3,86 1,000 1,09 1,269

Intraperit. (G3) 4,18 0,593 3,29 0,560 -0,89 0,524

Fonte: Levantamento de dados primários, AGOSTO/2011.

No décimo dia após a infecção (Tabela 4), o grupo controle(G1) também

apresentou um maior quantidade das UFC quando comparado aos grupos G2 e G3.

Enquanto que o grupo G3, tratado com glucana intraperitoneal, apresentou uma

diminuição das UFC. E o grupo G2, tratado com glucana por via vaginal, mostrou um

aumento das UFC, porém menor que a quantidade das UFC no controle. Apesar da

diferença na contagem de colônias, em nenhum caso apresentou significância

estatisticamente.

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Tabela 4: Comparação da média da diferença de UFC entre o 10° e o 2° dia, nos três

grupos, através do teste de Kruskal-Wallis: (log10, n=3)

Grupo 2º 10º Diferença

Valor-p Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão

Controle (G1) 2,46 0,343 2,91 0,704 0,46 0,887

0,695 Vaginal (G2) 2,92 0,410 3,26 0,602 0,34 0,900

Intraperit. (G3) 4,16 0,151 3,95 0,949 -0,22 0,983

Fonte: Levantamento de dados primários, AGOSTO/2011.

4.1.2. Dosagem da Citocina IFN-γ, no lavado vaginal

Devido ao papel crítico das citocinas na imunoregulação, promovendo

indução e persistência da resposta celular específica e dependente de anticorpos,

(ROMANI, 1997) o fluído vaginal dos camundongos foi coletado em três intervalos

durante o experimento (6º, 9º e 11º dias após a inoculação) (Figura 6).

Figura 6:Detecção da citocina IFN-γ, no lavado vaginal de camundongos com candidíase

vulvovaginal por C. albicans, durante o experimento, nos dias 6, 9 e 10 após a

inoculação. A citocina foi quantificada usando o pool do lavado vaginal dos

camundongos (três animais por pool).

Foi avaliada a presença da citocina Interferon-gama (IFN-γ), representativa

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da resposta tipo Th1. Durante o experimento, foi observada a presença dessa

citocina, no lavado vaginal, principalmente nos grupos tratados com glucana (G2 e

G3), todos os dias de coleta (Figura 6). O maior pico (416,35 pg/mL) foi encontrado

no sexto dia após a inoculação, no grupo G3, enquanto que no nono dia ocorreu um

declínio para 3,64 pg/mL e no 11º o IFN-γ teve um aumento para 101,94 pg/mL.

Nogrupo G2, os níveis de IFN-γ praticamente se mantiveram constantes no sexto e

nono dia após a inoculação (219,73 e 225,48 pg/mL, respectivamente), já no 11º,

ocorreu um declínio para 17, 54 pg/mL. Enquanto que no grupo controle, não-tratado

com glucana, o IFN-γ não foi detectado em nenhum dia de coleta.

4.1.3. Análise Histopatológica

Foi observada a presença de todas as morfologias de C. albicans

(blastoconídios, hifas e pseudohifas) aderidas e invadindo tanto o tecido vaginal dos

grupos tratados com glucana por via vaginal (G2) (Figura 8) e intraperitoneal (G3)

(Figura 9) como nos não-tratados com glucana (G1) (Figura 7).

A presença de leveduras no tecido vaginal foi observada durante todo o

experimento, principalmente, no sexto, nono e décimo primeiro dia após a

inoculação, quando o tecido vaginal foi removido dos animais para análise.

Em relação ao infiltrado de células inflamatórias, em todos os animais

evidenciou-se a presença de neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) e em alguns

casos observou-se a presença de linfócitos tanto na mucosa como na submucosa

vaginal.O grupo G1, controle, apresentou menor infiltração de células PMNs, nos

três dias (6º, 9º e 11º), quando comparado com os grupos tratados com glucana. O

grupo G2, apresentou maior infiltração de células PMN para a mucosa vaginal, em

todos os três dias de análise, quando comparado aos demais grupos G1 e G3. O

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grupo G3 também apresentou alto influxo de células PMNs, nos três dias, quando

comparado ao controle, porém menor que o grupo G2.

Em relação à carga fúngica, foi observado que tanto o grupo controle (G1)

como o grupo G2, glucana por via vaginal, demonstraram alta carga fúngica de C.

albicans, aderidas e invadindo o tecido vaginal. Enquanto que o grupo G3, glucana

por via intraperitoneal, apresentou redução da carga fúngica, principalmente, no 11º

após a inoculação, quando os animais já haviam recebido a segunda dose da

glucana, não apresentando invasão, no tecido vaginal, pelas células de C. albicans.

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Figura 7: Análise histopatológica do tecido vaginal de camundongos controle (G1) (a

e b) e com glucana por via vaginal (G2) (c e d) infectados com C. albicans. (a) e (c):

Coloração com hematoxilina e eosina e (b) e (d): Coloração com Ácido periódico de

Schiff (PAS). (X400). Setas pretas: infiltração de células PMNs e setas brancas:

invasão de C. albicans.

A

B

C D

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Figura 8: Análise histopatológica do tecido vaginal de camundongos tratados com

glucana por via intraperitoneal (G3) infectado com C. albicans. (a e c): Coloração

com hematoxilina e eosina e (b e d): Coloração com Ácido periódico de Schiff (PAS).

(X400). Seta preta: infiltração de PMNs e seta branca: invasão de C. albicans. (a e

b): 8º dia e (c e d): 11º dia.

A B

C D

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5- DISCUSSÃO

A CVV é uma das infecções vaginais mais comuns em todo mundo, com

aproximadamente 13 milhões de casos emergentes a cada ano. Sua incidência tem

aumentado constantemente, devido ao extensivo uso de antibióticos e

corticosteróides. Essa infecção pode afetar a saúde mental e física das pacientes e

até mesmo o relacionamento com os seus parceiros (THEODORE; KIEREN;

RALEIGH, 1998). Por isso, a CVV é atualmente um relevante problema na saúde da

mulher (ÁLVARES et al., 2007). Com o propósito de avaliar a capacidade

imunomodulatória da β-glucana, nós estabelecemos um modelo de CVV em

camundongos, sob influência do estrógeno, para garantir a efetiva infecção. Nosso

estudo mostrou que 100% dos animais tratados com estrógeno desenvolveram a

infecção, sugerindo que o modelo experimental obteve sucesso.

A atividade imunomodulatória da glucana foi avaliada, no local da infecção,

através da coleta do lavado vaginal, o qual foi utilizado para a contagem de UFC e

para a quantificação da citocina IFN-γ e através da análise histopatológica.

Em relação à contagem de colônias, nossos resultados mostraram que os

animais tratados com glucana intraperitoneal (G3) apresentaram redução da carga

fúngica, no oitavo e décimo dia após a inoculação, quando comparados com os do

grupo controle (G1). No entanto, o grupo tratado com glucana, por via vaginal,

apresentou um aumento da carga fúngica no quinto, oitavo e décimo dia, assim

como o grupo controle, porém menor do que neste grupo. Em todos os casos, os

resultados da contagem de UFC não foram estatisticamente significantes. Este fato

corrobora com os dados obtidos por Pietrellaet al. 2010, os quais mostraram que a

vacina conjugada com glucana conferiu proteção contra a infecção por C. albicans,

em modelos vaginais, porém, na primeira semana de infecção vaginal por Candida,

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os animais apresentaram alta variação na contagem das UFC. Além disso, a

morfologia do fungo pode afetar significativamente a precisão das medidas de UFC

na avaliação da carga fúngica, porque a C. albicans apresenta-se sobre varias

morfologias de leveduras, incluindo hifas e pseudohifas durante a infecção em

animais (ENJALBERT et al.,2009). Em outro estudo usando modelos de infecções

vaginais em ratos, foi encontrado que a vacina glicoconjugada de β-glucana,

adicionada ao toxóide diftérico CRM197, como uma proteína carreadora, conferiu

proteção contra a infecção vaginal por C. albicans (TOROSSANTUSSI et al., 2005),

sugerindo que a glucana administrada por via intraperitoneal possa ter um efeito

protetor contra a CVV por C. albicans.

Acredita-se que o tecido vaginal não contenha um tecido linfóide organizado,

porém a resposta parece ser altamente sensível no local ou distal a imunização

contra antígenos de Candida (DE BERNARDIS et al., 2006), sugerindo que as

células T locais desempenham um papel na proteção contra infecção, sem

apreciável mudança na composição ou percentual (SAVEEDRA et al., 1999). IFN-γ é

uma citocinas chave no controle de infecções fúngicas em humanos e

camundongos, sendo produzida pelos linfócitos e células NK (ROMANI, PUCCETTI,

BISTON, 1997; ROMANI, 2004), porém as células NK não estão presentes na

mucosa vaginal (STEELE et al., 1999).

Nossos resultados na quantificação da citocina IFN-γ, no lavado vaginal, mostraram

que essa foi detectada somente nos animais tratados com glucana, tanto por via

intraperitoneal (G3) como vaginal (G2) (Figura 5), enquanto que nos animais

controle, o IFN-γ não foi detectável. No estudo de De Bernardis et al. (2000), IFN-γ

foi também encontrado no lavado vaginal, em modelos de CVV sobre pseudoestrus

sem nenhum tratamento, mas no sexto dia após a inoculação, os camundongos

mostraram diminuição praticamente total do IFN-γ, o que foi observado nos nossos

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camundongos controles. Então, nós podemos assumir que a glucana, por via vaginal

e intraperitoneal, induziu as células T locais contra a candidíase vulvovaginal pela C.

albicans, confirmando os resultados de Saveedra et al. (1999), que afirma a

participação das células T locais na resposta CMI, no tecido vaginal, uma vez que a

resposta CMI sistêmica contra infecções vaginais é insuficiente (WOZNIAK;

WORMLEY; FIDEL, 2002). Em relação à análise histopatológica, nossos resultados

mostraram que todos os animais tratados e não-tratados apresentaram o influxo

predominante de neutrófilos. Contudo, os animais tratados com glucana mostraram

maior infiltração de neutrófilos, quando comparado com o não tratado. No estudo

realizado por Fidel et al. (2004), os neutrófilos fizeram um importante papel protetor

contra CVV por C. albicans, em mulheres, embora esse resultado não foi encontrado

em animais. Então, é possível que a glucana, por via vaginal, principalmente,

aumente a proteção contra a C. albicans, na candidíase vaginal. Em relação a carga

fúngica, na análise histopatológica, a glucana por via intraperitoneal causou uma

marcante redução na carga fúngica de C. albicans, no tecido vaginal, quando

comparado ao grupo controle e vaginal, sugerindo que a glucana pode reduzir a

carga fúngica (como foi observado na contagem de CFU). De todas as evidências

avaliadas, pode-se concluir que a glucana por via intraperitoneal reduziu de forma

marcante a carga fúngica de C. albicans, mas não foi estatisticamente significante, e

induziu a produção de IFN-γ, ajudando a resposta immune contra a CVV por C.

albicans. Enquanto que a glucana por via vaginal reduziu levemente a carga fúngica

no tecido vaginal, porém induziu a produção de IFN-γ e aumentou o influxo de

neutrófilos para o local da infecção. Então, a glucana, certamente, faz um papel na

imunomodulação da resposta immune contra a CVV por C. albicans.

Assim, com base nestes resultados, novas pesquisas serão realizadas para

ter-se uma maior compreensão do mecanismo de ação deste polissacarídeo e

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consequentemente uma padronização para o seu futuro uso na terapia desta

infeccção.

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6- CONCLUSÕES

Na avaliação da infecção vulvovaginal através da contagem UFC, os animais

tratados com glucana, por via intraperitoneal, apresentaram uma diminuição das

UFC, quando comparado com o grupo controle, sendo essa redução confirmada

pelo histopatológico. Porém, os animais tratados com glucana, por via vaginal, não

apresentaram diminuição, mas a quantidade das UFC foi menor quando comparado

ao grupo controle. Embora tenha ocorrido diferença na contagem de UFC, durante o

experimento, nenhum caso apresentou significância estatística. A infecção por C.

albicans pôde ser confirmada pela análise histopatológica, a qual apresentou todas

as morfologias desta levedura (blastoconídios, hifas verdadeiras e pseudohifas). A

presença da citocina IFN-γ, no fluido vaginal, foi observada somente nos animais

tratados com glucana tanto por via intraperitoneal como vaginal. Enquanto que o

IFN-γ não foi detectável, no fluido vaginal dos animais controles. Em relação ao

infiltrado celular inflamatório, no tecido vaginal, observou-se a predominância de

neutrófilos PMN em todos os grupos (tratados e não-tratados). No entanto, os

animais tratados com glucana, por via vaginal, mostraram maior infiltração de células

PMN, no tecido vaginal, seguidos pelos tratados com glucana intraperitoneal.

Então, a glucana, certamente, faz um papel na imunomodulação da resposta

immune contra a CVV por C. albicans

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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APÊNDICE I

Protocolo Candidíase Vulvovaginal

Dia/

Grupo G1 (Controle) G2 (Glucana

Vaginal)

G3 (Glucana

Intraperitoneal)

-5 E E E

-4 E E E

-3 E E E

-2 E E E

-1 E E E

0 E, Inoculação E,Inoculação E,Inoculação

1 E E E

2 E,

Monitoramento

E,

Monitoramento

E,

Monitoramento

3 E E E

4 E, Cloreto de

Sódio

E, Glucana

Vaginal

E, Glucana

Intraperitoneal

5 E, Contagem

de UFC

E, Contagem

de UFC

E, Contagem de

UFC

6 E, Lavado e

Eutanásia

E, Lavado e

Eutanásia

E, Lavado e

Eutanásia

7 E, Cloreto de

Sódio

E, Glucana

Vaginal

E, Glucana

Intraperitoneal

8 E, Contagem

de UFC

E, Contagem

de UFC

E, Contagem de

UFC

9 E, Lavado e

Eutanásia

E, Lavado e

Eutanásia

E, Lavado e

Eutanásia

10 E, Contagem

de UFC

E, Contagem

de UFC

E, Contagem de

UFC

11 E, Lavado e

Eutanásia

E, Lavado e

Eutanásia

E, Lavado e

Eutanásia

E: Estrôgeno

UFC: Unidades Formadoras de Colônia