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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Atividade Imunoestimulante da β- 1,3 Glucana em Candidíase Vulvovaginal Experimental
ALEIDA MARIA DA SILVA LIMA
Orientadora: Profª Drª VALÉRIA SORAYA DE FARIAS SALES Co-orientador: Profº Drº GUILHERME MARANHÃO CHAVES
Natal, RN 2012
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ALEIDA MARIA DA SILVA LIMA
Atividade Imunoestimulante da β 1-3, Glucana em Candidíase Vulvovaginal Experimental
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para a obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas (Imunologia).
Natal, RN 2012
CATALOGAÇÃO NA FONTE
L732a
Lima, Aleida Maria da Silva. Atividade imunoestimulante da β-1,3 glucana em candidíase
vulvovaginal experimental / Aleida Maria da Silva Lima. – Natal, 2012.
62f. Orientadora: Profa. Dra. Valéria Soraya de Farias Sales.
Coorientador: Prof Dr. Guilherme Maranhão Chaves
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
1. β-Glucana – Dissertação. 2. Cândida albicans – Dissertação.
3. Candidíase vulvovaginal – Dissertação. I. Sales, Valéria Soraya de Farias. II. Chaves, Guilherme Maranhão. III. Título.
2.
RN-UF/BS-CCS CDU: 57.083:616.97(043.3)
4
"Para realizar grandes conquistas, devemos
não apenas agir, mas também sonhar; não
apenas planejar, mas também acreditar"
( Anatole France )
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DEDICATÓRIA
Aos Meus Pais, Gleydson Bento e Lucinete Lima, por todo o amor e dedicação, acreditando nos meus sonhos e sempre me ensinando a ser uma pessoa melhor. Amo vocês.
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AGRADECIMENTOS
À Deus, primeiramente, que me deu sabedoria e paciência para seguir em frente e
não desistir nunca.
Aos Meus Irmãos e familiares (Larisa, Erick, Bentinho, Ritinha, Felipe, Tia Celina e
Tia Almerinda), os quais torceram por mim em todos os momentos da minha vida.
Aos Meus Amigos (Adriano, Keith, Larissa, Rominne, Eliz, Tony e Belinha), que
trouxeram alegria e paz, quando eu mais precisava. Sempre dizendo que eu era
capaz.
Às Minhas Amigas de Laboratório (Karina, Luanda, Bruna, Mariana e Sarah), que me
ajudaram todos os dias de experimentos, incluindo sábados e domingos. Fazendo
os dias mais leves, com as nossas conversas loucas e intermináveis, principalmente
nas segundas-feiras.
À Minha Orientadora (Valéria Sales), que não só me acrescentou conhecimentos
como também acreditou na minha capacidade.
Ao Meu Co-orientador (Guilherme Maranhão), que abriu as portas do seu laboratório
para mim, dando todo o apoio necessário.
À Professora Keyla Borges, que fez a análise histopatológica.
Às Professoras Iracilda e Danielle, que abriram as portas no Laboratório de
Imunologia Clínica, em Araraquara, para que eu pudesse fazer alguns experimentos.
À Professora Eveline Milan, por ter cedido a cepa mais virulenta, fazendo do
experimento um sucesso.
Aos Ausentes (Tio Francisco), que ficaria muito orgulhoso dessa conquista.
Àqueles (Mariana, Rafaela e Leo), que por ironia do destino, participaram dos meus
experimentos, dando apoio quando eu mais precisei.
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À CAPES, por ter financiado a minha bolsa durante todo o mestrado.
Ao estatístico Felipe Henrique, por toda paciência.
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RESUMO
LIMA AMS. Atividade Imunoestimulante da β 1-3, Glucana em Candidíase Vulvovaginal Experimental. Mestrado (Imunologia). Laboratório de Imunologia Clínica da Universidade Federal do Rio grande do Norte, Natal, 2012. A candisíase vulvovaginal (CVV) é uma doença inflamatória, no tecido vaginal, causada principalmente por leveduras patogênicas de Candida albicans. E atualmente CVV é um problema significativo na saúde da mulher. As β glucanas são polissacarídeos estruturais da parede celular da levedura Saccharomyces cerevisiae e existem vários relatos que demonstram o efeito imunomodulador desta estrutura em infecções bacterianas, virais, fúngicas e parasitárias. Sabendo disso, o presente estudo avaliou se a β-glucana tem atividade imunomoduladora em camundongos com candidíase vulvovaginal sob a influência do estrógeno. Os animais foram inoculados com C. albicans, por via intravaginal, e tratados com glucana, vaginal e intraperitonealmente, e os animais do grupo de controle receberam por via intraperitoneal, solução salina. Os animais tratados com glucana intraperitoneal e vaginal mostraram menor número de UFC, no fluido vaginal, em comparação com animais controles. No entanto, os resultados mais marcantes foram do intraperitoneal, confirmando com o histopatológico, porém sem diferença estatisticamente significante. Em relação ao influxo dos neutrófilos polimorfonucleares (PMNs), os grupos tratados com glucana mostraram maior infiltração desses. Além disso, observou-se que os animais tratados com glucana apresentaram uma maior quantidade de IFN-γ, no lavado vaginal, em comparação com o controle. Os dados sugerem que glucana pode ter uma atividade importante na proteção contra C. albicans. Palavras-chaves: β-Glucana, Candida albicans, Candidíase Vulvovaginal
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ABSTRACT
LIMA AMS. Immunostimulant Activity of β 1-3, Glucana in Experimental Vulvovaginal Candidiasis. MSc (Immunology). Laboratory of Clinical Immunology, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, 2012.
Vulvovaginal candidiasis (VVC) is an inflammatory disease, on vaginal tissue, caused mainly by pathogenic yeasts of Candida albicans. And actually, VVC is currently a significant problem in women's health. The β-glucans are structural polysaccharides of the cell wall of the fungi Saccharomyces cerevisiae and there are several reports that demonstrate the immunomodulatory effect this structure in infections of bacterial, viral, fungal and parasitic. Knowing this, the present study evaluated whether β-glucan has immunomodulatory activity in mice with vulvovaginal candidiasis under the influence of estrogen. The animals were inoculated with C. albicans, intravaginally, and treated with glucan, vaginally and intraperitoneally, and the control group animals received saline, intraperitoneally. The animals treated with intraperitoneal and vaginal glucan showed smaller number of the CFU, in the vaginal fluid, compared with control animals. However the results more marked was of the intraperitonel, confirmed with histopathological, but in neither case the results were statistically significant. Relative to influx of the polymorphonuclear neutrophilis (PMNs), the groups treated with glucan showed greater infiltration. Moreover, it was observed that animals treated with glucan showed a higher quantity of IFN-γ, in vaginal washed, compared with the control. The data suggest that glucan may have an important activity in protection against C. albicans.
Keywords: β-Glucan, Candida albicans and Vulvovaginal Candidiasis
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CARD: Domínio de Recrutamento e Ativação de Caspases
CR: Receptores de Complemento
CXCL: Quimiocina com duas cisteinas separadas por um aminoácido
CVV: Candidíase Vulvovaginal
CVVR: Candidíase Vulvovaginal Recorrente
CD: Grupamento de Diferenciação
C: Complemento
CE: Células Epiteliais
DCs: Células Dendríticas
ELISA: Ensaio Imunoenzimático
g: Grama
GM-CSF: Fator Estimulador de Colônias de Macrófagos e Granulócitos
IFN: Interferon
IL: Interleucina
Ig: Imunoglobulina
ITAM: Motivo Citoplasmático baseado na tirosina
LacCer: Receptor Lactosilceramida
MyD88: Gene de Resposta Primária de Diferenciação Mielóide 88
MHC: Complexo Principal de Histocompatibilidade
mg: Miligrama
mL: Mililitro
mM: Milimol
NF-κB: Fator Nuclear Kappa B
NK: CélulasNatural Killer
PRRs: Receptores de Reconhecimento Padrão
PAMPs: Padrões Moleculares Associados à Patógenos
PBS: Tampão Fosfato Salina
PAS: Ácido Periódico de Schiff
pH: Concentração hidrogeniônica
RM: Receptor de manose
reg: Regulatório
Sap: Proteinase Aspártica Secretada
TLR: Receptores semelhantes ao Toll
TNF: Fator de Necrose Tumoral
UFC: Unidades Formadoras de Colônia
YEPD: Extrato de Fungo, Peptona e Dextrose
μg: Micrograma
μL: Microlitro
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Modelo de interação do Zymosan com Dectina-1 e Toll-like ..................... 29
Figura 2: Glucana insolúvel pulverizada ................................................................... 35
Figura 3:Inoculação de Candida albicans, por via vaginal ........................................ 36
Figura 4:Placa de Elisa, na dosagem de IFN-γ ........................................................ 38
Figura 5: Células de C. albicans crescidas em Ágar Sabouraud dextrose após um
período de incubação de 48 horas, incubadas à temperatura de 37ºC. (Método Pour-
plate, contagem de UFC) .......................................................................................... 41
Figura 6:Detecção da citocina IFN-γ, no lavado vaginal de camundongos com
candidíase vulvovaginal por C. albicans, durante o experimento, nos dias 6, 9 e 10
após a inoculação. A citocina foi quantificada usando o pool do lavado vaginal dos
camundongos (três animais por pool). ...................................................................... 43
Figura 7: Análise histopatológica do tecido vaginal de camundongos controle (G1) (a
e b) e com glucana por via vaginal (G2) (c e d) infectados com C. albicans. (a) e (c):
Coloração com hematoxilina e eosina e (b) e (d): Coloração com Ácido periódico de
Schiff (PAS). (X400). Setas pretas: infiltração de células PMNs e setas brancas:
invasão de C. albicans. ............................................................................................. 46
Figura 8: Análise histopatológica do tecido vaginal de camundongos tratados com
glucana por via intraperitoneal (G3) infectado com C. albicans. (a e c): Coloração
com hematoxilina e eosina e (b e d): Coloração com Ácido periódico de Schiff (PAS).
(X400). Seta preta: infiltração de PMNs e seta branca: invasão de C. albicans. (a e
b): 8º dia e (c e d): 11º dia. ........................................................................................ 47
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Grupos de tratamento com glucana, no 4º e 7º dia após a inoculação ..... 36
Tabela 2: Comparação da média da diferença de UFC entre o 5° e o 2° dia, nos três
grupos, pelo do teste de Kruskal-Wallis: (log10 ufc, n=3).......................................... 41
Tabela 3: Comparação da média da diferença de UFC entre o 8° e o 2° dia, nos três
grupos, pelo do teste de Kruskal-Wallis: (log10 ufc, n=3).......................................... 42
Tabela 4: Comparação da média da diferença de UFC entre o 10° e o 2° dia, nos
três grupos, pelo do teste de Kruskal-Wallis: (log10, n=3) ........................................ 43
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SUMÁRIO
1- INTRODUÇÃO ............................................................................................... 14
1.1. Biologia e Fatores de Virulência da Candida albicans ............................. 14
1.2. Candidíase Vulvovaginal ......................................................................... 17
1.3. Epidemiologia da Candidíase Vulvovaginal- Mundo e Brasil ................... 18
1.4. Imunidade a C. albicans na Candidíase Vulvovaginal ............................. 19
1.5. Modelos Animais de Candidíase Vulvovaginal ........................................ 26
1.6. β-Glucana ................................................................................................ 27
2- OBJETIVOS ................................................................................................... 32
2.1. Objetivos Gerais ...................................................................................... 33
2.2. Objetivos Específicos ............................................................................... 33
3- MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 33
3.1. Animais .................................................................................................... 33
3.2. Microorganismos e Condições de crescimento ....................................... 33
3.3. Preparo do Inóculo................................................................................... 34
3.4. Extração e preparação da β, 1-3 Glucana ............................................... 34 3.5. PROTOCOLO EXPERIMENTAL (ANEXO II) .......................................... 35
3.5.1 Vulvovaginite Experimental ......................................................... 35 3.5.2. Tratamento com β,1-3 Glucana .................................................. 36 3.5.3. Monitoramento da infecção fúngica: Contagem de Unidades
Formadoras de Colônia (UFC) ........................................................................ 37
3.5.4. Lavado vaginal para dosagem de citocinas ............................... 37
3.6. Dosagem de citocina ............................................................................... 38 3.7. Estudo Histopatológico ............................................................................ 38
3.8. Estatística ............................................................................................... 39
4- RESULTADO ................................................................................................ 40
4.1. Infecção vulvovaginal por C. albicans .......................................................... 40 4.1.1. Contagem de UFC ................................................................................ 40 4.1.2. Dosagem de citocina, no lavado vaginal ............................................... 43 4.1.3. Análise histopatológica ......................................................................... 44
5- DISCUSSÃO .................................................................................................. 48
6- CONCLUSÃO ................................................................................................ 52
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA APÊNDICE I
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1. INTRODUÇÃO
1.1. Biologia e Fatores de Virulência de Candida albicans
Candida albicans é uma levedura pleomórfica que existe como comensal de
animais de sangue quente, incluindo seres humanos. Esta levedura coloniza as
superfícies das mucosas oral, da cavidade vaginal e do trato gastrointestinal
(JAYATILAKE; SAMARANAYAKE;SAMARANAYAKE,2005; MOLERO et al., 1998),
sendo ainda considerada um patógeno oportunista, agente causador da maioria dos
casos de candidíase (YANO et al., 2005). C. albicans pode existir sob três
morfologias distintas, como células de leveduras (blastoconídios), pseudohifas e
hifas verdadeiras (SU et al., 2007). Como comensal, este fungo,
assintomaticamente, coloniza a superfície epitelial, aparentemente, na forma de
blastoconídio (COSTA; FELIPE; GAZIRI,2008). Portanto, a sua patogenicidade está
relacionada em parte com a capacidade de transição de blastoconídios a hifas,
denominada de morfogênese, ocasionada em resposta a sinais ambientais, como
pH, temperatura dentre outros(SU et al., 2007).
A permanência da levedura como comensal do corpo humano deve-se a
vários fatores, tais como: a pele intacta, que é protegida por células queratinizadas;
a superfície mucosa; a presença de mucinas, de Imunoglobulina (Ig) A e de
numerosas bactérias que conferem proteção ao hospedeiro, alojando-se ao redor do
fungo, impedindo sua adesão. Modificações nestas barreiras naturais, como aquelas
causadas por antibioticoterapia, corticoterapia, quimioterapia, cirurgias,
cateterismos, sondas e cateteres, podem propiciar a invasão do fungo e o processo
infeccioso (COSTA; FELIPE; GAZIRI, 2008). Além disso, essa transição de
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colonização para infecção pode ocorrer devido a fatores que aumentam a virulência
do micro-organismo (CASSONE; DE BERNADIS; SANTONI, 2007).
Os fatores de virulência são expressos pelos fungos, na superfície da mucosa
e têm mostrado desempenhar um papel importante na infecção por estes micro-
organismos. Exemplos de fatores de virulência são as enzimas da família das
Proteinases Aspárticas Secretadas (Saps) e uma série de adesinas protéicas e
glicoprotéicas, que desempenham papel fundamental na patogenicidade de Candida
spp.. Como previamente mencionado, a expressão da virulência também é
promovida pela capacidade do fungo de formar hifas, segmentos em crescimento
que têm potencial propriedade de evasão do sistema imune (CASSONE; DE
BERNADIS; SANTONI, 2007). De acordo com Cassone et al. (1998), a presença de
tais “comensais” sobre a superfície da mucosa não passa despercebida, ou
simplesmente tolerada pelo hospedeiro, mas sim, fatores humorais e celulares tanto
da resposta imune inata como adaptativa restringem o crescimento do fungo e
neutralizam sua virulência.
Essa hipótese é sustentada por observações de Schaller et al. (2003), no
modelo de tecido epitelial vaginal reconstituído de humanos, no qual alguns
membros da família Sap (principalmente, Sap1 e Sap2) atacam e destroem a
arquitetura epitelial, eliminando as propriedades físicas e funcionais antifúngicas. Em
resposta a esse dano, os queratinócitos epiteliais produzem uma cascata de
citocinas inflamatórias (SCHALLER et al., 2005), dentre elas(fator de necrose
tumoral alfa (TNF-α), interleucina-10 (IL-10) e interferon gama (IFN-γ)), podendo
induzir uma resposta imune regulada e protetora, no hospedeiro normal(ROMANI,
2004).Um papel crítico pode ser desempenhado pelos anticorpos, que neutralizam a
virulência característica dos fungos. Como é o caso do anti-Sap2, anticorpo que
inibe a atividade e a aderência da Sap2, no tecido vaginal de ratos. Este mecanismo
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providencia forte proteção pré- e pós- desafio, em modelos de candidíase vaginal
em ratos (DE BERNARDIS et al., 2007). Todos esses achados sustentam a idéia da
importância do binômio virulência versus a imunidade do hospedeiro, na mucosa
vaginal e sugerem que o resultado do comensalismo é o equilíbrio entre as mesmas,
sendo que a doença resultaria da quebra desse equilíbrio (CASSONE; DE
BERNADIS; SANTONI, 2007).
A família Sap é constituída de 10 proteinases aspárticas cujas sequências,
propriedades bioquímicas e expressão in vitro e in vivo diferem de forma tão
marcante que constituem pelo menos três linhagens diferentes (WHEELER; FINK,
2006). As Sap1 a Sap3 têm um pH ótimo de atividade na faixa ácida (pH 3 a 5) e se
acredita serem expressas principalmente em infecções cutâneas e mucosas, tanto
experimentais como clínicas (NAGLIK et al., 2003). No entanto, as Sap4 a Sap6
requerem um pH neutro como ótimo de atividade e exibem expressão preferencial
nas infecções sistêmicas (NAGLIK; CHALLACOMBE; HUBE, 2003). Contudo, nos
modelos de infecção vaginal em camundongos BALB/c, Sap4 e Sap5 são também
expressas, fator este atribuído ao alto pH do fluído vaginal dos camundongos,
comparado ao dos ratos e mulheres (TAYLOR et al., 2005).
De fato, a candidíase vaginal em mulheres foi fortemente associada com altos
níveis da expressão de Sap in vitro por isolados vaginais de C. albicans, assim como
elevados níveis de Sap no fluído vaginal (DE BERNARDIS et al., 1990). Os estudos
mais recentes têm mostrado como é complexo o perfil de expressão das Sap in vivo
e como as diferentes Sap podem cooperar e afetar a expressão da virulência em
tempos diferentes durante a infecção por C.albicans (NAGLIK; CHALLACOMBE;
HUBE, 2003).
No entanto, baseando-se na consideração de todos os dados publicados,
Sap2 emergiu como uma proteína que desempenha um papel particularmente
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consistente na relação Candida spp e tecido vaginal, provavelmente maior que
qualquer outro atributo de virulência. A Sap2 apresenta maior especificidade ao
substrato das Sap, sendo capaz de hidrolisar proteínas estruturais do hospedeiro,
queratina da pele e do epitélio vaginal, e fatores humorais da imunidade inata e
adaptativa, incluindo proteínas do complemento e imunoglobulinas, sendo esses
altamente susceptíveis a atividade da Sap2 (HUBE., 2004). Além disso, a expressão
do gene da SAP2 (Sap2) está também relacionada com a infecção vaginal em ratos
(DE BERNARDIS et al., 1995).
As adesinas podem desempenhar tanto um papel direto na patogênese
promovendo a adesão do fungo ao tecido vaginal, como indireto exercendo uma
atividade de remodelação da parede celular necessária à transição em hifas. São
exemplos de adesinas a proteína glicosilfosfatidilinositol-ancoradas (SPELLBERG et
al., 2006) ou outras enzimas da parede celular, glucanase e/ou transglucosidase (DE
GROOT et al., 2004). Por exemplo, a manoproteína MP65 tem uma sequência típica
de uma enzima glucanase ou transglucosidase e recentemente foi mostrado estar
envolvida na adesão da C. albicans às células epiteliais vaginais e, ao mesmo
tempo, ser crítica para a formação de hifas (DE BERNARDIS et al., 2007). Não
surpreendentemente, todas as características de virulência descritas acima têm sido
associadas ao potencial de evasão do sistema imune dos fungos (WHEELER; FINK,
2006).
1.2. Candidíase Vulvovaginal
A candidíase vulvovaginal (CVV) é uma doença inflamatória causada por
leveduras patogênicas do gênero Candida, que pode apresentar diversas espécies,
porém a C. albicans é a responsável por cerca de 90% das infecções humanas.
Estima-se que três quartos de todas as mulheres adultas no mundo serão
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acometidas por candidíase vulvovaginal, em alguma época de sua vida, sendo
muitas vezes recorrente. A candidíase vulvovaginal recorrente (CVVR), caracterizada
por 3 ou 4 episódios de CVV por ano, ocorre em cerca de 25% das mulheres. Isto
provavelmente se deve à permanência de fatores predisponentes, à contaminação a
partir do sistema gastrintestinal, a partir do parceiro sexual não-tratado, ao
tratamento insuficiente ou inadequado, ao diagnóstico incorreto e a resistência de
algumas espécies de Candida aos antifúngicos disponíveis no mercado para
tratamento (BASTOS et al., 2003; CHEN et al., 2007). Por isso a CVV é atualmente
um relevante problema na saúde da mulher (ÁLVARES et al., 2007).
A CVV se caracteriza clinicamente pela ocorrência de prurido vulvar intenso,
leucorréia, dispareunia, disúria, edema e eritema vulvovaginal, sendo o prurido o
sintoma mais importante quando a CVV é comparada a vulvovaginites de outra
etiologia. Em alguns casos, é possível observar a presença de lesões satélites
vulvares, como escoriações (HOLANDA et al., 2007).
1.3. Epidemiologia da Candidíase Vulvovaginal
A CVV é um dos diagnósticos mais frequentes na prática diária em
ginecologia e sua incidência tem aumentado drasticamente, tornando-a a segunda
infecção genital mais freqüente nos Estados Unidos e no Brasil. A CVV representa
20% a 25% das leucorréias vaginais de natureza infecciosa, precedida apenas pela
vaginose bacteriana (CORSELO et al., 2003). Na Europa, é a primeira causa de
vulvovaginite (ZIARRUSTA, 2002). Cavalcante, Miranda e Portugal (2005) reforçam
em seu estudo a necessidade de valorizar a doença como importante causa de
comprometimento da saúde da mulher. Estima-se que aproximadamente 75% das
mulheres adultas apresentem pelo menos um episódio em sua vida, sendo que
19
destas, 40% a 50% vivenciarão novos surtos e 5% atingirão o caráter recorrente
(CVVR) (MARDH et al., 2002).
1.4. Imunidade a C. albicans na Candidíase Vulvovaginal
A defesa do hospedeiro contra a infecção por Candida spp depende
daresposta imune inata e adaptativa. Embora cada uma possa contribuir de maneira
diversa nos diferentes sítios de infecção, a imunidade inata, por meio de macrófagos
e neutrófilos, domina a proteção contra a candidemia, enquanto que a imunidade
celular, predominantemente mediada por citocinas das células TCD4+, protege as
mucosas da infecção. Em relação à imunidade humoral, existem controvérsias entre
estudos clínicos e modelos de animais, havendo dados discordantes acerca do
papel efetivo dos anticorpos contra infecção por C. albicans (COSTA; FELIPE;
GAZIRI, 2008).
Até recentemente, pouco se sabia sobre as maneiras pelas quais os
neutrófilos e macrófagos, os principais intervenientes da imunidade inata,
reconheciam a C. albicans como micro-organismo patogênico, ou como se dava a
interação fungo-leucócito desencadeando a resposta inflamatória (MITCHISON,
1993). Somente nas últimas décadas, tornou-se claro que imunidade inata não
somente reconhece várias classes de micro-organismos, mas também inicia e
modula a subseqüente resposta adaptativa que é realizada pelas células B e T
através da interação com as células apresentadoras de antígenos (especialmente
células dendríticas (DC)) (HOEBE; JANSSEN; BEUTLER, 2004). A tarefa de
reconhecer o patógeno invasor e ativar a resposta do hospedeiro são realizadas
pelos receptores de reconhecimento padrão (PRRs), que são expressos
principalmente em células do sistema imune inato incluindo neutrófilos, monócitos,
20
macrófagos e células dendríticas, reconhecendo os padrões moleculares associados
à patógenos (PAMPs), presentes na parede celular dos fungos (GOW et al., 2007;
COSTA;FELIPE; GAZIRI, 2008).
Os principais PAMPs da parede celular deC. albicans são β-glucanas, quitinas
e mananas. O receptor Dectina-1,Toll-likereceptor (TLR- receptores semelhantes ao
Toll) e o receptor de manoses (RM) são os principais PRRs responsáveis pelo
reconhecimento de componentes polissacarídeos da parede celular de C.
albicans(LI et al., 2009).
O Dectina-1 é o principal receptor para a β-glucana, induzindo a sinalização
intracelular via motivo citoplasmático baseado na tirosina (ITAM) através da via
envolvendo a quinase Syk, PLCγ2 e Card9 e através da via quinase Raf-1 (REID;
GOW; BROWN,2009; XU et al.,2009). A sinalização do dectina-1 é também
conhecida por mediar a ativação de calcineurina, uma proteína fosfatase, que
quando ativada é importante para o controle de infecções fúngicas em camundongos
e humanos (GREENBLATT et al., 2010). A indução dessas vias resulta na produção
de numerosas citocinas, incluindo Fator estimulador de colônias de macrófagos e
granulócitos (GM-CSF), TNF, da quimiocina CXCL2, IL-2, IL-10, IL-6, IL-23 e IL-1β,
bem como da liberação de ácido araquidônico e produção de prostaglandinas
(GOODRIDGE et al., 2009;ROSAS et al., 2008).O Dectina-2 não é muito conhecido,
mas esse receptor faz a ligação, preferencialmente, com hifas deC. albicans e induz
a produção de TNF-α e do antagonista do receptor de IL-1 (SATO et al., 2006).
Enquanto a produção de IL-10, IL-6 e IL-2 pode ser mediada diretamente pelo
dectina-1, a indução de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas requerem a
colaboração com o TLR2. (GANTNER et al., 2003)
Os principais TLRs envolvidos no reconhecimento deC. albicans são o TLR2,
TLR4, TLR6 e TLR9, que após a interação com o fungo, induzem a produção de
21
citocinas pró-inflamatórias (AKIRA; HEMMI, 2003). O balanço entre os sinais
produzidos pelo TLR2 e TLR4 são cruciais para a regulação da resposta imune.
TLR4 pode estimular fortemente a produção de citocinas pró-inflamatórias através
de dois caminhos: um envolvendo o gene de resposta primária de diferenciação
mielóide 88 (MyD-88), que depende do Fator Nuclear Kappa B (NF-κB), liberando
citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas; e o outro envolvendo o Fator de
Regulação de Interferon 3 (IRF 3), liberando interferon tipo I, que induz a produção
secundária de citocinas do perfil Th-1 como o IFN-γ (NETEA et al., 2002). Em
contraste, muitos estudos têm demonstrado que embora a ligação do TLR2 possa
induzir a produção de citocinas pró-inflamatórias, este efeito é menor que o mediado
pela ligação do TLR4. Além disso, o TLR2 falha na indução da liberação de IL-12 e
IFN-γ, promovendo condições que são favoráveis a resposta do perfil Th-2 e T-
regulatória (T-reg) (RE; STROMINGER, 2001).A C. albicans induz a
imunossupressão através do TLR2, liberando IL-10 e isso leva a geração de células
T reg CD4+CD25+, com potencial supressor (BLANCO; GARCIA, 2008).
As superfícies endoteliais e epiteliais também têm PRRs, que reconhecem os
PAMPs de superfície de micro-organismos invasores e colonizadores como a
C.albicans. Em estudos ex vivo com cultura de tecido epitelial humano reconstituído
inoculado com células fúngicas, a expressão dos TLRs é semelhante em
experimentos in vivo (WEINDI et al., 2007). Usando esse modelo,foi visto que os
leucócitos polimorfonucleares (PMNs) ativam a resposta imune, mostrando diferença
na imunidade da mucosa oral e vaginal (SCHALLER et al., 2004; FIDEL, 2007).As
células epiteliais vaginais expressam TLR2 e TLR4 in vivo, e a presença de células
de C.albicans inativadas e zymosan (partícula da parede da levedura, contendo,
principalmente, polissacarídeos, sendo a β-glucana e mananas os principais
constituintes) induz a produção de citocinas pró-inflamtórias, quimiocinas e de β-
22
defensinas 2, um componente antimicrobiano que também ocasiona a quimiotaxia
de células PMNs (PIVARCSI et al., 2005).
Os receptores de manoses presentes na superfície de macrófagos
reconhecem a superfície rica em manoses, sendo especialmente importantes na
fagocitose de C. albicans. A fagocitose da levedura, por meio do receptor de
manoses, resulta na produção de citocinas pró-inflamatórias, degradação do fungo,
estímulo de moléculas co-estimulatórias, expressão das moléculas do complexo
principal de histocompatibilidade (MHC) classe II e na estimulação da resposta
celular protetora T helper 1(Th1) (LI et al., 2009).
Após a fagocitose, os fagócitos usam muitos mecanismos oxidativos e não-
oxidativos que trabalham sinergicamente para destruir o fungo intra e
extracelularmente. Essas atividades são bastante influenciadas pelo estado de
ativação celular, que é controlado amplamente através da ativação por citocinas e
outros mediadores solúveis que podem aumentar (como o IFN-γ) ou suprimir (como
a IL-10) o mecanismo efetor antifúngico. Diferentes fagócitos variam na habilidade
para destruir o fungo ou restringir o seu crescimento, e essa atividade depende da
espécie do fungo envolvida. No tocante aC. albicans, por exemplo, neutrófilos são os
mais potentes efetores, seguidos pelos monócitos, macrófagos e as células
dendríticas (VONK et al., 2006).
A imunidade inata é o principal mecanismo de proteção contra candidíase
disseminada. Anormalidades quantitativas e qualitativas dos neutrófilos e monócitos
são associadas com candidíase sistêmica. Os doentes com linfoma, leucemia,
doença granulomatosa crônica, que resultam em neutropenia, aumentam o risco de
infecções disseminadas (BLANCO; GARCIA, 2008). De modo semelhante, os
neutrófilos PMN, também desempenham um papel importante na defesa contra a
candidíase vaginal, pois em um estudo realizado por Fidel et al. (2004), em mulheres
23
com infecção vaginal experimental, foi observado considerável função efetora contra
C. albicans, mas não existem evidências em animais, que na ausência dessas
células aumente a susceptibilidade a candidíase vaginal.
As células dendríticas capturam antígenos nos tecidos periféricos e, quando
maduras, migram para as áreas de linfócitos T nos órgãos linfóides, providenciando
células T com sinalização adequada e específica. As DCs expressam vários TLRs, e
são principal conector dos sistemas imune inato e adaptativo. Estas células são
excepcionalmente hábeis em decodificar informações associadas a fungos e traduzi-
las em diferentes respostas imune dependente de células T (ROMANI; BISTONI;
PUCCETTI, 2002).
Na imunidade adaptativa, as células dendríticas que fagocitaram os
patógenos, podem ativar linfócitos antígenos específicos, que podem diferenciar-se
tanto em células T efetoras, como também em células T de memória,
proporcionando proteção imediata contra patógenos nos tecidos periféricos. O
tecido vaginal não contém um tecido linfóide organizado, mas parece ser altamente
sensível no local ou distal a imunização com antígenos de Candida nas mucosas, de
modo que uma resposta protetora antimicrobiana na região vaginal pode ser
facilmente alcançada (DE BERNARDIS et al., 2006). Os linfócitos estão
frequentemente presentes em fluidos de lavado vaginal de ratos, mas a sua
presença não tem correlação com a redução da carga fúngica vaginal, na
candidíase, corroborando com as diversas controvérsias em relação à atividade da
imunidade mediada por células (CMI) (WOZNIAK; WORMLEY; FIDEL, 2002).
Praticamente todos os fungos que infectam os homens induzem a liberação
de IL-12 pelos fagócitos e células dendríticas. A IL-12 é produzida de modo
morfotipo-dependente, através do uso de diferentes receptores de reconhecimento e
TLRs. A IL-12 juntamente com a IL-18, induzem IFN-γ, citocina chave no controle da
24
infecção fúngica em camundongos e humanos (ROMANI; PUCCETTI; BISTONI,
1997). IFN-γ produzido pelas células T e células natural killer (NK), estimulam a
migração, aderência, fagocitose e morte oxidativa pelos neutrófilos e macrófagos, e
sustenta a reatividade das células Th1 pela sua capacidade de manter as células
TCD4+ responsivas a IL-12 (ROMANI, 2004).
Mais recentemente, investigadores relataram a participação da imunidade
adaptativa tipo Th17 no controle de infecções fúngicas, particularmente na
mucosa.Contudo,essa resposta parece ser relevante somente em lugares
específicos da mucosa e para patógenos específico. Deficiência na resposta Th17 é
relacionada a susceptibilidade a fungos,como é o caso da Síndrome de
Hiperimunoglobulina E (CONTI; GAFFEN, 2010). E também, a interação deC.
albicans com Dectina-1 e 2 e o RM induz a resposta Th17 (ROBINSON et al.,
2009;VON VEERDONK et al., 2009; LEIBUNDGUT- LANDMANN et al., 2007).
O mecanismo imune humoral por proteínas do complemento participa da
resposta a C. albicans, a qual ativa a cascata do complemento (C) pelas vias
clássicas e alternativas, com deposição de C3 na superfície nas células fúngicas. A
ativação do complemento facilita o recrutamento de fagócitos para tecidos infectados
e melhora sua atividade anticandida. Ratos de indução deficiente de C5 têm uma
propensão maior de desenvolver infecção disseminada (BLANCO; GARCIA, 2008).
O papel da imunidade humoral dependente de anticorpos contra a vaginite é incerto.
Em pacientes com CVVR, a presença de níveis normais ou até mesmo níveis
elevados de anticorpos da classe IgA e IgG candida-específicos, no soro ou nas
secreções vaginais sugere pouco ou nenhum papel protetor de anticorpos contra a
vaginite (FIDEL et al., 1997). Em camundongos, no entanto, anticorpos IgM e IgG3
contra manana de Candida foram mostrados por ter a proteção contra candidíase
sistêmica e infecções vaginais experimentais. Além disso, em um modelo de rato
25
com candidíase vaginal, a infecção vaginal induziu a produção de anticorpos IgA
anti-Sap,os quais contribuíram para a proteção contra a infecção (WOZNIAK;
WORMLEY; FIDEL, 2002).
As células T vaginais foram recentemente caracterizadas e quantificadas na
lâmina própria no epitélio vaginal e no colo do útero em seres humanos. Há cerca de
240 linfócitos T por mm² no tecido epitelial vaginal (ILDGRUBEN; SJOBERG;
HAMMARSTROM, 2003). Em todos os casos as células T CD8 + parecem ser mais
numerosas do que as células TCD4+, onde a razão é aproximadamente 1,25,
diferentemente dos demais tecidos. A maioria das células T vaginais migram para o
epitélio vaginal, em resposta a um estímulo antigênico local e/ou quimiocinas
inflamatórias. A mesma tendência parece ser observada para as células B e células
plasmáticas secretoras de imunoglobulinas, que normalmente estão ausentes na
vagina saudável, mas são recrutadas para o tecido vaginal após a imunização
adequada (PUDNEY; QUAYLE; ANDERSON, 2005). Notavelmente, a relação de
células T CD4 e CD8 vaginais em mulheres saudáveis é mais semelhante a da
vagina do rato (DE BERNARDIS et al., 2000), do que a de camundongo (FIDEL et
al., 1999).
Uma função antimicrobiana crítica defensiva é desempenhada pelas células
epiteliais (CE), que envolve todo o trato reprodutivo. Estas células não só constituem
uma barreira mecânica, mas também funcionam como sentinelas que reconhecem e
processam antígenos, além de secretarem uma grande quantidade de mediadores
imunológicos (quimiocinas, citocinas, peptídeos de defesa), que orquestram a
imunidade inata e regulam a imunidade adaptativa (WIRA et al., 2005). Elas estão
sob a influência dos hormônios sexuais em um delicado equilíbrio, que permite a
manutenção da vigilância imunológica contra patógenos, fornecendo o grau de
tolerância imunológica necessária para aceitar sêmen e feto (WASSEN L;
26
JERTBORN M, 2006).
Em particular, CE vaginais humanas têm demonstrado possuir atividade
intrínseca anti-Candida, sendo esta atividade menor nos pacientes com CVVR
comparado aos indivíduos saudáveis.Esta atividade tem se mostrado dependente de
estrógeno, sugerindo que o estrógeno permite a infecção vaginal, não só por
modificações histológicas conhecidas no tecido vaginal, mas também pela
diminuição do potencial inibitório das CE (FIDEL, 2005).
1.5. Modelos Animais de Candidíase Vulvovaginal
Modelos animais são úteis para o estudo de vários aspectos de
patogenicidade da Candida spp. e resposta imune anti-Candida, sob condições
possivelmente mimetizando a infecção humana. A Candidíase vulvovaginal
experimental é reproduzida especialmente em camundongos e ratos em condições
pseudoestrus (estrogeno-dependente), mas um modelo de primatas também está
sendo explorado (STEELE et al., 1999). Com a administração de estrógeno, o
epitélio vaginal fica mais espesso e totalmente queratinizado (KINSMAN; COLLARD,
1986), oferecendo subsequentemente um substrato para adesão da levedura,
crescimento e formação de biofilme (CHANDRA et al., 2001). Formação de
hifas, aderência e produção de Sap também são reforçadas pela produção da
camada de queratina. Além disso, o estrogéno diminui a imunidade mediada por
células (CMI) e reduz a infiltração de leucócitos (KINSMAN; COLLARD, 1986), o que
ajuda o crescimento de fungos e estabelecimento da infecção (TARRY et al., 2005).
Na verdade, infecções vaginais humanas ocorrem quase exclusivamente
durante os anos férteis e são extremamente raras no período pré-menarca e em
mulheres na pós-menopausa, e a prevalência e gravidade aumentam na semana
pré-menstrual (ECKERT, 2006), condições estas que são claramente influenciadas
27
pelo estrógeno. Há portanto, um consenso que os modelos descritos anteriormente
são pouco representativos da doença humana e que o conhecimento da expressão
da virulência do fungo e a relação da resposta imune no modelo animal podem
ajudar apenas a entender o mecanismo da infecção por Candida e a imunidade em
mulheres. Duas advertências principais devem ser consideradas quando se faz
paralelo entre seres humanos e animais. Primeiro, C. albicans é um comensal na
vagina da maioria das mulheres, o que não acontece nos modelos animais com
camundongos e ratos. Assim, as mulheres são imunologicamente “marcadas” contra
os fungos, enquanto os animais não são. Em segundo lugar, a infecção vaginal
experimental em roedores é alcançada pela inoculação intravaginal direta de grande
quantidade de inóculo de fungos (geralmente 106 e 107 células), o que é improvável
ser o mecanismo típico de infecção humana, que provavelmente ocorre pelo influxo
de células fúngicas do reservatório intestinal (BLACK et al., 1998).
1.6. β-Glucana
As β-glucanas são polissacarídeos de peso molecular de aproximadamente
6.500 daltons (HASSID; JOSLYN; MC CREADY, 1941)e constituintes estruturais da
parede celular de leveduras, fungos filamentosos, alguns cereais, plantas e algas,
que se diferenciam pelo tipo de ligação entre as unidades de glicose da cadeia
principal e pelas ramificações que se conectam a essa cadeia (BROWN; GORDON,
2001). Na levedura Saccharomyces cerevisiae, a β-glucana é constituída por um
esqueleto linear central de unidades de glicose ligadas na posição β (1-3), com
cadeias laterais unidas em β(1-6), que ocorrem em diferentes intervalos e têm
tamanhos variados, sendo essa estrutura um potente imunoestimulante, pois ao ser
reconhecido pelo organismo desencadeia uma série de eventos na resposta imune
28
(MAGNANI; CATRO-GÓMEZ, 2008).
A estrutura da β-1,3 glucana tem tamanho estimado de 1500 resíduos de
glicose e a β-1,6 glucana apresenta 150 a 200 resíduos. Na parede do S. cerevisiae,
são rearranjadas por ramificações introduzidas por glisosiltransferases (STRAFORD,
1994). Segundo Lee et al. (2002), a solubilidade em água depende do número de
resíduos de glicose unidos em β-1,6 das cadeias laterais e do grau de
polimerização. De acordo com Klis et al. (2002) o grau de polimerização de β-
1,3glucana pode variar com as condições em que a levedura se encontra.
Quanto à solubilidade em alcoóis, são encontradas duas frações de β-1,3,
sendo uma solúvel e outra insolúvel. A porção insolúvel contém 3 a 6% de
ramificações unidas em β-1,6 e representa o maior componente da parede, A porção
solúvel representa 15 a 20% e apresenta uma estrutura semelhante à insolúvel,
entretanto com maior número de ramificações β-1,6 (SHAHINIAN; BUSSEY, 2000).
As β-glucanas são reconhecidas pelo sistema imune inato dos vertebrados
através de receptores na superfície celular, principalmente de leucócitos, incluindo
macrófagos, neutrófilos e células natural killer (NK), como também receptores em
células não-imunes como as endoteliais e os fibroblastos (BROWN; GORDON,
2003).
As β-glucanas fúngica atuam como PAMPs, iniciando a resposta imune
quando em contato com os PRRS. Nos seres humanos, vários desses receptores
para a glucana foram identificados, tais como Dectina-1, receptores de complemento
3 (CR3), o receptor scavenger, lactosilceramida (LacCer) e o receptor Toll-like
(BROWN; GORDON, 2005).
O Dectina-1 é um dos principais receptores para zymosan nos macrófagos
(BROWN et al., 2002; GOW et al., 2007) e, de acordo com Gantner et al. (2003) é
necessária a interação das estruturas da parede da levedura com ambos os
29
receptores Dectina-1 e TLR-2 para que exista a produção de citocinas pró-
inflamatórias. Dessa forma, o dectina-1 se ligaria a β-glucana e os outros
componentes da parede celular da levedura interagiriam com o receptor TLR-2. Ou
seja, existe um efeito de colaboração entre os receptores, pois através de TLR-2
ocorreria o estímulo do adaptador MyD88 para a ativação do fator NFκB, induzindo a
fagocitose e produção de TNF-α e IL-12.
Figura 1: Modelo de interação do Zymosan com Dectina-1 e Toll-like
FONTE: GANTNER et al.,2003
A glucana é capaz de induzir a hiperfuncionabilidade do sistema fagocitário
mononuclear pelo aumento da função fagocítica, da imunidade celular e humoral, da
produção de citocinas e dos fatores citotóxicos do macrófago. A glucana tem a
capacidade de influenciar o sistema imunológico do hospedeiro, regulando a
atividade celular por meio de interações entre macrófagos, células T e B, células NK,
granulócitos e fatores humorais. Esse polissacarídeo é capaz de modificar a
resposta a infecções em animais normais e imunossuprimidos bem como controlar o
crescimento de tumores (RIBEIRO; PASSETI; OGATA, 2005).
Existem diversos relatos que comprovam o efeito imunomodulatório da
glucana em infecções de origem bacteriana, viral, fúngica e parasitária (MAGNANI;
30
CATRO-GÓMEZ, 2008). Esse fato pôde ser confirmado por Browder et al. (1984),
que avaliou a habilidade da glucana em aumentar a resistência à septicemia por C.
albicans, induzida experimentalmente no pós-operatório. Camundongos receberam
injeções endovenosas de glucana dias antes de serem submetidos à laparotomia em
branco e serem inoculados com organismos viáveis da levedura, enquanto que o
outro grupo só foi infectado, não tendo sido submetido à cirurgia. A glucana conferiu
proteção à infecção por C.albicans tanto nos animais operados (73% de sobrevida)
quanto nos não-operados (100% de sobrevida)
Em outro estudo, a associação de itraconazol e glucana, demonstrou uma
melhor eficácia no tratamento de cromoblastomicose refratária ao antifúngico, tendo
contribuído para a regressão das lesões dessa micose (AZEVEDO et al., 2006). De
acordo com Martins et al. (2007), ratos com esporotricose experimental tratados com
itraconazole glucana, por via oral e subcutânea, respectivamente, e outros tratados
somente com glucana, quando comparados com animais sem tratamento (controle),
apresentaram uma menor quantidade de unidades formadoras de colônia, nos
órgãos internos.
Para avaliar a capacidade protetora da vacina β-glucana-conjugada,
formulada com o adjuvante MF59, PIETRELLA et al. administrou a mesma por via
parenteral em camundongos com CVV por C.albicans. Pode se verificar que a
vacina conferiu significativa proteção, e esta foi associada com a produção de
anticorpos IgG anti-glucana no soro e no lavado vaginal dos animais (PIETRELLA et
al., 2010).
Sabendo-se que a glucana desempenha uma atividade imunomodulatória nas
infecções fúngicas, bacterianas e virais, evitando a progressão e melhorando o
prognóstico das mesmas, acredita-se que este polissacarídeo possa desempenhar
um papel importante na candidíase vulvovaginal, podendo levar a uma melhora na
31
progressão da infecção. Esse fator torna-se de grande relevância, uma vez que a
incidência dessa infecção tem aumentado nos últimos tempos, as recidivas
constantes têm comprometido a qualidade de vida das mulheres e o tratamento é
dificultado pela resistência de algumas espécies de Candida aos antifúngicos
disponíveis no mercado para o seu tratamento.
Baseado nessas afirmações, esse trabalho tem como finalidade pesquisar um
novo imunomodulador para o tratamento da candidíase vulvovaginal.
32
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral: Avaliar a atividade imunoestimulante da β -1,3 glucana, na
candidíase vulvovaginal experimental.
2.2. Objetivos Específicos:
Avaliar a infecção vulvovaginal através da contagem de
unidades formadoras de colônias e análise histopatológica;
Avaliar a concentração da citocina IFN-γ no fluido vaginal dos
animais;
Averiguar o infiltrado celular inflamatório no tecido vaginal dos
animais.
33
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
Foram utilizados camundongos fêmeas BALB/c (n= 54) com peso corporal de
21 a 35g e com 7 a 10 semanas de idade, os quais foram divididos em 3 grupos com
9 animais cada, sendo os experimentos feitos em triplicata. Os animais foram
alojados, no Biotério do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, mantidos com controle de umidade, temperatura e com
alimentos e água ad libitum.
A eutanásia foi realizada com a administração de tiopental sódico 100mg/Kg,
por via intraperitoneal. As carcaças dos animais utilizados foram congeladas em
“freezer” e posteriormente recolhidas na coleta seletiva do Hospital Universitário
Onofre Lopes (HUOL).
Esse trabalho foi aprovado pela comissão de ética no uso de animais
(CEUA), com número do protocolo 029/2010 (Anexo I).
3.2. Micro-organismos e condições de crescimento
A levedura utilizada foi a cepa deC. albicans 351cv originalmente isolada da
secreção vaginal de pacientes apresentando sinais e sintomas de CVV, pertencente
ao banco de micro-organismos do Hospital Giselda Trigueiro e gentilmente cedida
pela Profª Eveline Milan. Previamente aos experimentos, células de C. albicans
foram reativadas em placas de Petri contendo Ágar-Sabouraud Dextrose (ASD)
(HIMEDIA®) adicionado de 50µg/mL de cloranfenicol, incubadas a 37ºC por 48
34
horas, com pelo menos dois repiques sucessivos
3.3. Preparo do Inóculo
Previamente à inoculação nos animais, as células foram crescidas em YEPD
caldo (2% de glicose, 2% de peptona e 1% de extrato de levedura) por 18 horas a
37ºC, 200 rpm (Tecnal® TE-420, Brasil).As leveduras foram lavadas com salina-
tween (salina a 150 mM e tween 80 a 0,05%) e centrifugadas a 4ºC, numa rotação
de 3.000 rpm (High Speed Refrigrated Centrifuge, Supra 21K) por 5 minutos. Por
último, foram suspensas em salina-tween e quantificadas em hemocitômetro na
concentração de 5x 104 de células de C. albicans para uso posterior.
3.4. Extração e preparação da β- 1,3 glucana insolúvel
A β-1,3 glucana foi extraída a partir do fermento Fleischmann®
(Saccharomyces cerevisiae) pelo método de HASSID et al. (1941) com algumas
modificações, no Laboratório de Imunologia Clínica da Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Análises químicas e de ressonância
magnética nuclear (RMN 1D e 2D) confirmaram que a linear β-1,3 glucana foi
purificada e não estava contaminada com outros carboidratos, proteínas e
componentes fenólicos. Após extração e pulverização, a glucana foi suspensa em
soro fisiológico a 0,9%, nas concentrações de 1mg/mL e 5mg/mL, sendo, em
seguida, sonicada numa rotação de 45 rpm por 40 segundos + 10 segundos em
gelo, seis vezes. Por último, as suspensões foram autoclavadas.
35
Figura 2: Glucana insolúvel pulverizada
3.5. PROTOCOLO EXPERIMENTAL (Apêndice I)
3.5.1. Vulvovaginite experimental em camundongos
Os animais foram tratados com 0,1mg de Benzoato de Estradiol (Sigma®,
Brasil) em 0,1mL de Óleo Sésamo (Sigma®, Brasil), por via subcutânea. A
administração começou cinco dias previamente à inoculação com C. albicans, sendo
mantida durante 17 dias, mantendo o pseudoestrus, nos camundongos. Os animais
foram inoculados, no sexto dia de experimento, com 5x104blastoconídios de C.
albican sem 10 µL de salina-tween, por via vaginal. Após a inoculação, cada animal
foi colocado de cabeça para baixo durante um minuto para melhor penetração do
inoculo (Vulvovaginite adaptada de CHEN et al., 2007).
36
Figura 3: Inoculação de Candida albicans, por via vaginal
3.5.2. Tratamento com β-1,3 glucana
Para o ensaio in vivo, os animais foram divididos em três grupos G1 (Controle), G2
(Glucana Vaginal) e G3 (Glucana Intraperitoneal). No 4º e 7º dia após a inoculação
com Candida, o grupo G1 recebeu 1 ml de Cloreto de sódio estéril a 0,9% e o grupo
G3 recebeu 1mg/mL de glucana em 1mL de cloreto de sódio estéril a 0,9%, ambos
por via intraperitoneal. Enquanto que o grupo G2 recebeu 5mg/mL de glucana em
40µL de cloreto de sódio estéril a 0,9%, por via vaginal.
Tabela 1: Grupos de tratamento com glucana, no 4º e 7º dia após a inoculação
TRATAMENTO COM GLUCANA
G1 (Controle) G2 (Vaginal) G3 (Intraperitoneal)
1mL de Cloreto de sódio a
0,9%, via intraperitoneal
5mg/mL de Glucana em
40µL de Cloreto de sódio a
0,9%, via vaginal
1mg/ml de Glucana em
1mL de Cloreto de sódio a
0,9%, via intraperitoneal
37
3.5.3. Monitoramento da infecção fúngica: Contagem de Unidades Formadoras
de Colônias (UFC)
O monitoramento da infecção vulvovaginal foi realizado nos animais através
da coleta de fluido vaginal, no 2º dia após a inoculação (em todos os animais), no 5º,
8º e 10ºdia (em 3 animais de cada grupo).As cavidades vaginais dos camundongos
foram lavadas com 100μL de salina estéril, a qual foi aspirada e expirada por 20
segundos. Esse lavado vaginal foi diluído na concentração de 1:100 em 1mL de
salina, o qual foi transferido e homogeneizado em Ágar-Sabouraud Dextrose
adicionado de 50μg/mL de cloranfenicol, fundido à 50ºC. As placas de Petri foram
incubadas sob a temperatura de 37ºC por 48 horas, para posterior observação e
determinação das UFC.
Os camundongos foram considerados infectados, quando pelo menos uma
UFC estivesse presente na amostra vaginal, ou seja, uma contagem de >10³ UFC/
mL.
3.5.4. Lavado vaginal para dosagem de citocina
A lavagem da cavidade vaginal dos camundongos foi realizada no 6º, 9º e 11º
dia após a inoculação, nos três animais que passaram pela contagem de UFC no 5º,
8º e 10º, respectivamente. Em cada dia de lavagem os três animais de cada grupo
foram sacrificados e a lavagem vaginal foi conduzida imediatamente após a
eutanásia, usando 100μL de PBS estéril, pela injeção e aspiração por 30 a 40
segundos. Os fluidos coletados foram agrupados para cada grupo experimental e
centrifugados por 10 minutos em 14.000 rpm (High Speed Refrigrated Centrifuge,
Supra 21K) à 4ºC, sendo o sobrenadante estocado em -80ºC para posterior
38
dosagem de citocina.
3.6. Dosagem da Citocina IFN-γ
Foi feito um “pool” do fluido vaginal coletado dos camundongos em diferentes
períodos durante a infecção, sendo centrifugado como descrito acima. A citocina
dosada foi o IFN-γ pelo método de ELISA (Ensaio Imunoenzimático), utilizando um
kit comercial (IFN- γ de camundongo, BD Biosciences. San Diego, USA), seguindo
todas as orientações do fabricante.
As ODs foram lidas no comprimento de 450 nm com uma leitora de
microplacas (Multiskan ascent, Labsystems), e os resultados, expressos em
picogramas por mililitros, foram comparados com os valores da curva padrão
específica para a citocina IFN-γ, indicado pelo fabricante. A sensibilidade desse teste
era de 0,762 pg/ml.
Figura 4: Placa de Elisa, na dosagem de IFN-γ
3.7. Estudo histopatológico
Após a coleta do lavado vaginal para a dosagem de citocinas, os animais
sacrificados passaram pela remoção do tecido vaginal, o qual foi imediatamente
39
fixado em 10% (v / v) de formaldeído.
Em seguida, os tecidos vaginais passaram pela desidratação em etanol
graduado e diafanização com xileno. Essas peças foram incluídas em parafina e
microtomizadas em oito mm de espessura, para a confecção das lâminas. Por
último, algumas lâminas foram coradas com hematoxilina-eosina para avaliar o
infiltrado celular e outras com PAS (Ácido Periódico de Schiff) para avaliar a carga
fúngica, em microscópio de luz (OLIMPUS).
3.8. Análise Estatística
Foram utilizados os testes não-paramétricos, pois os dados não atenderam
as condições exigidas pelos testes paramétricos. O teste não-paramétrico usado foi
o Kruskal-Wallis, o qual testa a hipótese se há diferença significativa entre os
grupos, com a atribuição do valor-p de 5%. Os softwares utilizados foram o Excel
2007 para organização dos dados e o SPSS versão 17.0 para execução dos testes
estatísticos.
40
4. RESULTADOS
4.1. Infecção Vulvovaginal por C. albicans
4.1.1.Contagem de UFC
Dois dias após a inoculação, realizou-se um lavado da cavidade vaginal de
todos os animais, o qual foi adicionado em ASD para a realização do método Pour-
plate, contagem das UFC (Figura 5). O lavado vaginal para o isolamento de C.
albicans além de assegurar que todos os animais estavam infectados com C.
albicans, confirmando o sucesso da infecção no modelo experimental, também foi
utilizado para avaliar a carga fúngica antes do tratamento com glucana. Para a
obtenção dos dados da contagem de UFC, nesse dia, foram feitas médias de três
animais por grupo, as quais foram utilizadas na comparação das médias dos
mesmos animais em dias seguintes, obtendo a diferença das médias nos grupos. Ou
seja, comparou-se o resultado das médias da contagem de UFC do segundo dia
após a inoculação com o do quinto dia (Tabela 2), com do oitavo (Tabela 3) e com do
décimo dia após a inoculação (Tabela 4), avaliando, assim, a evolução da infecção.
41
Figura 5: Células de C. albicans crescidas em Ágar Sabouraud dextrose após um período
de incubação de 48 horas, incubadas à temperatura de 37ºC. (Método Pour-plate,
contagem de UFC)
De acordo com as Tabelas 2, 3 e 4, observou-se que todos os animais se
apresentaram infectados e mantiveram a infecção durante todo o período do
experimento. Observando a tabela 2, pode-se afirmar que, no quinto dia após a
inoculação, os animais tratados com glucana (G2 e G3) apresentaram uma menor
quantidade das UFC quando comparado com o controle (G1). No entanto, essa
diferença não foi considerada estatisticamente significante, apresentando um p> α
(0,05).
Tabela 2: Comparação da média da diferença de UFC entre o 5° e o 2° dia, nos três
grupos, através do teste de Kruskal-Wallis: (log10 ufc, n=3)
Grupo 2º 5º Diferença
Valor-p Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão
Controle (G1) 2,70 0,928 3,90 0,764 1,20 1,041
0,679 Vaginal (G2) 3,60 0,957 4,29 0,387 0,68 1,009
Intraperit. (G3) 3,19 0,510 4,02 0,525 0,83 0,629
Fonte: Levantamento de dados primários, AGOSTO/2011.
Assim como no quinto dia, no oitavo dia após a inoculação, também foi
42
observada uma tendência de maior quantidade das UFC no grupo controle (G1),
quando comparado com os grupos tratados com glucana (Tabela 3).
Interessantemente, o grupo G3, tratado com glucana intraperitoneal, apresentou
uma diminuição das UFC.Com relação ao grupo G2, os animais tratados com
glucana, por via vaginal, apresentaram um aumento de UFC. Entretanto, a
quantidade de UFC foi menor que o grupo controle. Não houve diferença
estatisticamente significativa entre nenhum dos grupos avaliados.
Tabela 3: Comparação da média da diferença de UFC entre o 8° e o 2° dia, nos três
grupos, através do teste de Kruskal-Wallis: (log10 ufc, n=3)
Grupo 2º 8º Diferença
Valor-p Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão
Controle (G1) 2,56 0,999 4,04 0,839 1,48 1,668
0,086 Vaginal (G2) 2,78 0,786 3,86 1,000 1,09 1,269
Intraperit. (G3) 4,18 0,593 3,29 0,560 -0,89 0,524
Fonte: Levantamento de dados primários, AGOSTO/2011.
No décimo dia após a infecção (Tabela 4), o grupo controle(G1) também
apresentou um maior quantidade das UFC quando comparado aos grupos G2 e G3.
Enquanto que o grupo G3, tratado com glucana intraperitoneal, apresentou uma
diminuição das UFC. E o grupo G2, tratado com glucana por via vaginal, mostrou um
aumento das UFC, porém menor que a quantidade das UFC no controle. Apesar da
diferença na contagem de colônias, em nenhum caso apresentou significância
estatisticamente.
43
Tabela 4: Comparação da média da diferença de UFC entre o 10° e o 2° dia, nos três
grupos, através do teste de Kruskal-Wallis: (log10, n=3)
Grupo 2º 10º Diferença
Valor-p Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão
Controle (G1) 2,46 0,343 2,91 0,704 0,46 0,887
0,695 Vaginal (G2) 2,92 0,410 3,26 0,602 0,34 0,900
Intraperit. (G3) 4,16 0,151 3,95 0,949 -0,22 0,983
Fonte: Levantamento de dados primários, AGOSTO/2011.
4.1.2. Dosagem da Citocina IFN-γ, no lavado vaginal
Devido ao papel crítico das citocinas na imunoregulação, promovendo
indução e persistência da resposta celular específica e dependente de anticorpos,
(ROMANI, 1997) o fluído vaginal dos camundongos foi coletado em três intervalos
durante o experimento (6º, 9º e 11º dias após a inoculação) (Figura 6).
Figura 6:Detecção da citocina IFN-γ, no lavado vaginal de camundongos com candidíase
vulvovaginal por C. albicans, durante o experimento, nos dias 6, 9 e 10 após a
inoculação. A citocina foi quantificada usando o pool do lavado vaginal dos
camundongos (três animais por pool).
Foi avaliada a presença da citocina Interferon-gama (IFN-γ), representativa
44
da resposta tipo Th1. Durante o experimento, foi observada a presença dessa
citocina, no lavado vaginal, principalmente nos grupos tratados com glucana (G2 e
G3), todos os dias de coleta (Figura 6). O maior pico (416,35 pg/mL) foi encontrado
no sexto dia após a inoculação, no grupo G3, enquanto que no nono dia ocorreu um
declínio para 3,64 pg/mL e no 11º o IFN-γ teve um aumento para 101,94 pg/mL.
Nogrupo G2, os níveis de IFN-γ praticamente se mantiveram constantes no sexto e
nono dia após a inoculação (219,73 e 225,48 pg/mL, respectivamente), já no 11º,
ocorreu um declínio para 17, 54 pg/mL. Enquanto que no grupo controle, não-tratado
com glucana, o IFN-γ não foi detectado em nenhum dia de coleta.
4.1.3. Análise Histopatológica
Foi observada a presença de todas as morfologias de C. albicans
(blastoconídios, hifas e pseudohifas) aderidas e invadindo tanto o tecido vaginal dos
grupos tratados com glucana por via vaginal (G2) (Figura 8) e intraperitoneal (G3)
(Figura 9) como nos não-tratados com glucana (G1) (Figura 7).
A presença de leveduras no tecido vaginal foi observada durante todo o
experimento, principalmente, no sexto, nono e décimo primeiro dia após a
inoculação, quando o tecido vaginal foi removido dos animais para análise.
Em relação ao infiltrado de células inflamatórias, em todos os animais
evidenciou-se a presença de neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) e em alguns
casos observou-se a presença de linfócitos tanto na mucosa como na submucosa
vaginal.O grupo G1, controle, apresentou menor infiltração de células PMNs, nos
três dias (6º, 9º e 11º), quando comparado com os grupos tratados com glucana. O
grupo G2, apresentou maior infiltração de células PMN para a mucosa vaginal, em
todos os três dias de análise, quando comparado aos demais grupos G1 e G3. O
45
grupo G3 também apresentou alto influxo de células PMNs, nos três dias, quando
comparado ao controle, porém menor que o grupo G2.
Em relação à carga fúngica, foi observado que tanto o grupo controle (G1)
como o grupo G2, glucana por via vaginal, demonstraram alta carga fúngica de C.
albicans, aderidas e invadindo o tecido vaginal. Enquanto que o grupo G3, glucana
por via intraperitoneal, apresentou redução da carga fúngica, principalmente, no 11º
após a inoculação, quando os animais já haviam recebido a segunda dose da
glucana, não apresentando invasão, no tecido vaginal, pelas células de C. albicans.
46
Figura 7: Análise histopatológica do tecido vaginal de camundongos controle (G1) (a
e b) e com glucana por via vaginal (G2) (c e d) infectados com C. albicans. (a) e (c):
Coloração com hematoxilina e eosina e (b) e (d): Coloração com Ácido periódico de
Schiff (PAS). (X400). Setas pretas: infiltração de células PMNs e setas brancas:
invasão de C. albicans.
A
B
C D
47
Figura 8: Análise histopatológica do tecido vaginal de camundongos tratados com
glucana por via intraperitoneal (G3) infectado com C. albicans. (a e c): Coloração
com hematoxilina e eosina e (b e d): Coloração com Ácido periódico de Schiff (PAS).
(X400). Seta preta: infiltração de PMNs e seta branca: invasão de C. albicans. (a e
b): 8º dia e (c e d): 11º dia.
A B
C D
48
5- DISCUSSÃO
A CVV é uma das infecções vaginais mais comuns em todo mundo, com
aproximadamente 13 milhões de casos emergentes a cada ano. Sua incidência tem
aumentado constantemente, devido ao extensivo uso de antibióticos e
corticosteróides. Essa infecção pode afetar a saúde mental e física das pacientes e
até mesmo o relacionamento com os seus parceiros (THEODORE; KIEREN;
RALEIGH, 1998). Por isso, a CVV é atualmente um relevante problema na saúde da
mulher (ÁLVARES et al., 2007). Com o propósito de avaliar a capacidade
imunomodulatória da β-glucana, nós estabelecemos um modelo de CVV em
camundongos, sob influência do estrógeno, para garantir a efetiva infecção. Nosso
estudo mostrou que 100% dos animais tratados com estrógeno desenvolveram a
infecção, sugerindo que o modelo experimental obteve sucesso.
A atividade imunomodulatória da glucana foi avaliada, no local da infecção,
através da coleta do lavado vaginal, o qual foi utilizado para a contagem de UFC e
para a quantificação da citocina IFN-γ e através da análise histopatológica.
Em relação à contagem de colônias, nossos resultados mostraram que os
animais tratados com glucana intraperitoneal (G3) apresentaram redução da carga
fúngica, no oitavo e décimo dia após a inoculação, quando comparados com os do
grupo controle (G1). No entanto, o grupo tratado com glucana, por via vaginal,
apresentou um aumento da carga fúngica no quinto, oitavo e décimo dia, assim
como o grupo controle, porém menor do que neste grupo. Em todos os casos, os
resultados da contagem de UFC não foram estatisticamente significantes. Este fato
corrobora com os dados obtidos por Pietrellaet al. 2010, os quais mostraram que a
vacina conjugada com glucana conferiu proteção contra a infecção por C. albicans,
em modelos vaginais, porém, na primeira semana de infecção vaginal por Candida,
49
os animais apresentaram alta variação na contagem das UFC. Além disso, a
morfologia do fungo pode afetar significativamente a precisão das medidas de UFC
na avaliação da carga fúngica, porque a C. albicans apresenta-se sobre varias
morfologias de leveduras, incluindo hifas e pseudohifas durante a infecção em
animais (ENJALBERT et al.,2009). Em outro estudo usando modelos de infecções
vaginais em ratos, foi encontrado que a vacina glicoconjugada de β-glucana,
adicionada ao toxóide diftérico CRM197, como uma proteína carreadora, conferiu
proteção contra a infecção vaginal por C. albicans (TOROSSANTUSSI et al., 2005),
sugerindo que a glucana administrada por via intraperitoneal possa ter um efeito
protetor contra a CVV por C. albicans.
Acredita-se que o tecido vaginal não contenha um tecido linfóide organizado,
porém a resposta parece ser altamente sensível no local ou distal a imunização
contra antígenos de Candida (DE BERNARDIS et al., 2006), sugerindo que as
células T locais desempenham um papel na proteção contra infecção, sem
apreciável mudança na composição ou percentual (SAVEEDRA et al., 1999). IFN-γ é
uma citocinas chave no controle de infecções fúngicas em humanos e
camundongos, sendo produzida pelos linfócitos e células NK (ROMANI, PUCCETTI,
BISTON, 1997; ROMANI, 2004), porém as células NK não estão presentes na
mucosa vaginal (STEELE et al., 1999).
Nossos resultados na quantificação da citocina IFN-γ, no lavado vaginal, mostraram
que essa foi detectada somente nos animais tratados com glucana, tanto por via
intraperitoneal (G3) como vaginal (G2) (Figura 5), enquanto que nos animais
controle, o IFN-γ não foi detectável. No estudo de De Bernardis et al. (2000), IFN-γ
foi também encontrado no lavado vaginal, em modelos de CVV sobre pseudoestrus
sem nenhum tratamento, mas no sexto dia após a inoculação, os camundongos
mostraram diminuição praticamente total do IFN-γ, o que foi observado nos nossos
50
camundongos controles. Então, nós podemos assumir que a glucana, por via vaginal
e intraperitoneal, induziu as células T locais contra a candidíase vulvovaginal pela C.
albicans, confirmando os resultados de Saveedra et al. (1999), que afirma a
participação das células T locais na resposta CMI, no tecido vaginal, uma vez que a
resposta CMI sistêmica contra infecções vaginais é insuficiente (WOZNIAK;
WORMLEY; FIDEL, 2002). Em relação à análise histopatológica, nossos resultados
mostraram que todos os animais tratados e não-tratados apresentaram o influxo
predominante de neutrófilos. Contudo, os animais tratados com glucana mostraram
maior infiltração de neutrófilos, quando comparado com o não tratado. No estudo
realizado por Fidel et al. (2004), os neutrófilos fizeram um importante papel protetor
contra CVV por C. albicans, em mulheres, embora esse resultado não foi encontrado
em animais. Então, é possível que a glucana, por via vaginal, principalmente,
aumente a proteção contra a C. albicans, na candidíase vaginal. Em relação a carga
fúngica, na análise histopatológica, a glucana por via intraperitoneal causou uma
marcante redução na carga fúngica de C. albicans, no tecido vaginal, quando
comparado ao grupo controle e vaginal, sugerindo que a glucana pode reduzir a
carga fúngica (como foi observado na contagem de CFU). De todas as evidências
avaliadas, pode-se concluir que a glucana por via intraperitoneal reduziu de forma
marcante a carga fúngica de C. albicans, mas não foi estatisticamente significante, e
induziu a produção de IFN-γ, ajudando a resposta immune contra a CVV por C.
albicans. Enquanto que a glucana por via vaginal reduziu levemente a carga fúngica
no tecido vaginal, porém induziu a produção de IFN-γ e aumentou o influxo de
neutrófilos para o local da infecção. Então, a glucana, certamente, faz um papel na
imunomodulação da resposta immune contra a CVV por C. albicans.
Assim, com base nestes resultados, novas pesquisas serão realizadas para
ter-se uma maior compreensão do mecanismo de ação deste polissacarídeo e
51
consequentemente uma padronização para o seu futuro uso na terapia desta
infeccção.
52
6- CONCLUSÕES
Na avaliação da infecção vulvovaginal através da contagem UFC, os animais
tratados com glucana, por via intraperitoneal, apresentaram uma diminuição das
UFC, quando comparado com o grupo controle, sendo essa redução confirmada
pelo histopatológico. Porém, os animais tratados com glucana, por via vaginal, não
apresentaram diminuição, mas a quantidade das UFC foi menor quando comparado
ao grupo controle. Embora tenha ocorrido diferença na contagem de UFC, durante o
experimento, nenhum caso apresentou significância estatística. A infecção por C.
albicans pôde ser confirmada pela análise histopatológica, a qual apresentou todas
as morfologias desta levedura (blastoconídios, hifas verdadeiras e pseudohifas). A
presença da citocina IFN-γ, no fluido vaginal, foi observada somente nos animais
tratados com glucana tanto por via intraperitoneal como vaginal. Enquanto que o
IFN-γ não foi detectável, no fluido vaginal dos animais controles. Em relação ao
infiltrado celular inflamatório, no tecido vaginal, observou-se a predominância de
neutrófilos PMN em todos os grupos (tratados e não-tratados). No entanto, os
animais tratados com glucana, por via vaginal, mostraram maior infiltração de células
PMN, no tecido vaginal, seguidos pelos tratados com glucana intraperitoneal.
Então, a glucana, certamente, faz um papel na imunomodulação da resposta
immune contra a CVV por C. albicans
53
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62
APÊNDICE I
Protocolo Candidíase Vulvovaginal
Dia/
Grupo G1 (Controle) G2 (Glucana
Vaginal)
G3 (Glucana
Intraperitoneal)
-5 E E E
-4 E E E
-3 E E E
-2 E E E
-1 E E E
0 E, Inoculação E,Inoculação E,Inoculação
1 E E E
2 E,
Monitoramento
E,
Monitoramento
E,
Monitoramento
3 E E E
4 E, Cloreto de
Sódio
E, Glucana
Vaginal
E, Glucana
Intraperitoneal
5 E, Contagem
de UFC
E, Contagem
de UFC
E, Contagem de
UFC
6 E, Lavado e
Eutanásia
E, Lavado e
Eutanásia
E, Lavado e
Eutanásia
7 E, Cloreto de
Sódio
E, Glucana
Vaginal
E, Glucana
Intraperitoneal
8 E, Contagem
de UFC
E, Contagem
de UFC
E, Contagem de
UFC
9 E, Lavado e
Eutanásia
E, Lavado e
Eutanásia
E, Lavado e
Eutanásia
10 E, Contagem
de UFC
E, Contagem
de UFC
E, Contagem de
UFC
11 E, Lavado e
Eutanásia
E, Lavado e
Eutanásia
E, Lavado e
Eutanásia
E: Estrôgeno
UFC: Unidades Formadoras de Colônia