ASAM α-LIPOAT MENURUNKAN EKSPRESI MMP-1 PADA ...

TESIS

ASAM α-LIPOAT MENURUNKAN EKSPRESI MMP-1

PADA KULTUR FIBROBLAS YANG TERPAPAR

EKSTRAK ASAP ROKOK IN VITRO

IRWAN

PROGRAM MAGISTER

PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR

2011

TESIS

ASAM α-LIPOAT MENURUNKAN EKSPRESI MMP-1

PADA KULTUR FIBROBLAS YANG TERPAPAR

EKSTRAK ASAP ROKOK IN VITRO

Tesis Untuk Memperoleh Gelar Magister

Pada Program Magister Program Studi Ilmu Biomedik

Kekhususan Anti Aging Medicine

Program Pascasarjana Universitas Udayana

IRWAN

NIM 0890761012

PROGRAM MAGISTER

PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK

KEKHUSUSAN ANTI-AGING MEDICINE

UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR

2011

LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING

TESIS INI TELAH DISETUJUI

PADA TANGGAL 11 NOVEMBER 2011

Pembimbing I Pembimbing II

Prof.Dr.dr. N Adiputra,MOH Prof.Dr.dr. Wimpie I Pangkahila,Sp.And.FAACS NIP: 194712111976021001 NIP: 194612131971071001

Mengetahui,

Ketua Program Magister Program Studi Anti-Aging Medicine

Program Pascasarjana

Universitas Udayana,

Prof. DR. dr. Wimpie I Pangkahila, Sp.And.FAACS

NIP: 194612131971071001

Tesis Ini Telah Diuji dan Dinilai

oleh Panitia Penguji pada

Program Pascasarjana Universitas Udayana

Pada Tanggal 11 November 2011

Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana

No: 1906/UN14.4/HK/2011

Tanggal 31 Oktober 2011

Panitia Penguji Tesis adalah:

Ketua : Prof. Dr. dr. N Adiputra, MOH

Anggota :

1. Prof. DR. dr. Wimpie I Pangkahila, Sp.And, FAACS

2. Prof. dr. N Agus Bagiada, Sp.BIOK

3. Prof. DR. dr. J Alex Pangkahila, M.Sc, Sp.And

4. Prof. dr. N Tigeh Suryadhi, MPH. Ph.D

UCAPAN TERIMA KASIH

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas

rahmat-Nya penelitian dan penyusunan tesis yang berjudul “ Asam α-Lipoat

Menurunkan Ekspresi MMP-1 Pada Kultur Fibroblas Yang Terpapar

Ekstrak Asap Rokok Secara In-Vitro ” dapat diselesaikan.

Tesis ini disusun dalam rangka memenuhi persyaratan tugas akhir studi

untuk meraih gelar Magister pada Program Magister Program Studi Ilmu

Kedokteran Biomedik, Kekhususan Anti Aging Medicine, Program Pascasarjana

Universitas Udayana.

Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis mengucapkan terima kasih

yang sebesar-besarnya kepada Prof. Dr. dr. I. N. Adiputra M. OH., selaku

pembimbing I sekaligus pembimbing akademik dan Prof. Dr. dr. Wimpie

Pangkahila, Sp. And., FAACS., selaku pembimbing II atas bimbingan, perhatian,

dorongan, serta semangat yang telah diberikan selama mengikuti program studi

magister, khususnya dalam penyelesaian tesis ini.

Ucapan yang sama juga ditujukan kepada :

1. Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. dr. I Made Bakta, Sp.PD(KHOM),

atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk

mengikuti dan menyelesaikan Program Magister di Universitas Udayana.

2. Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana Prof. Dr. dr. AA.

Raka Sudewi, Sp.S(K) atas kesempatan yang diberikan kepada penulis

untuk menjadi mahasiswa program magister pada Program Pascasarjana

Universitas Udayana.

3. Ketua Program Studi Ilmu Biomedik Prof. Dr. dr. Wimpie Pangkahila, Sp.

And., FAACS, juga selaku pembimbing, atas kesempatan yang diberikan

kepada penulis untuk menjadi mahasiswa Program Magister Ilmu

Biomedik kekhususan Anti Aging Medicine, Program Pascasarjana

Universitas Udayana, yang juga telah memberikan semangat, masukan dan

bimbingan untuk menyelesaikan tesis ini.

4. Prof. Dr. dr. J. Alex Pangkahila, MSc, Sp.And., selaku penguji yangtelah

banyak memberikan semangat, bimbingan dan masukan yang sangat

berharga dalam penyusunan tesis ini.

5. Prof. dr. N. A. Bagiada, Sp.BIOK selaku penguji yang telah membimbing,

mengarahkan serta memberi masukan dalam penyusunan tesis ini.

6. Prof. dr. N. Tigeh Suryadhi, MPH. PhD selaku penguji yang telah

membimbing dan memberikan masukan dalam penyusunan tesis ini.

7. dr. AAGP. Wiraguna, Sp.KK, yang banyak memberikan bantuan dan

masukan yang sangat berharga dalam penyusunan tesis ini.

8. Drs. I. Ketut Tunas, Msi yang membimbing dalam analisis statistik.

9. Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gajah Mada

atas segala sarana, fasilitas dan segala kemudahan yang diberikan dalam

pelaksanaan penelitian sehingga penyusunan tesis ini dapat diselesaikan.

10. Para dosen pengajar Program Studi Ilmu Biomedik Program Pascasarjana

Universitas Udayana, teman-teman sependidikan, dan seluruh karyawan

bagian Ilmu Biomedik serta semua pihak yang telah membantu selama

pendidikan, penelitian dan penulisan tesis ini.

11. Ibu TriYuliati dan ibu Haryati atas segala bantuan serta kemudahan yang

diberikan dalam pelaksanaan penelitian sehingga penyusunan tesis dapat

diselesaikan.

12. Keluarga terkasih, orang tua akan dukungan serta pengertian dalam

memberikan kesempatan untuk menyelesaikan tesis ini.

Semoga Tuhan Yang Maha Esa selalu melimpahkan rahmat-Nya kepada

semua pihak yang telah membantu pelaksanaan dan penyelesaian tesis ini.

Surabaya, Oktober 2011

Penulis

ABSTRAK

ASAM α-LIPOAT MENURUNKAN EKSPRESI MMP-1 PADA KULTUR FIBROBLAS YANG TERPAPAR EKSTRAK ASAP ROKOK IN VITRO

Merokok menyebabkan banyak kematian setiap tahun, selain sangat berpengaruh terhadap berbagai penyakit sistemik, merokok juga menyebabkan berbagai gangguan pada kulit yang salah satunya adalah penuaan dini kulit. Merokok dapat meningkatkan kadar MMP-1, yang berakibat penghancuran serat kolagen, serat elastin dan proteoglikan, ketidakseimbangan antara sintesis dan degradasi pada metabolisme jaringan ikat di bagian dermis kulit. ROS memegang peranan penting dalam asap rokok dalam menyebabkan penuaan dini kulit. Ekstrak asap rokok telah terbukti mempercepat terjadinya penuaan dini kulit, secara in vivo dan in vitro. Pemberian asam α-lipoat yang dapat meredam ROS akan menghambat rangsangan terhadap MMP-1. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui, apakah asam α-lipoat mampu memberikan perlindungan terhadap penuaan dini kulit akibat paparan ekstrak asap rokok, dinilai dari penurunan ekspresi MMP-1.

Rancangan penelitian ini adalah posttest only control group design. Penelitian in vitro menggunakan sel fibroblas yang dibiakkan dari kulit preputium post sirkumsisi. Terdiri dari 13 kelompok, yang dibagi ke dalam 3 kelompok yaitu kelompok kontrol (tanpa perlakuan), kelompok sel yang hanya mendapatkan paparan ekstrak asap rokok dengan variasi dosis 50μl/ml, 25μl/ml, 12,5μl/ml, dan kelompok yang diberikan asam α-lipoat dengan variasi dosis 50μg, 100μg dan 200μg sebelum dipapar oleh ekstrak asap rokok. Supernatan dari kultur sel fibroblas dikumpulkan setelah 24 jam dan ekspresi MMP-1 dinilai dengan MMP-1 Human enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit sesuai protokol.

Hasil penelitian didapatkan bahwa ekstrak asap rokok pada semua variasi dosis mampu meningkatkan MMP-1 secara bermakna (p<0,05). Asam α-lipoat pada variasi dosis pemberian (50μg, 100μg dan 200μg) mampu menurunkan ekspresi MMP-1 akibat paparan ekstrak asap rokok pada kultur sel fibroblas dengan variasi dosis ekstrak asap rokok 50μl/ml, 25μl/ml, 12,5μl/ml secara bermakna (p<0,05). Dapat disimpulkan bahwa asam α-lipoat sebagai antioksidan mampu melindungi kulit dari penuaan dini akibat paparan ekstrak asap rokok dengan menurunkan ekspresi MMP-1. Diperlukan penelitian lebih lanjut, penelitian in vivo untuk mengetahui efek perlindungan asam α-lipoat terhadap penuaan dini kulit.

Kata kunci : asam α-lipoat, ekstrak asap rokok, penuaan dini, ekspresi MMP-1.

ABSTRACT

α-LIPOIC ACID REDUCES MMP-1 EXPRESSION IN CULTURED FIBROBLAST EXPOSED TO CIGARETTE SMOKE EXTRACT IN

VITRO

Smoking causes many deaths each year, in addition to great effect on a variety of systemic diseases. Smoking also causes various skin disorders, such as premature aging of skin. Smoking can increase levels of MMP-1, which resulted in the destruction of collagen fibers, elastin fibers and proteoglycans, the imbalance between synthesis and degradation in connective tissue metabolism in the dermis of skin. ROS plays an important role in cigarette smoke in causing premature aging of skin. Cigarette smoke extract has been shown to accelerate the aging of skin, in vivo and in vitro. Giving α-lipoic acid that can scavenge the ROS would inhibit the stimulation of MMP-1. This study aims to determine, whether α-lipoic acid could provide protection against premature skin aging caused by exposure to cigarette smoke extract, assessed from the decreased expression of MMP-1.

The design of this study was posttest only control group design. In vitro studies using cell cultures of skin fibroblasts cultured from the prepuce post-circumcision, consisting of thirteen groups, divided into three groups : control group (without exposed), groups of cells that were exposed to cigarette smoke extract with dose variation 50μl/ml, 25μl/ml, 12,5μl/ml, and groups given α-lipoic acid with a variation dose of 50μg, 100μg and 200μg before being exposed by cigarette smoke extract. Supernatant from fibroblast cell cultures were collected after 24 hours and expression of MMP-1 was assessed by the Human MMP-1 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit with accordance do to protocol.

The results found that extract of cigarette smoke in all variations of the dose was able to increase MMP-1 significantly (p<0.05). α-lipoic acid on variations of dose administration (50μg, 100μg and 200μg) was able to reduce MMP-1 expression due to exposure to cigarette smoke extract on fibroblast cell cultures with a variety of doses of cigarette smoke extract 50μl/ml, 25μl/ml, 12,5μl/ml significant (p<0.05).

It can be concluded that α-lipoic acid as antioxidant is capable of protecting the skin from premature aging due to exposure to cigarette smoke extract by reducing the expression of MMP-1. Further research is needed, in vivo studies to determine the effects of α-lipoic acid protection against premature skin aging.

Key words : α-lipoic acid, cigarette smoke extract, premature aging, expression of MMP-1

DAFTAR ISI

SAMPUL DALAM ...................................................................................................... i

PRASYARAT GELAR ................................................................................................ ii

LEMBAR PERSETUJUAN ......................................................................................... iii

PENETAPAN PANITIA PENGUJI ............................................................................. iv

UCAPAN TERIMA KASIH ........................................................................................ v

ABSTRAK.....................................................................................................................viii

ABSTRACT ................................................................................................................ ix

DAFTAR ISI ............................................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR ................................................................................................... xiv

DAFTAR TABEL ........................................................................................................ xv

BAB I PENDAHULUAN .......................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ............................................................................................ 1

1.2 Rumusan Masalah ....................................................................................... 6

1.3 Tujuan Penelitian ........................................................................................ 6

1.4 Manfaat Penelitian ...................................................................................... 6

BAB II KAJIAN PUSTAKA ....................................................................................... 8

2.1 Aging ......................................................................................................... 8

2.1.1 Teori-teori aging ............................................................................... 9

2.2 Anatomi dan Fisiologi Kulit ....................................................................... 11

2.2.1 Anatomi dan fisiologi kulit manusia .................................................. 11

2.2.2 Kolagen............................................................................................. 14

2.2.3 Elastin ............................................................................................... 16

2.2.4 MMP................................................................................................. 17

2.2.5 Penuaan intrinsik kulit ....................................................................... 18

2.3 Penurunan Fungsi Kulit yang Berkaitan dengan Bertambahnya Usia .......... 19

2.3.1 Pergantian sel dan penyembuhan luka................................................ 19

2.3.2 Fungsi sensoris .................................................................................. 19

2.3.3 Perbaikan kerusakan DNA................................................................. 20

2.3.4 Fungsi imunitas ................................................................................. 20

2.3.5 Produksi vitamin D............................................................................ 20

2.3.6 Fungsi pertahanan dan proteksi mekanis ............................................ 21

2.4 Radikal Bebas ............................................................................................ 22

2.4.1 Definisi radikal bebas ........................................................................ 22

2.4.2 Tahapan pembentukan radikal bebas .................................................. 22

2.4.3 Sifat radikal bebas ............................................................................. 23

2.4.4 ROS ( Reactive Oxygen Species ) ...................................................... 24

2.5 Rokok ....................................................................................................... 27

2.5.1 Kandungan kimia rokok .................................................................... 28

2.5.1.1 Nikotin .................................................................................. 28

2.5.1.2 Tar ......................................................................................... 29

2.5.1.3 Gas ........................................................................................ 29

2.6 Merokok dan Kulit ..................................................................................... 30

2.6.1 Efek yang diakibatkan oleh merokok pada jaringan ikat kulit secara

in vivo dan in vitro ............................................................................ 33

2.7 Antioksidan dan Kulit ................................................................................ 34

2.8 Asam α- lipoat ........................................................................................... 35

BAB III KERANGKA BERPIKIR DAN HIPOTESIS PENELITIAN .......................... 41

3.1 Kerangka Berpikir...................................................................................... 41

3.2 Konsep ...................................................................................................... 42

3.3 Hipotesis Penelitian ................................................................................... 42

BAB IV METODE PENELITIAN ............................................................................... 43

4.1 Rancangan Penelitian ................................................................................. 43

4.2 Tempat Penelitian ...................................................................................... 47

4.3 Subyek dan Sampel .................................................................................... 47

4.3.1 Variabilitas populasi ......................................................................... 47

4.2.2 Besaran sampel ................................................................................ 48

4.4 Variabel ..................................................................................................... 48

4.4.1 Klasifikasi variabel ........................................................................... 48

4.4.2 Definisi operasional variabel ............................................................ 48

4.5 Bahan dan Instrumen Penelitian ................................................................. 50

4.5.1 Bahan Utama .................................................................................... 50

4.5.2 Bahan Penunjang .............................................................................. 50

4.5.3 Instrumen Penelitian ......................................................................... 50

4.6 Prosedur Penelitian in vitro ........................................................................ 51

4.6.1 Pemberian perlakuan in vitro ............................................................. 51

4.6.2 Penghitungan Jumlah Sel Uji ............................................................. 53

4.6.3 Uji Aktivitas in vitro.......................................................................... 54

4.7 Alur Penelitian ........................................................................................... 55

4.8 Analisis Data ............................................................................................. 55

BAB V HASIL PENELITIAN ..................................................................................... 57

5.1 Uji Normalitas Data ................................................................................... 57

5.2 Uji Homogenitas antar Kelompok .............................................................. 57

5.3 Pemberian Ekstrak Asap Rokok 50µl/ml (EAR 50µl/ml) ............................ 57

5.3.1 Uji Efek Pemberian EAR 50µl/ml ..................................................... 57

5.4 Pemberian Ekstrak Asap Rokok 25µl/ml (EAR 25µl/ml) ............................ 60

5.4.1 Uji Efek Pemberian EAR 25µl/ml ..................................................... 60

5.5 Pemberian Ekstrak Asap Rokok 12,5µl/ml (EAR 12,5µl/ml) ..................... 63

5.5.1 Uji Efek Pemberian EAR 12,5µl/ml .................................................. 63

BAB VI PEMBAHASAN ........................................................................................... 67

BAB VII SIMPULAN DAN SARAN .......................................................................... 72

7.1 Simpulan.................................................................................................. 72

7.2 Saran ....................................................................................................... 72

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................. 73

LAMPIRAN ................................................................................................................ 78

Lampiran 1 : Uji Normalitas Data MMP-1 Berdasarkan Paparan Ekstrak Asap Rokok

(EAR) 50µl/ml, 25µl/ml dan 12,5µl/ml .................................................. 78

Lampiran 2 : Uji Homogenitas, Anova Test dan LSD Test Kelompok EAR 50µl/ml .... 79

Lampiran 3 : Uji Homogenitas, Anova Test dan LSD Test Kelompok EAR 25µl/ml .... 81

Lampiran 4 : Uji Homogenitas, Anova Test dan LSD Test Kelompok EAR 12,5µl/ml . 83

Lampiran 5 : Foto-foto Penelitian ................................................................................ 85

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Mekanisme Molekuler dari Penuaan Kulit Dini yang Diinduksi Asap

Tembakau ............................................................................................. 31

Gambar 2.2 Skema Kerja Asam α- lipoat .................................................................... 39

Bagan 4.1 Skema Rancangan Penelitian in vitro ...................................................... 44

Bagan 4.2 Alur Penelitian in vitro ............................................................................ 55

Gambar 5.1 Grafik Sesudah Paparan EAR 50µl/ml ..................................................... 59

Gambar 5.2 Grafik Sesudah Paparan EAR 25µl/ml ..................................................... 61

Gambar 5.3 Grafik Sesudah Paparan EAR 12,5µl/ml .................................................. 64

DAFTAR TABEL

Tabel 5.1 Rerata MMP-1 antar Kelompok Sesudah Pemberian EAR 50µl/ml ............ 58

Tabel 5.2 Analisis Komparasi antar Kelompok Sesudah Pemberian

EAR 50µl/ml ........................................................................................... 60

Tabel 5.3 Rerata MMP-1 antar Kelompok Sesudah Pemberian EAR 25µl/ml ............ 61


EAR 25µl/ml ........................................................................................... 63

Tabel 5.5 Rerata MMP-1 antar Kelompok Sesudah Pemberian EAR 12,5µl/ml ......... 64


EAR 25µl/ml ........................................................................................... 66

DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG

MMP-1 : Matriks Metalloproteinase 1

EAR : Ekstrak Asap Rokok

ROS : Reactive Oxygen Species

A4M : American Academy of Anti-Aging Medicine

AAL : Asam Alfa Lipoat

SOD : Superoxide Dismutase

TCF : Tissue Culture Flask

RPMI 1640 : Rosenthal Park Memorial Institute 1640

TIMP : Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteinase

TGF-β : Transforming Growth Factor β

AP-2 : Activator Protein 2

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Penuaan adalah suatu proses yang dialami oleh setiap manusia di dunia,

tetapi dengan kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi proses penuaan dapat

diperlambat. Usia harapan hidup seseorang semakin panjang menyebabkan

populasi lanjut usia semakin bertambah pula. Pada sensus penduduk yang pertama

diadakan di Amerika Serikat pada tahun 1790, setengah dari populasi berusia di

bawah 16 tahun. Pada tahun 1990, kurang dari seperempat populasi yang berusia

di bawah 16 tahun. Jumlah golongan usia ini telah berubah dua kali lipat dalam

200 tahun. Kenyataannya, Biro Kependudukan Amerika Serikat meramalkan pada

tahun 2025, akan ada 2 orang berusia 65 tahun untuk tiap 1 remaja/umur belasan

(Goldman dan Klatz, 2007).

Berdasarkan proyeksi penduduk pada tahun 2010 di Indonesia,

diperkirakan pada tahun 2020, jumlah penduduk usia lanjut sebesar 11,34%.

Dengan semakin bertambahnya usia, maka akan terjadi penurunan berbagai fungsi

organ tubuh dan terjadinya perubahan fisik baik tingkat seluler, organ, maupun

sistem karena proses penuaan (Baskoro dan Konthen, 2008). Hingga tahun 2020,

populasi dunia diperkirakan mencapai lebih dari 1 milyar orang berumur 60 tahun

atau lebih, dan sebagian besar di negara sedang berkembang (Beers, 2005).

Seiring dengan bertambahnya populasi orang tua maka bertambah juga

berbagai permasalahan yang menyertai usia tersebut. Sebagian besar orang merasa

pasrah bahwa menjadi tua harus mengalami segala macam penyakit, kemunduran,

kekurangan, dan ketidakberdayaan. Bahkan, istilah “penyakit tua” sangat dikenal

oleh masyarakat luas. Penuaan ditandai dengan penurunan dan bahkan

berhentinya fungsi berbagai organ tubuh, dibedakan menjadi dua, yang pertama

yaitu tanda fisik yang meliputi massa otot berkurang, lemak meningkat, kulit

berkerut, dan lain sebagainya; sedangkan tanda yang kedua adalah tanda psikis

seperti sulit tidur menurunnya gairah hidup, mudah cemas, dan masih banyak lagi

(Pangkahila, 2007).

Bersamaan dengan adanya perkembangan jaman dan bertambahnya ilmu

pengetahuan telah dicetuskan suatu konsep baru pada tahun 1993 yaitu konsep

Anti-Aging Medicine atau Kedokteran Anti-Penuaan yang mengharapkan manusia

tetap dapat hidup dengan kualitas yang prima walaupun usia merambah naik.

Bahkan, proses penuaan dapat diperlambat, ditunda, atau dihambat, dan usia

harapan hidup menjadi lebih panjang dengan kualitas hidup yang baik

(Pangkahila, 2007).

Kulit merupakan organ yang kompleks dan dinamis yang menunjukkan

tanda-tanda penuaan secara nyata. Kulit berhubungan langsung dengan

lingkungan sekitar dan oleh karena tersebut penuaan yang juga sebagai

konsekuensi dari kerusakan oleh lingkungan (Gilchrest dan Krutmann, 2006).

Penuaan kulit kronologis meliputi segala perubahan yang terjadi pada kulit

akibat dari perjalanan waktu saja. Perubahan-perubahan ini terjadi sebagai bagian

dari hasil kumulasi kerusakan endogen dari pembentukan ROS (reactive oxygen

species) secara terus-menerus yang terbentuk selama metabolisme oksidasi seluler

(Gilchrest dan Krutmann, 2006).

ROS, baik yang dihasilkan oleh metabolisme seluler maupun yang berasal

dari lingkungan luar, dapat mengubah struktur asam amino yang cukup untuk

menghasilkan hilangnya fungsi (Stadtman, 2001). Pelepasan ROS yang tidak

terkontrol ikut berperan pada patogenesis terjadinya sejumlah gangguan kulit pada

manusia termasuk di antaranya adalah neoplasma kutaneus (Black 2004b).

Sesuai dengan konsep dalam Kedokteran Anti-Penuaan yang menyatakan

bahwa penuaan dapat dihambat dan bahkan dapat dikembalikan ke keadaan

semula maka perlu diketahui secara jelas penyebab-penyebab penuaan tersebut.

Berbagai teori penyebab penuaan telah dikemukakan dan salah satunya adalah

teori tentang radikal bebas yang pertama dikenalkan oleh R.Gerschman pada

tahun 1954, yang kemudian dikembangkan oleh Dr. Denham Harman. Radikal

bebas adalah suatu istilah yang digunakan untuk menjelaskan berbagai molekul

yang memiliki elektron bebas, yang dapat dengan mudah bereaksi dengan

molekul lain dengan jalan yang cepat dan merusak (Goldman dan Klatz, 2007).

Rokok merupakan sumber radikal bebas yang cukup besar, dengan

mengandung lebih dari 4.000 bahan kimia, termasuk di dalamnya 43 zat yang

telah diketahui bersifat karsinogenik dan 400 racun lainnya. Termasuk di

dalamnya nikotin, tar dan karbon monoksida, termasuk juga formaldehid, amonia,

hidrogen sianida, arsenik dan DDT (Ginzel, 1999).

Merokok merupakan penyebab morbiditas yang dapat dihindari dan ini

bertanggung jawab atas lebih dari tiga juta kematian dalam setahun di seluruh

dunia. Sebagai tambahan akan hubungan yang kuat terhadap penyakit-penyakit

sistemik, merokok juga berhubungan dengan berbagai kondisi dermatologis,

termasuk penyembuhan luka yang buruk, penuaan dini kulit, karsinoma sel

squamosa, melanoma, dan lain sebagainya (Morita, 2007a).

Telah lama ditetapkan bahwa merokok memiliki efek yang mengganggu

kulit. Studi epidemiologis mengindikasikan bahwa merokok merupakan faktor

lingkungan yang penting dalam terjadinya penuaan dini kulit. Reactive oxygen

species (ROS) berperan dalam penuaan dini kulit yang diakibatkan asap

tembakau. Studi in vitro mengindikasikan bahwa ekstrak asap tembakau merusak

produksi kolagen dan meningkatkan produksi tropoelastin dan matrix

metalloproteinase (MMP), yang mendegradasi matriks protein, dan juga

menyebabkan produksi abnormal dari material elastosis. Merokok meningkatkan

level MMP, yang membawa pada keadaan degradasi serat-serat kolagen, elastin

dan proteoglikan, diduga terjadi ketidakseimbangan antara biosintesis dan

degradasi pada metabolisme jaringan penghubung dermis (Morita, 2007b).

Penelitian yang telah dilakukan oleh Kim dkk di Universitas Nebraska

Medical Center pada tahun 2004 mendapatkan hasil yang menyatakan bahwa asap

rokok merangsang produksi dan aktivitas MMP-1 lewat pengaktifan jalur

transduksi sinyal ERK1/2. Dengan menginduksi MMP1, asap rokok menyebabkan

kerusakan jaringan yang berlebihan (Kim et al, 2004).

Penelitian pada binatang dan manusia mendukung adanya peranan radikal

bebas pada proses penuaan, dan penggunaan antioksidan dapat menghambat

kerusakan akibat radikal bebas (Pangkahila, 2007). Asam α-lipoat memiliki

keunikan dalam kemampuannya bertindak sebagai antioksidan yang dapat larut

baik dalam jaringan lemak maupun air pada baik bentuk teroksidasi maupun

tereduksi. Dapat diserap dengan baik dalam sediaan oral. Karena keuntungan-

keuntungan ini dan tingkat toksisitas yang rendah, asam α-lipoat mendapatkan

perhatian yang lebih sebagai agen terapeutik yang sangat potensial dalam berbagai

kondisi klinis yang berhubungan dengan kerusakan yang disebabkan radikal

bebas.

Lester Packer, PhD, Universitas California di Berkeley, menyarankan

asam α-lipoat sebagai kandidat antioksidan yang ideal karena perannya sebagai

berikut spesifitasnya dalam memadamkan radikal bebas, aktivitas meng-kelasi

metal, interaksi dengan antioksidan lainnya dan pengaruh pada ekspresi gen.

Karena aktivitas biologisnya yang sangat banyak, termasuk kemampuan untuk

meng-kelasi logam dan meredam banyak macam radikal bebas, asam α-lipoat

dipertimbangkan oleh beberapa ahli sebagai antioksidan yang ideal (Nichols,

2001).

Data di atas menunjukkan bahwa asam α-lipoat merupakan antioksidan

yang baik, namun pada penelitian yang dilakukan oleh Lin dkk pada tahun 2004

mengatakan bahwa asam α-lipoat kurang efektif untuk melakukan perlindungan

pada kulit, pada penelitian in vivo dengan subyek hewan , babi dengan

menggunakan paparan sinar UV (Lin et al, 2004).

Berdasarkan data di atas perlu dilakukan penelitian ini untuk membuktikan

bahwa asam α-lipoat memiliki kemampuan untuk melindungi kulit, terutama

struktur kolagen, dari kerusakan kulit yang diakibatkan paparan asap rokok.

1.2 Rumusan Masalah

Permasalahan yang akan dicari jawabanya melalui penelitian ini dapat

dirumuskan sebagai berikut:

Apakah pemberian asam α-lipoat dapat menurunkan MMP-1 pada kultur

fibroblast yang terpapar ekstrak asap rokok?

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan umum : Mengetahui efek proteksi pemberian antioksidan pada kultur

fibroblast dari kulit preputium manusia setelah paparan ekstrak asap rokok.

Tujuan khusus : Mengetahui penurunan MMP-1 pada kultur fibroblast dari kulit

preputium manusia yang terpapar ekstrak asap rokok setelah pemberian asam α-

lipoat .

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini adalah sebagai berikut :

Manfaat ilmiah :

- Memberikan informasi mengenai pemberian asam α-lipoat dapat menghambat

peningkatan kadar MMP-1, yang bersifat destruktif terhadap kolagen, setelah paparan

ekstrak asap rokok dan kemungkinan dapat dipergunakan sebagai dasar untuk dilakukan

penelitian in vivo lebih lanjut pada manusia.

Manfaat klinis :

13. Dapat digunakan sebagai dasar untuk praktek sehari-hari bagi pasien.

Manfaat sosial :

Sebagai acuan bagi masyarakat untuk memahami pentingnya antioksidan dan

bahkan agar bagi para perokok boleh menyadari begitu buruknya dampak

terhadap khususnya kulit dan kesehatan secara menyeluruh yang diakibatkan

oleh rokok dan dapat berhenti merokok.

BAB II

KAJIAN PUSTAKA

2.1 Aging

Aging atau penuaan secara praktis dapat dilihat sebagai suatu penurunan fungsi

biologik dari usia kronologik. Aging tidak dapat dihindarkan dan berjalan dengan

kecepatan berbeda, tergantung dari susunan genetik seseorang, lingkungan dan gaya

hidup, sehingga aging dapat terjadi lebih dini atau lambat tergantung kesehatan masing-

masing individu (Fowler, 2003).

Menurut A4M (American Academy of Anti-Aging Medicine) aging adalah

kelemahan dan kegagalan baik fisik maupun mental yang berhubungan dengan aging

normal disebabkan oleh disfungsi fisiologik, dalam banyak kasus dapat diubah dengan

intervensi kedokteran yang tepat (Klatz, 2003). Aging dapat dibagi menjadi dua konsep

yang berbeda, yaitu : usia kronologis dan usia biologis. Usia kronologis yaitu usia

berdasarkan urutan waktu, terhitung sejak tanggal lahir, sedangkan usia biologis

merupakan fungsi fisik dan mental seseorang, yang terkadang dapat lebih muda atau

lebih tua bila dibandingkan orang lain yang seusianya (Goldman dan Klatz, 2007;

Pangkahila, 2007).

Perkembangan ilmu kedokteran, dalam hal ini Ilmu Kedokteran Anti-Penuaan

(KAP) atau Anti-Aging Medicine (AAM) telah membawa konsep baru dalam dunia

kedokteran. Penuaan diperlakukan sebagai penyakit, sehingga dapat dan harus dicegah

atau diobati bahkan dikembalikan ke keadaan semula sehingga usia harapan hidup

dapat menjadi lebih panjang dengan kualitas hidup yang baik (Goldman dan Klatz, 2007;

Pangkahila, 2007). Dengan mencegah proses penuaan, fungsi berbagai organ tubuh

dapat dipertahankan agar tetap optimal. Hasilnya organ tubuh dapat berfungsi seperti

pada usia yang lebih muda, walaupun usia bertambah. Dengan demikian penampilan

dan kualitas hidupnya lebih muda dibandingkan dengan usia sebenarnya (Pangkahila,

2007).

Konsep dan definisi ilmu KAP atau AAM pada awalnya diperkenalkan oleh A4M (

American Academy of Anti-Aging Medicine) pada tahun 1993, definisinya adalah

“Kedokteran Anti-Penuaan (KAP) adalah bagian ilmu kedokteran yang didasarkan pada

penggunaan ilmu pengetahuan dan teknologi kedokteran terkini untuk melakukan

deteksi dini, pencegahan, pengobatan dan perbaikan ke keadaan semula berbagai

disfungsi, kelainan dan penyakit yang berkaitan dengan penuaan, yang bertujuan untuk

memperpanjang hidup dalam keadaan sehat ” (Pangkahila, 2007)

2.1.1 Teori-teori aging

Teori terbaru dari aging dari tingkat seluler hingga molekuler secara umum

terdiri dari 2 latar belakang, yaitu aging sebagai sesuatu yang terprogram dan aging

merupakan sesuatu yang kebetulan. Teori program berdasarkan pemikiran bahwa sejak

konsepsi hingga kematian, perkembangan manusia diperintah oleh jam biologis. Jam ini

mengatur waktu yang tepat untuk sejumlah perubahan. Teori kebetulan menyatakan

organisme menjadi tua oleh sejumlah kejadian acak. Contohnya kerusakan DNA oleh

radikal bebas atau hanya wear and tear dari kehidupan sehari-hari. Ada 4 teori pokok

dari aging (Goldman dan Klatz, 2007)

Teori “wear and tear”

Tubuh dan selnya mengalami kerusakan karena sering digunakan dan

disalahgunakan (overuse and abuse). Organ tubuh seperti hati, lambung, ginjal, kulit dan

yang lainya, menurun karena toksin didalam makanan dan lingkungan, konsumsi

berlebihan lemak, gula, kafein, alkohol dan nikotin, karena sinar ultraviolet dan karena

stres fisik dan emosional. Tetapi kerusakan ini tidak terbatas pada organ melainkan juga

terjadi di tingkat sel.

Teori neuroendokrin

Teori ini berdasarkan peranan berbagai hormon bagi fungsi organ tubuh.

Hormon dikeluarkan oleh beberapa organ yang dikendalikan oleh hipotalamus, sebuah

kelenjar yang terletak di otak. Hipotalamus membentuk poros dengan hipofise dan

organ tertentu yang kemudian mengeluarkan hormonya. Dengan bertambahnya usia

tubuh memproduksi hormon dalam jumlah kecil, yang akhirnya mengganggu berbagai

sistem tubuh.

Teori Kontrol Genetik

Teori ini fokus pada genetik memprogram sandi sepanjang DNA, dimana kita

dilahirkan dengan kode genetik yang unik, yang memungkinkan fungsi fisik dan mental

tertentu. Dan penurunan genetik tersebut menentukan seberapa cepat kita menjadi tua

dan berapa lama kita hidup.

Teori Radikal Bebas

Teori ini menjelaskan bahwa suatu organisme menjadi tua karena terjadi

akumulasi kerusakan oleh radikal bebas dalam sel sepanjang waktu. Radikal bebas

sendiri merupakan suatu molekul yang memiliki elektron yang tidak berpasangan.

Radikal bebas memiliki sifat reaktifitas tinggi, karena kecenderungan menarik elektron

dan dapat mengubah suatu molekul menjadi suatu radikal oleh karena hilangnya atau

bertambahnya satu elektron pada molekul lain. Radikal bebas akan merusak molekul

yang elektronya ditarik oleh radikal bebas tersebut sehingga menyebabkan kerusakan

sel, gangguan fungsi sel, bahkan kematian sel. Molekul utama di dalam tubuh yang

dirusak oleh radikal bebas adalah DNA, lemak dan protein (Suryohudoyo, 2000).

Bersamaan dengan bertambahnya usia maka akumulasi kerusakan sel akibat

radikal bebas semakin mengambil peranan, sehingga mengganggu metabolisme sel, juga

merangsang mutasi sel, yang akhirnya membawa pada kanker dan kematian. Selain itu

radikal bebas juga merusak kolagen dan elastin, suatu protein yang menjaga kulit tetap

lembab, halus, fleksibel dan elastis. Jaringan tersebut akan menjadi rusak akibat paparan

radikal bebas, terutama pada daerah wajah, dimana mengakibatkan lekukan kulit dan

kerutan yang dalam akibat paparan yang lama oleh radikal bebas (Goldman dan Klatz,

2007).

2.2 Anatomi dan Fisiologi Kulit

2.2.1 Anatomi dan fisiologi kulit manusia

Kulit terdiri dari tiga lapisan besar, yaitu epidermis, dermis dan hipodermis.

1. Epidermis

Epidermis merupakan lapisan berfungsi untuk proteksi, yang terdiri akan

keratinosit sebagai komponen yang terutama, kemudian melanosit, sel Langerhans, sel

Merkel dan akson yang tidak bermyelin.

Epidermis merupakan struktur yang terus memperbaharui diri secara kontinyu,

yang memberikan tempat tumbuh bagi struktur turunan yang disebut appendage

(kelompok pilosebaseus, kuku, dan kelenjar keringat). Ketebalan epidermis berkisar

antara 0,4 sampai 1,5 mm dibandingkan dengan kedalaman kulit 1,5 sampai 4,0 mm.

Sebagian besar epidermis terdiri dari sel keratinosit yang mengelompok menjadi empat

lapisan, yang diberi nama sesuai dengan posisi atau sel pembentuk strukturnya. Sel

tersebut berdiferensiasi progresif dari sel basal proliferatif, melekat dengan epidermal

membran basal, menuju diferensiasi akhir stratum korneum terkeratinisasi, yang

merupakan lapisan terluar dan barier kulit.

Dermal-epidermal junction adalah daerah membran basal yang membentuk

batas antara epidermis dan dermis. Fungsi utamanya adalah melekatkan antara

epidermis dan dermis sehingga memberikan resistensi terhadap bahaya dari luar.

Ini menunjang epidermis, membedakan polaritas pertumbuhan, organisasi

sitoskleton sel basal, memberikan sinyal pertumbuhan, dan bertindak sebagai

barier semipermiabel.

2. Dermis

Dermis terdiri dari kelenjar ekrin dan apokrin, folikel rambut, pembuluh

darah, syaraf dan jaringan halus dari serabut-serabut kolagen, serat-serat elastin

dan komponen-komponen lainnya dari matriks ekstraseluler.

Dermis merupakan sistem integrasi dari fibrus, filamentus, difus, dan

elemen seluler jaringan penghubung yang mengakomodasi saraf, jaringan

pembuluh darah, appendage epidermal, dan terdiri dari berbagai tipe sel, termasuk

fibroblas, makofag, sel mast, dan sel yang berperan pada sistem imun.

Dermis merupakan komponen terbesar pembentuk kulit sehingga

mempertahankan pliabilitas, elastisitas dan kekuatan peregangan kulit. Ini

melindungi tubuh dari trauma mekanik, mengikat air, dan berperan pada

termoregulasi, dan mengandung reseptor berbagai stimulus. Dermis bekerjasama

dengan epidermis dalam mempertahankan komponen masing-masing serta

berinteraksi dalam perbaikan dan pembentukan kembali kulit setelah perlukaan.

Dermis terdiri dari dua bagian, yaitu : papiler dermis dan retikuler dermis.

Kedua bagian tersebut dapat dibedakan secara histologis, dan keduanya berbeda

dalam hal organisasi jaringan penunjang, densitas sel, bentuk saraf dan pembuluh

darah. Papiler dermis berbatasan dengan epidermis, sedangkan retikuler dermis

terbentuk sebagian besar dari serat kolagen berdiameter besar, menyatu

membentuk rangkaian, cabang serat elastin mengelilingi rangkaian tersebut. Pada

orang normal, serat elastin dan rangkaian kolagen meningkat ukurannya secara

progresif sampai ke hipodermis. Bagian terbawah dari retikuler dermis dikatakan

transisi dari jaringan penunjang fibrus dengan jaringan penunjang lemak dari

hipodermis.

3) Hipodermis (subkutis)

Jaringan hipodermis menyekat tubuh, sebagai bantalan dan pelindung kulit,

dan memungkinkan mobilitas kulit dari jaringan di bawahnya. Jaringan ini juga

memberikan efek kosmetik dengan memberikan bentuk tubuh.

Kulit merupakan organ kompleks yang melindungi dari lingkungan, pada saat

bersamaan memungkinkan interaksi dengan lingkungannya. Kulit merupakan

perpaduan yang dinamis, kompleks, terintegrasi dari sel, jaringan, dan elemen

matriks yang memediasi berbagai fungsi, yaitu : kulit merupakan barier

permeabilitas fisik, menjaga dari agen infeksius, termoregulasi, proteksi sinar

ultraviolet, penyembuhan luka dan regenerasi, dan memberikan penampilan fisik

luar (Kochevar et al., 2008).

2.2.2 Kolagen

Kolagen merupakan komponen struktural penting pada jaringan pengikat kulit,

memberi kekuatan peregangan pada kulit. Sekitar 70-80% berat kering kulit terdiri dari

kolagen. Tipe kolagen yang paling banyak didapatkan di kulit adalah tipe I dan III, tipe I

ini membentuk sekitar 80% dari kolagen total yang terdapat di kulit dan tipe III sekitar

15% (Raitio, 2005).

Tipe kolagen lainnya yang ditemukan di dermis termasuk kolagen tipe IV, yang

banyak didapatkan pada membran dasar, kolagen tipe V, terletak pada periseluler,

kolagen tipe VI, berperan pada pembentukan matriks dan sebagai mikrofibril-mikrofibril

di antara serat-serat kolagen, dan kolagen tipe VII, merupakan komponen struktural dari

anchoring fibrils.

Sebuah molekul kolagen terdiri dari tiga rantai-α, yang dapat bergantian rantai

polipeptida yang sama maupun tidak sama. Sebagai contoh, kolagen tipe I terdiri dari

dua rantai α1(I) identik, yang disintesis dari gen yang sama, dan rantai α2(I), yang

disintesis oleh gen yang lain, sedangkan kolagen tipe III terdiri dari tiga rantai α1(III)

identik yang dikode oleh gen tunggal (Raitio, 2005). Pembentukan triple helix pada

molekul kolagen memerlukan glisin pada setiap asam amino ketiga pada rantai

polipeptida, yang menghasilkan suatu rangkaian Gly-X-Y, dimana X dan Y dapat berupa

asam amino apapun kecuali glisin. Asam amino esensial yang lain untuk pembentukan

struktur triple helix adalah prolin dan 4-hidroksiprolin. Prolin sering ditemukan pada

posisi X dan 4-hidroksiprolin pada posisi Y dari urutan asam amino.

Sintesis kolagen kulit terutama terjadi pada fibroblas. Sintesis dari kolagen

tersebut dibagi menjadi fase intraseluler dan ekstraseluler, yang kedua-duanya

melibatkan modifikasi post-translasi yang sangat diperlukan untuk pembentukan triple

helix dari molekul kolagen yang stabil, dengan cross-link yang tepat.

Modifikasi intraseluler termasuk juga hidroksilasi residu prolin pada posisi Y

menjadi 4-hidroksiprolin dan beberapa residu pada posisi X menjadi 3-hidroksiprolin

begitu juga hidroksilasi residu lisin pada posisi Y menjadi hidroksilisin (Myllyharju dan

Kivirikko 2001; Raitio, 2005). Askorbat sangat diperlukan dalam biosintesis dari kolagen

dan berperan sebagai kofaktor pada hidroksilasi prolin dan lisin. Glikosilasi dari residu

hidroksilisin dan asparagin juga terjadi pada intraseluler. Keduanya, baik hidroksilasi

maupun glikosilasi terus berlanjut sampai pembentukan triple helix yang diinginkan dari

molekul diperoleh.

Molekul prokolagen yang terbentuk intraseluler dikeluarkan ke ruang

ekstraseluler, dimana gugus amino dan gugus karboksi pada propeptida pada

prokolagen dipecah dan kemudian diblokir ujung-ujungnya oleh berbagai

endoproteinase yang spesifik (Raitio, 2005).

2.2.3 Elastin

Serat elastin sangat penting untuk kelentingan dan elastisitas kulit, meskipun

mereka ini hanya berjumlah sekitar 1-2% dari berat kering kulit (Raitio, 2005). Serat

elastis terdiri dari elastin, yang terhitung sekitar 90% dari serat yang matur, dan

komponen mikrofibriler, yang terletak di sekitar elastin dan berselang-seling di antaranya.

Serat elastin berhimpun pada dermis sebagai jaringan tiga dimensi (Lewis et al., 2004).

Elastin merupakan polipeptida yang berukuran sekitar 70kDa, yang dikode oleh

kopi suatu gen tunggal yang didapatkan pada kromosom 7. Elastin dan protein

mikrofibriler disintesis terutama oleh fibroblas (Lewis et al, 2004). Gen yang mengkode

elastin, mengkode tropoelastin, protein prekursor untuk elastin. Tropoelastin disintesis

intraseluler dan kemudian dikeluarkan ke ruang ekstraseluler, dimana cross-linking

terjadi (Raitio, 2005).

Faktor-faktor pertumbuhan dan berbagai sitokin mengambil bagian dalam

regulasi dari ekspresi gen dan biosintesis elastin. Ekspresi elastin diregulasi meningkat

secara invitro, contohnya, oleh insulin-like growth factor I dan transforming growth

factor β1. Sitokin-sitokin lainnya seperti tumor necrosis factor α (TNFα) dan interferon γ

(IFNγ) meregulasi turun akan ekspresi gen elastin (Raitio, 2005). Elastin dimetabolisme

oleh enzim-enzim proteolitik, seperti serine-type elastases dan matrix metalloproteinases,

yaitu stromelysin, macrophage metalloelastase (MMP-12), matrilysin (MMP-7) dan

gelatinase (MMP-2 dan MMP-9) yang paling aktif bagi serat elastis (Lewis et al., 2004).

2.2.4 MMP ( Matrix metalloproteinase )

Terdapat tiga famili besar dari protease yang merupakan komponen untuk

mendegradasi matriks ekstraseluler, yaitu serin, sistein dan metalloproteinases, mereka

ini sangat penting berperan dalam perbaikan jaringan dan inflamasi maupun dalam

invasi tumor dan metastase. Matrix metalloproteinases (MMPs) dan tissue inhibitors of

matrix metalloproteinases (TIMPs) meregulasi degradasi kolagen, elastin dan komponen

matriks ekstraseluler lainnya. Matrix metalloproteinases merupakan endopeptidase

netral yang tergantung zinc, yang terbagi menjadi empat grup utama tergantung pada

struktur primer dan spesifisitas substratnya, yaitu kolagenase, gelatinase, stromelysin

dan membrane-type matrix metalloproteinases (Raitio, 2005).

Kolagenase, MMP-1, MMP-8 dan MMP-13 merupakan proteinase utama yang

mampu memulai degradasi serabut kolagen tipe I, II, III dan V, tetapi 72-kDa gelatinase

(MMP-2) dan MT-1 MMP (MMP-14) juga mampu memotong serabut kolagen,

sedangkan 92-kDa gelatinase (MMP-9) berperan dalam degradasi akhir dari serabut

kolagen setelah proses pemotongan dan meregulasi re-epitelialisasi dari kulit (Mohan et

al., 2002). MMP-1 mendegradasi kolagen tipe III dengan kecepatan yang lebih cepat

daripada tipe I dan II, sedangkan MMP-8 mendegradasi kolagen tipe I dengan kecepatan

yang lebih cepat daripada tipe III (Raitio, 2005).

Proses penyembuhan luka dimulai dengan pembentukan fibrin clot, diikuti

dengan pelepasan berbagai macam faktor-faktor pertumbuhan dari sel-sel yang

mengalami cedera dan matriks ekstraseluler, inflamasi, pembentukan jaringan granulasi,

epitelialisasi dan pada akhirnya produksi matriks dan remodelling (Ravanti dan Kähäri,

2000). Re-epitelialisasi dimulai dalam beberapa jam setelah kerusakan jaringan, dan

manifestasi awalnya berupa proliferasi keratinosit. Sel epitelial yang baru terbentuk

bermigrasi pada membran dasar, dan jika memungkinkan akan menyebrang matriks

transien dari fibrin dan fibronektin disaat membran dasar sedang dalam perbaikan (Raitio,

2005).

Selama masa remodelling, matriks ekstraseluler yang sementara didegradasi dan

digantikan oleh kolagen. MMP-1 dan MMP-8 sangat penting berperan dalam regulasi

akan proses penyembuhan luka, sedangkan MMP lainnya, seperti MMP-2, MMP-9 dan

MMP-19, berperan juga pada perbaikan luka ( Mohan et al., 2002; Hieta et al., 2003).

MMP-1 ditandai dengan bermigrasinya keratinosit basal pada semua tipe luka

kutaneous dan penyempurnaan proses re-epitelialisasi menyebabkan menurunnya

ekspresi dari MMP-1 (Raitio, 2005).

2.2.5 Penuaan intrinsik kulit

Penuaan kulit intrinsik/kronologis meliputi segala perubahan yang terjadi pada

kulit akibat dari perjalanan waktu saja. Perubahan-perubahan ini terjadi sebagai bagian

dari hasil kumulasi kerusakan endogen dari pembentukan ROS (reactive oxygen species)

secara terus-menerus yang terbentuk selama metabolisme oksidasi seluler.

Pembentukan ROS merusak beberapa unsur seluler termasuk membran, enzim

dan DNA dan juga turut campur dalam interaksi antara DNA-protein dan protein-protein

meskipun dengan adanya sistem antioksidan seluler yang cukup rumit. Pemendekan

telomer pada pembelahan sel juga dikatakan salah satu penyebab penuaan intrinsik

kulit, selain oleh karena penurunan faktor pertumbuhan dan hormon. Manifestasi klinis

penuaan kronologis kulit dapat berupa serosis, kekenduran, kerutan dan gambaran

tumor jinak seperti keratosis seboroik dan angioma buah cherry (Gilchrest dan

Kurtmann, 2006).

2.3 Penurunan Fungsi Kulit yang Berkaitan dengan Bertambahnya Usia

2.3.1 Pergantian sel dan penyembuhan luka

Keratinosit meliputi 90% dari populasi sel di epidermis, dengan bertambahnya

waktu, mereka kehilangan kapasitas proliferatif, kemampuan berdiferensiasi dengan

tepat untuk membentuk stratum korneum yang bersifat protektif (Yaar dan Gilchrest,

2003) dan kemampuan untuk menguraikan sitokin-sitokin dan sinyal sel-sel lainnya pada

respon terhadap rangsangan lingkungan (Gilchrest dan Kurtmann, 2006).

2.3.2 Fungsi sensoris

Seiring dengan bertambahnya usia, terdapat penurunan sensori persepsi

cahaya, sensasi getar, kemampuan untuk membedakan dua titik dan ketajaman ruang

dan terjadi peningkatan ambang nyeri (Gilchrestdan Kurtmann, 2006). Beberapa

penelitian menunjukkan bahwa orang dengan usia 60 tahun atau lebih tua mengalami

penurunan densitas serat-serat saraf baik yang bermyelin maupun yang tak bermyelin

yang menjalarkan sensasi panas dan nyeri (Gibson dan Farrell, 2004).

2.3.3 Perbaikan kerusakan DNA

Telah tercatat dengan baik bahwa kerusakan DNA dan frekuensi terjadinya

mutasi meningkat dengan bertambahnya usia. Walaupun akumulasi mutasi dapat

merupakan hasil dari bertambahnya waktu itu sendiri, ada data yang mendukung bahwa

kapasitas perbaikan DNA menurun juga dengan bertambahnya usia. Bersamaan dengan

itu beberapa penelitian menunjuk pada menurunnya kemampuan perbaikan DNA

menjadi salah satu predisposisi dalam berkembangnya kanker pada orang tua (Gilchrest

dan Kurtmann, 2006).

2.3.4 Fungsi imunitas

Dengan bertambahnya usia, terdapat pengurangan jumlah sel Langerhans pada

epidermis, yang merupakan skin's immune antigen-presenting effector cells (Yaar dan

Gilchrest, 2003). Terdapat juga penurunan produksi dari sitokin epidermis interleukin

(IL)-1α dan begitu juga terjadi penurunan produksi sitokin-sitokin selanjutnya termasuk

IL-6, granulocyte-macrophage colony stimulating factor dan IL-8. Berbagai bukti juga

menunjukkan dengan bertambahnya usia, terjadi penurunan imunitas seluler dan

humoral. Penurunan pada sistem imunitas ini, menyebabkan orang tua lebih rentan

terkena infeksi (Mouton et al., 2001) dan sebagai akibat penurunan sistem kekebalan ini

memungkinkan kanker lebih mudah berkembang pada orang tua (Gilchrest dan

Kurtmann, 2006).

2.3.5 Produksi vitamin D

Epidemis kulit manusia berperan dalam pembentukan dari bentuk aktif vitamin

D, 1,25(OH)2D3 (Yaar dan Gilchrest, 2003). Disamping perannya dalam menjaga

homeostasis kalsium dan pemeliharaan tulang, 1,25(OH)2D3 juga terlibat dalam respon

imun, mempengaruhi fungsi makrofag dan memodulasi pelepasan sitokin inflamatori

(Gilchrest dan Kurtmann, 2006) dan mungkin pada pencegahan jenis kanker tertentu

yang berasal dari jaringan epitelial seperti payudara dan kolon (Lowe et al., 2003).

Dalam konteks ini perlu dicatat bahwa orang tua mengalami penurunan tingkat

vitamin D, sebagian dikarenakan penurunan konsumsi vitamin D pada diet mereka,

sebagian lainnya karena kekurangan paparan sinar matahari. Lebih jauh lagi tingkat dari

prekursor vitamin D pada epidermis, 7-dehydrocholesterol per unit skin surface

menurun secara linier mencapai 75% diantara dewasa muda sampai dewasa tua, diduga

dikarenakan kekurangan prekursornya, individu yang lebih tua gagal mensintesa dengan

jumlah yang cukup akan 1,25(OH)2D3 (Gilchrest dan Kurtmann, 2006).

2.3.6 Fungsi pertahanan dan proteksi mekanis

Kemampuan termoregulasi yang menurun menyebabkan orang tua dapat

menghadapi suatu kondisi yang mengancam jiwa termasuk heat stroke dan hipotermi.

Penurunan produksi keringat dengan bertambahnya usia menambah kemungkinan

orang tua mengalami heat stroke. Pada akhirnya, dengan menurunya androgen baik

yang dihasilkan oleh gonad maupun androgen, menyebabkan penurunan produksi

sebum mencapai 23% per dekade yang dimulai pada dekade kedua – terjadi penurunan

sekitar 60% selama masa hidup dewasa (Yaar dan Gilchrest, 2003).

2.4 Radikal Bebas

2.4.1 Definisi radikal bebas

Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki elektron yang tidak

berpasangan (unpaired electron). Radikal bebas memiliki sifat reaktifitas yang tinggi,

karena kecenderungannya menarik elektron dan dapat mengubah suatu molekul

menjadi suatu radikal oleh karena hilangnya atau bertambahnya satu elektron pada

molekul lain. Radikal bebas diproduksi secara endogen dan diperoleh pula secara

eksogen. Secara endogen, radikal bebas diproduksi oleh mitokondria, membran plasma,

lisosom, retikulum endoplasma dan inti sel. Secara eksogen, radikal bebas berasal dari

asap rokok, polutan, radiasi ultraviolet, obat-obatan dan pestisida (Suryohudoyo, 2000).

2.4.2 Tahapan pembentukan radikal bebas

Reaksi radikal bebas dapat dibagi menjadi tiga tahap (Setiati, 2003), yaitu:

1. Tahap inisiasi, yaitu tahapan yang menyebabkan terbentuknya radikal bebas.

Cu

RH + O2 R+ + HOO+

2. Tahap propagasi, yaitu tahap dimana radikal bebas cenderung bertambah

banyak dengan membuat reaksi rantai dengan molekul lain.

R+ + O2 ROO+

3. Tahap terminasi, yaitu apabila terjadi reaksi antara radikal bebas dengan radikal

bebas lain atau antara radikal bebas dengan suatu senyawa pembasmi radikal

(scavenger).

R+ + R+ R : R

Reduksi oksigen memerlukan pengalihan 4 elektron (electron transfer).

Pengalihan ini tidak dapat sekaligus, tetapi dalam 4 tahapan yang setiap tahapannya

hanya melibatkan pengalihan 1 elektron kendala yang mengharuskan oksigen hanya

dapat menerima satu elektron setiap tahap menyebabkan terjadinya dua hal, yaitu

kurang reaktifnya oksigen dan terbentuknya senyawa-senyawa oksigen reaktif seperti

O2- (ion peroksida), H2O2 (hidrogen peroksida), OOH- (radikal peroksil), dan OH-

(radikal hidroksil).

2.4.3 Sifat radikal bebas

Radikal bebas memiliki dua sifat, yaitu :

1. Reaktivitasnya tinggi, karena kecenderungannya menarik elektron.

2. Dapat mengubah suatu molekul menjadi suatu radikal

Sifat radikal bebas yang mirip dengan oksidan terletak pada kecenderungannya

untuk menarik elektron. Jadi sama halnya dengan oksidan, radikal bebas adalah

penerima elektron. Itulah sebabnya dalam kepustakaan kedokteran, radikal bebas

digolongkan dalam oksidan. Namun perlu diingat bahwa radikal bebas adalah oksidan

tetapi tidak setiap oksidan adalah radikal bebas. Radikal bebas lebih berbahaya

dibanding dengan oksidan yang bukan radikal. Hal ini disebabkan oleh kedua sifat radikal

bebas di atas, yaitu reaktivitas yang tinggi dan kecenderungan membentuk radikal baru,

yang pada gilirannya nanti apabila menjumpai molekul lain akan membentuk radikal

baru lagi, sehingga terjadilah reaksi rantai (chain reaction).

2.4.4 ROS (Reactive Oxygen Species)

Kulit merupakan organ tubuh yang terbesar, menyediakan suatu pertahanan

diantara tubuh dengan lingkungan, dan secara terus menerus terpapar oleh serangan

berbagai polutan lingkungan baik yang fisik maupun kimiawi (Athar, 2002). Sebagai

tambahan, sejumlah besar dari kontaminan dalam diet dan obat-obatan dapat

memberikan gejala toksisitasnya pada kulit (Sander et al., 2004). Bahan-bahan toksik

yang berasal dari lingkungan atau hasil metabolitnya yang melekat dengan oksidan

dan/atau secara langsung maupun tidak langsung mendorong produksi dari berbagai

oksidan reaktif yang juga dikenal sebagai reactive oxygen species (ROS). ROS merupakan

suatu senyawa yang hidupnya singkat yang terus terbentuk pada level yang rendah

selama proses metabolisme aerobik yang normal. Yang termasuk ROS adalah singlet

oxygen, anion superoksida, H2O2, radikal hidroksil, dan lain sebagainya (Bickers dan

Athar, 2006).

O2 dibentuk dengan memindahkan dari energi fisik atau kimia pada molekul

oksigen (O2), yang pada suhu ambien berlaku sebagai triplet dan paramagnetik. O2 tidak

memiliki elektron bebas dan ini merupakan oksidan yang sangat kuat. Langkah-langkah

yang berurutan dalam pengurangan elektron pada O2 menyebabkan terbentuknya O2-,

H2O2 dan OH-.

Reaksi radikal bebas berbeda dengan yang bukan radikal bebas, dalam hal

senyawa radikal bebas yang baru terbentuk menghasilkan sedikitnya satu produk dari

hasil reaksinya. Radikal bebas merangsang suatu reaksi yang biasanya beruntun.

Contohnya , berlaku sebagai donor elektron O2- dapat membawa pada pembentukan

OH- melalui reaksi Fenton yang dipicu oleh O2-, dan dengan interaksi dengan NO, dapat

menghasilkan peroksinitrit (ONOO-) yang sangat reaktif. Penerima elektron seperti

molekul oksigen siap bereaksi dengan radikal bebas sampai diri mereka sendiri menjadi

radikal bebas. Sumber tambahan dari radikal oksigen pada kulit sama halnya pada organ

yang lain menyusup masuk kedalam leukosit yang memiliki sistem yang berlimpah untuk

menghasilkan senyawa-senyawa radikal bebas tersebut, diantaranya O2- dan hipoklorit,

yang merupakan sumber ROS insitu.

Tujuan dasar dari pelepasan banyak ROS tersebut selama proses inflamasi

adalah untuk membunuh atau menghancurkan mikroorganisme yang menyerang

dan/atau untuk mendegradasi struktur jaringan yang rusak. Bukanlah target dari ROS

sehingga dapat menginduksi stres oksidatif pada sel normal yang berdampingan menuju

pada proses patologis (Bickers dan Athar, 2006).

ROS, baik yang dihasilkan oleh metabolisme seluler maupun yang berasal dari

lingkungan luar, dapat mengubah struktur asam amino yang cukup untuk menghasilkan

hilangnya fungsi. Oksidasi juga dapat memecah rantai polipeptida secara langsung dan

menyebabkan ikatan saling silang dari peptida dan protein (Stadtman, 2001). Protein

karbonil, yang menjadi tanda akan oksidasi protein yang diperantarai ROS, dibentuk baik

oleh pembelahan oksidatif protein atau dengan oksidasi secara langsung akan residu

lisin, arginin, prolin dan treonin (Stadtman, 2001). Pada akhirnya ROS juga dapat

menyebabkan modifikasi asam amino yang spesifik, 'sidik jari', yang menghasilkan

perubahan pada struktur dan fungsi enzimatis protein.

Paparan pada kulit yang menyebabkan terjadinya ionisasi dan radiasi UV

dan/atau xenobiotik/obat-obatan menghasilkan ROS dalam jumlah yang banyak dengan

cepat membanjiri antioksidan jaringan dan jalur-jalur pendegradasi oksidan lainnya.

Pelepasan ROS yang tidak terkontrol ikut berperan pada patogenesis terjadinya

sejumlah gangguan kulit pada manusia termasuk di antaranya adalah neoplasma

kutaneus (Briganti dan Picardo, 2003; Black, 2004b).

Agen-agen yang menyebabkan stres oksidatif pada kulit termasuk polutan yang

berada pada udara lingkungan yang dihasilkan oleh asap kendaraan bermotor atau

pabrik-pabrik, radiasi UV, kontaminan/zat tambahan/pengawet pada makanan, produk-

produk kosmetik, obat-obatan, asap rokok, dan lain sebagainya (Athar, 2002).

Selanjutnya, jalur yang diperantarai heme mungkin memiliki efek pro-oksidan, dimana

heme oksigenase, enzim yang mendegradasi heme, dapat berfungsi baik sebagai

antioksidan maupun pro-oksidan (Ryter dan Tyrell, 2000). Beberapa dari agen-agen ini

secara intrinsik menghasilkan ROS ataupun metabolit-metabolitnya seperti reaksi redoks

mengaktifkan quinone dan beberapa di antaranya berperan pada patogenesa dari

berbagai gangguan/reaksi alergi/neoplasma kulit (Briganti dan Picardo, 2003; Black

2004; Sander et al., 2004).

Penelitian-penelitian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa paparan pada

kulit akan berbagai agen-agen kimiawi ataupun fisik merangsang terjadinya stres

oksidatif yang membawa pada induksi peroksidasi lipid kutaneus seiring dengan

modulasi pada tingkat antioksidan dan enzim-enzim yang memetabolisme obat-obatan

(Bickers dan Athar, 2006). Pada penelitian selanjutnya, menunjukkan bahwa ROS

menginduksi sejumlah faktor-faktor transkripsi seperti activator protein 1 (AP-1) dan NF-

κB (Dhar et al., 2002). Telah diketahui bahwa O2- dapat memulai proses penyampaian

sinyal pada c-jun N-terminal kinase (JNK), yang menyebabkan induksi pada kolagenase

interstitial sama halnya dengan sintesis sitokin-sitokin proinflamasi seperti IL-1 dan IL-6

pada fibroblas yang diberikan radiasi UVA (Bickers dan Athar, 2006).

Diantara senyawa-senyawa oksigen reaktif, radikal hidroksil merupakan

senyawa yang paling berbahaya karena reaktivitasnya sangat tinggi. Radikal hidroksil

dapat merusak tiga jenis senyawa yang penting untuk mempertahankan integritas sel,

yaitu:

1. Asam lemak, khusus asam lemak tak jenuh yang merupakan komponen penting

fosfolipid penyusun membran sel.

2. DNA, yang merupakan perangkap genetik sel.

3. Protein, yang memegang berbagai peran penting seperti enzim, reseptor,

antibodi, dan pembentuk matriks serta sitoskeleton.

2.5 Rokok

Merokok tembakau merupakan penyebab morbiditas yang cukup tinggi dan

menurut data pada tahun 1996 didapati merokok bertanggung jawab atas lebih dari 3

juta kematian di seluruh dunia setiap tahunnya. Merokok merupakan penyebab

morbiditas dan mortalitas yang bisa dihindari. Selain mempunyai hubungan yang kuat

dengan kanker paru-paru, emfisema, penyakit kardiovaskuler, penyakit dalam yang

serius, kanker, merokok juga menyebabkan berbagai gangguan dermatologis, seperti

proses penyembuhan yang jelek, penuaan dini kulit, karsinoma skuamous sel,

melanoma, kanker mulut, jerawat, psoriasis dan kerontokan rambut (Morita, 2007a).

2.5.1 Kandungan kimia rokok

Rokok terdiri dari gabungan bahan kimia yang sangat kompleks yaitu bahan

kimia non spesifik dari pembakaran bahan-bahan organik dan bahan kimia yang spesifik

dari pembakaran tembakau dan komponen lain dari rokok seperti nitrosamin spesifik

tembakau (Fowles dan Bates, 2000).

Telah diperkirakan bahwa ada lebih dari 4000 kandungan kimia dalam asap

tembakau. Ada sekitar 400 telah diukur dalam asap utama dan asap sampingan. Dari

sekitar 400 senyawa, ada sekitar 100 yang bersifat toksik (Fowles dan Bates, 2000).

Beberapa bahan kimia pada rokok menurut Fowles dan Bates (2000) adalah:

2.5.1.1 Nikotin

Nikotin merupakan zat utama dalam daun tembakau. Zat ini adalah alkaloid

beracun yang merupakan senyawa organik dan terdiri dari karbon, hidrogen, nitrogen

dan oksigen (Wang, 2000). Zat ini biasanya digunakan sebagai bahan racun serangga.

Nikotin berwarna kuning pucat, bila terkena udara atau cahaya perlahan-lahan

menjadi coklat. Bau dan rasa tidak enak serta bersifat toksis (Martindale, 1979).

Nikotin merupakan amin tersier yang terdiri dari cincin pyridin dan cincin

pyrolidin. Ini merupakan basa lemah, yang mampu melewati membran sel dalam bentuk

unionized. Nikotin berikatan dengan reseptor asetilkolin pada ganglion otonomik,

medula adrenal, neuromuscular junction dan otak. Rangsangan pada reseptor nikotinik

menyebabkan pengeluaran katekolamin, dopamin, serotonin, vasopresin, hormon

pertumbuhan dan ACTH (Benowitz, 1988).

Nikotin mempunyai sifat sangat menyebabkan ketergantungan (adiksi) dan telah

diketahui bahwa perokok dapat mempertahankan kadar nikotin dalam sirkulasi

darahnya dengan mengatur kedalaman dan frekuensi dari isapan, tergantung pada

jumlah nikotin yang ada pada rokok. Sesuai dengan faktanya bahwa perokok merokok

beberapa kali dalam sehari, terjadi akumulasi nikotin dalam tubuh perokok (Jacob et al.,

1999). Nikotin banyak di metabolisme oleh hati, sebagian melalui jalur sitokrom P450

dan hanya 5-10% diekskresikan melalui urin (Benowitz, 1996)

2.5.1.2 Tar

Tar didefinisikan sebagai nikotin bebas kering , berwarna coklat, berbau tidak

sedap dan berupa partikulat yang terbentuk selama pemanasan tembakau pada rokok

(Fowles dan Bates, 2000). Fraksi partikulat dari asap rokok mengandung banyak bahan

berbahaya diantaranya logam berat ( Cd, Hg, Pb ), poliaromatik hidrokarbon, dan

nitrosamin yang tidak mudah menguap.

2.5.1.3 Gas

Beberapa bahan kimia asap rokok ditemukan dalam fase gas seperti karbon

monoksida (CO) dan benzene yang dikeluarkan dalam konsentrasi tinggi. Gas lain yang

terbentuk selama reaksi pembakaran rokok dengan O2 adalah CO, NO2, SO2 dan H2O

(Fowles dan Bates, 2000).

Benzene adalah salah satu anggota dari hidrokarbon aromatik yang merupakan

cairan tidak berwarna , jernih, mudah menguap dan larut dalam air. Senyawa ini

merupakan kontaminan lingkungan dan telah diidentifikasi oleh IARC sebagai

karsinogen. Sumber utama benzene berasal dari gas pembuangan kendaraan bermotor,

bahan bakar kendaraan dan asap rokok. Benzene dalam asap rokok merupakan produk

dari reaksi pirolisa (Fowles dan Bates, 2000).

Karbon monoksida adalah gas tidak berwarna, tidak berbau, dan diproduksi oleh

segala proses pembakaran yang tidak sempurna dari bahan-bahan mengandung karbon

(Fowles dan Bates, 2000).

Gas nitrogen oksida (NOx) yang merupakan gas buangan hasil dari pembakaran

terdiri dari gas nitrogen monoksida (NO) dan gas nitrogen dioksida (NO2). Kedua macam

gas tersebut mempunyai sifat berbeda dan berbahaya bagi kesehatan. Gas NO

merupakan gas tidak berwarna dan tidak berbau. Gas NO2 berwarna merah kecoklatan

dan berbau tajam menyengat hidung (Wardhana, 1995).

Tembakau / asap tembakau juga mengandung nitrosamin, polynuclear aromatic

hydrocarbon (PAH), klorin dioksin, furan, fenol, karbonil dan zat radioaktif; yang

memberikan efek negatif pada tubuh.

2.6 Merokok dan Kulit

Kejadian terjadinya kerut yang prematur ditemukan sebagai kejadian yang

mempunyai hubungan secara bebas antara paparan sinar matahari dan jumlah pak rokok

per tahun. Pada penelitian akhir-akhir ini, beberapa faktor yang mengacaukan, seperti

usia dan paparan sinar matahari telah diperhitungkan (Yin et al., 2001).

Perokok berat sigaret memiliki 4,7 kali lebih berkerut daripada yang bukan

perokok, dan bagi mereka yang memiliki riwayat terpapar sinar matahari secara

berlimpah, memiliki resiko yang meningkat 3,1 kali lipat dalam memiliki kerut yang lebih

luas. Penelitian lain yang dilakukan oleh Ernster pada tahun 1995 tentang kerutan pada

wajah yang diperoleh dari 227 kelompok yang tidak pernah merokok, 456 orang yang

pernah merokok dan 228 orang yang masih merokok, mendukung penemuan bahwa

terjadi kenaikan resiko timbulnya kerutan pada perokok (Ernster et al, 1995).

Gambar 2.1 Mekanisme Molekuler dari Penuaan Kulit Dini yang Diinduksi Asap

Tembakau

Ernster, dkk melaporkan dengan mengendalikan faktor usia, paparan sinar

matahari dan indeks massa tubuh, resiko menderita kerut dari sedang sampai dengan berat

pada perokok dengan pembanding bukan perokok memiliki rasio 2,3 bagi laki-laki dan

3,1 bagi perempuan. Resiko munculnya kerut juga meningkat pada perempuan yang

dulunya pernah merokok (Ernster et al, 1995). Kemungkinan hubungan antara banyaknya

kerutan pada wajah pada perokok dengan efek samping sistemik dari merokok, seperti

stroke, telah dilakukan evaluasi (Morita, 2007a).

Pada suatu penelitian 40 perokok dan 40 bukan perokok, dari setengah yang

menderita stroke, perokok didapati memiliki kerutan wajah yang lebih tinggi

dibandingkan dengan bukan perokok, tetapi derajat dari kerutan pada wajah tidak

berkorelasi dengan kejadian terjadinya penyakit kardiovaskuler pada baik perokok

maupun bukan perokok (Aizen dan Gilhar, 2001).

Pada beberapa penelitian, peningkatan kerut secara signifikan berhubungan

dengan jumlah pak rokok pertahun yang dikonsumsi. Perokok berat dengan disertai

tingkat terkena paparan sinar matahari yang cukup tinggi mempunyai resiko yang jauh

lebih besar untuk memiliki kerutan, dengan resiko sekitar 11-12 kali lebih tinggi

dibandingkan dengan bukan perokok (Yin et al., 2001).

Pada suatu survei di AS tentang kewaspadaan publik akan hubungan antara

merokok dan penuaan kulit, berdasar wawancara yang dilakukan melalui telepon,

didapati bahwa bukan perokok dan orang yang dulunya perokok memiliki kesadaran

yang lebih akan efek merokok terhadap penampilan fisik daripada perokok. Temuan

yang cukup menarik adalah hampir seperempat dari perokok percaya bahwa beberapa

atau bahkan sebagian besar perokok akan berhenti dari kebiasaan merokoknya jika

mereka tahu bila dengan merokok meningkatkan penuaan kulit wajah dan kerutan

wajah. Penulis menekankan bahwa pendidikan kesehatan sangatlah penting sesuai

dengan survei ini dan mengusulkan kesempatan yang cukup unik bagi para dermatologis

untuk berperan serta pada program pencegahan kanker dan penghentian merokok

(Demierre et al., 1999).

2.6.1 Efek yang diakibatkan oleh merokok pada jaringan ikat kulit secara in vivo dan

in vitro

Serat-serat elastis yang abnormal pada perokok berat telah dilaporkan oleh

Frances dkk, Perancis, yang menemukan serat elastis pada kulit perokok berjumlah lebih

banyak, lebih tebal dan lebih terfragmentasi dibanding dengan kulit bukan perokok.

Perubahan pada serat elastis ini juga didapati pada serat elastis yang rusak akibat dari

paparan sinar matahari, yang mengenai seluruh bagian dermis, kecuali bagian papiler

dermis tidak terpengaruhi pada kulit perokok. Menurut penulis, letak kerusakan serat

elastis yang terjadi akibat merokok mungkin berhubungan dengan penyebaran melalui

vaskuler akan bahan-bahan toksik dari rokok sigaret (Raitio, 2005).

Efek dari asap tembakau pada kelarutan dan saling-silang dari kolagen telah

diteliti sebelumnya. Penurunan yang tergantung pada dosis terjadi pada kelarutan

kolagen seiring dengan penurunan pada kandungan lisin dan hidroksilisin, disertai

dengan kerentanan kolagen terhadap kolagenase, telah diamati. Lebih lanjut, satu

kelompok dari Denmark Jorgensen dkk pada tahun 1998 melaporkan penurunan

produksi kolagen pada kulit perokok (Raitio, 2005).

Sebuah polytetrafluoroethylene subkutan, model penyembuhan luka yang

digunakan untuk menentukan deposisi protein total dan kolagen matur di subkutis. Para

perokok memiliki median yang lebih kecil secara signifikan dari jumlah hidroksiprolin

pada kulitnya dibanding dengan bukan perokok, dan deposisi hidroksiprolin memiliki

hubungan negatif dengan konsumsi sigaret. Komponen-komponen yang mudah menguap

dari ekstrak asap sigaret telah menunjukkan dapat mempengaruhi kontraksi kolagen gel

secara invitro, yang dapat menjadi faktor penghambat perbaikan lukan pada perokok

(Raitio, 2005).

Penelitian kultur sel pada fibroblas kulit manusia telah menunjukkan gangguan

pada turnover matriks ekstraseluler setelah paparan ekstrak asap tembakau, yang

menginduksi ekspresi mRNA dari matrix metalloproteinase MMP-1 dan MMP-3, dan

ekspresi protein MMP-1, tetapi tidak berpengaruh ekspresi dari TIMP-1 ( tissue

inhibitors of matrix metalloproteinase) dan TIMP-3, yang berakibat terjadinya degradasi

matriks ekstraseluler, termasuk kolagen, elastin dan proteoglikan. Telah dibuktikan

produksi kolagen tipe I dan III menurun setelah paparan terhadap ekstrak asap

tembakau (Yin et al., 2000).

2.7 Antioksidan dan Kulit

Penuaan kulit merupakan proses biologis yang kompleks yang termasuk

didalamnya penuaan intrinsik dan ekstrinsik. Penuaan intrinsik mempengaruhi kulit pada

cara yang sama sebagaimana pada organ-organ lainnya. Proses yang memperberat,

berasal dari faktor lingkungan, seperti asap tembakau dan radiasi ultraviolet yang

berperan terhadap terjadinya penuaan ekstrinsik. Kulit manusia normal bergantung

pada keseimbangan antara biosintesis dan degradasi akan matriks ekstraseluler.

Telah dilakukan penelitian untuk menentukan peran pemadam singlet oxygen

yang poten yaitu sodium azide (NaN3), l-ascorbic acid, dan vitamin E dalam

menghambat aktivitas reactive oxygen species (ROS) yang berasal dari ekstrak asap

tembakau yang terlibat dalam peningkatan produksi MMP. Pada penelitian ini terbukti

NaN3, l-ascorbic acid dan vitamin E menghambat induksi MMP setelah rangsangan pada

fibroblas dengan ekstrak asap tembakau. Oleh karena itu terlihat bahwa ROS

nampaknya merupakan faktor mayor yang bertanggung jawab dalam meng-induksi

MMP pada perlakuan dengan ekstrak asap tembakau (Yin et al., 2000).

Berbagai antioksidan enzimatik dan non-enzimatik melindungi kulit dari

kerusakan oksidatif pada kulit yang terpapar oleh asap tembakau. Enzim yang

memperbaiki trauma oksidasi pada kulit diantaranya superoksid dismutase, katalase dan

tioreduksin dismutase, begitu juga antioksidan alamiah lainnya seperti vitamin A, C, E

dan glutation, berperan langsung untuk mencegah kerusakan akibat radikal oksigen.

2.8 Asam α-lipoat

Asam α-lipoat, pertama kali diisolasi pada tahun 1951 oleh Reed dkk sebagai

agen katalis yang berhubungan dengan piruvat dehidrogenase, dikenal dengan berbagai

nama, termasuk 2-dithiolane-3 pentanoic acid; 1,2-dithiolane-3 valeric acid; dan thioctic

acid (Packer, 1995). Sejak awal telah diklasifikasikan sebagai vitamin, meskipun, setelah

itu asam α-lipoat ditemukan bahwa ini disintesa oleh hewan dan manusia. Meskipun jalur

enzim untuk terbentuknya asam α-lipoat ini masih belum dapat sepenuhnya dijelaskan,

sistein nampaknya menjadi sumber dari sulfur dan oktanoat sebagai prekursor intermediet

untuk 8-carbon fatty acid (Nichols, 2001).

Asam α-lipoat ini dapat dengan mudah berubah menjadi bentuk tereduksinya,

asam dihidrolipoat atau dihydrolipoic acid (DHLA), pada banyak jaringan tubuh.

Struktur bangun Asam α-lipoat dan DHLA

Asam α-lipoat

S S

CH2 CH2 CH2 CH2

CH2 CH2 CH2 COOH

DHLA

SH SH

CH2 CH2 CH2 CH2

CH2 CH2 CH2 COOH

Asam α-lipoat cukup unik dengan memiliki kemampuan berperan sebagai

antioksidan dalam jaringan larut lemak maupun air, didalam bentuk teroksidasi maupun

tereduksi. Asam α-lipoat juga sangat mudah diserap melalui konsumsi lewat oral. Oleh

karena keuntungan-keuntungan ini dan toksisitas-nya yang rendah, asam α-lipoat

mendapatkan perhatian yang meningkat dari para peneliti sebagai agen terapeutik yang

efektif dan potensial pada berbagai kondisi klinis yang berhubungan dengan kerusakan

akibat radikal bebas. Lester Packer, PhD, dari University of California di Berkeley,

menyarankan asam α-lipoat sebagai kandidat antioksidan ideal karena perannya sebagai

berikut : spesifitas dalam memadamkan radikal bebas, aktivitas meng-kelasi logam,

interaksi dengan antioksidan lainnya dan beberapa efek pada ekspresi gen (Nichols,

2001).

Fungsi dari asam α-lipoat sebagai antioksidan ditemukan pada tahun 1959 oleh

Rosenburg dan Culik, yang melaporkan bahwa asam α-lipoat dapat mencegah gejala

scurvy pada babi dengan defisiensi vitamin C dan pada tikus yang defisiensi vitamin E

dengan diet yang kurang α-tokoferol. Podda dkk melaporkan bahwa asam α-lipoat

mencegah gejala defisiensi vitamin E pada tikus yang diberikan diet yang kurang akan

vitamin E, meskipun, asam α-lipoat tidak memiliki efek dalam mempertahankan

konsentrasi vitamin E dalam jaringan (Packer, 1995). Bukti eksperimen menunjukkan

pengurangan optimal akan dehidroaskorbat menjadi asam arkobat dapat diperoleh dengan

adanya piruvat, asam α-lipoat dan ATP (Nichols, 2001).

Asam α-lipoat memiliki potensial redoks yang rendah dan melalui bentuk

tereduksinya, DHLA, sangat mudah memberikan elektronnya ke senyawa lainnya. Asam

askorbat dan vitamin E secara tidak langsung, diperbaharui oleh DHLA disebut fungsi

recycle, karena dapat mengubah dehydroascorbate menjadi asam askorbat, sehingga

dapat menjalankan fungsi antioksidannya kembali (Jones et al, 2002). Busse et al

menemukan asam α-lipoat dapat meningkatkan glutathione dalam intraseluler. DHLA

juga dapat memperbaharui Coenzym Q10 dan NADPH atau NADH melalui glutathione

(Nichols, 2001).

Para ahli dalam persetujuan umum bahwa asam α-lipoat mampu memakan

radikal hidroksil, asam hipoklor dan singlet oxygen tetapi tidak dengan peroksida

hidrogen, peroksil dan superoksida. DHLA merupakan antioksidan dan juga prooksidan

pada penelitian dimana radikal hidroksil dihasilkan. Ini melindungi dari pemutusan

untaian tunggal DNA yang diinduksi oleh singlet oxygen, meskipun ini berlangsung

secara tidak langsung dan beberapa langkah mungkin terlibat pada proses ini. Sandhya et

al menyatakan bahwa asam α-lipoat bekerja dengan cara yang tergantung pada dosis

pada perannya sebagai agen pelindung nephron melawan toksisitas yang diinduksi

gentamicin pada suatu eksperimen (Nichols, 2001).

Vitamin E

α-tocopherol

α-tocotrienol

ROO

ROOH Ubiquinone

NADH

NADPH

succinate

Ubiquinol

Dihydrolipoic acid Dehydroascobate

Glutathione

α-ketodehydrogenase

NADH

α-lipoic acid Ascorbate

Glutathione disulfide

Vitamin E

Radical

Gambar 2.2 Skema Kerja Asam α-lipoat

Asam α-lipoat tampaknya mampu meng-kelasi logam transisi pada sistem

biologis. Sigel melaporkan asam α-lipoat membentuk kompleks yang stabil dengan ion-

ion tembaga, mangan dan zinc. Kemampuan untuk meng-kelasi besi tetap belum jelas

(Packer, 1995).

Tikus dilindungi dari keracunan arsen dengan pemberian asam α-lipoat ketika

rasio dari asam α-lipoat terhadap arsen paling sedikit 8:1. Perlindungan terjadi meskipun

pemberian asam α-lipoat setelah gejala keracunan yang berat telah ada, telah dilaporkan

oleh Grunert (Nichols, 2001).

Bukti yang ada menduga asam α-lipoat dapat meng-kelasi tembaga. Ou dkk

melaporkan R-enantiomer dan campuran rasemik tampaknya lebih efektif dibanding

dengan S-enantiomer pada uji kadar logam yang dihasilkan dari efek kelasi logam. Pada

isoloasi hepatosit, asam α-lipoat didapati mengurangi toksisitas yang diinduksi

cadmium, meskipun DHLA lebih efektif (Ou, 1995).

Sumanthi dkk juga melaporkan asam α-lipoat memberikan proteksi pada hepar

melawan keracunan cadmium, meskipun dalam kondisi yang kekurangan glutathione

secara eksperimental. Pada model tikus, dosis 30 mg akan asam α-lipoat secara penuh

mencegah peroksidasi lipid yang diinduksi oleh cadmium pada otak, jantung, dan testis.

Menurut Keith melalui eksperimen in-vitro yang telah dilakukannya menyatakan bahwa

asam α-lipoat, yang bukan merupakan chelating agent yang paling efektif, akan

menyingkirkan merkuri dari potongan renal (Nichols, 2001).

Asam α-lipoat memiliki LD50 pada dosis 400-500 mg/kg dengan kategori

pemberian dosis tinggi pada dosis 20 mg/kg.

BAB III

KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1 Kerangka Berpikir

Bertambahnya usia akan mengakibatkan terjadinya penurunan berbagai fungsi

organ tubuh dan perubahan fisik, baik tingkat seluler, organ maupun sistem. Ini semua

diakibatkan karena proses penuaan. Ada banyak faktor yang menyebabkan orang

menjadi tua melalui proses penuaan, dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok

utama, yaitu faktor internal dan faktor eksternal. Beberapa faktor internal yaitu radikal

bebas, hormon yang berkurang, proses glikosilasi, metilasi, apoptosis, sistem kekebalan

yang menurun dan gen. Faktor eksternal meliputi gaya hidup yang tidak sehat,

kebiasaan yang salah, polusi lingkungan, bahan kimia, radiasi ultraviolet, obat-obatan,

stres dan rokok.

Kerangka konsep penelitian ini didasarkan pada teori dan hasil penelitian bahwa

paparan asap rokok dapat menimbulkan kerusakan kulit. Kerusakan kulit yang terjadi

akibat paparan asap rokok tersebut dapat ditandai dengan kerutan dan peningkatan

enzim MMP-1, yaitu enzim yang mendegradasi kolagen. Proses ini dimulai dengan

terbentuknya radikal bebas pada kulit setelah paparan asap rokok yang merusak

struktur kulit mulai dari DNA, membran sel, dan protein.

Asam α-lipoat berperan sebagai antioksidan yang dapat mencegah kerusakan

oleh radikal bebas akibat paparan asap rokok pada kulit dengan mengikat (singlet

oksigen dan mencegah peroksidasi lipid).

3.2 Konsep Penelitian

Berdasarkan perumusan masalah dan kajian pustaka maka disusunlah konsep penelitian

sebagai berikut :

3.3 Hipotesis Penelitian

Berdasarkan kerangka konsep, maka hipotesis yang dapat diajukan adalah

Pemberian asam α-lipoat dapat menurunkan ekspresi MMP-1 pada kultur

Asam α-lipoat dan Ekstrak Asap Rokok

Faktor internal

Radikal bebas

Hormon yang menurun Glikosilasi

Metilasi Apoptosis

Penurunan Sistem Kekebalan Tubuh

Faktor eksternal

Stress

Polusi lingkungan

Kultur Fibroblast

Ekspresi MMP-1

F

I

B

R

O

fibroblast yang terpapar ekstrak asap rokok.

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental, dengan rancangan

penelitian yang digunakan adalah Posttest only control group design pada

penelitian in vitro dengan subyek kultur fibroblast (Campbell, 1963).

Penelitian in vitro, dilakukan dengan menggunakan kultur sel fibroblast,

dimana sel fibroblast diberikan asam α-lipoat dengan variasi 3 dosis 50μg/hr,

100μg/hr, dan 200μg/hr dan selanjutnya diberikan ekstrak asap rokok dengan

variasi dosis 50μl/ml, 25μl/ml, dan 12,5μl/ml. Supernatan dari kultur sel

fibroblast dikumpulkan setelah 24 jam dan nilai MMP-1 diamati dengan

menggunakan MMP-1 Human enzyme-linked immunsorbent assay ( ELISA ) kit.

P0

K K1 P1

K2 P2

P S R K K3 P3

K4 P4

K5 P5

K6 P6

K7 P7

K8

P8

K K9 P9

K10 P10

K11 P11

K12 P12

K13

Bagan 4.1 Skema Rancangan Penelitian in vitro

Keterangan :

P = Populasi

S = Sampel

R = Random

K = MMP-1 di awal, sebelum diberikan perlakuan

K1 = MMP-1 kelompok kontrol yang tidak dipapar ekstrak asap rokok di

akhir penelitian

K2 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 50μl/ml

K3 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 25μl/ml

K4 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 12,5μl/ml

K5 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 50μl/ml dan

pemberian asam α-lipoat 50μg/hr











K11 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 12,5μl/ml dan






P0 = Tidak ada perlakuan

P1 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 50μl/ml

P2 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 25μl/ml

P3 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 12,5μl/ml

P4 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 50μl/ml pada kelompok dengan





pemberian α-lipoic acid 200μg/hr







P10 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 12,5μl/ml pada kelompok

dengan pemberian asam α-lipoat 50μg/hr





4.2 Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu

Universitas Gajah Mada dan Laboratorium Bagian Kulit dan Kelamin Fakultas

Kedokteran Universitas Gajah Mada.

4.3 Subyek dan Sampel

4.3.1 Variabilitas populasi

Populasi pada penelitian in vitro adalah fibroblast yang diisolasi dari kulit

preputium penis ( post sirkumsisi ) anak berusia 6-10 tahun yang sehat, sesuai

dengan prosedur yang telah ditetapkan di LPPT Universitas Gajah Mada. Jumlah

spesimen jaringan kulit preputium penis diambil sebanyak 5 spesimen, yang

nantinya dipilih yang terbaik kondisinya.

4.3.2 Besaran sampel

Pada penelitian in vitro perhitungan jumlah sampel dihitung dengan rumus

Federer (1963)

Rumus : ( n-1 )( k-1 ) ≥ 15

n = jumlah sampel (mewakili pengulangan perlakuan pada kelompok sampel)

k = jumlah kelompok perlakuan (kelompok perlakuan yang diberikan sebanyak

13)

sehingga didapatkan hasil : ( n-1 )( 13-1 ) ≥ 15 n = 2,25 ( 3 )

Jadi jumlah sampel yang diperlukan sebanyak 4 pada masing-masing kelompok

perlakuan.

4.4 Variabel

4.4.1 Klasifikasi variabel

a. Variabel bebas : dosis asam α-lipoat dan dosis ekstrak asap rokok

b. Variabel tergantung : ekspresi MMP-1

c. Variabel kendali : media kultur dan sel fibroblast

4.4.2 Definisi operasional variabel

1. Dosis asam α-lipoat adalah jumlah asam α-lipoat yang diberikan sebagai

bahan uji (dengan menggunakan bahan aktif asam α-lipoat yang

diproduksi oleh Ferron Pharm) dengan dosis 50μg/hr, 100μg/hr dan

200μg/hr pada kelompok perlakuan dengan asam α-lipoat, sebelum

diberikan perlakuan paparan ekstrak asap rokok.

2. Pembuatan ekstrak asap rokok

Pada suhu ruang, ekstrak asap tembakau dihasilkan dengan melewatkan

asap dari rokok melalui phosphate-buffered saline (PBS). Dua tabung yang

berisi 20 ml PBS digunakan pada sistem ini. Satu sisi dari tabung ( A )

dihubungkan ke pompa, dan tabung yang lain ( B ) dihubungkan ke rokok.

Satu buah rokok ( dengan kertas dan filter ) dipompa selama 2 detik

dengan interval 1 menit. Kemudian larutan asap dari kedua tabung (

A+B= 40 ml ) dikumpulkan dan disesuaikan pH-nya menuju 7,4 dengan

cairan natrium bikarbonat dan disaring dengan menggunakan filter 0,22-

μm ( Millipore Co., Bedford. Mass. )

3. Dosis ekstrak asap tembakau adalah jumlah kadar ekstrak asap rokok yang

diberikan pada kultur sel fibroblast, dengan konsentrasi 50μl/ml, 25μl/ml

dan 12,5μl/ml. Pemberian ekstrak asap rokok dilakukan 1 kali pada

masing-masing kelompok perlakuan.

4. Nilai ekspresi MMP-1 adalah nilai ekspresi MMP-1 pada supernatan

kultur sel fibroblast yang dikumpulkan 24 jam setelah paparan dengan

variasi dosis ekstrak asap rokok pada seluruh kelompok perlakuan dan

kelompok kontrol, dinyatakan dengan satuan ng/gram dari protein seluler

menggunakan human enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA ) kit.

4.5 Bahan dan Instrumen Penelitian

4.5.1 Bahan Utama

Bahan utama yang digunakan adalah bahan dasar asam α-lipoat, kit MMP-1, dan

ekstrak asap rokok.

4.5.2 Bahan Penunjang

Bahan penunjang yang digunakan pada proses kultur fibroblast ini adalah Media

RPMI 1640 ( dengan glutamine, tanpa sodium bicarbonate ), Fetal Bovine Serum

( FBS ), Media Komplit 20% ( FBS 20 ml, penicillin streptomycin 2 ml,

fungisone 0,5 ml, ditambahkan Media RPMI sampai dengan 100 ml ), Phosphat

Buffer Saline ( PBS ), Trypsin.

4.5.3 Instrumen Penelitian

Instrumen yang digunakan dalam penelitian ini adalah :

1. Laminar Air Flow safety class II ( Labconco )

2. Inkubator CO2 ( Memmer )

3. Mikroskop inverted ( Leitz )

4. Mikroskop binokuler ( Olympus )

5. ELISA Reader ( Bio Rad 680 XR )

6. Sentrifuge 1500 rpm

7. Tissue Culture Flask

8. Petri kecil dan besar

9. Well Plated 8x12 ( 96 wadah )

10. Tabung sentrifuge 15 ml, conicle tube Eppendorff beserta raknya

11. Pipet mikro ( ukuran 20μl , 50-200μl , 100-1000μl )

12. Bilik hitung Neubauer

13. Scalpel

14. Pinset

15. Gunting

4.6 Prosedur Penelitian in vitro

4.6.1 Pemberian perlakuan in vitro

Kulit preputium penis yang telah disiapkan sebagai kultur primer

dimasukan ke dalam medium komplit, kemudian disimpan satu hari dalam lemari

pendingin dengan suhu 4ºC. Keesokan harinya kulit preputium penis tersebut

diletakkan pada cawan petri, selanjutnya proses dilakukan dalam laminar flow.

Kulit tersebut dipotong dengan ukuran 3-4 cm, dipisahkan dari jaringan subkutan

dan epidermis. Setelah itu dipotong dengan ukuran sekecil-kecilnya menggunakan

gunting jaringan dengan bantuan pinset. Selanjutnya potongan-potongan jaringan

tersebut dipindahkan ke dalam 3 buah petri kecil, disusun dibagian tengah petri

dan ditutup dengan cara agak ditekan menggunakan cover glass. Sisa media

komplit di sekitarnya dibuang menggunakan pipet mikro, setelah sisa media

komplit tersebut habis, diganti dengan media komplit 20% sebanyak 3 ml pada

masing-masing petri, dan dipastikan cover glass yang menutupi potongan jaringan

tersebut tidak mengambang dengan menekannya menggunakan ujung tip pipet

mikro yang digunakan mengisi larutan media komplit tersebut. Kemudian ketiga

petri kecil masing-masing ditutup dengan tutup petri, selanjutnya disusun dalam

petri besar. Petri besar ditutup dan diberi label. Kultur primer yang ditumbuhkan

ini disimpan dalam inkubator CO2 ( 37ºC, 5% CO2, kelembaban 95% ).

Setelah 24 jam, kultur diamati setiap hari dengan mikroskop inverted,

apakah sudah tampak adanya sel fibroblast. Diamati juga kemungkinan terjadinya

kontaminasi bakteri atau jamur yang dapat menghambat pertumbuhan sel

fibroblast. Apabila terjadi kontaminasi bakteri proses pertumbuhan kultur sel tidak

dapat dilanjutkan dan harus segera diganti dengan yang baru. Media komplit 20%

pada kultur diganti setiap 3 hari. Sel fibroblast yang tumbuh mempunyai sifat

menempel pada dasar petri sedangkan sel yang mati akan mengambang di

permukaan media, sehingga saat penggantian media sel yang mati akan ikut

terbuang.

Sel fibroblast dari kultur primer yang sudah konfluen 60-70% dapat

dipanen dan dibiakkan kembali sebagai sub kultur ( kultur sekunder ). Supernatan

dibuang, sisa larutan FBS yang masih ada dalam petri dibilas menggunakan media

RPMI sampai bersih, setelah itu ditambahkan trypsin 0,25% sebanyak 1 ml untuk

melepaskan sel yang melekat pada dasar petri, kemudian diinkubasi selama 8

menit. Dengan pemberian trypsin berbentuk bulat dan ukuranya menjadi lebih

besar. Setelah inkubasi sejumlah sel dapat dibiakan kembali sebagai sub kultur

dengan memindahkan sejumlah sel ke TCF lainnya yang telah diisi media komplit

7 ml, selanjutnya disimpan kembali dalam inkubator CO2 dan media diganti tiap 3

hari. Apabila sel telah cukup banyak jumlahnya dapat dilakukan panen sel dan

penghitungan jumlah sel untuk proses perlakuan yang akan diberikan selanjutnya.

4.6.2 Penghitungan Jumlah Sel Uji

Adapun cara penghitungan sel adalah dengan cara sebagai berikut, terlebih

dahulu larutan yang tersisa dalam TCF dibuang, setelah suspensi sel telah bersih

dari FBS, dipindahkan ke dalam tabung sentrifuge 15 ml yang telah diisi media

RPMI, disentrifuge 1500 rpm selama 10 menit. Tampak sel menjadi berwarna

putih mengendap di bagian dasar, supernatan dibuang. Sel yang telah mengendap

ditambahkan media komplit 1 ml dan dihomogenkan. Suspensi sel yang telah

homogen diambil sebanyak 20μl, dimasukkan ke dalam well plate, kemudian

tambahkan tripan blue 180μl lalu dihomogenkan. Ambil sel sebanyak 10μl

masukkan ke dalam bilik hitung Neubauer, selanjutnya dihitung jumlah sel

fibroblast dengan menggunakan mikroskop binokuler pembesaran 10x. Cara

penghitungannya adalah dengan menghitung seluruh sel fibroblast yang

ditemukan dalam 4 buah kotak berukuran 4x4 pada bilik hitung, selanjutnya

perhitungan dilakukan dengan menggunakan rumus seperti berikut ini

n1 + n2 + n3 +n4

Jumlah sel/ml = x 10 6 :10 4 n = jumlah sel dalam masing-masing bilik hitung

4 = jumlah bilik hitung

10 6 = konstanta jumlah sel per ml larutan

10 = jumlah pengenceran larutan

4.6.3 Uji Aktivitas in vitro

Kultur fibroblast dibagi menjadi 3 kelompok dan sub kelompok dengan variasi

dosis asam α-lipoat dan pemberian ekstrak asap rokok, yaitu :

Kelompok 1 : tanpa perlakuan apapun, sebagai kontrol negatif

Kelompok 2 : dengan perlakuan pemaparan dengan ekstrak asap rokok dengan

dosis bervariasi 50μl/ml, 25μl/ml, dan 12,5μl/ml.

Kelompok 3 : dengan pemberian asam α-lipoat dengan variasi dosis 50μg/hr,

100μg/hr, dan 200μg/hr, serta pemaparan ekstrak asap rokok dengan variasi dosis

50μl/ml, 25μl/ml, dan 12,5μl/ml.

Dua puluh empat jam setelah perlakuan pemaparan dengan ekstrak asap rokok,

supernatan dari masing-masing sub kelompok beserta pengulangan kelompok

tersebut dikumpulkan dan ekspresi MMP-1 dinilai dengan menggunakan kit

MMP-1 human enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA ) dengan prosedur

yang sesuai dengan protokol dari pabrik.

4.7 Alur Penelitian

Kulit Preputium

Kultur Fibroblast

KONTROL

P0

Ekstrak Asap Rokok (μl/ml) EAR

50

P1 EAR

25

P2 EAR 12,5

P3

Ekstrak Asap Rokok/EAR (μl/ml) dan asam α-lipoat/AAL (μg/hr)

EAR 50

EAR 25

EAR 12,5

AAL 50

P4 AAL 100

P5 AAL 200

P6 AAL 50

P7 AAL 100

P8 AAL 200

P9 AAL 50

P10 AAL 100

P11 AAL 200

P12

Nilai MMP-1 setelah 24 jam

Bagan 4.2

Alur Penelitian in vitro

4.8 Analisis Data

Data yang didapatkan pada penelitian in vitro ini dianalisis sebagai berikut

(Campbel, 1963; Sugiyono, 2009) :

1. Analisis Deskriptif

2. Analisis Normalitas dan Homogenitas :

a. Uji Normalitas data dengan Saphiro-Wilk Test untuk mengetahui rerata

data sampel berdistribusi normal atau tidak.

b. Uji Homogenitas = test of the equality of variances = F test (Levene's

Test for Equality of Variances).

3. Analisis Inferensial :

A. Data berdistribusi normal : (nilai α = 0,05)

Uji Compare means antar kelompok dengan Anova Test

1.Post test kelompok kontrol negatif, kelompok ekstrak asap rokok, dan

kelompok asam α-lipoat + ekstrak asap rokok.

2. Data beda (selisih) kelompok kontrol negatif, kelompok ekstrak asap

rokok, dan kelompok asam α-lipoat + ekstrak asap rokok.

BAB V

HASIL PENELITIAN

Proses penelitian dimulai dengan pembiakan kultur sel fibroblast selama ±

6 minggu dengan mengikuti prosedur standar pembuatan kultur sel. Setelah

jumlah sel fibroblast mencukupi dilakukan pembagian kelompok, menjadi 1

kelompok kontrol dan 12 kelompok perlakuan yang sesuai dengan rancangan

penelitian. Setelah pemberian pelakuan, pengukuran nilai absorbansi MMP-1

menggunakan ELISA reader, selanjutnya analisis data dan pengolahan data

menggunakan Program Statistic Base SPSS 11,5 for Windows didapatkan hasil

sebagai berikut

5.1 Uji Normalitas Data

Data sebelum perlakuan maupun sesudah perlakuan pada masing-masing

kelompok diuji normalitasnya dengan menggunakan uji Shapiro-Wilk. Hasilnya

menunjukkan data berdistribusi normal (p>0,05), disajikan pada Lampiran 1.

5.2 Uji Homogenitas Data antar Kelompok

Data antar kelompok baik sebelum perlakuan maupun sesudah perlakuan

diuji homogenitasnya dengan menggunakan uji Levene's test. Hasilnya

menunjukkan data homogen (p>0,05), disajikan pada Lampiran 2, 3 dan 4.

5.3 Pemberian Ekstrak Asap Rokok 50μl/ml (EAR 50μl/ml)

5.3.1 Uji Efek Pemberian EAR 50μl/ml

Uji efek perlakuan bertujuan untuk membandingkan rerata antar kelompok

sesudah diberikan perlakuan. Hasil analisis kemaknaan dengan uji One Way

Anova disajikan pada Tabel 5.1 berikut.

Tabel 5.1

Rerata MMP-1 antar Kelompok Sesudah Pemberian EAR 50μl/ml

Kelompok subyek N Rerata SB F P

Kontrol EAR 50

EAR 50 + 50 AAL EAR 50 + 100 AAL

EAR 50 + 200 AAL

4 4

4 4

4

0,114 0,346

0,274 0,251

0,222

0,010 0,017

0,014 0,005

0,009

195,506

0,000

Tabel 5.1 di atas menunjukkan rerata MMP-1 pada kelompok kontrol

adalah 0,114 ± 0,010, rerata MMP-1 pada kelompok EAR 50 adalah 0,346 ±

0,017, rerata MMP-1 pada kelompok EAR 50 + AAL50μg/hr adalah 0,274 ±



0,009

Tabel 5.1 di atas, dengan uji One Way Anova menunjukkan bahwa kelima

kelompok sesudah diberikan perlakuan rerata MMP-1 berbeda secara bermakna

(p<0,05).

Gambar 5.1 Grafik Sesudah Pemberian EAR 50μl/ml

Gambar 5.1 di atas menggambarkan bahwa dengan pemberian EAR

50μl/ml meningkatkan MMP-1, dan dengan pemberian asam α-lipoat 50μg/hr,

100μg/hr dan 200μg/hr sebelum diberikan EAR dengan dosis yang sama tampak

aktivitas MMP-1 mengalami penurunan.

Sebagai uji lanjutan untuk mengetahui beda rerata kelompok yang berbeda

perlu dilakukan uji lanjutan dengan Least Significant Difference – test (LSD).

MMP-1

Didapatkan perbedaan yang bermakna antara kelompok-kelompok yang berbeda

tersebut. Hal tersebut ditunjukkan pada tabel 5.2 dengan uraian sebagai berikut

1. Beda rerata antara kelompok kontrol dan kelompok EAR 50μl/ml

didapatkan nilai p<0,05.

2. Beda rerata antara kelompok kontrol dengan kelompok EAR 50μl/ml +

asam α-lipoat (variasi dosis 50, 100 dan 200μg/hr) menunjukkan p<0,05.

3. Beda rerata antara kelompok EAR 50μl/ml dengan kelompok EAR

50μl/ml + asam α-lipoat (variasi dosis 50, 100 dan 200μg/hr)

menunjukkan nilai p<0,05.

4. Beda rerata antara kelompok EAR 50 + asam α-lipoat dengan variasi dosis

50, 100 dan 200μg/hr) menunjukkan nilai p<0,05.

Hasil uji disajikan pada tabel 5.2 di bawah ini :

Tabel 5.2

Analisis Komparasi antar Kelompok setelah Pemberian EAR 50μl/ml

Kelompok BR P Interpretasi Kontrol & EAR 50 0,231

0,000

Berbeda bermakna

Kontrol & EAR 50 + 50 AAL 0,160 0,000 Berbeda bermakna



EAR 50 & EAR 50 + 50 AAL 0,715 0,000 Berbeda bermakna



EAR 50 + 50 AAL & EAR 50 + 100 AAL 0,235 0,015 Berbeda bermakna



5.4 Pemberian Ekstrak Asap Rokok 25μl/ml (EAR 25μl/ml)

5.4.1 Uji Efek Pemberian EAR 25μl/ml


sesudah diberikan perlakuan. Hasil analisis kemaknaan dengan uji One Way

Anova disajikan pada Tabel 5.3 yang menunjukkan bahwa rerata MMP-1 pada

kelompok kontrol adalah 0,114 ± 0,010, rerata MMP-1 pada kelompok EAR 25

adalah 0,251 ± 0,012, rerata MMP-1 pada kelompok EAR 25 + AAL50μg/hr



adalah 0,184 ± 0,005.

Tabel 5.3

Rerata MMP-1 antar Kelompok Sesudah Pemberian EAR 25μl/ml


Kontrol

EAR 25 EAR 25 + 50 AAL

EAR 25 + 100 AAL EAR 25 + 200 AAL

4

4 4

4 4

0,114

0,251 0,234

0,209 0,184

0,010

0,012 0,004

0,013 0,005

117,989

0,000


kelompok sesudah diberikan perlakuan reratanya berbeda secara bermakna

(p<0,05).

Gambar 5.2 Grafik Sesudah Pemberian EAR 25μl/ml

Gambar 5.2 di atas menggambarkan bahwa dengan pemberian EAR 25μl/ml

meningkatkan MMP-1, dan dengan pemberian asam α-lipoat 50μg/hr, 100μg/hr dan

200μg/hr sebelum diberikan EAR dengan dosis yang sama tampak aktivitas MMP-1

mengalami penurunan.





1. Beda rerata antara kelompok kontrol dan kelompok EAR 25μl/ml


MMP-1

2. Beda rerata antara kelompok kontrol dengan kelompok EAR 25μl/ml +


3. Beda rerata antara kelompok EAR 25μl/ml dengan kelompok EAR

25μl/ml + asam α-lipoat (variasi dosis 50, 100 dan 200μg/hr)


4. Beda rerata antara kelompok EAR 25 + asam α-lipoat dengan variasi dosis

50, 100 dan 200μg/hr) menunjukkan nilai p<0,05.

Tabel 5.4

Analisis Komparasi antar Kelompok setelah Pemberian EAR 25μl/ml

Kelompok BR P Interpretasi Kontrol & EAR 25 0,136

0,000

Berbeda bermakna










5.5 Pemberian Ekstrak Asap Rokok 12,5μl/ml (EAR 12,5μl/ml)

5.5.1 Uji Efek Pemberian EAR 12,5μl/ml


sesudah diberikan perlakuan. Hasil analisis kemaknaan dengan uji One Way Anova

disajikan pada Tabel 5.5 yang menunjukkan bahwa rerata MMP-1 pada kelompok

kontrol adalah 0,114 ± 0,010, rerata MMP-1 pada kelompok EAR 12,5 adalah 0,175 ±

0,009, rerata MMP-1 pada kelompok EAR 12,5 + AAL50μg/hr adalah 0,161 ± 0,004,

rerata MMP-1 pada kelompok EAR 12,5 + AAL100μg/hr adalah 0,142 ± 0,011, rerata

MMP-1 pada kelompok EAR 12,5 + AAL200μg/hr adalah 0,128 ± 0,005.

Tabel 5.5 Rerata MMP-1 antar Kelompok Sesudah Pemberian EAR 12,5μl/ml


Kontrol

EAR 12,5 EAR 12,5 + 50 AAL

EAR 12,5 + 100 AAL EAR 12,5 + 200 AAL

4

4 4

4 4

0,114

0,175 0,161

0,142 0,128

0,010

0,009 0,004

0,011 0,005

32,704

0,000


kelompok sesudah diberikan perlakuan reratanya berbeda secara bermakna

(p<0,05).

Gambar 5.3 Grafik Sesudah Pemberian EAR 12,5μl/ml

Gambar 5.3 di atas menggambarkan bahwa dengan pemberian EAR 12,5μl/ml

meningkatkan MMP-1, dan dengan pemberian asam α-lipoat 50μg/hr, 100μg/hr dan

200μg/hr sebelum diberikan EAR dengan dosis yang sama tampak aktivitas MMP-1

mengalami penurunan.





1. Beda rerata antara kelompok kontrol dan kelompok EAR 12,5μl/ml


MMP-1

2. Beda rerata antara kelompok kontrol dengan kelompok EAR 12,5μl/ml +


3. Beda rerata antara kelompok EAR 12,5μl/ml dengan kelompok EAR

12,5μl/ml + asam α-lipoat (variasi dosis 50, 100 dan 200μg/hr)


4. Beda rerata antara kelompok EAR 12,5 + asam α-lipoat dengan variasi

dosis 50, 100 dan 200μg/hr) menunjukkan nilai p<0,05.

Tabel 5.6

Analisis Komparasi antar Kelompok setelah Pemberian EAR 12,5μl/ml

Kelompok BR P Interpretasi Kontrol & EAR 12,5 0,060 0,000

Berbeda bermakna

Kontrol & EAR 12,5 + 50 AAL 0,047 0,000 Berbeda bermakna



EAR 12,5 & EAR 12,5 + 50 AAL 0,013 0,042 Berbeda bermakna



EAR 12,5+50 AAL & EAR 12,5+100 AAL 0,019 0,007 Berbeda bermakna



BAB VI

PEMBAHASAN

Berdasarkan teori yang telah diuraikan dimana paparan ekstrak asap rokok

dapat menimbulkan kerusakan kolagen kulit.

Akibat dari paparan ekstrak asap rokok yang menimbulkan keadaan stres

pada sel fibroblas memicu pembentukan ROS, meningkatkan latent TGF-β serta

menurunkan jumlah reseptor TGF-β. Hal tersebut meningkatkan produksi dari

MMP-1,3,7 yang menyebabkan peningkatan degradasi matriks kolagen,

penumpukan proteoglikan abnormal, serta akumulasi tropoelastin abnormal.

Semua kerusakan tersebut mengakibatkan penghancuran matriks dermis serta

gangguan pada sistem perbaikan. Apabila kerusakan pada kulit ini berlanjut terus

menerus lebih jauh akan terjadi penuaan dini pada kulit tersebut.

Dari hasil penelitian dan analisis data yang telah dilakukan pada hasil

penelitian in vitro tampak bahwa ekstrak asap rokok berpengaruh terhadap

terjadinya peningkatan MMP-1 yang dihasilkan oleh sel fibroblas, dimana terjadi

peningkatan nilai MMP-1 yang signifikan (p<0,05) pada kelompok kultur sel

fibroblas yang dipapar ekstrak asap rokok dosis 50μl/ml, 25μl/ml, 12,5μl/ml jika

dibandingkan dengan kelompok kontrol. Peningkatan MMP-1 terjadi pada semua

dosis. Pada pemaparan ekstrak asap rokok dosis 50μl/ml terjadi peningkatan

MMP-1 sebesar 3,04 kali dari kontrol, pada pemaparan ekstrak asap rokok dosis

25μl/ml terjadi peningkatan MMP-1 sebesar 2,20 kali dari kontrol dan pada

pemaparan ekstrak asap rokok 12,5μl/ml terjadi peningkatan MMP-1 sebesar

1,54 kali dari kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa MMP-1 dapat terbentuk pada

berbagai variasi dosis. Peningkatan MMP-1 tertinggi pada penelitian ini terjadi

pada paparan ekstrak asap rokok dosis 50μl/ml, yaitu sebesar 3,04 kali lipat dari

MMP-1 pada kelompok kontrol yang tidak dipapar ekstrak asap rokok. Sedangkan

pada paparan ekstrak asap rokok dengan dosis 12,5μl/ml terjadi peningkatan

MMP-1 sebesar 1,54 kali lipat dari kontrol, peningkatan pada dosis ini lebih

rendah jika dibandingkan dengan peningkatan MMP-1 pada dosis lainnya.

Sebagai antioksidan, asam α-lipoat dinyatakan mampu memberikan

perlindungan pada kulit terhadap paparan ekstrak asap rokok yang dapat memicu

pembentukan radikal bebas, radikal hidroksil, singlet oxygen, serta kerusakan

lainnya yang dapat ditimbulkan, sesuai dengan sifat asam α-lipoat yang dapat

memakan berbagai macam radikal bebas dan mengkelasi logam (Nichols, 2001).

Asam α-lipoat mempunyai kelebihan dibandingkan dengan antioksidan

lainnya yaitu kelarutannya pada air dan lemak, sehingga memudahkan asam α-

lipoat melalui membran sel dan menetralkan radikal bebas (Gurer, 1999).

Kelebihan lainnya adalah kemampuan untuk mendaur ulang beberapa

antioksidan penting seperti vitamin C, E, dan glutation. Antioksidan menjadi

teroksidasi akibat meredam sebuah radikal bebas, keadaan teroksidasi ini tidak

dapat meredam radikal bebas yang baru, sampai antioksidan tersebut direduksi

kembali. DHLA (dihydro-lipoic acid), bentuk tereduksi dari asam α-lipoat

mampu mereduksi antioksidan yang telah teroksidasi, sehingga dapat berfungsi

sebagai antioksidan kembali (Jones et al, 2002). Asam α-lipoat dapat

meningkatkan kadar glutation pada kultur sel dan jaringan binatang yang sudah

tua. Pada tikus, dosis oral 150mg/kgBB/hari selama 8 minggu mampu

meningkatkan kadar glutation dalam darah dan hati (Suh et al, 2004).

Asam α-lipoat juga memiliki kemampuan untuk meng-kelasi atau

mengikat logam berat. Kedua bentuk asam α-lipoat telah ditemukan dapat

membentuk bentukan kompleks dengan mangan, zinc, cadmium, timbal, kobalt,

nikel dan ion besi (Lynch, 2001).

Efek perlindungan tersebut di atas dapat dilihat dari kelompok kultur sel

fibroblas yang mendapatkan perlindungan asam α-lipoat dengan berbagai variasi

dosis sebelum diberikan paparan ekstrak asap rokok dengan variasi dosis, secara

umum menunjukkan hambatan ekspresi MMP-1. Hal tersebut terlihat dari

penurunan ekspresi MMP-1 pada kelompok kultur yang diberikan asam α-lipoat

jika dibandingkan dengan kelompok kultur sel fibroblas yang tidak diberikan

asam α-lipoat, dan dari hasil analisis menunjukkan perbedaan yang bermakna

(p<0,05).

Tampak hasil yang signifikan pada kelompok kultur sel fibroblas yang

mendapat perlindungan asam α-lipoat 50μg, 100μg dan 200μg sebelum dipapar

ekstrak asap rokok dengan dosis 50μl/ml, 25μl/ml, 12,5μl/ml. Pada kelompok

kultur sel fibroblas yang dipapar ekstrak asap rokok dengan dosis 50μl/ml dengan

perlindungan asam α-lipoat 50μg mengalami penurunan ekspresi MMP-1 sebesar

20,81%, pada pemberian asam α-lipoat dosis 100μg dan 200μg mengalami

penurunan ekspresi MMP-1 sebesar 27,46 % dan 35,84%. Pada kelompok kultur

sel fibroblas yang dipapar ekstrak asap rokok dengan dosis 25μl/ml dengan

perlindungan asam α-lipoat 50μg, 100μg dan 200μg tampak terjadi penurunan

ekspresi MMP-1 berturut-turut sebesar 6,77%, 16,73% dan 26,69% dibandingkan

dengan kelompok kultur sel fibroblas yang tidak mendapatkan perlindungan asam

α-lipoat. Pada kelompok kultur sel fibroblas yang dipapar ekstrak asap rokok

dosis 12,5μl/ml dengan perlindungan asam α-lipoat dosis 50μg, 100μg dan 200μg

tampak terjadi penurunan ekspresi MMP-1 berturut-turut sebesar 8,00%, 18,86%

dan 26,86%.

Dari hasil penelitian tampaknya dengan perlindungan antioksidan asam α-

lipoat terjadi penurunan ekspresi MMP-1 akibat paparan ekstrak asap rokok

dengan berbagai dosis. Hal ini sesuai dengan sifat asam α-lipoat sebagai

antioksidan yang dapat meredam radikal bebas, dan juga dapat mendaur ulang

antioksidan lainnya. Pemberian asam α-lipoat menurunkan ekspresi MMP-1 dan

diharapkan semakin kecil kerusakan kolagen yang pada umumnya terjadi seiring

dengan proses penuaan.

Kemampuan asam α-lipoat untuk melindungi kulit dari penuaan dini

akibat paparan asap rokok atau merokok ini diharapkan dapat digunakan dalam

kehidupan sehari-hari. Mengingat jumlah perokok yang banyak dan seringkali kita

menjadi perokok pasif, mengkonsumsi asam α-lipoat sebagai antioksidan dapat

membantu menghambat perusakan kulit akibat radikal bebas yang ditimbulkan

asap rokok dan terlebih baik lagi bila tidak merokok atau menghindari asap rokok.

Merokok merupakan penyebab kematian yang dapat dicegah. Selain

sangat berpengaruh terhadap berbagai penyakit sistemik, juga menyebabkan

berbagai gangguan pada kulit yang salah satunya adalah penuaan dini kulit.

Merokok meningkatkan kadar MMP, yang berakibat penghancuran serat kolagen,

serat elastin dan proteoglikan, ketidak seimbangan antara sintesa dan degradasi

pada metabolisme jaringan ikat di dermis. ROS memegang peranan penting dalam

asap rokok dalam menyebakan penuaan dini kulit. Pemberian antioksidan yang

dapat memakan ROS akan menghambat rangsangan terhadap MMP.

BAB VII

SIMPULAN DAN SARAN

7.1 Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan mengenai efek pemberian

asam α-lipoat dapat menurunkan ekspresi MMP-1 pada kultur fibroblas yang

dipapar ekstrak asap rokok dapat disimpulkan bahwa

1. Asam α-lipoat sebagai antioksidan dengan berbagai variasi dosis mampu

menurunkan ekspresi MMP-1 pada kultur sel fibroblas yang dipapar oleh

ekstrak asap rokok.

2. Dosis asam α-lipoat 200μg/hr memberikan efek proteksi tertinggi pada

fibroblas yang terpapar ekstrak asap rokok.

7.2 Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dan lebih mendalam tentang efek

asam α-lipoat terhadap ekspresi MMP-1 pada kultur sel fibroblas yang dipapar

oleh ekstrak asap rokok, efek proteksi asam α-lipoat pada kulit secara in vivo dan

berbagai dosisnya.

DAFTAR PUSTAKA

Aizen, E. and Gilhar, A. 2001. Smoking Effect on Skin Wrinkling in The Aged Population. Int J Dermatol. Vol 40. p. 431-433.

Athar, M. 2002. Oxidative Stress and Experimental Carcinogenesis. Indian J Exp Biol. vol 40. p. 656–667.

Baskoro,A., Konthen, P.G. 2008. Basic Immunologyof Aging Process. Naskah Lengkap pada 5th Bali Endocrine Update 2nd Bali Aging and Geriatric Update Symposium. Bali 11-13 April 2008.

Beers, M. 2005. The Merck Manual of Health & Aging. Amerika Serikat : Ballantine Book Trade Paperback. p. 24-25.

Benowitz, N.L. 1988. Pharmacologic Aspects of Cigarette Smoking and Nicotine Addiction. N Engl J Med. vol 319. p. 1318-1330.

Benowitz, N.L. 1996. Cotinine As a Biomarker of Environmental Tobacco Smoke Exposure. Epidemiol Rev. vol 18. p. 188-204.

Bickers, D.R and Athar, M. 2006. Oxidative Stress in The Pathogenesis of Skin Disease. Journal of Investigative Dermatology. vol 126. p. 2565–2575. doi:10.1038/sj.jid.5700340

Black, H.S. 2004. ROS: A Step Closer to Elucidating Their Role in The Etiology of Light-induced Skin Disorders. J Invest Dermatol. vol 122:xiii–v.

Briganti, S., Picardo, M. 2003. Antioxidant Activity, Lipid Peroxidation and Skin Diseases : What’s new. J Eur Acad Dermatol Venereol. vol 17. p. 663–669.

Campbell, D. 1963. Experimental and Quasi-Experimental Design for Research. Boston : Houghton Miffin Company. p.13-22.

Demierre, M. F., Brooks, D., Koh, H. K., Geller, A. C. 1999. Public Knowledge, Awareness, and Perceptions of The Association Between Skin Aging and Smoking. J Am Acad Dermatol. vol 41. p. 27-30.

Dhar, A., Young, M. R., Colburn, N.H. 2002. The Role of AP-1, NF-kappaB and ROS/NOS in Skin Carcinogenesis: The JB6 Model is Predictive. Mol Cell Biochem. vol 234–235. p. 185–193.

Ernster, V.L., Grady, D., Miike, R., Black, D., Selby, J., Kerlikowske, K. 1995. Facial Wringkling in Men and Women, by Smoking Status. American Journal Public Health. vol 85. p. 78-82.

Fowles, J., Bates, M. 2000. The Chemical Constituents in Cigarette and Cigarette Smoke : Priorities For Harm Reduction. Epidemiology and Toxicology Group. ESR : Kenepuru Science Centre. Porirua. New Zealand.

Fowler, B. 2003. Functional and Biological Markers of Aging in Klatz, R. Anti Aging Medical Therapeutic. vol 5. The A4M Publication. Chicago. p. 43.

Gibson, S. J., Farrell, M. 2004. A Review of Age Differences in The Neurophysiology of Nociception and The Perceptual Experience of Pain. Clin J Pain. vol 20. p. 227-239.

Gilchrest, B. A dan Krutmann, J. 2006. Skin Aging. Germany : Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany. p.10-11, 34-42.

Ginzel, K. H. 1999. What's In a Cigarette. University of Arkansas. Departement Pharmacology and Toxicology.

Goldman, R dan Klatz, R. 2007. The New Anti-Aging Revolution. Malaysia : Printmate Sdn. Bhd. p. 19-25.

Gurer, H., et al. 1999. Antioxidant Role of Alpha Lipoic Acid in Lead Toxicity. Free Radic Biol Med. vol 1. p. 75-81.

Hieta, N., Impola, U., Lopez-Otin, C., Saarialho-Kere, U., Kähäri, V. M. 2003. Matrix Metalloproteinase-19 Expression in Dermal Wounds and by Fibroblasts in Culture. J Invest Dermatol. vol 121. p. 997-1004. Available from : http://herkules.oulu.fi/isbn9514277899/isbn9514277899.pdf. Accessed November 11, 2009.

Jacob, P., Yu, L., Shulgin, A. T., Benowitz, N. L. 1999. Minor Tobacco Alkaloids as Biomarkers for Tobacco Use : Comparison of Users of Cigarettes, Smokeless Tobacco, Cigars, and Pipes. Am J Public Health. vol 89. p. 731-736.

Jones, W., Li, X., Qu, Z. C., Perriott, L., Whitesell, R. R., May, J. M. 2002. Uptake, Recycling, and Antioxidant Actions of Alpha Lipoic Acid in Endothelial Cells. Free Radic Biol Med. vol 33. p. 83-93.

Klatz, R. 2003. Anti Aging Medical Therapeutic. vol 5. The A4M Publication. Chicago. p. 3.

Kochevar, I. E., Taylor, C. R., Krutmann, J. 2008. Disorder Due To Ultraviolet Radiation. In: Wolff, K., Goldsmith, L. A., Katz, S. I., Gilchrest, B. A. Paller, A. S., Jeffell, D. J., editors. Fitzpatrick's Dermatology in General Medicine. 7th edition volume 1. Amerika Serikat : Mc-Graw-Hill, Inc. p. 59-63, 383-384, 797-799.

Lewis, K. G., Bercovitch, L., Dill, S. W., Robinson–Bostom, L. 2004. Acquired Disorders of Elastic Tissue : Part I. Increased Elastic Tissue and Solar Elastotic Syndromes. J Am Acad Dermatol. vol 51. p. 1-21.

Lin, J. Y., Lin, F. H., Burch, J. A., Selim, M. A., Monteiro-Riviere, N. A., Pinell, S. R. 2004. α- Lipoic Acid is Ineffective as Topical Antioxidant for Photoprotection of Skin. J Invest Derm. vol 123. p. 996-998. Available from : http://www.nature.com/jid/journal/v123/n5/full/5602557a.html. Accessed November, 27, 2010.

Lynch, M. A. 2001. Lipoic Acid Confers Protection Against Oxidative Injury in Non-Neuronal and Neuronal Tissue. Nutr Neurosci. vol 6. p. 419-438.

Lowe, L., Hansen, C. M., Senaratne, S., Colston, K. W. 2003. Mechanisms Implicated in The Growth Regulatory Effects of Vitamin D Compounds in Brest Cancer Cells. Recent Results Cancer Res. vol 164. p. 99-110.

Martindale. 1979. The Extra Pharmacopoeia 27th edition. The pharmaceutical Press. London.

Mohan, R., Shravan, K. C., Jung, J. C., Villar, W. V. L., McCabe, F., Russo, L. A., Lee, Y., McCarthy, B. E., Wollenberg, K. R., Jester, J. V., Wang, M , Welgus, H. G., Shipley, J. M., Senior, R. M., Fini, M. E. 2002. Matrix Metalloproteinase Gelatinase B (MMP-9) Coordinates and Effects Epithelial Regeneration. J Biol Chem. vol 277. p. 2065-2072.

Morita, A. 2007a. Tobacco Smoke Causes Premature Skin Aging. Journal of Dermatological Science. vol 48. p. 169-175.

Morita, A. 2007b. Tobacco Smoke Extract Induces Premature Skin Aging in Mouse. Journal of Dermatological Science. vol 46. p. 69-71.

Mouton, C. P., Bazaldua, O. V., Pierce, B., Espino, D. V. 2001. Common Infections in Older Adults. Am Fam Physician. vol 63. p. 257-268.

Myllyharju, J., Kivirikko, K. I. 2001. Collagens and Collagen-related Diseases. Ann Med. vol 33. p. 7-21.

Nichols, T. B. 2001. α-lipoic acid : Biological Effects & Clinical Implications. Alternative Medicine Review. Thorne Research.vol 2. p. 177-183

Ou, P., Tritschler, H. J., Wolff, S. P. 1995. Thioctic (Lipoic) Acid: A Therapeutic Metal-Chelating Antioxidant. Biochem Pharmacol. vol 50. p. 123-126.

Packer, L., Witt, E. H., Tritschler, H. J. 1995. Alpha−lipoic Acid as A Biological Antioxidant. Free Rad Biol Med. vol 19. p. 227-250.

Pangkahila, W. 2007. Anti Aging Medicine : Memperlambat Penuaan, Meningkatkan Kualitas Hidup. Cetakan ke-1. Jakarta : Penerbit Buku Kompas. Hal : 35-42.

Raitio, A. 2005. Comparison of the Appearance, Physical Qualities, Morphology, Collagen Synthesis & Extracellular Matrix Turnover of Skin in Smokers and Non-smokers. Smoking and Skin.

Ravanti, L., Kähäri, V. M. 2000. Matrix Metalloproteinases in Wound Repair. Int J Mol Med. vol 6. p. 391-407. Available from :

http://herkules.oulu.fi/isbn9514277899/isbn9514277899.pdf. Accessed November 11, 2009.

Ryter, S. W., Tyrrell, R. M. 2000. The Heme Synthesis and Degradation Pathways: Role in Oxidant Sensitivity. Heme Oxygenase Has Both Pro and Antioxidant Properties. Free Radic Biol Med. vol 28. p. 289–309.

Sander, C. S., Chang, H., Hamm, F., Elsner, P., Thiele, J. J. 2004. Role of Oxidative Stress and The Antioxidant Network in Cutaneous Carcinogenesis. Int J Dermatol. vol 43. p. 326–335.

Setiati, S. 2003. Radikal Bebas, Antioksidan, dan Proses Menua dalam : Medika no. 6 Tahun XXIX. Jakarta. p. 366.

Stadtman, E. R. 2001. Protein Oxidation in Aging and Age-related Disease. Ann N Y Acad Sci. vol 928. p. 22-38.

Suh, J. H., Shenvi, S. V., Dixon, B. M. 2004. Decline in Transcriptional Activity of Nrf2 Causes Age-Related Loss of Glutathione Synthesis, Which is Reversible With Lipoic Acid. Proc Natl Acad Sci USA. vol 101. p. 3381-3386.

Suryohudoyo, P. 2000. Kapita Selekta Ilmu Kedokteran Molekuler. Jakarta : CV. Infomedika. p. 31-46.

Wardhana, W. A. 1995. Dampak Pencemaran Lingkungan. Penerbit Andi Offset.

Yaar, M., Gilchrest, B. A. 2003. Aging of Skin. In Freedberg, I. M., Eizen, A.,Z., Wolff, K., Austen, K. F., Goldsmith, L. A., Katz, S. I. (eds) Fitzpatrick's Dermatology in General Medicine. McGraw-Hill. New York. vol 2. p. 1386-1398.

Yin, L., Morita, A., Tsuji, T. 2000. Alterations of Extracellular Matrix Induced by Tobacco Smoke Extract. Arch Dermatol Res. vol 292. p. 188-194.

Yin, L., Morita, A., Tsuji, T. 2001. Skin Aging Induced by Ultraviolet Exposure and Tobacco Smoking : Evidence from Epidemiological and Molecular Studies. Photodermatol Photoimmunol Photomed. vol 17. p. 178-183.

Lampiran 1

Uji Normalitas Data MMP-1 Berdasarkan Dosis Paparan Ekstrak Asap Rokok 50μl/ml, 25μl/ml dan 12,5μl/ml

Normalitas pada EAR 50μl/ml

Tests of Normality

.231 4 . .974 4 .865

.219 4 . .938 4 .645

.209 4 . .985 4 .928

.215 4 . .946 4 .689

.230 4 . .939 4 .645

KelompokKontrolEAR 50EAR 50 + 50 AALEAR 50 + 100 AALEAR 50 + 200 AAL

MMP-1Statistic df Sig. Statistic df Sig.

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Lilliefors Significance Correctiona.

Normalitas pada EAR 25μl/ml

Tests of Normality

.231 4 . .974 4 .865

.190 4 . .962 4 .792

.243 4 . .905 4 .457

.212 4 . .979 4 .896

.170 4 . .983 4 .921

KelompokKontrolEAR 25EAR 25 + 50 AALEAR 25 + 100 AALEAR 25 + 200 AAL




Normalitas pada EAR 12,5μl/ml

Tests of Normality

.231 4 . .974 4 .865

.287 4 . .849 4 .223

.275 4 . .871 4 .304

.241 4 . .959 4 .774

.200 4 . .973 4 .861

KelompokKontrolEAR 12,5EAR 12,5 + 50 AALEAR 12,5 + 100 AALEAR 12,5 + 200 AAL




Lampiran 2

Uji Homogenitas, Anova Test dan LSD-test kelompok EAR 50μl/ml

Descriptives

MMP-1

4 .11450 .010344 .005172 .09804 .13096 .103 .1284 .34600 .017263 .008631 .31853 .37347 .323 .3624 .27450 .014480 .007240 .25146 .29754 .258 .2934 .25100 .005292 .002646 .24258 .25942 .246 .2584 .22275 .009394 .004697 .20780 .23770 .214 .235

20 .24175 .078308 .017510 .20510 .27840 .103 .362

KontrolEAR 50EAR 50 + 50 AALEAR 50 + 100 AALEAR 50 + 200 AALTotal

N Mean Std. Deviation Std. Error Lower Bound Upper Bound

95% Confidence Interval forMean

Minimum Maximum

Homogenitas kelompok EAR 50μl/ml

Test of Homogeneity of Variances

MMP-1

1.073 4 15 .404

LeveneStatistic df1 df2 Sig.

Anova Test EAR 50μl/ml

ANOVA

MMP-1

.114 4 .029 195.506 .000

.002 15 .000

.117 19

Between GroupsWithin GroupsTotal

Sum ofSquares df Mean Square F Sig.

Post Hoc Test EAR 50μl/ml

Multiple Comparisons

Dependent Variable: MMP-1LSD

-.23150* .008549 .000 -.24972 -.21328-.16000* .008549 .000 -.17822 -.14178-.13650* .008549 .000 -.15472 -.11828-.10825* .008549 .000 -.12647 -.09003.23150* .008549 .000 .21328 .24972.07150* .008549 .000 .05328 .08972.09500* .008549 .000 .07678 .11322.12325* .008549 .000 .10503 .14147.16000* .008549 .000 .14178 .17822

-.07150* .008549 .000 -.08972 -.05328.02350* .008549 .015 .00528 .04172.05175* .008549 .000 .03353 .06997.13650* .008549 .000 .11828 .15472

-.09500* .008549 .000 -.11322 -.07678-.02350* .008549 .015 -.04172 -.00528.02825* .008549 .005 .01003 .04647.10825* .008549 .000 .09003 .12647

-.12325* .008549 .000 -.14147 -.10503-.05175* .008549 .000 -.06997 -.03353-.02825* .008549 .005 -.04647 -.01003

(J) KelompokEAR 50EAR 50 + 50 AALEAR 50 + 100 AALEAR 50 + 200 AALKontrolEAR 50 + 50 AALEAR 50 + 100 AALEAR 50 + 200 AALKontrolEAR 50EAR 50 + 100 AALEAR 50 + 200 AALKontrolEAR 50EAR 50 + 50 AALEAR 50 + 200 AALKontrolEAR 50EAR 50 + 50 AALEAR 50 + 100 AAL

(I) KelompokKontrol

EAR 50

EAR 50 + 50 AAL

EAR 50 + 100 AAL

EAR 50 + 200 AAL

MeanDifference

(I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound95% Confidence Interval

The mean difference is significant at the .05 level.*.

Lampiran 3

Uji Homogenitas, Anova Test dan LSD-test kelompok EAR 25μl/ml

Descriptives

MMP-1

4 .11450 .010344 .005172 .09804 .13096 .103 .1284 .25100 .012111 .006055 .23173 .27027 .235 .2634 .23425 .004992 .002496 .22631 .24219 .230 .2414 .20925 .013124 .006562 .18837 .23013 .193 .2254 .18450 .005686 .002843 .17545 .19355 .178 .191

20 .19870 .049766 .011128 .17541 .22199 .103 .263

KontrolEAR 25EAR 25 + 50 AALEAR 25 + 100 AALEAR 25 + 200 AALTotal



Minimum Maximum

Homogenitas kelompok EAR 25μl/ml


MMP-1

.712 4 15 .596


Anova Test EAR 25μl/ml

ANOVA

MMP-1

.046 4 .011 117.989 .000

.001 15 .000

.047 19



Post Hoc Test EAR 25μl/ml



-.13650* .006951 .000 -.15132 -.12168-.11975* .006951 .000 -.13457 -.10493-.09475* .006951 .000 -.10957 -.07993-.07000* .006951 .000 -.08482 -.05518.13650* .006951 .000 .12168 .15132.01675* .006951 .029 .00193 .03157.04175* .006951 .000 .02693 .05657.06650* .006951 .000 .05168 .08132.11975* .006951 .000 .10493 .13457

-.01675* .006951 .029 -.03157 -.00193.02500* .006951 .003 .01018 .03982.04975* .006951 .000 .03493 .06457.09475* .006951 .000 .07993 .10957

-.04175* .006951 .000 -.05657 -.02693-.02500* .006951 .003 -.03982 -.01018.02475* .006951 .003 .00993 .03957.07000* .006951 .000 .05518 .08482

-.06650* .006951 .000 -.08132 -.05168-.04975* .006951 .000 -.06457 -.03493-.02475* .006951 .003 -.03957 -.00993

(J) KelompokEAR 25EAR 25 + 50 AALEAR 25 + 100 AALEAR 25 + 200 AALKontrolEAR 25 + 50 AALEAR 25 + 100 AALEAR 25 + 200 AALKontrolEAR 25EAR 25 + 100 AALEAR 25 + 200 AALKontrolEAR 25EAR 25 + 50 AALEAR 25 + 200 AALKontrolEAR 25EAR 25 + 50 AALEAR 25 + 100 AAL

(I) KelompokKontrol

EAR 25

EAR 25 + 50 AAL

EAR 25 + 100 AAL

EAR 25 + 200 AAL

MeanDifference



Lampiran 4

Uji Homogenitas, Anova Test dan LSD-test kelompok EAR 12,5μl/ml

Descriptives

MMP-1

4 .11450 .010344 .005172 .09804 .13096 .103 .1284 .17525 .009106 .004553 .16076 .18974 .167 .1854 .16175 .004031 .002016 .15534 .16816 .156 .1654 .14275 .011442 .005721 .12454 .16096 .129 .1574 .12800 .005715 .002858 .11891 .13709 .122 .135

20 .14445 .023823 .005327 .13330 .15560 .103 .185

KontrolEAR 12,5EAR 12,5 + 50 AALEAR 12,5 + 100 AALEAR 12,5 + 200 AALTotal



Minimum Maximum

Homogenitas kelompok EAR 12,5μl/ml


MMP-1

.756 4 15 .570


Anova Test EAR 12,5μl/ml

ANOVA

MMP-1

.010 4 .002 32.704 .000

.001 15 .000

.011 19



Post Hoc Test EAR 12,5μl/ml



-.06075* .006081 .000 -.07371 -.04779-.04725* .006081 .000 -.06021 -.03429-.02825* .006081 .000 -.04121 -.01529-.01350* .006081 .042 -.02646 -.00054.06075* .006081 .000 .04779 .07371.01350* .006081 .042 .00054 .02646.03250* .006081 .000 .01954 .04546.04725* .006081 .000 .03429 .06021.04725* .006081 .000 .03429 .06021

-.01350* .006081 .042 -.02646 -.00054.01900* .006081 .007 .00604 .03196.03375* .006081 .000 .02079 .04671.02825* .006081 .000 .01529 .04121

-.03250* .006081 .000 -.04546 -.01954-.01900* .006081 .007 -.03196 -.00604.01475* .006081 .028 .00179 .02771.01350* .006081 .042 .00054 .02646

-.04725* .006081 .000 -.06021 -.03429-.03375* .006081 .000 -.04671 -.02079-.01475* .006081 .028 -.02771 -.00179

(J) KelompokEAR 12,5EAR 12,5 + 50 AALEAR 12,5 + 100 AALEAR 12,5 + 200 AALKontrolEAR 12,5 + 50 AALEAR 12,5 + 100 AALEAR 12,5 + 200 AALKontrolEAR 12,5EAR 12,5 + 100 AALEAR 12,5 + 200 AALKontrolEAR 12,5EAR 12,5 + 50 AALEAR 12,5 + 200 AALKontrolEAR 12,5EAR 12,5 + 50 AALEAR 12,5 + 100 AAL

(I) KelompokKontrol

EAR 12,5

EAR 12,5 + 50 AAL

EAR 12,5 + 100 AAL

EAR 12,5 + 200 AAL

MeanDifference



Lampiran 5

FOTO-FOTO PENELITIAN

1. Proses Pembuatan Ekstrak Asap Rokok

Proses pembuatan EAR

Persiapan alat-alat

Penyesuaian pH

Penyaringan EAR

2. Kultur Fibroblas

Sel Fibroblas

Sel Fibroblas yang mengendap

Penghitungan sel fibroblas

3. Pembagian Kelompok Perlakuan

Pembagian kelompok perlakuan dalam well plate

4. Pengukuran MMP-1

Persiapan kit MMP-1

Koleksi supernatan 24 jam post EAR

Pembacaan hasil dengan ELISA Reader

ASAM α-LIPOAT MENURUNKAN EKSPRESI MMP-1 PADA ...

Documents

Transcript of ASAM α-LIPOAT MENURUNKAN EKSPRESI MMP-1 PADA ...