1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE FURG ESCOLA DE QUMICA E ALIMENTOS EQA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA TECNOLGICA E AMBIENTAL PPGQTA DISSERTAO DE MESTRADO INFLUNCIA DA INCORPORAO DE CIDO -ELEOSTERICO, PURIFICADO E ISOLADO DO LEO DE TUNGUE, NA DINMICA MOLECULAR DE LIPOSSOMOS Mestrando: Robson Simplicio de Sousa Orientadora: Dr Rosilene Maria Clementin Coorientadora: Dr Vnia Rodrigues de Lima Linha de Pesquisa: Qumica Orgnica Tecnolgica Rio Grande, 30 de agosto de 2013.
2. 2. 1. INTRODUO 2. REVISO BIBLIOGRFICA 2.1. TCNICAS INSTRUMENTAIS DE ANLISE DE LIPOSSOMOS 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo Geral 3.2. Objetivos Especficos 4. MATERIAIS E MTODOS 4.1. Reagentes, materiais e equipamentos 4.2. Mtodos 5. RESULTADOS E DISCUSSO 5.1. Ensaio de purificao do -ESA 5.2. Efeitos de -ESA na peroxidao lipdica de lipossomos contendo fosfatidilcolina 5.3. Interao do -ESA com a cabea polar da fosfatidilcolina presente em lipossomos de ASO 5.4. Influncia do -ESA na regio de interface da fosfatidilcolina presente em lipossomos de ASO 5.5. Efeitos do -ESA nos metilenos da cadeia acil de fosfatidilcolina presentes em lipossomos de ASO 5.6. Medidas de Turbidez 6. CONCLUSES 7. REFERNCIAS SUMRIO 2
3. 3. 1. INTRODUO Os cidos graxos com sistema trieno conjugado tm sido encontrados em um grande nmero de diferentes espcies de plantas. cido 9Z,11E,13Z-octadecatrienoico cido puncico cido 9E,11E,13Z-octadecatrienoico cido catalpico Rom Catalpa ovata 3
4. 4. O OH cido 9Z,11E,13E-octadecatrienoico cido -eleosterico (-ESA) Caractersticas estruturais do -ESA: cido graxo com 18 carbonos; cadeia poliinsaturada; trs ligaes conjugadas C9, C11 e C13. 1. INTRODUO Tungue 4
5. 5. -ESA reduziu os nveis de peroxidao lipdica causados por estresse oxidativo no plasma, lipoprotenas e membranas de eritrcitos em ratos (DHAR et al., 1999). EFEITOS DO -ESA EM MEMBRANAS NO FORAM COMPLETAMENTE ELUCIDADOS Conjugao do sistema no -ESA Efeito farmacolgico de supresso tumoral por induo da apoptose via peroxidao lipdica seletivamente. (TSUZUKI, T. et al., 2004.; 11. MOON et al. ) 1. INTRODUO O OH O O H O O H -ESA 9Z11E-CLA10E12Z-CLA> > 5
6. 6. 1. INTRODUO Sistemas lipossomais facilitam o controle da composio fosfolipdica, da estrutura e da dinmica (SAMUNI, LIPMAN E BARENHOLZ, 2000; CASTELLI, 1997). O estudo das propriedades fsico-qumicas das membranas celulares difcil, devido suas estruturas complexas (ENGBERTS, HOEKSTRA, 1995). Influncia do -ESA na dinmica molecular da membrana Modelos de menor complexidade LIPOSSOMOS 6
7. 7. 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral O objetivo geral deste trabalho foi isolar e purificar o -ESA presente no leo de tungue, bem como incorporar e caracterizar seus efeitos na dinmica molecular grau de hidratao, ordem e mobilidade de lipossomos compostos fosfatidilcolinas. 7
8. 8. 2. OBJETIVOS 2.2. Objetivos especficos - Isolar e purificar o -ESA presente no leo de tungue atravs da reao de saponificao seguida de cristalizao; - Caracterizar o composto isolado por espectroscopia de Infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), cromatografia gasosa acoplada com espectrmetro de massas (GC-MS) e ressonncia magntica nuclear de 1H e 13C (RMN); - Incorporar -ESA em lipossomos contendo asolecitina de soja (ASO); - Avaliar a localizao preferencial, bem como o efeito do -ESA no grau de hidratao e ordem da membrana atravs de anlises de FTIR; - Monitorar o efeito do -ESA em parmetros termodinmicos dos lipossomos pela anlise de valores de Tm e H, atravs de medidas de DSC. - Monitorar a influncia de -ESA nos valores de T1 para os ncleos de 1H presentes na regio colina dos lipossomos utilizando RMN. 8
9. 9. 3. REVISO BIBLIOGRFICA A rvore de tungue, Aleurites fordii (famlia Euphorbiaceae), nativa da China. O leo extrado de suas sementes usado por sculos como impermeabilizante. Aplicaes do leo de tungue (KAUTZ et al., 2008; CHAN et al., 1947; LI et al., 2003; WANG et al., 2000; SHANG el al., 2010): - indstria farmacutica - indstria automobilstica - indstria de tintas e vernizes - pesquisa com materiais polimricos - rea bioenergtica. rvore de leo de tungue. 9
10. 10. Fonte: http://www.pacificoutdoorfurniture.com 3. REVISO BIBLIOGRFICA 10
11. 11. Sementes de tungue ~ 33% de leo. Fonte: http://www.pacificoutdoorfurniture.com Contm 75-80% de -ESA. VERSATILIDADE DO LEO DE TUNGUE Quantidade de CIDO -ELEOSTERICO (-ESA) Metodologias para purificao do -ESA: - Caras HPLC-Ag+ (YANG et al., 2009) - Alternativas sem clareza de procedimentos e caracterizaes (THOMAS e THOMSON, 1934; BROWN, 1941). 3. REVISO BIBLIOGRFICA 11 KAUTZ et al., 2010.
12. 12. (Adaptado de Tsuzuky et al., 2004.) O OH -ESA Clulas de cncer de clon transplantadas em ratos crescimento das clulas cancergenas por lipoperoxidao a partir da administrao de -ESA na dieta 3. REVISO BIBLIOGRFICA 12
13. 13. LIPOPEROXIDAO um processo associado a eventos patolgicos como: diabetes; cncer; sndrome da imunodeficincia adquirida (AIDS); danos por isquemia e reperfuso, processos inflamatrios crnicos; doenas neurodegenerativas, como Parkinson e Alzheimer, dentre outros. A lipoperoxidao, em geral, possui trs etapas: 1. Iniciao 2. Propagao 3. Terminao 3. REVISO BIBLIOGRFICA 13 CASTELLI et al., 1997; YIN, et al., 1998; OHYASHIKI e NUNOMURA, 2000; HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2000; REITER, 1998
14. 14. Esquema de lipoperoxidao em cidos graxos poli-insaturados. 1: abstrao de H da cadeia poli-insaturada de lipdios de membrana; 2: formao de radical peroxil; 3: formao da segunda espcie radical centrada no carbono; 4: formao de endoperxidos. (HALLIWELL E GUTTERIDGE, 2000) INICIAO: (energia de dissociao C-H) hidrognios metilnicos bis-allicos 75-80 kcal/mol); hidrognios allicos ( 88 kcal/mol); alqulicos ( 101 kcal/mol). GARDNER, 1989; KOPPENOL, 1990; 3. REVISO BIBLIOGRFICA ROOH H-1 R CH OOH RCHOOH O2 2 ROOH O O LH L 3 4 R CH O OH O O ROOH O OH O2, calor ou hidrlise O O MDA 4-HDA O OH R OH + 14
15. 15. A extenso do dano lipoperoxidativo causado por espcies reativas est associada diferenciao qualitativa e quantitativa dos constituintes fosfolipdicos em funo dos tecidos do organismo (TEIXEIRA et al., 2003). A heterogeneidade da composio fosfolipdica em membranas biolgicas tambm afeta o potencial de sistemas antioxidantes contra os danos causados pela lipoperoxidao induzida por espcies reativas. importante a utilizao de modelos de membrana celular, cujas variveis podem ser estabelecidas e controladas. 3. REVISO BIBLIOGRFICA 15
16. 16. Lipossomos: constitudos por uma bicamada lipdica em forma de concha esfrica; estruturalmente semelhante matriz lipdica das membranas celulares. http://djalmasantos.files.wordpress.com/2011/02/lipo1.jpg 3. REVISO BIBLIOGRFICA 16
17. 17. So menos txicos para o organismo, quando comparadas a outras matrizes, e formam um ambiente favorvel imobilizao de estruturas biolgicas. Os lipossomos constitudos por matrizes lipdicas so interessantes como sistemas de liberao prolongados de frmacos. Representao estrutural e esquemtica de uma molcula de fosfatidilcolina. 3. REVISO BIBLIOGRFICA 17 OHVO-REKIL et al., 2002
18. 18. Representao de MLV (esquerda), LUV (meio) e SUV (direita). Vesculas multilamelares grandes (MLV) - tamanho: 400 nm; - uma ou mais lamelas (ou bicamadas) 15. Vesculas unilamelares grandes (LUV) - tamanho: 50-400 nm; - apenas uma bicamada. Vesculas unilamelares pequenas (SUV) - tamanho: 20-50 nm e so - mais instveis. Lipossomos: 3. REVISO BIBLIOGRFICA 18 HOPE et al., 1986
19. 19. Tcnicas para investigar as propriedades fsico-qumicas de lipossomos, e os efeitos causados nas mesmas aps suas interaes com espcies reativas e substncias pr- ou antioxidantes: espectroscopia de absoro UV-visvel (UV-Vis); infravermelho com tranformada de Fourier (FTIR); calorimetria de varredura diferencial (DSC); ressonncia magntica nuclear (RMN). Os efeitos podem ser descritos como alteraes nas propriedades fsico-qumicas dos lipossomos como: graus de hidratao; ordem; mobilidade de grupos especficos dos lipdios que os compem. 3. REVISO BIBLIOGRFICA 19 CASTELLI et al., 1997; ARORA et al., 2000; FENSKE e JARRELL et al., 1991
20. 20. Lipossomos Para o detector Cristal de ATRRaio IV Grau de desordem conformacional; Grau de hidratao. Material denso com alto ndice de refrao/ZnSe. A energia de cada onda passada de volta para o feixe de luz IV, at que saia na extremidade oposta do cristal. Refletncia cria uma onda que estende-se para alm da superfcie do cristal dentro da amostra. gerado um espectro. Infravermelho com transformada de Fourier Refletncia Total Atenuada Horizontal (HATR FTIR) 3. REVISO BIBLIOGRFICA 20
21. 21. Espectro de HATR-FTIR de lipossomos compostos por dimiristoilfosfatidilcolina(DMPC)/ cedido pelo GIIMM Nmero de onda: as Colina 970 cm-1 as PO2 - 1260-1220 cm-1 C=O 1725-1740 cm-1 s CH2 2850 cm-1 as CH2 2920 cm-1 cm-1 %T Os espectros de FTIR da fosfatidilcolina mostram bandas que podem ser divididas em trs diferentes regies: Polar; Interfacial; Hidrofbica do lipdio. 3. REVISO BIBLIOGRFICA 21 MANTSCH e MCELHANEY, 1991 HERE et al., 2007; MANRIQUE-MORENO, et al., 2010
22. 22. A presena de uma molcula exgena incorporada na membrana pode induzir alteraes nas bandas de fosfatidilcolina: Introduo e Reviso Deslocamentos de picos referentes a grupos metilnicos da regio apolar (CH2) para uma menor frequncia indicam um ordenamento da membrana; Deslocamento dos grupos PO2 - ou C=O para uma menor frequncia podem indicar possveis interaes atravs de ligaes de hidrognio. O alargamento dos picos indica um aumento do grau de fluidez na membrana devido ao surgimento de ligaes na conformao gauche. 3. REVISO BIBLIOGRFICA 22 SEVERCAN, SAHIN e KAZANCI, 2005
23. 23. Fornece informaes sobre o efeito de substncias na velocidade e ordem molecular de regies especficas dos lipdios. Tcnica