Fuente de las Enzimas

De donde se obtienen las enzimas?

(Propósito)

- Plantas- Animales

- MICROORGANISMOS

Enzimas microbianas Enzimas de Plantas Enzimas animales

glucosa isomerasa Papaina (Papaya) tripsina

β-galactosidasa ficina (Higos) lipasa (pancreas)

Proteasas bacterianas Bromeleina (piña) renina (estomago de ternero)

90% de enzimas industriales son de origen microbiano

- Microorganismos son faciles de cultivar en condiciones controladas: Altos rendimientos de enzimas

Consideraciones de seguridad

• Infinidad de microorganismos: Amplia variedad de enzimas

• Limitado numero de microorganismos son usados- Usar el mismo microorganismo para la obtencion de diversas enzimas

- Las condiciones de cultivo, metabolismo ya son conocidas y dan resultados exitosos

Consideraciones de seguridad

• Usar enzimas o microorganismos aprobados por las autoridades reguladoras de produccion industrial

- GRAS (generally regarded as safe) – FDA.

• Nuevas enzimas: se debe demostrar la inocuidad

Microorganismos geneticamente modificados

• Microorganismos que expresan un gen que proviene de otro organismo a traves de de la tecnologia del DNA recombinante.

• Microorganismos que han sido modificadso para sobre expresar la enzima deseada (productor eficiente)

Quimosina (manufactura de quesos)

Microorganismos geneticamente modificados

Microorganismos (celulas totales) vs enzimas purificadas

• Alta especificidad no es necesaria• Purificacion de enzima no es necesaria (Catalizador

barato)• La actividad enzimatica es mas estable dentro de la celula• La enzima puede requerir de la regeneracion del

cofactor/co-sustrato.

Entonces:- Las celulas pueden estar en reposo o muertas.- Las celulas estan vivas pero solo se mantiene el nivel

nutricional sin permitir el crecimiento

BIOCATALIZADORES

Preparacion de enzimas• Enzimas son utilizadas en diferentes grados de pureza• Usos para propositos cientificos, medicinales o

analiticos Alta pureza (90-100%)

• Alta pureza enzimatica requiere de procesos caros:- Centrifugacion- Precipitacion- Cromatografia de afinidad- Cromatografia de intercambio ionico- Filtracion en gel (Cromatografia de exclusion molecular)- Cristalizacion

AGENTE BIOLOGICO

SELECCION

GENETICARecombinantes

HibridosMutantes

CEPAS, LINEAS CELULARES,

CLONES

MICROBIANASVEGETALESANIMALES

SUSTRATO Medio de

cultivo

ESTERILIZACION

PREPARACION

DISEÑO Y FORMULACION

FERMENTACION

MODOS DE OPERACION

TIPO DE REACTOR

BIOTRANSFORMACION

BIOCONVERSIONDOWNSTREAM PROCESSING

ENZIMA

SEPARACION YPURIFICACION

SELECCIÓN DEOPERACIONES Y

PROCESOS

PRODUCTO

EFLUENTES

Formulación del producto

Naturales(wild-type)

ScreeningColecciones de

cultivos

Aplicaciones tecnicas de las enzimas

Uso técnico e industrial de las enzimas

Análisis /DiagnósticoAutoanalizadores

Tiras reactivasELISA

Biosensores

Tratamiento del papel

Transformaciones enzimaticas

Almidon

L-aminoacidos

Aspartame

Esteres, grasas y aceites

Compuestos quirales

Glucosa isomerasa

Uso medicinalTratamiento de cuero

textiles

Detergentes

Area de alimentosPanificacion

Productos lacteosJugos, vinos

Cerveza

ANALISIS

• Ventaja: Alta especificidad enzimatica.

Determinacion de un analito (sustrato)

No requiere procesos de separacion

Sustrato (+ Cosustrato ox/red) Producto (+ Cosustrato ox/red) + ∆H

Analito puede ser cuantificado por:

-Siguiendo la velocidad de conversion (Metodo cinetico)

- Determinando la concentracion despues de una conversion completa (metodo de punto final)

• Sustrato o Producto poseen espectros altos de absorbancia, conviene medir consumo de sustrato o formacion de producto

Azucares, Proteinas, Lipidos

CH2 CH2 CH2

O O OAG AG AG

CH2 CH2 CH2

Lipasa + Agua

OH

OH OH

Glicerol

R COOH

R COOH

R COOH

+

Acidos grasos libres

Areas del Analisis enzimaticoArea Clinica

Determinacion de metabolitos

Plasma, Suero, Orina, LCR, etc Area de alimentos

Area de analisis ambiental

Biociencias: Bioquimica y Microbiologia

Cuatro tecnologias:

Autoanalizadores

Inmunoensayos (ELISA)

Tiras reactivas

Biosensores

Analisis con autoanalizadores• Seguimiento de la reaccion por

espectrofotometria• Cambios en la absorcion molar NAD+/NADH.

Determina reactantes < 20 μM

Etanol + NAD+ Acetaldehido + NADH + H+Alcohol deshidrogenasa

Reaccion 1

Glucosa + ATP Glucosa-6-P + ADP

Reaccion 2

Glucosa-6-P + NADP+ 6-P-gluconato + NADPH + H+

Hexoquinasa

Glucosa 6-P-deshidrogenasa

Inmunoensayos - ELISA

Tiras reactivas• Analisis de glucosa

en orina y sangre

• Estimacion de colesterol

• Test de embarazo

Transformaciones enzimaticas• Preparacion de productos tales como:

- L-aminoacidos- Grasas modificadas- Edulcorantes artificiales

Biotransformaciones industriales

Produccion de penicilinas semisinteticas

Produccion de L-aminoacidos

Produccion de Aspartame

Produccion de detergentes

Ventajas del uso de enzimas- Bajas temperaturas de

lavado- Evitar el uso de sustancias

blanqueadoras y polifosfatos

- Mejorar la calidad del color de la ropa

Enzima tipica de lavanderia :- pH 10 -11- 40 – 60 ºC- Agentes blanqueadores

(perborato + activadores TAED)

- Agentes tensioactivos/agitacion

Produccion de detergentes

Enzimas usadas y sus funciones• Proteasas (siempre):• Lipasas (frecuentemente)• Amilasas (frecuentemente)• Celulasas (algunas veces)

Alimentos y areas relacionadasFabricacion de leche libre de

lactosa

Lactosa

(galactosa+glucosa) galβ(1-4)glc

β-galactosidasa

Galactosa Glucosa

Leche UHT(Industria lechera)

Lactasa microbiana

Transporte de leche Leche libre de lactosaConsumidor final

Fabricacion de cerveza light

-Cerveza normal tiene alto contenido calorico

alcohol y polisacaridos no hidrolizados en los procesos de malteado y produccion de mosto

-Añadir una enzima 1,6 exoglucanasa (Pululanasa) disminuye la cantidad de polisacaridos : ↑contenido alcoholico

-Cerveza debe ser diluida hasta alcanzar el grado alcoholico requerido

- Cerveza de 30% menos en calorias

Fabricacion de vinos y jugos

pectinasas pectinasas

Fabricacion de papel

celulasas xilanasasEnz ligninoliticas

Pulpa de papelCelulasas en clarificacion

Enzimas en el tratamiento de cuerosPelambre

Remojo de cuero

DesgrasadoProteasas

Lipasas

Producción anaerobica de enzimas a partir de bacterias extremofilas

Producción anaerobica de enzimas a partir de bacterias extremofilas

Producción aeróbica de enzimas a partir de hongos

23% proteasas17% amilasas 19% pectinasas

16% celulasas 13% lipasas 7% xilanasas

5% enzimas ligninolíticas