ANKARA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

DOKTORA TEZİ

BİYOKATALİTİK OLARAK ENANTİYOSEÇİMLİ αααα-HİDROKSİ KETON

ÜRETİM PROSESİNİN GELİŞTİRİLMESİ

ÇİĞDEM BABAARSLAN

KİMYA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI

ANKARA

2008

Her hakkı saklıdır

TEZ ONAYI

Çiğdem Babaarslan tarafından hazırlanan “Biyokatalitik Olarak Enantiyoseçimli αααα-

Hidroksi Keton Üretim Prosesinin Geliştirilmesi” adlı tez çalışması 20 Şubat 2008

tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri

Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı’nda DOKTORA TEZİ olarak kabul

edilmiştir.

Danışman : Prof.Dr. Ülkü MEHMETOĞLU

Eş Danışman : Prof.Dr. Ayhan Sıtkı DEMİR, Ortadoğu Teknik Üniversitesi, Kimya Anabilim Dalı Başkan: Prof. Dr. Tülin KUTSAL

Hacettepe Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı

Üye: Prof.Dr. Ülkü MEHMETOĞLU

Ankara Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı

Üye: Prof. Dr. Serpil TAKAÇ

Ankara Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı

Üye: Prof. Dr. Canan ÜNALEROĞLU

Hacettepe Üniversitesi, Kimya Anabilim Dalı

Üye: Prof. Dr. Mustafa GÜLLÜ

Ankara Üniversitesi, Kimya Anabilim Dalı

Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr.Ülkü MEHMETOĞLU Enstitü Müdürü

i

ÖZET

Doktora Tezi

BİYOKATALİTİK OLARAK ENANTİYOSEÇİMLİ α-HİDROKSİ KETON ÜRETİM PROSESİNİN GELİŞTİRİLMESİ

Çiğdem BABAARSLAN

Ankara Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

Danışman: Prof. Dr. Ülkü MEHMETOĞLU Eş-Danışman: Prof. Dr. Ayhan Sıtkı DEMİR

Bu tez kapsamında çeşitli izole enzimler ve mikroorganizmalar biyokatalizör olarak kullanılarak enantiyomerik saflıkta benzoin üretimi gerçekleştirilmiştir. Üretim için farklı yöntemler kullanılmıştır. İncelenen yöntemlerden ilki P. fluorescens biovar I katalizörlüğünde benzaldehitten C-C bağı oluşumu yoluyla enantiyomerik saflıkta benzoin üretimidir. BAL kaynağı olarak kullanılan P. fluorescens farklı üretim ortamlarında çoğaltılmış ve benzoin üretiminde kullanılmıştır. İncelenen tüm ortamlarda tepkimeyi katalizleyen BAL üretimi gözlenememiş, dolayısıyla benzoin elde edilememiştir. İkinci olarak farklı izole lipaz ve mikroorganizmalar (bakteri ve küf) ile rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu incelenmiş, çözücü, açil verici ve moleküler elek gibi ortam koşullarının benzoin enantiyoseçimliliği üzerine etkisi belirlenmiştir. Farklı biyokatalizörlerin kullanılması ve ortam koşullarının değiştirilmesi rasemik benzoin ee’sini önemli ölçüde değiştirmemiştir. En yüksek ee ve dönüşüm sırasıyla % 21 ve % 48 olarak P. fluorescens kullanıldığında S-benzoin için n-hekzan çözücü olarak kullanıldığında elde edilmiştir. Üçüncü olarak R. oryzae CBS-111718 küfü kullanılarak ras-benzoinin derasemizasyonu incelenmiştir. Rasemik benzoinin derasemizasyonu farklı pH’larda üreme ve tampon ortamlarında gerçekleştirilmiş ve pH’ın enantiyoseçimliliği önemli ölçüde etkilediği belirlenmiştir. Üreme ortamında en yüksek ee (%) değeri >99 olarak benzoinin S-enantiyomeri için pH: 6’da elde edilmiş, bu süre içerisinde benzoinin benzile dönüşümü % 49 olarak belirlenmiştir. Derasemizasyon tampon ortamında gerçekleştirildiğinde en yüksek ee değeri % 84 olarak pH:9’da S-enantiyomer için bulunmuş, bu süre içerisinde benzile dönüşüm ise % 24 hesaplanmıştır. Son olarak enantiyoseçimli benzoin üretimi R. oryzae CBS-111718 küfü katalizörlüğünde benzilin indirgenmesi ile gerçekleştirilmiştir. Üreme ortamında % 33 dönüşümle S-enantiyomer için en yüksek ee değeri % >99 olarak pH: 9’de bulunmuştur. Dondurarak kurutulmuş hücrelerle tampon ortam pH’sının ee üzerine etkisi incelendiğinde 9 en uygun pH olarak belirlenmiştir. Mikroorganizma üretim koşullarının ee’ye etkisi araştırıldığında en yüksek ee değerine pH: 7 de 2 gün üretilen hücrelerle ulaşılmış ve ee S-benzoin için % 92 bulunmuştur. Tampon ortamında ise en yüksek dönüşüm ve ee değeri 8. gün sonunda % 31 dönüşümle % 88 olarak S- benzoin için elde edilmiştir. Koenzim rejenerasyonunu arttırmak için kosubstrat olarak farklı karbonhidrat ve alkollerin tepkime ortamına ilavesi dönüşümü arttırmış, genel olarak ee’yi ise etkilememiştir. Ultrasound ile hücrelerin parçalanması tepkimeyi hızlandırmış, ee’yi ise düşürmüştür. Şubat 2008, 128 sayfa Anahtar kelimeler: Benzoin, benzil, C-C bağı oluşumu, kinetik rezolüsyon, derasemizasyon, indirgenme

ii

ABSTRACT

Ph.D. Thesis

DEVELOPMENT OF BIOCATALYTICAL ENANTIOSELECTIVE α-HYDROXY KETONE PRODUCTION PROCESS

Çiğdem BABAARSLAN

Ankara University

Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering

Supervisor: Prof. Dr. Ülkü MEHMETOĞLU Co-Supervisor: Prof. Dr. Ayhan Sıtkı DEMİR

The production of enantiomerically pure benzoin was performed using isolated lipase and microorganisms as biocatalyst within this thesis. Different methods were used for production. The first one was production of enantiomerically pure benzoin via P. fluorescens biovar I- catalyzed C-C bond formation from benzaldehyde. P. fluorescens used BAL enzyme source was growth in different mediums and used for production of benzoin. Because of generation of BAL could not be performed using the microorganism, benzoin wasn’t obtained in reaction media. Secondly, kinetic resolution of benzoin using different isolated enzymes and microorganisms (bacteria and fungus) was investigated. The effect of medium conditions as solvent, acyl donor and molecular sieve was researched on enantioselective benzoin production. To use different biocatalysts and change the medium conditions did not change the enantiomeric excess of benzoin markedly. The highest ee and conversion were found as 21 % and 48 %, respectively for S-benzoin using hexane. Optically pure benzoin production was achieved via deracemisation of rac-benzoin using R. oryzae CBS-111718 as a third. Deracemisation of benzoin was performed in growth and buffer having different pH. As a result, it was found that pH influenced enantioselectivity markedly. In growth medium, the highest ee was obtained for S-benzoin as >99 % at pH:6 and conversion of benzoin to benzil was found 49 %. In buffer medium, the best ee was found for S-benzoin as 84 % at pH:9 and conversion of benzoin to benzil was calculated as 24 %. Finaly, the production of enantioselective benzoin was performed with R. oryzae CBS-111718- catalyzed benzil reduction. In growth medium, the best ee and conversion were found as >99 % and 33 %, respectively for S-enantiomer at pH:9. In buffer medium, highest ee and conversion was found for S-benzoin 31 % and 88 %, respectively in 8 day. To increase coenzyme regeneration adding different carbohydrates and alcohols as cosubstrate enhanced the conversion but ee was not affected generaly. Disruption of microorganism using ultrasound increased the reaction rate but ee value decreased. February 2008, 128 pages Key words: Benzoin, benzil, C-C bond formation, kinetic resolution, deracemization, reduction

iii

TEŞEKKÜR

Akademik yaşantım boyunca tüm çalışmalarımı destekleyen ve manevi desteğini hiçbir

zaman esirgemeyen danışmanım Prof. Dr. Ülkü MEHMETOĞLU ve Doç. Dr. Emine

BAYRAKTAR’a, çalışmalarımda önerileriyle bana yol gösteren ve her konuda

yardımlarını gördüğüm hocalarım Prof. Dr. Ayhan Sıtkı DEMİR ve Doç. Dr. Afife

GÜVENÇ’e teşekkürlerimi sunarım.

Prof. Dr. Ayla ÇALIMLI, Prof. Dr. Murat EROL ve Prof. Dr. Zeki AKTAŞ başta olmak

üzere tüm Kimya Mühendisliği Bölümüne, gösterdikleri tüm yardım ve örnek

dostluklarından ötürü Dr. Emine YAĞMUR, Dr. Suna ERTUNÇ ve Doç. Dr. Bülent

AKAY’a şükranlarımı sunarım.

Doktora deneylerimi yaparken yardımlarını ve güler yüzünü esirgemeyen Peruze

AYHAN ve Cemil İŞLEK’e teşekkür ederim.

Eşi bulunmaz anları paylaştığım, her zaman yanımda olan ve dostluklarının ömür boyu

süreceğine inandığım değerli arkadaşlarım Mehmet YÜCEER, İlknur EMRE, Akif

SESLİ ve Atike ÖZCAN’a şükranlarımı sunarım.

Doktoramın son dönemlerinde gösterdiği tüm iyi niyet ve çabalarından ötürü Refik

Saydam Hıfzıssıhha Merkez Başkanlığı Çevre Sağlığı Araştırma Müdürü Hamza

YILDIZ, Hava Kirliliği Araştırma Laboratuar Şefi Lütfi KILIÇLAR ve iş arkadaşlarıma

teşekkürlerimi sunarım.

Çalışmamı, teşekkürün en büyüğünü hak eden, üzerimde en büyük emeğe sahip olan

Rahmetli babam Nizam BABAARSLAN, annem Naile BABAARSLAN ve

kardeşlerime ithaf ediyorum.

Çiğdem BABAARSLAN

Ankara, Şubat 2008

iv

İÇİNDEKİLER

ÖZET……………………………………………………………………………….... i ABSTRACT…………………………………………………………………………. ii TEŞEKKÜR…………………………………………………………………………. iiiSİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ……………………………………......... viiŞEKİLLER DİZİNİ………………………………………………………………...... viiiÇİZELGELER DİZİNİ………………………………………………………………. x1. GİRİŞ…………………………………………………………………………… 12. TEZİN AMACI……………...…………………………………………………. 63. KURAMSAL TEMELLER…………………………………………………… 83.1 Stereokimyasal Terimler………......…………………………………..……….. 8 3.1.1 Ayna görüntüleri ve kirallik….…………....………………………………… 83.1.2 Optikçe aktiflik……………....………………………………………………. 9 3.1.3 Mutlak konfigürasyonlar…...………………………………………………... 103.1.4 Enantiyomerler…………………...………………………………………….. 133.1.5 Rasem karışım……………………………………..………………………… 143.1.6 Kiral tanıma……………………………………………………...………....... 143.1.7 Enantiyomerik saflık belirlenmesi………………………………………….... 153.1.7.1 Optik rotasyon……………………………………………………………... 163.1.7.2 HPLC metodları……………………………………………………………. 163.1.7.3 GLC Metotları……………………………………………………………... 173.1.7.4 NMR metotları……………………………………………………………... 173.2 Enantiyomerik Olarak Saf Bileşiklerin Sentezi……………………………....... 173.2.1 Stereoseçimli sentez…………………………………………………………. 183.2.1.1 Kiral başlangıç substratı…………………………………………………… 193.2.1.2 Kiral ayırıcılar…………………………………………………………….... 193.2.1.3 Kiral çevre………………………………………………………………..... 203.2.2 Rasematların rezolüsyonu…………………………………………………..... 203.2.2.1 Tercihli kristalizasyon……………………………………………………... 213.2.2.2 Diastomer kristalizasyonu…………………………………………………. 213.2.2.3 Kromotografi………………………………………………………………. 223.2.2.4 Kinetik rezolüsyon…………………………………………………………. 223.3 Enzimler………………………………………………………………............... 243.3.1 Enzimlerin sınıflandırılmaları ve reaksiyon mekanizmaları……………........ 273.3.1.1 Oksidoreduktazlar (E.C.1) …………………………………………………………... 273.3.1.1.1 Dehidrojenazlar………………………………………………………………………. 293.3.1.1.2 Oksidaz ve oksijenazlar…………………………………………………………….. 323.3.1.1.3 Peroksidazlar………………………………………………………………………..... 323.3.1.2 Transferazlar (E.C.2) …………………………………………………………………. 323.3.1.3 Hidrolazlar (E.C. 3) ………………………………………………………………….... 333.3.1.3.1 Lipazlar (triaçilgliserol hirolazlar) ……………………………………………..... 333.3.1.4 Liyazlar (E.C.4) …………………………………………………………………..……. 363.3.1.4.1 Benzaldehit liyaz…..………………………………………………………………... 363.3.1.5 İzomerazlar (E.C.5) ………………………………………………………………..….. 403.3.1.6 Ligazlar (E.C.6) ………………………………………………………………………... 41

v

3.4 Biyokatalitik Uygulamalar………………………………………………….…. 413.4.1 Hidrolitik tepkimeler……………………………………………………….... 413.4.2 İndirgenme tepkimeleri……………………………………………………..... 423.4.2.1 İzole enzimler ile aldehit ve ketonların indirgenmesi……………………... 423.4.2.2 Tüm hücre (whole cell) ile aldehit ve ketonların indirgenmesi……………. 443.4.3 Oksidasyon tepkimeleri…………………………………………………….... 453.4.3.1 Oksijenasyon tepkimeleri………………………………………………….. 463.4.4 Karbon- karbon bağı oluşumu……………………………………………….. 473.5 Hücre Parçalama Yöntemleri…………………………………………………... 473.5.1 Mekanik hücre parçalama yöntemleri……………………………………...... 493.5.1.1 Ultrasonikasyon……………………………………………………………………….... 504. KAYNAK ARAŞTIRMASI…..……………………………………...………... 514.1 C-C Bağı Oluşumu Yoluyla…..……………………………………...………... 514.2 İndirgenme Yoluyla...………………………………………………………….. 564.3 Kinetik Rezolüsyon Yoluyla……………………………...…………………… 614.4 Derasemizasyon Yoluyla...…………………………………………………….. 675. GEREÇ ve YÖNTEM.………………………………………………………… 725.1 Gereçler……..………………………………………………………………..... 725.2 Yöntem………………………………………………………………………… 725.2.1 Mikroorganizmaların üretilmesi……………………………………………... 725.2.2 Tampon ortamları……………………………………………………………. 745.2.3 Mikroorganizmaların dondurularak kurutulması……………………….......... 745.2.4 Enantiyoseçimli benzoin üretimi…………………………………………….. 755.2.4.1 C-C bağı oluşumu yoluyla benzoinin enantiyoseçimli üretim tepkime koşulları……………………………………………………………………

75

5.2.4.2 Kinetik rezolüsyon yoluyla enantiyoseçimli üretim tepkime koşulları……. 765.2.4.3 İndirgenme ve derasemizasyon tepkime koşulları….……………………… 765.2.5 Substrat ve ürün analizi…..………………………………………………….. 776. BULGULAR…………………………………………………………………… 786.1 C-C Bağı Oluşumu Yoluyla Enantiyomerik Saflıkta Benzoin Üretimi……...... 786.1.1 Anisoin içeren tuz ortamı……………………………………………………. 796.1.2 Maya özütü içeren tuz ortamında üretim…………………………………….. 806.1.3 Zengin ortamda üretim……………………………………………………..... 816.1.4 Enantiyoseçimli benzoin üretimi…………………………………………….. 846.2 Rasemik Benzoinin Kinetik Rezolüsyonu ile Enantiyomerik Saflıkta Benzoin Eldesi …………………………………………………………………

84

6.2.1 P. fluorescens Biovar I ile rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu………..... 856.2.1.1 Mikroorganizma miktarının etkisi…………………………………………. 856.2.1.2 Çözücü cinsinin etkisi…………………………………………………….... 866.2.1.3 Başlangıç substrat miktarının etkisi………………………………………... 876.2.1.4 Açil verici cinsinin etkisi…………………………………………………... 886.2.1.5 Sıcaklığın etkisi…………………………………………………..………... 896.2.1.6 Karıştırma hızının etkisi………………………………………………….... 906.2.1.7 Moleküler elek miktarının etkisi………………………………….………... 916.2.1.8 Islak hücrelerle rasemik benzoinin kinetik…………………………..…….. 926.2.2 Farklı küfler ile rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu………………...…... 926.2.2.1 Çözücü etkisi………………………..……………………………………... 93

vi

6.2.2.2 Açil verici cinsinin etkisi…………………...……………………………… 946.2.2.3 Farklı bakteriler ile rasemik benzoinin enantiyoseçimli elde edilmesi……. 946.2.3 Farklı izole lipaz enzimleri ile rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu…....... 956.2.3.1 Enzim kaynağının etkisi…………………………………………………… 966.2.3.2 Açil verici etkisi……………………………………………………………. 966.2.3.3 Sıcaklık etkisi…………..………………………………………………….. 976.2.3.4 Moleküler elek miktarının etkisi.…………………………….…………….. 986. 3 Benzilin İndirgenmesi ile Enantiyoseçimli Benzoin Eldesi..…….…………… 99 6.3.1 Üreme ortamında benzilin indirgenmesi ile enantioseçimli benzoin

üretimi…....……………………………………………………….………….. 100

6.3.1.1 Üreme ortam pH’sının enantioseçimli benzoin üretimine etkisi…..………. 1006.3.1.2 Üreme ortamında rasemik benzoinin derasemizasyonu…..……………...... 1026.3.2 Tampon ortamında benzilin indirgenmesi ile enantioseçimli benzoin

üretimi..…………………………………………………………………….. 103

6.3.2.1 Tampon ortam pH’sının enantioseçimli benzoin üretimi……………...…... 1046.3.2.2 Mikroorganizma üretim koşullarının enantiyoseçimlilik üzerine etkisi........ 1046.3.2.3 En iyi üretim koşullarında tampon pH’sının enantioseçimli

benzoin üretimine etkisi …............................................................................ 106

6.3.2.4 Tampon ortamında benzoinin derasemizasyonu…………..……...……….. 1086.3.2.5 Kosubstrat ilavesinin enantiyoseçimli benzoin üretimine etkisi ...………... 1096.3.2.6 Ses ötesi dalgaların enantiyoseçimli benzoin üretimine etkisi……..……… 1107. TARTIŞMA ve SONUÇ…………………………….…………….……………. 1127.1 Sonuçlar………………………………………………………………………... 1127.2 Değerlendirme…………………………………………………………………. 114

KAYNAKLAR………………………………………………………………………. 116EKLER……………………………………………………………………………….. 121ÖZGEÇMİŞ………………………………………………………………………...... 126

vii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ

Simgeler α Çevirme açısı

[α] Enantiyomer karışımının çevirme açısı

Kısaltmalar ee Enantiyomerik aşırılık

c Dönüşüm

T Sıcaklık DMSO Dimetil sülfoksit

THF Tetrahidrofuran

DMF Dimetilformamit

ME Moleküler elek

LYM Liyofilize mikroorganizma

VA Vinil asetat

HPLC Yüksek basınç sıvı kromotografi

TLC İnce tabaka kromotografi

ATCC American Type Culture Collection

CBS Centraalbureau voor Schimmelcultures

Kf Konfigürasyon

BAL Benzaldehit liyaz

ThDP Thiamin difosfat

ThDP Thiamin pirofosfat

viii

ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1.1 Endüstiriyel olarak kiral bileşik sentezi için kiral kaynaklar (134

proses)………………………………………………………………. 3 Şekil 1.2 Endüstriyel proseslerle kullanılan enzim türleri (134 proses)…….... 4 Şekil 1.3 Endüstriyel proseslerde enzim veya tüm hücrelerin kullanımı (134

proses)…………………………………………………………….....

4 Şekil 2.1 Benzoinin enantiyomerleri………………………………………….. 6 Şekil 3.1 Bromofloroklorometanın iki enantiyomeri……….………………… 8 Şekil 3.2 Sol el ve onun ayna görüntüsü sağ el……………………………….. 9 Şekil 3.3 2-bromo-2-kloro-1,1,1-trifloroetan (halotan)……………………….. 10 Şekil 3.4 Karvonun enantiyomerleri………………………………………….. 14 Şekil 3.5 Nikotin, adrenalin ve tiroksin……………………………………….. 15 Şekil 3.6 Enantiyomerik saflıkta bileşiklerin sentezinde kullanılan metotlar… 18 Şekil 3.7 Stereoseçimli sentez………………………………………………… 19 Şekil 3.8 Rasematların rezolüsyonu için metotlar…………………………….. 21 Şekil 3.9 Katalitik kinetik rezolüsyon………………………………………… 22 Şekil 3.10 Kinetik rezolüsyon………………………………………………….. 23 Şekil 3.11 Dinamik kinetik rezolüsyon………………………………………… 24 Şekil 3.12 İndirgenme için hidrojen kaynağı olarak HCO2H kullanarak

NADH’ın geri dönüşümü…………………………………………… 30 Şekil 3.13 Alkol dehidrojenaz enzimi………………………………………….. 31 Şekil 3.14 Lipazların katalizlediği tepkimeler…………………………………. 35 Şekil 3.15 Benzaldehit liyaz katalizli kırılma ve benzoin sentezi……………… 37 Şekil 3.16 Benzoin molekülünün R- ve S- enantiyomerleri……………………. 37 Şekil 3.17 Tiamin pirofosfat………………………………………………….. 38 Şekil 3.18 TPP ile α-ketollerin oluşması ve yıkılması…………………………. 39 Şekil 3.19 Dehidrojenaz katalizli indirgenme reaksiyonu……………………... 42 Şekil 3.20 Ketonların asimetrik indirgenmesi için Prelog’un kuralı…………… 43 Şekil 3.21 Enzimatik oksidasyon reaksiyonları………………………………... 47 Şekil 3.22 Hücre parçalama yöntemleri………………………………………... 48 Şekil 4.1 BFD katalizli α –hidroksi keton üretim tepkimesi………………..... 52 Şekil 4.2 BAL katalizli α –hidroksi keton üretim tepkimesi…………………. 54 Şekil 4.3 Benzaldehit ve pirüvatın R-PAC’ye biyotransformasyonu…….…… 56 Şekil 4.4 α -Diketonların indirgenme tepkimesi……………………………… 57 Şekil 4.5 Benzilin enantiyoseçimli indirgenmesi…………………................... 58 Şekil 4.6 Stereoseçimli olarak karbonil gurubunun indirgenmesi……………. 59 Şekil 4.7 α-Haloketonların maya katalizli indirgenmesi……………………... 60 Şekil 4.8 α-Haloketonların indirgenmesi……………………………………... 61 Şekil 4.9 α-Hidroksi ketonların kinetik rezolüsyonu………….……………… 62 Şekil 4.10 İncelen α –hidroksi ketonların…………………………………......... 62 Şekil 4.11 α-Asetoksi ketonların enantiyoseçimli hidrolizi ile hidroksi

ketonların sentezi………………………………………………........ 63 Şekil 4.12 Rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu…………………………..... 65 Şekil 4.13 Rasemik 2-fenil-1-propiyonik asitin alkol ile esterleşmesi………..... 66 Şekil 4.14 Nitrillerin (±)-1 hidrolizi………………………………………......... 66 Şekil 4.15 (R/S)-1-ariletil asetatların hidroliz tepkimesi……………………….. 67

ix

Şekil 4.16 (±)-Adrenejik blokerlerin derasemisazyonu………………………... 68 Şekil 4.17 Rasemik benzoinin derasemizasyonu………………………………. 69 Şekil 4.18 Rasemik α-hidroksi asit esterlerinin derasemizasyonu…………....... 69 Şekil 4.19 Derasemizasyon tepkimesi için önerilen tepkime mekanizması…..... 70 Şekil 5.1 Mikroorganizma üretimi ve dondurarak kurutulması ………..…….. 75 Şekil 5.2 Kinetik rezolüsyon tepkime ortamı……………................................. 76 Şekil 6.1 C-C bağı oluşumu yoluyla benzaldehitden enantiyoseçimli benzoin

eldesi………………………………………………………………... 78 Şekil 6.2 Anisoin tuz ortamında hücre üreme eğrisi………..………………… 79 Şekil 6.3 Farklı derişimlerde maya özütü içeren besi ortamlarında hücre

üreme eğrileri………..……………………………………………… 80 Şekil 6.4 0.5 g/L maya özütü ile birlikte farklı karbon kaynakları ve içeren

besi ortamlarında hücre üreme eğrileri……………………………... 81 Şekil 6.5 Zengin ortamda hücre büyüme eğrisi………..………………..…….. 82 Şekil 6.6 Farklı substrat içeren tuz ortamında hücre üreme eğrileri…………... 83 Şekil 6.7 Farklı çözücülerin hücre üremesi üzerine etkisi…………………….. 83 Şekil 6.8 Rasemik benzoinin çözücülü ortamda kinetik rezolüsyonu……….... 85 Şekil 6.9 Benzilin indirgenme tepkimesi.......………..…………..………….... 100 Şekil 6.10 Ultrasonik ses dalgalarının ee ve dönüşüm üzerin etkisi….………... 111

x

ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Benzoin’in özellikleri 6 Çizelge 3.1 Organik sentezde yaygın olarak kullanılan enzimler….…………….... 26 Çizelge 3.2 Enzim sınıfları……………………………………………………….... 27 Çizelge 3.3 Kofaktör olarak tiamin pirofosfat (TPP) gerektiren bazı enzimler…… 40 Çizelge 3.4 Prelog’un kuralına uyan dehidrojenazlar……………………………... 43 Çizelge 4.1 BFD katalizli aromatik aldehitler……………………………………... 53 Çizelge 4.2 BAL katalizlediği aromatik aldehitler………………………………… 55 Çizelge 4.3 α-Asetoksi keton ve hidroliz sonucu elde edilen α-hidroksi ketonlar... 64 Çizelge 5.1 Anisoin tuz ortamı………..……………………….…………………... 73 Çizelge 5.2 Küf katı üretim ortamı………..………………………………………. 74 Çizelge 5.3 Analiz koşulları……………………………………………………….. 77 Çizelge 6.1 Başlangıç mikroorganizma miktarının ee üzerine etkisi, 25 gün

(50 mg Benzoin, 5 mL THF, 2.5 mL VA, 0.23 g ME, 30 oC, 150 rpm)…………………………………………………………………....

86 Çizelge 6.2 Çözücü cinsinin ee üzerine etkisi, 25 gün (50 mg Benzoin, 50 mg

LFM, VA=2.5 mL, ME=0.23 g, T=30 oC, 150 rpm)...………………..

87 Çizelge 6.3 Başlangıç substrat miktarının ee üzerine etkisi, 25 gün (50 mg LFM,

5 mL THF, 2.5 mL VA, 0.23 g ME, 30 oC, 150 rpm)………...............

88 Çizelge 6.4 Açil verici cinsinin ee üzerine etkisi, 25 gün (50 mg Benzoin, 50 mg

LFM, 5 mL THF, 0.23 g ME, 30 oC, 150 rpm)…...………..………....

89 Çizelge 6.5 Çizelge 6.5 Sıcaklığın ee üzerine etkisi, 25 gün (50 mg Benzoin, 50 mg LFM, 5

mL THF, 2.5 mL VA, 0.23 g ME, 150 rpm)……...……………….…

90 Çizelge 6.6 Karıştırma hızının ee üzerine etkisi, 25 gün (50 mg Benzoin, 50 mg

LFM, 5 mL THF, 2.5 mL VA, 0.23 g ME, 30 oC )…………………....

90 Çizelge 6.7 Moleküler elek miktarının ee üzerine etkisi, 25 gün (50 mg Benzoin,

50 mg LFM, 5 mL THF, 2.5 mL VA, 30 oC, 150 rpm)………….……

91 Çizelge 6.8 Islak hücrelerle rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu (50 mg

Benzoin, 100 mg LFM, 5 mL THF, 2.5 mL VA, 0.23 g ME, 30 oC, 150 rpm……………………………………………………..…….....

92 Çizelge 6.9 Çözücü cinsinin ee üzerine etkisi (50 mg Benzoin, 50 mg LFM,

2.5 mL VA, 0.23 g ME, 30 oC, 150 rpm)……...………..……………..

93 Çizelge 6.10 Açil verici cinsinin ees üzerine etkisi, 30 gün (50 mg Benzoin,

50 mg LFM, 5 mL THF, 30 oC, 150 rpm) …………..……………….

94 Çizelge 6.11 Farklı bakterilerin ee üzerine etkisi, 17 gün (30 mg Benzoin, 30 mg

LFM, 2.5 mL THF, 1.5 mL VA, 0.15 g ME, 30 oC,150 rpm………….

95 Çizelge 6.12 Enzim kaynağının ee üzerine etkisi, 5 gün (50 mg Benzoin, 50 mg

Enzim, 5 mL THF, 2.5 mL VA, 0.1 g ME, 30 oC, 150 rpm)………..... 96 Çizelge 6.13 Açil verici türünün ee üzerine etkisi (50 mg Benzoin, 50 mg P.

cepeciae, 5 mL THF, 0.1 g ME, 30 oC , 150 rpm)………........………. 97 Çizelge 6.14 Açil verici türünün ee üzerine etkisi, 4 gün (50 mg Benzoin, 50 mg

Amono Lipaz PS II, 5 mL THF, 0.1 g ME, 30 oC, 150 rpm)……...….. 97 Çizelge 6.15 Sıcaklığın ee üzerine etkisi (50 mg Benzoin, 50 mg P. cepeciae,

2.5 mL VA, 5 mL THF, 0.1 g ME, 150 rpm)....…...……...………..…

98 Çizelge 6.16 Moleküler elek miktarının ee üzerine etkisi etkisi (50 mg Benzoin, 50

mg P. cepecia, 2.5 mL VA, 5 mL THF, 30 oC, 150 rpm..…………….

99

xi

Çizelge 6.17 Benzilden enantiyoseçimli benzoin üretimine üreme ortam pH’ının

etkisi (0.004 g benzil/10 mL, 0.1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm)…........ 101 Çizelge 6.18 Üreme ortamında rasemik benzoinin derasemizasyonu (0.04 g

benzoin /100 mL, 1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm)……………………. 103 Çizelge 6.19 Benzilden enantiyoseçimli benzoin üretimine tampon ortam pH’ının

etkisi (2 g LYM, 0.04 g benzoin/100 mL, 1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm)….…..……………………………………………………………. 104

Çizelge 6.20 Mikroorganizma üretim süresinin enantiyoseçimli benzoin üretimine etkisi (2 g LYM, 0.04 g benzoin/100 mL, 1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm)…………………………………………………………………… 105

Çizelge 6.21 Mikroorganizma üretim pH’ının enantiyoseçimli benzoin üretimine etkisi (2 g LYM, 0.04 g benzoin/100 mL, 1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm)………….……………………………………………………....... 106

Çizelge 6.22 Enantiyoseçimli benzoin üretimin tampon ortamı pH etkisi (0.2 g LYM, 0.004 g benzoin/10 mL, 0.1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm)…... 107

Çizelge 6.23 Tampon ortamında rasemik benzoinin derasemizasyonu (2 g LYM, 0.04 g benzoin/100 mL, 1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm)……….…….. 108

Çizelge 6.24 Kosubstrat ilavesinin enantiyoseçimli benzoin üretimine etkisi (0.2 g LYM, 0.004 g benzoin/10 mL, 0.1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm, 6 gün)…………………………………………………............................ 109

Çizelge 6.25 Ultrasonik ses dalgası uygulama sayısının ee ve dönüşüm üzerine etkisi (0.2 g LYM, 0.004 g benzoin/10 mL, 0.1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm)………………………………………….…………………… 111

1

1. GİRİŞ

Eczacılık ya da ziraatte kullanılan kiral moleküller genellikle karmaşık olup, çok

fonksiyonlu yapıları vardır. Genel olarak enantiyomerik saflıkta ya da rasemik halde

bulunurlar. Enantiyomerik çiftler birbirinin üst üste çakışmayan ayna görüntüsü olup,

atomlarının üç boyutlu uzaydaki dizilişleri farklıdır. Yoğunluk, erime noktası, kaynama

noktası gibi fiziksel ve birçok kimyasal özellik her iki enantiyomer için de aynıdır.

Ancak üç boyutlu uzayda atomlarının düzenlenmesine bağlı olarak farklı biyolojik

aktivite gösterirler (Tüzün 1994). Farklı biyolojik etkilerinden dolayı genellikle

enantiyomerlerden yalnız bir tanesi istenen aktiviteyi sağlar ve farmokolojik açıdan ilgi

görür (Williams et al.1998). İstenmeyen enantiyomer ise bir biyolojik aktivite

göstermez ve safsızlık olarak nitelendirilir, yan ve toksik etki gösterebilir ya da diğer

enantiyomerin etkisini azaltacak yönde çalışabilir (Maier et al. 2001). Bu nedenle bu

enantiyomerlerin ayrılması ilaç endüstrisi için büyük önem taşır (Kordikowski et al.

1999).

Son yıllarda yapılan araştırmalara göre dünyada pazarlanan reçeteli ve kayıtlı ilaçların

sayısı 5.000 civarındadır ve bunların yaklaşık üçte biri ya doğal üründür ya da doğal

ürünlerin kimyasal modifikasyonu ile elde edilmişlerdir. Doğal ürünlerden elde edilen

ilaçların çoğu kiral olup çoğu zaman rasem karışım şeklinde değilde bir tek enantiyomer

olarak elde edilirler. 1300 den fazla ilaçta bulunan 500’ün üzerindeki kiral madde

organik kimya ürünleridir. Son zamanlara kadar böyle bileşikler, birkaç istisna dışında,

uygun terapi aktivitesinin enantiyomerlerden yalnız birinde mevcut olmasına rağmen,

rasem karışımlar halinde elde edilir, satılır ve uygulanırdı. Bu yöntem kiral sentetik

ilaçların enantiyomerik olarak saf halde daha fazla elde edilmesi şeklinde hızlı bir

değişikliğe uğramıştır. Sonuç olarak, ilaçlar ve agrokimyasalların üretiminde optik

olarak saf enantiyomerlerin kullanımı giderek artan bir eğilim göstermeye başlamıştır.

Optikçe aktif saf enantiyomerler hedefe spesifiktirler ve rasemik karışımlardan daha az

yan etkiye sahiptirler (Mustaranta et al. 2001, Tüzün 1994 ). Tek enantiyomerli ilaç

satışları dünya çapında sürekli olarak büyümektedir. Çok satılan 500 ilaçtan 269’u tek

2

enantiyomer içermektedir. Örnek olarak, rasemik ilaç halinde iken hiç bir etki

göstermeyen fluoxetine’nin S- formunun migreni önleyici etkisi vardır. Omeprazol’un

S- formu mide ülserini iyileştirmek için kullanılmaktadır ve 1997’de 5 milyar $ satarak

dünyada en çok satan ilaç olmuştur (Maier et al. 2001). 2-arilpropiyonik asit sınıfından

olan ateş düşürücü ilaç ibuprofenin yalnızca S (+) formu aktiftir (Mustaranta et al.

2001). Dolayısıyla ilaç olarak kullanılabilecek aktif enantiyomeri ayırmak veya

enantiyoseçimli çıkış maddeleri ile ilaç üretmek, diğer enantiyomerin hastada

oluşturduğu olumsuz etkileri engellemek açısından büyük önem taşır.

Optik saflıkta enantiyomerlerin eldesi için rasemik karışımların rezolüsyonu (kinetik

rezolüsyon, diastereomerik kristalizasyon), kiral havuzda yer alan bileşiklerden sentez

ve asimetrik sentez olmak üzere üç temel yol vardır. Optik olarak saf bileşikleri elde

etmek için diğer yollarda önemli ilerlemeler olmasına rağmen diastereomerik

kristalizasyon ile rasematların klasik rezolüsyonu hala endüstride kullanılan en önemli

yöntemlerden biridir. Ancak bir enantiyomerin maksimum teorik verimi % 50’dir

(Jacques et al. 1981). Kinetik rezolüsyonda rasemik karışım kiral girdi ile farklı hızlarda

tepkimeye girer. En mükemmel kinetik rezolüsyonun enzimler kullanılarak

gerçekleştirildiği rapor edilmiştir. Doğal olarak meydana gelen kiral bileşikler (kiral

havuz bileşikleri) enantiyomerik saflıkta bileşiklerin sentezinde başlangıç maddesi

olarak ya da organik sentezde enantiyoseçimli ajan (katalizör ya da ligand) olarak

kullanılır (Blaser et al. 1992). Doğal bileşiklerin çoğunun iki enantiyomerinin de

mevcut olmaması ise kısıtlayıcı faktördür. Stereoseçimli sentez için en umut verici ve

en cazip yöntem asimetrik katalizdir. Başarılı tepkimelerin büyük bir kısmında ee’nin

>% 95 olduğu belirlenmiştir. Bu tepkimeler asimetrik indirgenme, asimetrik oksidasyon

ve asimetrik C-C bağı oluşumu şeklindedir. Özellikle C-C bağı oluşumunun çok büyük

sentetik kullanımı vardır (Ojima 1993, Brunner et al. 1993). Şekil 1.1’de biyokatalitik

olarak gerçekleştirilen endüstriyel proseslerle üretilen ürünler için kiral bileşik

kaynakları verilmiştir (Straathof et al. 2002).

3

Şekil 1.1 Endüstriyel olarak kiral bileşik sentezi için kiral kaynaklar (134 proses)

Farmasotik ürünlerin sentezi ve optik olarak saf ilaçların stereoseçimli olarak elde

edilmesi için katalizör olarak enzim ya da mikroorganizmaların kullanımı büyük ölçüde

önem kazanmış ve biyolojik katalizörlerin kullanıldığı çalışmalar giderek artmıştır.

Biyokatalizörler homojen ve heterojen kimyasal katalizörlerle karşılaştırıldığında eşsiz

özelliklere sahiptir. Biyokatalizörlerin gerçekleştirdiği tepkimeler daha hızlıdır ve

çevreye daha tehlikesizdir. Ilımlı koşullarda tepkimeleri gerçekleştirdiklerinden dolayı

bozunma, izomerizasyon ve rasemizasyon gibi istenmeyen yan tepkimeler önlenir.

Biyokatalizörler sayısız reaksiyonu katalizleyebilirler ve stereoseçimlilikleri yüksektir.

Örnek olarak, S-formu R-formuna göre 28 kez daha etkili olan naproksenin (ağrı kesici)

enzimatik olarak ayrılması diğer ayırma proseslerine göre daha verimli olmaktadır (Wu

et al. 1999). Gerçekleştirilen biyokatalitik araştırmaların büyük çoğunluğunda hidrolitik

enzimler kullanılırken, % 15’inde oksidoredüktazlar ve % 15’den daha azında ise diğer

enzimler kullanılır. Temel alınan 134 endüstriyel prosesde kullanılan enzim türleri Şekil

1.2’de gösterilmiştir. Genel olarak hücrelerin doğrudan (whole cells) kullanımı, izole

edilmiş enzimlere göre daha popülerdir. Tutuklama ise hücrelerin doğrudan kullanımı

izole enzimlere göre daha az yaygındır (Şekil 1.3) (Straathof et al. 2002).

Kiral havuz bileşikleri

Kinetik rezolüsyon

Asimetrik sentez

Kirallik içermeyen

4

Şekil 1.2 Endüstiriyel proseslerle kullanılan enzim türleri (134 proses)

Şekil 1.3 Endüstiriyel proseslerde enzim veya tüm hücrelerin kullanımı (134 proses)

Enantiyomerik olarak saf α-hidroksi ketonlar ise sahip oldukları önemli fonksiyonel

gruplar nedeniyle asimetrik sentezin vazgeçilmez yapı taşlarıdır ve biyolojik olarak

etkin çeşitli moleküllerin asimetrik sentezinde başlangıç maddesi olarak kullanılırlar.

Endüstriyel açıdan önemli ilaçların ve doğal ürünlerin sentezinde kullanılan kiral

alkollerin üretiminde kullanılırlar. Ayrıca 2-hidroksipropiyofenon türevlerinin

sentezinde anahtar ara üründürler. Aerolik asit antibiyotiklerin, anti-bakteriyel,

antidepresyon, anti-virütik, potasyum kanal açıcıları ve çeşitli kalp ilaçlarının

sentezlenmesi için önemli yapı taşlarıdır. Örnek olarak R–1-(3-klorofenil)-2-

hidroksipropan-1-on depresyonu iyileştirmekte kullanılan bupropiyon için başlangıç

maddesidir.

Oksidoredüktazlar Trasferazlar

Liyazlar Hidrolazlar

İndirgeyici hücreler

Oksitleyici hücreler

İzomerazlar

Tutuklanmış hücreler

Serbest hücreler

Tutuklanmış enzimler

Serbest enzimler

Rapor edilmemiş

Proses sayısı

5

Optikçe saf α-hidroksi ketonlar çeşitli kimyasal ve enzimatik yöntemlerle üretilebilirler.

Kimyasal olarak kiral triazolyum tuzlarının katalizör olarak kullanıldığı C-C bağı

oluşum reaksiyonları, C-C bağı oluşumuna dayanmayan optikçe aktif enolatların

steroseçimli oksidasyonu, optikçe aktif oksaziridinler kullanılarak prokiral enolatların

oksidasyonu, kiral titanyum enolatlarının seçimli oksidasyonu, silil enol eterlerin

asimetrik oksidasyonu gibi çeşitli yöntemlerle üretilmektedir. Biyokatalitik olarak

aromatik aldehitlerden C-C bağı oluşumuyla prokiral ketonların indirgenmesi, rasemik

α-hidroksi, perokso ve asetoksi ketonların kinetik rezolüsyonu ve derasemizasyon

yöntemleri ile gerçekleştirilmektedir (Nakamura et al.1996, Demir vd. 1999).

Biyokatalitik üretim kimyasal yolla yapılan üretime oranla daha avantajlı olduğundan

bu tez kapsamında biyokatalitik olarak α-hidroksi ketonların üretimi araştırılmıştır.

İzole enzim saflaştırmanın maliyetinin yüksek, daha zahmetli bir iş olmasından dolayı

ve koenzim rejenerasyonuna gerek duyulmaması sebebiyle biyokatalizör olarak izole

enzimler yerine tüm hücreler kullanılmıştır. Model olarak seçilen ve bir α-hidroksi

keton olan benzoinin enantiyoseçimli üretimi çeşitli enzim ve mikroorganizmalar

kullanılarak gerçekleştirilmiştir. En yüksek dönüşüm ve enantiyomerik aşırılıkta

benzoinin elde edilebilmesi için C-C bağı oluşumu, kinetik rezolüsyon, indirgenme

derasemizasyon gibi farklı yöntemler kullanılmıştır. Biyokatalizör olarak çeşitli bakteri,

küfler ve saf lipaz enzimleri kullanılmıştır.

6

2. TEZİN AMACI Enantiyomerik olarak saf α-hidroksi ketonlar sahip oldukları önemli fonksiyonel

gruplar nedeniyle asimetrik sentezin vazgeçilmez yapı taşlarıdır ve biyolojik olarak

etkin çeşitli moleküllerin asimetrik sentezinde başlangıç maddesi olarak kullanılırlar.

Bu tez kapsamında model olarak seçilen ve bir α-hidroksi keton olan benzoinin

enantiyomerik saflıkta eldesi araştırılmıştır (Şekil 2.1). Çizelge 2.1’de benzoinin

özellikleri gösterilmiştir. Yüksek enantiyomerik saflıkta benzoin üretimi için uygun

yöntem, biyokatalizör ve ortam koşullarının etkisi incelenmiştir.

R-benzoin S-benzoin

Şekil 2.1 Benzoinin enantiyomerleri Çizelge 2.1 Benzoin’in özellikleri

Formül C14H12O2

Molekül ağırlığı 212.2476 g/mol

Suda çözünürlüğü 0.0001 g/ mL

Kaynama noktası 444 o

Kritik sıcaklık 548 oC

Kritik basınç 33.14 bar

Kritik hacim 622.5 cm3/mol

Erime noktası 122 oC

Log P 2.53

7

Enantiyoseçimli benzoin üretimi çeşitli biyokatalizörler kullanılarak dört farklı

yöntemle gerçekleştirilmiştir:

1. Benzaldehit’ten C-C bağı oluşumu

Biyokatalizör: BAL enzim kaynağı olarak P. fluorescens biovar I (ATCC 3615 )

2. Rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu

Biyokatalizörler: Lipaz kaynağı olarak Pseudomonas fluorescens biovar I

Pseudomonas putida

Pseudomonas stutzeri

Pseudomonas aeroginase

Rhizopus oryzae CBS-112-07

Aspergillus oryzae MIM

Amono lipaz PS II

Pseudomonas cepeciae lipaz 3. Benzilin indirgenmesi Biyokatalizör: Rhizopus oryzae CBS-111718 4. Rasemik benzoinin derasemizasyonu Biyokatalizör: Rhizopus oryzae CBS-111718

8

3. KURAMSAL TEMELLER

3.1 Stereokimyasal Terimler

Atomların ve moleküllerin uzaysal düzenlenmeleri ile ilgili çalışmalar stereokimya

olarak bilinir. Organik bileşiklerin enantiyoseçimli sentezinde enantiyoseçimliliği daha

iyi anlayabilmek için bazı stereokimyasal terimlerin iyi bilinmesi gerekir.

3.1.1 Ayna görüntüleri ve kirallik

Bir organik molekülün optikçe aktif olabilmesi için molekülün disimetrik olması

gereklidir. Bir molekülde disimetri meydana gelmesi için molekülde bulunan bir karbon

atomuna dört farklı atom veya grup bağlı olması gerekir. Moleküldeki bazı engellenmiş

dönmelerle de disimmetri meydana gelebilir ve bu sebepten böyle bileşiklerde optikçe

aktiflik gösterebilir. Moleküllerdeki dissimetriye kiralik de denir. Bromofloro

klorometan da bir karbon atomuna bağlı dört farklı atom (Br, Cl, F, H) olup bu molekül

kiral moleküldür ve bu karbon merkezi de stereojenik merkez olarak tanımlanır. Böyle

bir bileşiğin polarize ışığın düzlemini birisi sağa, öbürü sola çeviren iki optik izomeri

bulunur. Bunlara enantiyomerler denir ve bromofuloroklorometanın iki enantiyomeri

örnek gösterilebilir (Şekil 3.1). Enantiyomerler simetrik olmayan yani dissimetrik

moleküllerdir.

Şekil 3.1 Bromoklorofulorometanın iki enantiyomeri

9

Kiral sözcüğü Yunanca’da el anlamındaki cheiros kelimesinden gelmektedir. Sağ el ve

sol el ya da sağ ayak sol ayak birbirine çok benzediği halde birbirinin tam aynı değildir

(Şekil 3.2). Sol elimizi aynanın önüne tuttuğumuzda ayna görüntüsü sağ elimizdir ve

sağ ile sol elimizi üst üste getirdiğimizde çakışmazlar. Ayna görüntüsü ile üst üste

çakışmayan nesneler ya da moleküller kiraldir. Molekül içinde bir simetri öğesi

bulunmasıyla molekül dissimetrik olmaktan çıkar, yani simetrik olur ve optikçe

aktifliğini yitirir. Geometride simetri öğeleri nokta, doğru veya düzlem olabilir ve bu

simetri öğelerinden en az bir tanesi var ise molekül simetriktir (Tüzün 1994).

Şekil 3.2 Sol el ve onun ayna görüntüsü sağ el 3.1.2 Optikçe aktiflik

Polarize ışık, içinden geçtiğinde titreşim düzlemini değiştiren maddelere optikçe aktif

maddeler denir. Böyle maddeler organik veya inorganik türden olabilir. Örneğin kuvars,

kalsit, aragonit gibi mineraller ile doğal laktik asit, malik asit gibi birçok organik

bileşikler bu özelliği gösterirler yani polarize ışığın titreşim düzlemini belirli bir derece

sağa ya da sola çevirirler. Ancak bu özellik bakımından iki tür bileşik arasında temel bir

fark vardır: inorganik bileşiklerin bu özellikleri sadece kristal yapıları ile ilgilidir,

örneğin eritilerek veya bir çözücüde çözülerek kristal yapısı değiştiğinde madde

özelliğini yitirir. Oysa organik bileşiklerin optikçe aktiflik özellikleri, kristal yapılarına

bağlı olmayıp molekül yapılarıyla ilgili bir özelliktir. Optikçe aktif organik bir bileşik

eritilse, bir çözücüde çözülse veya buhar haline getirilse bu özelliğini yitirmez (Tüzün

1994).

10

3.1.3 Mutlak konfigürasyon

Bağıl konfigürasyonda bir stereojenik merkeze bağlı grupların düzeni, bazı standart

referans bileşiklere veya onun tersine benzer olarak tanımlanır. Oysa ki gerçek düzen

eğer molekülün fotoğrafı çekilebilirse görülendir ki bu da molekülün mutlak

konfigürasyonudur.

Mutlak konfigürasyonu belirlemek için kullanılan sistem ilk defa 1956 yılında iki

İngiliz kimyacısı R.S. Cahn ve Sir Christoper Ingold tarafından ve Vladimir Prelog’un

iş birliği ile gerçekleştirildi. Bu geliştirilen sistemin en önemli özeliği genel anlamda

moleküldeki stereojenik karbona bağlı olan atomların, atom numaralarına göre öncelikli

sıralanmasıdır. Örneğin, hastanelerde anestezi maddesi olarak kullanılan 2-bromo-2-

kloro-1,1,1-trifloroetanın her bir enantiyomerinin mutlak konfügürasyonu aşağıdaki

kurala göre belirlenir (Şekil 3.3).

Şekil 3.3 2-bromo-2-kloro-1,1,1-trifloroetan (halotan)

1. Stereojenik karbona bağlı atomlar belirlenir ve azalan atom numarasına göre sıralanır.

Bu sıralama aynı zamanda stereojenik karbona bağlı atom ve birden fazla atomdan

oluşan grupların öncelikli sırasını belirler. Örnek moleküldeki stereojenik karbona bağlı

atom ya da gruplar H, Cl, Br ve CF3 olup bunlar azalan atom sırasına göre sıralanır.

Br> Cl>C>H

En öncelikli En az öncelikli

11

2. En az öncelikli atom ya da grup sayfa düzleminin arkasında kalacak şekilde molekül

yönlendirilir. Örnekte hidrojen en az öncelikli olup molekül doğru yönelimdedir.

En az öncelikli

A B

3. Daha sonra, moleküldeki kalan diğer üç atom ya da grup moleküle aynı yönden, yani

en küçük grup arkada kalacak şekilde önden bakıldığında nasıl görünüyorlarsa o şekilde

çizilir.

(2) (4) (4) (2)

(3) (3)

[Öncelikli sıra: 4 en yüksek]

4. En öncelikli olan gruptan azalan öncelik sırasına göre (Br> Cl>CF3) gidildiğinde, A

da olduğu gibi saat ibresinin yönünde gidilmiş ise molekülün mutlak konfigürasyonu R

(Latince rectus ‘sağ ’) olarak; B de olduğu gibi saat ibresinin tersi yönünde gidildi ise

molekülün mutlak konfigürasyonu S (Latince sinister ‘sol ’) olarak tanımlanır.

12

Saat yönü (R) Saat yönünün tersi (S) A B

(R)-2-Bromo-2-kloro- (R)-2-Bromo-2-kloro-

1,1,1-trifuloroetan 1,1,1-trifuloroetan

Halotanın A ve B olarak gösterilen iki enantiyomerini ele alalım. Bunlardan biri R

diğeri S konfigürasyonundadır. Genel bir kural olarak; mutlak konfigürasyonu R olan

bir maddenin enantiyomeri S, mutlak konfigürasyonu S olan bir maddenin enantiyomeri

ise R konfigürasyonuna sahiptir.

2-bütanolün mutlak konfigürasyonuna bakıldığında bu molekülde stereojenik merkeze

bağlı atom ya da gruplar H, OH, CH3 ve CH2CH3 olup en yüksek ve en düşük öncelikli

atom ya da gruplar sırası OH ve H’dir.

Diğer taraftan metil ve etil gruplarının her ikiside karbon atomları ile stereojenik

merkeze bağlanmışlardır. Bu durumda grupların atomları, stereojenik merkeze

bağlandıkları noktadan itibaren tek tek değerlendirilir ve farklılığın çıktığı noktada

öncelik tespit edilir. Böylece –CH2CH3[-C(C,H,H)], CH3[-C(H,H,H)]den daha

önceliklidir. Yani etil grubunda stereojenik merkeze bağlı karbon atomuna bir karbon ve

iki hidrojen bağlı iken; metil grubunda stereojenik merkeze bağlı karbon atomuna üç

hidrojen bağlıdır.

13

Bu durumda 2-bütanolün enantiyomerlerinin mutlak konfigürasyonu aşağıdaki gibidir.

(S)-(+)-2-Bütanol (R)-(-)-2-Bütanol

3.1.4 Enantiyomerler

Bir molekül ile onun ayna görüntüsü olan ve üst üste çakışamayan stereoizomerlere

enantiyomer denir. Enantiyomerlerden biri polarize ışık düzlemini sağa (+), diğeri sola

çevirir (-). Yoğunluk, erime noktası kaynama noktası gibi hemen her zaman konu edilen

fiziksel özellikler bir kiral bileşiğin her iki enantiyomeri içinde aynıdır. Enantiyomerler,

üç boyutlu uzayda atomların düzenlenmesine bağlı olarak farklı özellikler

gösterebilirler. Örneğin karvonun enantiyomerlerinden (R)-(-)- karvon nane yağının ana

bileşiği iken enantiyomeri olan (S)-(+)- karvon ise kimyon kökü yağının ana bileşenidir

(Şekil 3.4). Karvonun bu iki enantiyomerinin her birinin kendi karakteristik kokusu

vardır. (R)- ve (S)- Karvon arasındaki koku farklılığı onların burundaki alıcı sinir

bölgelerine karşı farklı davranmalarından kaynaklanır. Uçucu moleküller, bu

molekülleri barındıracak uygun şekle sahip alıcı sinir bölgelerini işgal eder. Bu alıcı

sinirlerin kendileri kiral olup sonuçta bir enantiyomer, alıcı sinirlerin bir bölgesi için

uygun olurken diğer enantiyomer diğer bir bölge için uygun olur (Tüzün 1994).

14

Şekil 3.4 Karvonun enantiyomerleri 3.1.5 Rasem karışım

Enantiyomerlerin eşit miktarda ki karışımına rasemat denir ve herhangi bir optik

çevirme göstermez. Çünkü her bir enantiyomerin polarize ışık düzlemini pozitif ve

negatif yönde çevirmeleri birbirini yok eder. Simgeleme (±) veya (d, l) şeklinde olabilir

ve bu simgeler sadece çevirme yönünü belirler. Rasem bileşik basit bir karışım değildir.

Çünkü enantiyomerlerin polarize ışığa karşı davranışları dışında diğer özellikleri

aynıdır. Bu sebepten moleküller arasında daha farklı bir etkileşme vardır; bu nedenle

rasem bileşiğin enantiyomerlerine ayrılması basit karışımların ayrılmasından daha

güçtür. Sıvı veya gaz halinde rasem şekli ile optikçe aktif şekiller arasında fark yoktur,

yoğunluk, kaynama noktası, ışık kırma indisi, UV, NMR, IR gibi spektroskopik

özellikler birbirinin aynıdır. Bir kimyasal reaksiyonda asimetrik bir karbon atomu

oluşuyorsa pek çok durumda oluşan ürün rasem şeklidir.

3.1.6 Kiral tanıma

Bazı kiral alıcıların veya kimyasal bileşiklerin, bir kiral molekülün enantiyomerlerinden

biri ile seçici olarak etkileştiği bir işlemdir. Özellikle bazı biyolojik etkileşmelerde kiral

tanıma çok yüksek bir seviyede gözlenir. Örneğin (-)-nikotin (+)-nikotinden daha

zehirlidir, (+)-adrenalin kan damarlarını sıkıştırmada (-)-adrenalinden daha aktiftir. (-)-

Tiroksin troit bezleri tarafından üretilen ve metabolizmayı hızlandırarak

15

heyecanlanmaya ve kilo kaybına neden olan bir hormondur. Onun enantiyomeri olan

(+)-tiroksinde bu özelliklerin hiçbirisi yoktur (Şekil 3.5). Fakat bu hormon kandaki

kolesterol seviyesini düşürmek üzere bazen kalp hastalıklarına verilir.

(Kiral karbon atomları yıldızla işaretlenmiştir)

Şekil 3.5 Nikotin, adrenalin ve tiroksin 3.1.7 Enantiyomerik saflık belirlenmesi

Biyolojik aktive bakımından optik saflığın öneminin giderek artması optik saflığın

belirlenmesi için kesin, güvenilir metotların geliştirilmesine ihtiyaç duyulmuştur.

16

3.1.7.1 Optik rotasyon

Enantiyomerik saflığın belirlenmesi için klasik metot, polarimetre kullanılarak optik

çevirme açısısının ölçülmesidir. Spesifik optik çevirme açısı aşağıdaki eşitlik ile

belirlenir:

% Optik saflık [ ][ ]

1000

×=α

α

[α] enantiomer karışımının spesifik optik çevirmesidir ve [α]0 saf enantiyomerin optik

çevirmesidir. Ancak, pratikte karışıklığa yol açtığından dolayı optik saflığın

belirlenmesinde bu metodun kullanımı tercih edilmemektedir. Bu sebeple

enantiyomerik saflık, enantiomerik aşırılık (ee) denen kesin bir terimle ifade edilmesi

daha uygun bulunmuştur. R>S ise:

% Enantiyomerik aşırılık (ee) = 100)(

)(×

+

−

SR

SR

95:5 oranında R ve S enantiyomerleri içeren bir örnekte ee % 90 dır. Optik rotasyon

ölçümlerinden daha güvenilir bir metottur.

3.1.7.2 HPLC metotları

Enantiyomerlerin aynı adsorpsiyon özelliklerine sahip olmasından dolayı akiral

adsorbentler üzerinde direk kromotografik ayırma yöntemleri uygulanması uygun

değildir. Ayırma farklı özeliklere sahip diasteremoerlerin oluşumu ile

gerçekleştirilebilir. Bu iki yolla olur. İlki akiral kolonda ayrılabilen diastereomerlerin

oluşumuna yol açan kiraltürevlendirme reaktifi ile örneğin türevlendirilmesidir. Diğeri

ise kiral mobil faz ilavesi (CMPA) ya da kiral durgun faz formunda kiral seçici (CSP)

ile enantiyomerlerin etkileşimi sağlanarak geçici diastereomerlerin oluşturulmasıdır.

17

CSP kiral ligand değişim fazları, afinite fazları, helikal polimerler, kavite fazları ve

Pirkle-türü fazlar olmak üzere 5 sınıfa ayrılır.

3.1.7.3 GLC metotları Bozunma olmaksızın kolaylıkla buharlaşabilen bileşikler için CSP üzerinde gaz

kromotografi enantiyomerik saflık saflığı belirlemek için doğru ve güvenilir bir

metottur. Bu teknik hızlı geliştirilmiş ve basit, hızlı, tekrarlanabilir ve duyarlı bir metot

olması bakımından avantajlıdır. Enantiyomerlerin gaz kromotografik ayrılmasında

kullanılan CSP üç sınıfa ayrılabilir:

1. HPLC belirlemesinde kullanıldığı şekle benzer ligand fazları.

2. Amino asit türevleri

3. Cam ya da silika yüzeyine kaplanmış siklodekstrin türevleri

Özelikle siklodekstrin türevlerinin kullanımı artan bir önem kazanmıştır. 25-250 oC

sıcaklık aralığında kullanılabilir ve polar ve polar olmayan çeşitli bileşikler için yüksek

duyarlılık sergiler.

3.1.7.4 NMR metotları Son yıllarda kiral HPLC ve GLC’nin artan popülerliğine rağmen, NMR enantiyomerik

saflık belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir metottur. Optik olarak saf reaktif ile

tepkime gerçekleştirilerek enantiyomerik karışım diastereomer karışıma dönüştürülür.

Mosher reaktifi bu amaç için sıklıkla kullanılır (Sheldon 1993).

3.2 Enantiyomerik olarak saf bileşiklerin eldesi

Eczacılık ya da ziraatte kullanılan kimyasallar gibi kiral moleküller genellikle karmaşık

olup, çok fonksiyonlu yapıları vardır ve çok adımlı sentezlerle üretilirler (Ghanem et al.

2004). Enantiyomerik saflıkta (ee>% 99) ya da enantiyomerik açıdan zenginleştirilmiş

18

bileşiklerin eldesinde kullanılan metotlar genel olarak başlangıç maddesinin türüne

bağlı olarak üçe ayrılabilir (Şekil 3.6) .

Enantiyomerik saflıkta bileşiklerin eldesi

klerin elde edilmesi

Şekil 3.6 Enantiyomerik saflıkta bileşiklerin eldesinde kullanılan metotlar

3.2.1 Stereoseçimli sentez

Stereoseçimli sentez kiral havuz bileşikleri adı da verilen kiral başlangıç substratı ve

kimyasal ya da biyolojik kiral ayrıcı ve kiral çevre kullanılarak akiral bileşiklerle

gerçekleştirilebilir (Şekil 3.7).

Kiral Havuz

Bileşikleri

Rasematlar Akiral Bileşikler

Rezolüsyon

Sentez kinetik kristalizasyon kromatografi

asimetrik sentez

kataliz enzimatik kimyasal

Enantiyomerik saflıkta bileşikler

19

Şekil 3.7 Stereoseçimli sentez 3.2.1.1 Kiral başlangıç substratı

Doğa optik olarak saf olmasa da optik olarak aktif materyallerin büyük bir kısmını üretir

ve buda asimetrik sentez için başlama noktası olarak kullanılır. Alkoloidler, terpenler,

şekerler, α-amino- ve α-hidroksi asitler- kiral havuzu oluşturan materyallerdir.

Stereoseçimli sentez için kiral havuz yöntemine birçok örnek verilebilir ve bunların

çoğunun önemli endüstriyel uygulamaları vardır. Örnek olarak (R)-limonen portakal

suyu endüstrisinin yan ürünü olarak portakal kabuğundan izole edilir ve nane tadını

veren ana bileşen (R)-karvon’un ticari üretiminde başlangıç materyali olarak kullanılır.

Klinik yönden önemli β-laktam antibiotik tienamisin (S)-aspartik asitten sentezlenir ve

(S)-aspartik asit ucuz olup kolayca elde edilebilir.

3.2.1.2 Kiral ayırıcılar Rasemik olmayan kiral ayırıcılar stereoseçimli sentezde tepkime ürünlerinde

stereoseçimliliği teşvik etmek için kullanılır ve kimyasal ya da biyolojik olabilir. Ayırıcı

kiral kısmı kovalent olarak kiral olmayan önkiral substrata bağlanır ve stokiyometrik

miktarlarda reaksiyon ortamında olmalıdır. Tepkimeden sonra kiral ayırıcı ortamdan

uzaklaştırıldığında optik olarak aktif ürünler elde edilir ve başarılı bir tepkimede kiral

bileşikler yaklaşık olarak % 100 optik saflıkta elde edilebilir.

20

3.2.1.3 Kiral çevre

Kimyasal reaksiyon ortamına kiral çözücüler ya da kiral ligand gibi katkılar eklenerek

kiral çevre oluşturulur. Kiral çevre tepkimenin diastereomerik geçiş halinin serbest

enerjisini değiştirerek iki diastoremerik yol izinin bir tanesinin gerçekleşmesini sağlar.

Ortam sıcaklığında iki yol izi arasında serbest aktivasyon enerjisi farkı ∆G= 12 kj/mol

olup, % 99 optik saflıkta ürün elde edilebilir. Çoğu durumda çok verimli bir yöntem

değildir.

3.2.2 Rasematların rezolüsyonu

Rezolüsyon, bir rasem bileşiğin enantiyomerlerine ayrılma işlemidir. Bunun için

kristallendirme başta olmak üzere bir takım fiziksel ve kimyasal yöntem geliştirilmiştir.

İlk rezolüsyon 1848 de Pastör tarafından, rasem sodyum amonyum tartarat çözeltisinin

27oC den daha düşük bir sıcaklıkta yavaş buharlaştırılarak kristallendirilmesi ile

gerçekleştirilmiştir. Pasteur burda oluşan büyük kristallerin bir kısmının diğerlerinin

ayna görüntüsü olduğunu fark etmiştir. Aynı türden olanları toplayarak suda

çözdüğünde ise birinin polarize ışığı sağa diğerinin ise sola çevirdiğini görmüştür.

Rezolüsyonun birçok uygulama alanı vardır. Örnek olarak ilaç olarak kullanılacak

bileşik disimetrik bir molekül ise bunun sadece bir enantiyomeri etkindir, diğer

enantiyomerin ilaç etkinliği yoktur veya çok azdır. Böyle bir bileşik kimyasal

yöntemlerle sentezlendiğinde çoğunlukla rasem şeklinde elde edilir, sonrasında ise

rasemik bileşiğin rezolüsyonu yapılarak etkin enantiyomer elde edilir. Asimetrik sentez

yöntemi ile enantiyomerlerin saf olarak üretimi ile ilgili büyük gelişmeler olmasına

rağmen endüstriyel sentezlerde yaygın olarak kullanılan yöntem rasematların

rezolüsyonudur. Enantiyomerlerin rezolüsyonu için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir ve

bu yöntemler tercihli kristalizasyon, diastereomerik tuzların kristalizasyonu,

kromotografi ve kinetik rezolüsyon yöntemleri olmak üzere dörde ayrılabilir (Şekil 3.8).

21

Şekil 3.8 Rasematların rezolüsyonu için metotlar

3.2.2.1 Tercihli kristalizasyon

Bu yöntem endüstriyel ölçekli çalışmalarda yaygın olarak kullanılmakta olup,

kloramfenikol ve α-metil-ι-dopanın sentezleri bu türe örnek gösterilebilir. Bu proses

teknik olarak konglomerat formundaki rasematlarla gerçekleştirilebilir. Konglomerat

eşit miktarlarda iki enantiyomerin kristallerinin mekanik olarak karışımından elde edilir.

Malesef tüm rasematların % 20 ‘den daha azı konglomerat olduğundan avantajlı bir

yöntem değildir.

3.2.2.2 Diastereomer kristalizasyonu

Rasem bileşiğin optikçe aktif bir bazın enantiyomeri ile tuzu oluşturulduğunda artık bu

oluşan tuzlar enantiyomer olmayıp diastereomer tuzlardır, dolayısıyla fiziksel özellikleri

ve çözünürlük özellikleri birbirinden çok farklıdır. Uygun bir çözücüde

kristallendirilerek birbirinden ayrılabilir ve ayrılan tuzlar bir mineral asitle

etkileştirilerek asidin anyonu proton alarak serbest hale dönüştürülebilir. Genel olarak,

Rasematlar

Kinetik rezolüsyon

Tercihli kristalizasyon

Diastereomer kristalizasyon

Kimyasal Enzimatik

22

diastereomer tuzlar oluşturmak için kullanılan optikçe saf organik asitler ve bazlar doğal

bileşiklerdir ve türleri oldukça fazladır.

3.2.2.3 Kromotografi

Kolon kromotografisinde kolon dolgu maddesi olarak optikçe aktif katı maddeler

(glikoz, sakkaroz, laktoz gibi şekerler) kullanıldığında kolondan rasem bir bileşiğin

çözeltisi geçirildiğinde enantiyomerlerden biri diğerinden daha güçlü tutulur ve

rezolüsyon gerçekleşir. Kolon uzunluğu yeterli ise toplanan çözeltide sadece bir

enantiyomer bulunur. Kolonda tutulmuş olan diğer enantiyomer ise başka bir çözücü ile

alınabilir (Sheldon 1993).

3.2.2.4 Kinetik rezolüsyon

Rasematların rezolüsyonunda kullanılan üçüncü yöntem ise kinetik rezolüsyondur. Bu

yöntemin iyi sonuç vermesi kiral girdi ile iki enantiyomerin tepkime verme hızlarının

farklı olmasına bağlıdır. Kiral girdi, biyokatalizör olarak enzim veya mikroorganizma,

kimyasal katalizör olarak kiral metal kompleksi, kiral asit ya da baz olabilir ve ortamda

katalitik miktarda bulunmalıdır. Rasemik bileşiklerin kinetik rezolüsyonu lipazların

katalizlediği dönüşüm tepkimelerinden en yaygın olanıdır ve lipaz enzimi rasemik

karışımdaki iki enantiyomer arasında ayırım yapabilir. Dolayısıyla bir enantiyomer

diğerinden daha hızlı ürüne dönüştürülür (Şekil 3.9).

kR R P

kS S Q

Şekil 3.9 Katalitik kinetik rezolüsyon

23

kR≠kS olduğu durumda kinetik rezolüsyon gerçekleşir ve tepkime dönüşüm % 0 ila %

50 arasında bir değere ulaştığında durdurulur. İdeal durumda bir enantiyomer

diğerinden daha hızlı tepkimeye girer, örnek verilecek olursa tepkime girdisi (R)

tepkimeye giren tek enantiyomerdir (kS=0). Bu durumda enantiyomerlerin birbirine

oranı 50:50 olduğu rasemik karışımda % 50 dönüşüme ulaşıldığında karışım içinde %

50 girdi (S) ve % 50 ürün (R) kalır. Bu yöntem tek bir enzim kullanılarak iki

enantiyomerin kolay şekilde ayrılmasında avantaj sağlar. Yaygın olarak kullanılan bir

rezolüsyon türüdür ve enantiyomerik saflıkta ya da bir enantiyomerce zenginleştirilmiş

bileşiklerin elde edilmesinde etkin bir yoldur. Ancak, bu prosesde iki enantiyomerin

ayrılmasında maksimum % 50 verimle enantiyomerik saflıkta bileşik elde edilebilir. Bu

kısıtlama mezobileşikler ya da prokiral substratlar kullanılarak, istenmeyen

enantiyomerin stereodönüşümü, rasemizasyon ve istenmeyen enantiyomerin geri

döndürülmesi ve dinamik kinetik rezolüsyon gibi farklı yöntemler kullanılabilir (Şekil

3.10) (Ghanem et al. 2004).

kR (R)-substrat (R)-ürün

kS

(S)- substrat � (S)-ürün

Şekil 3.10 Kinetik rezolüsyon Dinamik kinetik rezolüsyonda enzim katalizli kinetik rezolüsyon ile rasemizasyon

birlikte gerçekleştirilir. Yaygın olarak kullanılan kinetik rezolüsyon ve dinamik kinetik

rezolüsyonda (R)-enantiyomeri (S)-enantiyomerinden daha hızlı (R)-ürününe

dönüştürülür (kR>kS) (Şekil 3.11). Dinamik kinetik rezolüsyonun tek farkı (S)-

enantiyomeri rezolüsyon prosesi süresince izomerleşir, böylece başlangıç (R)-

substratının tamamı (R)-ürününe dönüşebilir ve kras ≥ kR olmalıdır. Maksimum verim %

100 verime ulaşılabilir ve rasemizasyon için kimyasal katalizör olarak asit veya baz,

biyolojik katalizör olarak rasemazlar kullanılabilir (Strauss et al. 1999).

24

kR (R)-substrat (R)-ürün

kras kras kS

(S)- substrat � (S)-ürün

Şekil 3.11 Dinamik kinetik rezolüsyon 3.3 Enzimler Enzimler proteinlerdir; hücre içindeki hidrolitik reaksiyonları katalizler ve hücre dışında

hem doğal hem de doğal olmayan substratların olduğu tepkimeleri katalizlerler.

Katalizör olarak enzimlerin gösterdiği özellikler: (i) dar sıcaklık (genellikle 20 oC-40 oC) ve pH aralıklarında ılımlı koşullar altında kullanılırlar; (ii) seçimlilikleri az ya da

çok olarak değişebilmelerine karşın, katalizlenen tepkimelerde, stereoseçimli olabilirler;

(iii) katalitik aktiviteleri, var olan substratlar, ürünler ve diğer bileşenlerin

derişimlerinden önemli ölçüde etkilenebilir; (iv) genellikle kararsızdırlar; (v) kofaktör

gerektiren tepkimelerde, bazı kofaktörler katalitik döngü sırasında değişebilirler, aktif

formlarına tekrar döndürülmeleri gerekir. Üretim süresinin uzaması, kararsız olmaları,

yüksek fiyat, dar substrat seçimlilikleri, enzimlerin sentetik kimyada katalizör olarak

kullanılmalarında en önemli sorunlardır. Bununla birlikte, yeni endüstriyel

gereksinimler, kimya ve biyolojideki yeni gelişmeler ile bu anlayış değişmektedir.

Bunun farklı nedenleri vardır: (i) çeşitli enzimatik tepkimeler, doğal ya da doğal

olmayan substratların stereoseçimli olarak kullanışlı sentetik ürünlere dönüştüğünü

göstermektedir. Çizelge 3.1’de sentetik kimyada yaygın olarak kullanılan enzimler

verilmiştir. (ii) Hem enzim tutuklaması ve kararlılığı için hem de proseslerin ölçek

büyütmesi için yeni teknikler geliştirilmektedir. (iii) Moleküler ve hücre biyolojisi,

hesaplama ve analitik kimyadaki son gelişmeler istenilen proteinlerin elde edilmesinde

(expression) gen oluşturmak için genetik materyallerin işlenmesinde yeni yararlar

oluşturmaktadır. (iv) Rekombinant DNA teknolojisi, enzimleri içeren proteinlerin düşük

maliyetle üretilmesi ve bu proteinlerin özelliklerinin makul ölçüde değiştirilebilmesi

için yol açmaktadır. (v) Katalitik olarak aktif antikorların (“abzymes”) keşfedilmesi,

enzim katalizini harekete geçirmektedir (Schreirer 1997).

25

Böylece enzimlerin kullanılmasıyla çok sayıda organik tepkime, örneğin kiral ara

ürünlerin, şekerlerin, nükleotidlerin ve ilgili bileşenlerin dönüşümü; aminoasitler,

şekerler ve şeker fosfatları gibi fizyolojik aktif bileşenlerin sentezi; peptidlerin ve

proteinlerin dönüşümü; ve içinde klasik kimyasal yöntemlerin de kullanılmak zorunda

kalındığı diğer dönümler gerçekleştirilebilir. Sentetik organik kimyada enzimlerin

kullanımı üzerine yapılan araştırmalar, bütün kayıtlı olan uygulamaların % 65’inin

hidrolitik tepkimeler (% 40) ve dehidrojenaz tepkimeleri (%25) üzerine olduğu

göstermiştir. Bununla birlikte dehidrojenaz uygulamaları çoğunlukla

mikroorganizmaların, az sayıda izole enzimlerin kullanılmasıyla gerçekleştirilir.

Enzimlerin kullanıldığı bir diğer önemli tepkime, oksijenazın kullanıldığı tepkimelerdir

(% 24); enzimatik karbon-karbon sentezi ile ilgili az sayıda kayıt vardır (%4). Enzim

katalizli bütün diğer tepkimeler toplamın % 7’sini oluştururlar (Schreirer 1997).

26

Çizelge 3.1 Organik sentezde yaygın olarak kullanılan enzimler

a ATP, adenizin trifosfat; NAD(P), nikotinamid adenin dinükleotid; SAM, (-)-(S)-adenosil-L-metiyonin

Günümüzde var olduğu tahmin edilen 25000 enzimden yaklaşık 4000 tanesi Biyokimya

ve Moleküler Biyoloji Birliği (IUBMB) tarafından kabul edilmiş ve sınıflandırılmıştır

(Krishna et al. 2000). Çoğunluğu hidrolazlar, transferazlar ve oksidoredüktazlar olmak

üzere 400 tanesi araştırmalar için ticari olarak elde edilebilmektedir. Enzimlerin

arasında hidrolazlar, endüstriyel biyotrasformasyonlarda en çok kullanılan enzimlerdir.

Kofaktör gerektirmeyenler Kofaktör eklemesine gerek

duymayanlar

Kofaktör

gerektirenlera

1. Hidrolitik enzimler

Esterazlar

Lipazlar

Amidazlar

Fosfolipazlar

Epoksit hidrolazlar

Nükleosid fosforilazlar

2. İzomerazlar ve Liyazlar

Glukoz izomeraz

Fenil alenin amonya liyaz

Fumaraz

Siyonohidrin sentetaz

3. Aldolazlar

4. Glikozil transferaz

5. Glikozidazlar

6. Oksinitrilaz

1. Flavoenzimler

Glukoz oksidaz

Amino asit oksidaz

Diaforaz

Pridoksal

2. Enzimler

Transaminazlar

Trozinaz

3. Metalo enzimler

Galaktoz oksidaz

Monooksijenazlar

Dioksijenazlar

Peroksidazlar

Hidrojenazlar

Enoat redüktazlar

Aldolazlar

Nitril hidraz

4. Tiyamin profosfat

gerektiren enzimler

Transketolaz

Dekarboksilazlar

1. Kinazlar-ATP

2.Oksidoredüktazlar- NAD(P)

3. Metil-transferazlar-SAM

27

3.3.1 Enzimlerin sınıflandırılmaları ve tepkime mekanizmaları Enzimler katalizledikleri tepkimeye göre (EC numara sırasında) altı temel gruba

ayrılırlar (Çizelge 3.2).

Çizelge 3.2 Enzim sınıfları

3.3.1.1 Oksidoreduktazlar (E.C.1) Bu enzimler redoks (oksidasyon ve indirgenme) tepkimelerini katalizler. Substrat

üzerinde bir uçtan diğer uca elektron aktarımını sağlar. Enzimlerin substratları

genellikle elektron ve hidrojen donörleridir. Sistematik adlandırma, verici/alıcı

oksidoredüktaza göredir. Oksitlenen substrat hidrojen verici olarak kabul edilir ve

enzim dehidrojenaz olarak adlandırılır. Moleküler oksijen (O2) alıcı ise enzim oksidaz

No Sınıf Katalizlenen reaksiyon türü

1 Oksidoredüktazlar Elektron transferi (Hidrid iyonları ya da H

atomları)

2 Transferazlar Grup transfer reaksiyonları

3 Hidrolazlar Hidroliz reaksiyonları (fonksiyonel grupların

suya transferi)

4 Liyazlar Çift bağa grupların eklenmesi ya da grupların

uzaklaşmasıyla çift bağların oluşma

reaksiyonları

5 İzomerazlar Molekül içinde gurupların transferi ile izomerik

formların oluşum tepkimeleri

6 Ligazlar Enerji kullanılarak kondenzasyon reaksiyonları ile

C-C, C-S, C-O ve C-N bağlarının oluşum

tepkimeleri

28

olarak adlandırılır. Hidrolazlar ve oksidoredüktazlar arasındaki temel farklılık

oksidoredüktazların genellikle stokiyometrik oranda pahalı kofaktörlere ihtiyaç

duymasıdır. En yaygın olarak kullanılan kofaktörler NADH/NAD+, NADPH/NADP+,

FADH/FAD+, ATP/ADP ve PQQ’dur. Çoğunun pahalı olması nedeniyle endüstriyel bir

prosesin maliyeti için kofaktör rejenerasyon sistemi gerektirir. Endüstride benzoat

dioksijenaz kullanılarak benzen türevlerinden R-1,2,-dihdiroksi katekol üretimi ICI

(İngiltere) tarafından yapılmakta; elde edilen ürün, antiviral madde olarak etkin β-

laktam sentezinde kiral ara ürün olarak kullanılır. Enzimatik redoks prosesleri genellikle

fermantasyon ile gerçekleştirilir. Böylece çoğalan hücreler sistemleri ile kofaktör

rejenerasyon probleminin önüne geçilir. Ekmek mayası katalizörlüğünde indirgenme ve

mikrobiyal hidroksilasyon bu teknolojilerin tipik örnekleridir. Oksidoreduktazlar enzim

komisyonunun (Enzyme Commission) gerçekleştirilen organik dönüşüm temeline

dayanarak sınıflandırılır. Bu enzimler oksidant ve gerekli stokiyometrisine göre

sıralanırsa:

Dehidrojenazlar

Monooksijenazlar

Dioksijenazlar

Oksidazlar

RH + D R(-H) + DH2

RH + O2 RO2H

RH + O2 R(-H) + H2O2

RH + O2 + DH2 ROH + D + H2O

29

Peroksidazlar

D, DH2= kofaktör

3.3.1.1.1 Dehidrojenazlar

Dehidrojenazlar izole enzimlerin sentetik uygulamalarından dolayı büyük ilgi

kazanmış olan oksidoredüktaz enzimlerinin yalnızca bir sınıfıdır. Tüm hücre (whole

cell) sistemleri (örn. maya indirgenmeleri) kullanılan birçok oksidasyon ve

indirgenme tepkimelerinde asıl katalizörlerdir. E.C. listelerinde gerektirdiği kofaktör

(nikotin amid (NAD), flavin adenin dinükleotid (FAD) ve pirolokünolin kinon

(PQQ ) esasına dayanarak sınıflandırılabilen 176 farklı dehidrojenaz tanımlanır. En

çok çalışılan ve en iyi bilinen dehidrojenaz at karaciğer alkol dehidrojenazıdır

(HLADH). Asetaldehitten bisiklik ketonlara geniş bir substrat aralığına sahiptir ve

NADH-bağlıdır. İndirgenmede HLADH (ve diğer hidrojenazlar) karbonil

gurubunun re-yüzüne hücum ederek (S)-alkol oluşturmak üzere prokiral ketonun (%

100 teorik verim) enantiyoseçimli indirgenmesinde kullanılabilir. Oksidasyonda ise

tepkime kiral alkolün kinetik rezolüsyonu için kullanılabilir. (S)-enantiyomer

seçimli olarak oksitlenir ve ortam (R)-enantiyomerince zengin olur.

İndirgenme reaksiyonlarının gerçekleştirilmesi için hidrojen kaynakları gereklidir.

Biyokatalitik indirgenme için etanol, 2-propanol, glukoz, formik asit ve dihidrojen

kaynak olarak kullanılabilir. Kofaktör geri dönüşüm problemini çözmek için en

basit çözüm katalitik hidrojen transferi gerçekleştirmektir. Rhodococcus

erythropolis ile etil 4-kloro-3 okzobütanoat’ın indirgenmesi için formik asidin

hidrojen kaynağı olarak kullanımı Şekil 3.12’de gösterilmiştir. Substrat

indirgenirken NADH dan NAD+’a koenzimin oksidasyonu gerçekleşir. Ana substrat

indirgenmesinin bir sonraki döngüsünden önce HCO2H’ın CO2’e oksidasyonunu

katalizleyen format dehidrojenaz tarafından yürütülen koenzim NADH’a

indirgenmelidir.

RH + H2O2 ROH + H2O

30

Şekil 3.12 İndirgenme için hidrojen kaynağı olarak HCO2H kullanarak NADH’ın geri dönüşümü

Çevreye dost sistemler sağlamak için fotokimyasal metodlar geliştirilmiştir. Örnek

olarak fotosentetik biyokatalizör cyanobacterium kullanılarak bu metotta ışık

enerjisi NAD(P)H’ı rejenere etmekte kullanılır. Biyokatalizörler kullanılarak

asetofenon türevlerinin indirgenmesi aydınlıkta karanlıkta olduğundan daha etkin

gerçekleştirilmiştir. Cyanobacterium ile ışık enerjisi elektron aktarım sistemi

aracılığı ile NAD(P)H formunda kimyasal enerjiye dönüşür. Sonuç olarak kimyasal

enerji (NAD(P)H) substratı kiral alkole dönüştürmek için kullanılır (ee % 96- >99).

Organik bileşikleri sentezlemek için CO2’in indirgenmesinde kullanılan ışık enerjisi

substratları indirgemek içinde kullanılır. Fotosentetik mikroorganizmalar

kullanılmadığı zaman photosensitizer (ışığa duyarlı yapı) gereklidir. Metotlarda ışık

enerjisi photosensitizerden NAD(P)+’ya elektron transferini ilerletmek için

kullanılır.

NAD(P)H’ın elektrokimyasal rejenerasyonu bir diğer ilginç ve temiz metottur. Bu

sistemde elektrottan metil viyolejen ya da asetofenon gibi elektron aracısına,

aracıdanda reduktaz ya da alkol dehidrojenaz gibi elektrokatalizörler tarafından

katalizlenen NAD(P)+’ya elektron aktarımı gerçekleşir (Sheldon 1993, Nakamura et

al. 2003).

31

Alkol dehidrojenaz’ın aktif kısıma bakılacak olursa Şekil 3.13’de NAD+ cam göbeği

renginde, alkol ise boşluklar kırmızı, gri ve beyaz atomlarla doldurularak gösterilmiştir.

Tepkime etanolün (alkol) etanala (aldehit) dönüşüm tepkimesidir.

Tepkime: CH3CH2OH + NAD+ CH3CH=O + NADH + H

+

Bu bir oksidasyon tepkimesidir. Bu tepkime sonucu iki hidrojen iyonu ve iki elektron

uzaklaşır. İki elektron NAD+’a eklenir ve eklenmesi sonucu NADH ve H+’e dönüşür.

Bu alkol metabolizmasındaki ilk dönüşümdür. ADH’ın aktif bölgesinde koenzim

(NAD+) bağlanma kısmı ve substrat (alkol) bağlanma kısmı olmak üzere iki bağlanma

bölgesi vardır. NAD+ için bağlanma kısmının çoğu hidrofobiktir ve yeşil ile

gösterilmiştir. Akolün aldehit ve ketona katalitik oksidasyonunda ser-48, phe 140, and

phe 93 olmak üzere üç anahtar aminoasit vardır.

Şekil 3.13 Alkol dehidrojenaz enzimi

32

3.3.1.1.2 Oksidaz ve oksijenazlar Oksidaz ve mono-ve dioksijenazlar oksidant olarak oksijeni kullanırlar. Oksidazlar

dehidrojenazlar gibi aynı oksidasyon tepkimelerinde kullanılabilmelerine rağmen

kofaktör rejenerasyonuna ihtiyaç duymazlar. Sentetik uygulamaları yoktur. En çok

bilinen örnekleri glukoz, alkol ve kolesterol oksidazlar ticari şekliyle biyosensör olarak

klinik analizlerde kullanılır. Sitokrom P450 bağlı çeşidindeki gibi monooksijenazlar

hayvanlar, bitkiler ve mikroorganizmaların hücre içi metabolizmasında ve

xenobiotiklerin detoksifikasyonunda (zehir etkisini giderme) önemli rol oynayan, çoğu

zaman rastlanan enzimlerdir. Sentetik olarak ilginenilen dönüşümleri (örn. olefin

epoksidasyon, aromatiklerin ve alkanların hidroksilasyonu ve ketonların laktonlara

Baeyer-Villiger oksidasyonu) katalizleyebilmelerine rağmen hemen hemen hiç

uygulamaları yoktur. Bu enzimin uygulama bulamama nedenleri kofaktör rejenerasyonu

için gereksinim, hücre dışında kararlılığının az olması ve optimum

enantiyoseçimlilikten daha az seçimlilik elde edilmesidir.

3.3.1.1.3 Peroksidazlar Peroksidazların sentetik uygulamaları vardır ve monooksijenazlar gibi bazı dönüşüm

türlerine aracılık eder. Kofaktör tüketimi olmaksızın bir oksijen atomu substrata katılır.

Gerekli indirgeme eşdeğeri H2O2 nin hidrojenlerinden türetilir. Monooksijenazlar hücre

dışı enzimlerdir ve hücre içi monooksijenazlardan çok daha kuvvetlidir.

3.3.1.2 Transferazlar (E.C.2) Bu enzimler bir bileşikten (verici) diğerine (alıcı) kimyasal gurup aktarırlar. Sistematik

adlandırma, verici/alıcı grup transferaz sınıflandırılmasını izler. Pek çok durumda verici,

sıklıkla aktarılan aktif kimyasal grubu taşıyan kofaktör ya da koenzimlerdir.

Endüstriden çok doğada büyük rolleri vardır. Çeşitli nedenlerden dolayı az sayıda

transferaz endüstride kullanılır: Denge tepkimeleri sıklıkla yüksek dönüşümler vermez,

grup aktaran substratlar ve tepkimelerin gerçekleştirilmesi pahalıdır, ya da elde edilen

ürünler ortamdan kolaylıkla ayrılmazlar. Endüstride Monsanto (Amerika) tarafından D-

33

aspartat transaminaz ile D-aspartattan 2-okso-aspartat üretilmekte, bu ürün ilaçlarda ve

gıda katkılarında aminoasit olarak kullanılmaktadır.

3.3.1.3 Hidrolazlar (E.C. 3)

Bu enzimler, C-O, C-N, C-C ve fosfatlarda P-O bağlarını içeren bazı diğer bağların

hidrolitik parçalanmasını katalizlerler. Uygulamaları yağ asitlerinin esterleşmesi ve

polisakkaritlerin, nitrillerin, proteinlerin, lipidlerin hidrolizini kapsar. Bu enzimlerin

çoğu deterjan endüstrisinde ve gıda endüstrisinde, poteinleri, karbonhidratları ve

yağları parçalamak için tepkimelerde kullanılır. Hidrolaz ifadesi, substratın ismi ve

–az ekini kapsayan sistematik isimdir. Hidrolazlar endüstriyel proseslerde en çok

kullanılan enzimlerdir. Lipazlar, esterazlar ve amidazlar bu enzim sınıfına

girmektedir.

3.3.1.3.1 Lipazlar (triaçilgliserol hidrolazlar)

Karboksilik ester hidrolaz olan lipazların bitki ve mikroorganizmaların yağ

metabolizmasında önemli görevleri vardır (Ghosh et al. 1996, Grandhi et al. 2000).

Proteaz ve karbohidrazlar gibi enzimler yıllardan beri endüstriyel olarak

kullanılmakta ve dünyadaki enzim pazarının büyük bir bölümünü oluşturmaktadır.

Günümüzde lipazlar, bu pazarın % 10’undan daha azını oluşturmaktadır ve bu pazar

oldukça geniş uygulamalar ile giderek artan bir potansiyele sahiptir. Lipazlar çok

farklı memeli, bitki ve mikrobiyal kaynaklardan elde edilmektedir. Memeli lipazları,

karaciğer, dil, mide ve pankreas lipazları olmak üzere dört gruba, mikrobiyal

lipazlar ise bakteriyel ve fungal olmak üzere ikiye ayrılırlar.

Esterleşme, transesterleşme ve hidroliz tepkmelerini düşük sıcaklıkta

katalizlemeleri, susuz ortamda kararlı ve aktif olmaları, kofaktör gerektirmemeleri,

yüksek katalitik güçleri, ucuz olmaları, seçimli ve pozisyonel olarak spesifik yağ

34

asidi değiştirmeleri, ester bağına spesifik olmaları, yüksek substrat seçimlilikleri ve

yan ürün oluşumunu önlemeleri nedenleriyle yaygın olarak kullanılırlar. Lipazlar,

stereo ve bölgesel spesifik olmaları nedeniyle kimyasal olarak katalizlenemeyen

tepkimeleri katalizleyebilirler. Böylece var olan bir ester modifikasyonu ya da

fonksiyonel ve fizikokimyasal özellikleri farklı yeni bir ester üretimi yapabilmekte

ve bunun sonucunda değerli yeni kimyasal maddeler ya da daha kullanışlı gliserit

karışımları elde etmek mümkün olmaktadır.

Lipazlar hidroliz, esterleşme ve transesterleşme tepkimelerini katalizlerler.

Transesterleşme tepkimeleri, esterdeki açil grubu değişimi, bir asit ile yapılıyorsa

asidoliziz, bir alkol ile yapılıyorsa alkoliziz, bir başka ester durumunda

interesterleşme ve bir amin kullanılıyorsa aminoliziz adını alır (Şekil 3.14).

Lipazların uygulama alanları bileşiklerin sentezi, karbonhidrat ester sentezi, poli

doymamış yağ asitlerinin elde edilmesi, biyolojik aktif bileşenlerin sentezi, parfüm

ve tat esterlerinin üretimi, yapısal lipidlerin sentezi ve organik karbonatların sentezi

olarak sınıflandırılabilir. Lipazlar ile gerçekleştirilen optik ayırma prosesleri tipik

olarak, ya bir esterin rasemik karışımının enantiyoseçimli hidrolizi (örneğin iki

izomerden sadece bir tanesinin hidrolizinin tercih edilmesi) ya da rasemik bir

asit/esterin enantiyoseçimli esterleşmesi/transesterleşmesi ile esterden asidin

ayrılması şeklinde gerçekleşir. Bu tür çeşitli lipaz katalizli kiral sentez yöntemleri

endüstride kullanılır. Optikçe saf R-α-fenoksipropiyonik asit herbisitlerin sentezi

için ara ürün vermek üzere α-bromopropiyonik asitten ayrılması Avusturya’da

Chemie Linz tarafından ticari olarak gerçekleştirilmektedir. Glisidil bütüratın ve p-

metoksifenil glisidatın optik olarak ayrılması prosesleri DSM Adeno tarafından

ticari olarak yapılmaktadır. Bu bileşenler, optikçe aktif β- blokerlerin ve tansiyon

düşürücü ilaç diltiazem’in hazırlanmasında önemli ara ürünlerdir.

35

1. Hidroliz

2. Esterleşme

3. Transesterleşme

A. Asidoliziz

B. İnteresterleşme

C. Alkoliziz

D. Aminoliziz

Şekil 3.14 Lipazların katalizlediği tepkimeler

36

3.3.1.4 Liyazlar (E.C.4)

Bu enzimler C-C, C-O, C-N ve hidrolizden farklı düzendeki az sayıda diğer bağların

ayrılmasını katalizler. Sıklıkla, başka tepkimelere maruz bırakılan çift bağların

ayrılmasıyla bu olay gerçekleşir. Sistematik adlandırma, substrat grubu-liyaz

şeklindedir. Ayırma çizgisi (-) herhangi bir karışıklığı önlemek için önemlidir.

Örneğin hidrolaza çok benzemesi nedeniyle, hidroliyaz yerine hidro-liyaz terimi

kullanılmalıdır.

Liyazlar, yakın olan doğal bağ bozma tepkimelerini, doğal olmayan koşullar altında

(örneğin yüksek substrat derişimleri) ticari açıdan önemli yeni bağların oluşmasına

izin vererek, terse çevirebilirler (bağ oluşması, liyaz sentetaz olarak görev yapar).

Sıklıkla kiral merkezler bağ oluşması sırasında üretilir. Endüstriyel olarak fenil

alenin amonoliyaz kullanılarak, Japonya’da Ajinomoyo Co. tarafından, Parkinson

hastalığının tedavisinde kullanılan L-dihidroksi-L-fenil alanin (L-DOPA)

üretilmektedir.

3.3.1.4.1 Benzaldehit liyaz

Benzaldehit liyaz (BAL, EC 4.1.2.38) kofaktör olarak tiamin pirofosfat (TPP) bağlı

enzimdir (Şekil 3.15). Benzoinin açiloin bağını tersinmez olarak kırarak iki molekül

benzaldehit üretimini sağlar. Bu tepkimenin en önemli özelliği BAL katalizörlüğünde

yalnızca R-benzoin benzaldehit’e dönüşür, S-benzoin ise tepkime vermez. Bu nedenle

BAL enzimi doğal ürün ve ilaç sentezinde kullanılan bileşiklerin önemli bir sınıfı olan

α-hidroksi ketonların enantiyomerik saflıkta sentezi için kullanılır. Sahip olduğu

potansiyel sebebiyle optik aktif benzoin ve türevlerinin endüstriyel sentezinde artan bir

ilgiye sahiptir.

BAL enzimi ilk olarak Gonzales ve Vicuna (1989) tarafından Pseudomonas fluorescens

Biovar I’dan elde edilmiştir. Bu mikroorganizmanın benzoini üremek için karbon ve

enerji kaynağı olarak kullanabildiği belirlenmiştir. Benzoin enantiyomerleri Şekil

37

3.16’de gösterilmiştir. BAL kofaktör olarak tiamin pirofosfat (TPP) kullanarak açiloin

bağının kırılmasını sağlar. Bu tersinir tepkimede, BAL yüksek verim ve

stereoseçimlilikle iki aldehitin karboligasyonunu katalizler (Mosbacher et al. 2005).

Şekil 3.15 Benzaldehit liyaz katalizli kırılma ve benzoin sentezi

Şekil 3.16 Benzoin molekülünün R- ve S- enantiyomerleri

38

Tiamin profosfat (TPP), vitamin B

1 (tiamin)’in türevidir (Şekil 3.17).

Şekil 3.17 Thiamin prifosfat

TPP çeşitli enzimatik reaksiyonlarda aldehit grubunun transferinde görev yapan bir

koenzimdir; α-ketollerin oluşması ve yıkılmasını sağlar (Şekil 3.18). TPP bağlı enzimler

çeşitli biyosentetik yol izlerine ve temel olarak C-C bağı oluşumu ve kırılmasını içeren

tepkimelerin geniş bir aralığını katalizler. 2-hidroksi ketonları üreten 2-keto asitlerin

oksidatif olmayan ve oksidatif dekarboksilasyonu katalizler ve aktif aldehitleri çeşitli

alıcı bileşiklere transfer eder. C-N, C-O ve C-S bağlarınıda oluşturabilir ( Mosbacher et

al. 2005).

39

C

O

-O

C

O

CH3 N S

C

R+CH3

R

-+

N S

C

R+CH3

R

+

H

H3C C

O

H

N S

C

R+CH3

R

+

C

H

OHCH3

N S

C

R+CH3

R

+

C-

OH

CH3

N: S

C

R+CH3

R

C

OHCH3

N S

C

R+CH3

R

+

C

OH

CCH3

O-

O

Pirüvat

TPP karbanion TTP

Rezonans kararlilik

Hidroksietil TPP(aktif aldehit)

Asetaldehit

H+

H+

CO2

Şekil 3.18 TPP ile α-ketollerin oluşması ve yıkılması

40

Çizelge 3.3 Kofaktör olarak tiamin pirofosfat (TPP) gerektiren bazı enzimler şunlardır:

3.3.1.5 İzomerazlar (E.C.5)

İzomerazlar enzimlerin küçük bir bölümünü oluştururlar ve tek bir molekül içinde

geometrik ya da yapısal değişimleri katalizlerler. Değerli ürünleri elde etmek için

daha ucuz substratlara uygulanırlar. İzomerizasyonun türüne bağlı olarak, bu

enzimler, epimerazlar, rasemazlar, cis-trans izomerazlar, tautomerazlar ya da

mutazlar olarak adlandırılırlar. Rasemazlar özellikle kinetik ayırmalarda

(rezolüsyon) önemlidirler. Glukoz izomeraz, bu grup içinde yaygın olarak kullanılan

bir enzimdir ve endüstride glukozun fruktoza dönüşümünü katalizler; elde edilen

fruktoz gıda ve içki endüstrilerinde tatlandırıcı ya da invert şeker olarak kullanılır.

Enzim Yol izi Bağ ayrılması Bağ oluşması

Pirüvat dekarboksilaz

Alkol fermentasyonu

Prüvat dehidrojenaz

Asetil-CoA sentezi

α-Ketoglutarat dehidrojenaz

Sitrik asit döngüsü

Transketolaz Fotosentezin karbon

yerleştirme tepkimesi

Asetolaktat senteteaz

Valin, leucin biyosentezi

CR 1

O

C

O -

O

R1 C

H

O

CR6

O

C

O-

O

CR6

O

C

OH

C

O-O

41

3.3.1.6 Ligazlar (E.C.6) Bu enzimler, ATP ya da benzer trifosfat bağının hidrolizi ile birlikte iki molekül

arasında bağ oluşmasını katalizlerler. Oluşan bağlar C-O, C-S, ve C-N bağlarıdır.

Endüstride ligazlar kullanılarak kg ölçekte üretim yoktur, ancak doğada (ribosomal

peptid sentezi), DNA sarmalının tamirinde ve genetik mühendisliğinde (örneğin, DNA

ligazlar DNA sentezi sırasında C-O bağ oluşumunu katalizler) önemli rolleri vardır.

3.4 Biyokatalitik Uygulamalar

3.4.1 Hidrolitik tepkimeler

Enzim katalizli amid- ve ester- bağlarını içeren hidrolitik dönüşüm tepkimelerinin tüm

çeşitlerini proteazlar, esterazlar ya da lipazlar kullanılarak gerçekleştirmek en kolay

yöntemidir. Hidrolazların kofaktöre ihtiyaç duyamaması ve kolaylıkla bulunabilir

olması son yüzyılda organik kimyacılar için favori enzimler haline gelmesinin temel

nedenleridir. Biyotransformasyon alanında araştırmaların yaklaşık olarak üçte ikisi bu

hidrolitik enzimler kullanılarak gerçekleştirilir. Düşük su aktiviteli çözücü sistemlerinde

ester- ya da amid- sentezini yapan tepkimenin tersine dönmesi özellikle enzimler

kullanılarak incelenmiştir.

Fosfat esterleri, epoksitler ve nitrillerin oluşum ve/veya kırılmasını katalizleyen hidrolaz

enzimlerinin diğer uygulamaları gerçekleştirilmesi genellikle daha karmaşıktır.

Proteazlar, esterazlar ve lipazlar grubuna zıt olarak organik kimyada daha az

ilgilenilmektedir.

Amid- ve ester- hidrolizini gerçekleştiren enzimlerin mekanizması kimyasal hidrolize

yakındır. Enzimin aktif kısmından nükleofilik grup substrat ester ya da amidin karbonil

grubuna saldırır. Bu nükleofilik grup serinin hidroksi grubu (örn.: domuz karaciğer

estraz, subtilisin ve mikrobiyal lipazların büyük çoğunluğu), aspartik asitin korboksi

grubu (örn.: pepsin) ya da sisteinin fonksiyoneli thiol (örn: papain) olabilir.

42

3.4.2 İndirgenme tepkimeleri

Redoks tepkimelerinde kullanılan enzimler üç grupta toplanır: dehidrojenazlar,

oksijenazlar ve oksidazlar. En eski grup enzimler aldehit ya da ketonların karbonil

grupları ve karbon-karbon çift bağlarının indirgenmesi için yaygın olarak kullanılmıştır.

Substratın yer değiştirme seyrine bağlı olarak, bu tepkimelerin ikiside kiral ürün

oluşumuna yol açan prokiral substratın asimetrizasyonuna olanak verir (Şekil 3.18).

Tersinir proseslerde (örn.: alkol oksidasyonları ya da dehidrojenasyon tepkimeleri)

genellikle kiral merkez yok olur ve sınırlı kullanımı vardır (Sheldon 2003).

Şekil 3.19 Dehidrojenaz katalizli indirgenme reaksiyonu

3.4.2.1 İzole enzimler ile aldehit ve ketonların indirgenmesi

Ketonların geniş bir aralığı kiral alkolleri oluşturmak üzere dehidrojenazlar ile

stereoseçimli olarak indirgenebilirler. Tepkime süresince R- ya da S-alkol oluşumu için

enzim, hidridi ketonun Si- ya da Re- yüzüne aktarır. Birçok durumda substratın sterik

gereksinimine bağlı olan tepkimenin stereokimyasal yolu ‘Prelog’un kuralı olarak

adlandırılan basit bir model ile tahmin edilebilir (Şekil 3.20).

R1 R2

O

R1 R2

OH

R1 R2

OH

R3

XR1

R2

H

R3H

R2

R1 X

HR2

R1 X

H R3

kofaktör-H2 kofaktör

dehidrojenaz

geridöngü sistemi

kiral ürünler

ya da

ya da

43

Şekil 3.20 Ketonların asimetrik indirgenmesi için Prelog’un kuralı

Çizelge 3.4 Prelog’un kuralına uyan dehidrojenazlar

Dehidrojenaz

Spesifiklik

Kofaktör

Ticari varlığı

Maya-ADH Prelog NADH +

At karaciğer-ADH Prelog NADH +

Thermoanaerobium brockii-ADH Preloga NADHP +

Hdroxysteroid-ADH Prelog NADH +

Candida parapsilosis-ADH Prelog NADH -

Lactobacillus kefir-ADH Anti-Prelog NADPH +

Mucor javanicus-ADH Anti-Prelog NADPH -

Pseudomonas sp.-ADH Anti-Prelog NADH - aSubstrat olarak küçük ketonlar kullanıldığında sepsifiklik tersine döner Bu kuralın temeli Curvularia falcata hücreleri ile gerçekleştirilen mikrobiyal

indirgenme stereokimyasına dayandırılır ve bu durumda dehidrojenaz hidrid iyonunu

baskın olarak prokiral ketonun re-yüzüne aktarır. Çizelge 3.4’de Prelog’un kuralına

uyan dehidrojenazlar gösterilmiştir. Ketonların stereospesifik indirgenmesinde

kullanılan ticari olarak mevcut olan dehidrojenazlar [yeast alkol dehidrojenaz (YADH),

at karaciğer alkol dehidrojenaz (HLADH) gibi] ve mikroorganizmaların büyük

çoğunluğu (ekmek mayası) Prelog’un kuralını takip eder. Substrat olarak büyük

44

ketonlar kullanıldığında Thermoanaerobium brockii alkol dehidrojenaz (TBADH) bu

kurala uymaz iken küçük ketonlarda uyduğu gözlenmiştir. Anti-Prelog kuralına uyarak

R-alkolleri oluşturan mikrobiyal dehidrojenazlarda vardır, fakat çok azı ticari olarak

kullanılır (Lactobacillus kefir).

3.4.2.2 Tüm hücre (whole cell) ile aldehit ve ketonların indirgenmesi

Kofaktör döngüsü gerektiren izole edilmiş dehidrojenazlar yerine enzim içeren tüm

hücre kullanılabilir. Hücre doğal olmayan substratları kullanabilen çok sayıda

dehidrojenaz içerir. Hücre otomatik olarak metabolik yol izini kullanabildiğinden

kofaktör rejenerasyonu için gerekli kofaktör döngüsüne ihtiyaç duyulmaz. Glukoz ya da

sakkoroz gibi ucuz karbon kaynaklarını asimetrik indirgenme reaksiyonları için

yardımcı substrat olarak kullanabilirler. Whole cell kullanmanın bu avantajların yanı

sıra bazı dezavantajlarıda vardır:

- Mikrobiyal dönüşümlerin verimliliği genellikle düşüktür. Doğal olmayan substratların

büyük çoğunluğu yaşayan organizmaya toksik etki yapar ve düşük derişimlerde tolere

edilebilirler (hacim başına ~ % 0.1- 0.3).

- Özellikle ürün hücre içinde depolanıyorsa ve ortama salgılanmıyorsa tepkime

ortamında büyük miktarda biyokütle var olması tüm verimin düşük olmasına neden olur

ve ürün geri kazanımı zor olur.

- Rasemik substrat kullanıldığında hücre içine ve dışına kiral taşınma tepkimenin

spesifikliğini etkileyebilir.

- Mikroorganizmanın farklı türleri farklı özelliklere sahip olabilir ve literatürle sonuçları

karşılaştırabilmek için tam olarak aynı kültürün kullanılması önemlidir.

Düşük stereoseçimliliğin çeşitli sebepleri vardır:

- Aynı serbest enerjiye sahip iki enantiyomer tek bir oksidoredüktaz tarafından

indirgenebilir. Diğer bir deyişle yetersiz bir kiral tanıma gerçekleşir.

45

- Şayet yüksek enantiyoseçimliliğe sahip iki enzim varsa aynı substrat için zıt

stereokimyasal tercihle yarışabilirler.

Böylece ürünün optik saflığı tepkimelerin nispi hızları ile belirlenir. Bu durumda subtrat

derişimi önemlidir. Substrat derişimleri doygunluğun altında ise nispi hızlar her enzim

için Michaelis-Menten kinetiği ile tanımlandığı gibi Vmax/Km oranı ile belirlenir. Diğer

yandan substrat derişimi arttırılarak doygunluk değerine ulaşıldığında, nisbi hız iki

tepkimenin kkatalizör oranına bağlıdır. Sonuç olarak enantiyomerik substratın

dönüşümünde ortamda iki ya da daha fazla enzim olduğunda, ürünün optik saflığı

substrat derişimi ile yönetilebilir. Çünkü, substrat enantiyomerleri için Km ve Ks

değerleri yarışan enzimler için farklıdır. Araştırmalarda mayalarla düşük substrat

derişimlerinde daha yüksek eep değerine ulaşıldığı gözlenmiştir.

Mikrobiyal indirgenme tepkimelerinde enantiyoseçimliliği arttırmak için:

- Substrat modifikasyonu

- Tutuklama ile metabolik parametrelerin değiştirilmesi

- Farklı olgunlukta mikroorganizmaların kullanılması

- Optimum özellikteki mikroorganizmayı bulmak için mikroorganizma taraması

- Yarışan enzimlerden bir tanesinin seçimli inhibisyonu

3.4.3 Oksidasyon tepkimeleri

Oksidasyon alkan, alken ya da aromatik moleküller gibi organik sentezlerde kullanılan

ağır materyallere fonksiyonel grupların aktarılması için anahtar adımlardan biridir.

Geleneksel yöntemin bazı dezavantajlar vardır:

- Çoğu oksitleyiciler çevreyle uyuşmayan krom gibi toksik metal iyonlara bağlıdır.

- İstenmeyen yan rekasiyonlar çoktur.

- En ucuz ve en zararsız oksitleyici moleküler oksijendir, fakat etkin olarak

kullanılamaz ve

- Bölgesel- ve stereoseçimli oksidasyonlar gerçekleştirmek zordur.

46

Halojenli ara ürünler oksijenlenmiş bileşiklerin sentezi (alkoller, aldehit/ketonlar ve

karboksilik asitler gibi) için ara ürün olarak yaygın olarak kullanılmışlardır, fakat bu da

atık-muamelesinde ciddi problemlere yol açmıştır. Özellikle stereosçimliliğin gerekli

olduğu çoğu durumda biyolojik oksidasyon ile yukarıda sözü edilen dezavantajların

üstesinden gelinebilir.

3.4.3.1 Oksijenasyon tepkimeleri

Moleküler okijenin organik moleküle direk katılmasını sağlayan enzimler

oksijenazlardır. Organik alıcı moleküllere moleküler oksijenden oksijen transferi üç

farklı mekanizma ile gerçekleştirilebilir (Şekil 3.21).

- Mono-oksijenazlar moleküler oksijenden bir oksijen atomunu substrata katar.

- Di- oksijenazlar eşanlı olarak oksijenin iki atomunu peroksi-türleri oluşturarak

substrata katar.

- Oksidazlar moleküler oksijene elektron transferini katalizlerler. Hidrojen peroksit ya

da su kullanılarak iki ya da dört elektron transferi yoluyla gerçekleştirilir.

Dehidrojenazlar

Oksijenazlar

SubH2 + Donör Sub + DonörH2

Kofaktör döngüsü

Sub + DonörH2 + O2 SubO + Donör + H2OKofaktör döngüsü

Mono-oksijenaz

Sub + O2 SubO2Di-oksijenaz

47

Oksidazlar

Peroksidazlar

Şekil 3.21 Enzimatik oksidasyon reaksiyonları

3.4.4 Karbon- karbon bağı oluşumu

Yüksek seçimlilikle C-C bağı oluşumunu katalizleyebilen liyazlar sınıfına ait üç

enzimatik sistem bilinmektedir ve giderek artan ilgi kazanmıştır. Aldolazlar tarafından

katalizlenen aldol tepkimeleri, transketolaz ya da maya katalizli açiloin kondenzasyon

tepkimeleri ve Michael tipi ilaveler şeklinde enzimatik sistemler adlandırılır (Sheldon

2003).

3.5 Hücre Parçalama Yöntemleri

Endüstride kullanılan kimyasalların, antibiyotiklerin ve enzimlerin üretimi için

mikroorganizmaların önemi uzun zamandan beri bilinmektedir. Günümüzde endüstriyel

üretimi yapılan kimyasalların çoğu hücre dışıdır. Mikrobiyal ürünlerin büyük bir kısmı

ise hücre içine alı konmaktadır. Bilinen enzimlerin en önemlileri hücre içidir. Pek çoğu

hücre içi olan ve çok fazla kullanımı olan mikrobiyal ürünlerin saflaştırılması ile ilgili

çalışmalar beklenilenden daha çok ümit vericidir.

SubH2 + O2 Sub + H2O2

O2 + 2e- O2

-2 H2O2

O2 + 4e- 2O-2 2H2O

+2H+

+4H+

2SubH + H2O2 2Sub + 2H2O Sub-Sub

Sub + H2O2 SubO+H2O

48

Hücre içinde üretilen ürünlerin hücreden ayrılması fiziksel, kimyasal ya da enzimatik

patlatma yöntemleri ile gerçekleştirilebilir. Hücre içi enzimler ve ürünlerin önemli bir

bölümünü hücre dışına almak için genetik modifikasyon ile hücreyi tamamen geçirgen

yapmak tek başına oldukça güçtür. Hücre için mikrobiyal hücre parçalanma

yöntemlerine olan ilgi gittikçe artmaktadır. Bu konuda pek çok çalışma

yayınlanmaktadır. Ancak, anlamlı biyokimya mühendisliği tasarım verilerini elde etmek

için teknik ve bilimsel altyapının belli ölçüde olması gereklidir. Hücre içi ürünlerin

büyük ölçekte izolasyonu için işletme ve yatırım sermayesi oldukça büyüktür. Son

yıllarda hücre içi enzimlerin endüstriyel olarak üretimi gerçekleştirilebilmektedir.

Gıdalarda koruma amaçlı olarak glukoz oksidaz, antibiyotik üretimi için penisilin açilaz

ve kanser tedavisinde kullanılan asparajinaz örnek verilebilir.

Mikroorganizmaların güçlü selülozik duvarları ve membranlarını parçalamak için

değişik parçalama yöntemleri kullanılmaktadır. Hücre parçalama yöntemleri Şekil 3.22

de verilmiştir. Bunlar arasında sadece mekanik hücre parçalama yöntemlerinin

endüstriyel uygulaması vardır.

Hücre Parçalama Yöntemleri

Mekanik Olmayan yöntem Mekanik yöntem

Liziz Kurutma Katı Sıvı

Bilyalı Yüksek basınç Enzimatik değirmen homojenizötörü Kimyasal X-pres ULTRASONİK

Huges pres Fiziksel Şekil 3.22 Hücre parçalama yöntemleri

49

3.5.1 Mekanik hücre parçalama yöntemleri

Mekanik hücre parçalama yöntemleri, katı kesme gerilim ve sıvı kesme gerilim yöntemi

olarak ikiye ayrılır. Bunlar arasında bilyeli değirmen ve yüksek basınç homojenizatör

yöntemleri hücre parçalanması için büyük ölçekte başarılı şekilde kullanılmaktadır.

Katı kesme gerilim yönteminde hücreler bilyaların içerisinde öğütülür ya da

dondurulmuş hücreler yüksek basınçta orifisten geçirilir. Katı kesme gerilim yöntemleri,

bilyeli değirmen ve soğuk pres olmak üzere ikiye ayrılır. Bilyeli değirmen, fiziksel

hücre parçalama yöntemleri arasında en etkili yöntemlerden biri olarak dikkat

çekmektedir. Bilyeli değirmen için değişik tasarımlar mikrobiyal hücre parçalanması

için kullanılmaktadır. Bu değirmenler, yatay ya da düşey silindire benzer kamaralardan

herhangi biri ile dengesiz disklerin toplandığı merkez şaftın desteklediği motor ve diğer

karıştırma elemanlarından oluşmaktadır. Mikrobiyal hücrelerin soğuk preslenmesi de,

hücre parçalanması için kullanılmaktadır. Soğuk presleme cihazı için, soğuk hücre

pastasının -25 oC’da aşınma olmadan ya da sıfırın altındaki sıcaklıkta, orifis ya da dar

bir yarık boyunca kuvvetle geçirildiği Hughes presi örnek verilebilir. İlk durumda

buzun faz ve son hacim değişimleri parçalanma etkisini arttırır. Kristallenen buzdan

dolayı da katı kesme gerilimi önemlidir. Hughes presi kullanılarak yapılan hücre

parçalanması işlemi, mebrana bağlı enzimlerin izolasyonu için oldukça iyi bir

yöntemdir. Son zamanlarda kullanılan hücre parçalama düzeneklerinin çoğu, süt ve

boya gibi oldukça farklı ticari ürünlerin boyut küçültmesi ve homojenizasyonu için

orijinal olarak tasarlanmıştır.

Sıvı kesme gerilim yöntemleri, yüksek basınç homojenizatörü ve ultrasonikasyon

olarak ikiye ayrılır. Sıvı kesme gerilimi ile parçalama cihazları arasında, yüksek basınç

Manton-Gaulin APV tipi homojenizatör son derece geniş bir kullanıma sahiptir. Hücre

parçalama için bu sistemin yararlı bir teknik olduğu belirlenmiştir. Yüksek basınç

homojenizatörü bir ya da daha fazla pozitif yer değiştirmeli piston pompadan

oluşmaktadır. Hücre süspansiyonu basınç kuvveti altında silindir pompa ile ileri yönlü

vanaya gönderilir ve dar bir orifisten ayarlanabilen bir kuvvet ile geçirilir.

50

3.5.1.1 Ultrasonikasyon

Ultrasonikasyon yöntemi, 1929’dan beri mikrobiyal hücrelerin parçalanması için

kullanılmaktadır. Hücrelerin parçalanması ses dalgalarının çekirdekleşmesi, büyümesi

ve ardından yıkılması ile ifade edilen kavitasyon işlemindeki ultrasonik alan içerisinde

gerçekleşmektedir.

Ultrasonik alandaki kavitasyon işlemi akustik enerjiyi hidrodinamik enerjiye

dönüştürür. Kavitasyon işleminde kabarcıklar söndüğü zaman, akustik enerjide şok

dalgaları şeklinde uzaklaşır. Bu dalgalar sonik alan içerisinde çoğalır. Çoğalma

sırasında dalgaların enerjisi daha küçük dalga oluşturmak için parçalanır. Parçalanma

işlemi kavitasyon ortamının vizkozitesinin değişimi sonucunda küçük dalgalar

oluşturmak suretiyle devam eder. Bu nedenle sabit seviyedeki sonik alandaki kavitasyon

değişik ölçüde ve şiddette dalgalar içermektedir (Shinnar and Church 1960).

51

4. KAYNAK ARAŞTIRMASI

Biyokatalitik üretim kimyasal yöntemler kullanılarak yapılan üretime göre avantajlı

olduğundan bu tez kapsamında incelenmiş ve kaynak araştırmasında da biyokatalitik

olarak α-hidroksi ketonların enantiyoseçimli eldesi araştırılmıştır. Literatürde

biyokatalitik olarak enantiyoseçimli α-hidroksi ketonların eldesi, aromatik aldehitlerden

C-C bağı oluşumu, indirgenme, kinetik rezolüsyon ve derasemizasyon olmak üzere 4

farklı yöntemle gerçekleştirilmiş ve kaynak araştırması bu şekilde gruplandırılmıştır.

Ayrıca, literatür araştırmasında bu yöntemlerle sentezi gerçekleştirilen α-hidroksi

ketonlardan farklı organik bileşiklere de yer verilmiştir.

4.1 C-C Bağı Oluşumu Yoluyla

Wilcocks and Ward (1991) tarafından ThDP bağlı dekarboksilaz enzimi benzoil format

dekarboksilaz’ın (BFD) açiloin bileşiklerini oluşturma potansiyeli belirlenmiştir. BFD,

ThDP bağlı dekarboksilazlar arasında en aktifidir. R-benzoin ya da S- 2-hidroksi

propiyofenon türevlerini oluşturan dekarboksilasyon ve karboligasyon tepkimelerini

katalizleyebilir. BFD içeren P. putida ve bu bakteriden ekstrakte edilen enzim ile

asetaldehit varlığında benzoilformatın dekarboksilasyonu sonucu S-2-HPP oluşumu

gözlenmiştir. pH 5-8, sıcaklık 20-40 oC arasında iken enzimin optimum aktiviteye sahip

olduğu bulunmuş ve S-2-HPP için ee % 91-92 olarak belirlenmiştir. Acinetobacter

calcoaeticus hücreleri ve hücre ekstraktı ile yapılan diğer bir çalışmada S-HPP için ee

>% 98 olarak bulunmuştur. Mikroorganizmanın ekstraktına göre daha etkin bir katalizör

olduğu belirlenmiştir (Vard and Singh 2000).

Demir vd. (1999) benzoil format fekarboksilaz (BFD) ile asimetrik benzoin tipi α -

hidroksi ketonların sentezini çalışmışlardır (Şekil 5.1). Substrat olarak aromatik ve

heteroaromatik aldehitler kullanılmıştır. Kullanılan BFD enzimi Pseudomonas putida,

Acinetobacter calcoaceticus ve Pseudomonas aeruginosa gibi bakterilerde bulunur.

Tepkime MgSO4 ve enzim kofaktörü thiamin difosfat bulunan tampon ortamında

gerçekleştirilmiş ve substrat aldehitler çözücüde çözüldükten sonra tepkime ortamına

52

eklenmiştir. Tepkime ince tabaka kromotografisi (TLC) ile izlenmiş ve tepkime

sonunda ürün analizi Chiralpak AD kiral kolonu kullanılarak HPLC de yapılmıştır.

Şekil 4.1 BFD katalizli α –hidroksi keton üretim tepkimesi

Çalışmada başlangıç substratı olan aldehitler suda çok az çözündüğünden dimetil

sülfoksit (DMSO) çözüldükten sonra tepkime ortamına eklenmiştir. Çözücü

kullanıldığında dönüşüm hızı artmış fakat ee etkilenmemiştir. Substrat olarak

benzaldehit kullanıldığında R-benzoin % 20 verim ve >% 99 ee’de elde edilmiştir.

Tepkime süresi, enzim miktarı, kofaktör ve tepkime ortamı optimize edildikten sonra %

76 verim ve >% 99 ee’de R-benzoin bulunmuştur. Dönüşüm hızının aldehit yapısının

fonksiyonu olduğu ve benzaldehit kullanıldığında en yüksek değerine ulaştığı

gözlenmiştir (Çizelge 4.1). Aldehit yapısının orto kısmına bağlı gruplar genel olarak çok

az dönüşmüştür.

53

Çizelge 4.1 BFD katalizli aromatik aldehitler

Iding et al. (2000) tarafından P. putida’dan elde edilen BFD ile kiral 2-hidroksi

ketonların sentezini çalışılmıştır. BFD’nin substrat karakterizasyonu ve ürün aralığı ile

2-hidroksi ketonların optik saflığına etki eden faktörler ve kinetik parametreler

incelenmiştir. R-benzoin enantiyomerik saflıkta üretilirken S-HPP’nin ee’sinin sıcaklık

ve benzaldehit derişiminin fonksiyonu olduğu belirlenmiştir.

Demir vd. (2001) açiloin bağı oluşumu ve kırılması ile α-hidroksi ketonların

enantiyoseçimli olarak sentezini araştırmıştır. ThDP bağlı enzim olan Benzaldehit Liyaz

(BAL) ile aromatik aldehitler, rasemik benzoin ve alifatik aldehitlerden C-C bağı

kırılması ve C-C bağı oluşumu reaksiyonları ile benzoinin iki enantiyomeri ve R-HPP

türevlerini yüksek verimde elde edilebilmiştir. BAL enzimi ilk olarak Gonzales ve

Vicuna (1989) tarafından Pseudomonas fluorescens Biovar I’dan elde edilmiştir. Bu

Ar VVeerriimm eeee [[%%]] KKoonnffiigg..

Fenil (Ph) 76 >99 R

3-MeOC6H4 18 >99 R

4-ClC6H4 17 >99 R

2-BrC6H4 >2 - -

2-MeOC6H4 >2 - -

4-FC6H4 25 >99 R

2-FC6H4 68 >99 R

5-Me-2-furil 50 >96 R

4-MeOC6H4 12 >99 R

4-MeC6H4 69 >99 R

2-furil 62 >94 R

2-CNC6H4 - - -

2ArCHO ArAr

OH

O

tampon/DMSOBFD

54

mikroorganizma benzoini üremek için karbon ve enerji kaynağı olarak

kullanabilmektedir. BAL kullanıldığında substrat içeren tepkime ortamına çözücü

eklenmesiyle dönüşümün arttığı gözlenmiştir. Substrat olarak rasemik benzoin

kullanıldığında, sadece R-benzoin benzeldehite dönüşmüş, S-benzoin tüketilmemiştir.

Demir vd. (2002) Benzaldehit Liyaz’ın (BAL) katalizlediği C-C bağı oluşum

reaksiyonu ile (Şekil 4.2) enantiyoseçimli α- hidroksi ketonların sentezini

araştırmışlardır. Çalışmada substrat olarak farklı aromatik ve heteroaromatik aldehitler

kullanılmış ve BAL enziminin substrat ve ürün aralığı araştırılmıştır. BAL enzimi ilk

olarak Pseudomonas fluorescens Biovar I mikroorganizmasından izole edilmiştir. Bu

çalışmada kullanılan BAL enzimi ise rekombinant Escheria coli’ den saflaştırılmıştır.

Sonuç olarak BAL’ın aromatik ve heteroaromatiklerin geniş bir aralığını yüksek

seçimlilikle dimerize edebildiği bulunmuştur. BAL, BFD enzimine zıt olarak aldehitin

orto kısmına bağlı gruplar bulunduğunda da bu aldehitleri substrat olarak kullanmıştır.

(Çizelge 4.2).

Şekil 4.2 BAL katalizli α –hidroksi keton üretim tepkimesi

55

Çizelge 4.2 BAL katalizlediği aromatik aldehitler

Ar

VVeerriimm eeee [[%%]] KKoonnffiigg..

Fenil (Ph) 96 >99 R

2-FC6H4 68 96 R

2-ClC6H4 80 97 R

2-MeOC6H4 87 >99 R

3-FC6H4 80 97 R

3-ClC6H4 94 >99 R

3-BrC6H4 94 >99 R

3-MeOC6H4 93 >99 R

3-HOC6H4 84 - R

4-FC6H4 89 >99 R

4-ClC6H4 95 >99 R

4-MeOC6H4 95 >99 R

4-MeC6H4 94 >99 R

2,4-F2C6H3 87 >99 R

Mandwal et al. (2004) çoğalan, ıslak ve tutuklanmış Saccharomyces cerevisiae ve

Zygosaccharomyces roixii hücreleri ile PAC üretimini incelemişlerdir. 1-hidroksi-1-

fenil-2-propanon olarakda bilinen L-fenilasetil karbinol (L-PAC), L-efedrin ve L-

psödoefedrin’in ticari olarak kimyasal sentezinde ara üründür ve maya kültürleri ile

benzaldehitin biyotransformasyonu ile endüstriyel olarak üretilir (Şekil 4.3). Diğer

mayalarla karşılaştırıldığında Saccharomyces ve Candida türlerinin L-PAC üretiminde

en etkili biyokatalizörler oldukları belirlenmiştir (Tripathi et al. 1997). L-PAC

tutuklanmış Candida utilis kullanılarak kesikli beslemeli prosesle 15.2 g/L (Shin and

Rogers, 1995), tutuklanmış Saccharomyces cerevisiae 29 g/L ile üretilebilmiştir.

2ArCHO ArAr

OH

O

BALtampon/DMSO

56

Şekil 4.3 Benzaldehit ve pirüvatın R-PAC’ye biyotransformasyonu Hildebrand et al. (2007) sürekli işletilen membran reaktörde pseudomonas fluorescens

Biovar I’den elde edilen BAL ile (R)-2-hidroksi-1-fenil-propan-1-on türevlerinin

üretimini gerçekleştirmişlerdir. Seçimli üretim için reaktör sistemi geliştirilmiş ve

kesikli ve sürekli işletilen reaktörler için kesikli deneyler ile optimize edilen kinetik

model belirlenmiştir. Oluşturulan bu model sürekli işletilen enzim mebran reaktöründe

HPP üretimini belirlemek için kullanılmıştır. Ürünler yüksek verim ve ee ile gram

ölçekte elde edilebilmiştir.

4.2 İndirgenme Yoluyla Nakamura et al. (1996) α-diketonların indirgenmesiyle α-hidroksi ketonların yüksek

kimyasal verimle üretilmesini sağlamak ve indirgenmenin bölgesel seçimliliğini

geliştirmek için basit ve etkin bir metot geliştirilmeye çalışmışlardır. Mikrobiyal hücre

olarak ekmek mayası, substrat olarak ise farklı diketonlar kullanılmıştır. İndirgenme

tepkimesi pH=7 olan fosfat tamponunda, 30oC sıcaklığında 2.5 saat’de

gerçekleştirilmiştir. α -Diketonun ekmek mayası biyokatalizörlüğünde indirgenmesiyle

α-hidroksi ketonun 2 bölgesel izomeri oluşmakta, ekmek mayasındaki diğer enzimlerin

devreye girmesi ile oluşan α-hidroksi keton indirgenerek yan ürün olarak diol’e

dönüşmektedir (Şekil 4.4).

57

Şekil 4.4 α -Diketonların indirgenme tepkimesi

Bu çalışmada diol oluşumu istenmeyen bir durumdur ve engellemek için çeşitli enzim

inhibitörleri kullanılmıştır. Bölgesel seçimliliği arttırmak için ise mayaya ısıl ön işlem

uygulanmıştır. Enzim inhibitörleri içinde en iyi sonuç metil vinil keton ile elde

edilmiştir. Substrat 1-fenil-1,2-propandion iken ısıl işlem uygulanmadığında ve MVK

ortamda bulunmadığında verim %38 ve 2:3 oranı 32:68, ısıl işlem uygulandığında ve

MVK var iken verim % 81, 2:3 oranı 6:94 olarak bulunmuştur. Substrat olarak 1-fenil-

1,2-propandion kullanıldığında % 81 verimle S-1-fenil-2-hidroksi-2-propanon % 98

ee’de elde edilmiş olup, 1-fenil-1,2-bütadion, 1-fenil-1,2-pentadiondion ve 2,3-fenil-

1,2-oktandion substrat olarak kullanıldığında iyi sonuç alınamamıştır.

Mahmoodi et al. (2003) mikroorganizma olarak yine ekmek mayası kullanarak simetrik

ve simetrik olmayan benzil türevlerinin enantiyo- ve bölgesel seçimlilikle

indirgenmesini çalışmışlardır. α-Hidroksi keton verimini arttırmak için ısıl işlem

görmüş maya, asidik tampon çözeltisi, düşük tepkime sıcaklığı ve diol dönüşümünü

önlemek için enzim inhibitörü olarak metil vinil ketonu kullanarak tepkime koşullarını

modifiye etmişlerdir. Tepkime koşullarının modifikasyonu ile indirgenme sonucu R-

benzoin % 50 enantiyomerik aşırılıkla elde edilmiştir.

58

Çeşitli küflerin enzim sistemi kullanılarak benzilin benzoin ve hidrobenzoin’e

dönüşümü Demir et al. (2004) tarafından incelenmiştir (Şekil 4.5). Küf olarak R. oryzae

(ATCC 9363), R. oryzae (72465), Rhizomucor miehi (72460) ve Rhizomucor pusillus

(72561) kullanılmış ve ortam pH’sının benzoin ve hidrobenzoinin enantiyoseçimli

olarak indirgenmesi üzerine etkisi araştırılmıştır. Her küf farklı pH’larda çalışmıştır. R.

oryzae (ATCC 9363) ve R. oryzae (72465) inkübasyonundan sonra ortam pH’sı

değişmeden kalırken, Rhizomucor miehi (72460) ve Rhizomucor pusillus (72561)

kullanıldığında önce pH düşmüş sonra ise artmış ve kısmi rasemizasyon gözlenmiştir.

pH:6.5-8.5 iken R-enantiyomer için % 81 verimle % >99 olarak en yüksek ee değerine

R. oryzae (ATCC 9363) biyokatalizör olarak kullanıldığında ulaşılmıştır. pH: 4.2- 5

aralığında ise aynı mikroorganizma % 71 verimle % 80 ee de S-enantiyomerini

oluşturmuştur. Ortam pH’sının ürünün stereokimyasını büyük ölçüde değiştirdiği

gözlenmiştir.

Şekil 4.5 Benzilin enantiyoseçimli olarak indirgenmesi Molinari et al. (1999) tarafından biyokatalizör olarak dondurarak kurutulmuş mayalar

kullanılarak karbonil guruplarının indirgenmesi araştırılmıştır (Şekil 4.6). İlk olarak

59

tipik substrat olarak etil asetoasetat ve asetofenon kullanılarak 7 tane mayanın taze ve

dondurarak kurutulmuş hücreleri arasında indirgenme performansları incelenmiştir.

Şekil 4.6 Stereoseçimli olarak karbonil gurubunun indirgenmesi Dondurarak kurutulmuş hücrelerle dönüşüm düşükten yükseğe dağılım gösterirken ee

genellikle yüksek değerlerde elde edilmiştir. Bu nedenden ve kurutulmuş hücrelerin

çalışma kolaylığından dolayı farklı ketonların indirgenme deneylerinde kurutulmuş

hücreler kullanılmıştır. Asetofenon için en yüksek dönüşüm (% 80) ve ee (% 97) R-

alkol için Pichiae etchellsii ile elde edilmiştir. Comesseto et al. (2004) Aspergillus

terreus CCT 4083, A. Terreus CCT 3320 ve R. oryaze CCT 4964 küflerini kullanarak p

kısmına çeşitli grupların bağlı olduğu asetofenonların indirgenmesini incelemiştir.

Tepkime fosfat tamponunda, küflerin ıslak hücreleri ile gerçekleştirilmiştir. Ürün analizi

kiral kolonlu GC de gerçekleştirilmiştir. En iyi sonuçlar R. oryzae CCT 4964 küfü ile

elde edilmiş, % 70- 90 arasında dönüşüm, % >99 ee değerleri elde edilmiştir. A. Terreus

CCT 4083 ve A. Terreus CCT 3320’nin ıslak hücrelerinin indirgenme ürünü alkolleri

etkin şekilde derasemize ettiği gözlenmiştir. İndirgenme ve derasemizasyon

deneylerinde alkollerinde ketonlara okside olduğu gözlenmiştir. Daha önceki yıllarda

yapılan başka bir çalışmada aynı küfler kullanılarak floroasetofenonların indirgenmesi

incelenmiş ve indirgenme ürünü alkoller yüksek verim ve enantiyoseçimlilikle elde

edildiği rapor edilmiştir (Comasseto et al. 2003).

Martinez et al. (2000) tarafından β-bloker halohidrinlerin sentezinde kullanılan α-

haloketonların maya katalizli indirgenmesi araştırılmıştır (Şekil 4.7). Çeşitli proses

parametrelerinin verim ve ee üzerine etkisi incelenmiştir. S. cerevisiae biyokatalizörü ile

S-enantiyoseçimlilik gözlenirken, enzim inhibitörü olarak metil vinil keton

kullanıldığında enantiyoseçimliliğin R- yönüne kaydığı belirlenmiştir. Islak hücrelerle,

çoğalan hücreler kullanıldığı duruma göre daha yüksek verim ve ee elde edilmiştir. 1-

kloro-3 (1-naftiloksi) propan-2-ol’ün (haloketon 1) Yarrowia lipolytica 1240 ıslak

60

hücreleri ile % 87 verim ve % 99 ee ile S-formu elde edilirken, Pichiae mexicana 11105

ıslak hücreleri ile % 85 verim ve % 95 ee ile R-fromu elde edilmiştir. İndirgenme

prosesi diğer α-haloketonlara uygulandığında daha düşük ee elde edilmiştir.

Şekil 4.7 α-Haloketonların maya katalizli indirgenmesi Lagos et al. (2004) tarafından gerçekleştirilen diğer bir çalışmada üç yeni maya ile

yüksek enantiyoseçimlilikle haloketonların indirgenmesi incelenmiştir. Ekmek mayası

ile ariloksi-halo-2-propanon (1) ya da 1-kloro-3-(fitalimidil)-propan-2-on (2)

bileşiklerinin stereoseçimli indirgenmesi düşük verim ve ee ile elde edildiğinden

taksonomik tarama yapılmıştır. Tarama sonucunda keton indirgenmesinde etkin olan

Sacchoromyces bayanus CECT 1317, Yarrowia lipolytica CECT 1317 ve Pichia

mexicana CECT 1015 mayaları belirlenmiştir. Bu mayalar yüksek enentiyoseçimlilikle

indirgediği bulunmuştur. P. mexicana (1’in indirgenmesi) ve S. bayanus (2’nin

indirgenmesi) ile sırasıyla R- ya da S- halohidrinler % 90 ee ve % 85 verimle elde

edilebilmiştir. Martinez-Lagos et al. (2005) enantiyoseçimli olarak halohidrinlerin

sentezini kalsiyum aljinata tutuklanmış iki aktif maya katalizörlüğünde

gerçekleştirmişlerdir (Şekil 4.8). P. mexicana için ıslak hücrelerle karşılaştırıldığında

tutuklanmış hücrelerde az miktarda aktivite kaybı gözlenmiştir. Y. Lipolytica ise

aktivitesini korumuştur. Tutuklanmış biyokatalizörler keton indirgenmesinde 5 kez

kullanılabilmiştir. Haloketon 1’in P. mexicana ile % 80 verim ve % 96 ee değerinde R-

enantiyomeri, Y. Lipolytica ile % 80 verim ve % 95-97 ee de S- enantiyomeri elde

edilmiştir.

61

Şekil 4.8 Haloketonların indirgenmesi Erdelyi et al. (2006) çeşitli ilaçların sentezinde ara ürün olarak kullanılabilen farklı

prokiral aril- ve arilalkil- ketonların alkollere biyoindirgenmesini araştırmışlardır.

Tepkimelerde biyokatalizör olarak, incelenen mayalar arasında en yüksek enzim

aktivitesi ve enantiyoseçimliliğe sahip olan Z. Rouxii ve D. hanseii kullanılmıştır. Z.

Rouxii ATCC 14462, S-alcoholler 1-phenylpropan-2-ol, 1-(4-metoxyphenyl)propan-2-

ol, 1-(4-chlorophenyl) propan-2-ol’ü yüksek verim ve enantiyoseçimlilikte üretmiştir.

D. hanseii ile orto bağlı fenilaseton, benzilaseton ve asetofenonlar yeterli verim ve

enantiyomerik saflıkta üretilmiştir.

Mahmoodi and Navrood (2007) ekmek mayası ile organik-su çözücü sisteminde

aromatik α- diketonların indirgenmesini araştırmışlardır. α-Diketonların suda

çözünürlüklerinin az olması sebebiyle sulu ortamda tepkime hızı, verim ve ee’nin düşük

olmasından dolayı organik-su çözücü sisteminde tepkime gerçekleştirmişlerdir. Bazı

substratlar için daha yüksek verim ve ee elde edebilmişlerdir.

4.3 Kinetik Rezolüsyon Yoluyla Adam et al. (1996) lipaz katalizli tersinmez transesterleşme tepkimesi ile rasemik α–

hidroksi ketonların kinetik rezolüsyonunu incelemişlerdir. Transesesterleşme tepkimesi

O Cl

O

O Cl

OH H

O Cl

H OH

+

O NHiPr

H OH

1 S-2 R-2

S-beta-bloker

62

(Şekil 4.9) çözücü olarak tert-butil metil eter, açil verici olarak izo profenil asetat

kullanılarak, oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir. Substrat ve ürünlerin analizleri ise

Chiracell OD ve OB kolonları kullanılarak HPLC de yapılmıştır. Çalışmada öncelikle

farklı α-hidroksi ketonların (Şekil 4.10) transesterleşmesini katalizleyen farklı ticari

lipazlar denenmiş ve üretim verimleri belirlenmiştir.

Şekil 4.9 α –Hidroksi ketonların kinetik rezolüsyonu

Şekil 4.10 İncelen α –hidroksi ketonlar

Sonuç olarak test edilen lipazlar arasında Amono PS ve Amono AK en iyi sonuçları

vermiştir. Substrat olarak 2-hidroksi propiyofenon kullanıldığında Amona AK ile 92

saatte % 48 dönüşüm ve % 89 ee’de S-HPP elde edilmiştir. İzoprofenil yerine vinil

asetat ve tert-butil eter yerine THF, diklormetan, hekzan ya da toluenin kullanılması

sonuçları değiştirmemiştir.

Demir et al. (1998) Rhizopus oryzae ile α -asetoksi ketonların enantiyoseçimli hidrolizi

ile α-hidroksi ketonların sentezini araştırmışlardır. Biyokatalizör olarak Rhizopus

oryzae (NRRL 395), substrat olarak farklı α-asetoksi ketonlar kullanılmıştır. Hidroliz

63

tepkimesi (Şekil 4.11) üreme ortamında, 30 oC sıcaklığında gerçekleştirilmiş ve

substratı çözmek için etanol kullanılmıştır. Tepkime TLC ile izlenmiş ve rasemik

asetatın % 40-45’i hidroliz olana kadar tepkime devam ettirilmiştir. Tepkime sonunda

ise ürün ve substrat analizi NMR ve GC yapılmıştır.

ArOAc

O

ArOAc

O

ArOH

O

Asetoksi keton R-Hidroksi keton S-Asetoksi keton

R. oryzae

Şekil 4.11 α-asetoksi ketonların enantiyoseçimli hidrolizi ile hidroksi ketonların sentezi

Hidroliz süresince ortam CaCO3 çözeltisi ile nötür olarak tutulmuştur. Sonuç olarak

aromatik ketonların Mn(OAc)3 ile oksidasyonu ile istenen α-asetoksi ketonların

hidrolizi ile yüksek ee’de hidroksi keton ve enantiyomerik olarak zenginleşmiş asetoksi

ketonlar yüksek kimyasal verimlerle üretilmiştir. CaCO3 çözeltisi ile tepkime ortamının

nötralleştirilmesi ee’yi arttırırken, aşırı kullanılması ise azaltmıştır. Tepkime sıcaklığı ve

etanol çözücüsü yerine THF ya da DMSO kullanılması sonuçları değiştirmemiştir. R1

(aril) ve R2 (alkil) gruplarına sahip aromatik asetoksi ketonların hidrolizi incelendiğinde

(Çizelge 4.3) ee değeri ketona bağlı alkil gruplarına göre farklılık gösterdiği

gözlenmiştir.

64

Çizelge 4.3 α-Asetoksi keton ve hidroliz sonucu elde edilen α-hidroksi ketonlar

Snell and Colby (1999) tarafından rasemik ibuprofen amid’in Rhodococcus AJ270 ile S-

(+)-ibuprofen’e enantioseçimli hidrolizi çalışılmıştır. İbuprofen ateş düşürücü ilaç

olarak kullanılmakta olup sadece S (+) formu aktiftir. Hidroliz tepkimesi

Rhodococcus’un ıslak hücreleri ile tris tamponunda gerçekleştirilmiştir ve ürünler

HPLC’de analizlenmiştir. Rhodococcus AJ270 ile ibuprofen amit ve dört ilgili 2-

phenylpropiyonamidlerin uyan asitlere % 94 ee ile hidrolizi gerçekleştirilmiştir. Sonuç

olarak S-ibuprofen % 48 dönüşüm ve % 90 ee değerinde elde edilebilmiştir.

O

OH

O

OH

OH

O

OH

O

CH3O

OH

O

CH3O

OH

O

Asetoksi ketonlar (R)-Hidroksi ketonlar %Dön. t(h) ee

O

OAc

O

OAc

O

OAc

OAc

O

OAc

O

CH3O

OAc

O

CH3O

OAc

45 84 94 48 96 93 41 120 96 47 120 94 27 144 66 32 146 70

65

Aoyagi et al. (2000) lipaz TL® katalizörlüğünde (2R,2S)-erythro-2amino-1,2-

diphenylethanol (1) sentezinde kullanılan benzoinin kinetik rezolüsyonunu

incelemişlerdir (Şekil 4.12). 1 kiral yardımcı, HPLC’de kiral durgun faz ve asimetrik

katalizde ligand olarak kullanılmaktadır. İlk olarak vinil asetat ve THF içeren ortamda,

çeşitli ticari lipazlar kullanılarak ras-benzoinin kinetik rezolüsyonu incelenmiştir.

Lipazlar arasında en iyi sonuç Lipaz TL® ile elde edilmiştir ve dönüşüm % 50 ye

ulaşmıştır. Rezolüsyon üzerine açil verici, tepkime süresi ve çözücü gibi tepkime

parametrelerin etkisi incelendiğinde dönüşüm açısından en iyi sonuç (% 52) açil verici

olarak vinil asetat, çözücü olarak THF kullanıldığında elde edilmiştir. En yüksek

enantiyomerik oran ise R-benzoin için 96:4 olarak elde edilmiştir. S-benzoin-O-asetat

ise % >99 olarak bulunmuş, hidrolizi sonucu % 91 verim ve 98:2 enantiyomerik oran ile

S-benzoin bulunmuştur.

Şekil 4.12 Rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu Gandolfi et al. (2001) tarafından dondurarak kurutulmuş Aspergillus oryzae MIM ve

Rhizopus oryzae CBS 112.07 hücreleri ile rasemik 2-fenil-1-propiyonik asitin etanol ile

esterleşmesi çalışılmıştır (Şekil 4.13). Esterifikasyon tepkimesi organik çözücüde

gerçekleştirilmiştir. Tepkime farklı alkoller (etanol, 1-propanol, 1-butanol, 1-pentanol,

1-pentanol, 1-hekzanol, 1-metil-3-butananol) kullanılarak gerçekleştirildiğinde en

yüksek ee etanol ile elde edilmiştir. Farklı çözücülerle tepkime gerçekleştirildiğinde

çözücünün polaritesinin enzimatik aktiviteyi önemli ölçüde etkilediği gözlenmiştir.

Yüksek hidrofobikliğe sahip çözücülerde daha yüksek enzimatik aktive gözlenmiştir.

Sonuç olarak R. oryzae hücreleri ile tepkime heptan ya da pentadekan çözücüsü

R,S-IbuCONH2 + H2O R-(-)-IbuCONH2 + S-(-)-Ibuprofen + NH3

C

O

OH

C

O

OH

C

O

OH

+Lipaz TL

ras-benzoin S-benzoin asetat R-benzoin

66

kullanılarak gerçekleştirildiğinde R-etil ester % >97 ee’de elde edilmiştir. A. oryzae ile

S-etil ester toluen kullanıldığında % 90 ee’de elde edilmiştir.

Şekil 4.13 Rasemik 2-fenil-1-propiyonik asitin alkol ile esterleşmesi

Wang et al. (2002) tarafından nitrillerin mikrobiyal hidrolizi ile enantiyoseçimli olarak

2-aril-4-pentenoik asit türevleri (3) ve 2-aril-4-pentenamit (2) üretimi araştırılmıştır

(Şekil 4.14). Önceki çalışmalarında Rhododococcus sp. AJ270 cells ile rasemik trans-2-

arilsiklopropanekarbonitrillerin kinetik rezolüsyonunu yüksek enantiyoseçimlilikle

gerçekleştirebilmişlerdir. Bu çalışmadada Rhododococcus sp. AJ270 biyokatalizörü

kullanılarak incelen substratların hemen hemen hepsi yüksek ee de elde edilebilmiştir (

S-asitler (% 87.4- >99.5) ve R-amitler (99.2 to > 99.5 %)).

( )±

Şekil 4.14 Nitrillerin (±)-1 hidrolizi Bora et al. (2003) Pseudomonas fluorescens RRLJ 134 surfaktant Tween 80 varlığında

(R/S)-1-ariletil asetatları S-(-)-1-ariletil asetat ve R-(+)-1-ariletanole etkin şekilde

COOH

CH3

+ ROH

COOR

CH3

+ H2O

COOR

CH3

+ H2O

A.oryzae

R. oryzae

67

hidrolize etmiştir (Şekil 4.15). Surfaktant kullanıldığı durumda, kullanılmadığı duruma

göre enantiyoseçimlilik tersine dönmüştür. Surfaktant derişminin enzim aktivitesini

etkilediği ve yüksek derişimlerinde ee’nin düştüğü gözlenmiştir.

Şekil 4.15 (R/S)-1-ariletil asetatların hidroliz tepkimesi

4.4 Derasemizasyon Yoluyla

Damle et al. (2000) tarafından Rhizopus arrhizus ve Geotrichum candidum küfleri ile β-

adrejenik blokerlerin aktif enantiyomerleri S-atenolol (1) ve S-propanolol (2) eldesi

incelenmiştir (Şekil 4.16). Küfler üreme ortamında üretildikten sonra, santrüfüjlenip

yıkanmış ve tampon ortamına eklenmiştir. R. arrhizus ve G. Candidum ile (±)-

atenolol’ün derasemisazyonu süre ve ortam pH’sının etkisi araştırıldığında pH:7 de, 6

gün sonunda en yüksek ee (>99) ve verime (% 75) ulaşılmıştır.

Ar CH3

OAc

Ar CH3

OAc

Ar CH3

OH

H H

Ar CH3

OAc

Ar CH3

OH

H H

ras

R-(+) S-(-)

S-(-) R-(+)

P. fluorescens

P. fluorescens

Tween-80

68

(±)-1a S-(-)-2a (±)-1b S-(-)-2b

Şekil 4.16 (±)-Adrenejik blokerlerin derasemisazyonu Demir et al. (2002) Rhizopus oryzae (ATCC 9363) fungusunun rasemik benzoin üzerine

derasemizasyon etkisini incelemişlerdir. Derasemizasyon tepkimesi (Şekil 4.17)

mikroorganizma üreme ortamında, 35 oC’de gerçekleştirilmiş ve rasemik benzoin

tepkime ortamına DMSO da çözülerek eklenmiştir. Tepkime için optimum pH aralığı

7.5-8.5 olarak bulunmuş ve tepkime süresince bu pH aralığında ras-benzoinin S-

enantiyomeri azalırken, R-enantiyomerinin ise arttığı gözlenmiştir. R-benzoin % 73-76

verimle ve % 95-97 ee ile elde edilebilmiştir. Tepkime farklı pH (4-5) değerlerinde

gerçekleştirildiğinde ras-benzoin % 71 verim ve % 85 ee ile S-enantiyomerine

dönüşmüştür. Sonuç olarak asimetrik merkez etrafındaki grupların üç boyutlu

dizişlerinin ortamın asitliğine bağlı olarak değiştiği gözlenmiştir.

O NH

Ar OH

O NH

Ar OH

R.arrhizus

G. candidum

Ar=1a, 2a :

CH2CONH2

Ar=1b, 2b :

69

C

O

OH

C

O

O

C

O

OH

R. oryzae

R. oryzaepH:7.5-8

R-benzoin S-benzoin

ras-benzoin

R. oryzaepH:4-5

pH:7.5-8

pH:4-5

Şekil 4.17 Rasemik benzoinin derasemizasyonu Chadha and Baskar (2002) Candida parapsilosis (ATCC 7330) biyokatalizörlüğünde

rasemik 2-hidroksi-4-fenilbutanoik asit etil esterinin (α-hidroksi esterler)

derasemizasyonu ile S-etil 2-hidroksi-4-fenilbutanoat eldesini araştırmışlardır (Şekil

4.18). α-Hidroksi asit ve esterleri çeşitli biyoaktif moleküllerin asimetrik sentezinde

yapı taşı olarak kullanılmaktadır ve S-enantiomer >% 99 ee ve % 85-90 verimle elde

edilebilmiştir. Tepkime sulu ortamda ıslak hücrelerle gerçekleştirilmiştir. İlk olarak

tepkime süresinin ee üzerine etkisi incelenmiş ve süre arttıkça ee’nin arttığı, 1 saat

sonunda en yüksek değerine ulaştığı gözlenmiştir (%>99). Rasemik esterler su ile

karışabilen organik çözücüde çözüldükten sonra tepkime ortamına eklenmiştir. Su ile

karışmayan çözücü kullanıldığında tepkime süresinin uzadığı, ee’nin yaklaşık olarak

aynı kaldığı belirlenmiştir.

Şekil 4.18 Rasemik α-hidroksi asit esterlerinin derasemizasyonu

(CH2)n

HOH

COOR(CH2)n COOR

OH

C. parapsilosis

Rasemik S-enantiyomer ee: %>99

70

Padhi et al. (2004) Candida parapsilosis katalizörlüğünde aromatik β-hidroksi asit

esterlerin derasemizasyonunu incelemişlerdir. Tepkimeler C. arapsilosis ıslak hücreleri

ile steril suda gerçekleştirilmiştir. İlk olarak derasemizasyon tepkime koşulları optimize

edilmiş ve maksimium ee değerine 3 saat sonunda erişilmiştir. Optimum koşullarda %

75 verim ve %> 95 ee olarak en yüksek değerlere ulaşılmıştır. Tepkime mekanizması

için mikroorganizma içinde iki enzim sisteminin olduğu, bir enzim bir stereoizomerin

seçimli oksidasyonunu gerçekleştirirken, diğerinin oksitlenmiş araürünü seçimli olarak

indirgediği önerisinde bulunulmuştur (Şekil 4.19).

Şekil 4.19 Derasemizasyon tepkimesi için önerilen tepkime mekanizması Lunardi et al. (2005) tarafından Trichosporon cutaneum CCT 1903 ile (±)-3-hidroksi-4-

kromanon’un (2) derasemizasyonu ile yüksek stereoseçimlilikte (3R,4S)-3,4-

kromanediol eldesi araştırılmıştır. Derasemizasyon T. cutaneum’un ıslak hücreleri ile

farklı pH’lardaki fosfat tamponlarında gerçekleştirilmiş ve glukoz ilavesinin etkisi

incelenmiştir. Rasemik 2, 48 saatlik inkübasyondan sonra ürün karışımına dönüşmüştür.

Tüm deneylerde ana ürün cis-(3R,4S)-diol’dür ve ee % 92 ile % 99 arasında farklılık

göstermiştir (verim: % 38-58). Ortamda çok az miktarda trans-(3S,4S)-diol (ee: % 98)

ve 3-hidroksi kromonon belirlenmiştir. Yüksek pH değerlerinde (3R,4S)-diol için ee

daha yüksek değerde elde edilmiş, glukoz varlığı verim ve ee’yi fazla değiştirmemiştir.

Bu tepkime için ortam pH’sına bağlı olarak indirgeyici ve oksitleyici enzimlerin aynı

substrat için yarıştığı sonucuna varılmıştır.

71

Nestl et al. (2007) tarafından liyofilize mikrobiyal hücreler kullanılarak sek-alkol ve α-

hidroksi ketonların biyokatalitik rasemizasyonu incelenmiştir. Farklı bakteri, küf ve

mayalar kullanılmış ve enantiyomerlerden bir tanesi ortama eklenerek rasemizasyon

tepkimesi gerçekleştirilmiştir. Elde edilen dönüşüm ve ee değerlerinden rasemizasyonun

sek-alkol dehidrojenazlar ve α-diketon redüktazların katalizlediği denge kontrollü

indirgenme-oksidasyon zinciri ile gerçekleştiği sonucuna varılmıştır. İncelenen her

mikroorganizmanın farklı rasemizasyon aktivitesi gösterdiği belirlenmiştir.

72

5. GEREÇ ve YÖNTEM 5.1 Gereçler Çalışmada Pseudomonas fluorescens Biovar I ATCC 49036 (American Culture

Collection), Rhizopus oryzae CBS-11718 (Central Bureau voor Schimmelcultures,

Baarn, Holland), Rhizopus oryzae CBS 112-07, Aspergillus oryzae MIM (Prof. Dr.

Francesco Molinari), Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri ve Pseudomonas

aeroginase (Gazi üniversitesi, Biyoloji Bölümü) mikroorganizmaları kullanılmıştır.

İncelenen substratlar rasemik benzoin ve benzil için sırasıyla yüksek saflıkta Fluka ve

Merck marka kimyasallar kullanılmıştır. Deneylerde kullanılan çözücüler GC

saflığında, analizlerde kullanılan çözücüler ise HPLC saflığında olup, Merck markası

tercih edilmiştir. Moleküler elek (gözenek büyüklüğü, 3o

A ) Sigmadan temin edilmiştir.

5.2 Yöntem 5.2.1 Mikroorganizmaların üretilmesi

Deneylerde her mikroorganizmanın rutin üretimi için farklı besi ortamları

kullanılmıştır. Pseudomonas fluorescens Biovar I (ATCC 49036) üretimi için

Çizelge 5.1 de bileşimi verilen sıvı tuz ortamı kullanılmıştır. pH’sı 6.7 ye ayarlanan

tuz ortamları mikroorganizma üretiminden önce 15 dk otoklavda sterillenmiştir.

Steril ortamlara mikroorganizma aşılaması 1/10 oranında laminer akışlı steril

kabinde yapılmıştır. Mikroorganizma üretimi ise 24 saat süresince 100 mL ortam

içeren 250 mL’lik erlenlerde 30o C’de 150 rpm karıştırma hızında orbital

çalkalayıcıda gerçekleştirilmiştir.

73

Çizelge 5.1 Anisoin tuz ortamı

Rhizopus oryzae CBS-111718 ve Rhizopus oryzae CBS 112-07 için küf katı ortamı

Çizelge 5.2’de gösterilmiştir. Bileşimi belirtilen katı ortam sterillendikten sonra steril

petri kaplarına aktarılmış ve katı üretim ortamları hazırlanmıştır. Katı üretim ortamında

spor üretimi 4 gün süresince 30 oC sıcaklığında inkübatörde gerçekleştirilmiş ve üretim

sonrasında 4 oC buzdolabında saklanmıştır. Aspergillus oryzae MIM dondurularak

kurutulmuş olarak alındığından üretimi gerçekleştirilmemiştir. Katı üretim ortamında

çoğaltılan sporlar suya aktarılarak spor çözeltisi hazırlanmış ve mikroskopta sayımı

gerçekleştirilmiştir. Sayımı gerçekleştirilen spor çözeltisinden başlangıç spor sayısı

5*105/1 mL olacak şekilde bileşimi 5 g/L maya özütü, 20 g/L glukoz, 5 g/L sodyum

klorür, 10 g/L tripton olan sıvı üretim ortamına aktarılmıştır. Üretim 30 oC ve 150 rpm

karıştırma hızındaki orbital çalkalayıcıda 2 gün süre ile gerçekleştirilmiştir.

Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri ve Pseudomonas aeroginase bakterileri ise

5 g/L pepton, 3 g/L et özütü içeren zengin üretim ortamında pH:7 de 30 oC sıcaklıkta

100 mL besi ortamı içeren 250 mL hacimli erlenlerde 24 saat süresince üretilmiştir.

Elementler Derişim, g/L

Anisoin

NH4Cl

KH2PO4

KH2PO4.3H2O

MgSO4.7H2O

NaCl

1mL eser element;

Fe2 (SO4)3

ZnSO4.7H2O

CuSO4.5H2O

MnSO4.H2O

CuSO4.7H2O

0.136

2

2.1

3.8

0.3

0.1

0.6

0.2

0.2

0.2

0.2

74

İncelenen tüm mikroorganizmaların sıvı ortamda üretimi 30 oC de 150 rpm karıştırma

hızındaki orbital çalkalayıcıda gerçekleştirilmiştir.

Çizelge 5.2 Küf katı üretim ortamı

5.2.2 Tampon ortamları Benzoinin derasemizasyon ve benzilin indirgenme tepkimelerinde 0.1 M derişiminde

çeşitli tampon ortamları kullanılmıştır. pH:5 için sitrik asit-Na2HPO4, pH:6,7,8 için

bileşiminde Na2HPO4-NaH2PO4 bulunan fosfat tamponu ve pH:9 için Na2CO3-NaHCO3

tamponu kullanılmıştır. İstenilen pH ve hacimde tampon ortamı hazırlamak için tampon

bileşenleri ayrı ayrı distile suda çözüldükten sonra karıştırma işlemi pH metre

kontrolünde gerçekleştirilmiştir. İstenilen pH değerine geldikten sonra 10 mL ya da 100

mL hacimlere ayrılarak otoklavda 15 dk süresince sterillenmiştir.

5.2.3 Mikroorganizmaların dondurularak kurutulması

Yapılan deneylerin bir kısmı dondurularak kurutulmuş mikroorganizmalarla

gerçekleştirilmiştir. Mikroorganizmalar sıvı ortamda üstel üreme evrelerine kadar

üretilmiş, üretimin sonunda süzüldükten sonra yıkanmış ve dondurarak

kurutulmuştur (Şekil 5.1). Dondurarak kurutma işlemi liyofilizasyon cihazında -52 oC’de vakum altında 3 gün boyunca gerçekleştirilmiştir.

Elementler Derişim, g/L

Malt ekstrakt Glukoz Pepton Agar

20 20 1 20

75

Şekil 5.1 Mikroorganizma üretimi ve dondurarak kurutulması 5.2.4 Enantiyoseçimli benzoin üretimi 5.2.4.1 C-C bağı oluşumu yoluyla benzoinin enantiyoseçimli üretim tepkime

koşulları C-C bağı oluşumuyla enantiyoseçimli benzoin üretimi 1 g/L yaş hücre, 1 g/L

benzaldehit, % 20 DMSO, 0.15 mM tiamin difosfat (ThDP) içeren 100 mL potasyum

fosfat tamponunda 250 mL’ lik ağzı kapalı erlenlerde 30 oC sıcaklıkta 150 rpm karışma

hızında gerçekleştirilmiştir. Sıvı ortamda üretilen hücreler 10000 rpm’de soğutmalı

santürfüjde çöktürülüp, steril su ile yıkandıktan sonra tepkime ortamına eklenmiştir

5.2.4.2 Kinetik rezolüsyon yoluyla enantiyoseçimli üretim tepkime koşulları

Rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu dondurarak kurutulmuş 0.05 g

biyokatalizör, 0.05 g rasemik benzoin, 2.5 mL açil verici, 5 ml çözücü ve 0.23 g

moleküler elek içeren organik ortamda gerçekleştirilmiştir (Şekil 5.2). Tepkime 30 oC sıcaklıkta ve 150 rpm karıştırma hızında orbital çalkalayıcıda 50 mL’lik vidalı

kapaklı şişelerde yapılmıştır. Tepkime süresince substrat tüketimi ve ürün oluşumu

yürütme çözücüsü olarak 1/3 oranında etil asetat/ n-hekzan karışımı kullanılarak

ince tabaka kromotografisi (TLC) ile izlenmiştir.

Dondurarak

kurutma

Mikroorganizma

Üreme ort santürfüj Liyofilize M.O. M.O. üretimi ve süzme

76

Şekil 5.2 Kinetik rezolüsyon tepkime ortamı 5.2.4.3 İndirgenme ve derasemizasyon tepkime koşulları Benzilin indirgenme ve rasemik benzoininin derasemizasyon tepkimeleri sıvı üretim

ortamında ve ayrıca tampon ortamında gerçekleştirilmiştir. Sıvı üretim ortamında

gerçekleştirilen tepkimelerde mikroorganizmalar 5 g/L maya özütü, 20 g/L glukoz, 5

g/L sodyum klorür ve 10 g/L tripton içeren ve pH’ı 7 olan 100 mL hacmindeki sıvı

üretim ortamında 2 gün çoğaltılmıştır. 2 gün sonunda ortama 1 mL DMSO da çözülen

0.04 g rasemik benzoin ya da benzil 100 mL’lik üretim ortamına eklenmiştir.

Tampon ortamında gerçekleştirilen tepkimelerde ise tepkime ortamında üretilen

hücreler steril koşullarda süzüldükten sonra iki kez tampon ortamı ile yıkanmış ve

dondurarak kurutulmuş olarak deneylerde kullanılmıştır. Tampon ortamı olarak farklı

pH’larda hazırlanan tamponlar kullanılmıştır. Derasemizasyon ve indirgenme

tepkimeleri 2 g dondurarak kurutulmuş biyokatalizör, substrat olarak 1 mL DMSO da

çözülen 0.04g benzoin ya da benzil içeren 100 mL fosfat tamponunda 30oC ve 150

rpm’de orbital çalkalayıcıda gerçekleştirilmiştir. Tepkime süresince zamanla alınan

örnekler HPLC de analizlenmiştir.

Açil verici Moleküler elek

Organik çözücü

Biyokatalizör

Rasemik benzoin

77

5.2.5 Substrat ve ürün analizi Çözücü ortamında gerçekleştirilen tepkimelerde çözücü döner buharlaştırıcıda

uçurulduktan sonra kloroformda çözülmüş ve örnekler analize hazır hale getirilmiştir.

Sulu ortamda gerçekleştirilen tepkimelerde ise sıvı faz diklormetanla üç kez ekstrakte

edilmiş ve MgSO4 ile susuz hale getirildikten sonra çözücü döner buharlaştırıcıda

uçurulmuştur. Çözücüsü uzaklaştırılan örnekler koloroformda çözülmüştür.

Kloroformda çözülen tepkime ürünleri benzoin R-, S- enantiyomerleri ile benzil

HPLC’de analizlenmiştir.

Çizelge 5.3 Analiz koşulları HPLC

Thermofinnigan

Kolon

Chiral Pak AD

Chiral cell OB

Kolon sıcaklığı

30 oC

30 oC

Dedöktör

UV

UV

Taşıyıcı faz

n-hekzan/2-propanol: 90/10

n-hekzan/2-propanol: 95/5

Akış hızı

1 ml/dk

0.9 ml/dk

Enjeksiyon hacmi

10 µL

10 µL

78

6. BULGULAR Bu çalışmada enantiyoseçimli olarak benzoin üretiminde farklı yöntem ve

mikroorganizmalar kullanılmıştır. Optik saflıkta benzoin üretimi benzaldehitten C-C

bağı oluşumu yoluyla, rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu, benzilin indirgenme ve

derasemizasyonu yöntemleri ile gerçekleştirilmiştir.

6.1 C-C Bağı Oluşumu Yoluyla Enantiyomerik Saflıkta Benzoin Üretimi

Literatürde yer alan çalışmalarda (Demir et al. 2001, Demir et al. 2002) benzaldehit

liyaz enziminin (BAL) bir aromatik aldehit olan benzaldehitden C-C bağı oluşumuyla

yüksek dönüşüm ve enantiyosaflıkta benzoin ürettiği belirlenmiştir (Şekil 6.1). BAL

enzimi ilk olarak Gonzales and Vicuna (1989) tarafından Pseudomonas fluorescens

Biovar I’dan elde edilmiştir. BAL enzimi ticari olarak satılmamaktadır ve izole enzim

saflaştırmanın maliyetinin yüksek ve zahmetli bir iş olmasından dolayı araştırmalarda

saf enzim yerine BAL enzim kaynağı olarak Pseudomonas fluorescens Biovar I

mikroorganizması kullanılmıştır. P. fluorescens Biovar I katalizli enantiyoseçimli

benzoin üretimine farklı mikroorganizma üretim ortamlarının etkisi incelenmiştir.

Şekil 6.1 C-C bağı oluşumu yoluyla benzaldehitden enantiyoseçimli benzoin eldesi

H

O

O

OH

Benzaldehit R- Benzoin

P. fluorescens Biovar I

Tampon/DMSO

79

6.1.1 Anisoin içeren tuz ortamı Gonzales and Vicuna (1989) P. fluorescens Biovar I mikroorganizmasında bulunan

BAL enzimi aktivitesinin anisoin içeren tuz ortamında en yüksek değerine ulaştığını

belirlemişlerdir. Ayrıca, ATCC’de mikroorganizma için en uygun ortam olarakda bu tuz

ortamı gösterilmiştir. Bu nedenle öncelikle bu tuz ortamında mikroorganizma üretimi

incelenmiştir. Bu mikroorganizma ATCC den alındıktan sonra anisoin tuz ortamına

alışması sağlanmıştır. Alıştırma evresinden sonra ise farklı zamanlarda alınan hücre

örneklerinin UV spektrofotometresinde 660 nm dalga boyunda oluşturduğu absorbansa

bakılmış ve zamana karşı absorbans değerleri grafiğe geçirilerek hücre üreme eğrisi elde

edilmiştir (Şekil 6.2). Üretim ortamından 50 saat süresince örnek alınarak

analizlenmiştir. Elde edilen hücre üreme eğrisine bakıldığında anisoin içeren tuz

ortamında yeterli miktarda mikroorganizma üretimi sağlanamadığı gözükmektedir. Bu

nedenle de enantiyoseçimli benzoin üretim tepkimesi gerçekleştirilememiştir.

Mikroorganizma ATCC’den satın alınmıştır ve alındığında aktivitesinin düşük olması

ihtimaline karşın bir kez daha istenmiştir. Tekrar anisoin tuz ortamına aktarılan

mikroorganizma için yeterli üretim yine sağlanamamıştır.

zaman, saat

0 10 20 30 40 50

absorbans

0,00

0,05

0,10

Şekil 6.2 Anisoin tuz ortamında hücre üreme eğrisi

80

6.1.2 Maya özütü içeren tuz ortamında üretim

Pseudomonas fluorescens Biovar I hücre üremesini arttırmak amacıyla üretim ortamına

karbon kaynağı olarak anisoinin yanı sıra maya özütü eklenmiştir. Farklı derişimlerde

maya özütü (0-0.5 g/L) anisoin tuz ortamına eklenerek hücre üreme eğrileri

oluşturulmuştur. Mikroorganizma 9 saatte üstel üreme evresine ulaşmıştır. Hücre üreme

eğrilerine bakıldığında üreme ortamındaki maya özütü derişimi arttıkça hücre üremesi

artmış, maya özütü yok iken ise üreme gözlenmemiştir (Şekil 6.3). Mikroorganizmanın

en yüksek absorbans değerine 0.5 g/L derişiminde maya özütü kullanıldığında

erişilmiştir. Üremenin en yüksek olduğu 0.5 g/L maya özütü içeren tuz ortamında 9 saat

süresince üretilen hücreler 10000 rpm ve 4 oC sıcaklığında santrüfüjlenmiş ve optik

saflıkta benzoin üretim tepkimesi gerçekleştirmek amacıyla kullanılmıştır. Ayrıca maya

özütüne ilave olarak anisoinin yerine benzaldehit ve benzoin kullanılarak da hücre

üreme eğrileri çıkarılmıştır (Şekil 6.4). Elde edilen eğrilere bakıldığında

mikroorganizma üremesinin birbirine yakın olduğu belirlenmiştir. Mikroorganizmanın

substrata alışkın olmasından dolayı anisoinde biraz daha yüksek üreme gözlenmiştir.

Benzaldehit miktarının iki katına çıkarılması az da olsa hücre inhibisyonuna neden

olmuştur. 0.5 g/L maya özütü ve 0.5 g/L maya özütü-anisoin ya da benzaldehit içeren

tuz ortamda üretilen hücrelerle benzoin üretim tepkimesi gerçekleştirilmiştir.

Zaman,saat

0 2 4 6 8 10 12 14

Absorbans

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0 g/L maya özütü

0.05 g/L maya özütü

0.2 g/L maya özütü

0.3 g/Lmaya özütü

0.5g/L maya özütü

Şekil 6.3 Farklı derişimlerde maya özütü içeren besi ortamlarında hücre üreme eğrileri

81

Şekil 6.4 0.5 g/L maya özütü ile birlikte farklı karbon kaynakları ve içeren besi

ortamlarında hücre üreme eğrileri 6.1.3 Zengin ortamda üretim P. fluorescens Biovar I üretimi zengin ortamda da gerçekleştirilmiştir. Zengin ortam

Pseudomonas türü mikroorganizmaların yoğun şekilde ürediği ortamlardan bir tanesi

olduğundan ve benzoin enantiyoseçimliliği üzerine etkisi incelenmek amacıyla

seçilmiştir. Mikroorganizma 10 saatte üstel üreme evresine ulaşmıştır (Şekil 6.5).

Zengin ortamda üretilen hücreler mikroorganizma içindeki BAL enzimi üretimini

sağlamak amacıyla karbon kaynağı olarak anisoin ya da benzaldehit içeren tuz ortamına

bir kez alıştırılmıştır. Anisoin ve benzaldehit suda çok az çözündüklerinden dolayı N,N-

dimetil formamit de (34 µl, 500 µl) çözüldükten sonra ortama ilave edilmiştir. Zengin

ortamda üretilen hücrelerden substrat olarak 0.136 g/L anisoin veya benzaldehit içeren

ve karbon kaynağı içermeyen tuz ortamlarına 1/10 oranında aşılama yapılmış ve

zamanla örnekler alınarak hücre üremesi gözlenmiştir.

Zaman,saat

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Absorbans

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,136 g/L anisoin

0,136 g/L benzoin

0,136 g/L benzaldehit

0,272 g/L benzaldehit

82

Şekil 6.5 Zengin ortamda hücre büyüme eğrisi Karbon kaynağı olarak anisoin ya da benzaldehitin kullanılması ve ortama ilave edilen

çözücü miktarının arttırılması hücre üremesini önemli ölçüde etkilememiştir (Şekil 6.6).

Ortama hiç substrat eklenmediği durumda da hücre üremesi gözlenmiştir. 1/10

oranındaki aşılama sebebiyle ilave edilen zengin ortam bu üremeye neden olarak

gösterilebilir. Hücre üremesi substrat ortamda yok iken değişmemiş ancak üstel üreme

fazına daha hızlı ulaşılmıştır. Tuz ortamına substrat ve çözücü ilavesi üreme hızını az da

olsa yavaşlatmıştır. 0.136 g/L anisoin ve benzaldehit + 500 µL çözücü içeren tuz

ortamlarında 6 gün üretilen hücreler santürfüjlendikten sonra enantiyoseçimli benzoin

üretimininde kullanılmıştır. Çözücü olarak 1 ml hacminde dimetil formamit yerine

dimetil sülfoksit (DMSO) kullanıldığında hücre üremesi fazla etkilenmemiştir (Şekil

6.7).

Zaman,saat

0 2 4 6 8 10 12 14

Absorbans

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

83

zaman,gün

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Absorbans

0,2

0,4

0,6

0,834 mikL DMFA +0.136 g/L anisoin500 mikL DMFA+0.136 g/L anisoin500 mikL DMFA+0.136g/L benzaldehitSubstrat yok

Şekil 6.6 Farklı substrat içeren tuz ortamında hücre üreme eğrileri

Zaman,saat

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

Absorbans

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

NN-dimetil formamid

DMSO

Şekil 6.7 Farklı çözücülerin hücre üremesi üzerine etkisi

84

6.1.4 Enantiyoseçimli benzoin üretimi Farklı ortamlarda üretilen hücrelerle benzaldehitden enantiyoseçimli benzoin üretim

tepkimesi üzerine çalışılmıştır. Üretim ortamlarından elde edilen hücreler

santrüfüjlendikten sonra steril su ile yıkanmış ve yoğun olarak (1 g/L) benzaldehit

(1g/L), DMSO (% 20) ve ThDP (0.15 mM) içeren tampon ortamına eklenmiştir.

Tepkimeler 100 ml’lik ağzı kapalı erlenlerde gerçekleştirilmiş ve bir ay süresince

tepkime TLC (ince tabaka kromotografi) de takip edilmiştir. Ayrıca belli sürelerle

alınan örneklerden ürün karışımı ekstrakte edilmiş ve çözücüsü döner buharlaştırıcıda

uçurulduktan sonra kloroformda çözülerek HPLC’de analizlenmiştir. Yapılan analiz

sonuçlarında incelenen tüm üretim koşullarında benzoin oluşumu gözlenmemiştir.

6.2 Rasemik Benzoinin Kinetik Rezolüsyonu ile Enantiyomerik Saflıkta Benzoin Eldesi BAL katalizörlüğünde C-C bağı oluşum tepkimesi ile enantiyoseçimli olarak benzoin

üretimi gerçekleştirilememiştir. Bu nedenden ötürü farklı mikroorganizmalar ve

enzimlerin katalizör olarak kullanıldığı ve enantiyoseçimli organik bileşiklerin

üretiminde sıklıkla kullanılan kinetik rezolüsyon tepkimesi ile teze devam edilmiştir.

Rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu lipaz kaynağı olarak kullanılan mikroorganizma

ve izole lipaz enzimleri katalizörlüğünde transesterleşme tepkimesi ile

gerçekleştirilmiştir (Şekil 6.8). Kinetik rezolüsyon yönteminde kiral bir ayırıcı, katalizör

ya da çözücü varlığında enantiyomerlerin tepkime hızlarının farklı olmasından dolayı

kısmen ya da tümüyle rasemik bileşiğin rezolüsyonu gerçekleşir. Rasemik benzoinin

kinetik rezolüsyonu susuz ve organik çözücülü ortamda açil verici varlığında

mikroorganizma katalizli transesterleşme tepkimesi ile yapılmıştır.

Ulaşılması kolay ve verimli biyokatalizörler olduklarından farklı kaynaklardan elde

edilen lipazlar kinetik rezolüsyon tepkimelerinde sıklıkla kullanılmaktadır. Lipazların

rasemik alkol ve esterleri etkin şekilde ayırdığı belirlenmiştir. Bu enzimlerin çoğu ısıya

dayanıklı olduğu ve kofaktöre ihtiyaç duymadıkları belirlenmiştir (Haeffner et al.

1998).

85

Bu çalışmada rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu tepkimesinde Pseudomonas

fluorescens Biovar I, Rhizopus oryzae CBS-11718, Rhizopus oryzae CBS 112-07,

Aspergillus oryzae MIM, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri ve Pseudomonas

aeroginase mikroorganizmaları lipaz kaynağı olarak kullanılmıştır.

Ras-benzoin S-benzoin asetat R-benzoin ya da ya da R-benzoin asetat S-benzoin Şekil 6.8 Rasemik benzoinin çözücülü ortamda kinetik rezolüsyonu 6.2.1 P. fluorescens Biovar I ile rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu

Kinetik rezolüsyon deneylerinde en yüksek hücre üremesinin gözlendiği zengin ortamda

üretilen hücreler kullanılmıştır. P. fluorescens zengin ortamda 10 saat süresince

üretildikten sonra santrüfüjlenmiştir. Santrüfüjlenen mikroorganizma dondurularak

kurtulmuş olarak kinetik rezolüsyon tepkimesinde kullanılmıştır. Dondurarak kurutma

işlemi mikroorganizmadaki fazla suyu uzaklaştırmak amacıyla yapılmıştır.

Transesterleşme tepkimeleri organik çözücülü ortamda gerçekleştirilmekte ve ortamda

su olması istenmemektedir. Su varlığında tepkime farklı bir yöne kaymakta ve hidroliz

tepkimesi gerçekleşmektedir. Bu da istenmeyen bir durum olduğundan mikroorganizma

üretim ortamından gelen su mikroorganizmanın dondurarak kurutulması ile

uzaklaştırılmıştır.

6.2.1.1 Mikroorganizma miktarının etkisi Kinetik rezolüsyon tepkimesinin hızına ve substrat enantiyomerik aşırılığına etkisini

incelemek amacıyla ilk olarak dondurarak kurutulmuş mikroorganizma miktarının

86

enantiyomerik aşırılığa olan etkisi incelenmiştir. Farklı miktarlarda kurutulmuş hücre

(0.01 g -0.785 g) çözücü olarak THF ve açilverici olarak vinil asetat içeren tepkime

ortamına eklenmiştir. 25 gün sonunda en iyi ee değeri benzoinin S- formu için %20

olarak 0.05 g başlangıç kurutulmuş hücre miktarında gözlenmiş ve %45 dönüşüm

değerine ulaşılmıştır (Çizelge 6.1). Enzimatik tepkimelerde hız enzim derişimi ile

orantılı olarak değişir. Buna bağlı olarak mikroorganizma miktarı arttıkça 25 gün

sonunda elde edilen dönüşüm değerleri artmış, ancak ee fazla etkilenmemiştir. Yüksek

seçimlilik elde edilememesine ise mikroorganizma enzim sisteminin benzoin

enantiyomerlerini ayırt edememesi ya da bir enzim bir enantiyomeri asetatına

dönüştürürken diğer enzim diğer enantiyomeri asetatına dönüştürmesi neden olarak

gösterilmiştir.

Çizelge 6.1 Başlangıç mikroorganizma miktarının ee üzerine etkisi, 25 gün (50 mg

Benzoin, 5 mL THF, 2.5 mL VA, 0.23 g ME, 30 oC, 150 rpm)

Hücre miktarı, g

% ee

% c

Kf

0.01 19 25 S

0.05 20 45 S

0.25 16 47 S

0.50 18 53 S

0.785 15 67 S

6.2.1.2 Çözücü etkisi Farklı organik çözücülerin substratın enantiyoseçimliliği üzerine etkisi incelenmiştir.

Organik çözücü olarak tetrahidrofuran, kloroform, 2-propanol, dietileter, n-hekzan,

benzen, metanol, etilasetat, diklormetan ve aseton kullanılmıştır. Tepkime 0.05 g

kurutulmuş hücre ile gerçekleştirilmiştir. En yüksek ee değeri %48 dönüşümle

benzoinin S -formu için %21 olarak n-hekzan çözücü olarak kullanıldığında elde

edilmiştir (Çizelge 6.2). En yüksek dönüşüm ise kloroform kullanıldığında %50

değerinde bulunmuştur. Organik çözücüler tepkimeyi farklı şekillerde

87

etkileyebilmektedir. Hücre içerisindeki aktif olması istenen enzim ve izoenzimlerinin

seçimli denatürasyonuna sebep olabilir. Substrat ve ürün dağılımını etkileyebilmekte ya

da toksikliği dolayısıyla hücrelerin inaktivasyonuna sebep olabilmektedir (Wu et al.

2004). Bu çalışmada farklı polaritede çözücü kullanılması dönüşüm ve ee üzerinde

önemli bir etki yaratmamıştır. Literatürde gerçekleştirilen lipaz katalizli bazı esterleşme

ve transesterleşme çalışmalarında dönüşüm ve ee’nin çözücü cinsinden etkilendiği,

ancak çözücü polaritesi ile ilişkisinin olmadığı belirlenmiştir (Secundo et al. 1992,

Aoyagi et al. 2000, Gandolfi et al. 2001).

Çizelge 6.2 Çözücü cinsinin ee üzerine etkisi, 25 gün (50 mg Benzoin, 50 g LFM, 2.5

mL VA, 0.23 g ME, 30 oC, 150 rpm)

6.2.1.3 Başlangıç substrat miktarının etkisi

Tepkime 0.05 g kurutulmuş hücre ve farklı miktarlarda ras-benzoin içeren çözücü

ortamında gerçekleştirilmiştir. Çözücü olarak THF, açil verici olarak vinil asetat

kullanılmıştır. Tepkime ortamında substrat derişiminin değişmesi tepkime hızının yanı

sıra stereoseçimliliğide etkileyen bir parametredir. Mikroorganizma içinde farklı

stereoseçimliliğe sahip enzimlerin bulunabilmesi, bu enzimlerin substrat için farklı

Çözücü

log P

% c

% ee

Kf

Metanol - 0.76 48 17 S

Aseton - 0.23 45 15 S

2-propanol 0.28 45 16 S

Tetrafuran 0.5 45 20 S

Etilasetat 0.68 47 5 S

Dietileter 0.85 45 12 S

Kloroform 2 50 9 S

Benzen 2 46 7 S

Diklormetan 1.5 40 8 S

n-hekzan 3.5 48 21 S

88

ilgiye sahip olmaları ve farklı enzimler için farklı substrat derişimlerinde substrat

inhibisyonunun gerçekleşmesi tepkime hız ve stereoseçimliliğinde değişikliğe sebep

olmaktadır. Elde edilen sonuçlarda başlangıç substrat miktarının değiştirilmesi ee

üzerinde önemli bir değişiklik yaratmamıştır. Başlangıç substrat miktarı 0.1 g iken en

yüksek ee değeri % 39 dönüşümle benzoinin S- formu için % 22 olarak bulunmuştur

(Çizelge 6.3). Substrat inhibisyonu nedeniyle başlangıç substrat miktarı arttıkça

dönüşümün azaldığı gözlenmiştir. Molinari et al. (1998) dondurarak kurutulmuş

mikrobiyal hücrelerle yaptıkları çalışmada benzer bir sonuçla başlangıç substrat

derişimi arttıkça dönüşümün azaldığını, ee’nin ise değişmediğini gözlemişlerdir.

Çizelge 6.3 Başlangıç substrat miktarının ee üzerine etkisi, 25 gün (50 g LFM, 5 mL

THF, 2.5 mL VA, 0.23 g ME, 30 oC, 150 rpm)

6.2.1.4 Açil verici cinsinin etkisi

Açil verici cinsinin substratın enantiyoseçimliliği üzerine etkisi incelenmiş, açil verici

olarak ise vinil asetat ve vinil butirat olmak üzere farklı açil grubuna sahip iki vinil ester

kullanılmıştır. Açil grubu stereokimyasal kontrol edici olarak lipaz enziminin aktif

kısmına bağlanır ve lipaz enziminin kiral bağlanma bölgesinin yanı sıra kovalent olarak

aktif kısma bağlanan açil grubuda enantiyoseçimlilikte büyük rol oynar. Bu nedenle

rezolüsyon üzerine etkisi incelenmiştir. Kinetik rezolüsyon tepkimesi çözücü olarak

THF, açil verici olarak vinil asetat ya da vinil butirat kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 25

gün devam ettirilen tepkime sonunda incelenen iki açil vericiden vinilasetat ile % 20 ee

(S) değerine ulaşılmıştır. Açil vericinin değiştirilmesi enantiyoseçimliliği etkilememiş,

Substrat derişimi,

g/7.5 mL

% c

% ee

Kf

0.025 48 17 S

0.05 45 20 S

0.1 39 22 S

0.2 35 19 S

89

ee ve dönüşüm değerleri birbirine çok yakın bulunmuştur (Çizelge 6.4). Elde edilen

sonuçlara zıt olarak literatürde yer alan bazı çalışmalarda kullanılan substrat ve enzime

bağlı olarak farklı açil verici kullanılmasının enantiyoseçimliliği büyük ölçüde

değiştirebildiği gözlenmiştir (Ema et al. 1996, Molinari et al. 1998).

Çizelge 6.4 Açil verici cinsinin ee üzerine etkisi, 25 gün (50 mg Benzoin, 50 mg LFM 5 mL THF, 0.23 g ME, 30 oC, 150 rpm)

6.2.1.5 Sıcaklığın etkisi Rasemik benzoinin enantiyoseçimli transesterifikasyonu üzerine sıcaklık etkisi

incelenmiş ve tepkime 10 oC, 30 oC, 40 oC, 50 oC sıcaklıklarında gerçekleştirilmiştir.

Tepkimede açilverici olarak vinil asetat ve çözücü olarak ise THF kullanılmıştır.

Sıcaklık enzim aktivitesini, seçimliliğini ve kararlılığını etkileyen bir parametredir.

Sıcaklık arttıkça enzimatik tepkimelerde hız artar. Bu artış sıcaklık belli bir değere

yükselinceye kadar devam eder. Daha yüksek sıcaklıklarda enzim denatüre olarak

aktivitesini kaybeder ve tepkime hızı azalır. Bu tepkime için sıcaklığın yükselmesiyle

dönüşüm artırmış, ee değeri ise yaklaşık olarak aynı değerde kalmıştır. Maksimum ee

(S) 25 gün sonunda 50 oC sıcaklıkta % 21 bulunmuştur (Çizelge 6.5).

Açil verici

% c

% ee

Kf

vinil asetat 46 20 S

vinil butirat 45 18 S

90

Çizelge 6.5 Sıcaklığın ee üzerine etkisi, 25 gün (50 mg Benzoin, 50 mg LFM, 5 mL THF, 2.5 mL VA, 0.23 g ME, 150 rpm)

6.2.1.6 Karıştırma hızının etkisi Rasemik benzoinin enantiyoseçimli transesterleşmesi üzerine karıştırma hızı etkisi

incelenmiş ve tepkime 0, 150, 200 rpm karıştırma hızlarında gerçekleştirilmiştir.

Karıştırma hızı tepkime sisteminde substrat ve ürün difüzyonunu ve dağılımını

etkilemektedir. Böylece hız, verim ve enantiyoseçimlilik etkilenir. Bu tepkime

sisteminde ise incelenen karıştırma hızlarında enantiyoseçimlilik etkilenmemiş, ee

değerleri birbirine çok yakın bulunmuştur. Tepkime sonunda elde edilen dönüşüm

karıştırma hızı arttıkça artmış, 150 rpm de en yüksek ee (% 20 S) değerine ulaşılmıştır

(Çizelge 6.6). Karıştırma hızı arttıkça dönüşüm artması, tepkime için kütle transferinin

hız kısıtlayıcı basamak olduğu şeklinde yorumlanmıştır.

Çizelge 6.6 Karıştırma hızının ee üzerine etkisi, 25 gün (50 mg Benzoin, 50 mg LFM, 5

mL THF, 2.5 mL VA, 0.23 g ME, 30 oC )

T, oC

% c

% ee

Kf

10 30 17 S

30 45 20 S

40 50 21 S

50 55 18 S

Karıştırma hızı, rpm

% c

% ee

Kf

0 40 18 S

150 45 20 S

200 50 17 S

91

6.2.1.7 Moleküler elek miktarının etkisi

Rasemik benzoinin enantiyoseçimli transesterleşmesi üzerine moleküler elek miktarının

etkisi incelenmiş ve tepkime 0, 0.1, 0.2 g moleküler elek miktarlarında

gerçekleştirilmiştir. Tepkime ortamında moleküler elek yok iken rasemik substratın

dönüşümü çok yavaş olmuştur. Moleküler elek miktarı arttıkça dönüşüm artmış, ee ise

yakın değerlerde elde edilmiştir (Çizelge 6.7). Moleküler elek ortamda var olan fazla

suyu uzaklaştırmak amacıyla eklenmiştir. Lipaz katalizli transesterleşme tepkimelerinde

ortamda su olması tepkimeyi hidroliz yönüne kaydırmakta ve tepkime verimini

düşürmektedir. Ayrıca tepkime ortamında enzimin katalitik aktivite gösterebilmesi için

ihtiyacı olandan fazla su bulunması ile girdi ve ürünlerin lipaz aktif merkeziyle

tepkimesi engellenmiş olmakta ve tepkime hızı yavaşlamaktadır. Bu sebeple

mikroorganizmalar dondurarak kurutulduktan sonra tepkimelerde kullanılmış ve ortama

moleküler elek eklenmiştir. Kurutma sonunda mikroorganizma içinde bir miktar suyun

tam olarak uzaklaşmadan kalması ya/ ya da moleküler eleğin tepkime yüzeyini

arttırması nedeniyle moleküler elek miktarının artışı dönüşümü yükseltmiştir.

Literatürde yapılan çalışmalarda moleküler elek ilavesinin özellikle hidrofobik

çözücülerde transesterleşme hızını arttırdığı gözlenmiş ve enantiyoseçimliliği önemli

ölçüde değiştirmediği belirlenmiştir (Yamane et al. 1989, Secundo et al. 1992).

Çizelge 6.7 Moleküler elek miktarının ee üzerine etkisi, 25 gün (50 mg Benzoin, 50 mg LFM, 5 mL THF, 2.5 mL VA, 30 oC, 150 rpm)

Moleküler elek miktarı, g

% c

% ee

Kf

0 20 15 S

0.1 45 20 S

0.2 55 17 S

92

6.2.1.8 Islak hücrelerle rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu Islak hücrelerle rezolüsyon tepkimesinde sıvı üretim ortamından santrüfüjle ayrılan

hücreler, steril saf su ile yıkandıktan sonra tekrar santürfüjlenip yoğun olarak tepkime

ortamına eklenmiştir. Tepkime 20 gün devam ettirilmiştir. Sonuçlara bakıldığında süre

arttıkça rasemik benzoinin benzoin asetata dönüşümü artmış, fakat benzoinin

enantiyomerik aşırılığı (ee) çok küçük artış ve azalışlar göstermiştir (Çizelge 6.8). En

yüksek ee değeri % 24 olarak benzoinin S- formu için 16. gün de elde edilmiştir.

Kinetik rezolüsyon tepkimesi yaş hücrelerle çok yavaş gerçekleşmiştir. Kurutulmadan

ıslak olarak çözücü ortamına eklenen hücreler moleküler elek etrafına yapışmış, sıvı

içinde homojen olarak dağılımı sağlanamamıştır. Bu nedenle ve eklenen moleküler

eleğinde ortamdaki suyu uzaklaştırmakta yetersiz kaldığından dönüşüm yavaş olmuştur.

Çizelge 6.8 Islak hücrelerle rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu (50 mg Benzoin,

100 mg LFM, 5 mL THF, 2.5 mL VA, 0.23 g ME, 30 oC, 150 rpm)

Süre, gün

% c

% ee

Kf

12 5 15 S

14 8 18 S

16 12 24 S

18 20 22 S

20 27 21 S

6.2.2 Farklı küfler ile rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu

Benzoinin transesterleşme tepkimesinde kullanılan R. oryzae CBS 112-07 ve

Aspergillus oryzae MIM küfleri dondurarak kurutulmuş olarak kullanılmıştır. Rasemik

benzoinin kinetik rezolüsyonu üzerine ortam koşullarından çözücü cinsi, açil verici cinsi

ve sıcaklık etkisi incelenmiştir.

93

6.2.2.1 Çözücü cinsinin etkisi Farklı organik çözücülerin R. oryzae CBS 112-07 ve A. oryzae MIM katalizörlüğünde

benzoinin enantiyoseçimli transesterifikasyonu üzerine etkisi incelenmiştir. Organik

çözücü olarak tetrahidrofuran, kloroform, diklormetan, 2-propanol, benzen, toluen ve

etilasetat kullanılmıştır. İki biyokatalizör içinde çözücü cinsinin enantiyomerik aşırılığı

önemli ölçüde etkilemediği görülmüştür (Çizelge 6.9). Benzoin tepkime süresince

rasemik olarak kalmış olup iki enantiyomerde aynı hızda asetatına dönüşmüştür.

Dönüşüm ise çözücü türünden büyük ölçüde etkilenmiş, iki biyokatalizör içinde en

yüksek dönüşüme kloroform çözücü olarak kullanıldığında erişilmiştir. R. oryzae için

benzen ve toluen çözücü olarak kullanıldığında elde edilen dönüşümler çok küçük

değerlerde bulunmuştur. Dönüşüm, çözücünün hücre içerisindeki aktif olması istenen

enzim ve izoenzimlerinin seçimli denatürasyonuna sebebiyet vermesi, substrat ve ürün

dağılımını etkilemesi ya da toksikliği dolayısıyla hücreleri inaktive etmesi gibi

sebeplerle etkilenmiştir. İki küf karşılaştırıldığında ise elde edilen ee ve dönüşümler

birbirine yakın değerlerde elde edilmiştir.

Çizelge 6.9 Çözücü cinsinin ee üzerine etkisi (50 mg Benzoin, 50 mg LFM, 2.5 mL VA,

0.23 g ME, 30 oC, 150 rpm)

Mikroorganizma

R. oryzae CBS 112-05

A. oryzae MIM

Çözücü % c % ee Kf % c % ee Kf

tetrahidrofuran 35 16 R 30 7 S

kloroform 46 8 R 45 9 S

diklormetan 20 6 R 25 11 S

2-propanol 25 4 R 20 10 S

benzen 6 7 R

toluen 3 5 R

etilasetat 23 6 R

94

6.2.2.2 Açil verici cinsinin etkisi Açil verici cinsinin substratın enantiyoseçimli transesterifikasyonu üzerine etkisi

incelenmiş ve açil verici olarak vinil asetat, vinil bütirat, bütil asetat ve izopropenil

asetat kullanılmıştır. Tepkime 0.05 g dondurarak kurutulmuş R. oryzae CBS 112-07,

0.05 g ras-benzoin, 5 mL THF, 2.5 mL açil verici içeren ortamda gerçekleştirilmiştir.

Açil verici cinsi benzoinin enantiyoseçimliliğini etkilememiştir, iki enantiyomerde

yaklaşık olarak eşit hızlarda asetatına dönüşmüştür. İncelenen açil vericilerden vinil

esetat ile en yüksek ee benzoinin R-formu için % 16 olarak bulunmuştur (Çizelge 6.10).

Dönüşüm değerleri kullanılan açil vericiye göre farklı elde edilmiştir. 30 gün sonunda

en yüksek dönüşüm değerine (% 45) vinil butirat kullanıldığında ulaşılmıştır.

Açil grubu stereokimyasal kontrol edici olarak lipaz enzininin aktif kısmına bağlanır ve

lipaz enziminin kiral bağlanma bölgesinin yanı sıra kovalent olarak aktif kısma

bağlanan açil grubuda enantiyoseçimlilikte büyük rol oynar. Fakat bu tepkime için açil

grubunun değişmesi stereoseçimliliği etkilememiştir.

Çizelge 6.10 Açil verici cinsinin ee üzerine etkisi, 30 gün (50 mg Benzoin, 50 mg LFM,

5 mL THF, 30 oC, 150 rpm)

6.2.2.3 Farklı bakteriler ile rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu Farklı bakteri olarak Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri ve Pseudomonas

aeroginase kullanılmıştır. Rasemik benzoinin transeterleşme tepkimesi 0.03 g

dondurarak kurutulmuş hücre, 0.03 g rasemik benzoin ve 1.5 ml açil verici ile 2.5 ml

Açil verici

% c

% ee

Kf

vinil asetat 35 16 R

vinil bütirat 45 10 R

bütil asetat 33 11 R

izopropenil asetat 30 8 R

95

THF bulunan çözücü ortamında gerçekleştirilmiştir. Lipaz kaynağı olarak kullanılan bu

mikroorganizmaların rasemik benzoinin enantiyoseçimliliği üzerine etki etmediği,

yalnızca dönüşümü etkilediği gözlenmiştir (Çizelge 6.11). P. aeroginase bakterisi

kullanıldığında dönüşüm daha yüksek bulunmuştur. Nedeni bakteri içindeki enzim

aktivitesinin daha yüksek olması şeklinde yorumlanmıştır.

Çizelge 6.11 Farklı bakterilerin ee üzerine etkisi, 17 gün (30 mg Benzoin, 30 mg LFM,

2.5 mL THF, 1.5 mL VA, 0.15 g ME, 30 oC, 150 rpm)

Mikroorganizma

% c

% ee

Kf

pseudomonas stutzeri 20 5 R

pseudomonas aeroginase 30 10 S

pseudomonas putida 25 8 S

6.2.3 Farklı izole lipaz enzimleri ile rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu Çalışmanın bu kısmına kadar benzoinin transesterleşme tepkimesi ile enantiyoseçimli

üretimi lipaz enzimi içeren mikroorganizmalarla gerçekleştirilmiştir. Fakat incelen

mikroorganizmalar benzoinin iki enantiyomerini de substrat olarak kullandığından

yüksek enantiyoseçimlilik elde edilememiştir. Bilindiği gibi mikroorganizmalar enzim

deposudur ve substrata uygun enzim mikroorganizma içinde var olmayabilir ya da

enzim substrat için enantiyoseçimliliğe sahip değildir. Ayrıca, mikroorganizma içinde

birden fazla enzim olabilir ve bir enzim enantiyomerlerden bir tanesini kullanırken diğer

enzim öbür enantiyomeri kullanabilir. Böyle durumlarda yüksek enantiyoseçimliliğin

elde edilmesi mümkün olmaz. Şimdiye kadar yapılan çalışmalarda elde edilen

sonuçlarda, incelenen mikrobiyal hücreler benzoin enantiyomerlerinin ikisinide yaklaşık

olarak aynı hızlarda asetatına dönüştürmüştür. Çalışmanın devamında izole lipaz

enzimleri kullanılarak devam edilmiştir.

96

6.2.3.1 Enzim kaynağının etkisi

Enzim kaynağının etkisi incelenirken Pseudomonas cepeciae ve amono lipaz PS II

enzimleri kullanılmıştır. Tepkime 0.05 g enzim, 0.05 g ras-benzoin, 0.1 g moleküler

elek, 2.5 ml vinil asetat ve çözücü olarak 5 ml THF içeren ortamda gerçekleştirilmiştir.

Mikrobiyal lipazlara göre daha kısa sürede yüksek dönüşümlere ulaşılmış, ancak

rasemik benzoinin enantiyoseçimliliği değişmemiştir (Çizelge 6.12). Dönüşümün daha

yüksek değerlerde olması saf olarak ortama eklenen enzim miktarının daha fazla olması

ve kütle aktarım kısıtlamasının olmaması ile açıklanabilir. Bu nedenlerle izole enzim

kullanıldığında daha kısa sürede yüksek dönüşüm değerlerine ulaşılmıştır.

Çizelge 6.12 Enzim kaynağının ee üzerine etkisi, 5 gün (50 mg Benzoin, 50 mg Enzim,

5 mL THF, 2.5 mL VA, 0.1 g ME, 30 oC, 150 rpm)

Enzim

% c

% ee

Kf

pseudomonas cepeciae 40 5 S

amona lipase PS II 42 3 S

6.2.3.2 Açil verici etkisi

Açil verici olarak farklı zincir uzunluklarına sahip vinil asetat, vinil laurat, n-bütil asetat

ve etil heptanoat kullanılmıştır. Enzim olarak P. cepeciae lipazı kullanıldığında

incelenen açil vericiler ile yüksek ee de benzoin elde edilememiştir (Çizelge 6.13). Etil

heptanoat açil verici olarak kullanıldığında daha kısa sürede yüksek dönüşüm elde

edilmiş ve 4 günde % 49 dönüşüme ulaşılmıştır.

97

Çizelge 6.13 Açil verici türünün ee üzerine etkisi (50 mg Benzoin, 50 mg P. cepeciae, 5 mL THF, 0.1 g ME, 30 oC, 150 rpm)

Açil verici

Süre

% c

% ee

Kf

vinil asetat 9 52 5 S

vinil laurat 12 45 8 S

n-bütil asetat 15 50 10 S

etil heptanoat 4 49 7 S

Amono lipaz PS II kullanıldığında ise incelenen açil vericiler ee’yi etkilememiş ve

benzoin ortamda rasemik formda kalmıştır (Çizelge 6.14). Etil heptanoat açil verici

olarak kullanıldığında tepkime daha hızlı gerçekleşmiştir ve 4 günde % 48 dönüşüme

ulaşılmıştır.

Çizelge 6.14 Açil verici türünün ee üzerine etkisi, 4 gün (50 mg Benzoin, 50 mg Amono

Lipaz PS II, 5 mL THF, 0.1 g ME, 30 oC, 150 rpm)

Açil verici

% ee

% c

Kf

vinil asetat 6 40 S

vinil laurat 3 38 S

n-bütil asetat 9 25 S

etil heptanoat 5 48 S

6.2.3.3 Sıcaklık etkisi Sıcaklık etkisi 0.05 g P.cepeciae lipazı, 0.05 g ras-benzoin, 0.1 g moleküler elek, 2.5

mL vinil asetat ve 5 mL THF içeren ağzı kapaklı şişelerde 0 oC, 10 oC ve 30 oC

sıcaklıklarında 150 rpm karıştırma hızında incelenmiştir. Sıcaklık artışı tepkime hızını

arttırmasına karşın ee üzerine etki etmemiştir (Çizelge 6.15).

98

Çizelge 6.15 Sıcaklığın ee üzerine etkisi (50 mg Benzoin, 50 mg P. cepeciae, 2.5 mL VA, 5 mL THF, 0.1 g ME, 150 rpm)

6.2.3.4 Moleküler elek etkisi Moleküler elek etkisi incelenirken 0.05 g P. cepeciae, 0.05 g ras-benzoin ve moleküler

elek, 2.5 mL farklı açil vericiler ve 5 mL THF içeren ağzı kapaklı şişelerde 30 oC ve

150 rpm de gerçekleştirilmiştir. İncelenen tüm açil vericilerle moleküler elek ortamda

yok iken tepkime çok yavaş olmuş, var iken ise tepkime büyük ölçüde hızlanmıştır.

Fakat ee etkilenmemiştir (Çizelge 6.16).

Mikrobiyal lipazlar yerine saf lipazlar kullanıldığında farklı olarak daha kısa sürede

yüksek dönüşümler elde edilmiştir. İncelenen tüm koşullarda iki şekilde de iki

enantiyomerin yaklaşık aynı hızla asetatına dönüştüğü ve benzoinin tepkime sonunda

rasemik formda kaldığı belirlenmiştir. İncelenen mikroorganizmalar ve daha önce farklı

ticari lipaz enzimleri ile yapılan çalışmalar sonucunda (Kösali 2005) rasemik benzoinin

zor bir substrat olduğu, mikroorganizma içinde varolan enzimler ve izole enzimlerin

benzoin enantiyomerlerini etkin şekilde ayırt edemediği sonucuna varılmıştır.

T, oC

Süre

% c

% ee

Kf

0 19 28 10 S

10 19 39 12 S

30 9 52 11 S

99

Çizelge 6.16 Moleküler elek miktarının ee üzerine etkisi etkisi (50 mg Benzoin, 50 mg P. cepeciae, 2.5 mL VA, 5 mL THF, 30 oC, 150 rpm

6.3 Benzilin İndirgenmesi ile Enantiyoseçimli Benzoin Eldesi Asimetrik sentezlerde ve enantiyoseçimli üretimde sıklıkla kullanılan yöntemlerden biri

de indirgenmedir. Benzilin indirgenmesi ile enantiyoseçimli benzoin üretiminde,

prokiral substrat olan bezil molekülünde bulunan C=0 çift bağlarından bir tanesi seçimli

olarak oksidoredüktaz enzimleri katalizörlüğünde indirgenmekte ve zaman içinde

benzoin enantiyomerlerinin R- ya da S- formunu oluşturmaktadır (Şekil 6.10). Bu

tepkimede oluşan benzoin enantiyomerleri derasemizasyona yol açan oksidasyon

tepkimesi ile tekrar benzile dönüşebildiği gibi benzoin molekülünde bulunan diğer C=O

çift bağ da indirgenerek hidrobenzoin oluşumu gerçekleşebilmektedir. Ortam pH’sı ve

zaman ürün enantiyoseçimliliği ve dönüşüm açısından çok etkilidir. Benzilin benzoine

indirgenme tepkimesinde Rhizopus oryzae CBS-111718 küfü biyokatalizör olarak

kullanılmıştır.

Moleküler elek, g

Süre gün

Açil verici

% c

ee

Kf

0

21 vinil laurat 30 10 S

21 n-bütil asetat 27 7 S

21 etil heptanoat 45 5 S

0.1

5 vinil laurat 30 8 S

15 n-bütil asetat 50 3 S

4 etil heptanoat 49 4 S

100

Şekil 6.9 Benzilin indirgenme tepkimesi (Demir et al. 2004) 6.3.1 Üreme ortamında benzilin indirgenmesi ile enantioseçimli benzoin üretimi R. oryzae CBS-111718 ile benzilin indirgenmesi ilk olarak sıvı üretim ortamlarında

gerçekleştirilmiştir. Üreme ortam pH’sının benzoinin enantiyoseçimliliğine ve benzilin

benzoine dönüşümüne etkisi gözlenmiştir. Ayrıca rasemik benzoinin üreme ortamında

derasemizasyonu da bu başlık altında incelenmiştir.

6.3.1.1 Üreme ortam pH’sının enantioseçimli benzoin üretimine etkisi MEA katı ortamında üretilen küfün spor çözeltisi hazırlanmış ve başlangıç spor sayısı

5*105 hücre/1 mL olacak şekilde başlangıç pH’ı 5, 6, 7, 8 ve 9 olarak ayarlanan üretim

ortamlarına eklenmiştir. Üreme ortam pH’ının benzoinin enantiyoseçimliliğini önemli

ölçüde etkilediği gözlenmiş, tepkime pH’sı değiştirilerek iki enantiyomer de yüksek

enantiyoseçimlilikle elde edilebilmiştir. En yüksek ee değeri % 33 dönüşümle S-

enantiyomer için pH: 9’da % >99 değerinde bulunmuştur. R-enantiyomer için ise % 15

dönüşümle en yüksek ee değeri pH:7’de % >99 olarak belirlenmiştir (Çizelge 6.17).

Tepkimede R. oryzae içinde bulunan oksidoredüktaz enzimleri ile benzil seçimli olarak

benzoin enantiyomerlerinden birine indirgenirken derasemizasyon ile diğer enantiyomer

ortamda baskın hale geçmiştir. İndirgenme tepkimesi süresince enzim sistemi farklı

pH’larda farklı seçimlilik göstermiştir. pH 5 ve 8 iken tepkimenin ilk dört günü

O

O

O

OH

O

OH

OH

OH

R-benzoin S-benzoinR,R-hidrobenzoin

Benzil

101

dönüşüm artarken, R-benzoin açısından enantiyoseçimlilik düşüş göstermiştir.

Dördüncü günden sonra dönüşüm artmaya devam ederken, bu kez S-benzoin açısından

enantiyoseçimlilik yükselmeye başlamıştır. Tepkime süresince konfigürasyon R-‘den S-

‘ye dönmüştür.

Çizelge 6.17 Benzilden enantiyoseçimli benzoin üretimine üreme ortam pH’ının etkisi (0.004 g benzil/10 mL, 0.1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm)

pH

5

6

7

8

9

Süre

gün

% c

% ee

Kf

% c

% ee

Kf

% c

% ee

Kf

% c

% ee

Kf

% c

% ee

Kf

1 12 47 R d.y. - - 1 >99 R 3 43 R 10 8 S

3 30 41 R 7 21 S 4 >99 R 9 27 R 16 23 S

4 35 35 R 10 30 S 8 >99 R 14 30 R 20 53 S

6 40 5 S 14 45 S 10 >99 R 21 35 S 28 77 S

8 44 40 S 17 72 S 13 >99 R 24 65 S 30 90 S

13 45 48 S 21 >99 S 15 >99 R 30 75 S 33 >99 S

d.y.:dönüşüm yok

Bu sonuçlara ışığında oksidasyon-indirgenme prosesinin gerçekleştiği varsayılmıştır.

Benzil seçimli olarak S- benzoine indirgenirken R-benzoin oksidasyon ile benzile

dönüşmüş ve zamanla ortamdaki S-benzoin miktarı artmıştır. Bu tepkimede S-benzoinin

oksidasyonunun gerçekleşmediği ya da çok yavaş olduğu varsayılmıştır. pH 6 ve 9 için

dönüşüm ve S-benzoin için enantiyoseçimlilik sürekli olarak artmıştır. Zamanla S-

benzoin için enantiyoseçimliliğin artması bu pH’larda da R-benzoinin oksidasyon ile

benzile dönüştüğüne işaret etmektedir. pH: 7’de ise tepkime süresi arttıkça dönüşüm

artarken, enantiyoseçimlilik sürekli sabit kalmıştır. Enzim sistemi bu pH’da seçimli

olarak benzili R-benzoine indirgemiştir. Hidrobenzoin oluşumu ise belirlenmemiştir.

Farklı pH’larda gerçekleştirilen rasemik benzoinin derasemizasyonu deneylerinde ras-

benzoinin benzile oksidasyonu belirlenmiştir.

102

Comasseto et al. (2003, 2004) tarafından farklı küflerle asetofenonların indirgenme

tepkimesi incelenmiş ve indirgenme sonucu oluşan enantiyomerlerden birinin

oksidasyonu ile asetofenonların derasemizasyonunun gerçekleştiği gözlemlenmiştir.

Ayrıca incelenen her küf farklı enantiyoseçimlilik göstermiştir. Demir et al. (2004)

tarafından farklı küflerle gerçekleştirdikleri bir çalışmada üreme ortam pH’sının

benzoin enantiyoseçimliliğini önemli ölçüde etkilediği ve tepkime süresince

mikroorganizma enzim sisteminin seçimli indirgenme ve izomerizasyon tepkimelerini

gerçekleştirdiği belirlenmiştir. Ayrıca tüm benzil tükenmeden önce çok az miktarda

hidrobenzoin oluştuğu analizlenmiştir.

6.3.1.2 Üreme ortamında rasemik benzoinin derasemizasyonu Üreme ortamlarının başlangıç pH’ları 5, 6, 7 ve 9’a ayarlanmış ve sporlar substrat

olarak rasemik benzoin içeren ortamlara başlangıç spor sayısı 5*105 hücre/1 mL olacak

şekilde aktarılmıştır. Tepkime süresince alınan örnekler HPLC’de analizlenmiştir. En

yüksek ee (%) değeri >99 değerinde benzoinin S-enantiyomeri için pH: 6’da elde

edilmiştir. Bu süre içerisinde benzoinin benzile dönüşümü % 49 olarak belirlenirken,

benzoinin R-enantiyomeri için en yüksek ee değeri pH:7’de % 55, benzoinin benzile

dönüşüm ise % 19 bulunmuştur. Tüm pH değerlerinde tepkime ortamı zamanla

başlangıçta rasemik olan benzoinin enantiyomerlerden bir tanesinin benzile

oksidasyonu ile derasemizasyonu gerçekleşmiştir. HPLC analizlerinde benzoinin

benzile dönüştüğü belirlenmiştir.

Tepkime pH’sının değiştirilmesi hem oksidasyon, hemde indirgenme tepkime hızını

etkilemiş ve buna bağlı olarak enantioseçimlilik farklılık göstermiştir. Bilindiği üzere

enzimatik tepkimelerde pH önemli bir rol oynamaktadır. pH değişimi substrat ve

enzimlerin iyonik durumunu değiştirdiğinden enzim aktivitesinde ve enantiyoseçimlikte

farklılıklar yaratmaktadır. Bu nedenlerden dolayı ve küf içinde oksidasyon ve

indirgenme tepkimelerini katalizleyen farklı enantiyoseçimliliğe sahip enzimlerin

aktivite gösterdikleri pH’ların aynı olmaması ile pH’a bağlı olarak ee değişmiştir.

103

Literatürde R. oryzae NRRL 395 ile üreme ortamında rasemik benzoinin

derasemizasyonu gerçekleştirilmiş ve benzer şekilde ortam pH’sının ürün

enantiyoseçimliliğini büyük ölçüde değiştirdiği belirlenmiştir. Farklı olarak benzoinin

benzile oksidasyonu gözlenmemiş ve derasemizasyon için farklı mekanizmalar

önerilmiştir Çalışmada benzoinin derasemizasyon mekanizması çok açık olmamakla

birlikte enediol oluşumu ile substratın derasemizasyonu ya da bir enantiyomerin

diğerine enantiyoseçimli bozunması şeklinde iki olası yol olabileceği belirtilmiştir

(Demir et al. 2002).

Çizelge 6.18 Üreme ortamında rasemik benzoinin derasemizasyonu ( 0.04 g benzoin/

100 mL, 1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm)

pH

5

6

7

9

Süre gün

% ee

Kf

% ee

Kf

% ee

Kf

% ee

Kf

2 16 S 22 S 12 R 11 S

4 20 S 45 S 16 R 31 S

6 41 S 53 S 22 R 52 S

10 53 S 78 S 49 R 59 S

13 64 S 83 S 52 R 65 S

15 65 S >99 S 55 R 71 S

6.3.2 Tampon ortamında benzilin indirgenmesi ile enantioseçimli benzoin üretimi R. oryzae CBS-111718 ile benzilin indirgenmesi farklı pH lardaki tampon üretim

ortamlarında gerçekleştirilmiştir. Sıvı üretim ortamında üretilen hücreler dondurarak

kurutulduktan sonra indirgenme tepkimesinde kullanılmıştır. Biyokatalizör olarak

dondurarak kurutulmuş hücrelerin kullanılması taşınması, saklanması ve oluşan tepkime

ürünlerinden ayrılması kolay olduğundan tercih edilmiştir.

104

6.3.2.1 Tampon ortam pH’sının enantioseçimli benzoin üretimine etkisi DMSO da çözüldükten sonra benzil ve dondurularak kurutulan hücreler pH’ları 5, 6, 7,

8 ve 9 olan tampon ortamlarına eklenmiştir. Zamanla alınan örnekler HPLC’de

analizlenmiş ve enantiyoseçimlilik değerleri belirlenmiştir. En yüksek ee değeri pH:9 da

benzoinin S-enantiyomeri için % 92 olarak bulunmuştur (Çizelge 6.19). İncelenen pH

değerlerinde tepkime süresi ilerledikçe derasemizasyon nedeniyle ürün konfigürasyonu

değişmiştir. Gerçekleştirilen diğer deneyler en yüksek ee değerinin elde edildiği pH: 9

tamponunda dondurarak kurutulmuş hücrelerle gerçekleştirilmiştir.

Çizelge 6.19 Benzilden enantiyoseçimli benzoin üretimine tampon ortam pH’ının etkisi (2 g LYM, 0.04 g benzoin/100 mL, 1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm)

pH

5

6

7

8

9

Süre

gün

% ee

Kf

% ee

Kf

% ee

Kf

% ee

Kf

% ee

Kf

2 25 R 50 S 38 R 2 S 50 S

4 20 R 44 S 21 R 23 S 63 S

6 53 S 10 R 24 R 38 S 86 S

8 65 S 25 R 19 S 55 S 92 S

9 77 S 56 R 16 S 66 S 91 S

6.3.2.2 Mikroorganizma üretim koşullarının enantiyoseçimlilik üzerine etkisi Farklı sürelerde üretilen hücreler dondurarak kurutulmuş ve pH:9 olan tampon ortamına

eklenerek benzilin indirgenme tepkimesi gerçekleştirilmiştir. Küf MEA katı üretim

ortamında üretildikten sonra pH’sı 7 olan tepkime öncesi üretim ortamına aktarılmış ve

1, 1.5 ve 2 gün süresince üretilmiştir. Farklı sürelerle üretilen hücreler süzülüp tamponla

yıkandıktan sonra dondurarak kurutulmuş ve pH’sı 9 olan tampon ortamında

indirgenme tepkimesinde kullanılmıştır. Üretim süresi enantiyoseçimliliği önemli

ölçüde etkilemiştir. En yüksek ee değeri % 92 olarak S-enantiyomeri için 2 gün üretilen

hücreler kullanıldığında 8. günün sonunda elde edilmiştir (Çizelge 6.20). Üretim süresi

105

1 ve 1.5 gün iken zamanla enantiyoseçimlilik S-benzoin için azalmış, R-benzoin için

artış göstermiştir. S-benzoinin seçimli oksidasyonu ile ürün R konfigürasyonunda elde

edilmiştir. 2 gün üretimde ise 8 gün süresince zaman ilerledikçe enantiyoseçimlilik S-

benzoin için artış göstermiştir. Burada benzil seçimli olarak S-benzoine indirgenirken R-

benzoin benzile okside olmuş ve zamanla enantiyoseçimlilik yükselmiştir.

Mikroorganizma üretim süresi olarak en yüksek ee’nin elde edildiği 2 gün seçilmiş ve

ileriki çalışmalarda mikroorganizma 2 gün süre ile üretildikten sonra kullanılmıştır.

Çizelge 6.20 Mikroorganizma üretim süresinin enantiyoseçimli benzoin üretimine etkisi (2 g LYM, 0.04 g benzoin/100 mL, 1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm) Üretim süresi

1 gün

1.5 gün

2 gün

Süre gün

% ee

Kf

% ee

Kf

% ee

Kf

2 45 S 67 S 50 S

4 24 S 34 S 63 S

6 10 S 7 R 86 S

8 8 R 12 R 92 S

9 11 R 20 R 91 S

Üreme ortam pH’sı 6, 7 ve 8’e ayarlanmış ve 2 gün süresince üretilen

mikroorganizmalar dondurarak kurutulduktan sonra pH’sı 9 olan tampon ortamın

eklenerek indirgenme tepkimesi gerçekleştirilmiştir. Enzim sistemi ile

enantiyoseçimlilik açısından en yüksek değer pH: 7’de elde edilmiş ve % 92 olarak S-

enantiyomeri için pH:7 de üretilen hücreler kullanıldığında 8. günün sonunda elde

edilmiştir (Çizelge 6.21).

106

Çizelge 6.21 Mikroorganizma üretim pH’ının enantiyoseçimli benzoin üretimine etkisi (2 g LYM, 0.04 g benzoin/100 mL, 1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm)

Üretim pH’sı

6

7

8

Süre gün

% ees

Kf

% ee

Kf

% ee

Kf

1 50 S 42 S 59 S

2 45 S 50 S 65 S

4 32 S 63 S 54 S

6 25 S 86 S 40 S

8 16 S 92 S 39 S

6.3.2.3 En iyi üretim koşullarında tampon pH’ının enantioseçimli benzoin

üretimine etkisi R. oryzae pH’sı 7 olan üreme ortamında 2 gün üretildikten sonra dondurularak

kurtulmuş ve indirgenme deneylerinde kullanılmıştır. 0.2 g kurutulmış hücre 5, 6, 7, 9

pH’larında hazırlanan 10 mL hacmindeki tampon ortamlarına eklenmiştir. Farklı

sürelerle örnekler alınırken 10 mL’lik ortamların tamamı uzaklaştırılarak ee ve dönüşüm

değerleri birlikte hesaplanmıştır. S-enantiyomer için en yüksek ee değeri 10.günde %

17 dönüşümle % >99 bulunmuştur. En yüksek dönüşümde elde edilen en yüksek ee

değeri 8. günde % 31 dönüşümle % 88 olarak S- enantiyomeri için elde edilmiştir

(Çizelge 6.22). pH 7 ve 9 için enantiyoseçimlilik değerleri birbirine yakın olmasına

rağmen, pH:9 iken daha kısa sürede daha yüksek dönüşüm elde edilmiştir. Bu nedenle

yapılan diğer çalışmalarda pH’sı 9 olan tampon ortamı kullanılmıştır.

Tepkimede R. oryzae içinde bulunan oksidoredüktaz enzimleri ile benzil seçimli olarak

benzoin enantiyomerlerinden birine indirgenirken derasemizasyon ile diğer enantiyomer

ortamda baskın hale geçmiştir. İndirgenme tepkimesi süresince küf enzim sistemi farklı

pH’larda farklı seçimlilik göstermiştir. pH: 5 ve 7 iken tepkimenin ilk iki günü dönüşüm

artmış, enantiyoseçimlilik ise R-enantiyomer için azalmıştır. İkinci günden sonra

107

dönüşüm artmaya devam ederken, bu kez S-benzoin açısından enantiyoseçimlilik

yükselmeye başlamıştır. Tepkime süresince konfigürasyon R-benzoinden, S-benzoine

dönmüştür. pH:6’da tam tersi bir durum söz konusu olmuştur.

Çizelge 6.22 Enantiyoseçimli benzoin üretimin tampon ortamı pH etkisi (0.2 g LYM, 0.004 g benzoin/10 mL, 0.1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm) pH

5

6

7

9

Süre

gün

% c

% ee

Kf

% c

% ee

Kf

% c

% ee

Kf

% c

% ee

Kf

1 1 51 R 6 50 S 3 25 R 6 42 S

2 6 2 S 12 58 S 7 20 R 10 63 S

4 10 25 S 15 55 S 10 17 S 22 66 S

6 19 40 S 20 3 R 14 58 S 27 75 S

8 17 50 S 24 38 R 16 77 S 31 88 S

10 18 70 S 30 69 R 17 >99 S 30 86 S

Üreme ortamında olduğu gibi elde edilen sonuçlara göre tampon ortamında da

oksidasyon-indirgenme prosesinin gerçekleştiği varsayılmıştır. Ortamda üretilen R-

benzoin oksidasyon ile benzile dönüşürken zamanla ortamdaki S-benzoin miktarı artış

göstermiştir. Bu tepkimede S-benzoinin oksidasyonunun gerçekleşmediği ya da çok

yavaş olduğu varsayılmıştır. pH: 9’da ise dönüşüm ile birlikte S-benzoin için

enantiyoseçimlilik devamlı olarak artmıştır. Bu pH’da benzil seçimli olarak S-

enantiyomerine indirgenirken, R-benzoinin benzile oksidasyonu ile zamanla

enantiyoseçimlilik S-benzoin için artmıştır. Tepkime pH’sının değiştirilmesi hem

oksidasyon, hemde indirgenme tepkime hızını ve seçimliliğini etkilemiş, buna bağlı

olarak üretilen benzoin konfigürasyonu farklılık göstermiştir. pH değişimi substrat ve

enzimlerin iyonik durumunu değiştirebileceğinden enzim aktivitesinde farklılıklar

yaratmış olması ve küf içinde oksidasyon-indirgenme tepkimelerini katalizleyen farklı

enantiyoseçimliliğe enzimlerin optimum pH’larının aynı olmaması gibi nedenlerden

ürün konfigürasyonu ve ee’de değişiklikler kaydedilmiştir.

108

Literatürde bu çalışmaya benzer şekilde farklı küflerle asetofenonların indirgenme

tepkimesi incelenmiş ve indirgenme sonucu oluşan enantiyomerlerden bir tanesinin

oksidasyonu ile asetofenonların derasemizasyonunun gerçekleştiği belirlenmiştir.

Comasseto et al. (2003, 2004).

6.3.2.4 Tampon ortamında benzoinin derasemizasyonu

R. oryzae CBS-111718’in rasemik benzoini derasemizasyonuna tampon pH’sının etkisi

incelenmiştir. Sıvı üretim ortamında pH:7’de iki gün üretimden sonra hücreler

santürfüjlenip yıkanmış ve dondurarak kurutulmuştur. Dondurarak kurutulmuş hücreler

ve DMSO da çözülen benzoin pH’ları 5, 6, 7 ve 9 olan tampon ortamlarına aktarılmıştır.

Tampon pH’sının ee’yi büyük ölçüde değiştirdiği gözlenmiştir. En yüksek ee değeri %

84 olarak pH:9’da S-enantiyomer için elde edilmiş, bu süre içerisinde benzile dönüşüm

ise % 24 olarak belirlenmiştir. R-enatiyomeri için ise en yüksek ee değeri pH:6’da % 64,

benzile dönüşüm ise % 39 olarak belirlenmiştir.

Çizelge 6.23 Tampon ortamında rasemik benzoinin derasemizasyonu (2 g LYM, 0.04 g

benzoin/100 mL, 1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm)

pH

5

6

7

9

Süre gün

% ee

Kf

% ee

Kf

% ee

Kf

% ee

Kf

2 21 S 10 R 16 S 22 S

4 28 S 25 R 23 S 45 S

5 44 S 44 R 26 S 50 S

9 61 S 49 R 35 S 69 S

12 73 S 55 R 43 S 74 S

15 72 S 64 R 54 S 84 S

109

6.3.2.5 Kosubstrat ilavesinin enantiyoseçimli benzoin üretimine etkisi Farklı karbonhidrat ve alkoller kosubstrat olarak tampon ortamlarına eklenmiştir.

Oksidoredüktaz enzimleri genellikle kofaktör gerektiren enzimlerdir. Kosubstratlar

biyoindirgenmelerde kofaktör rejenerasyonunda sıklıkla kullanıldığından dönüşüm ve

ee’yi arttırmak için tepkime ortamlarına eklenmiştir. R. oryzae pH’sı 7 olan üreme

ortamında 2 gün üretilip dondurularak kurutulduktan sonra indirgenme deneylerinde

kullanılmıştır. 0.2 g kurutulmuş hücre, kosubstrat ve DMSO da çözülen benzil pH’sı 9

olan 10 mL hacmindeki tampon ortamlarına eklenmiştir. Metanol hariç kosubstrat

ilavesi dönüşümü arttırırken, genel olarak ee’de önemli bir değişiklik yaratmamıştır. En

yüksek ee kosubstrat yok iken % 31 dönüşümle % 88 bulunmuş, en yüksek dönüşüm ise

% 75 ee ile glukoz kullanıldığı durumda % 49 olarak belirlenmiştir (Çizelge 6.24).

Erdelyi et al. (2006) yaptıkları çalışmada Debaryomyces hanseii’nin reduktaz aktivitesi

üzerine kosubstrat olarak farklı karbonhidrat ve alkollerin ee üzerine etkisini incelemiş

ve 2-propanolün en etkin kofaktör olduğunu belirlemişlerdir. İncelenen kosubstratların

ee’yi etkilemediğini gözlemişlerdir.

Çizelge 6.24 Kosubstrat ilavesinin enantiyoseçimli benzoin üretimine etkisi (0.2 g LYM, 0.004 g benzoin/10 mL, 0.1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm, 6 gün)

Süre (gün)

c (%)

ee (%)

Kf

kosubstrat yok 31 88 S

glukoz 49 75 S

gliserol 42 37 S

2-propanol 41 84 S

metanol 30 82 S

110

6.3.2.6 Ses ötesi dalgalarının enantiyoseçimli benzoin üretimine etkisi

Ses ötesi dalgaların dönüşüm ve ee üzerine etkilerini incelemek amacıyla farklı sürelerle

dondurarak kurutulmuş hücrelere ultrasonik ses dalgaları uygulanmıştır. 2.5 dk ses

dalgası 1.5 dk ara verilerek hücreler parçalanmıştır. Bu işlem bir, iki, üç ve dört kez

uygulanmıştır. Yapılan deneylerde kofaktör olarak glukoz kullanılmıştır.

Mikroorganizmanın selülozik hücre duvarını ve membranını parçalayarak kütle aktarım

kısıtlamalarını azalttığından hücreler ultrasonik ses dalgaları ile parçalandığında

tepkime daha hızlı gerçekleşmiştir. Dönüşüm ultrasaund uygulama sayısı arttıkça artmış

ancak, 4. kez uygulandığında düşmüştür (Çizelge 6.25). 10 gün sonunda ulaşılan ee ve

dönüşüm değerleri Şekil 6.9’da gösterilmiştir. Ultrasaund ısıtma ve kavitasyon

sebebiyle biyolojik hücre ve dokulara zarar verebilmekte ve protein denatürasyonuna

sebep olabilmektedir. Dönüşümdeki bu azalmaya protein denatürasyonu neden olarak

gösterilmiştir. En yüksek ee değeri % 28 dönüşümle S-enantiyomer için % 63 olarak üç

kez ultrasound uygulandığında elde edilmiştir. R-enantiyomer için ise en yüksek ee

değeri % 64 dönüşümle % 31 olarak bir kez ultrasaund uygulandığında belirlenmiştir.

Ultrasaund uygulanmadığı durumda dönüşüm daha düşük ee ise daha yüksek

bulunmuştur. 10 günlük süre içinde ee değerleri ultrasound uygulanmadığı duruma

oranla azalmıştır. Bu azalma ses ötesi dalgalarının üç boyutlu enzim yapısında

değişiklik yaratmış olması ve seçimli enzim denatürasyonuna sebep olmasına

bağlanmıştır.

111

Çizelge 6.25 Ses ötesi dalgaları uygulama sayısının ee ve dönüşüm üzerine etkisi (0.2 g LYM, 0.004 g benzoin/10 mL, 0.1 mL DMSO, 30 oC, 150 rpm) Ultrasaund uygulama sayısı

0 kez

1 kez

2 kez

3 kez

4 kez

Süre, gün

% c

% ee

Kf

% c

% ee

Kf

% c

% ee

Kf

% c

% ee

Kf

% c

% ee

Kf

2 18 38 S 21 44 S 24 53 S 28 63 S 7 21 S

4 34 57 S 38 30 S 43 35 S 46 44 S 11 30 S

6 40 63 S 44 14 S 49 22 S 51 29 S 23 8 S

8 43 71 S 51 2 S 58 11 S 66 16 S 30 6 S

10 49 75 S 64 31 R 67 19 R 70 17 R 42 18 R

0

20

40

60

80

cee

0 kez 1 kez 2 kez 3 kez 4 kez

Şekil 6.10 Ses ötesi dalgaların ee ve dönüşüm üzerin etkisi

112

7. TARTIŞMA VE SONUÇLAR 7.1 Sonuçlar � İlk olarak BAL enzim kaynağı Pseudomonas fluorescens Biovar I mikroorganizması

kullanılarak enantiyoseçimli benzoin üretimi incelenmiştir. İnceleme sonucunda

biyokatalizör olarak P. fluorescens kullanıldığında enantiyoseçimli benzoin

üretilememiştir. Farklı mikroorganizma üretim ortamı kullanılması benzoin üretimini

sağlamamıştır.

� İkinci olarak P. fluorescens rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu incelenmiştir.

Biyokatalizör miktarı, çözücü, açil verici, moleküler elek gibi ortam koşullarının

benzoinin ee’si üzerine etkileri araştırılmıştır.

Mikroorganizma miktarının etkisi incelendiğinde 25 gün sonunda en iyi ee değeri

benzoinin S- formu için % 20 olarak 0.05 g başlangıç kurutulmuş hücre miktarında

gözlenmiş ve % 45 dönüşüm değerine ulaşılmıştır. Farklı çözücüler kullanıldığında en

yüksek ee değeri % 48 dönüşümle benzoinin S -formu için % 21 olarak n-hekzan

çözücü olarak kullanıldığında elde edilmiştir.

Başlangıç substrat miktarının değiştirilmesi ee üzerinde önemli bir değişiklik

yaratmamıştır. Başlangıç substrat miktarı 0.1 g iken en yüksek ee değeri %39

dönüşümle benzoinin S- formu için %20 olarak bulunmuştur. Açil verici cinsinin etkisi

incelendiğinde 25 gün devam ettirilen tepkime sonunda incelenen iki açil vericiden

vinilasetat ile %20 ee (S) değerine ulaşılmıştır. Açil vericinin değiştirilmesi

enantiyoseçimliliği etkilememiştir.

Sıcaklık etkisi araştırıldığında 25 gün sonunda en yükse ee değeri 50 oC sıcaklıkta %21

ee (S) olarak belirlenmiş. İncelenen farklı karıştırma hızlarında elde edilen ee değerleri

birbirine çok yakın bulunmuş ve yüksek seçimlilik elde edilememiştir. Moleküler elek

miktarının etkisi incelendiğinde tepkime ortamında moleküler elek yok iken rasemik

113

substratın dönüşümü çok yavaş olmuştur. Moleküler elek miktarı arttıkça dönüşüm

artmış, benzoin enantiyoseçimlilik önemli ölçüde etkilenmemiştir.

� Farklı küfler kullanılarak ortam koşullarından çözücü ve açil verici cinsinin rasemik

benzoinin kinetik rezolüsyonuna etkisi incelendiğinde ee önemli ölçüde

etkilenmemiştir. En yüksek ee değeri açil verici olarak vinil esetat, çözücü olarak ise

THF kullanıldığında R-benzoin için % 16 olarak bulunmuştur. En yüksek dönüşüm

değerine (% 45) vinil butirat kullanıldığında ulaşılmıştır. Farklı mikroorganizma ve saf

lipaz enzimlerinin lipaz kaynağı olarak kullanılması rasemik benzoinin

enantiyoseçimliliği üzerine etki etmemiş, yalnızca dönüşümü önemli ölçüde

değiştirmiştir.

� R. oryzae CBS-111718 küfü kullanılarak rasemik benzoinin derasemizasyonu

incelenmiş, üreme ve tampon ortam pH’larının etkisi belirlenmiştir. Sonuç olarak en

yüksek ee (%) değeri >99 olarak benzoinin S-enantiyomeri için pH: 6’da elde edilmiştir.

Bu süre içerisinde benzoinin benzile dönüşümü % 49 olarak belirlenirken, benzoinin R-

enatiyomeri için ise en yüksek ee değeri pH:7’de % 55, benzoinin benzile dönüşüm ise

% 19 bulunmuştur. Derasemizasyon tampon ortamında gerçekleştirildiğinde en yüksek

ee değeri % 84 olarak pH:9’da S-enantiyomer için elde edilmiş, bu süre içerisinde

benzile dönüşüm ise % 24 olarak belirlenmiştir.

� R. oryzae CBS-111718 küfü kullanılarak benzilin indirgenmesi ile enantiyoseçimli

benzoin eldesine üretim ortam pH’sı, tampon pH’sı, mikrorganizma üretim süresi ve

pH’sı, kosubstrat ilavesi ve ultrasonik ses dalgalarının etkileri incelenmiştir. Üreme

ortam pH’sının benzoinin enantiyoseçimliliğini önemli ölçüde etkilediği gözlenmiştir.

Tepkime pH’sı değiştirilerek iki enantiyomerde yüksek enantiyoseçimlilikle elde

edilebilmiştir. En yüksek ee değeri % 33 dönüşümle S-enantiyomer için pH: 9’da % >99

değerinde bulunmuştur. R-enantiyomer için ise % 15 dönüşümle en yüksek ee değeri

pH:7’de % >99 bulunmuştur.

114

Tampon ortamında en yüksek ee değerine pH:9 da benzoinin S-enantiyomeri için

ulaşılmıştır. Mikroorganizma üretim koşullarının enantiyoseçimlilik üzerine etkisi

incelendiğinde en yüksek ee değeri 2 gün üretilen hücreler ile pH:7’de elde edilmiştir.

ee değeri S- benzoin için % 92 olarak belirlenmiştir.

Enantiyoseçimlilik açısından en iyi mikroorganizma üretim koşullarında tampon

pH’sının ee ve dönüşüme etkisi araştırılmıştır. S-benzoin için en yüksek ee değeri % 17

dönüşümle % >99 bulunmuştur. En yüksek dönüşümde elde edilen en yüksek ee değeri

8 gün sonunda % 31 dönüşümle % 88 olarak S- benzoin için elde edilmiştir.

Metanol hariç kosubstrat ilavesi dönüşümü arttırırken, genel olarak ee’de önemli bir

değişiklik yaratmamıştır. En yüksek ee kosubstrat yok iken % 31 dönüşümle % 88

bulunmuş, en yüksek dönüşüm ise % 75 ee ile glukoz kullanıldığı durumda % 49 olarak

belirlenmiştir

Ultrasonik ses dalgalarının enantiyoseçimli benzoin üretimine etkisi araştırıldığında

hücreler ultrasonik ses dalgalarıyla parçalandığında tepkime daha hızlı gerçekleşmiştir.

Dönüşüm ultrasaund uygulama sayısı arttıkça artmış, fakat 4. kez uygulandığında

protein denatürasyonu nedeniyle dönüşüm düşmüştür. En yüksek ee değerine 2. gün

sonunda S-enantiyomer için üç kez ultrasaund uygulandığında ulaşılmış ve % 63 ee, %

28 dönüşüm elde edilmiştir. R-enantiyomer için ise en yüksek ee % 31 olarak bir kez

ultrasound uygulandığında 10. gün sonunda ulaşılmış, dönüşüm % 64 hesaplanmıştır.

7.2 Değerlendirme

Pseudomanas fluorescens Biovar I ile benzaldehitten C-C bağı oluşum tepkimesi ile

benzaldehitten enantiyoseçimli benzoin üretimi sağlanamamıştır. İncelenen üretim

ortamlarında mikroorganizma tarafından BAL enzimi üretimi sağlanamamıştır. BAL

enzimi bu tepkimeyi çok yüksek verim ve ee ile katalizlemesine rağmen, bu enzimin

elde edildiği mikroorganizma ile benzoin üretimi gerçekleşmemiştir. Literatürde bu

mikroorganizma ile α-hidroksi keton üretimine ilişkin çalışma yer almamaktadır.

115

Mikrobiyal lipaz ve saf lipaz enzimleri ile rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu

gerçekleştirildiğinde maksimum dönüşüme (% 50) ulaşılmasına rağmen, yüksek

enantiyoseçimlilik elde edilememiştir. Lipazlar benzoin enantiyomerlerinin ikisinide

asetatına dönüştürmüş, benzoin enantiyomerlerini ayırt edememiştir. Mikrobiyal lipaz

ve izole lipazların bezoin kinetik rezolüsyonu için uygun biyokatalizörler olmadığı

sonucuna varılmıştır.

Rhizopus oryzae CBS-111718 biyokatalizörlüğünde gerçekleştirilen indirgenme ve

derasemizasyon tepkimelerinde iki enantiyomeride yüksek enantiyoseçimlilikle

üretilebilmiş, fakat dönüşüm yüksek değerlede elde edilememiştir. Tepkime süresi de

uzun bulunmuştur. Çalışmanın devamında dönüşümü yükseltmek ve tepkime süresini

kısaltmak için başlangıç biyokatalizör derişimi, sıcaklık, karıştırma hızı gibi tepkime

parmetrelerinin etkisi incelenebilir. Benzoin suda az çözünen bir substrat olduğundan

dolayı çözücü türü ve çözücü miktarınında etkisi incelenmelidir. Tepkime çift fazlı

sistemdede gerçekleştirilebilir. Bu mikroorganizma içinde oksidoredüktaz enzimleri ile

indirgenme ve oksidasyon olmak üzere iki farklı tepkime gerçekleştirmektedir.

Oksidasyon tepkimesinin gerçekleşmesi indirgenme verimini düşürmektedir. Bu

sebeple geniş bir mikroorganizma taraması yapıldıktan sonra redüktaz aktivitesi ve

enantiyoseçimliliği en yüksek mikroorganizma seçilerek tepkime için optimum koşullar

belirlenmelidir. Mikroorganizma taramasında belirlenen en etkili birkaç

biyokatalizörlede daha geniş bir substrat aralığının indirgenme verimi ve

enantiyoseçimliliği araştırılabilir.

116

KAYNAKLAR

Adam, W., Diaz, M.T., Fell, R.T. and Saha-Möller, R.C. 1996. Kinetic resolution of

racemic α-hydroxy ketones by lipase-catalyzed irreversible transesterification, Tedrahedron: Asymmetry, 7, 2207-2210.

Aoyagi, Y., Agata, N., Shibata, N., Hariguchi, M. and Williams, R.M. 2000. Lipase

TL®-mediated kinetic resolution of benzoin:facile synthesis of (2R,2S)-erythro-2amino-1,2-diphenylethanol, Tetrahedron Letters, 41, 10159, 10162.

Bora, U., Saikia, C.J., Cheita, A., Mishra, A.K., Kumar, B.S.D. and Baoruah, R.C.

2003. Resolution of reacemic 1-arylethyl acetates by Pseudomonas fluorescens in the presence of a surfactant, Tetrahedron letters, 44, 9099-9102.

Chadha, A. and Baskar, B. 2002. Biocatalytic deracemisation of α-hydroxy esters: high

yield preparation of (S)-ethyl 2-hyroxy-4-phenylbutanoate from the racemate, Tetrahedron: Asymmetry, 13, 1461-1464.

Comasseto, J.V., Omori, A.T., Andrade, L.H. and Porto, A.L.M. 2003. Bioreduction of

fluoroacetophenones by fungi Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae, Tetrahedron: Asymmetry, 14, 711-715.

Comasseto, J.V., Andrade, L.H., Omori, A.T., Assis, L. F. and Porto, A.L.M. 2004.

Deracemization of aryl ethanols and reduction of acetophenones by whole cells of Aspergillus terreus CCT 4083, A. Terreus CCT 3320 and Rhizopus oryzae CCT 4964, J. Mol. Cat. B: Enzymatic,29, 55-61.

Damle, S.V., Patil, P.N. and Salunkhe, M.M. 2000. Bitoransformation with Rhizopus

arrhizus and Geotrichum candidum for the preparation of (S)-atenolol and (S)-propanolol, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 8, 2067-2070.

Demir, A.S., Hamamci, H., Tanyeli, C., Akhmedov, I.M. ve Doğanel, F. 1998.

Synthesis and Rhizopus oryzae mediated enentioselective hydrolysis of racemic α-acetoxy aryl alkyl ketones, Tetrahedron: Letters, 9,1673- 1677.

Demir, A.S., Dünwald T., Iding, H., Pohl, M. and Müller, M. 1999. Asymmetric

benzoin reaction catalyzed by benzoylformate decarboxylase, Tetrahedron: Asymmetry, 10, 4769- 4774.

Demir, A.S., Pohl, M., Janzen, E. and Müller, M. 2001. Enantioselective synthesis of α-

hydroxy ketones through cleavage and formation of acyloin linkage. Enzymatic kinetic resolution via C-C bond clevage, J.Chem.Soc., Perkin Trans.1, 344, 633-635.

Demir, A.S., Şeşenoğlu, Ö., Eren, E., Hosrik, B., Pohl, M., Janzen, E.,Kolter, D.,

Feldmann, R., Dünkelmann, P. and Müller, M. 2002. Enantioselevtive synthesis

117

of α-hydroxy ketones via benzaldeyde lyase catalyzed C-C bond formation reaction, Adv.Synth.Catal, 344, 96-103.

Demir, A.S., Hamamci, H., Şeşenoğlu, O., Neslihanoğlu, R., Asikoğlu, B. ve

Capanoğlu, D. 2002. Fungal deracemization of benzoin, Tetrahedron: Letters, 43.

Demir, A.S., Hamamci, H., Peruze, A., Duygu, N., Igdir, A.C. ve Capanoğlu, D. 2004.

Fungi mediated conversion of benzil to benzoin and hydrobenzoin, Tetrahedron: Asymmetry, 15, 2579-2582.

Ema, T., Maeno, S., Takaya, Y., Sakai, T. and Utaka, M. 1996. Kinetic resolution of

racemic 2-substituted 3-cyclopenten-1-ols by lipase-catalyzed transesterifications: a rational strategy to improve enantioselectivity, J. Org. Chem., 61, 8610-8616.

Erdelyi, B., Szabo, A. and Seres, G. 2006. Stereoselective production of (S)-1-arylalkil

and 1-aryethanols by freshly harvested and lyophilized yeast cells, Tetrahedron: Asymmetry, 17, 268-274.

Faber, K. 2000. Biotransformation in organic chemistry, Sprinder-Verlag, Germany. Ghanem, A., Aboul-Enein and H.Y. 2004. Lipase-mediated chiral resolution of

racemates in organic solvents, 15, 3331-3351. Gondolfi, R., Gualandris, R., Zanchi, C. and Molinari, F. 2001. Resolution of (RS)-2-

phenylpropanoic asit by enantioselective esterification with dry microbial cells in organic solvents, Tetrahedron: Asymmetry, 12, 501-504.

Gonzales, B. and Vicuna, R. 1989. Benzaldehyde Lyase, a novel thiamine PPi-requiring

enzyme, from Pseudomonas fluorescens Biovar I, Journal of bacteriology, 171(5), 2401-2405.

Haefner, F., Norin, T. and Hult, K. 1998. Molecular modelling of the enantioselectivity

in lipase-catalyzed transesterification reactions, Biophysical journal, 74, 1251-1262.

Hildebrand, F., Kuhl, S., Pohl, M.,Vasic-Racki, D., Muller, M., Wandrey, C. and Lütz,

S. 2007. The production of (R)-2-hydroxy-1-phenyl-propan-1-one derivatives by benzaldehyde lyase from pseudomonas fluorescens in a continuously operated membrane reactor, Biotech. and Bioeng., 96, 836-843.

Iding, H., Dünwald T., Gareiner, L., Liese,A., Müller, M., Siegert, P., Demir, A.S. and

Pohl, M. 2000. Benzoylformate decarboxylase from Pseudomonas putida as stable catalyst for the synthesis of chiral of 2-hydroxy ketones, Chem. Eur.J., 6, 1483-1495.

Joly, S., and Nair, M.S. 2003. Studies on the enzymatic kinetic resolution of β-hydroxy ketones, J. mol. cat. B: Enzymatic, 22, 152-160.

118

Kato, D., Miyamato, K. and Ohta H. 2004. Microbial deracemization of α-substituted carboxylic acids: control of the reaction path, Tetrahedron: Asymmetry, 15, 2965, 2973.

Kordikowski, A.,York, P. and Latham, D. 1999. Resolution of ephedrine insupercritical

CO2: a novel technique for seperation of chiral drugs, Journal of Pharmaceutical Sciences, 88, 786-791.

Lunardi, I., Conceiçao, G.J.A., Moran, P.J.S. and Rodrigues, J.A.R. 2005. Highly

stereoselective preparation of (3R,4S)-3,4-chromanediol by deracemization of (±)-3-hydroxy-4-chromannone by Trichosporon cutaneum, Tetrahedron: Asymmetry, 16, 2515-2519.

Maier, M.N., Franco,P., Lindner, W. 2001. Journal of Chromotography A, 906:3-33. Mandwal, A.K., Tripathi, C.K.M., Trivedi, P.D., Joshi, A.K., Agarwal, S.C. and Bihari,

V. 2004. Production of L-phenyl carbinol by immobilized cells of Saccharomyces cerevisiae, Biotechnology Letters, 26, 217-221.

Martinez, F., Campo, C.D., Sinisterra, J.V. and Llama, E.F., 2000. Preparation of

halohydrin β-blocker precursor using yeast-catalysed reduction, Tetrahedron: Asymmetry, 11, 4651-4660.

Martinez Logos, F., Carballeira, J.D., Bermudez, J.L., Alvarez, E. and Sinisterra, J.V.

2004. Highly stereoselective reduction of haloketones using three new yeasts: application to the synthesis of (S)-adrenerjic β-blockers related to propanolol, Tetrahedron: Asymmetry, 15, 763-770.

Martinez-Lagos, F. and Sinisterra, J.V. 2005. Enantioselective production of halohydrin

precursor of propranolol catalysed by immobilized yeasts, J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 36, 1-7.

Molinari, F., Mantegazza, L., Villa, R. and Aragozzini, F. 1998. Resolutipn of 2-

alkonols by microbially-catalyzed esterification, Journal of fermentation and bioengineering, 86, 62-64.

Molinari, F., Gandolfi, R., Villa, R. and Occhiato, E. 1999. Lyophilized yeasts: easy-to-

handle biocatalysts for stereoselective reduction of ketones, Tetrahedron: Asymmetry, 10, 3515-3520.

Mosbacher , T.G.,Mueller, M., Schulz, G.E. 2005. Structure and mechanism of the ThDP-dependent benzaldehyde lyase from Pseudomonas fluorescens, FEBS J., 272, 6067-76.

Mustaranta, A. 1992. Use of lipases in the resolution of racemic ibuprofen, Appl. Microbiol Biotechnol, 38, 61-66.

119

Mohmoodi, N.O. and Mohammadi, H.G. 2003. Enantio-, regio-, and chemoselective reduction of aromatic α-diketones by baker’s yeast, Monatshefte für Chemie,134, 1283-1288.

Nakamura, K., Kondo,S-İ., Kawai. Y., Hida,., K, Kitano,K., Ohno, A. 1996. Enantio- and regioselective reduction of α-diketones by baker’s yeast, Tetrahedron: Asymmetry, 7, 409-412.

Nakamura, K., Yamanaka, R., Matsuda, T. and Harada, T. 2003. Recent developments

in asymmetric reduction of ketones with biocatalysts, Tetrahedron: Asymmetry, 14, 1-23.

Nest, B.M., Voss, C.V., Bodlenner, A., Ellmer-Schaumberger, Kroutill, W. and Faber,

K. 2007. Biocatalytic racemization of sec-alcohols and hydroxyketones using lyophilized microbial cells, Appl Microbiol Biotechnol, 76, 1001-1008.

Padhi, S. K., Pandian, N. G. and Cahadga, A. 2004. Microbial deracemisation of

aromatic β-hydroxy acid esters, J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 29, 25-29.

Rosche, B., Sandford, V., Breuer, M., Hauer, B. and Rogers, P. 2001, Biotransformation of benzaldehyde in to (R)-phenylacetylcarbinol by filamentous fungi or their extracts, Appl Microbiol Biotechnol, 57, 309-315.

Schrerier, P. 1997. Enzymes and flavour technology, In advances in biochemical

engineering/ biotechnology, 55, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 51-72. Secundo, F., Riva, S. and Carrea, G. 1992. Effects of medium and of reactions

conditions on the enantioselectivity of lipases in organic solvents and possible reationates, Tetrahedron: Asymmetry, 3, 267-280.

Sheldon, R.A. 1993. Chirotechnology, Marcel Dekker, New York. Shinnar, R. and Church J.C. 1960. Predicting particle size in agitated dispersions,

Industrial and engineering chemistry, 52, 253-256.

Snell, D. and Colby, J. 1999. Enantioselective hydrolysis of racemic ibuprofen amide to S-(+)-ibuprofen by Rhodococcus AJ270, Enzyme and microbial technology, 24, 160-163.

Shin, H.S. and Rogers, P.L. 1995. Applied microbiology and biotechnology, 44, 7-14.

Straathof, A. J., Panke, S. and Schmid, A. 2002. The production of fine chemicals by

biotransformations, Current opinion in biotechnology, 13, 548–556.

120

Strauss, U.T., Felfer, U. and Faber, K. 1999. Biocatalytic transformation of racemates in to chiral bulding blocks in % 100 chemical yield and, % 100 enantiomeric excess, Tetrahedron: Asymmetry 10, 107-117.

Tripathi, C.M., Agarwal, S.C. and Basu, S.K. 1997. Journal of Fermentation and Bioengineering, 84, 487.

Tüzün, C. 1996. Organik Kimya, 7. Baskı, Palme Yayın Dağıtım, Ankara. Wang, M-X and Feng, G-Q. 2000. Enantioselective synthesis of chiral cyclopropane

compounds through microbial transformations of trans- 2-arylcyclopropanecarbonitriles, Tetrahedron Letters, 41, 6501-6505.

Wang, M-X. and Zhao, S-M. 2002. Synthesis of enantiomerically enriched (S)-(+)-2-

aryl-4-pentenoic acids and (R)-(-)-2aryl-4-pentenamides via microbial hydrolysis of nitriles, a chemoenzymatic approach to stereoisomers of α,γ-disubstituted γ-butyrolactones, Tetrahedron: Asymmetry, 13, 1695-1702.

Ward, O.P. and Singh, A. 2000. Enzymatic asymmetric synthesis by decarboxylases,

Curr. Opin Biotechnol,11, 520-526. Wilcocks, R. and Ward, O.P. 1991. Factors affecting 2-hydroxypropiophenone

formation by benzoylformate decarboxylase from Pseudomonas putida, Biotech. Bioeng., 39,1058-1063.

Williams, R.C., Riley, C.M., Sigvardson, K.W., Fortunak, J., Ma, P., Nicolas, E.C., Unger, S.E., Krahn, D.F. and Bremmer, S.L. 1998. Pharmaceutical development and specification of stereoisomers, Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,17, 917-924.

Wu, J.Y and Liang, T.L. 1999. Enhancement of enantioselectivity by altering alcohol

concentration for esterification in supercritical CO2, J. Chem. Eng., 32, 338-340.

121

EKLER

Benzil+ rasemik benzoin

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40

mAU

0

500

1000

mAU

0

500

1000

15.845

19.513

24.463

UV-254nm

Retention Time

İsim Kalma süresi

Benzil 15.845

S-Benzoin 19.513

R-Benzoin 24.463

122

Üreme ortamı

pH:9

13. gün

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40

mAU

0

500

1000

1500

mAU

0

500

1000

15004.365

15.598

20.663

UV-254nm

Retention Time

İsim Kalma süresi

Benzil 15.598

S-Benzoin 20.663

c: % 33

ee (S): % >99

123

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : Çiğdem BABAARSLAN

Doğum Yeri : Yozgat

Doğum Tarihi : 01.04.1976

Medeni Hali : Bekar

Yabancı Dili : İngilizce

Eğitim Durumu

Lise : Ankara Anıttepe Lisesi (1993)

Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Mühendisliği Bölümü (1998)

Y. Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği

Anabilim Dalı (2001)

Doktora : Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği

Anabilim Dalı (2001- 2008)

Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl

Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi : 1998-2006

Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkez Başkanlığı : 2006-devam ediyor

Yayınları (SCI ve diğer)

Mehmetoglu, U., Bayraktar, E. and Babaarslan, Ç. 2007. Production of enantiomerically

pure pharmaceutical compounds using biocatalyst”, Enzyme mixtures and complex biosynthesis, Landes Biosicience.

Babaarslan, Ç., Abuhamed, T., Tekeli, A., Mehmetoğlu, T. and Mehmetoğlu, Ü. 2003

Biodegradation of BTEX compounds by a mixed culture obtained from petroleum formation water, Energy Sources, 7,733.

Babaarslan, Ç., Tekeli, A., Abuhamed, T., Bayraktar,E., Mehmetoğlu, T., Ataoğlu, F., Mehmetoğlu, Ü., 2001. Petrol formasyon suyu mikroorganizmalarının BTEX'li ortamda çoğalması, Biyoteknolojisi Dergisi, 2,15.

Babaarslan C., Mehmetoglu U., Demir AS. 2005. Kinetic resolution of racemic benzoin with different lyophilized microorganisms, Journal of biotechnology 118, S49-S49 Suppl. 1 AUG.

124

Babaarslan, Ç., Mehmetoğlu, Ü., Demir, A.S. 2005. Kinetic resolution of racemic benzoin with different lyophilized microorganisms, 12th European Congress on Biotechnology, s.21, Copenhagen, Denmark.

Babaarslan, Ç., Mehmetoğlu, Ü. And Demir, A.S. 2004. Kinetic resolution of racemic

benzoin with lyophilized pseudomonas fluorescens , P056, s.117, Biocat2004, Hamburg, Almanya.

Babaarslan, Ç., Kösali, Y.K. and Mehmetoğlu, Ü. 2004. Resolution of (RS)-benzoin by

enantioselective transesterification with lipase, P028, s.86, Biocat2004, Hamburg, Almanya.

Babaarslan, Ç., Abuhamed, T., Bayraktar, E., Mehmetoğlu,Ü. and Mehmetoğlu,T. 2001

The effect of the microorganism concentration on the biodegradation of BTEX by a mixed culture”, 2nd Eastern Mediterranean Chemical Engineering Conference, s.62, Ankara, Türkiye.

Babaarslan, Ç., Abuhamed, T., Bayraktar, E., Mehmetoğlu, Ü. and Mehmetoğlu, T.

2000. Biodegradation of BTEXs by microorganisms isolated from formation water, 11 th International Biotechnology and Exhibition, s. 415, Berlin, Almanya.

Babaarslan, Ç., Kösali, Y.K. ve Mehmetoğlu, Ü. 2004. Lipaz katalizli transesterleşme tepkimesi ile optikçe saf benzoin üretimi, RM08, UKMK 6, İzmir.

Uçar, B., Babaarslan, Ç. ve Mehmetoğlu, Ü., 2004. Biyotransformasyonla enantiyomerik saflıkta benzoin üretimine etki eden parametrelerin incelenmesi, ÖP01, UKMK 6, İzmir.

Babaarslan, Ç., Bedir, M. ve Mehmetoğlu Ü. 2003. BTEX Bileşiklerinin Pseudomonas putida F1 mikroorganizmasının çoğalma hızı üzerine inhibisyon etkisi,13. Biyoteknoloji Kongresi Poster bildirileri kitabı, Çanakkale.

Babaarslan, Ç., Abuhamed, T., Tekeli, A., Bayraktar, E., Mehmetoğlu, Ü. ve

Mehmetoğlu, T. 2001. Karışık kültürle BTEX bileşiklerinin biyolojik bozunması ve substrat etkileşimleri, XII. Biyoteknoloji Kongresi, s.273, Balıkesir.

Babaarslan, Ç., Abuhamed, T. Bayraktar, E., Mehmetoğlu, Ü. ve Mehmetoğlu, T.,

2000. UKMK-IV. Dördüncü Ulusal Kimya Mühendisliği Kongresi, CA01, İstanbul.