ANÁLISIS ESTRUCTURAL, EVOLUTIVO Y FUNCIONAL DE … · Isopropil-β-D-tio-galactopiranósido ......
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UNIVERSIDAD DE CHILE Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas ANÁLISIS ESTRUCTURAL, EVOLUTIVO Y FUNCIONAL DE LA PIRIDOXAL QUINASA HUMANA (hPLK) Memoria para optar al título profesional de BIOQUÍMICO FREDDY RODRIGO NAVARRO GAJARDO Santiago de Chile, 2010 Directora de la memoria Dra. Victoria Guixé Leguía Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular Departamento de Biología Facultad de Ciencias Universidad de Chile Co-Director de la memoria Dr. Ricardo Cabrera Paucar Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular Departamento de Biología Facultad de Ciencias Universidad de Chile Profesor Patrocinante Dra. Daniela Seelenfreund Hirsch Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Universidad de Chile
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UNIVERSIDAD DE CHILE Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
ANÁLISIS ESTRUCTURAL, EVOLUTIVO Y FUNCIONAL
DE LA PIRIDOXAL QUINASA HUMANA (hPLK)
Memoria para optar al título profesional de BIOQUÍMICO
FREDDY RODRIGO NAVARRO GAJARDO
Santiago de Chile, 2010
Directora de la memoria Dra. Victoria Guixé Leguía
Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular Departamento de Biología
Facultad de Ciencias Universidad de Chile
Co-Director de la memoria Dr. Ricardo Cabrera Paucar
Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular Departamento de Biología
Facultad de Ciencias Universidad de Chile
Profesor Patrocinante Dra. Daniela Seelenfreund Hirsch
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Universidad de Chile
i
AGRADECIMIENTOS
A todos quienes me apoyaron y han confiado en que este proyecto lo haya sacado adelante.
En especial a mis padres, Segundo Navarro e Irsia Gajardo, y hermana, Pamela Navarro,
que siempre ofrecieron su ayuda en la medida de lo posible y a mis directores de memoria, Dra.
Victoria Guixé y Dr. Ricardo Cabrera, como a mi profesora patrocinante, Dra. Daniela
Seelenfreund, por entender y apoyar mi proceso formativo como persona.
Agrego también a quienes siempre me dieron palabras de aliento y me instaron a seguir,
sean ellos amigos de antaño, o a personas que he conocido recientemente, entre los que se
encuentran mis compañeros de laboratorio; varios de los cuales me han dado consejos que
trascienden las ciencias.
Agradezco también a personas ajenas al ámbito de mi tesis que se atrevieron a leer y ofrecer
correcciones en mi memoria, como lo son mis primos Miguel y Octavio.
ii
ABREVIATURAS
APS
BSA
DEAE
DTT
F6P
HEPES
HMPPK
hPLK
IPTG
LB
Me+2
Me+2
-ATP
MES
NADH
PdxH
PIPES
PL
PLK
PLP
PM
PMP
PN
PNP
SDS
TEMED
THZK
Persulfato de amonio
Seroalbúmina de bovino
Dietilaminoetil
Ditiotreitol
Fructosa 6-fosfato
Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etilsulfónico
4-amino-5-hidroximetil-2-metilpirimidina fosfato quinasa
Piridoxal quinasa humana
Isopropil-β-D-tio-galactopiranósido
Luria-Bertani
Metales divalentes
Complejo metal divalente–ATP
Ácido 2-(N-morfolino) etilsulfónico
Dinucleótido de β–nicotinamida y adenina reducida
Piridoxina 5'-fosfato oxidasa
Ácido piperacina-N,N'-bis etilsulfónico
Piridoxal
Piridoxal quinasa
Piridoxal-5’-fosfato
Piridoxamina
Piridoxamina-5'-fosfato
Piridoxina
Piridoxina-5'-fosfato
Dodecil sulfato de sodio
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina
4-metil-5-β-hidroxi-etiltiazol quinasa
iii
INDICE GENERAL
página
Agradecimientos
Abreviaturas
Índice General
Índice de Materias
Índice de Tablas
Índice de Figuras
Resumen
Abstract
i
ii
iii
iv
vi
vii
viii
ix
iv
INDICE DE MATERIAS
página
I
II
2.1
2.2
2.3
III
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
3.11
3.12
3.13
3.14
3.15
3.16
3.17
3.18
3.19
3.20
IV
4.1
4.1.1
4.1.2
4.1.3
Introducción
Hipótesis de trabajo y Objetivos
Hipótesis
Objetivos generales
Objetivos específicos
Materiales y Métodos
Materiales
Alineamiento Estructural
Alineamiento de secuencias
Construcción de árbol filogenético
Preparación de células competentes
Transformación de células competentes
Ensayo de expresión de hPLK en la transformante BL21-p24a-hPLK
Crecimiento e inducción de hPLK en la transformante BL21-p24a-hPLK
Purificación de hPLK
Estimación del coeficiente de extinción molar de PLP
Determinación de las condiciones para la medición de la actividad enzimática de
hPLK
Mezcla de reacción para la medición de actividad enzimática
Efecto de distintos Me+2 en la actividad de hPLK
Curva de pH para hPLK
Cálculo de las concentraciones de las especies presentes en solución
Estimación de parámetros cinéticos de hPLK
Determinación del efecto de las especies presentes sobre la actividad de hPLK
Ensayos de inhibición por Zn+2 libre sobre la actividad de hPLK
Fluorescencia intrínseca de hPLK
Análisis de datos
Resultados
Análisis bioinformático
Alineamiento estructural
Alineamiento múltiple de secuencias
Construcción de árbol filogenético
1
7
7
7
7
8
8
9
9
10
11
11
12
12
13
13
14
14
14
15
15
17
18
19
20
21
22
22
22
24
25
v
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.2.6
4.2.7
4.2.8
4.2.9
4.2.10
V
5.1
5.2
5.3
5.4
VI
VII
Análisis cinético
Ensayo de expresión en la transformante BL21-p24a-hPLK
Purificación de hPLK de la transformante BL21-p24a-hPLK
Estimación del coeficiente de extinción molar de PLP
Estandarización de condiciones para la medición de actividad enzimática
Efecto de distintos Me+2 en la actividad de hPLK
Curva de pH
Determinación de los parámetros cinéticos de hPLK
Determinación del efecto de las especies presentes sobre la actividad de hPLK
Ensayos de inhibición
Fluorescencia intrínseca de hPLK
Discusión
Análisis evolutivo de hPLK
Caracterización general de hPLK
Determinación de parámetros cinéticos de hPLK
Inhibición sobre hPLK
Conclusiones
Referencias
29
29
29
31
31
32
33
34
36
38
41
43
43
46
48
50
53
54
vi
INDICE DE TABLAS
página
Tabla 1
Tabla 2
Tabla 3
Tabla 4
Tabla 5
Tabla 6
Tabla 7
Tabla 8
Tabla 9
Tabla 10
Tabla 11
Constantes de asociación de complejos formados por Zn+2 y ATP-4
Reacciones al equilibrio para la formación de los complejos de Zn+2, DTT- y
hPLK
Estructuras encontradas en la base de datos de PDB
Cantidad de posiciones conservadas en el alineamiento múltiple de secuencias,
en relación a los clados encontrados
Purificación de hPLK desde la transformante BL21- p24a-hPLK
Parámetros cinéticos de hPLK
Parámetros cinéticos dependientes de la variación de Zn+2 libre
Constantes obtenidas a partir del ajuste de los datos experimentales a los modelos
de inhibición por Zn+2 libre
Constantes de equilibrio para las reacciones descritas en la Tabla 2
Recopilación de parámetros cinéticos de piridoxal quinasa de distintas fuentes
Datos de inhibición provocada por zinc en distintas proteínas
15
21
22
28
30
35
39
41
42
49
51
vii
INDICE DE FIGURAS
página
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
Figura 11
Figura 12
Figura 13
Figura 14
Figura 15
Figura 16
Figura 17
Figura 18
Figura 19
Figura 20
Figura 21
Figura 22
Vía de incorporación de PLP en E. coli
Diagrama topológico de un monómero de hPLK
Elementos de estructura secundaria comunes a los miembros de la
superfamilia de la riboquinasa
Diagramas de topología de representantes de la superfamilia de la riboquinasa
Código del programa ejecutable, especies.sci
Esquemas de modelos de inhibición enzimática
Alineamiento estructural de las PLK
Alineamiento múltiple de secuencias proteicas
Árbol filogenético de las PLK
Esquema resumen del análisis bioinformático
Inducción de hPLK con IPTG desde la transformante BL21-p24a-hPLK
Purificación de hPLK
Estimación del coeficiente de extinción molar de PLP a pH 6,5 y 37°C
Efecto del PL, Zn+2 y ATP sobre la absorbancia a 388 nm.
Actividad de hPLK con distintos Me+2
Actividad de la enzima dependiente del pH
Gráficos de velocidad inicial en función de la concentración de sustrato
Variación de las distintas especies que se encuentran en solución cuando se
varía el pH y el ZnATP-2
Efecto del Zn+2 libre sobre la actividad de hPLK
Inhibición provocada por el Zn+2 libre sobre hPLK
Modelos de inhibición para hPLK en presencia de Zn+2
Cambio de la fluorescencia intrínseca de hPLK en presencia de Zn+2
1
2
4
5
17
20
23
25
26
28
29
30
31
32
33
34
35
37
37
39
40
42
viii
RESUMEN
La enzima piridoxal quinasa (PLK) pertenece a la familia de quinasas sin dominio menor de
la superfamilia de la riboquinasa y cataliza la formación de piridoxal-5’-fosfato (PLP) a partir de
piridoxal (PL) y de un complejo metal divalente–ATP (Me+2-ATP), siendo fundamental en la vía de
salvataje de PLP en diversos organismos. PLP es la forma activa de la vitamina B-6 y es el segundo
cofactor más usado en la naturaleza, luego del ATP, principalmente relacionado con el metabolismo
de los compuestos aminos, como los aminoácidos.
A partir de análisis filogenéticos se infirió que existen cuatro clados de PLK bien
diferenciados, tres de los cuales corresponden al dominio de las bacterias y uno al dominio de los
eucariontes, estando ausente el dominio de las arqueas, las que sólo poseen una vía de biosíntesis de
novo de PLP. En el caso de las bacterias, uno de los clados corresponde a las proteínas que son
homólogos cercanos del gen pdxK y los otros dos clados son homólogos cercanos del gen pdxY,
donde en uno se encuentran las PLK de firmicutes, bacteroidetes, espiroquetas, fusobacterias y
termotogales, mientras que en el otro se encuentran las PLK de proteobacterias, actinobacterias y
deinococos-thermus. Además, se distinguieron tres motivos de secuencia conservados, los cuales
corresponden a DPV, NXXE y GXGD, asociados a la unión de sustratos, unión de Mg+2 y la
catálisis. La estructura de PLK de origen humano (hPLK) posee una alta similitud estructural con
PLKs de otras fuentes, como de Ovis aries y Escherichia coli, salvo en algunos loops de la
estrucura.
hPLK, que fue expresada en E. coli, se purificó y caracterizó cinéticamente. En cuanto al
uso de diferentes metales divalentes (Me+2), se observó que la mayor velocidad inicial se obtiene a
bajas concentraciones de Zn+2 libre. En relación a los parámetros cinéticos, la Vmax fue de 4789
U/mg y la kcat de 3,2 s-1, en tanto, la Km para PL fue de 490 µM, mientras que para ZnATP-2 fue de
20 µM. El pH óptimo de hPLK fue de 6,4 en las condiciones usadas.
Respecto a la regulación de la actividad enzimática, se determinó que hPLK es inhibida por
PL, ZnATP-2 y Zn+2 libre, mientras que las especies ATP-4 y HATP-3 no generan cambios en la
actividad de la enzima. La inhibición por Zn+2 libre posee un IC50 de 37 µM, en tanto que la Kd para
Zn+2, determinada por fluorescencia intrínseca, es de 266 nM.
El Zn2+ libre presenta un patrón de inhibición complejo: cuando se varía el sustrato ZnATP-2
los datos se ajustan a un modelo de inhibición denominado sistema C1 de tipo mixto lineal,
mientras que cuando se varía el sustrato PL, los datos se ajustan a dos modelos, debido a que se
observa un perfil de inhibición dual dependiendo de la concentración de Zn+2 libre. El primer
modelo, que explica el comportamiento inhibitorio hasta una concentración de Zn+2 libre de 50 µM,
es lo que se denomina sistema C5 de inhibición de tipo mixto hiperbólico, en tanto que el segundo
modelo, que explica el comportamiento inhibitorio desde 50 µM a concentraciones mayores,
corresponde a un modelo de inhibición incompetitiva modificado, en el cual se incluye la unión de
un Zn+2 adicional a la enzima libre.
ix
ABSTRACT
Structural, evolutive and functional analysis of human pyridoxal kinase (hPLK)
Pyridoxal kinase (PLK) is a member of the ATP-dependent kinases family that lacks the
minor domain of the ribokinase superfamily. This enzyme catalyzes the formation of
pyridoxal-5’-phosphate (PLP), from pyridoxal (PL) and divalent metal–ATP complex (Me+2-ATP),
and plays a central role in the salvage pathway of PLP in various organisms. PLP is the active form
of vitamin B-6 and is the second most important cofactor in nature after ATP, mainly related to the
metabolism of amine compounds, such as amino acids.
Phylogenetic analyses of PLKs show four main clades; three of them are from Bacteria and
one from the Eucarya domain. In the case of bacteria, one clade corresponds to close homologues of
the pdxK gene, and the other two are more related to the protein coded by the pdxY gene (one
containing firmicutes, bacteroidetes, spirochaetes, fusobacteria and thermotogae, and the other
including proteobacteria, actinobacteria y deinococcus-thermus. Also, three conserved motifs
probably associated to substrate and Mg+2 binding and catalysis were found. These correspond to:
DPV, NXXE and GXGD. Human PLK (hPLK) has a high structural similarity with PLKs from
Escherichia coli and Ovis aries sources, except in some loops of the structure.
hPLK, expressed in E. coli, was purified and characterized. With respect to the use of
divalent metal cations (Me+2), the maximal activity was obtained at low free Zn+2 concentrations.
Kinetic parameters Vmax, kcat, Km for PL and Km for ZnATP-2 are 4789 U/mg, 3.2 s-1, 490 µM and 20
µM, respectively. Optimum pH was 6.4 under the conditions used.
In regard to the regulation of the enzyme activity, PLK was inhibited by PL, ZnATP-2 and
free Zn+2, whereas the ATP-4 y HATP-3 species do not modify the enzyme activity. Inhibition by
free Zn+2 presents a IC50 of 37 µM while binding of Zn+2, determined by intrinsic fluorescence
measurements, shows a Kd of 266 nM.
Inhibition by free Zn2+ presents a complex pattern. The data adjust to a mixed lineal
inhibition model called C1, when ZnATP-2 was the variable substrate. However, when the varied
substrate is PL, the data adjust to two models depending on the free Zn2+ concentration employed.
The first model explains the inhibitory behavior up to a free Zn2+ concentration of 50 µM, and
corresponds to a mixed hyperbolic inhibition system C5, whereas the second model explains the
inhibitory behavior from 50 µM to higher concentrations of free Zn2+, and corresponds to a
modified uncompetitive inhibition system, where binding of an additional Zn2+ to the free enzyme
was included.
1
I. INTRODUCCIÓN
El PLP es la forma activa de la vitamina B-6, siendo éste uno de los cofactores más
importantes y versátiles de la naturaleza. Casi todas las enzimas dependientes de PLP, con
excepción de la glicógeno fosforilasa, están asociadas con vías bioquímicas que involucran
compuestos aminos, principalmente aminoácidos. En organismos procariontes se estima que el
1,5% de sus genes codifica enzimas dependientes de PLP (Perducani y Peracchi, 2003).
La síntesis de novo de PLP desde metabolitos intermediarios ocurre en ciertas bacterias,
hongos y plantas, pero no en mamíferos, ya que estos últimos no poseen las enzimas de la vía
biosintética y dependen exclusivamente del aporte exógeno, donde PLK es fundamental en las vías
de incorporación de PLP (véase Figura 1) (Hanna y cols., 1997).
Figura 1: Vía de incorporación de PLP en E. coli. La vía de incorporación es similar en todos los organismos que la poseen. Se muestran las reacciones involucradas en esta vía, con todas las fosforilaciones catalizadas por PLK, y los seis vitámeros (distintas formas químicas en que se presentan las vitaminas) de la vitamina B-6. PdxH representa a la enzima piridoxina-5'-fosfato oxidasa. P'asa se refiere a fosfatasa. Se destacan la presencia de PLK y los sustituyentes de C(4) del anillo de piridina en un recuadro rojo. Editado del trabajo de Mittenhuber, 2001.
2
PLK (E.C. 2.7.1.35) es la enzima que cataliza la fosforilación de PL, piridoxina (PN) o
piridoxamina (PM) para formar PLP, piridoxina-5'-fosfato (PNP) o piridoxamina-5'-fosfato (PMP),
respectivamente (véase Figura 1) (Li y cols., 2002). Recientemente se han determinado las
estructuras tridimensionales de las PLK de Homo sapiens, Ovis aries (oveja) y Escherichia coli, y
dentro de esta última especie son dos las proteínas cristalizadas, según los genes (pdxY y pdxK) que
codifican a la proteína (Cao y cols., 2006; Li y cols., 2002; Safo y cols., 2004; Yang y cols., 1998).
Los sustratos de PLK - PL, PN y PM – tienen en común el anillo de piridina y la mayoría de los
sustituyentes, salvo el grupo en el C(4) del anillo, donde PL presenta un aldehído, PN un
hidrocimetilo y PM un grupo metil-amino (véase Figura 1). Sin embargo, se ha descrito que
ninguno de los grupos en la posición C(4) del anillo poseen interacción con algún residuo de la
enzima, lo que explicaría la diversidad de sustrato que acepta PLK, debido a la incapacidad de la
enzima de diferenciar entre ellos (Li y cols., 2004).
De acuerdo a los datos obtenidos a partir de la estructura cristalográfica de hPLK,
determinada por Cao y colaboradores (2006), se establece que esta enzima es un homodímero,
donde cada monómero contiene 9 hélices α y 12 hebras β. La interfase del dímero está formada por
los componentes estructurales α1, α9, β1 y β3 de ambos monómeros. A diferencia de la estructura
de la PLK de O. aries y E. coli, la enzima de humano posee dos hebras β adicionales, denominadas
en el diagrama topológico como β5a y β5b (Cao y cols., 2006) (véase Figura 2).
Figura 2: Diagrama topológico de un monómero de hPLK. Las flechas indican hebras β y los rectángulos indican hélices α. Los elementos de estructura secundaria están numerados desde el N-terminal, donde en color celeste se expresan las hebras β y en rojo se expresan las hélices α. Extraído de Cao y cols., 2006.
PLK pertenece al grupo de enzimas que conforman la superfamilia de la riboquinasa. Estas
agrupaciones son hechas en base a sistemas de clasificación estructural, como CATH
(http://www.cathdb.info/) y SCOP (http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/), las cuales organizan
3
jerárquicamente todas las proteínas con estructura conocida (Orengo y Thornton, 2005).
La clasificación evolutiva considera los conceptos de superfamilia y familia, que son
agrupaciones de proteínas homólogas, por lo que responden a la similitud de sus estructuras y
funciones enzimáticas. Esto es, proteínas relacionadas muy cercanamente, con una alta similitud de
secuencias (sobre 40%) y generalmente con la misma función, pueden ser agrupadas como familia,
mientras que homólogos más lejanos, que tienen baja similitud de secuencias (bajo 30%) y
generalmente con distinta función, son agrupadas en superfamilias (Orengo y Thornton, 2005).
Entre la cantidad enorme de herramientas bioinformáticas que son útiles para organizar toda
la información evolutiva, el alineamiento estructural es muy poderoso para descubrir relaciones
filogenéticas entre proteínas lejanas, ya que la estructura es más conservada que la secuencia. Esta
herramienta consiste en superponer estructuras de proteínas en tres dimensiones, ajustando los
átomos de ellas tanto como sea posible (Mount, 2001). Por otra parte, el alineamiento múltiple de
secuencias, que basa su análisis exclusivamente en la información de la secuencia de las proteínas,
es una excelente herramienta para desentrañar eventos recientes en la evolución y motivos
conservados asociados a funciones específicas. Finalmente, con la construcción de un árbol
filogenético se evidencia cómo son las relaciones evolutivas entre los integrantes de una familia, e
incluso, estimar la probabilidad y el tiempo de los sucesos evolutivos (Mount, 2001).
La superfamilia de la riboquinasa (SCOP ID: 53613, CATH ID: 3.40.1190.20), cuyos
miembros catalizan la fosforilación de un grupo hidroximetil en sustratos aceptores como azúcares,
nucleósidos y coenzimas, se caracterizan estructuralmente por poseer una sábana β central de 8
hebras, flanqueada por 8 hélices α, 5 por un lado y 3 por el otro, la que también ha sido descrita
como estructura αβα; donde la hebra β7 es la única que no es paralela en la sábana β central (véase
Figura 3A y Figura 4). Además, el sitio activo se encuentra en un surco superficial a lo largo del
borde C-terminal de la sábana β, con el grupo hidroxilo aceptor de fosfato y el fosfato-γ del ATP
cercanos en el medio del surco (véase Figura 3B) (Zhang y cols., 2004).
En la superfamilia de la riboquinasa se observan tres variaciones topológicas principales
sobre el plegamiento arquetípico, lo que permite clasificarlos en tres grupos de familias: quinasas
dependientes de ADP, entre las cuales se cuentan glucoquinasas y fosfofructoquinasas, quinasas
dependientes de ATP con dominio menor, como la riboquinasa, y las quinasas dependientes de ATP
sin dominio menor, como 4-metil-5-β-hidroxi-etiltiazol quinasa (THZK),
4-amino-5-hidroximetil-2-metilpirimidina fosfato quinasa (HMPPK) y PLK. Nótese que el dominio
menor se refiere a las inserciones de sábanas β y de hélices α adicionales en N-terminal, con
respecto a la familia dependiente de ATP sin dominio menor (véase Figura 4). Esta última familia es
considerada la más ancestral de la superfamilia (Zhang y cols., 2004).
Dentro de la superfamilia se han detectado elementos estructurales conservados. Sin
embargo, no se han realizado estudios filogenéticos dentro de la familia que permitan correlacionar
la diversidad estructural y funcional en términos evolutivos, ni se ha evaluado la importancia de los
motivos conservados para la función en este grupo de quinasas. En nuestro laboratorio se han hecho
4
trabajos que dan luces respecto a esta familia y se han propuesto funciones para los motivos
conservados NXXE y DPV (Parducci y cols., 2006; Ramírez, 2010), mientras que el motivo GXGD
ha sido caracterizado por otros grupos (Li y cols., 2002).
Figura 3: Elementos de estructura secundaria comunes a los miembros de la superfamilia de la riboquinasa. Representaciones mediante cintas de las estructuras secundarias básicas que contienen las proteínas pertenecientes a la superfamilia de la riboquinasa, donde se muestra en azul la sábana β central y en gris las hélices α que flanquean la sábana β central. Se destaca la hebra antiparalela β7. En (A) se representa una estructura en estado apo y en (B) una estructura que posee unida una molécula de ATP que se encuentra representado mediante barras (licorice) y una molécula de Mg+2, representado mediante una esfera verde. Las figuras se realizaron a partir de estructuras de hPLK.
Los miembros del grupo de quinasas sin dominio menor participan en las etapas finales de
la biosíntesis de coenzimas - específicamente en las denominadas vías de incorporación - como PLP
y tiamina pirofosfato, cofactores clave para diversas reacciones del metabolismo de aminoácidos y
azúcares. Los miembros caracterizados de este grupo se presentan como oligómeros, ya sea como
dímero en el caso de HMPPK y PLK, o como trímero en el caso de THZK (Zhang y cols., 2002).
hPLK tiene la particularidad de que el monómero es catalíticamente activo (Kwok y cols., 1987;
Lee y cols., 2000), algo que sólo se ha presentado en otras 2 proteínas de la superfamilia, la
adenosina quinasa y la glucoquinasa (Zhang y cols., 2004).
Por otra parte, hPLK, cuyo gen (Gene Id: 8566) se localiza en el cromosoma 21, se expresa
de manera ubicua en todos los tejidos, debido a que el PLP circulante en el torrente sanguíneo no
puede cruzar la membrana celular, razón por la cual el PLP (que fue fosforilado inicialmente en el
hígado al ingresar al organismo) debe ser desfosforilado por fosfatasas asociadas a membrana, y
luego que atraviesa la membrana se debe volver a fosforilar por una PLK ubicada en el citoplasma
de dicha célula (Hanna y cols., 1997). En los humanos, la deficiencia de PLP está directamente
relacionada con una serie de enfermedades, entre las cuales se han descrito la depresión, autismo y
A B β7
5
beta-talasemia; además de una serie de desórdenes tan diversos como el metabolismo del colesterol
y la proliferación de linfocitos (Holman, 1995), por lo cual, entender la regulación de hPLK, esto es,
los inhibidores y activadores que posee, es imprescindible para entender cómo se preservan los
niveles de PLP en los tejidos humanos. Por lo mismo, hPLK constituye un importante blanco
farmacológico para regular la cantidad de PLP en el organismo y, por ende, la gran cantidad de
desórdenes enumerados anteriormente.
Figura 4: Diagramas de topología de representantes de la superfamilia de la riboquinasa. En triángulo se representan las hebras β y en círculo, las hélices α. Los colores azul, rojo y verde exponen las estructuras secundarias que se conservan en la superfamilia, donde la única diferencia entre verde y rojo es la posición que poseen las hélices α, respecto a la sábana β. Las figuras geométricas en color blanco indican estructuras adicionales a los elementos estructurales básicos de la superfamilia. Las figuras en color amarillo representan elementos estructurales adicionales a los elementos básicos de la superfamilia, los que sólo están ausentes en THZK y HMPPK. Las figuras de color gris indican elementos estructurales adicionales a los que poseen los miembros de la familia de la riboquinasa sin dominio menor. En círculos rojos se destaca la zona donde se encuentra el dominio menor. Las estructuras corresponden a (Familia sin dominio menor) PLK, (Familia dependiente de ATP con dominio menor) riboquinasa y (Familia dependiente de ADP con dominio menor) glucoquinasa. Adaptado de Cheng y colaboradores, 2002.
En cuanto al sustrato dador de fosforilo, es imprescindible que el ATP se encuentre
formando complejo con un Me+2, cuestión ya descrita para homólogos lejanos en la superfamilia de
la riboquinasa (Parducci y cols., 2006). Entre los Me+2 que forman complejos con ATP, se han
descrito varios, uno de los cuales es el Zn+2 (Sigel, 2004), el cual se une al ATP-4 mediante la
coordinación con los grupos fosfato-β y fosfato-γ. Por otra parte, también se forman otras especies
Familia dependiente de ATP con dominio menor
Familia dependiente de ADP con dominio menor
Familia sin dominio menor
6
cuando hay presencia de Me+2 y ATP-4, las cuales dependen del ambiente en que se encuentran.
Entre éstas destaca la forma protonada del ATP-4 (el protón se ubica en el fosfato-γ del ATP), esto es,
HATP-3, el cual pudiese tener efectos en la actividad de las enzimas que poseen al complejo metal
divalente-ATP (Me+2-ATP) como sustrato, ya sea como inhibidor o como especie que limita la
concentración de ATP-4 libre, disponible para la formación del sustrato (Storer y Cornish-Bowden,
1976; Tribolet y Sigel, 1988).
Además, el metal libre provoca efectos inhibitorios sobre la actividad de PLK,
particularmente en el caso del Zn+2 (McCormick y cols., 1961). A pesar que el zinc es el vigésimo
séptimo metal en orden de abundancia en el planeta, es uno de los más utilizados en la naturaleza, y
en los humanos es el metal de transición que se encuentra en mayor cantidad, luego del hierro
(Canzoniero y cols., 1999). El zinc posee unas características químicas que lo hacen único a nivel
fisiológico, ya que en tales condiciones no experimenta oxidación y reducción, posee una esfera de
coordinación variable y una adaptabilidad estereoquímica con lo que puede asumir múltiples
geometrías de coordinación (Vallee y Falchuk, 1993). El 50% del zinc se encuentra en el citoplasma
y sus organelos.
Las caracterizaciones cinéticas de hPLK observadas hasta ahora, no han sido hechas
considerando factores fundamentales cuando se trabaja en presencia de metales y moléculas que
varían su comportamiento dependiendo del pH, tal como es el caso del ATP-4 y el HATP-3 (Storer y
Cornish-Bowden, 1976), por lo cual, ambas especies son tratadas como la misma y se cae en errores
de cálculo de las especies en solución. Incluso, nadie ha propuesto cómo actúa el complejo ZnATP-2,
o el Zn+2 libre sobre la actividad de hPLK. Es por eso, que existen varios flancos por abordar en este
tema, donde necesariamente lo antes descrito debe estar incluido, teniendo presente que están
involucradas moléculas sumamente importantes en la homeostasis y correcto funcionamiento de
múltiples actividades dentro del organismo humano.
Comparaciones de la estructura tridimensional de hPLK con las dos PLK de E. coli,
muestran que el RMSD (medida de la distancia promedio entre los C-α de los residuos de proteínas
superpuestas) entre hPLK y PDXK es 1,34 Å, entre hPLK y PDXY es 1,17 Å, mientras que entre
PDXK y PDXY es 1,43 Å. Aunque estos datos sugieren una mayor semejanza entre hPLK y PDXY
de E. coli, no permiten determinar con precisión sus niveles de parentesco. Por esto se hace
necesario generar una filogenia entre las PLK, para establecer las relaciones evolutivas entre las
proteínas de las diversas especies.
En esta tesis se establecerán las relaciones evolutivas de hPLK en el contexto de la familia a
la cual pertenece, y se analizarán sus mecanismos regulatorios en función de una precisa
determinación de las especies involucradas en el equilibrio metal nucleótido.
7
II. HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS
2.1 Hipótesis
Este trabajo se enfoca en las características filogenéticas y cinéticas de la piridoxal quinasa
humana. En función de esto, se trabajará con dos hipótesis:
Hipótesis filogenética
El grupo de piridoxal quinasas de eucariontes, al que pertenece la piridoxal quinasa
humana, está filogenéticamente más relacionada con el grupo formado por homólogos cercanos de
PDXY de E. coli.
Hipótesis cinética
El mecanismo catalítico de la piridoxal quinasa humana contempla el uso de dos metales
divalentes; uno formando complejo con el nucleótido y un metal libre responsable de la inhibición
de la actividad enzimática.
2.2 Objetivos Generales
Caracterizar cinéticamente a la piridoxal quinasa humana
Establecer las relaciones filogenéticas de la piridoxal quinasa humana dentro de la familia
sin dominio menor de la superfamilia de la riboquinasa.
2.3 Objetivos Específicos
2.3.1 Efectuar un análisis estructural y evolutivo de piridoxal quinasa de la familia de
quinasas sin dominio menor de la superfamilia de la riboquinasa.
2.3.2 Determinar los parámetros cinéticos de piridoxal quinasa de H. sapiens (Km, kcat,
Vmax).
2.3.3 Caracterizar el uso de cationes divalentes por parte de piridoxal quinasa de H.
sapiens
2.3.4 Establecer el efecto de las distintas especies que se encuentran en solución: Zn+2,
ATP-4, HATP-3 y ZnATP-2 sobre la actividad de piridoxal quinasa de H. sapiens.
2.3.5 Establecer un mecanismo de inhibición sobre piridoxal quinasa de H. sapiens,
por parte de Zn+2 libre.
8
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Materiales
El plasmidio p24a-LIC-hPLK fue una donación de la Dra. Linda McBroom-Cerajewski del
Structural Genomic Consortium (Ismail y cols., 2005) de Canadá.
De Sigma se obtuvo: α-glicerofosfato deshidrogenasa, β-mercaptoetanol, ácido
2-(N-morfolino) etilsulfónico (MES), ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etilsulfónico (HEPES),
ácido piperacina-N,N'-bis etilsulfónico (PIPES) 99%, ATP como sal disodio, aldolasa, citrato de
sodio, cloruro de manganeso (MnCl2), cloruro de calcio (CaCl2), dietilaminoetil (DEAE) sefarosa,
dinucleótido de β–nicotinamida y adenina reducida (NADH), ditiotreitol (DTT), dodecil sulfato de
sodio (SDS) 99%, estándar de bajo peso molecular SigmaMarker low range M3913, hidrocloruro de
piridoxal, hidrocloruro de piridoxal-6-fosfato, fructosa-6-fosfato (F6P), persulfato de amonio
(APS), seroalbúmina de bovino (BSA) y triosa fosfato isomerasa.
De Merck se obtuvo: acetato de sodio, ácido clorhídrico (HCl), cloruro de cadmio (CdCl2);
cloruro de cobalto (CoCl2), cloruro de cobre (CuCl2), cloruro de magnesio (MgCl2), cloruro de
potasio (KCl), cloruro de zinc (ZnCl2), etanol absoluto, fosfato de potasio monobásico (KH2PO4),
imidazol y sulfato de níquel (NiSO4).
De Winkler se obtuvo: bicarbonato de sodio, carbonato de sodio, cloruro de sodio (NaCl),
fosfato de potasio dibásico (K2HPO4), glicerol, glicina, hidróxido de sodio (NaOH), isopropil-β-D-
tio-galactopiranósido (IPTG), sulfato de amonio ((NH4)2SO4) y tris.
De Bio-Rad Laboratories INC se obtuvo: acrilamida 99,9%, Bio-Rad Protein Assay y
Chelex 100.
De Invitrogen se obtuvo: agar seleccionado y células de E. coli BL21(DE3).
De Becton Dickinson Company se obtuvo: extracto de levadura Bacto™ y triptona
Bacto™.
De US Biological se obtuvo: kanamicina.
De Branson Ultrasonics Corporation es el Sonicador Branson Digital Sonifier 102C
De Eppendorf se adquirió la centrífuga Eppendorf 5810R y sus rotores F-34-6-38 y A-4-62.
De GE Healthcare se adquirió la columna de níquel HisTrap.
De Gibco BRL – Ultra Pure – Life Technologies se obtuvo:
N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TEMED).
De Hewlett Packard se adquirió el Espectrofotómetro Hewlett Packard 8453.
De Millipore se adquirieron los Centriplus.
De Omega Bio-Tek se obtuvo el sistema comercial extractor de plasmidio Plasmid minikit
I.
9
3.2 Alineamiento Estructural
El fin de realizar un alineamiento estructural es usarlo como guía para un posterior
alineamiento múltiple de secuencias y para mostrar la conservación de la estructura en las PLK.
Se hizo un sondeo en la base de datos de estructuras de PDB
(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do), usando como sujeto de búsqueda la estructura de hPLK
(PDB: 2AJP), mediante el algoritmo BLAST (Altschul y cols., 1997) que se encuentra en la
herramienta de búsqueda (http://www.rcsb.org/pdb/search/advSearch.do?st=SequenceQuery),
eliminando las estructuras que no correspondían a la familia. Para el alineamiento se usaron las
estructuras en formato PDB de las PLK encontradas en estado apo (que no presentan ligando unido)
para evitar discrepancias debidas a cambios conformacionales como consecuencia de la unión del
ligando.
Se realizó un alineamiento estructural múltiple usando el algoritmo STAMP (Rusell y
Barton, 1992) de la herramienta multiseq (Roberts y cols., 2006) del programa VMD 1.6 (Humphrey
y cols., 1996; http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/), para lo cual se utiliza un monómero de cada
estructura. Una vez realizado, se revisó manualmente para corregir posibles errores en cuanto a los
motivos conservados no detectados mediante superposición.
La calidad del alineamiento estructural se evalúa mediante la medida de similitud
estructural Qres, la cual es aplicada a la secuencia y a la estructura. Ésta calcula la similitud
estructural de cada residuo en un conjunto de estructuras alineadas, a partir de las distancias de
Cα-Cα entre un residuo y todos los demás de la proteína, excluyendo a los vecinos más cercanos
(Roberts y cols., 2006). Visualmente, Qres hace uso de una escala de colores, donde la mayor
similitud en la estructura es presentada en color azul, la menor similitud, en color rojo y una
similitud intermedia se establece con color blanco. Se hará énfasis en las zonas con baja
superposición estructural, para analizarlas.
3.3 Alineamiento de secuencias
Se realizó un sondeo exhaustivo en la base de datos nr, mediante el algoritmo PSI-BLAST,
estableciendo el valor-E en 5x10-5 como límite de búsqueda (Altschul y cols., 1997;
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), usando varios sujetos de búsqueda como templado, que
corresponden a variantes de la especificidad en PLK, los cuales fueron las secuencias proteicas de
hPLK (GenInfo Identifier (GI): 4505701), de PDXK de E. coli (GI: 114793678) y de PDXY de E.
coli (GI: 242377367). De las secuencias encontradas se seleccionan las PLK y las que se publican
como posibles PLK, además de algunas HMPPK, para luego proceder a eliminar las secuencias
incompletas y las secuencias que se encuentran repetidas, con el fin de evitar la redundancia en
resultados posteriores.
El resultado del alineamiento estructural se usó como perfil para realizar un alineamiento
múltiple en ClustalX 2.0, mediante la estrategia “profile alignment” (Larkin y cols., 2007;
10
http://www.clustal.org/), con todas las secuencias seleccionadas de las búsquedas. Los valores de
penalidad para gaps usados son los siguientes: en el alineamiento de a pares se castiga con 35
puntos la apertura de un gap y con 0,75 su extensión; y en el alineamiento múltiple la apertura de un
gap se castiga con 15 puntos y su extensión se va castigando con 0,45 puntos.
Todos los alineamientos múltiples realizados fueron sometidos al algoritmo Neighbour
Joining (Saitou y Nei, 1987) que se encuentra disponible en el programa ClustalX 2.0, para
construir árboles filogenéticos de manera rápida y, de esta manera, corroborar el alineamiento
múltiple. Se realizó un análisis de muestro (bootstrapping), donde el número de réplicas (bootstrap)
es 1000. Además se utilizó como grupo externo una secuencia de HMPPK de Methylobacterium
populi, donde el criterio usado para hacer esta elección se discute en la sección 5.1 (página 43).
Una vez resuelto el alineamiento, se revisó y editó mediante el programa Genedoc 2.7.000
(Nicholas y cols., 1997; http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/), eliminando las posiciones que incluyen
gaps, ya que éstos son tratados como datos perdidos y no contribuirán con información filogenética.
El alineamiento se exportó en formato NEXUS, para su posterior utilización en la
generación del árbol filogenético.
3.4 Construcción de árbol filogenético
A partir del resultado del alineamiento múltiple se realizó un árbol filogenético mediante el
método Bayesiano, modelo probabilístico que relaciona la probabilidad posterior de la hipótesis – el
árbol – con su probabilidad de ser correcto, dada la probabilidad inicial, los datos y el modelo, para
lo que se utiliza el programa Mr. Bayes 3.1.2 (Huelsenbeck y cols., 2001;
http://mrbayes.csit.fsu.edu/).
El alineamiento múltiple de secuencias obtenido en formato NEXUS, se usó como input en
el programa Mr. Bayes 3.1.2. En éste se prueban los diez modelos disponibles de evolución, y se
manipula el número de generaciones, que es la cantidad de iteraciones que el programa debe hacer
para llegar a obtener el árbol de consenso, el cual debe cumplir con que el promedio de desviación
estándar de frecuencias de separación entre las iteraciones sea menor a 0,01.
Una vez hecho el análisis, el programa muestra el árbol de consenso como un filograma y
los valores de probabilidad posterior en cada nodo, para evaluar la calidad de las agrupaciones
generadas. Para enraizar el árbol correctamente se utilizó como grupo externo una secuencia de
HMPPK de M. populi.
El árbol de consenso fue visualizado y editado en el programa Archaeopteryx 0.955 beta
(Han y Zmasek, 2009; http://www.phylosoft.org/archaeopteryx/), y posteriormente exportado en el
formato de imagen PNG.
Además, se analizó el alineamiento múltiple para relacionar los cambios aminoacídicos con
los clados encontrados. Para determinar las diferencias entre los cuatro clados principales, se
comparó la similitud de residuos que existe en cada uno de estos grupos en relación a los otros tres.
11
Estos residuos también se consideraron similares cuando mantenían las características generales, es
decir, que sean hidrofóbicos, aromáticos, ácidos, básicos o polares sin carga.
3.5 Preparación de células competentes
Células de E. coli BL21(DE3) se cultivaron durante la noche a 37ºC en 1 mL de medio
Luria-Bertani (LB) (1% Triptona, 0,5% extracto de levadura, 1% NaCl), el que se usó como
inóculo. Se inocularon 0,5 mL del medio antes mencionado en 50 mL de medio LB y se incubaron a
37ºC con una agitación vigorosa en un matraz de 4 L, para facilitar la aireación. Cuando las células
alcanzaron un OD580 de 0,4 se colocaron en hielo durante 10 minutos. Las células se colectaron por
centrifugación a 5000 rpm y 4ºC durante 10 minutos en un tubo frío y estéril, usando el rotor
F-34-6-38 de la centrífuga Eppendorf 5810R. El sobrenadante se descartó y las células se
resuspendieron en una solución de CaCl2 estéril, fría y en hielo, en una relación de volumen 1:1 por
40 minutos. Las células se centrifugaron a 5000 rpm y 4ºC en un tubo frío y estéril, usando el rotor
F-34-6-38 de la centrífuga Eppendorf 5810R. Se descartó el sobrenadante y las células se
resuspendieron suavemente en una proporción 1/50 de volumen de solución de CaCl2 0,1 M, fría y
estéril, y luego se dejó el tubo que posee a las células en hielo. Se sacó el tubo que posee a las
células del hielo luego de 24 horas. Posterior a estos pasos las células son competentes para la
transformación.
3.6 Transformación de células competentes
Se posee el vector p24a-LIC-hPLK que codifica a hPLK, el cual posee una modificación de
la secuencia proteica de hPLK por adición de seis histidinas en el N-terminal de ésta (marcador
His).
Se alicuotaron 0,1 mL de células competentes en un tubo Eppendorf precongelado que ya
contenía 2 µL del DNA plasmidial antes mencionado. Para asegurarse de que las células se
encuentren distribuidas homogéneamente, se mezclaron suavemente antes de alicuotarlas, ya que
éstas tienden a asentarse sobre el fondo del tubo. Luego de 40 minutos, el tubo que contenía a las
células se sacó del hielo. El estrés térmico se provocó por incubación de las células en un baño
térmico a 42ºC por 45 segundos y luego éstas se regresaron al hielo durante 60 segundos. Se
agregaron 0,4 mL de medio LB al tubo, el que se mezcló y agitó durante 1 hora a 37ºC. La
transformante se denomina en adelante BL21-p24a-hPLK.
Se colocaron 0,1 mL de células transformadas sobre placas de agar LB (1% Triptona, 0,5%
extracto de levadura, 1% NaCl, 1,5% agar) con 50 µg/mL de kanamicina. Además, se sembraron las
células transformadas en placas, en diluciones de 1:10 y 1:20 con medio LB. Éstas se incubaron
durante la noche a 37ºC. Se seleccionó una colonia de la transformante de la placa de agar que
contenía colonias aisladas, es decir, donde se pueda diferenciar claramente una colonia de otra, sin
12
que haya formación de “césped”, para luego colocarla en 1 mL de medio LB con 50 µg/mL de
kanamicina, y se incubó durante la noche. Este cultivo se inoculó en 10 mL de medio LB con 50
µg/mL de kanamicina y se creció durante 12 horas. Se guardaron alícuotas de 500 µL del cultivo,
mezcladas con 500 µL de glicerol estéril al 100% a -80ºC.
3.7 Ensayo de expresión de hPLK en la transformante BL21-p24a-hPLK
Para optimizar el proceso posterior de purificación, se debió realizar una prueba de
expresión del vector que transporta la secuencia de hPLK, donde se advierte el efecto del IPTG a
través de su concentración, y de la cantidad de horas de inducción.
Los preinóculos se hacen al 0,1% v/v en medio LB usando 50 µg/mL de kanamicina,
teniendo un volumen final de 3 mL y dejando crecer durante 12 horas. A continuación se inocularon
los 3 mL de preinóculo en 150 mL de medio LB con 50 µg/mL de kanamicina, se incubó hasta
alcanzar un OD580 de 0,6, se tomó una alícuota de 15 mL y posteriormente se indujo la expresión de
la enzima recombinante con 0,5 mM y 1 mM de IPTG. Luego se tomaron alícuotas de 15 mL cada
una, a distintos tiempos, en un rango de 2 a 24 horas (tiempo 2, 4, 6 y 24 horas), las cuales se
centrifugaron a 5000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente en la centrífuga Eppendorf
5810R con el rotor F-34-6-38. El sedimento bacteriano se guardó a -20ºC durante la noche.
Las células se resuspendieron en 50 mM de Tris-HCl pH 8,0 y 100 mM de NaCl. Luego las
células se rompieron mediante sonicación con el sonicador Branson Digital Sonifier, usando 3
pulsos de 10 segundos, con intervalos de 30 segundos, y se centrifugaron a 12.000 rpm durante 15
minutos a 4ºC en la centrífuga Eppendorf 5810R, usando el rotor F-34-6-38. El sobrenadante, que
posee la proteína, se usó para la medición de actividad y análisis mediante un gel SDS-PAGE al
11,5% (el gel separador se compone de acrilamida 11,5%, SDS 0,1%, 0,37 M de amortiguador
Tris-HCl pH 8,8, APS 0,34% y TEMED 0,14%, y el gel concentrador posee acrilamida 4,4%, SDS
0,1%, 0,23 M de amortiguador Tris-HCl pH 6,8, APS 0,66% y TEMED 0,39%) con su respectivo
estándar de peso molecular.
3.8 Crecimiento e inducción de hPLK en la transformante BL21-p24a-hPLK
Los preinóculos se preparan introduciendo las células correspondientes mediante el asa de
inoculación en 50 mL de medio LB, en presencia de 50 µg/mL de kanamicina, y a 37ºC. Se
cultivaron durante 12 horas, para luego agregarlas a 1,8 L de medio Terrific (1,2% triptona, 2,4%
extracto de levadura, 0,4% glicerol, 0,23% KH2PO4 y 1,25% K2HPO4) a 37ºC, en presencia de 50
µg/mL de kanamicina. Una vez alcanzado un OD580 de 0,8, se procedió a inducir con 1 mM de
IPTG, cambiando a temperatura ambiente, y manteniendo una agitación vigorosa durante toda la
noche. Posteriormente, se procedió a sedimentar las bacterias mediante centrifugación en el rotor A-
4-62 de la centrífuga Eppendorf 5810R, durante 25 minutos a 4000 rpm y a temperatura ambiente.
13
3.9 Purificación de hPLK.
El uso de un marcador His es un recurso que se usó anteriormente para purificar hPLK (Cao
y cols., 2006), el cual se basa en la alta afinidad del grupo imidazol, que poseen las seis histidinas
presentes en el marcador His, con el níquel de la columna.
El sedimento bacteriano se resuspendió en 100 mL de amortiguador de unión (10 mM de
Tris-HCl pH 7,5, 0,5 M de NaCl, 5% de glicerol, 10 mM de β-mercaptoetanol, y 5 mM de
imidazol). El rompimiento de las células se llevó a cabo mediante sonicación con el sonicador
Branson Digital Sonifier, aplicando 25 pulsos de 20 segundos cada uno, los cuales no deben superar
los 25 Watts RMS, con 30 segundos de espera entre cada pulso. El lisado se centrifugó usando el
rotor F-34-6-38 de la centrífuga Eppendorf 5810R a 12000 rpm durante 40 minutos a 4ºC.
El sobrenadante se pasó a través de una columna de DEAE de 40 mL previamente
equilibrada con el amortiguador de unión a 4ºC, la que se lavó con 2 volúmenes de columna (80
mL) del amortiguador de unión. En estas condiciones la hPLK, no es retenida en la columna.
La proteína recuperada del paso anterior se cromatografió a través de una columna de
níquel de 5 mL (HisTrap), previamente equilibrada con 50 mL del amortiguador de unión y a 4ºC.
La columna se lavó con 150 mL de amortiguador de lavado (10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 0,5 M de
NaCl, 5% de glicerol, 10 mM de β-mercaptoetanol, y 30 mM de imidazol) y la proteína se eluyó
con 20 mL del amortiguador de elución (10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 0,5 M de NaCl, 5% de
glicerol, 10 mM de β-mercaptoetanol, y 250 mM de imidazol). En la elución se obtienen fracciones
de 1 mL cada una, las cuales fueron analizadas mediante medición de actividad, para determinar las
fracciones que poseían la enzima.
Las fracciones que poseían actividad piridoxal quinasa se juntaron y se dializaron contra
una solución de 2 L, que contenía 50 mM de Tris-HCl pH 7.5, 5% de glicerol y 10 mM de
β-mercaptoetanol, durante toda la noche. Inmediatamente se procedió a concentrar la proteína
usando un Centriplus, previa adición de 5 mM de MgCl2 y 10 mM de DTT. La concentración de
proteína fue estimada en base al ensayo de Bradford (Bradford, 1976). Cuando la proteína alcanzó
una concentración de 2 mg/mL se almacenó en 50% de glicerol y a -20ºC.
Para comprobar la pureza de la proteína se realizó un gel SDS-PAGE al 11,5% con su
respectivo estándar de peso molecular.
3.10 Estimación del coeficiente de extinción molar de PLP
Se realizó este ensayo para poder relacionar, según la Ley de Lambert-Beer, el cambio de
absorbancia a la longitud de onda de 388 nm con la cantidad de PLP formado y, por lo tanto, con las
unidades enzimáticas (U) de proteína, las cuales definimos como la cantidad de nanomoles de PLP
producidos por minuto.
Este ensayo se elaboró a pH 6,5 y 37° C para que los resultados obtenidos sean consistentes
con las condiciones del medio que se utilizarán para medir la actividad enzimática. En la literatura
14
sólo se encuentra información cuando se trabaja a pH 7,0, donde el coeficiente de extinción molar
es 4900 M-1cm-1 (Sober, 1970).
Se hicieron muestras en triplicado de PLP a distintas concentraciones, usando 20 mM de
amortiguador PIPES a pH 6,5 y abarcando un rango de concentraciones de 0 a 0,25 mM de PLP.
Las muestran se midieron en el espectrofotómetro Hewlett Packard 8453 a 388 nm y a 37° C.
3.11 Determinación de las condiciones para la medición de la actividad enzimática de
hPLK
Para medir la actividad enzimática, se usó un método espectrofotométrico directo, en el cual
se cuantifica la cantidad de PLP formado a 388 nm, 37ºC y durante 3 minutos (Churchich y Wu,
1981).
Se ejecutaron ensayos, donde se variaron concentraciones de moléculas que se usaron en el
medio de reacción para observar el efecto en la estabilidad de la señal de la absorbancia a 388 nm
en ausencia de la reacción enzimática. Por un lado, se mantuvo el PL constante a una concentración
de 0,1 mM y se observó como cambió la absorbancia a 388 nm en ausencia y presencia de 1 mM de
ZnCl2. Posteriormente el PL se mantuvo a una concentración de 0,5 mM y se observó como varió la
absorbancia a 388 nm en ausencia y presencia de 1 mM de ZnCl2. Además, en una solución que
tenía las concentraciones antes descritas de PL y ZnCl2, se añadió 0,5 mM de ATP, para ver el efecto
de este último sobre la absorbancia a 388 nm. Finalmente, se mantuvo la concentración de PL a 1
mM y se observó la variación de la absorbancia a 388 nm en ausencia y presencia de 1 mM de
ZnCl2.
La medición de la actividad enzimática se determinó a pH 6,5, el cual está en el rango de
pH óptimo de la proteína y es el usado en la mayoría de los trabajos (Lee y cols., 2000; Lum y cols.,
2002). Se prefirió el uso de 20 mM de amortiguador PIPES, por sobre otros amortiguadores, como
es el caso del amortiguador fosfato (refiérase a la sección 4.2.4).
3.12 Mezcla de reacción para la medición de actividad enzimática
Esta mezcla se utiliza para determinar la actividad de hPLK en los procesos de purificación,
la cual contenía 20 mM de amortiguador PIPES, pH 6,5, 2,5 mM de PL, 2,5 mM de ATP y 0,5 mM
de ZnCl2, la que se incuba durante 10 minutos a 37ºC y luego se comienza la reacción adicionando
la enzima.
3.13 Efecto de distintos Me+2 en la actividad de hPLK
Se utilizaron varios cationes divalentes en 3 concentraciones distintas, 0,1 mM, 0,5 mM y
1,5 mM. Los Me+2 usados son Zn+2, Cd+2, Mg+2, Mn+2, Cu+2, Ni+2, Ca+2 y Co+2. La mezcla de
15
reacción constó de 3,5 mM de PL, 0,5 mM de ATP y 20 mM de amortiguador PIPES pH 6,5. Se
usaron 5 µg de proteína (0,18 µM).
3.14 Curva de pH para hPLK
Se generó una curva variando el pH entre 4,0 y 10,0 con los siguientes amortiguadores:
Acetato (pH 4,0 - 5,5), Citrato (pH 4,0 – 5,5), MES (pH 6,1), PIPES (pH 6,1 – 7,5), HEPES (pH 6,8
– 8,2), Tris-HCl (pH 6,8 – 8,2) y Carbonato (8,9 – 10,0). Los amortiguadores MES, PIPES y
HEPES corresponden a Good Buffers, quienes cumplen 9 reglas impuestas por el grupo de Norman
Good, (1966), entre las cuales se encuentran que el pKa se encuentre entre 6 y 8, que tengan
máxima solubilidad en agua, que produzcan un mínimo efecto por presencia de sales, por la
concentración del amortiguador y por temperatura, y que tengan gran estabilidad (Good y cols.,
1966). Todos los amortiguadores se usaron a una concentración final de 20 mM y en presencia de
2,5 mM de PL, 2,5 mM de ATP, y 0,5 mM de Zn+2 total y 5 µg de proteína.
3.15 Cálculo de las concentraciones de las especies presentes en solución
Para obtener las concentraciones reales de las distintas especies que se forman en solución,
al encontrarse presente Zn+2 y ATP-4, se debió tener en cuenta las reacciones que ocurren en el
medio, sus constantes de asociación (Ka), que corresponden a datos obtenidos usando soluciones a
37ºC (véase Tabla 1) (Abercrombie y Martin, 1980), y el pH de la solución (Cornish-Bowden,
1995). Poseyendo esos datos se podrán obtener las constantes cinéticas de la enzima, la Km para los
sustratos PL y ZnATP-2 y la kcat, en las condiciones que se establezcan.
Ka (M-1)
Zn+2 + HATP-3 ZnHATP- 3,95x102
Zn+2 + ATP-4 ZnATP-2 5,47x104
H+ + HATP-3 H2ATP-28,12x103
H+ + ATP-4 HATP-3 1,03x107_________________________________________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________
Tabla 1
Constantes de asociación de complejos formados por Zn+2 y ATP-4
Reacción
El principio en que se basó el cálculo de especies es el siguiente: Se considera una mezcla
de m complejos diferentes formados por la asociación de n componentes diferentes. La
concentración total Ai del componente i es la suma de su concentración libre ai y las
concentraciones xj de los m complejos, donde cada uno de los últimos es multiplicado por αij que es
16
el número de moléculas o iones del componente i contenido en una molécula o complejo.
La concentración xj del complejo j puede ser expresada en términos de las concentraciones
libres de los componentes y la constante de asociación Kj, para su formación desde los componentes
libres.
Al sustituir la Fórmula 2 en la Fórmula 1 se obtiene
Que puede ser reordenada para expresar las concentraciones libres ai en términos de la
concentración total Ai
Esta fórmula se debe utilizar de manera iterativa (f, f+1, f+2, …,f+n) hasta encontrar una
solución que se considere satisfactoria, esto es, hasta que las ecuaciones de la iteración f+n
concuerden en al menos 99,99% en su resultado con las de la iteración f+n-1, lo cual debe estar
presente en todas las ecuaciones de la iteración f+n.
Una vez que las concentraciones de las especies en estado libre son conocidas con
exactitud, esto es, las de Zn+2 y ATP-4, se puede calcular la concentración de cada complejo
directamente con la Fórmula 3. Los protones se consideran constantes, debido a que se trabaja en
soluciones con amortiguador de pH.
Todo lo descrito anteriormente fue realizado en el programa Scilab 4.1.2
(http://www.scilab.org/), en el cual se escribió el código del ejecutable especies.sci (véase Figura 5).
Como entrada de información se solicita la concentración inicial de Zn+2 total, y la concentración
inicial de ATP-4 y el pH, mientras que como salida del proceso, se muestran los resultados de las
concentraciones de Zn+2 libre, ATP-4 libre, ZnATP-2 y HATP-3. Finalmente, es importante destacar
que el código puede ser totalmente editado, en caso de que se quiera utilizar para otras especies.
Fórmula 4
Fórmula 1
Fórmula 3
Fórmula 2
17
Figura 5: Código del programa ejecutable, especies.sci. Escrito en Scilab 4.1.2, genera una completa información acerca de las especies que se encuentran en solución, dependiendo del pH. En color verde se muestran los comentarios que explican las distintas variables.
3.16 Estimación de parámetros cinéticos de hPLK
Las constantes cinéticas fueron calculadas suponiendo una condición de estado
estacionario, por lo cual todos los resultados se ajustan a la ecuación de Michaelis-Menten, usando
//Archivo : especies.sci//Proyecto : Trabajo de título de Bioquímico//Autor : Lic. Bqca. Freddy Rodrigo Navarro Gajardo//Fecha : Marzo 2010////Conversión// x(1) = Zn+2
// x(2) = ATP-4
// x(3) = HATP-3
// x(4) = H+
// x(5) = ZnATP-2
// x(6) = H2ATP-2
// x(7) = ZnHATP-
//// Reacción K a // Zn+2 + HATP-3 ZnHATP - 3.95*1e 2 = K(1) // H+ + HATP -3 H 2ATP-2 8.12*1e 3 = K(2)// Zn+2 + ATP-4 ZnATP -2 5.47*1e 4 = K(3)// H+ + ATP-4 HATP -3 1.03*1e 7 = K(4)//function especies clc; banner(); tolerancia=1-0.9999; X=ones(1,7)*1e-12; K(1)=3.95*1e2; K(2)=8.120*1e3 ; K(3)=5.47*1e4; K(4)=1.03*1e7; concentraciones=['Zn';'ATP';'pH' ]; concent=x_mdialog('Concentraciones Inicicales (mM)',concentraciones,['0.5';'2.5';'6.5']); X(1)=evstr(concent(1))*1e-3 ; X(2)=evstr(concent(2))*1e-3 ; X(4)=10^(-evstr(concent(3))) ; x=X; aux=x; x(7)=K(1)*x(1)*x(3); x(6)=K(2)*x(3)*x(4); x(5)=K(3)*x(1)*x(2); x(3)=K(4)*x(2)*x(4); x(2)=x(2)*X(2)/(x(2)+x(3)+x(5)+x(6)+x(7)); x(1)=x(1)*X(1)/(x(1)+x(5)+x(7)); while max(abs(x-aux)./x)>tolerancia aux=x; x (7)=K(1)*x(1)*x(3); x (6)=K(2)*x(3)*x(4); x (5)=K(3)*x(1)*x(2); x (3)=K(4)*x(2)*x(4); x (2)=x(2)*X(2)/(x(2)+x(3)+x(5)+x(6)+x(7)); x (1)=x(1)*X(1)/(x(1)+x(5)+x(7)); end concent_fin=['Zn+2 : ' ;'ATP-4 : ' ;'HATP-3 : ';'ZnATP-2 : '] ; format('e',10); concent_val=string([x(1);x(2);x(3);x(5)]*1e3)+[' (mM)' ;' (mM)' ;' (mM)' ;' (mM)' ]; x_message(concent_fin+concent_val);endfunction
18
regresión no lineal.
v representa la velocidad inicial en la catálisis, Vmax representa la velocidad máxima en la
catálisis, [S] es la concentración del sustrato y Km es la constante de Michaelis. Para obtener la Km
para PL, se varió progresivamente la concentración de este sustrato, dejando constante las demás
especies; para la Km de ZnATP-2 se mantiene constante PL y Zn+2, variando progresivamente
ZnATP-2. Sin embargo, esta condición es imposible de obtener, ya que no se pueden independizar de
ningún modo las especies ZnATP-2, HATP-3, ATP-4 y Zn+2. Las especies ZnHATP- y H2ATP-2 se
obviarán, ya que se forman en una cantidad despreciable, respecto a las otras especies en solución.
La constante catalítica (kcat) de la enzima se resuelve según la definición de ésta en
condición de estado estacionario, es decir:
Donde Et es la concentración de enzima total. Todos los ensayos se realizaron usando 20
mM de amortiguador PIPES pH 6,5 y 5 µg de proteína (0,18 µM).
3.17 Determinación del efecto de las especies presentes sobre la actividad de hPLK
Si se cambia la concentración de ATP-4, ineludiblemente va a cambiar la de HATP-3 de
manera directa, es decir, si aumenta una especie, la otra también. Por otro lado, si se desea mantener
el ZnATP-2 constante, las otras especies, esto es, Zn+2 libre, ATP-4 y HATP-3 también lo hacen. Si se
mantiene constante el Zn+2 libre, varían el ZnATP-2, el ATP-4 y el HATP-3, y si se desea mantener
constante el ATP-4 o el HATP-3 varían el Zn+2 libre y el ZnATP-2. Es decir, en todos los casos antes
mencionados va a existir más de una variable en el ensayo, por lo que es imprescindible conocer las
concentraciones de todas las especies presentes.
En primer lugar, se realizó un ensayo en el cual se fue variando progresivamente la
concentración de ATP y ZnCl2, siempre con un exceso de ATP sobre ZnCl2, en una relación 5:1, a
pH 6,5 con 20 mM de amortiguador PIPES y a pH 8,0 con 20 mM de amortiguador HEPES. En
segundo lugar, se mantiene constante el ZnATP-2 y se varían el Zn+2 libre, el ATP-4 y el HATP-3,
usando 20 mM de amortiguador PIPES a pH 6,5. Todos los ensayos fueron hechos en presencia de 5
µg de proteína y con concentración constante de PL en 2,5 mM.
Fórmula 6
Fórmula 5
19
3.18 Ensayos de inhibición por Zn+2 libre sobre la actividad de hPLK
En primer lugar, se varió el ZnATP-2, manteniéndose el Zn+2 libre constante. Se generaron
distintas condiciones, donde en cada una de ellas se usaba una concentración de Zn+2 libre distinta,
que varió entre 19 µM, y 79 µM. Todos estos ensayos fueron hechos en presencia de 2,5 mM de PL,
20 mM de amortiguador PIPES pH 6,5 y 5 µg de proteína.
En segundo lugar, se analizó el efecto de distintas concentraciones de Zn+2 libre, sobre la
actividad de hPLK, variando también el PL. Para esto, se aumenta progresivamente el PL, con una
cantidad constante de Zn+2 libre, que seguidamente se modifica para crear varias condiciones de
Zn+2 libre, entre 19 y 92 µM. Los ensayos se realizan con ZnATP-2 constante a 480 µM, 20 mM de
amortiguador PIPES pH 6,5 y 5 µg de proteína.
Los datos son analizados mediante el programa DynaFit 3.28 (Kuzmic, 1996,
http://www.biokin.com/dynafit/), el cual ejecuta regresiones no lineales por mínimos cuadrados de
los datos experimentales, suponiendo una condición de equilibrio rápido. A través del programa se
pusieron a prueba tres modelos de inhibición enzimática, los cuales se denominaron modelo de
inhibición mixto-parcial, modelo de inhibición mixto-total y modelo de inhibición competitiva
(véase Figura 6), en los que se observa que las constantes de equilibrio que explican las reacciones
involucradas con el inhibidor poseen los factores α y β, quienes dan cuenta del efecto que provoca
el inhibidor sobre las constantes de equilibrio. Es importante señalar que al ingresar al programa las
concentraciones de Zn+2 libre como inhibidor, éstas deben ser hechas tomando en cuenta que a 19
µM es cuando comienza a actuar éste como inhibidor, por lo cual esta concentración debe ser
considerado como 0 µM de inhibidor, y a todas concentraciones que siguen de Zn+2 libre, se les
debe restar esa cantidad.
Una vez ejecutado el programa, con todos los datos experimentales cargados, éste genera un
análisis de discriminación de modelos, que se basa en el criterio de información de Akaike, el cual
es una medida de la bondad de los ajustes a determinados modelos (Kuzmic, 1996). Para
discriminar entre los distintos modelos, el criterio de información de Akaike normaliza las
probabilidades relativas, lo que es denominado peso de Akaike (w), el que puede ser interpretado
como el peso que evidencia que un modelo en particular es el mejor, dado los datos y el conjunto de
modelos. Lo siguiente fue recopilar los datos de las constantes que se obtienen a partir del análisis
del modelo que mejor se ajusta.
La inhibición provocada por Zn+2 libre variando PL se debió analizar con un modelo de
inhibición adicional (refiérase a Figura 21C).
20
Figura 6: Esquemas de modelos de inhibición enzimática. Los 3 modelos con que se evaluarán los datos experimentales, donde E es enzima, S es sustrato, I es inhibidor, P es producto, EI es el complejo enzima-inhibidor, ES es el complejo enzima-sustrato, EIS es el complejo enzima-inhibidor-sustrato, Ks, αKs, Ki y αKi son las constantes de equilibrio de las respectivas reacciones, kp es la constante catalítica y βkp es la constante catalítica donde el inhibidor permanece unido a la enzima. (A) Es el modelo de inhibición mixto-parcial, (B) es el modelo de inhibición mixto-total y (C) es el modelo de inhibición competitiva.
3.19 Fluorescencia intrínseca de hPLK
El objetivo de los ensayos de fluorescencia intrínseca fue observar la unión Zn+2 libre con la
proteína, además del efecto que pudiesen generar los sustratos sobre la fluorescencia intrínseca de
hPLK.
La proteína se excita a una longitud de onda de 295 nm (excitación de triptofano) y se
efectúa un barrido en el espectro de emisión entre las longitudes de onda de 300 y 450 nm. Las
ranuras del monocromador de excitación y del de emisión se mantuvieron en 5 nm. Se usaron 80 µg
de proteína, 20 mM de amortiguador PIPES pH 6,5 pasado por Chelex 100 y 7 mM de DTT. El
máximo de emisión se encontró a 337 nm.
Inicialmente, se buscaron las condiciones donde el espectro de emisión de la proteína no
varíe en el tiempo, por lo cual se probó el efecto del β-mercaptoetanol y del DTT. Una vez
encontrada las condiciones apropiadas, esto es, 7 mM de DTT, se buscó observar cambios en el
espectro de emisión de la proteína en distintas condiciones, las cuales son: (1) agregando ATP, (2)
agregando ZnCl2, (3) agregando ATP y luego ZnCl2, y (4) agregando ZnCl2 y luego ATP.
Además, se debe tener en cuenta que en solución, el Zn+2 y el DTT forman complejos, por
lo cual, los cálculos deben tener en consideración tales datos (véase Tabla 2). No existe información
C
E + S ES E + P+ +I I
EI + S EIS EI + P
Ki αKi βkp αKs
kp KsA
E + S ES E + P+ +I I
Ki αKs
EI + S EIS
kp Ks
αKi
Kskp
E + S ES E + P+I
Ki
EI
B
21
de las constantes de equilibrio de tales reacciones, pero sí, un trabajo hecho por el grupo de Krezel
(Krezel y cols., 2001), donde titulan Zn+2 con DTT. A partir de esos datos se calcularon las Ka para
las ecuaciones 1 y 2 de la Tabla 2 a pH 6,5, con análisis numéricos, mediante el método de
bisección. A partir de los datos obtenidos se obtiene el Zn+2 que se encuentra disponible para unirse
a hPLK.
Finalmente, se calcula la constante de unión (Kd) de hPLK con Zn+2, ajustando los datos
experimentales a una curva hiperbólica.
3.20 Análisis de datos
Los datos, los gráficos y las regresiones lineales como no lineales, se realizaron usando el
programa Sigma Plot 10.0. El análisis digital de los geles SDS-PAGE se efectuó mediante el
programa Gel-Pro Analyzer 3.1.00.
1) Zn+2 + DTT- ZnDTT + H+
2) 3Zn+2 + 4DTT- Zn3DTT4 + 2H+
3) Zn+2 + hPLK Zn-hPLK + 2H+
4) ZnDTT + Zn3DTT4 + 5H+ + Zn-hPLK
Reacciones al equilibrio para la formación
Tabla 2
5Zn+2 + 5DTT- + hPLK
de los complejos de Zn+2, DTT- y hPLK
22
IV. RESULTADOS
4.1 ANALISIS BIOINFORMATICO
4.1.1 Alineamiento estructural
Entre todas las estructuras encontradas (véase Tabla 3), 4 corresponden a PLK en estado
apo, las cuales son de las siguientes fuentes: O. aries (PDB: 1LHP), E. coli PDXK (PDB: 2DDM)
E. coli PDXY (PDB: 1VI9) y el sujeto de búsqueda que pertenece a H. sapiens (PDB: 2AJP).
La superposición estructural fue excelente, donde el Qres de gran parte de la estructura es
cercana a uno. La estructura terciaria de estas quinasas está muy conservada, observándose
variaciones en algunos loops (véase Figura 7A).
PDB id Enzima Organismo Ligandos
2yxt PLK H. sapiens fosfato
2yxu PLK H. sapiens ATP, Mg+2, fosfato
2ajp PLK H. sapiens Mg+2
1lhp PLK O. aries -
1lhr PLK O. aries ATP, Zn+2
1rft PLK O. aries ACP, PM, Zn+2
1rfu PLK O. aries ADP, PLP, Zn+2
1rfv PLK O. aries ADP, Zn+2
1ygj PLK O. aries roscovitina
1ygk PLK O. aries roscovitina
1yhj PLK O. aries roscovitina
1vi9 PLK PDXY E. coli -
1td2 PLK PDXY E. coli PL
2ddm PLK PDXK E. coli -
2ddo PLK PDXK E. coli ATP, Mg+2, fosfato2ddw PLK PDXK E. coli PL
2i5b PLK PDXK B. subtilis ADP
1ub0 HMPPK T. thermophilus -
Tabla 3
Estructuras encontradas en la base de datos de PDB
En negrita se destacan las cuatro estructuras seleccionadas. ACP (adenosin-5’-[β,γ-metilen]-trifosfato es un análogo de ATP.
23
Figura 7: Alineamiento estructural de las PLK. Representaciones de las estructuras proteicas donde las hebras β y las hélices α son representadas mediante cintas. (A) Las estructuras de PLK de O. aries, H. sapiens y E. coli PDXY y PDXK se encuentran superpuestas. El color azul denota la mayor similitud, en tanto que el rojo, menor similitud, respecto del ambiente de un residuo de una proteína particular, en relación al ambiente del mismo residuo de las otras proteínas. Se resaltan los elementos estructurales β10 y α9 para ubicarse espacialmente en las estructuras. En (B) se resaltan las zonas con baja similitud estructural entre las PLK, usando como estructura base la de PLK de H.
sapiens. Las zonas con baja similitud en las proteínas son diferenciadas según el color: (▬) H.
sapiens, (▬) O. aries, (▬) PDXK de E. coli y (▬) PDXY de E. coli. Se nombran algunos loops para ubicarse espacialmente en las estructuras.
Una diferencia importante observada en las estructuras se encuentra en el loop formado
entre los elementos estructurales β5 y α4 (véase Figura 7B). En hPLK y en PDXK de E. coli, estas
estructuras se encuentran en una posición similar y tienen 2 pequeñas hebras β, las que en hPLK se
han denominado β5a y β5b (superestructura secundaria β-loop-β) (Cao y cols., 2006). No obstante,
difieren en el tamaño, ya que en hPLK la cantidad de aminoácidos involucrados es 12, mientras que
en PDXK existen 9 residuos. Por otra parte, en las estructuras de las otras dos proteínas, vale decir
en la de O. aries y PDXY de E. coli, el loop no presenta hebras β, y además se encuentran en
distintas posiciones, si se compara cada una con relación a las demás.
El loop que se encuentra entre los elementos estructurales β7 y β8 también presenta
diferencias, ya que por un lado se encuentra ausente en PDXK de E. coli, mientras que por el otro,
la similitud estructural entre las proteínas de O. aries y H. sapiens es mediana, aún cuando los
residuos son prácticamente los mismos. En el caso de PDXY de E. coli, no existe similitud de
secuencia con las anteriores, y la conformación del loop es claramente distinta (véase Figura 7B).
Además, entre los elementos estructurales β8 y β9, existen diferencias principalmente en el
tamaño del loop, donde en O. aries se observa el de mayor longitud (7 residuos), seguido por H.
sapiens (5 residuos), mientras que los de E. coli son menores (4 residuos), aunque la similitud
estructural de las dos últimas es alta. Entre los elementos estructurales α7 y α8, los eucariontes
poseen dos residuos adicionales, en relación a las proteínas de bacterias.
A B
β10
α9
α8-α9
β5-α4
β7- β8
1 0
24
Finalmente, desde el término de α8, hasta el inicio de α9, existe una gran diferencia en
cuanto a la longitud de este loop, ya que en eucariontes se contabilizan 14 residuos, mientras que en
procariontes, sólo 1. No obstante, la superposición estructural en esta región es bastante alta cuando
se comparan entre proteínas que pertenecen a organismos del mismo dominio taxonómico (véase
Figura 7B).
4.1.2 Alineamiento múltiple de secuencias
El resultado de la búsqueda en la base de datos nr mediante el algoritmo PSI-BLAST y el
uso de dos iteraciones por sujeto de búsqueda, arroja una cantidad considerable de secuencias
proteicas (alrededor de 900), las cuales en su mayoría pertenecen a las quinasas sin dominio menor
de la superfamilia de la riboquinasa, y las restantes corresponden a otros miembros de la
superfamilia.
Entre las PLK se encontraron representantes de los dominios de eucariontes y bacterias, no
así de arqueas. Para comprobar que no existían secuencias aminoacídicas de PLK en el dominio de
las arqueas, se realizó una búsqueda adicional en la literatura existente, a través de las base de datos
Scirus (http://www.scirus.com/) y PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/), sin embargo, no
existen referencias acerca de la presencia de esta proteína en este dominio. Además se encontraron
muchas secuencias redundantes, especialmente en los filos de las proteobacterias y los cordados,
por lo cual se fue refinando la cantidad de secuencias usadas, hasta quedar con 83 secuencias.
En el alineamiento múltiple de secuencias se observan tres motivos conservados, dos de los
cuales también se han descrito en la superfamilia de la riboquinasa (Maj y cols., 2002; Parducci y
cols., 2006; Zhang y cols., 2004). Estos son: el motivo NXXE que se encuentra entre las posiciones
92 y 95 del alineamiento y GXGD que se encuentra entre las posiciones 126 y 129. El tercer motivo
conservado es DPV, que se encuentra entre las posiciones 66 y 68 del alineamiento múltiple. En el
motivo NXXE, se observa que figuran la glutamina y la fenilalanina como los residuos
representados con X, mientras que en el motivo GXGD, X es representado principalmente por
treonina en eucariontes, y por residuos hidrofóbicos en procariontes (véase Figura 8). El aspartato
del motivo GXGD es sustituido por cisteína en las secuencia de PLK de Bacillus subtilis y de
HMPPK, mientras que la valina del motivo DPV, es sustituido por isoleucina en la secuencia de
PLK de Brachyspira hyodysenteriae (datos no mostrados).
Otros residuos altamente conservados son: S5 (sólo falta en la secuencia de PLK de
Clostridium sp), G7, P12 (sólo falta en B. subtilis y en HMPPK), S24 (sólo falta en Tribolium
castaneum y en HMPPK), G45 (sólo falta en HMPPK) y P91. En el alineamiento de secuencias de
la Figura 8 se muestran adicionalmente otros residuos muy conservados.
25
Figura 8: Alineamiento múltiple de secuencias proteicas. Se seleccionaron secuencias representativas del alineamiento múltiple, esto es, cuatro representantes de los eucariontes (H.
sapiens, D. erecta, S. tuberosum y L. braziliensis), cuatro de bacterias PDXK (E. albertii, B.
pertussis, S. maltophila y R. palustris) y ocho de bacterias PDXY (P. distanosis, S. sputigena, P.
mobilis, B. burgdorferi, E. coli, V. harveyi, S. tropica y D. geothermalis). Las letras representan los aminoácidos, según el código de una letra. Las columnas con fondo negro representan residuos totalmente conservados y las columnas con fondo gris representan residuos altamente conservados. Los números en la parte superior de indican la posición de los residuos en el alineamiento. Se destacan en un recuadro rojo los motivos conservados.
4.1.3 Construcción de árbol filogenético
El árbol filogenético obtenido a través del programa Mr. Bayes, se ajustó al modelo de
velocidad denominado Wag, que usa una matriz de mutaciones de aminoácidos hecha a partir de
datos obtenidos de 3095 secuencias proteicas, que corresponden a 182 familias de proteínas
(Whelan y Goldman, 2001). Luego de realizar dos millones de iteraciones ( se seleccionaron 15000
árboles propuestos) y alcanzar un promedio de desviación estándar de frecuencias de separación
menor a 0,01, se registra una clara diferenciación entre los grupos que se forman.
Se observa que la secuencia de PLK de B. subtilis es la que se encuentra más cercana a la de
HMPPK. La próxima divergencia muestra a una serie de secuencias de homólogos cercanos de PLK
PDXY de bacterias pertenecientes a los filos: firmicutes, bacteroidetes, espiroquetales, termotogales
y fusobacterias, que en su conjunto denominaremos PDXY-1. Posteriormente, se observa una
26
divergencia entre secuencias de PLK de bacterias y de eucariontes, a lo que le sigue una divergencia
entre las secuencias de bacterias, la cual ha sido descrito anteriormente (Yang y cols., 1998), donde
uno de los grupos corresponde a homólogos cercanos de PLK PDXK de E. coli y el otro grupo
pertenece a homólogos cercanos de PLK PDXY de E. coli (que denominaremos PDXY-2), según
los genes que codifican a las proteínas (pdxK y pdxY) (véase Figura 9).
De manera interesante, el gen pdxK sólo lo poseen las proteobacterias, mientras que el gen
pdxY se encuentra en todos los filos de bacterias usados para el alineamiento.
En cuanto al dominio de los eucariontes, se observa que los dos grupos más antiguos
corresponden a organismos que pertenecen al reino conocido comúnmente como protistas.
Posteriormente, se encuentra el linaje de las estreptófitas, para terminar con los artrópodos,
placozoos y cordados que corresponden al reino metazoa o animal, indicado como el reino más
nuevo de este dominio.
Otro punto importante es que las secuencias proteicas de PDXY de gamaproteobacterias,
poseen diferencias en posiciones conservadas del alineamiento, con respecto al resto de las PDXY
que no sean de gamaproteobacterias (datos no mostrados).
Figura 9: Árbol filogenético de las PLK. (A) Representado como un árbol circular y en (B) Representado como un filograma (página siguiente), en el cual se muestra la probabilidad posterior de las divergencias que nacen en los nodos. En el nodo final se muestra el nombre de la especie y finalmente se muestran las especies agrupadas en filos. La escala representa sustituciones por sitio. En un recuadro rojo se enmarca a hPLK. (▬) Corresponde al clado de bacterias con proteína PDXY-1, (▬) es el clado de bacterias con proteína PDXK, (▬) es el clado de bacterias con proteína PDXY-2 y (▬) es el clado del dominio de los eucariontes.
A
27
Firmicutes
Bacteroidetes
Espiroquetas
Fusobacterias y Termotogales
Proteobacterias
Proteobacterias
Actinobacterias
Cordados
Placozoos
Artrópodos
Estreptófitos
Cinetoplastidos Tricomonadas
Deinococos- thermus
B
28
Al agrupar a las secuencias proteicas en sus 4 clados principales, esto es, si pertenecen a
eucariontes, a bacterias con la proteína PDXK, o a los dos clados que poseen a las bacterias con la
proteína PDXY (que se denominan PDXY-1 y PDXY-2), se observan que ciertas posiciones
conservadas en un clado, no necesariamente se encuentran conservados en los otros clados, o que se
encuentren conservados en algunos, pero no en todos los clados.
El clado que posee más conservación de posiciones sin compartir es el PDXK. Los clados
que comparten más posiciones conservadas entre ellas son las que se denominan PDXY-2 y
eucariontes. Entre todas las PLK se contaron 18 posiciones conservadas (véase Tabla 4).
A modo didáctico se muestra un diagrama con los pasos que se siguieron para obtener el filograma
de las PLK (véase Figura 10).
Grupo 1 se refiere a las posiciones conservadas entre PDXY-1, PDXK y PDXY-2. Grupo 2 corresponde a las posiciones conservadas entre PDXK, PDXY-2 y eucariontes. Grupo 3 consiste a las posiciones conservadas de todas las secuencias.
Figura 10: Esquema resumen del análisis bioinformático: Se muestran todos los pasos que se siguieron para realizar el árbol filogenético.
Estructuras SecuenciasPSI-BLAST
STAMP Alineamiento estructural HMPPKFirmicutes
H. sapiens EspiroquetasO. aries Deinococos
PDXK E. coli ActinobacteriasPDXY E.coli Proteobacterias
Eucariontes
ClustalX Perfil 1 Perfil 2
Alineamiento de secuencias
Mr. Bayes Arbolfilogenético
PDXY 1 PDXK PDXY 2 Eucariontes
PDXY 1 8 3 2 0PDXK 3 18 3 2
PDXY 2 2 3 5 9Eucariontes 0 2 9 9
Grupo 1Grupo 2Grupo 3
Tabla 4
Cantidad de posiciones conservadas en el alineamientomúltiple de secuencias, en relación a los clados encontrados
15
18
29
4.2 ANÁLISIS CINÉTICO
4.2.1 Ensayo de expresión en la transformante BL21-p24a-hPLK
A pesar de las distintas condiciones de inducción, no se aprecia en los geles de SDS-PAGE
una banda cuya intensidad se incremente debido al tiempo de inducción y a la concentración de
IPTG (véase Figura 11A). No obstante, es posible detectar incremento en la actividad enzimática,
donde la actividad piridoxal quinasa es mucho mayor en una transformante que posee el vector, que
en una cepa no transformada y, además, se percibe una actividad mayor a 24 horas, en relación a los
tiempo 0 y 4 de inducción, donde en estos últimos no se visualiza diferencia (véase Figura 11B).
Al ver que los datos obtenidos del gel SDS-PAGE y de actividad enzimática no indicaban
diferencias entre usar 0,5 mM o 1 mM de IPTG, se optó por seguir la purificación recomendada por
Ismail y colaboradores del Structural Genomic Consortium, donde se induce con 1 mM de IPTG y
durante 24 horas (Ismail y cols., 2005).
Figura 11: Inducción de hPLK con IPTG desde la transformante BL21-p24a-hPLK. (A) Gel SPS-PAGE cuyos carriles muestran la cantidad de IPTG que se usa y el tiempo en horas de inducción, acompañado con los pesos moleculares en KDa del marcador estándar. En un recuadro rojo se destaca donde se espera la aparición de la banda que represente a hPLK. Los carriles indican: 1: estándar de bajo peso molecular; 2: antes de la inducción con IPTG; 3: 0,5 mM de IPTG a las 2 horas; 4: 0,5 mM de IPTG a las 4 horas; 5: 0,5mM de IPTG a las 6 horas; 6: 0,5 mM de IPTG a as 24 horas; 7: 1 mM de IPTG a las 2 horas; 8: 1 mM de IPTG a las 4 horas; 9: 1 mM de IPTG a las 6 horas; 10: 1 mM de IPTG a las 24 horas. En un recuadro rojo se muestra donde debería encontrarse la banda de hPLK. (B) Actividad específica de hPLK a distintos tiempos de inducción, en presencia de 0,5 mM de IPTG (■) o 1 mM de IPTG (■).
4.2.2 Purificación de hPLK de la transformante BL21-p24a-hPLK.
La purificación de hPLK con el marcador His permite rendimientos muy altos, debido al
A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tiempo de Inducción, horas0 4 24
Act
ivid
ad e
spec
ífica
, U/m
g
0
200
400
600
800
1000
120066 →
45 →
36 →
29 →24 →
20 →
14,2 →
PM
30
uso de una columna de afinidad. Se observa un incremento de 36,7 veces de actividad específica,
respecto al extracto crudo. El paso de la muestra por la columna de DEAE no generó un cambio en
la actividad específica, con respecto a la que se manifiesta en el extracto crudo. Por otro lado, se
logró purificar la enzima por sobre el 90%, lo cual es aceptable para los ensayos a realizar y el peso
molecular se estableció en 35,7 KDa (véase Figura 12 y Tabla 5).
Figura 12: Purificación de hPLK. Se muestran las imágenes de los geles SDS-PAGE de la purificación de hPLK de la transformante BL21-p24a-hPLK, junto con el detalle del peso molecular en KDa al lado izquierdo de la imagen. En un recuadro rojo se indica la proteína deseada. Los carriles del gel corresponden a 1: estándar de bajo peso molecular; 2: extracto crudo; 3: DEAE; 4: proteína purificada por la columna de níquel. En cada carril se cargan 15 µg de proteína total.
Proteína total U totales Act. específica Purificación Rendimiento(mg) (nmol/min) (U/mg) (veces) %
Ext. Crudo 317 557,8 1,8 1 100DEAE 315 554,5 1,8 1 99,4Níquel 8,1 525 64,7 36,7 94,1
Tabla 5
Purificación de hPLK desde la transformante BL21- p24a-hPLK
Las mediciones de actividad se hacen según lo descrito en la sección 3.12. La columna de Proteína total muestra la cantidad de proteína encontrada luego de los distintos pasos de purificación. U totales representan las unidades enzimáticas totales. La actividad específica es una relación entre las unidades enzimáticas totales y la proteína total (U/(proteína total)). El concepto de purificación se refiere a una normalización de la actividad específica, donde se asigna arbitrariamente un valor de 1. El rendimiento es un porcentaje de las unidades enzimáticas totales de cada paso, donde el 100% corresponde a las U del extracto crudo. Ext. Crudo se refiere a extracto crudo, DEAE se refiere al eluído de la muestra por la columna de DEAE y Níquel corresponde a la elución obtenida de la columna de afinidad.
1 2 3 4
66 →
45 →
36 →29 →24 →
20 →
14,2 →6,5 →
PM
31
4.2.3 Estimación del coeficiente de extinción molar de PLP
Inicialmente se buscaron las concentraciones de PLP cuya absorbancia a 388 nm estén
dentro del límite de detección del espectrofotómetro y que además exista linealidad entre la
concentración de PLP y la absorbancia a 388 nm. Por lo anterior, se usó un rango de
concentraciones de 0 a 0,25 mM de PLP. Finalmente se obtuvo un coeficiente de extinción molar
para PLP correspondiente a 2687,5 M-1cm-1, dato que se utilizará de aquí en adelante para calcular
la actividad específica de la enzima (véase Figura 13).
Figura 13: Estimación del coeficiente de extinción molar de PLP a pH 6,5 y 37° C. Los ensayos se realizaron en triplicado. El coeficiente de extinción molar se obtiene a partir de la pendiente.
4.2.4 Estandarización de condiciones para medición de actividad enzimática
En un principio se buscó cambiar el amortiguador, ya que en la literatura se usa
principalmente el amortiguador fosfato, pero nosotros observamos que al hacer los ensayos en que
se usa zinc, hay precipitación, lo que queda claro al realizar los respectivos controles y además
encontrar que la sal fosfato de zinc es insoluble en agua, pero soluble en ácidos (Chemical Rubber
Publishing CO., 1950).
Para eso se probó el amortiguador PIPES, cuyo uso para medir actividad de PLK estaba
descrito (Abercrombie y Martin, 1980). Éste no provocó ningún tipo de precipitación, bajo distintas
concentraciones de Zn+2 y otros Me+2, por lo cual fue el amortiguador que se seleccionó para todos
los ensayos.
Por otra parte, en el ensayo de estabilidad de la señal de la absorbancia a 388 nm en
ausencia de la reacción enzimática, la tendencia mostrada es que luego de cinco minutos de
incubación, la señal de absorbancia a 388 nm se mantienr constante, lo que ocurre en todas las
PLP, M0 1e-4 2e-4
Uni
dade
s de
Abs
orba
ncia
a 3
88 n
m
0,0
0,2
0,4
0,6
32
condiciones definidas. Además, se visualiza claramente que mientras mayor es la concentración de
PL, mayor es la absorbancia a 388 nm (véase Figura 14).
El efecto del Zn+2 y del ATP es nulo sobre el cambio de la absorbancia a 388 nm, ya que las
curvas son muy similares cuando es constante la concentración de PL (véase Figura 14).
Con estos datos se definieron los parámetros de la reacción, es decir, la incubación de la
mezcla de reacción, que contiene el amortiguador, PL, Zn+2 y ATP, es a 37ºC y durante 10 minutos,
antes de colocar la enzima.
Figura 14: Efecto del PL, Zn+2 y ATP sobre la absorbancia a 388 nm. Curva de tiempo donde se observa el efecto que provoca 1 mM de Zn+2 a distintas concentraciones de PL, sobre el cambio de absorbancia a 388 nm y también de ATP. Las concentraciones de las especies descritas son: 0,1 mM PL (�); 0,1 mM PL + 1 mM Zn+2(�); 0,5 mM PL (�); 0,5 mM PL + 1 mM Zn+2 (�); 0,5 mM PL + 1 mM Zn+2 + 0,5 mM ATP-4 ();1 mM PL (�); 1 mM PL + 1 mM Zn+2 (�). Los experimentos se hicieron en presencia de 20 mM de PIPES pH 6,5 y en duplicado.
4.2.5 Efecto de distintos Me+2 en la actividad de hPLK
En ausencia de metal, no hay actividad enzimática (datos no mostrados), por lo cual éstos
son imprescindibles para la catálisis. Para revisar el efecto de distintos Me+2 sobre la actividad de
hPLK, se realizó un ensayo en que se usaron ocho Me+2 diferentes (Zn+2, Cd+2, Mg+2, Mn+2, Cu+2,
Ni+2, Ca+2 y Co+2) y en tres concentraciones distintas, manteniendo siempre el ATP constante en 0,5
mM y el PL en 3,5 mM. Las relaciones entre las concentraciones de Me+2:ATP fueron 1:5, 1:1 y 3:1.
Se determinó la amplia gama de Me+2 con los que se puede observar actividad hPLK, donde
sólo el Ca+2 no permite la activación de la enzima. La mayor actividad se observa en presencia de la
menor concentración de Zn+2, actividad que disminuye a medida que se aumenta la concentración
tiempo, m inutos0 5 10 15 20 25 30 35
Abs
orba
ncia
, uni
dade
s ar
bitr
aria
s
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
33
de Zn+2 (véase Figura 15).
Por otra parte, se observa que el Cd+2, el Cu+2 y el Ca+2 no provocan un cambio significativo
en la actividad al variar sus concentraciones. Respecto al Ni+2, éste genera que la actividad
enzimática sea similar cuando tiene igual y mayor concentración en relación a ATP. El Co+2 y el
Mn+2 en cantidades equimolares de Me+2 total y ATP total, generan la mayor actividad. Finalmente,
el Mg+2 muestra un comportamiento diferente, donde a medida que aumenta en concentración, la
actividad enzimática también lo hace, sin embargo, la activación observada es muy inferior cuando
se compara este Me+2 con el Zn+2.
Figura 15: Actividad de hPLK con distintos Me+2. Medición de la actividad de hPLK usando distintos Me+2 y con distintas concentraciones de éstos, los cuales son; 0,1 mM de Me+2 total (■), 0,5 mM de Me+2 total (■) y 1,5 mM de Me+2 total (■). La concentración de PL es de 3,5 mM y la de ATP total es de 0,5 mM. El ensayo se realizó usando amortiguador PIPES pH 6,5, 5 µg de proteína y en duplicado.
4.2.6 Curva de pH
Es importante notar que todos los trabajos hechos con PLK varían el pH entre pH 6 y pH 7,
no obstante, es necesario conocer el pH óptimo de la proteína, para de esa manera asegurarse que se
trabaje en condiciones favorables para la actividad enzimática.
Hay un efecto importante de los amortiguadores sobre la actividad de la enzima. Se observa
que al mismo pH, dos amortiguadores provocan que la enzima tenga distintas velocidades iniciales.
Por ejemplo, cuando se usa el Tris-HCl, un amortiguador ampliamente usado en biología molecular,
la actividad es menor en relación al amortiguador HEPES. A pH ácido el amortiguador citrato
genera un efecto inhibitorio en la actividad de hPLK, no así el acetato, donde a medida que el pH se
torna a neutro, la actividad enzimática aumenta. Otro aspecto importante, es que tanto con el
Metales divalentesZn Cd Mg Mn Cu Ni Ca Co
Act
ivid
ad r
elat
iva,
%
0
20
40
60
80
100
34
amortiguador HEPES, como con el MES, se logran actividades enzimáticas mayores que usando
PIPES (véase Figura 16A).
A partir de las mayores velocidades iniciales por cada pH ensayado, se generó una curva de
pH. Esto ocurrió mediante el uso de los Good Buffers en el rango de pH 6 a pH 8, y los
amortiguadores acetato en el extremo ácido y el carbonato en el extremo básico de la curva. De esta
manera, se determinó el pH óptimo, el cual fue de pH 6,4 (véase Figura 16B).
Figura 16: Actividad de hPLK dependiente del pH. En (A) se muestra el efecto de los amortiguadores usados sobre la actividad de hPLK y en (B) la variación de la actividad en función del pH. Todos los amortiguadores se usaron a una concentración final de 20 mM. La concentración de PL es de 2,5 mM, la de ATP total es de 2,5 mM y la de Zn+2 total es de 0,5 mM. Se usaron 5 µg de proteína. Los amortiguadores empleados son: Acetato (●), Citrato (�), MES (�), PIPES (�), HEPES (●), Tris-HCl (▼) y Carbonato (). El ensayo se realizó en duplicado
4.2.8 Determinación de los parámetros cinéticos de hPLK
En cuanto al sustrato PL, se observa una curva donde a bajas concentraciones la enzima
sigue una cinética Michaeliana, mostrando un aumento en la actividad hasta llegar a saturación
(véase gráfico inserto de la Figura 17A). Sin embargo, es claro que a concentraciones mayores que
4-5 mM de PL, éste comienza a inhibir a la enzima hasta quedar con una actividad de 25% respecto
a la actividad máxima (véase Figura 17A). Analizando los datos hasta las concentraciones de PL
que no generan inhibición a la enzima, se obtiene una Km para PL de 490 µM. Con respecto a la
Vmax, ésta alcanza un valor de 4789 U/mg (véase gráfico inserto en la Figura 17A y Tabla 6).
También se observó que el sustrato ZnATP-2 se comporta como sustrato tipo Michaelis a
bajas concentraciones, no obstante, a medida que se aumenta la concentración del ZnATP-2 por
sobre 0,6 mM, se observa inhibición (véase Figura 17B). La Km observada para este sustrato,
calculada en el rango de concentración donde no se observa inhibición, es de 20 µM. Por otra parte,
la Vmax es inferior respecto a la observada cuando se varía PL (véase gráfico inserto en la Figura
17B y la Tabla 6), situación que se discute en la sección 5.3.
pH4 6 8 10
Act
ivid
ad e
spec
ífica
, U/m
g
0
1000
2000
3000
4000
pH4 6 8 10
Act
ivid
ad e
spec
ífica
, U/m
g
0
1000
2000
3000
4000 A B
35
La kcat, se calculó mediante la Fórmula 6 (refiérase a la sección 3.16) para cuando se varía
el sustrato PL y el sustrato ZnATP-2, obteniéndose los valores de 3,2 s-1 y 1,9 s-1, respectivamente.
Estos resultados se relacionan directamente con los de Vmax, por lo que se discuten en la sección 5.3.
Finalmente, las constantes cinéticas obtenidas cuando se varía el sustrato PL, se compararon
con las registradas con una enzima obtenida de la transformante BL21-pET11a-PKH, hPLK que no
posee el marcador His (Ramírez, 2010), notándose que la Km para este sustrato es prácticamente la
misma en las dos formas de la enzima, pero varía la Vmax y, por lo mismo, la kcat (véase Tabla 6). La
Km para ZnATP-2 en la enzima sin el marcador His no fue calculada en aquel trabajo.
Entre paréntesis se indica la proteína que se usó para la medición. BL21-p24a-hPLK posee el marcador His, mientras que BL21-pET11a-PKH, no.
Figura 17: Gráficos de velocidad inicial en función de la concentración de sustrato. En (A) se varía la concentración de PL, donde las demás especies se mantienen constantes, esto es, la concentración de ATP-4 es de 473 µM; la de HATP-3 es de 1,54 mM; la de Zn+2 libre es de 19 µM; y la de ZnATP-2 es de 470 µM. En el gráfico inserto se muestra un ensayo similar, pero sin llegar a concentraciones inhibitorias. En (B) se varía la concentración de ZnATP-2, sin embargo, varían también las concentraciones de HATP-3 (�) y ATP-4 (�). En el gráfico inserto se observa una curva similar, pero sin llegar a concentraciones inhibitorias de ZnATP-2. La concentración de PL es de 2,5 mM y la de Zn+2 es de 15 µM. En todos los ensayos se utiliza 20 mM de amortiguador PIPES a pH 6,5 y 5 µg de proteína. Los ensayos se realizaron en duplicado.
ZnATP, mM0,0 0,2 0,4 0,6
Act
ivid
ad
espe
cífic
a, U
/mg
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Act
ivid
ad e
spec
ífica
, U/m
g
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
ZnATP-2, mM0,0 0,5 1,0 1,5
Con
cent
raci
ón d
e es
peci
es, m
M
0
2
4
6
8
10
Piridoxal, mM0 2 4 6 8 10 12
Act
ivid
ad e
spec
ífica
, U/m
g
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Piridoxal, mM0 1 2 3 4 5
Act
ivid
ad E
spec
ífica
, U/m
g
0
1000
2000
3000
4000
5000
A B
PL (BL21- p24a-hPLK) PL (BL21- pET11a-PKH) ZnATP-2
Km (µΜ) 490 500 20
Vmax (U/mg) 4789 2300 2788
kcat (s-1) 3,2 1,5 1,9
Parámetros cinéticos de hPLK
Tabla 6
36
Cuando se variaba la concentración de ZnATP-2 se debía mantener constante la
concentración Zn+2 libre, sin embargo, se observó que las especies HATP-3 y ATP-4 también
variaban, aumentando sus concentraciones hasta 6,4 mM y 2 mM, respectivamente, cuando el
ZnATP-2 tenía una concentración de 1,6 mM. Por lo anterior, se deben descartar el efecto que tengan
las especies HATP-3 y ATP-4 en la inhibición observada (refiérase a la sección 4.2.9).
4.2.9 Determinación del efecto de las especies presentes sobre la actividad de hPLK
A medida que aumenta el ZnATP-2, también lo hacen las especies HATP-3 y ATP-4, no
obstante, se puede regular el cambio de concentración de estas dos últimas especies, aprovechando
la dependencia que existe entre ellas y el pH.
En primer lugar, se usaron dos pH distintos, pH 6,5 y pH 8,0. A medida que se aumenta la
concentración de ZnATP-2, varían las concentraciones de ATP-4, HATP-3 y, en menor medida, del
Zn+2, el cual a los dos pH aumenta progresivamente desde 0 hasta 19 µM. Cuando la solución se
encuentra a pH 6,5, la especie que aumenta su concentración de manera más importante, hasta los
15,3 mM, es el HATP-3, mientras que el ATP-4 llega hasta una concentración de 4,7 mM (véase
Figura 18A). A pH 8,0 la especie que aumenta en mayor medida es el ATP-4, consiguiendo una
concentración de 18,1 mM, mientras que el HATP-3 alcanza una concentración de 1,9 mM (véase
Figura 18B)
A pH 6,5 se observó que la actividad específica alcanza un máximo de 3550 U/mg cuando
la concentración de ZnATP-2 es de 0,48 mM, para luego disminuir y lograr una actividad específica
de alrededor de 2350 U/mg (actividad relativa de 66%, respecto a la actividad máxima) a 1,9 mM
de ZnATP-2, la cual se mantiene constante a medida que aumenta la concentración de ZnATP-2
(véase Figura 18A).
A pH 8,0, la actividad específica llega a un máximo de 1500 U/mg cuando la concentración
de ZnATP-2 es de 0,5 mM, para luego experimentar una inhibición, que posteriormente se mantiene
constante en 1000 U/mg (actividad relativa de 67%, respecto a la actividad máxima), una vez que la
concentración de ZnATP-2 es de 2 mM (véase Figura 18B).
La actividad máxima a pH 8,0 es un 42% a la que se obtiene a pH 6,5, mientras que en
condición de inhibición, la actividad a pH 8,0 es 43% respecto a pH 6,5.
En segundo lugar, se generó un ensayo donde se varía el Zn+2, quedando el ZnATP-2
constante en 0,5 mM. A medida que el Zn+2 libre aumentaba su concentración, el HATP-3 y el ATP-4
iban disminuyendo de manera similar (véase Figura 19A). Además, se observó que a medida que
aumentaba el Zn+2 libre, la actividad específica de la proteína aumentó, hasta llegar a un máximo de
3300 U/mg cuando la concentración de Zn+2 libre era de 19 µM, luego de lo cual la actividad
específica comenzó a disminuir fuertemente, hasta bajar a 250 U/mg, sobre los 350 µM de Zn+2
libre.
En tercer lugar, se hizo un ensayo donde sólo se observa la inhibición de la actividad
37
enzimática provocada por Zn+2 libre, es decir, desde la concentración de Zn+2 libre que permite la
mayor actividad de la enzima, hacia mayores concentraciones. La inhibición es muy significativa, la
que además se ajusta a una función de decaimiento hiperbólico. A partir del ajuste a esa función, se
puede determinar una constante, la cual es un IC50 (concentración que se necesita de Zn+2 libre para
inhibir a la mitad la actividad máxima), que a pH 6,5 se determinó en 37 µM (véase Figura 19B).
Figura 18: Variación de las distintas especies que se encuentran en solución cuando se varía el pH y el ZnATP-2. Se fue variando progresivamente la concentración de ATP y ZnCl2, siempre con un exceso de ATP sobre ZnCl2 de manera proporcional (en una relación 5:1) (A) a pH 6,5 y (B) a pH 8,0. Los símbolos indican: actividad específica (�), Zn+2 libre (�); ATP-4 (�) y HATP-3 (�). Se usa una concentración de 1,5 mM de PL, 20 mM de amortiguador PIPES pH 6,5, 20 mM de amortiguador HEPES pH 8,0 y 5 µg de proteína. Los ensayos se realizaron en duplicado.
Figura 19: Efecto del Zn+2 libre sobre la actividad de hPLK. En (A) se muestra el comportamiento de la actividad respecto a la variación de Zn+2 libre a pH 6,5 y además se muestra como varía el ATP-4 (�) y el HATP-3 (�). En (B) se muestra la parte donde existe inhibición de la actividad a pH 6,5. La concentración de ZnATP-2 es de 480 µM y la de PL es de 2,5 mM. Se usaron 20 mM de amortiguador PIPES pH 6,5 y 5 µg de proteína. Los ensayos se realizaron en duplicado.
ZnATP -2, mM0 1 2 3 4 5
Act
ivid
ad e
spec
ífica
, U/m
g
0
1000
2000
3000
4000
Esp
ecie
s, m
M
0
5
10
15
20
Act
ivid
ad e
spec
ífica
, U/m
g
1000
2000
3000
4000
ZnATP -2, mM0 1 2 3 4 5
Esp
ecie
s, m
M
0
5
10
15
20
A B
Zn+2 libre, mM0 1 2 3 4
Act
ivid
ad e
spec
ífica
, U/m
g
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Esp
ecie
s, m
M
0
5
10
15
Zn+2 libre, µM0 200 400 600
Act
ivid
ad e
spec
ífica
, U/m
g
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
A B
38
4.2.10 Ensayos de inhibición
A partir de las evidencias que sugieren inhibición por Zn+2 libre, se realizaron ensayos para
determinar qué tipo de mecanismo da cuenta de la inhibición de hPLK.
En primer lugar, se analizó el efecto del Zn+2 libre sobre la actividad enzimática, cuando se
varía la concentración del ZnATP-2. La condición inicial es con 19 µM de Zn+2 libre, ya que es ahí
donde se encuentra la mayor actividad de hPLK (refiérase a Figura 19A). La Km aparente para
ZnATP-2 muestra una tendencia a aumentar a medida que se acrecienta la concentración de Zn+2
libre, mientras que la Vmax observada tiene una clara tendencia a disminuir (véase Figura 20A y
Tabla 7).
Mediante el uso del programa DynaFit, los datos se ajustaron a un modelo de inhibición
mixto-total (véase Figura 21A y Fórmula 7) con un factor w de 0,99, lo que indica que este modelo
tiene una probabilidad del 99% de ser el modelo que explique los datos experimentales, en relación
a los demás modelos. Este modelo general de inhibición se corresponde con un sistema C1 de
inhibición de tipo mixto lineal, descrito por Segel, donde el factor α posee una valor mayor a uno,
mientras que el factor β es igual a cero (Segel, 1975) (véase Tabla 8)
En cuanto al efecto producido por la variación de la concentración de Zn+2 libre con
respecto a la concentración de PL, se observó una disminución importante en la actividad
enzimática, donde el Zn+2 libre provoca una disminución en la Km aparente para PL, para luego
mantenerla constante en las últimas tres curvas, y una disminución continua en la Vmax de la hPLK
(véase Figura 20B y Tabla 7).
Los datos experimentales se analizaron en DynaFit, los cuales se ajustaron globalmente a
un modelo de inhibición mixto-total, sin embargo, al comparar los datos experimentales con los
datos obtenidos del modelo, no concuerdan con las constantes obtenidas, por lo que se decidió hacer
ajustes globales de los dos comportamientos de la enzima por separado. De este manera, se obtiene
que las primeras tres curvas se ajustan perfectamente al modelo de inhibición de tipo mixto-parcial
(véase Figura 21B, Tabla 8 y Fórmula 8), con un factor w de 0,99. En cuanto a las 3 curvas
restantes, se ajustaron a un modelo de inhibición incompetitiva modificada, que contempla a la
enzima libre como la ya unida al Zn+2 libre, por lo cual el complejo Zn-PL-hPLK es el activo (véase
Figura 21C, Tabla 8 y Fórmula 9). Este modelo posee un factor w de 0,99 de 0,53, mientras que un
modelo de inhibición incompetitiva alcanza un factor w de 0,40.
max
[ ]
[ ] [ ]1 [ ] 1s
i i
v S
V I IK S
K Kα
=
+ + +
Fórmula 7
Fórmula 8
max
[ ]
[ ] [ ][ ]
[ ]i i
s
i
v S
V K I I KK S
I K
γγ
= + ++
39
De acuerdo a la nomenclatura usada por Segel, el ajuste global de las tres primeras curvas
responde fielmente a un sistema C5 de un modelo de inhibición tipo mixto hiperbólico, donde el
factor α es menor que 1, β es menor que 1 y β es mayor que α, tal como se observa en los datos del
ajuste (véase Tabla 8) (Segel, 1975).
Figura 20: Inhibición provocada por el Zn+2 libre sobre hPLK. Inhibición que provoca el aumento de la concentración de Zn+2 sobre hPLK, en función de la variación de la concentración de los sustratos. En (A) se muestra cuando se varía la concentración de ZnATP-2 y en (B) cuando se varía la concentración de PL. Las concentraciones de Zn+2 libre usadas son: en (A) 19 µM (●), 27 µM (▼), 40 µM (▼), 55 µM (▼) y 79 µM (�), y en (B) 19 µM (●), 25 µM (●), 34 µM (○), 57 µM (▲), 73 µM (▲) y 92 µM (�). Se usó 20 mM de amortiguador PIPES, 5 µg de proteína y los ensayos se realizaron en duplicado
Fórmula 9
max
[ ]
[ ] [ ][ ]
[ ] [ ]i i
s
i i
v S
V I K I KK S
I K I K
ααβ α β α
= + ++ + +
ZnATP-2, µM
0 100 200 300 400 500 600
Act
ivid
ad e
nzim
átic
a, U
/mg
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
PL, µM
0 200 400 600 800 1000
Act
ivid
ad e
spec
ífica
, U/m
g
0
1000
2000
3000A B
Zn+2, µM Km observada, µM Vmax, U/mg Zn+2, µM Km observada, µM Vmax, U/mg
19 20 4100 19 510 442027 26 3790 25 305 376940 28 3160 34 234 303555 68 3020 57 86 180079 60 2220 73 65 1214
92 65 856
Parámetros cinéticos dependientes de la variación de Zn+2 libre
Tabla 7
ZnATP-2 PL
40
Ks
hPLK + ZnATP-2 ZnATP-hPLK hPLK + ZnADP-
+ + Zn+2 Zn+2
αKi
Zn-hPLK + ZnATP-2 Zn-ZnATP-hPLK
Ki αKs
kp
Ks
hPLK + PL PL-hPLK hPLK + PLP+ +
Zn+2 Zn+2
αKs αKi
Zn-hPLK + PL Zn-PL-hPLK Zn-hPLK + PLP
kp
βkp Ki
Zn+2
+hPLK
Ki Ks kp
Zn-hPLK + PL Zn-PL-hPLK Zn-hPLK + PLP+
Zn+2
γKi
Zn-Zn-PL-hPLK
Figura 21: Modelos de inhibición para hPLK en presencia de Zn+2. Propuestos a partir de los datos experimentales analizados en DynaFit, se observan los modelos para: (A) cuando se varía el sustrato ZnATP-2 y el Zn+2 libre se une a un sitio, (B) cuando se varía el sustrato PL ajustando a un modelo de inhibición mixto parcial, y (C) cuando se ajusta a un modelo de inhibición incompetitiva, que fue modificado para incluir el equilibrio existente entre Zn+2 libre y hPLK.
A
B
C
41
Constantes
ZnATP-2 PL (1) PL (2)
w 1 0,99 0,53Ks (µM) 27 470 380
αKs (µM) 240 231 0Ki (µM) 6 2 2
αKi (µM) 51 1 0γKi (µM) 0 0 10
kp (s-1) 2 3,3 5,6
βkp (s-1) 0 2,5 0
α 8,7 0,5 4,6β 0 0,8 0γ 0 0 5
Tabla 8
Sustratos
Constantes obtenidas a partir del ajuste de los
datos experimentales a los modelos de inhibición por Zn+2 libre
(1) se refiere a las constantes obtenidas usando el modelo que explica las curvas iniciales cuando se varía PL. (2) se refiere a las constantes obtenidas usando el modelo que explica las curvas finales cuando se varía PL.
4.2.11 Fluorescencia intrínseca de hPLK
Debido al fenómeno de transferencia de energía, no se puede ver el efecto de PL en el
espectro de emisión de la fluorescencia intrínseca de la proteína, debido a que PL absorbe a una
longitud de onda de 393 nm, y con un coeficiente de extinción molar muy alto (1700 M-1cm-1)
(Sober, 1970), lo que solapa completamente el espectro de emisión de la fluorescencia intrínseca de
hPLK. Por otro lado, el ATP no provoca variaciones en el espectro de fluorescencia intrínseca, ya
que no se observa ningún cambio en la intensidad de la fluorescencia, ni tampoco en el corrimiento
del espectro, ya sea cuando se colocó en presencia de Zn+2 o solo (datos no mostrados).
En tanto, hPLK disminuye fuertemente la intensidad de fluorescencia del espectro de
emisión a 337 nm en función de un aumento de la concentración de Zn+2 libre (16% respecto a la
mayor intensidad) (véase Figura 22A). Incluso, cuando ya había ATP en la solución, el Zn+2 también
generó una disminución similar en la intensidad de fluorescencia emitida por hPLK (datos no
mostrados).
42
Figura 22: Cambios en la fluorescencia intrínseca de hPLK en presencia de Zn+2. (A) Se muestra el espectro de emisión de fluorescencia, donde la curva con mayor intensidad a 337 nm corresponde a la proteína en ausencia de Zn+2. La curva que presenta menor intensidad a esa longitud de onda corresponde a la en presencia de la máxima concentración de Zn+2. (B) Se grafica la intensidad de fluorescencia a 337 nm en función de la concentración de Zn+2 libre. Se usaron 80 µg de proteína.
Finalmente, la variación en la intensidad de la fluorescencia intrínseca de hPLK en función
de la concentración de Zn+2 libre se pudo ajustar a una curva de decaimiento hiperbólico. Sin
embargo, antes se debieron ajustar las concentraciones de Zn+2 disponible para la unión con la
proteína, debido a la presencia de DTT, para lo cual se calcularon las Ka para los complejos
formados, como se describió en el apartado de métodos (refiérase a la sección 3.19). Una vez
obtenidas tales Ka (véase Tabla 9), se desarrollan los equilibrios 1 y 2 descritos en la Tabla 2 para
cada condición de Zn+2 y DTT presente. Suponiendo que todo el Zn+2 que forme los complejos
ZnDTT y Zn3DTT4 no estará disponible para unirse a la proteína se concluyó que la Kd para la
unión de Zn+2 a hPLK es de 266 nM (véase Figura 22B y Tabla 9).
Ka1 (µM-1) Ka2 (µM-1) Kd (nM)
0,04 1,1 x 10-12 266
Constantes de equilibrio para las reacciones descritas en la Tabla 2
Tabla 9
Ka1 y Ka2 corresponden a las Ka de las ecuaciones 1 y 2, respectivamente, de la Tabla 2.
A
Zn+2 libre, µM0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
Inte
nsid
ad d
e la
fluo
resc
enci
a a
337
nm
340
360
380
400B
43
V. DISCUSIÓN
5.1 Análisis evolutivo de hPLK
A partir del árbol filogenético se observa que PLK no está presente en las arqueas y en una
cantidad importante de bacterias. Para entender lo anterior, se debe considerar que PLK pertenece a
la vía de incorporación de PLP y que en E. coli se ha descrito una vía de síntesis de novo de PLP.
No obstante, los dos genes claves de la vía biosintética de PLP en E. coli, PdxA y PdxJ, sólo poseen
homología con genes de un pequeño grupo de gamaproteobacterias (Fitzpatrick y cols., 2007).
Por otra parte, a partir de estudios hechos en Cercospora nicotianae (Ehrenshaft y cols.,
1999) y Aspergillus nidulans (Osmani y cols., 1999) se descubrió la presencia de otra vía de
biosíntesis de novo de PLP. Los genes involucrados en esta nueva vía se denominaron Pdx1 y Pdx2
(Ehrenshaft y Daub, 2001), las cuales codifican para proteínas que en conjunto forman el complejo
PLP sintasa. Éstos no mostraron homología con los genes descritos en la biosíntesis de novo de PLP
en E. coli, pero sí se encuentran ampliamente distribuidos en arqueas como Pyrococcus woesei
(PDB: 1HG3; Walden y cols., 2001) y Sulfolobus solfataricus (PDB: 1A53; Henning y cols., 2002),
en hongos, plantas y en algunas bacterias.
Con esto, se concluye que hay organismos que tienen una vía biosintética de novo de PLP,
junto a una vía de incorporación de PLP, como es el caso de E. coli. También existen organismos
que sólo poseen vía biosintética de novo de PLP, como en las arqueas (a menos que se demuestre
que existen alternativas a la vía de incorporación de PLP conocida), mientras que hay otros
organismos que sólo poseen vía de incorporación de PLP, como el caso de H. sapiens. Es decir, es
indispensable obtener la vitamina B-6 desde la dieta.
Por otra parte, se pueden abrir cuestionamientos respecto a la ausencia de una vía de
biosíntesis de novo en humanos. Cuál fue la presión evolutiva que generó la pérdida de esta vía en
organismos superiores; porqué otras moléculas tan importantes, como son las purinas, poseen una
vía de biosíntesis de novo como también una vía de incorporación; y qué relación evolutiva existe
entre los organismos que sólo poseen vía de incorporación.
La elección de una secuencia de HMPPK como raíz del árbol filogenético, se debe a la
sugerencia de Zhang y colaboradores, quienes establecen que los indicadores para determinar el
cambio evolutivo en la superfamilia de la riboquinasa incluyen la estructura cuaternaria, el tamaño
del monómero, la elaboración de la tapa que se encuentra en el sitio activo y los cambios
conformacionales, debido a la unión de sustratos. Por lo anterior, se justifica considerar a HMPPK
como ancestro de PLK, debido a que PLK posee actividad aún como monómero (Lee y cols., 2000;
Zhang y cols., 2004), a la mayor cantidad de elementos estructurales que posee el monómero de
PLK, respecto a HMPPK (refiérase a Figura 4), por el mayor tamaño de la superestructura
secundaria β-loop-β de hPLK (refiérase a página 23), respecto a la encontrada en HMPPK, y debido
a la capacidad que posee la superestructura secundaria β-loop-β en PLK de poder girar una vez que
44
se une el ATP (algo que en HMPPK no es posible por su tamaño).
La superestructura secundaria β-loop-β corresponde a una de las principales diferencias
observadas en las estructuras PLK, la que de acuerdo a Cheng y colaboradores, se relaciona con el
dominio menor de las otras dos familias de la superfamilia de la riboquinasa (Cheng y cols., 2002).
Al dominio menor de la riboquinasa se le ha descrito, por su función, como una tapa del sitio
activo, ya que una vez que ingresan los sustratos, el dominio menor se acerca al dominio mayor,
cerrando el sitio activo (Zhang y cols., 2004).
Se ha propuesto que la superestructura secundaria β-loop-β de PLK se encuentra
involucrada en evitar la hidrólisis no productiva de ATP en ausencia de PL unido (Safo y cols.,
2004). En el caso de hPLK y PLK de O. aries, esta superestructura posee tres residuos adicionales,
con respecto a las proteínas de bacterias, lo que permitiría que en eucariontes ésta se desplace en
función de la presencia de ATP (Cao y cols., 2006; Musayev y cols., 2007).
Otro de los loops que presenta diferencias morfológicas es el que se encuentra entre los
elementos estructurales β7 y β8. A pesar de estar cerca del sitio activo, no se le ha descrito
diferencias importantes entre las distintas enzimas analizadas, aunque se advierte que ciertos
residuos de este loop (118 y 119 según nuestro alineamiento) se encuentran conservados en
eucariontes y algunas bacterias (véase Figura 8), los cuales forman puentes de hidrógeno con el
fosfato-β del ATP (Safo y cols., 2004; Musayev y cols., 2007).
Un caso especial dentro de las PLK es la PDXK que pertenece a B. subtilis, la cual quedó
agrupada entre las HMPPK y no entre las PLK (Ramírez, 2010), ya que la secuencia del gen que
generaba la proteína era más similar a las primeras. Incluso, anteriormente hubo confusión sobre las
características de ésta (Park y cols., 2004), ya que en un principio se expuso que provenía del gen
thiD (que codifica a las HMPPK), por la similitud de secuencias entre ellos, pero luego se demostró
que el gen no corresponde a thiD, ya que la particularidad de este gen es que se encuentre en un
cluster relacionado con la vía biosintética de tiamina, lo que el gen de B. subtilis no cumplía y, por
tanto, no correspondería a esta clasificación. Por lo pronto, se determinó que esta proteína fosforila
a PL, PN y PM, como también fosforila HMP, pero que tiene una mayor preferencia por PL, con lo
cual se declaró que el gen propuesto como thiD, debe ser renombrado como pdxK (Park y cols.,
2004).
Un punto interesante es la divergencia que existe entre las PDXY de los filos
proteobacterias, actinobacterias y deinococos-thermus por un lado, con respecto a los filos
firmicutes, espiroquetales, bacteroidetes, fusobacterias y termotogales por el otro, los cuales
presentan diferencias importantes en cuanto a las posiciones conservadas. Por lo mismo es que
hemos decidido denominarlos PDXY-2 y PDXY-1, respectivamente (véase Figura 8 y Tabla 4).
Es más, el clado PDXY-1 difiere en posiciones importantes con los otros tres clados de
PLK, varias posiciones conservadas en el clado PDXY-1 se observan también en HMPPK y no en
los otros clados de PLK. Además, el clado PDXY-1 es el más cercano a HMPPK (refiérase a Figura
45
8). Estos puntos, agregados a que PLK del firmicutes B. subtilis se encuentra directamente
relacionado con HMPPK, nos hace suponer que este clado tiene una importancia fundamental en
cuanto a la evolución de la familia sin dominio menor, ya que correspondería a la transición entre la
actividad HMPPK y la actividad PLK. Para lo anterior, se debiese estudiar cinética y
estructuralmente a algunos miembros de este clado, esperando que éstos mantengan una pequeña
actividad HMPPK y que a la vez posean una actividad PLK, aunque menor a la que encontramos en
hPLK. Estructuralmente se podría esperar que las PDXY-1 tuviesen más similitud con las PLK que
con las HMPPK, no como PLK de B. subtilis que posee más similitud estructural con las HMPPK.
Por otro lado, se deja en evidencia la separación de clados entre PDXK y PDXY-2, algo ya
descrito en la literatura (Yang y cols., 1998), los cuales tienen diferencias en algunos residuos
conservados y en la actividad PLK observada. PDXY de E. coli posee sólo un 1% de actividad
respecto a PDXK de E. coli (di Salvo y cols., 2004), lo que puede ser explicado en base a que en las
proteínas PDXY-2 que pertenecen a las gamaproteobacterias, existe un residuo conservado, C72
(véase Figura 8), el cual une covalentemente a PL y a PLP (Safo y cols., 2004). Sin embargo, no se
tienen antecedentes de la actividad de PDXY-2 de otras fuentes distintas de gamaproteobacterias,
los cuales no poseen conservado C72, sino que tienen residuos hidrofóbicos, con lo cual el 1% de
actividad, en relación a PDXK, no es necesariamente una constante de este grupo.
Siguiendo con el argumento anterior, Safo y colaboradores postulan que C72, Y149 y una
glutamina (no mostrada en el alineamiento múltiple), son residuos esenciales y representativos para
el clado de proteínas PDXY-2 (Safo y cols., 2004), lo cual estaría errado, ya que sólo las
gamaproteobacterias de este grupo poseen conservación en los residuos Q47 y C72, mientras que
Y149 se encuentra ausente en un conjunto de proteobacterias. Se han presentado más antecedentes
para describir las diferencias entre estas dos PLK en bacterias, entre las que se encuentran que
PDXY-2 de E. coli no es capaz de realizar catálisis si se presentan los sustratos PN y PM (Newman
y cols., 2006), y que PDXK de E. coli posee además actividad HMP quinasa (Mizote y cols., 1999).
En base a los antecedentes obtenidos, se torna necesario realizar un estudio que explique
mejor el paso evolutivo de HMPPK a PLK, la aparición de cisteína en algunas gamaproteobacterias,
y entender la divergencia que ocurrió en bacterias.
Como parte de los motivos conservados que se encuentran en la familia sin dominio menor
de la riboquinasa, el motivo de secuencia DPV, que se encuentra justo después del elemento
estructural β5, interactúa con el ATP, a partir de la coordinación del aspartato con el fosfato-γ del
ATP (Musayev y cols., 2007; Li y cols., 2004).
El motivo conservado NXXE, que se encuentra en la estructura secundaria α5 de la
proteína, se ha propuesto fundamental para la coordinación del metal libre en el sitio activo, como
es el caso del Mg+2 (Parducci y cols., 2006). Sin embargo, el Zn+2 libre no interactuaría con este
motivo, lo que refuerza los resultados que describen la diferencia entre usar Mg+2 o Zn+2, con
respecto a la actividad de hPLK (refiérase a la Figura 15). Entre los residuos que componen este
46
motivo, se indica que asparagina se encuentra interactuando con el fosfato-β y el fosfato-γ del ATP,
mientras que el glutamato, con el fosfato-γ (Li y cols., 2002).
El otro motivo conservado, GXGD, que se encuentra en N-terminal del componente
estructural α7, es postulado como el bolsillo aniónico, ya que cumple un rol como estabilizador del
estado de transición del grupo fosfato que se traspasa del ATP al PL, neutralizando la carga negativa
acumulada (Gandhi y cols., 2009). Parte fundamental de la catálisis es llevada por este motivo,
donde un oxígeno del fosfato-γ del ATP estaría formando un puente de hidrógeno con el carboxilo
del aspartato y con los nitrógenos de la cadena principal de los residuos del motivo. Posteriormente,
el aspartato actúa en la deprotonación del grupo hidroxilo que se encuentra en el C(5) del anillo de
piridina de PL y los electrones del oxígeno deprotonado atacan nucleofílicamente al fósforo del
fosfato-γ, rompiéndose el enlace entre el fosfato-β y el fosfato-γ del ATP, formándose el nuevo
enlace entre el fosfato-γ y PL (Li y cols., 2004; Musayev y cols., 2007). Además X (treonina en
eucariontes) estaría coordinado con el fosfato-α del ATP, y G126 coordinaría con el fosfato-α del
ATP a través de un nitrógeno del anillo de adenina (véase Figura 8).
No obstante, D129 no se conserva en la secuencia proteica de PLK de B. subtilis, ni en las
secuencias de HMPPK, donde en su lugar se encuentra una cisteína (Guixé y Merino, 2009). Las
secuencias antes mencionadas son las proteínas más ancestrales en el árbol filogenético (refiérase a
Figura 8). Además, las secuencias proteicas de THZK también poseen cisteína en vez de aspartato
(Zhang y cols, 2004), por lo que la aparición de aspartato fue un evento que ocurrió con el
nacimiento de las PLK y se mantuvo en el resto de la superfamilia, dada la importancia del residuo.
Adicionalmente, se muestra la conservación de varios residuos, algunos de los cuales se han
descrito con una acción importante en la actividad de las PLK. Entre estos residuos se encuentran
S5 que interactúa con N(1) del PL, el residuo Y46 hace interacciones π con el anillo de piridina del
PL, lo cual permite orientar a este sustrato para la posterior reacción catalítica (Safo y cols., 2004),
el residuo Y73, que forma parte del loop entre los elementos estructurales β4 y α5, y que actúa
restringiendo la conformación del ATP previniendo su hidrólisis (Li y cols., 2004), y T26, que
forma puentes de hidrógeno con el O del C(3) del anillo de piridina de PL (Musayev y cols., 2007).
A los demás residuos que se conservan no se les ha descrito en alguna función específica dentro de
la enzima, lo que no significa que carezcan de importancia, Por ejemplo, varios de ellos podrían
formar puentes de hidrógeno para estabilizar a los sustratos, tal como S24 lo podría hacer con PL y
T90 con el ATP.
5.2 Purificación, pH óptimo y uso de metales
La purificación que se realizó de hPLK fue exitosa, exclusivamente debido a la
cromatografía de afinidad, razón por la cual la etapa de la cromatografía de intercambio iónico no
fue necesaria, tal como lo hizo el grupo de Ismail (Ismail y cols., 2005). El peso molecular de la
proteína purificada se estimó en 35,7 KDa, lo cual concuerda con la literatura, que estima el peso
47
molecular de hPLK entre 35 y 40 KDa (di Salvo y cols., 2004; Kästner y cols., 2007; Lee y cols.,
2000).
En cuanto a los amortiguadores, se ha descrito que el tris inhibe la desfosforilación
promovida por el ion metálico formando un complejo con la molécula de ATP, por medio de la
formación de un complejo Zn-Tris o Zn-ATP-Tris (Amsler y Sigel, 1976), lo que puede explicar
porqué la actividad de hPLK es bastante menor en este amortiguador, en relación a los “Good
Buffers” PIPES y HEPES.
El pH óptimo encontrado para la actividad PLK está en concordancia con lo descrito en la
literatura, donde se reportan valores entre pH 6,0 y pH 6,5 (Lee y cols., 2000; McCormick y cols.,
1961; Neary y Diven, 1970).
En relación a la actividad enzimática observada en función del Me+2 presente, es
indiscutible que la mayor actividad inicial es alcanzada en presencia de zinc, lo que ha sido
demostrado en una serie de trabajos (Lee y cols., 2000; Lum y cols., 2002; McCormick y cols.,
1961), en los cuales todos han recalcado que se necesita una menor concentración de zinc, respecto
a otros metales para obtener mayor actividad.
No obstante, a nivel de superfamilia existe un trabajo realizado en nuestro laboratorio,
donde se hace un análisis del efecto de distintos metales en la fosfofructoquinasa dependiente de
ADP de Pyrococcus horikoshii. En este caso, la actividad que presenta la enzima en presencia de
zinc es despreciable, mientras que la mayor actividad obtenida es en presencia de níquel, en
contraste del 25% de actividad relativa encontrada en hPLK. Cabe recalcar, que en el trabajo de la
fosfofructoquinasa sólo se usaron concentraciones de metal total mayores que la de ADP (Currie y
cols., 2009).
Lee y colaboradores, que trabajaron con hPLK, así como el grupo de Lum, que trabajaron
con PLK proveniente de A. thaliana, mostraron que con el metal que se obtiene la segunda mayor
actividad es cobalto, donde en el primer caso es un 80% de la actividad relativa, mientras que en el
segundo caso es sólo un 32% de actividad relativa respecto a la obtenida con Zn+2 (Lee y cols.,
2000; Lum y cols., 2002). Nosotros estimamos que con cobalto se obtiene una actividad relativa del
70% en relación a la lograda con Zn+2 (refiérase a Figura 15).
Ambos trabajos muestran también el efecto que provocan el Mn+2 y el Mg+2, pues Lee y
colaboradores estimaron que las actividades relativas logradas son 40% con Mn+2 y 10% con Mg+2,
mientras que el grupo de Lum estimó actividades relativas de 23% para Mn+2 y 17% para Mg+2,
todos en relación al Zn+2. Respecto al Mn+2, nosotros obtuvimos 56% de actividad relativa, en
relación al Zn+2, lo que es cercano a lo observado por el grupo de Lee, no así con los resultados del
grupo de Lum, lo que se puede explicar por las diferentes fuentes de las cuales se obtienen las PLK.
En cuanto al Mg+2, estos resultados contrastan con los nuestros, donde obtuvimos una actividad
relativa de 43%, lo que muestra una subestimación de la actividad enzimática lograda en presencia
de Mg+2 en esos trabajos, debido a que los ensayos se hicieron con concentraciones de metal
menores a las de ATP, lo que no les permitió observar lo que ocurría con concentraciones superiores
48
de metal por sobre el ATP, que es donde demostramos que se logra la mayor actividad relativa
cuando se usa Mg+2.
5.3 Determinación de parámetros cinéticos de hPLK
En la literatura existen varios datos respecto a las propiedades cinéticas de PLK de distintas
fuentes (véase Tabla 10). Las constantes cinéticas se obtienen en la mayoría de los casos usando
Zn+2 o Mg+2 como Me+2, y la Km la calculan suponiendo ATP como el sustrato, siendo que se ha
propuesto que el sustrato real de las quinasas es el complejo Me+2-ATP (Amsler y Sigel, 1976). La
existencia de algunas publicaciones donde se dan a conocer parámetros cinéticos para la hPLK, nos
permite la comparación con nuestros datos.
Sólo usamos PL como sustrato aceptor de fosforilo, el que además es el más utilizado en los
ensayos cinéticos hechos por otros grupos. Además, di Salvo y colaboradores (di Salvo, 2004)
señalan que en células de E. coli no se detectó PN y PM, mientras que los niveles de PL eran de 12
µM, de los cuales un tercio está en forma libre y el resto se encuentra unido a proteínas, por lo cual
se sugiere que PL es el sustrato fisiológicamente activo en la vía de incorporación de PLP.
Al realizar el ensayo para obtener la Km para PL, se observó una inhibición por sustrato, la
cual fue descrita anteriormente en dos trabajos (McCormick y cols., 1961; Neary y Diven, 1970), y
además, en el ensayo para observar la Km para ZnATP-2 también se observó inhibición, pero en
menor medida, situación que no ha sido descrita anteriormente. Es más, las observaciones de
inhibición por PL de hPLK, sólo se han señalado de manera muy escueta, sin entrar en detalles en
cuanto a qué mecanismos estarían involucrados. Por lo mismo se hace necesario dar una
explicación de la regulación de hPLK que involucren a ambos sustratos y, de esta manera, dar una
explicación global de la inhibición por sustrato sufrida por hPLK.
Una diferencia importante se observó entre las Vmax obtenidas para la enzima cuando se
realizaron los ensayos para obtener las Km de PL y de ZnATP-2. Esta diferencia puede deberse al uso
de una concentración de Zn+2 libre de 15 µM en el caso donde se observó una Vmax menor (cuando
se calculó Km para ZnATP-2), en relación a los 19 µM de concentración de Zn+2 libre que se usaron
en el otro ensayo, que es la concentración óptima para que el Zn+2 libre se comporte como activador
(refiérase a Figura 19). Este argumento es válido para explicar la menor Vmax encontrada en el
ensayo donde se usó la proteína sin el marcador His, ya que la concentración de Zn+2 libre fue
menor a la óptima (Ramírez, 2010).
Debemos recordar que usamos un coeficiente de extinción molar distinto (refiérase a
sección 3.10), ya que en todos esos trabajos usaron el descrito en literatura a pH 7,0, es decir, 4900
M-1cm-1 (Chemical Rubber Publishing CO., 1950). De esta manera, los datos de kcat se ven
directamente afectados, ya que posee a Vmax como numerador (refiérase a Fórmula 6). Sin embargo,
si la Vmax que obtuvimos la ajustamos con el coeficiente de extinción molar existente en la
literatura, tenemos que la kcat es 1,7 s-1, que se encuentra más cercana a los resultados de los otros
49
trabajos (véase Tabla 10).
Fuente kcat (s-1) Km PL (µM) Km ATP (µM) Referencia
H. sapiens 1 59 n.d Kästner y cols., 2007H. sapiens n.d 3 n.d Hanna y cols., 1997
H. sapiens , Cerebro n.d 97 12 Lee y cols., 2000H. sapiens (MgATP) 3,3 75 500 Musayev y cols., 2007H. sapiens (MgATP) 0,8 30 420 di Salvo y cols., 2004H. sapiens (ZnATP) 0,5 350 n.d di Salvo y cols., 2004
R. norvegicus , Hígado n.d 15 n.d McCormick y cols., 1961R. norvegicus , Hígado n.d 190 n.d Takeichu y cols., 1984
S. scrofa , Cerebro n.d 25 n.d Gao y cols., 1998S. scrofa , Cerebro n.d 25 12 Kwok y Churchich., 1979O.aries , Cerebro n.d 40 20 Kerry y cols., 1986O.aries , Cerebro 1,9 70 35 Kwok y Churchich., 1991
B. taurus , Cerebro n.d 50 n.d McCormick y cols., 1961A. thaliana n.d 688 98 Lum y cols., 2002
P. falciparum 0,05 212 82 Wrenger y cols., 2005E. coli PDXK (MgATP) 2,3 100 600 di Salvo y cols., 2004E. coli PDXK (ZnATP) 2 190 70 di Salvo y cols., 2004
B. subtilis 0,03 47 n.d Park y cols., 2004
Recopilación de parámetros cinéticos de piridoxal quinasa de distintas fuentes.
Tabla 10
Las especies ZnATP-2 y MgATP-2 se colocan entre paréntesis sólo en los trabajos en que se consideraron a éstos como sustrato, y no al ATP-4. n.d es no determinado.
De las constantes cinéticas recopiladas en la Tabla 10 seleccionamos las que se obtuvieron
usando hPLK para hacer comparaciones con nuestros datos.
El grupo de di Salvo usó 50 µM de Zn+2 total y 200 µM de ATP a pH 7,3, con lo que la
concentración de Zn+2 libre es de 8 µM, muy inferior a la concentración que determinamos óptima
para medir actividad. La Km de PL da cuenta de la similitud en este parámetro, sin embargo,
debemos hacer notar que el co-sustrato ZnATP-2, sólo posee una concentración de 42 µM en esas
condiciones, la cual no estaría en concentraciones saturantes (generalmente se considera que una
concentración es saturante cuando es diez o más veces su Km).
En relación al trabajo de Kästner y colaboradores (2007), ellos usaron 100 µM de Zn+2 total
y 1 mM de ATP a pH 6,2, lo que, según los cálculos, genera una concentración de Zn+2 libre de 13
µM y 83 µM de ZnATP-2. Esto último no son concentraciones saturantes del co-sustrato, además
que la concentración de Zn+2 libre está por debajo de la concentración óptima para que actúe como
activador, lo que podría explicar las diferencias con nuestro trabajo.
En el grupo de Hanna (Hanna y cols., 1997), se utilizó 100 µM de Zn+2 total y 1 mM de
ATP a pH 6,4, lo que, según los cálculos, genera una concentración de Zn+2 libre de 9 µM y de 88
µM ZnATP-2, condición que se asemeja a la del trabajo de Kästner y colaboradores, por lo cual
existe el mismo argumento para explicar la diferencia en los parámetros cinéticos.
50
En el trabajo de Lee y colaboradores (2000) se usó 0,1 mM de Zn+2 total y 0,5 mM de ATP
a pH 6,0, lo que genera que la concentración de Zn+2 libre sea de 31 µM y la de ZnATP-2 de 64 µM.
Esta condición genera una inhibición en la enzima por parte del Zn+2 libre y también que el
co-sustrato no se encuentre en concentraciones saturantes. También usan 0,5 mM de PL cuando
calculan la Km para ATP, lo que ellos consideran como una condición de concentración saturante de
co-sustrato, no así por lo recogido en nuestros datos. Es importante señalar que en este trabajo se
menciona a la especie ATP-4 como sustrato, y no ZnATP-2 (Lee y cols., 2000).
Para el caso del trabajo realizado por Musayev y colaboradores (2007), no se pueden
comparar los datos, debido a que usaron Mg+2 como Me+2 para sus ensayos, a pesar de eso, ellos son
los que mencionan la mayor kcat (3,3 s-1), la cual dicen se debe a que usaron Na+ en la mezcla de
reacción, demostrando la importancia de metales monovalentes en la activación de la proteína
(Musayev y cols., 2007).
Todos los datos anteriormente descritos, avalan nuestra crítica en cuanto a que no se
calculan los parámetros cinéticos considerando exhaustivamente las condiciones del medio en que
se encuentra la proteína y, por lo tanto, se incurre en errores en las concentraciones de sustrato que
se señalan y, por lo mismo, en los parámetros cinéticos.
5.4 Inhibición sobre hPLK
La clara disminución de la actividad a pH 8,0 respecto a pH 6,5 (véase Figura 18) se debe
íntegramente a la acción del pH, donde el 42% de actividad relativa alcanzada a pH 8,0 en relación
a pH 6,5, es similar a la razón entre las actividades mostrada en la Figura 15B, donde a pH 8,0 sólo
se logra el 49% de la actividad respecto a pH 6,5. El perfil de inhibición es el mismo a los dos pH,
siendo que las especies ATP-4 y HATP-3 cambian considerablemente sus concentraciones en cada
condición de pH. Estos datos le restarían peso a la acción inhibitoria que pudiesen tener estas
especies, siendo más probable que esa inhibición se deba exclusivamente al ZnATP-2, ya que en los
dos casos la máxima actividad se encontraba cuando esta especie tenía una concentración de 0,5
mM y la inhibición comenzaba cuando el ZnATP-2 tenía una concentración de alrededor de 2 mM.
Además la variación de Zn+2 libre no tiene relación con la inhibición, ya que el Zn+2 libre sólo está
presente a concentraciones en las que actúa como activador.
Que el ATP-4 no sea un inhibidor de la actividad de un miembro de la superfamilia de la
riboquinasa, es una información muy interesante, teniendo en cuenta que ya se había descrito
anteriormente que ATP-4 sí era inhibidor en un miembro de la superfamilia (Guixé y Babul, 1985),
con lo cual éste no sería un rasgo conservado en este grupo de proteínas.
Si regresamos al gráfico de velocidad inicial en función del ZnATP-2 (véase Figura 17B),
este es bastante parecido al ensayo a pH 6,5 mostrado en la Figura 18A, salvo que en el primer caso
la concentración de Zn+2 libre es constante y en el segundo, la concentración de Zn+2 libre aumenta
desde 0 µM, hasta 19 µM. En el gráfico mencionado inicialmente, se observa una inhibición que
51
comienza con una concentración de 0,6 mM de ZnATP-2, parecido al gráfico de la Figura 18A,
donde la inhibición se observa con 0,5 mM de ZnATP-2. No obstante, no se puede observar el
mismo perfil de inhibición, debido a que en el primer caso sólo se llegó a una concentración de 1,5
mM de ZnATP-2 (véase Figura 17B), mientras que en el segundo caso, se alcanza una concentración
de 5 mM de ZnATP-2 (véase Figura 18A), siendo que en el último caso la actividad enzimática se
torna constante luego de 2 mM de ZnATP-2.
Cuando se realiza el ensayo para ver el efecto del Zn+2 libre, se observa claramente la
dependencia directa de la actividad de la enzima con la concentración de esta especie, la que actúa
como activador hasta los 19 µM, y luego como un gran inhibidor, donde queda menos del 10% de la
actividad específica de la enzima (véase Figura 19A). Claramente, ésta es la especie inhibitoria, ya
que aún cuando las concentraciones de ATP-4 y del HATP-3 se mantienen constantes en gran parte
del ensayo, hay un fuerte cambio en la actividad de la enzima, situación en el cual el Zn+2 libre varía
entre 25 µM y 600 µM.
El IC50, para hPLK obtenido por nosotros (37 µM), es claramente mucho mayor que los
IC50 descritos anteriormente en la literatura (véase Tabla 11), donde estos últimos actúan en el orden
nanomolar, donde incluso, la caspasa-3 presenta una estequiometría de inhibición en una relación
1:1, con respecto al Zn+2 libre (Maret y cols., 1999).
Datos extraídos de Maret y cols., 1999.
En cuanto a los modelos de inhibición, se observa que en el modelo propuesto para cuando
se varía la concentración de ZnATP-2 (refiérase a Figura 21A), hPLK posee mayor afinidad que
Zn-hPLK por ZnATP-2 y la afinidad de Zn+2 libre hacia la proteína es la mayor (Ki de 6 µM).
Además, siempre se formará el complejo Zn-ZnATP-hPLK, que será enzima no productiva (β es 0),
razón por la cual la Vmax disminuye y, por último, la afinidad de la enzima por ZnATP-2 disminuye
(reflejado en el aumento de la Km aparente), por la presencia del complejo Zn-hPLK.
Otro punto interesante es que la Ks para la formación del complejo ZnATP-hPLK es similar
a la Km obtenida para ZnATP-2, lo que es razonable, teniendo en cuenta las condiciones al equilibrio
Enzima IC50 (nM)
Caspasa-3 <10Fructosa 1,6-difosfatasa 100
Gliceraldehido 3-fosfato Deshidrogenasa 150Aldehído Deshidrogenasa 154
Tirosina Fosfatasa 200Enolasa de levadura 250Enolasa de conejo 1300
Tabla 11
Datos de inhibición provocada por zinc en distintas proteínas
52
en que se trabajó. La kcat también da un resultado parecido a la obtenida mediante los datos
experimentales (kp) (refiérase a Tabla 6 y a Tabla 8).
Cuando se varía la concentración de PL, se observan dos comportamientos (refiérase a
Figura 20B) de la actividad de hPLK. El primer comportamiento, denominado como sistema C5 de
una inhibición hiperbólica del tipo mixto, consiste en un importante aumento de la afinidad de la
enzima por el sustrato (el complejo enzima inhibidor tiene mayor afinidad que la enzima, por el
sustrato), como también una disminución en la constante de velocidad para la formación de
producto (βKp). Adicionalmente, la Ki y la αKi son las más pequeñas del modelo, con lo cual se
ratifica la afinidad importante que existe entre hPLK y el Zn+2 libre. Además, este modelo es
descrito característico para metales divalentes que se unen a otras moléculas, como es el caso del
ATP (Segel, 1975). Como en el caso anterior, la Ks con la Km son similares, como también lo son la
kcat con la kp (refiérase a Tabla 6 y a Tabla 8).
El segundo comportamiento ajusta perfectamente a un modelo de inhibición de tipo
incompetitiva, el cual fue modificado para describir el equilibrio entre hPLK y Zn+2 libre. Esto es
debido a que probablemente no existe hPLK en estado libre a esas concentraciones de Zn+2 libre,
sino que estaría formando el complejo Zn-hPLK, lo cual es muy razonable, tomando en cuenta que
la Kd obtenida para la proteína y el Me+2 es del orden nanomolar. Es decir, sobre 50 µM de Zn+2
libre, es muy probable que este Me+2 se una a un segundo sitio regulatorio.
Generalmente, el Zn+2 es coordinado por los aminoácidos histidina, glutámico, aspártico y
cisteína (Vallee y Falchuk, 1993). Con esto se puede investigar dónde se uniría el Zn+2 libre en
hPLK, de manera que efectúe su labor reguladora, lo cual sería un excelente complemento para
dilucidar la forma en que actúa, ya que se podrían proponer mutantes de hPLK que puedan
corroborar los datos entregados en este trabajo.
En tanto, la homeostasis del zinc permite que los rangos de éste se mantengan muy acotados
al interior del organismo humano, donde el exceso de zinc a nivel intracelular es poco frecuente
(Vallee y Falchuk, 1993). Según Canzoniero y colaboradores, la concentración de Zn+2 libre sobre
300 nM en neuronas es tóxica (Canzoniero y cols., 1999), por otra parte, los eritrocitos humanos
poseen una concentración bajo los 3 nM de Zn+2 libre (Kalfakakou y Simons, 1990) y las células
linfoides, una concentración sobre 10 µM de Zn+2 libre (Zalewsky y cols., 1993). Con estos
antecedentes, queda claro que a nivel fisiológico es improbable que Zn+2 sea el metal que forme
complejo con ATP, porque al considerar que las Ka de ZnATP-2 (5,47x104 M-1; Tabla 1) y de
MgATP-2 (3,48x104 M-1; Storer y Cornish Bowden, 1976) se encuentra que éstas son similares,
mientras que en la concentración intracelular de Mg+2 libre (0,85 mM en músculo ventricular; Buri
y McGuigan, 1990) es mucho mayor que la de Zn+2, lo que favorecerá la formación del complejo
MgATP-2, por sobre el de ZnATP-2. No obstante, en las células con concentraciones de Zn+2 libre en
el orden micromolar, sí se produciría la unión entre hPLK y Zn+2 ya que la Kd es del orden
nanomolar, por lo cual en estas condiciones el Zn+2 libre podría ejercer como regulador de la
actividad de hPLK.
53
VI. CONCLUSIONES
1. Se logró establecer mediante análisis estructural y filogenético que el grupo de PLK de
eucariontes no se encuentra más cercano al grupo de homólogos cercanos de PDXY de E.
coli, sino que el grupo de homólogos cercanos de PDXK de E. coli se encuentra más
cercano al grupo de homólogos cercanos de PDXY. Además, las arqueas no tienen la vía de
incorporación de PLP que involucra a PLK y sólo presentan vía de biosíntesis de novo de
PLP. En el árbol filogenético se presentan cuatro clados bien diferenciados de PLK, los
cuales corresponden a dos grupos de homólogos de PDXY en bacterias, denominados
PDXY-1 y PDX-2, un grupo de PLK en bacterias, las cuales son homólogos a las proteínas
codificadas por el gen Pdxk y un cuarto grupo de PLK que es conformado por eucariontes.
PDXY-1 sería un grupo de PLK de transición entre las proteínas con actividad HMPPK y
actividad PLK.
2. Los parámetros cinéticos para hPLK son: la Km para ZnATP-2 es 20 µM, la Km para PL es
490 µM y la kcat es 3,2 s-1.
3. hPLK emplea varios metales para su actividad, siendo el más efectivo Zn+2. La
concentración óptima de Zn+2 libre para la actividad de hPLK es de 19 µM.
4. hPLK es inhibida por PL y ZnATP-2 a concentraciones del orden milimolar, en tanto, el Zn+2
libre provoca una inhibición en la proteína, con un IC50 de 37 µM. Por otra parte, las
especies ATP-4 y HATP-3 no presentan efectos sobre la actividad de hPLK.
5. Determinaciones de fluorescencia intrínseca muestran que Zn+2 libre se une a la enzima en
ausencia de ligandos, con una Kd de 266 nM. La inhibición por Zn+2 libre presenta una
conducta compleja con respecto a ambos sustratos: cuando se varía la concentración de
ZnATP-2, se ajusta a un modelo de inhibición de tipo mixto total, en tanto que cuando se
varía la concentración de PL, se ajusta a dos modelos: hasta 50 µM de Zn+2 libre se ajusta a
un modelo de inhibición mixto parcial y luego de 50 µM se ajusta a un modelo de
inhibición incompetitiva modificado, en el cual la enzima libre corresponde al complejo Zn-
hPLK.
54
VII. REFERENCIAS
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