Aminoácidos e proteínas

Aminoácidos e

proteínas

Aurenívia Bonifá[email protected]

UFT - Gurupi

Aminoácidos

Características básicas

-grupo carboxila + grupo amino no carbono α

-diferem em suas cadeias laterais (grupos R)

Asparagina

1° aminoácido

descoberto

(1806)

Treonina

20° AA

descoberto

(1938)

Funções dos aminoácidos

L-aminoácido

Moléculas de transporte para:

Grupos NH2

Percussores de:

CetoácidosAminas biogênicasGlicoseNucleotídeosHeme, Creatina

Componentes de:

PeptídeosProteínasFosfolipídeos

Neurotransmissores:

GlutamatoAspartatoGlicina

Classificação dos aminoácidos

Projeção de Fischer

1. Quanto a isomeria óptica:

-Isômeros do tipo “D” e “L”

L-Gliceraldeído D-Gliceraldeído

L-aminoácido D-aminoácido


2. Quanto a essencialidade nutricional

- Essencial – obtidos pela dieta

- Não-essencial – sintetizados pelo organismo

Essencial Não-essencial

Fenilalanina Alanina

Histidina Arginina

Isoleucina Aspartato

Leucina Asparagina

Lisina Cisteína

Metionina Glicina

Treonina Glutamato

Triptofano Glutamina

Valina Prolina

Serina

Tirosina

NH2

C

O

HO

CH2

CH2

NH2

C

O

HO

CH CH2 C

O

NH2

Glicina

Glutamina

NH2

C

O

HO

CH CH

CH3

CH3

Valina

CH2

NH2

C

O

HO

CH CH

CH3

CH3

Isoleucina


3. Quanto a polaridade da cadeia lateral

- Não polares ou polares (não carregado ou carregado)

Aromáticos

Triptofano

Não polar

Valina

Alanina

Leucina Isoleucina

Glicina Prolina

Não-polar, alifáticos

Metionina

Tirosina

Relativamente não polares

Fenilalanina


GlutaminaAsparagina

Polar, não carregados

Treonina

Serina

Cisteína

Glumato

Aspartato

Polar, carregados

LisinaArginina

Histidina

3. Quanto a polaridade da cadeia lateral

- Não polares ou polares (não carregado ou carregado)

Aminoácidos Abreviação Mr pK1(-COOH)

pK2(-NH3

+)

pKR(grupo R)

pI

Grupo R alifáticos, não polares

Glicina Gly G 75 2,34 9,60 5,97

Alanina Ala A 89 2,34 9,69 6,01

Prolina Pro P 115 1,99 10,96 6,48

Valina Val V 117 2,32 9,62 5,97

Leucina Leu L 131 2,36 9,60 5,98

Isoleucina Ile I 131 2,36 9,68 6,02

Metionina Met M 149 2,28 9,21 5,74

Grupos R aromáticos

Fenilalanina Phe F 165 1,83 9,13 5,48

Tirosina Tyr Y 181 2,20 9,11 10,07 5,66

Triptofano Trp W 204 2,38 9,39 5,89

Propriedades dos aminoácidos


pK2(-NH3

+)

pKR(grupo R)

pI

Grupo R não carregados, polares

Serina Ser S 105 2,21 9,15 5,68

Treonina Thr T 119 2,11 9,62 5,87

Cisteína Cys C 121 1,96 10,28 8,18 5,07

Asparagina Asn N 132 2,02 8,80 5,41

Glutamina Gln Q 146 2,17 9,13 5,65



pK2(-NH3

+)

pKR(grupo R)

pI

Grupos R carregados positivamente

Lisina Lys K 146 2,18 8,95 10,53 9,74

Histidina His H 155 1,82 9,17 6,00 7,59

Arginina Arg R 174 2,17 9,04 12,48 10,46

Grupos R carregados negativamente

Aspartato Asp D 133 1,88 9,60 3,65 2,77

Glutamato Glu E 147 2,19 9,67 4,25 3,22


Aminoácidos incomuns

5-hidroxilisina

4-hidroxiprolina

Citrulina

Desmosina

Ornitina

Selenocisteína

Aminoácidos como ácidos e bases

- “Zwitterion” = íon híbrido

- Anfólitos - capaz de agir como ácido ou como base

- AA como ácidos = doam prótons

- AA como base = recebem prótons

AA como um ácido: AA como uma base:

Carga líquida: +1 0 -1

Curva de titulação da glicina

OH- (equivalentes)

Glicina

pKa

Medida de

tendência de um

grupo perder

prótons


Curva para

aminoácidos com

grupo R não ionizável

Curva de titulação da glicina

OH- (equivalentes)

Glicina pI

ponto isoelétrico,

onde a carga

líquida é zero

pH < pI

Carga líquida positiva

pH > pI

Carga líquida negativa


pI = pK1 + pK2

2

Curva para

aminoácidos com

grupo R não ionizável

Curvas de titulação da histidina

AA com grupo R ionizáveis possuem curvas com três estágios

pH 7.6(Ponto isoelétrico)

pH 0.5 pH 5

pH 11

Carga líquida

Proteínas

Características gerais

- Polímeros de

aminoácidos unidos por

ligações peptídicas

- Peso molecular acima

de 10.000 Dalton (Da)

Proteínas

Características gerais

- São estabilizadas por

pontes dissulfeto e pelas

interações fracas não

covalentes (pontes de

hidrogênio e interações

iônicas)

Classificação das proteínas

- Quanto ao número de cadeias polipeptídicas

Monoméricas e Oligoméricas

- Quanto aos seus componentes associados

Simples e Conjugadas

C-terminal

N-terminal

C-terminalN-terminal

α1α2

β1β2Monoméricas

Oligoméricas

Classificação das proteínas

- Quanto ao número de cadeias polipeptídicas

Monoméricas e Oligoméricas

- Quanto aos seus componentes associados

Simples e Conjugadas

Classes Grupo prostético

Lipoproteína Lipídeos

Glicoproteína Carboidratos

Fosfoproteína Grupos fosfato

Hemoproteína Heme (Fe)

Flavoproteína Nucleotídeo flavina

Metaloproteína Ferro

Zinco

Cálcio

Molibdênio

Cobre

Estrutura das proteínas

Primária Indica a sequência

linear dos aminoácidos

SecundáriaOs aminoácidos

interagem através de pontes de hidrogênio

São α-hélice e folha β

α-hélice

folha β


TerciáriaOcorrem interações

entre α-hélice e folha β


α1α2

β1β2

QuaternáriaProteínas com mais de uma

cadeia de aminoácidos

Ligações peptídicas

- Estrutura rígida e planar- Interações de ressonância- Aprox. 40% de característica de dupla ligação- Conformação trans mais frequente que cis

Cadeia principal

Ângulos de torção

Cadeia lateral

Amida plana

Amida plana

Grupo lateral

Ângulos de torção ou ângulos de rotação

Ψ - Cα–N Φ - Cα–C

-São ambos definidos como 180° ou -180°-Aumenta em sentido horário do Cα

Diagrama de Ramachandran

-Indica os ângulos de torção estericamente permitidos;

-Algumas estruturas secundárias já são pré-

determinadas:↑↑ - folha β paralela

↑↓- folha β antiparalelaα - α hélice (direita)

C - hélice do colágenoαL - α hélice (esquerda)

A α hélice

A folha β

Antiparalela (conformação amino-carboxil oposta)

Paralela (conformação amino-carboxil igual)

6.5Å

7Å

Dobras β

- Conecta estruturas de α hélice e folha β

- Conecta folhas β antiparalelas

- Envolve quatro resíduos de AA onde o O do 1° se liga ao H do 4° AA- Glicina e prolina são os AA mais frequentes

As proteínas pode ser fibrosas ou globulares

α-Queratina-Hélice com 5.1Å

-Rica em resíduos de cisteína-Rica em AA hidrofóbicos

protofilamento

Filamentointermediário

superhélice dobrada a esquerda

α-hélice dobrada a direita


Colágeno-hélice orientada para esquerda-três resíduos de AA por passo

Cadeia α

Estrutura secundária


Fibroína da seda-Formada por cadeias polipeptídicas predominantemente em conformação β-Rica em alanina e glicina-Estrutura mantida por numerosas interações fracas


Proteínas globulares-Formada por diferentes arranjos de estruturas secundárias-Enzimas; proteínas transportadoras, motoras e regulatórias; imunoglobulinas; entre outras.

Mioglobina

Padrões estruturais em proteínas globulares

Laço β-α-β Quilha α-α

Conexões típicas em um motivo totalmente β

Conexão cruzada(não observada)

Barril β Folha β retorcida

Conexão orientada para direita entre cadeias β

Conexão orientada para esquerda entre cadeias β

(muito rara)

Padrões estruturais em proteínas globulares

Estrutura quaternária das proteínas

- Proteína multissubunitária ou multímero

- Duas a centenas de subunidades

- Oligômero - poucas subunidades

- Protômero - unidade estrutural repetitiva


α1α2

β1β2

Funções das proteínas

-Envolvem ligação reversível com outras moléculas

-Ligante - molécula que se liga à proteína

-Sítio de ligação - complementar ao ligante (tamanho, forma, carga e caráter hidrofílico ou hidrofóbico)

-Podem existir vários sítios de ligação

-Exibem flexibilidade

-Interação proteína-ligante leva a alteração da conformação da proteína

-A interação proteína-ligante pode ser regulada

Mioglobina

-Proteína ligante ao oxigênio-Mr 14.600

Proteínas de reconhecimento

MHC“major

histocompatibility complex”

Complexo principal de

histocompatibilidade

Separação das proteínas

Centrifugação diferencial

Tecido

tampão

Homo-geneizador

Filtro

Centrifugação

citosol

Sobrena-dante

Pellet

RibossomosMacromoléculas

Membrana plasmáticaFragmentos de REPequenas vesículasFração microssomal

MitocôndriaLisossomosPeroxissomos (plantas; cloroplastos)

NúcleoCitoesqueleto

Células inteiras, tecidos

conectivos

Preparo do extrato bruto

Fracionamento (tamanho e carga)

Tipos:1. Centrifugação

diferencial

2. Centrifugação pelo gradiente de

densidade (isopícnica)

Separação das proteínas

Preparo do extrato bruto

Fracionamento (tamanho e carga)

Tipos:1. Centrifugação

diferencial

2. Centrifugação pelo gradiente de

densidade (isopícnica)

Gradiente de sacarose

Amostra

Centrifugação pelo gradiente de densidade

Componente menos denso

Componente mais denso

Fracionamento

12345678

Centrifugação

Purificação: precipitação com sal

“salting in”

Solubilidade é maior com menor concentração de sal

“salting out”

Solubilidade é menor com maior concentração de sal

Precipitação com sal

Concentração de sal

Camada de hidratação

Solubilidade

“salting out”

Sobrenadante

Precipitado

Proteína alvo

Purificação: diálise

- Processo físico-químico- Separa as proteínas do solvente- Baseado no tamanho das proteínas

Solução tampão

Solução de proteínas

Saco de diálise

Agitador

No equilíbrioNo início da diálise

Solução tampão

Solução de proteínas

Saco de diálise

Proteínasíon

- Interação diferencial dos seus componentes entre a fase estacionária (líquida/sólida) e a fase móvel (líquida/gasosa)

- Beneficia-se das diferenças de carga, tamanho, afinidade de ligação e outras propriedades da proteína

Purificação: cromatografia

A coluna cromatográfica

deve ser de material inerte: Carvão, sílica,

alumínio, fosfato de cálcio,

hidroxiapatita, etc...

Classificação dos tipos de cromatografia

1. Quanto a forma física do sistemaPlanar, em coluna, centrífuga

2. Segundo o modo de separaçãoAdsorção, partição, troca iônica, afinidade

3. De acordo com a fase estacionáriaSólida, liquida, quimicamente ligadas

4. Segundo a fase estacionáriaLíquida, gasosa, supercrítica

Carga positiva líquida grandeCarga positiva líquidaCarga negativa líquidaCarga negativa líquida grande

Cromatografia de troca iônica

As proteínas são separadas de acordo com suas cargas após passarem por

uma coluna contendo cátions/ânions e geralmente de celulose

A matriz utilizada deve ser:- porosa- inerte - natural ou sintética(compostos inorgânicos,resinas sintéticas ou polissacarídeos)

- Insolúvel em águasolventes orgânicos

- Ligada covalentemente a trocadores iônicos

Trocadores iônicos

Trocadores aniônicos Grupos funcionais

Dietilaminoetil (DEAE) -O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2

Aminoetil quaternário (QAE) -O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH3

Amônio quaternário (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3

Trietilaminoetil (TEAE) -O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CH3

Tocadores catiônicos Grupos funcionais

Carboximetil (CM) -O-CH2-COO-

Sulfopropil (SP) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3-

Sulfoetil (SE) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2SO3-

Fosfo (P) -O-PO4-

Metilsulfonato (S) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2SO3-

-

+

+ + +

+

+ +

-

-

-

-

-

+

-

- - -

-

- -

+

+

+

+

+

Trocador aniônico com contra-íons

trocavéis

Trocador catiônico com contra-íons

trocavéis

Os contra-íons podem ser trocados reversivelmente

com outros íons sem alterar as propriedades da matriz

Cromatografia de filtração em gel

Esferas com polímero poroso

grânulo de gel

Matriz do gel

Beneficia-se das diferenças de tamanho das

proteínas

Pequenas moléculas

Grandes moléculas

Solvente

As proteínas são purificadas de acordo

com sua especificidade por um substrato ou

cofator particular

Cromatografia de afinidade

Proteínas ligantes da glicose se ligam aos sítios de glicose (G) nas esferas do gel

Adiciona glicose

Proteínas ligantes da glicose são perdidas com

adição da glicose

Proteína de interesse

ligante

Mistura de proteína

Solução do ligante

Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)

Tempo (minutos)

Ab

so

rbâ

ncia

a 2

20

nm

Coluna do HPLC

Injetor

Solvente

Dados

DetectorBomba Descarte

Bombas de alta-pressão aceleram a movimentação das proteínas pela

coluna, reduzindo o tempo de transito na coluna e aumentando a resolução

Eletroforese

- A proteína é desnaturada e as subunidades se separam- As proteínas migram de acordo com tamanho e forma em um campo elétrico- As moléculas menores migram mais rapidamente através da matriz porosa do gel

Amostra

Poço

Direção da migração

Proteínas

Eletroforese

Gel poroso

Massa (kDa)

Dis

tân

cia

Eletroforese bidimensional

Focalização isoelétrica

Baixo pH(-)

Baixo pH(-)

Alto pH(+)

Alto pH(+)

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