Amilaza 2014

1

α-Amilaza

Predavanja iz Kliničke enzimologije Integrisane akademske studije: Farmacija-

medicinska biohemija Školska 2014/2015. godina

2

Pankreasni enzimi

• Amilaza • Lipaza • Proteolitički enzimi - zimogeni enzimi

– Tripsin – Himotripsin – Elastaza – Karboksipeptidaza

3

α-Amilaza

• Uloga amilaze • Distribucija • Izoenzimi • Klinički značaj • Analitika

4

α-Amilaza

• Alfa-amilaza (EC 3.2.2.1.) • 1,4-alfa-D-glukan glukanohidrolaza; AMY • Klase hidrolaza • Katalizuje hidrolizu 1,4-alfa-D-glikozidnu vezu u polisaharidima • Enzim ne deluje na 1,6-glikozidnu vezu na mestima granjanja

1,4-alfa-D-glikozidna veza

5

Digestija skroba α-amilazom

Maltoza

6

α-Amilaza • Oba poliglikana i pravi lanci (linearni) kao što je amiloza i razgranati

poliglikan kao što je amilopektin se hidrolizuju ali u različitim količinama • U slučaju linearnih lanaca –amiloze

– enzim cepa lanac na alternativnim alfa-1,4- hemiacetalnim vezama (-C-O-C-), dajući maltozu i ostatke glukoze;

• U slučaju razgranatih lanaca – amilopektina – nastaju maltoza, glukoza i neki dekstrini.

7

α-Amilaza

• Struktura pankreasne alfa-amilaze • Amilaze su metaloenzimi zavisni od kalcijuma

• Kalcijum je potreban za funkcionalni integritet

• Puna aktivnost se postiže u prisustvu određenih

anjona: – hlorida, bromida, nitrata, holata ili

– monohidrogen fosfata

– hlorid i bromid su najefikasniji aktivatori

• AMY iz humanog seruma ima pH optimum na 6,9-7,0 (vrlo uzak opseg)

• AMY iz humane plazme su mali molekuli

• Mm varira od 54000 do 62000 Da

• Enzim je dovoljno mali da prolazi kroz glomerularnu membranu bubrega

• AMY je jedini plazmatski enzim prisutan u urinu !

8

α-Amilaza Najviši nivoi su nađeni u:

• salivarnim žlezdama S-tip – Deluje na hranu u ustima i ezofagusu

• pankreasu P-tip – Deluje pri alkalnom pH duodenuma

Distribucija po organima i telesnim tečnostima •AMY je prisutna i u semenoj tečnosti, testisima, ovarijumi,

falopijevim tubama, poprečno-prugastim mišićima, plućima i adipoznom tkivu

•Enzim je prisutan i kolostrumu, suzama i mleku

•Epitelijalni tumori pluća i ovarijuma isto tako mogu da sadrže AMY

•AMY u ascitu i pleuralnoj tečnosti se javlja zbog prisustva tumora ili kod

pankreatitisa

9

Izoenzimi α-amilaze

• Enzim prisutan u normalnom serumu uglavnom je P-AMY ili S-AMY tip

• Ova dva izoenzima su produkti dva bliska lokusa na hromozomu 1

• AMY izoenzimi podležu post-translacionim modifikacijama: – deamidaciji, glikozilaciji i deglikozilaciji i grade izoforme

• Neenzimska deamidacija je verovatno mehanizam za starenje koji se dešava kod pankreasne pseudociste ili usled produženog stajanja seruma

• Iako P-AMY nije glikoziliran, S-AMY može da postoji u obe forme i kao glikoziliran i kao deglikoziliran

• Ove izoforme se mogu razdvojiti i u serumu i u urinu primenom izoelektrofokusiranja ili elektroforezom

• Osobe sa deficijencijom P-AMY u retkim slučajevima, pokazuju znake maldigestije ugljenih hidrata što rezultira abdominalnom nadutošću, gasovima, itd.

10

Klinički značaj α-amilaze • Aktivnost AMY u krvi je fiziološki niska i konstantna

Porast amilaze u serumu 1. Akutni pankreatitis

2. Inflamaciji salivarnih žlezda

Akutni pankreatitis • Porast serumske amilaze 5 do 8 sati od pojave simptoma

• Aktivnosti se tipično spuštaju na normalu posle trećeg ili četvrtog dana

• Uobičajen je porast od 4 do 6 puta iznad URL

• Pik vrednosti za 12 do 72 sata

• Veličina porasta serumske amilaze nije povezana sa težinom oboljenja

• Veći porast → veća je verovatnoća akutnog pankreatitisa

11

Klinički značaj α-amilaze

Akutni pankreatitis • Postoje slučajevi normalnih vrednosti amilaze u akutnom pankreatitisu 19-

32% pri prijemu pacijenta

• Uzroci:

1. Odloženi porast amilaze

2. Insuficijencija pankreasa sekundarno kod hroničnih alkoholičara

3. Hipertrigliceridemija – interferencija sa određivanjem alfa-amilaze – Lažno negativni rezultati

– Uklanjanje lipemije

12

Klinički značaj α-amilaze

Izlučivanje amilaze urinom – klirens amilaze iz cirkulacije • Deo povišene amilaze se izlučuje i putem urina

• Porast aktivnosti serumske amilaze odražava se i na porast amilaze u urinu

• U poređenju sa serumskom amilazom, porast amilaze u urinu je veći i perzistira duže vremena

Klinička specifičnost • Klinička specifičnost amilaze u dijagnostici akutnog pankreatitisa je

niska 20 do 60 %, zavisno od pacijenata koji su obuhvaćeni u ovim proračunima

• Povećanje amilaze nađeno i u nekim intrabdominalnim bolestima i u nekoliko ne-pankreasnih stanja (vidi tabelu)

13

Pankreasne bolesti

Intraabdominalne bolesti različite od pakreatitisa

Genito-urinarne bolesti Razne bolesti

P-AMY ↑ Pankreatitis Trauma pankreasa

P-AMY ↑ Bilijarne bolesti Intestinalne obstrukcije Mezenterični infarkt Perforacija peptičkog ulkusa Gastritis Ruptira aortne aneurizme Akutni apendicitis Peritonitis Trauma

P-AMY ↑ Ektopično kod rupture trudnoće u tubama Salpingitis Maligniteta ovarijuma Renalne insuficijencije P i S tip

S-AMY ↑ Oštećenje salivarnih žlezda Akutnog alkoholizma Dijabetične ketoacidoze Makroamilazemija P i S tip Septički šok Hirurgije srca Tumora Lekova

Uzroci hiperamilazemije

14

Klinički značaj pankreasne α-amilaze

• Nedostatak specifičnosti α-amilaze je usmerilo ispitivanja na merenje P-amilaze umesto ukupne enzimske aktivnosti za diferencijalnu dijagnozu pacijenata sa akutnim abdominalnim bolom

• Ukoliko se primeni najbolja granica odlučivanja (aktivnost koja je ekvivalentna povećanju od 3X URL) klinička specifičnost P-amilaze za dijagnozu akutnog pankreatitisa je veća od 90 %

• Vrednosti P-AMY ostaju povećane u 80 % pacijenata sa nekomplikovanim pankreatitisom jednu nedelju posle pojave, dok samo 30 % još uvek pokazuje povećanje ukupne AMY

• Dugoročno povećanje P-AMY u serumu samo utiče na to da je izlišno merenje ukupne AMY u urinu

– test koji se primenjuje da bi se postigla bolja dijagnostička senzitivnost u kasnoj fazi pankreatitisa

15

Klinički značaj α-amilaze • Hronični hepatitis

– Vrednosti amilaze mogu biti i normalne

• Oboljenje bilijarnog trakta, kao što je holecistitis, uzrokuje povećanje

od 4 puta u aktivnosti serumske P-AMY, a kao rezultat primarnog ili

sekundarne umešanosti pankreasa

• Razni intrabdominalni događaji dovode do značajnog porasta u

aktivnosti serumske P-AMY i do 4x i više

– Ova povećanja su posledica izlaska amilaze iz intestinuma u

peritonealnu šupljinu a potom u cirkulaciju

• U renalnoj insuficijenciji aktivnost serumske amilaze se povećava

proporcionalno oštećenju bubrega

– obično ne više od 5x u odnosu na URL

16

Klinički značaj α-amilaze • Hiperamilazemija se javlja u neoplastičnim oboljenjima

• Tumori pluća

• Kanceri ovarijuma – serozni i mešani (serozni i mukozni) kanceri dovode do hiperamilazemije sa

povećanim S-tipom izoenzima (tj.elektroforetska pokretljivost je kao S-izoenzima)

– povećanjem od 50 x URL

• Isto tako su opisani slučajevi produkcije amilaze kod multiplog mijeloma

• U slučajevima rupture ektopične trudnoće izoenzimi amilaze nisu dobro okarakterisani.

– Povećanje vrednosti amilaze mogu biti P-tipa (uključenost pankreasa u peritonitisu) iako je S-tip prisutan u falopijevim tubama

• Sniženje serumske P-AMY (ispod donje granice) je visoko specifično za egzokrinu pankreasnu insuficijenciju i u tom slučaju se ne primenjuju intubacioni testovi

• Ukoliko je P-AMY normalna, redukovana funkcija pankreasa se ne može isključiti

17

Makroamilazemija

Učestalost makroamilazemije: • 1,95 % u slučajnom uzorku • 2,56% kod osoba sa hiperamilazemijom • 0,98 % kod osoba sa normalnom serumskom amilazom

• Kompleksi amilaze (više S-tipa) i IgG i IgA

• Ovi makroenzimi se ne mogu filtrirati kroz glomerule zbog njihove veličine (Mm veća od 200 000) i ostaju i plazmi gde njihovo prisustvo povećava vrednost amilaze u serumu 2-8x

18

Makroamilazemija Stanje Serumska Serumska Amilaza u Cam:Ccr Serumska Amilaza Lipaza urinu makroamilaza Pankreasna ↑ ↑ ↑ ↑ odsutna Hiperamilazemija Salivarna ↑ N ↓ ili N ↓ ili N odsutna Hiperamilazemija Makroamilazemija ↑ N ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↑ ↑ Tip 1 Makroamilazemija ↑ N ↓ ili N ↓ ↑ ↑ Tip 2 Makroamilazemija N N N ↓ ili N u tragovima Tip 3

Cam : Ccr = klirens amilaze : klirens kreatinina = (Ua/Sa)x (SCr/UCr

19

Klinički značaj makroamilazemije

• Makroamilazemija nije nikakvo oboljenje zato što nema kliničkih simptoma koji prate njegovu pojavu

• To je stečeno benigno stanje koje se javlja kod zdravih osoba i češće kod muškaraca

• Obično se javlja u periodu između 5-7 decenije života.

• Pojava makroamilazemije može biti rani znak pojave bolesti, ali više kao nespecifičan marker

• Bolešću indukovana disproteinemija dovodi do stvaranja kompleksa proteina sa amilazom

• Bolest vezana za stvaranje imunokompleksa

20

Laboratorijska dijagnostika makroamilazemije

• Klinički važno je izdiferencirati makroamilazemiju od drugih stanja vezanih sa hiperamilazemijom

• Pacijent sa hiperamilazemijom, niskim odnosom amilaza/kreatinin klirens (< 1%) i normalnom renalnom funkcijom mora se testirati tj poći od predpostavke da je moguća makroamilazemija

• Definitivno identifikacija makroamilazemije zahteva direktan dokaz postojanja molekula tehnikom ultracentrifugiranja, hromatografije ili drugim fizičkim metodama

• Detekcija hromatografijom je korišćena mnogo godina kao brza i jednostavna metoda zasnovana na selektivnoj precipitaciji makroamilaze u polietilen glikol rastvoru

• Napomena: Cam : Ccr = klirens amilaze : klirens kreatinina = (Ua/Sa)x (SCr/UCr)

21

Određivanje aktivnosti α-amilaze

Istorijski gledano postoje:

•saharogene,

•amiloklastične

•Wolgemunth

•hromolitičke metode

Supstrat je bio skrob

Ranije su bile metode izbora za određivanje aktivnosti AMY.

22


Nove metode

Metoda sa dobro definisanim supstratom sa kraćim glikozil lancima

Korišćenje definisanog supstrata kao i pomoćnih i indikatorskih enzima u

AMY testu je poboljšalo stehiometriju reakcije i dovelo je do povećane kontrole i

konzistentnih uslova hidrolize

Supstrati koji se koriste uključuju kratke oligosaharide

Kada se hidrolizuju sa AMY, mali oligosaharidni supstrati daju tačno definisane

produkte u odnosu na hidrolizu skroba

Supstrati maltopentoza i maltotetroza pokazuju

- dobru stabilnost

- konzistentne produkte hidrolize

- odgovarajuću stehiometriju reakcije

23


Nove metode

A. Određivanje amilaze metodom sa glukoza-6-fosfat dehidrogenazom

B. Određivanje amilaze metodom sa 4-nitrofenil-(4NP)-glikozidnim supstratom

C. Određivanje amilaze metodom sa blokiranim supstratom EBS

D. Određivanje amilaze direktnom metodom sa indikatorom 2-hlor-p- nitrofenil

24

A. Određivanje amilaze metodom sa glukoza-6-fosfat dehidrogenazom

Supstrat maltotetroza

• Meri se NADH na 340 nm • Svaka hidrolizovana veza daje 2 molekula NADH • Nema glukoze i nema maltotrioze • Niže vrednosti aktivnosti amilaze

25

B. Određivanje amilaze metodom sa 4-nitrofenil-(4NP)- glikozidnim supstratom

Supstrat: 4-nitrofenil-(4NP)-glikozidni 4-NP-G(n) maltoheptoza Pomoćni enzim: α-glukozidaza

26

B. Određivanje amilaze metodom sa 4-nitrofenil-(4NP)- glikozidnim supstratom

• 4-NP-glikozidni supstrati se pripremaju vezivanjem 4-nitrofenil

ostatka na redukujući kraj definisanog oligosaharida

• Oligosaharid maltoheptoza (G7) onda je supstrat 4-NP-G7

• AMY cepa supstrat i nastaju slobodni oligosaharidi (G5,G4 i G3) i 4-

NP-G2 (9%), 4-NP-G3 (31 %) i 4-NP-G4( (60%)

• Specifičnost izoenzima

– P-AMY hidrolizuje supstrat u većoj količini nego S-tip u odnosu od 1,8:1

• G6, G1, 4-NP-G6 i 4-NP-G5 ne stvaraju se u dovoljnim količinama

27

B. Određivanje amilaze metodom sa 4-nitrofenil-(4-NP)- glikozidnim supstratom

• U originalnoj metodi rezultat kombinovane hidrolize AMY iz uzorka i

sa reagensom α-glukozidazom (EC 3.2.1.20; maltaza) nastaje više

od 30 % slobodnog NP

• Slobodan NP se meri na 405 nm

• α-glukozidaza ne reaguje sa oligosaharidom dužim od 4 glikozil

ostataka po jednom molekulu

• G4 se hidrolizuje ali vrlo sporo

28


Supstrat: EBS – (ethylidene protected substrate) etilidin blokirajući supstrat blokirajuća grupa je 4,6-etilidin Kovalentna veza Na neredukujući kraj Važnost ove metode ? Stehiometrijski odnos

29


• Fragmenti koji nastaju iz etilidin-4-NP-G7 supstrata su:

• 4-NP-G2 (40%), 4-NP-G3 (40%) i 4-NP-G4 (20%)

• Oslobađanje 4-NP je povećano, a reakciona brzina smanjena proporcionalno,

tako da ova dva efekta kompenzuju jedan drugi

• Novi tip α-glukozidaze (rekombinantni enzim AGH-211) koji u potpunosti

hidrolizuje nitrofenilatnisupstrat

• Kao rezultat cepanje jedne α-glikozidne veze sa AMY dolazi do oslobađanja

jednog molekula 4-NP

• IFCC je optimizirao ovu metodu na 370C i preporučuje se kao referentna

metoda

30

Supstrat: 2-hlor-p-nitrofenil-alfa-D-maltotriozid (CNP-G3)

D. Određivanje amilaze direktnom metodom sa indikatorom 2-hlor-p-nitrofenil

Karakteristike metode:

• Direktna metoda • Nedostatak je mala brzina konverzije supstrata u poređenju sa

sa esejom G4, G5 i G7; • Varijacija u molarnoj apsorpciji CNP je vezana za promene:

– u temperaturi, pH i sadržaju proteina – prisustva aktivatora, kalijum tiocijanata, koje dovodi do alosternih

promena amilaze

31

Biološki materijal

• Amilaza u serumu ili hepariniziranoj plazmi • Izuzev heparina svi ostali antikoagulansi inhibiraju aktivnost amilaze

tako što vezuju kalcijum • Citrat, oksalat i EDTA inhibiraju aktivnost 15 % • Određivanje u porciji urina

Stabilnost • Amilaza je stabilna 4 dana na sobnoj temperaturi • 2 nedelje na 4oC • 1 godina na -25oC • 5 godina na -75oC

Referentne vrednosti • Zavise od metode • IFCC preporučuje 37oC i onda su RV 28 do 100 U/L

32

Metode separacije i određivanja izoenzima α-amilaze

• elektroforeza

• jonoizmenjivačka hromatografija

• izoelektrofokusiranje

• selektivna inhibicija S-AMY pomoću inhibitora iz klice žitarica

• imunoprecipitacijom sa monoklonalnim antitelima i

• imunoinhibicijom

33


• Selektivna inhibicija izoenzima pomoću monoklonalnih antitela

pokazuju zadovoljavajuću preciznost i tačnost

• Praktično i analitički dovoljno brzi da omoguće uvođenje P-AMY u

kliničkoj praksi

• Esej sa duplim monoklonalim antitelima je komercijalno dostupan koji

koristi sinergističko dejstvo dva imunoinhibitorna antitela na S-AMY

• Nakon inhibicije S-AMY aktivnosti, neinhibirana aktivnost P-AMY se

meri korišćenjem supstrata EPS-4-NP-G7

• Ovaj esej je specifičniji i obzirom na cenu i mogućnost primene

automata on može u potpunosti da zameni ukupnu AMY

34


• Lažno pozitivni rezultati P-AMY kod makroamilazemije

• Imunoglobulin je kompleksiran sa amilazom i sprečava monoklona antitela de efikasno inhibiraju S-AMY

• Razdvajanje makroenzima elektroforezom

• Ukoliko nije moguća elektroforetsko razdvajanje makroenzima kompleks se može precipitirati sa PEG rastvorom 6000 (240 g/L)

• Rezidualna aktivnost AMY je manja od 30% u supernatantu je indikativno da je u pitanju makroamilazemija

35

Elektroforetsko razdvajanje izoenzima amilaze

M- makroamilazemija P/S smeša dva uzorka pankreasnog soka i salive S saliva

Posle elektroforeze, makro-AMY obično daje široku traku, jasno razdvojenu od homogenih traka izoenzima amilaze prisutnih u serumu

36

• Kod zdravih osoba P-AMY je oko 40-50 % od ukupne aktivnosti

AMY u serumu

• Primenom imunoinhibicije na 37o C referentni interval za

aktivnost P-AMY je 13-53 U/L

• Serumska P-AMY se ne može detektovati kod dece manje od 6

meseci, ali aktivnost se polako povećava i dostiže vrednost

odraslih do 5 godine života i ovo je rezultat postnatalnog razvoja

egzokrine funkcije pankreasa

• Kod dece ne može koristiti amilaza za dijagnozu akutnog

pankreatitisa već se onda koristi lipaza

Referentne vrednosti za izoenzime α-amilaze

Amilaza 2014

Health & Medicine

Transcript of Amilaza 2014