TRABAJO FIN DE MÁSTER

Alteraciones moleculares y funcionales inducidas

por la agregación de α-sinucleína en el núcleo

dorsal del rafe y su impacto en la actividad

β-glucocerebrosidasa

Autora: Guiomar Rodríguez Periñán

Directora: Dra. Rosario Moratalla, moratalla@cajal.csic.es

Co-directora: Dra Patricia García-Sanz, pgarcia@cajal.csic.es

Afiliación: Grupo de Neurobiología de los ganglios basales, Instituto Cajal (CSIC)

Madrid, 7 de septiembre de 2020

DECLARACIÓN DE LAS DIRECTORAS

Dra. Rosario Moratalla Villalba Laboratorio de Neurobiología de los ganglios basales Dpto. de Neurobiología Funcional y de Sistemas Instituto Cajal Madrid Dra. Patricia Julia García Sanz Laboratorio de Neurobiología de los ganglios basales Dpto. de Neurobiología Funcional y de Sistemas Instituto Cajal Madrid Como Directoras del Trabajo Fin de Master titulado “Alteraciones moleculares y funcionales inducidas por la agregación de α-sinucleína en el núcleo dorsal del rafe y su impacto en la actividad de la glucoce-rebrosidasa” que ha realizado bajo nuestra supervisión Dña. Guiomar Rodríguez Periñán como parte de sus trabajos para la obtención del Título del Máster en Neurociencia por la Universidad Autónoma de Madrid. DECLARAMOS: - Que el trabajo puede ser presentado para su evaluación por la Comisión Académica del Máster. - Que reúne los méritos suficientes para poder ser presentado y defendido públicamente. - Que el uso de animales utilizados en este TFM, está amparado por la autorización del Comité Ético de Experimentación Animal del Instituto Cajal (CEEA-IC) y por el Comité de Ética del CSIC bajo el proyecto financiado por la Comisión Europea, ref: AND-PD-848002 a RM. Madrid, a 4 de Septiembre de 2020 Fdo: Dra. Rosario Moratalla Villalba Fdo: Dra. Patricia Julia García Sanz

MORATALLA VILLALBA M.ROSARIO - DNI 04543995T

Firmado digitalmente por MORATALLA VILLALBA M.ROSARIO - DNI 04543995T Fecha: 2020.09.04 22:25:41 +02'00'

GARCIA SANZ PATRICIA JULIA - 77802391S

Firmado digitalmente por GARCIA SANZ PATRICIA JULIA - 77802391S Fecha: 2020.09.05 16:45:59 +02'00'

3

Índice

ABREVIATURAS…………………………………………………………………………………………………………………………….……….5

RESUMEN Y PALABRAS CLAVE…………………………………………………………………………………………………….………..7

INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………………………………………………………..………8

1. Enfermedad de Parkinson (EP) …………………………………………………………………………………………………….…8

1.1. Definición y epidemiología………………………………………………………………………………………..………….8

1.2. Factores de riesgo…………………………………………………………………………………………………………………8

1.3. Curso de la enfermedad…………………………………………………………………………………….………………….9

2. Neuropatología α-sinucleína……………………………………………………………………………………..………………....10

2.1. Estructura de la α-sinucleína…………………………………………………………………………………….…………10

2.2. Funciones de la α-sinucleína…………………………………………………………………….…………………………10

2.3. Mecanismos de agregación de la α-sinucleína…………………………………………………………………….11

2.4. Mecanismos de toxicidad de la α-sinucleína……………………………………………………………………….12

2.5. Progresión de la patología α-sinucleína…………………………………………………………………..………….14

3. Circuito motor de los ganglios basales…………………………………………………………………………………………..15

4. Bases neurobiológicas y moleculares de los síntomas no motores…………………………………..……………16

4.1. Importancia del NDR y el BNST en los síntomas no motores de la EP………………………………….19

5. Tratamiento de la EP……………………………………………………………………………………………………………………..20

6. Modelos animales de la enfermedad de Parkinson……………………………………………………………..…………22

6.1. Modelos basados en neurotoxinas………………………………………………………………………………..…….22

6.2. Modelos genéticos………………………………………………………………………………………………..…………….24

7. Glucocerebrosidasa y enfermedad de Parkinson………………………………………………..………………………….26

7.1. Glucocerebrosidasa y α-sinucleína………………………………………………………………………..……………27

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS……………………………………………………………………………………………..…………………………30

MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………………………………………………………………….……….31

Animales…………………………………………………………………………………………………………………………………………..31

Inmunohistoquímica…………………………………………………………………………………………………………………………32

Estereología de células TH y TPH2 positivas……………………………………………………………………………………..33

Cuantificación de la expresión de TH y α-Syn mediante análisis de imágenes……………………….………….33

Cuantificación del tamaño del soma de las neuronas TH……………………………………………………..…………..33

Extracción de proteínas y ensayo de actividad………………………………………………………………….……………..34

Análisis estadístico……………………………………………………………………………………………………………………………34

RESULTADOS…………………………………………………………………………………………………………………………………………35

1. Las neuronas dopaminérgicas de la SN y el ATV de los ratones Glong expresan la α-Syn……………….35

1.1. Los ratones Glong no muestran pérdida de las neuronas dopaminérgicas de la SN ni el ATV

con la edad…………………………………………………………………………………………………………………………37

4

1.2. Las neuronas dopaminérgicas de la SN y el ATV de los ratones Glong muestran alteraciones

funcionales y morfológicas asociadas a la edad………………………………………………………………….38

2. Los ratones Glong expresan la α-Syn truncada en las terminales dopaminérgicas del estriado……..41

2.1. Los ratones Glong acumulan la α -Syn humana truncada en el estriado………………………………43

2.2. La expresión de α-Syn truncada reduce la inervación dopaminérgica estriatal con la edad…44

3. Los ratones Glong expresan la α-Syn humana truncada en el NDR…………………………………………………45

3.1. La expresión de α-Syn humana truncada en el NDR no produce muerte neuronal

dopaminérgica ni serotoninérgica……………………………………………………………………………………….48

4. La α -Syn se acumula en las fibras dopaminérgicas del BNST de los ratones Glong………………………..50

4.1. La expresión de α-Syn truncada en las neuronas dopaminérgicas produce una pérdida

progresiva de la inervación dopaminérgica al BNST…………………………………………………………….51

5. La actividad GCasa tiende a disminuir con la edad en la sustancia negra y el núcleo dorsal del rafe

de los ratones Glong………………………………………………………………………………………………………………………52

DISCUSIÓN……………………………………………………………………………………………………………………………………….…..54

1. Acumulación de la α-Syn humana truncada (1-120) en el modelo Glong……………………………………….54

2. Efecto provocado en las neuronas dopaminérgicas de la SN y el ATV…………………………………………….55

3. Efecto provocado en la inervación dopaminérgica del estriado……………………………………………………..56

4. Efecto provocado en las neuronas dopaminérgicas y serotoninérgicas del NDR……………………….……57

5. Efecto provocado en la inervación dopaminérgica del BNST………………………………………………………….57

6. Efecto provocado en la actividad GCasa de la SN, el Str y el NDR……………………….………………………….58

7. Ventajas y limitaciones del modelo Glong……………………………………………………………………………..………63

CONCLUSIONES…………………………………………………………………………………………………………………………….………65

REFERENCIAS………………………………………………………………………………………………………………………………………..66

5

Abreviaturas

α-Syn: α-sinucleína

5-HIAA: Ácido 5-hidroxindolacético

5-HT: Serotonina o 5-hidroxitriptamina.

6-OHDA: 6-hidroxidopamina.

AAV: Virus adenoasociado.

ADPD: Enfermedad de Parkinson autosómica dominante.

AG: Aparato de Golgi.

AMB: Ambroxol.

ATP: Trifosfato de adenosina o adenosín trifosfato.

ATV: Área tegmental ventral

BHE: Barrera hematoencefálica.

BNST: Núcleo del lecho de la estría terminal

CBE: Conduritol β epóxido.

DA: Dopamina.

EP: Enfermedad de Parkinson

ERE: Estrés del RE.

GBA1-PD: Pacientes con EP que portan una mutación en el gen GBA1.

GCasa: β-glucocerebrosidasa.

GlcCer: Glucosilceramida.

GlcSph: Glucosilesfingosina.

GP: Globo pálido.

GPm: Globo pálido medial.

HIFU: Ultrasonido focalizado de alta intensidad.

KO: Knock out.

L-DOPA: Levodopa o L-3,4 dihidroxifenilalanina.

LPS: Lipopolisacárido.

6

MAO-B: Monoamino oxidasa B.

MPP+: 1-metil-4-fenilpiridinio.

MPTP: 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina.

NA: Noradrenalina.

NAC: Componente no amiloide.

NDR: Núcleo dorsal del rafe.

NST: Núcleo subtalámico.

RBD: Trastorno de conducta del sueño REM.

RE: Retículo endoplásmico.

RNAi: ARN interferentes.

ROS: Especies reactivas de oxígeno.

SERT: Transportadores de 5-HT.

SN: Sustancia negra.

SNC: Sistema nervioso central.

SNpc: Sustancia negra pars compacta.

SNr: Sustancia negra pars reticulata.

Str: Estriado.

TH: Tiroxina hidroxilasa.

TH+: Tiroxina hidroxilasa positivas.

TPH2: Triptófano hidroxilasa 2.

TPH2+: Triptófano hidroxilasa 2 positivas.

VMAT2: Transportador vesicular de monoaminas 2.

WT: Wild type.

7

Resumen y palabras clave

Resumen La enfermedad de Parkinson es la segunda enfermedad neurodegenerativa más frecuente en el mundo.

Una de sus principales características es la agregación de la α-sinucleína, implicada en la degeneración de

las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra. Además, se ha relacionado con la aparición de

síntomas no motores como la ansiedad y la depresión, cuyo sustrato anatómico es el núcleo dorsal del

rafe, entre otras estructuras. En este trabajo hemos determinado la acumulación de α-sinucleína en las

neuronas dopaminérgicas del núcleo dorsal del rafe y su impacto en la población neuronal dopaminérgica

y serotoninérgica de esta estructura y de las terminales que proyectan al núcleo del lecho de la estria

terminal, realizando estudios de estereología y análisis de imagen. Para ello, previamente, hemos

establecido características del ratón Glong, que expresa la α-Syn humana truncada (1-120) como modelo

de la enfermedad de Parkinson, estudiando la acumulación de α-Syn en la sustancia negra, el área

tegmental ventral y el estriado y las alteraciones celulares y funcionales asociadas. Por último, hemos

determinado los cambios de la actividad de la enzima lisosomal GCasa1 producidos por la α-sinucleína y

por la edad mediante ensayos de actividad enzimática. En este estudio hemos demostrado que el ratón

Glong, modelo de la enfermedad de Parkinson, muestra daños patológicos en las células dopaminérgicas

de la sustancia negra y el área tegmental ventral, así como pérdida de las terminales que proyectan al

estriado y al núcleo del lecho de la estría terminal. Así, hemos podido relacionar estos daños con cambios

comportamentales observados en este modelo previamente en el laboratorio. Este modelo también

presenta una reducción en la actividad glucocerebrosidasa debido a la acumulación de la α-Syn humana

truncada (forma patológica), lo que podría estar dificultando el aclaramiento de esta proteína. La ausencia

de α-Syn también provoca una reducción en la actividad glucocerebrosidasa en los ratones Ola Hsd

(deficientes en α-Syn), ya que estas dos proteínas se regulan mutuamente.

Palabras clave: Enfermedad de Parkinson, α-sinucleína, núcleo dorsal del rafe, núcleo del lecho de la

estría terminal, síntomas no motores.

8

Introducción

Enfermedad de Parkinson

Definición y epidemiología La enfermedad de Parkinson (EP) fue descrita por primera vez por James Parkinson en 1817 como

“parálisis agitante”, obteniendo su nombre actual a finales del siglo XIX por el neurólogo francés Jean-

Martin Charcot. Es la segunda enfermedad neurodegenerativa más frecuente en el mundo tras la

enfermedad de Alzheimer. Se trata de una enfermedad progresiva y multifactorial que afecta a unas

150.000 personas en España1 y a unos 7 millones de personas en el mundo2, caracterizada por la pérdida

de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta (SNpc).

Pertenece al grupo de las llamadas sinucleinopatías, junto con la demencia con cuerpos de Lewy y la

atrofia multisistémica, con las que comparte la característica más importante de su patología, la

acumulación de α-sinucleína (α-Syn), el mayor componente de los cuerpos y las neuritas de Lewy3. Esta

proteína juega un papel importante en el desarrollo de estas enfermedades, en las que se produce un

procesamiento aberrante de la misma4.

Los mecanismos moleculares más importantes implicados en la EP incluyen: disfunción mitocondrial,

estrés oxidativo elevado, alteración de la proteostasis y neuroinflamación. La alteración de estos procesos

favorece diferentes disfunciones fisiológicas en las neuronas más vulnerables a la enfermedad5. La EP es

principalmente un desorden del movimiento, pero también cursa con síntomas no motores como

ansiedad, depresión, hiposmia, estreñimiento, trastornos del sueño, demencia, etc6.

Factores de riesgo La EP es una enfermedad multifactorial en la que intervienen factores genéticos, ambientales y la edad,

así como una compleja interacción entre ellos.

El más importante de estos factores es la edad, ya que la incidencia de la enfermedad aumenta

considerablemente en grupos poblacionales de edad creciente: de un 1% en personas mayores de 60 años

a un 4% en aquellas mayores de 85 años7.

Un 5-10% de los pacientes poseen EP familiar causada por la herencia de mutaciones genéticas en genes

como SNCA (α-sinucleína), PRKN (parkina), o PINK1. De hecho, un 50% de los pacientes de EP de inicio

temprano (antes de los 40 años) tienen una mutación en DJ-1, PRKN o PINK18. Además, mediante estudios

GWAS se han identificado variantes genéticas comunes en genes como GBA1, LRRK2 o NR4A2 (Nurr1) que

contribuyen a incrementar la susceptibilidad a la enfermedad. Pero, la genética solo explica un 5-10% de

los casos, ya que la mayoría de los pacientes (90%) tienen EP esporádica (idiopática)9.

Dentro de los factores de riesgo ambientales, la exposición a pesticidas y herbicidas como el paraquat y

la rotenona se ha correlacionado con un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad; pero también son

importantes la dieta, el estrés oxidativo, las infecciones virales y la exposición a metales pesados como

9

manganeso y hierro9. Estos factores ambientales, junto con las variantes genéticas citadas, favorecen la

disfunción mitocondrial, el daño oxidativo, la fosforilación y el plegamiento anormal de proteínas, y la

formación de depósitos intracitoplasmáticos en forma de cuerpos de Lewy, lo que promueve el desarrollo

de la enfermedad.

La prevalencia en hombres es algo mayor que en mujeres por razones desconocidas, aunque se debate

un posible papel de los estrógenos. Por ello, el sexo masculino podría considerarse otro factor de riesgo8.

Y también existe una mayor prevalencia en la población caucásica frente a otros grupos poblacionales.

Cada uno de los factores, de forma aislada, no es suficiente para generar la EP. Por tanto, la etiología de

la mayoría de los casos de EP es probablemente compleja e implica una interacción entre el

envejecimiento, la susceptibilidad genética y los factores ambientales9.

Curso de la enfermedad La edad media de inicio de la enfermedad está en los 60 años, con una expectativa de vida de unos 15

años desde el diagnóstico. A pesar de esto, la enfermedad puede ocurrir de forma temprana o tardía. La

mayoría de los pacientes de inicio temprano (antes de los 40 años) tiene una historia familiar positiva de

EP y una larga duración de la enfermedad, mientras que los pacientes de inicio tardío (diagnosticados

alrededor de los 70 años) suelen tener un curso más complejo de la enfermedad con una corta duración

y una progresión más rápida3.

Pero también podemos dividir los casos de EP en genéticos y esporádicos. La EP idiopática se divide en

dos fases: una primera fase, denominada fase premotora (preclínica) que cursa con síntomas inespecíficos

como hiposmia (olfacción disminuida), estreñimiento, depresión, fatiga y trastornos del sueño; y una

segunda fase, en la que aparecen signos motores leves: ligera pérdida de habilidades y destrezas que

dificultan la ejecución de tareas específicas, descoordinación motora.

Para medir el avance de la enfermedad, a lo largo del tiempo han ido surgiendo diferentes escalas que

dividen el curso de la enfermedad en estadios: clínicos, si se basan en las manifestaciones clínicas de la

enfermedad o histopatológicos, si se basan en la patología cerebral. La escala de Hoehn y Yahr10 divide la

enfermedad en 5 estadios clínicos, en los que se progresa desde la aparición del temblor hasta la

imposibilidad de movilidad de manera independiente. La escala de Braak11 la divide en 6 estadios

histopatológicos, dependiendo de la presencia de cuerpos de Lewy en diferentes núcleos cerebrales,

empezando su aparición en el núcleo motor dorsal del vago, pasando por el núcleo del rafe y la formación

reticular hasta llegar a la corteza cerebral, cuando el cerebro se haya inundado de cuerpos de Lewy.

10

Neuropatología: α-sinucleína

Estructura de la α-sinucleína La α-sinucleína (α-Syn) es una pequeña proteína acídica compuesta por 140 aminoácidos2, que se localiza

en el sistema nervioso central (SNC), fundamentalmente en las terminales nerviosas presinápticas3.

Está compuesta por tres dominios: el dominio N-terminal

(1-60), que contiene repeticiones de la secuencia

KTKEGV, de unión a lípidos y que posee una estructura de

α-hélice anfipática; el dominio central (61-95) o

componente no amiloide (NAC), hidrofóbico e implicado

en la formación y agregación de las fibrillas; y el dominio

C-terminal (96-140) acídico, que posee una alta carga

negativa y juega un papel importante en la función,

solubilidad e interacción de la α-Syn con otras proteínas

(Fig. 1 y 2) .

Funciones de la α-sinucleína Es una de las proteínas más abundantes del sistema nervioso, con importantes funcionales reguladoras,

incluyendo el metabolismo lipídico12, el mantenimiento de las sinapsis, el metabolismo dopaminérgico y

la actividad chaperona3.

Su papel en la neurotransmisión sináptica está bien establecido y existen evidencias que confirman su

importancia en la síntesis de neurotransmisores, la función mitocondrial, la regulación de la expresión

génica y epigenética. Todas estas funciones sugieren cómo la pérdida de la α-Syn soluble puede alterar la

función celular13.

Además, esta proteína participa en el mantenimiento de la homeostasis mitocondrial, a la que influye

modulando su potencial de membrana, homeostasis del calcio, liberación del citocromo C, producción de

ATP y dinámica fusión/fisión13.

Su función es crucial para algunas poblaciones neuronales, lo que sugiere que la EP podría resultar de una

pérdida de función de la α-Syn, ya que está implicada en el mantenimiento de la viabilidad de las neuronas

dopaminérgicas nigroestriatales13.

Se ha demostrado su implicación en el desarrollo de un subconjunto de neuronas dopaminérgicas

mediante el uso de modelos animales, ya que la eliminación de la α-Syn endógena en algunos modelos

conlleva un menor número de neuronas dopaminérgicas en la SNpc, ocurriendo en el desarrollo y

persistiendo en la vida adulta14.

11

Mecanismos de agregación La primera evidencia de la conexión genética entre la EP y la α-Syn fue declarada por Polymeropoulos y

colaboradores en 1997. El grupo descubrió una mutación puntual en el gen SNCA, la A53T, en miembros

de una familia con una historia de EP autosómica dominante (ADPD). Desde entonces, se han encontrado

otras muchas mutaciones, sobre todo en su región N-terminal. Estas mutaciones han dado lugar a las

siguientes sustituciones: A30P, E46K, H50Q, G51D, A53E y A53T. Se considera que estas mutaciones

alteran la estructura de la proteína, produciendo cambios en la oligomerización, agregación y

citotoxicidad de la misma12.

En cuanto a su estructura conformacional, la α-Syn es una proteína desestructurada en su conformación

nativa y puede adoptar diferentes conformaciones dependiendo del ambiente. Además, interacciona

fácilmente con otros ligandos como lípidos de membrana o proteínas3. En la célula y en condiciones

fisiológicas, la α-Syn se encuentra en un equilibrio dinámico entre monómeros desplegados y tetrámeros

con estructura helicoidal, solubles y con baja tendencia a agregar15.

Su acumulación se considera un aspecto central en la patogénesis de la EP, en la que aparecen

mutaciones, multiplicaciones y polimorfismos del gen SNCA, lo que produce una proteína anormal que se

genera de forma incrementada y se acumula7. Pero, además, existen otros muchos factores que favorecen

su agregación, como alteraciones de las condiciones fisiológicas, exposición a metales, pesticidas,

modificaciones postraduccionales de la proteína (oxidación, nitración), poliaminas, glicosaminoglicanos,

alteración de su interacción con las membranas, alta temperatura, bajo pH; y también factores que

disminuyen la agregación, como las chaperonas16.

La agregación de la α-Syn es un proceso de polimerización dependiente de nucleación que se caracteriza

por una primera fase de nucleación y una segunda fase de crecimiento exponencial, llamada elongación.

Durante este proceso, los monómeros desestructurados de α-Syn adquieren una estructura secundaria

que contiene principalmente láminas β antiparalelas. Esta estructura permite que el dominio central de

la proteína quede accesible para establecer interacciones hidrofóbicas que facilitan su agregación y la

formación de oligómeros intermedios o núcleo. Durante la fase de elongación, el núcleo va creciendo

mediante la adición de monómeros que forman oligómeros maduros, protofibrillas y fibrillas amiloides

insolubles, que finalmente se acumulan en los cuerpos y neuritas Lewy (Fig. 3). Pero, además, la transición

conformacional de la α-Syn implica un intermediario helicoidal antes de convertirse en fibrillas de hoja

beta. Este podría suponer un intermediario obligatorio del proceso de auto-ensamblaje de la α-Syn16.

12

Mecanismos de toxicidad de la α-sinucleína Tanto el malplegamiento como la agregación de la α-Syn se consideran actualmente causantes de la

disfunción sináptica en la EP. Sin embargo, aún no está claro si la patología es una consecuencia de una

ganancia de función tóxica o de una pérdida de su función fisiológica normal. Probablemente, la patología

sea consecuencia de ambos procesos12.

Existen muchas evidencias sobre la citotoxicidad de la patología α-Syn y la afectación de diversos procesos

celulares, como la proteostasis celular, la función mitocondrial, la función sináptica, el transporte axonal,

el citoesqueleto, el aparato de Golgi, etc. Esta afectación puede producirse a través de diferentes

mecanismos. La α-Syn puede alterar la función de la mayoría de los orgánulos celulares secuestrando

proteínas importantes o alterando físicamente diferentes procesos celulares, produciendo patologías que

llevan a la muerte celular, especialmente en las células dopaminérgicas de la sustancia negra (SN),

probablemente porque son uno de los tipos celulares con más demanda energética debido a su largo axón

y a la elevada arborización de las terminales17, aunque las razones no se conocen con exactitud.

Estudios en ratones transgénicos han mostrado que la formación de fibrillas es un evento patogénico

importante. Sin embargo, existen evidencias en sistemas in vitro y en modelos animales que indican que

los agregados de α-Syn oligoméricos solubles, intermedios en la formación de las fibrillas, pueden ser

citotóxicos, uniéndose y alterando la función de las membranas y contribuyendo a la muerte neuronal15,16.

Uno de los daños más importantes se produce sobre la función sináptica. Por un lado, los agregados de

α-Syn se unen a componentes clave de la función sináptica como las proteínas SNARE, impidiendo la

formación del complejo y a las vesículas sinápticas, formando clústeres, limitando su tráfico normal y

alterando la neurotransmisión. Por otro lado, las formas oligoméricas de la α-Syn también interaccionan

con las vesículas generando poros en su superficie, lo que provoca la salida de los neurotransmisores. En

el caso de la dopamina (DA), debido a su alta reactividad, esta salida aumenta el estrés oxidativo y la

oligomerización de la α-Syn. Además, niveles altos de α-Syn pueden alterar la neurotransmisión

dopaminérgica mediante la modulación de la actividad de la tiroxina hidroxilasa (TH), enzima limitante en

la producción de DA. También, la α-Syn puede unirse al transportador de la DA e inhibir su recaptación.

Otras evidencias muestran que la acumulación de α-Syn en la hendidura sináptica también puede ser

dañina12.

La α-Syn también puede promover la disfunción mitocondrial. Diversos estudios muestran la acumulación

de α-Syn en las mitocondrias de la SN y del estriado en cerebros de pacientes de EP y de ratones

transgénicos y esto se ha relacionado con alteraciones de la arquitectura fisiológica de las membranas y

con la disfunción del complejo I12. También se ha confirmado in vitro y en modelos celulares18. Otros

mecanismos propuestos por los que la α-Syn puede afectar a la mitocondria incluyen la alteración de la

morfología y la dinámica mitocondrial (especialmente los procesos de fusión), el transporte, la

permeabilidad y el potencial de la membrana mitocondrial, la mitofagia (aclaramiento de las mitocondrias

disfuncionales) y el incremento de especies reactivas de oxígeno (ROS) mitocondriales18.

La α-Syn también puede afectar a compartimentos como el retículo endoplásmico (RE) y el aparato de

Golgi (AG). La colocalización de α-Syn difusa con marcadores de estrés del RE (ERE) y la presencia de

oligómeros de α-Syn en el RE de cerebros de pacientes de EP sugiere que la α-Syn puede inducir el ERE

observado en las sinucleinopatías. Esto se ha confirmado en modelos celulares y animales de EP, en los

que las neuronas afectadas por la patología α-Syn muestran diferentes marcadores de ERE como son el

13

incremento en las chaperonas, las anomalías morfológicas indicativas de disfunción y el aumento de

factores de transcripción asociados a la respuesta a proteínas desplegadas. De forma importante, la

inhibición farmacológica del ERE retrasa los síntomas de la enfermedad y reduce la acumulación de los

oligómeros de α-Syn. Esto puede afectar al tráfico RE-AG, lo que lleva a la fragmentación de este último

de forma dependiente de la concentración de α-Syn18.

La acumulación de α-Syn también puede alterar los diferentes mecanismos de proteostasis celular. Los

agregados de α-Syn pueden bloquear la macroautofagia mediante su unión a los componentes esenciales

de la vía autofágica lisosomal. De la misma forma, la α-Syn mutada puede alterar la autofagia mediada

por chaperonas al unirse al receptor lisosomal LAMP2A, impidiendo la entrada de los cargos al lisosoma y

con ello, su degradación. La patología α-Syn también puede provocar la disfunción del proteasoma

mediante el bloqueo estérico de su maquinaria. La alteración de todos estos mecanismos de proteostasis

lleva a una mayor acumulación de la α-Syn, además de otros sustratos, lo que altera la homeostasis

celular18.

Una de las vías por las que se genera estrés oxidativo a partir de la patología α-Syn es mediante la

activación de las células microgliales. Esta activación lleva a múltiples cambios proinflamatorios que

provocan neurotoxicidad, incluyendo el incremento de la producción de ROS y la activación de los

astrocitos, que rápidamente aumentan las moléculas de señalización inflamatoria, favoreciendo la

pérdida de neuronas dopaminérgicas en la SN, aunque también se ha observado acumulación de α-Syn

en los astrocitos de la neocorteza y del estriado en tejido post-mortem de pacientes de EP19. Además, la

carga de ROS procedente de la activación microglial inducida por la α-Syn es especialmente perjudicial

para las neuronas dopaminérgicas que ya sufrían un daño mitocondrial, lo que aumenta la disfunción de

las neuronas dopaminérgicas y la muerte celular. Así, el ciclo de acumulación proteica, microglía

inflamatoria y daño neuronal contribuye a la naturaleza progresiva de la EP19.

Además de funcionalmente, la patología α-Syn puede afectar estructuralmente a la célula. Mediante la

unión a proteínas como la tubulina, MAPT2 y Tau, la α-Syn puede inhibir la formación de microtúbulos,

alterando la morfología de la red de neuritas o provocando su desestabilización y, con ello, la

degeneración de las neuritas. Estas interacciones también pueden afectar al transporte axonal de

proteínas y orgánulos18. De igual forma, la patología α-Syn puede promover la permeabilización de las

membranas, ya que genera alteraciones estructurales tanto de la membrana plasmática como de las

membranas intracelulares, el incremento de los niveles intracelulares de calcio y la activación de la

calpaína y la desregulación de la transmisión sináptica, alterando con todo ello la homeostasis celular18.

Todas estas alteraciones celulares provocadas por la α-Syn comprometen la función neuronal y la

supervivencia, promoviendo la degeneración y muerte neuronal.

Como hemos visto, la interacción de la α-Syn con las membranas es un aspecto importante de la biología

de la α-Syn. Esto explica por qué muchas vías asociadas a la patobiología, como el tráfico intracelular, la

función mitocondrial e incluso la transferencia célula a célula están relacionadas con interacciones

membranales18.

14

Progresión de la patología α-sinucleína La iniciación y la progresión de la patología α-Syn-Lewy en la EP fue investigada por primera vez en

humanos por Braak y colaboradores11, que propusieron un estadiaje basado en la localización topográfica

de la patología en un gran número de muestras cerebrales post-mortem derivadas de pacientes con EP

(Fig. 4). Se hipotetizó que la iniciación ocurre en la mucosa periférica y en el sistema nervioso entérico,

viaja al cerebro a través de los nervios vago y olfatorio y progresa a estructuras particulares cerebrales

con un patrón predecible. Este patrón comienza en el tronco encefálico caudal (núcleo motor dorsal del

vago y del glosofaríngeo) y en el bulbo olfatorio (núcleo olfatorio anterior) (estadio 1), asciende hasta el

tegmento pontino (estadio 2), al mesencéfalo (estadio 3) y al mesocortex (estadio 4) y finalmente culmina

en una amplia difusión por la neocorteza (estadios 5 y 6).

Esto es consistente con el patrón y la secuencia de aparición de los síntomas en el curso de la enfermedad

en la mayoría de los casos6, que además apoyan el concepto de la difusión de las deposiciones de la α-Syn

a través del plexo autonómico desde el intestino hasta el tronco encefálico y hacia la corteza20.

Se ha propuesto un comportamiento priónico de la α-Syn patológica, lo que implica la habilidad de

propagarse alterando la conformación de la α-Syn nativa, generando formas potencialmente tóxicas21.

Las fibras de α-Syn reclutan monómeros de α-Syn endógena (nativa) para extender la patología

intracelular (Fig. 3), que es resistente a la degradación proteolítica y al aclaramiento celular22.

Estudios basados en muestras humanas y animales muestran que la patología α-Syn se propaga célula a

célula de forma trans-sináptica mediante diversos mecanismos de captación y liberación, incluyendo

transmisión anterógrada y retrógrada, lo que permite que la patología se vaya extendiendo entre regiones

cerebrales conectadas anatómicamente21,23. Existen diversas evidencias tanto en modelos celulares y

animales, como en estudios en pacientes de EP que confirman este tipo de difusión. Entre ellas, destaca

la observación de la presencia de cuerpos de Lewy en neuronas dopaminérgicas mesencefálicas

trasplantadas en el estriado de pacientes de EP más de una década después del trasplante, lo que sugiere

que la patología de Lewy se propaga desde el huésped a las células implantadas24.

Todo esto ayuda a entender la propagación de la patología de unas regiones cerebrales a otras.

15

Circuito motor de los ganglios basales Como hemos comentado anteriormente, en la EP se produce la degeneración de las neuronas

dopaminérgicas de la SNpc, lo que conlleva a la depleción de los niveles de DA. Ya que la principal diana

de estas neuronas es el estriado dorsal, su degeneración y la disminución en los niveles de DA provocan

cambios postsinápticos e incluso la remodelación de las neuronas estriatales25 con pérdida de espinas

dendríticas y reducción del árbol dendrítico26–29 debido a la pérdida de DA30 y, en particular, a la falta de

señalización del receptor dopaminérgico D129.

Estas estructuras forman parte del circuito motor de los ganglios basales, principal sustrato anatómico de

los cambios que se producen en la EP y cuyo desequilibrio explica la aparición de los síntomas motores

típicos de la enfermedad25. Los ganglios basales están formados por una serie de núcleos subcorticales

interconectados muy conservados en su circuito central y en sus tipos celulares en todos los vertebrados.

El circuito córtico-basal comprende estructuras corticales y subcorticales que incluyen el estriado

(caudado y putamen), el globo pálido (lateral y medial), la SN, el núcleo subtalámico y el tálamo31.

Cualquier acción voluntaria requiere extraer información de la experiencia para ejecutar los movimientos

que permitan alcanzar el objetivo. Así, este circuito integra la inferencia, la planificación, la selección y la

ejecución para el control voluntario31.

En este circuito, la corteza cerebral, el tálamo y la SNpc envían conexiones excitatorias (flechas verdes) al

estriado, núcleo principal de entrada de información a los ganglios basales (Fig. 5). La salida de la

información se origina en el globo pálido medial (GPm) y la sustancia negra pars reticulata (SNr),

dirigiéndose al tálamo, que proyecta a áreas frontales de la corteza cerebral25. Este circuito está

compuesto por dos vías: la directa y la indirecta. La vía directa se origina en las neuronas de proyección

estriatales (azules), cuyos axones (flechas azules) proyectan al GPm y la SNr. La vía indirecta se origina en

las neuronas estriato-palidales (rojas),

cuyos axones (flechas rojas) terminan

en el globo pálido (GP). Las neuronas de

este núcleo, a su vez, proyectan al

núcleo subtalámico (NST), que proyecta

al GPm y a la SNr. Así, las neuronas

estriato-palidales están conectadas

indirectamente, a través del GP y el NST

con los núcleos de salida de los ganglios

basales25. En la EP se produce un

desequilibrio en la función de las vías

directa e indirecta de los ganglios

basales25.

Aunque las principales proyecciones eferentes del sistema dopaminérgico mesencefálico se dirigen al

estriado y la corteza, también existen proyecciones al tálamo, la amígdala, el hipocampo y el GP. A su vez,

la SN recibe aferencias de diferentes estructuras, que juegan un papel en la regulación de las células

dopaminérgicas y en el procesamiento de los estímulos salientes32.

16

Bases neurobiológicas y moleculares de los síntomas no motores Hasta hace relativamente poco, la EP ha sido considerada principalmente un desorden del movimiento.

Sin embargo, aunque el diagnóstico de la EP se basa en la detección de los síntomas motores causados

por el déficit de dopamina en el estriado, esta enfermedad también está asociada a déficits de otros

neurotransmisores causantes de otros síntomas motores y no motores. Algunos de ellos, como la

hiposmia, el trastorno de conducta del sueño REM (RBD por sus siglas en inglés), la depresión o el

estreñimiento, pueden desarrollarse de forma insidiosa en la fase prodrómica de la enfermedad,

precediendo en varios años a los síntomas motores relacionados con el déficit de dopamina6.

Tanto la duración de la fase prodrómica como la secuencia de aparición y el desarrollo de los síntomas no

motores son variables entre pacientes. Pero estos síntomas también pueden aparecer o agravarse en

fases más avanzadas de la enfermedad, como los déficits cognitivos, que se vuelven más significativos en

los últimos años de la enfermedad. De hecho, con el progreso de la neurodegeneración y el avance de la

enfermedad, los problemas no motores comienzan a dominar el cuadro clínico de los pacientes y son los

determinantes principales de la calidad de vida y la institucionalización de estas personas6.

Uno de estos síntomas no motores es la hiposmia, que se desarrolla en más del 90% de los pacientes, por

lo que podría representar un biomarcador en la fase premotora temprana de la enfermedad. El bulbo

olfatorio de estos pacientes disminuye de tamaño y presenta cuerpos y neuritas de Lewy, presentes

también en otras regiones cerebrales relacionadas con la olfacción6.

Otras características comunes de la EP son los cambios en la función sensorial y el inicio del dolor, que

afectan a entre el 30 y el 85% de los pacientes y tienen su base en la desregulación del circuito córtico-

basal y del sistema dopaminérgico. Por ello, el dolor es más frecuente en los periodos off y la medicación

de reemplazo aumenta el umbral del dolor. Sin embargo, la medicación dopaminérgica no elimina el dolor

en la EP, por lo que otros mecanismos adicionales pueden estar implicados6.

Las vías ascendentes y descendentes están implicadas en el dolor. De hecho, el tracto espinotalámico

envía colaterales a estructuras como el locus coeruleus (noradrenérgico) o el núcleo del rafe

(serotoninérgico, dopaminérgico y glutamatérgico)33,34, que además reciben aferencias de grandes

centros para el control de la sensibilidad y excitabilidad de los sistemas somatosensoriales. Además, estas

estructuras envían fibras descendentes a la columna dorsal de la médula espinal, que modula el

procesamiento del dolor6. La participación en el dolor de las diferentes vías de neurotransmisión (DA, 5-

HT, NA) dificulta encontrar un tratamiento específico para su alivio. Estas estructuras (locus coeruleus y

núcleo del rafe) están afectadas por cambios patológicos en la EP, así como los sistemas de

neurotransmisión que controlan, lo que determina su implicación en estos síntomas no motores35.

La EP también cursa con características neuropsiquiátricas como la ansiedad y la depresión, que aparecen

desde la fase prodrómica premotora hasta las últimas fases de la enfermedad, lo que sugiere una base

independiente de las vías nigroestriatales. Sin embargo, estos síntomas fluctúan con el estado motor

(sobre todo la ansiedad, que predomina en los periodos off, asociados a bajos niveles de dopamina)6. De

hecho, la patogénesis de estos síntomas puede ser específica en la EP y diferir de la de los pacientes sin

EP36.

17

La ansiedad afecta a más de un 60% de los pacientes y suele aparecer acompañada de depresión,

clínicamente significativa en un 35% de los pacientes. Tienen bases neuroquímicas diferentes y existen

diferentes fenotipos en individuos con la EP37.

La ansiedad se ha relacionado con la disfunción o desregulación de los sistemas dopaminérgico,

noradrenérgico y serotoninérgico38,39. Uno de los sustratos neuroanatómicos más caracterizados en la

ansiedad es el núcleo del lecho de la estría terminal (BNST por sus siglas en inglés), ya que esta estructura

es central en el circuito de la respuesta comportamental al estrés40, pero también se han visto implicadas

estructuras como la amígdala38,41 y el núcleo dorsal del rafe (NDR)39,42, centro serotoninérgico del SNC,

relacionado con los desórdenes afectivos y con un papel importante en las respuestas fisiológicas y

comportamentales relacionadas con la ansiedad42. En esta estructura se ha observado tanto patología α-

Syn como pérdida neuronal previas a la degeneración dopaminérgica nigroestriatal11,43.

La depresión se ha correlacionado con la duración de la enfermedad, la gravedad de los síntomas, la

aparición de complicaciones o fluctuaciones motoras y la dosis de la medicación dopaminérgica; pero

también se ha relacionado con otros síntomas como el deterioro cognitivo, los episodios psicóticos, los

trastornos del sueño o los síntomas autonómicos6. Por todo ello, la depresión en la EP es un fenómeno

complejo que puede ser consecuencia de la patología de la enfermedad, una reacción a la discapacidad

asociada a la enfermedad, un fenómeno separado o una combinación de las tres44. Esta posible

complejidad puede ser la causa de que la depresión solo mejore en una proporción de los pacientes con

terapia dopaminérgica6.

Pero, además, existe una gran complejidad a nivel anatómico y bioquímico. Los sistemas dopaminérgico,

noradrenérgico y serotoninérgico, que sufren cambios en la EP, están implicados en la depresión38. Existen

evidencias de cambios en la función noradrenérgica en pacientes con depresión. Estos pacientes

muestran una reducción en la inervación dopaminérgica y noradrenérgica en el locus coeruleus, el tálamo

y regiones límbicas y un incremento en la pérdida neuronal y la gliosis en el locus coeruleus37. La

disponibilidad del transportador de DA en el estriado y en regiones límbicas se encuentra reducida en

pacientes de EP con depresión en comparación con individuos con EP sin depresión38. También el BNST

está implicado en cambios comportamentales asociados con la depresión; en particular, su actividad se

ha relacionado con la anhedonia tras un estrés crónico moderado45. Estos pacientes también muestran

una pérdida de sustancia blanca en regiones corticolímbicas, muy importantes en la regulación

dopaminérgica del estado de ánimo, la motivación y la recompensa46.

En cuanto al sistema serotoninérgico, centrado en el núcleo del rafe, está ligado a la depresión en la

población general y muchos investigadores han asociado la disfunción serotoninérgica con el desarrollo

de la depresión en la EP. Se cree que la degeneración del NDR y la alteración de la neurotransmisión

serotoninérgica en la EP tienen un papel esencial en la patofisiología de la depresión en esta

enfermedad47.

En el 60% de los pacientes también aparece la apatía, que se está empezando a reconocer como un

componente no motor de la enfermedad. En primates no humanos tratados con 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-

tetrahidropiridina (MPTP), la apatía correlaciona con la pérdida de neuronas dopaminérgicas en el área

tegmental ventral (ATV), que proyecta al núcleo accumbens6.

18

La fatiga, que aparece en un 50% de los pacientes, está caracterizada por la falta de energía, el cansancio

y el agotamiento. Esta puede ser una consecuencia de la disfunción motora o estar directamente

relacionada con la neuropatología, ya que se puede observar en pacientes con una buena función motora

y, además, puede aparecer antes de que se reconozcan signos motores. La disfunción de los ganglios

basales puede estar implicada en la aparición de fatiga debido a sus conexiones con el sistema límbico,

aunque no se han observado cambios en la expresión del transportador de DA en el estriado ventral, la

fatiga mejora con la disminución de los periodos off. Pacientes con EP y fatiga muestran niveles reducidos

del transportador de serotonina (5-HT) en diferentes estructuras como el estriado, el tálamo y la amígdala

en comparación con pacientes de EP sin fatiga6.

El deterioro cognitivo aparece en algún grado en más del 83% de los pacientes, aunque tanto el deterioro

cognitivo como la demencia suelen aparecer en las últimas etapas de la enfermedad. Un dato curioso es

que los pacientes que cursan la enfermedad con un predominio de bradicinesia y rigidez tienen un mayor

riesgo de desarrollar demencia que los que la cursan con predominio de temblor. Estos déficits se

relacionan con la aparición de cuerpos de Lewy en regiones de la corteza cerebral, principalmente en los

lóbulos parietal y temporal. Además, la severidad de la demencia se correlaciona con la densidad de

cuerpos y neuritas de Lewy presentes en la corteza6.

La psicosis suele aparecer en estadios avanzados de la enfermedad caracterizada por alucinaciones

visuales y delirios y está presente en más del 40% de los casos de EP36. El procesamiento visual anormal

de los estímulos, la disfunción del sueño y los cambios patológicos y neuroquímicos se han asociado a la

psicosis. Las alucinaciones visuales también pueden aparecer en las primeras etapas de la enfermedad,

constituyendo un factor de riesgo para una posterior demencia. Además, incrementan con la progresión

de la enfermedad, junto con la diplopía (visión doble)6.

Las alucinaciones se relacionan con la pérdida de células amacrinas dopaminérgicas, con el papel

regulador de los receptores dopaminérgicos D1 y D2 en la visión y con la presencia de cuerpos de Lewy

en el lóbulo occipital y en las neuronas retinianas, además de en la amígdala y las cortezas frontal,

temporal, parietal y visual, lo que sugiere que los cambios patológicos de la enfermedad pueden contribuir

de forma directa a las alucinaciones. Además, las alucinaciones y la psicosis pueden empeorar con la

terapia de reemplazo con levodopa y agonistas dopaminérgicos, lo que indica que la señal dopaminérgica

está implicada en su generación. También la disfunción del sistema serotoninérgico podría tener un papel

en la psicosis en la EP, ya que en los pacientes que la padecen, los niveles cerebrales de serotonina son

más bajos6.

Las alteraciones del sueño también afectan a la mayoría de los pacientes de la EP y su prevalencia aumenta

con la duración de la enfermedad. Tanto la dopamina como la noradrenalina y la serotonina están

implicadas en el control del sueño y, como ya hemos comentado, estos tres sistemas de

neurotransmisores y sus centros anatómicos, están afectados en la EP. En cambio, el trastorno de

conducta del sueño REM parece tener un origen diferente, ya que ocurre de forma temprana en el curso

de la enfermedad, mucho antes del inicio de los signos motores evidentes. La implicación temprana del

tronco encefálico se ha usado para explicar las características no motoras tempranas de las alteraciones

en el sueño y también de la hiposmia en pacientes con EP6.

19

También la disfunción autonómica es muy común y aunque puede preceder a los síntomas motores, es

más prevalente a medida que avanza la enfermedad y puede incluir disfunción vesical, intestinal y sexual,

así como complicaciones cardiovasculares. Estas últimas podrían ocurrir en más del 80% de los pacientes6.

También existen evidencias de cambios en el sistema nervioso entérico, como la reducción en los niveles

de DA y la presencia de cuerpos de Lewy en el tracto gastrointestinal en neuronas no TH+, aunque no

existen evidencias de neurodegeneración. De hecho, la presencia de agregados de α-Syn a lo largo del

tracto gastrointestinal se ha propuesto como una herramienta de diagnóstico, permitiendo la detección

temprana de la enfermedad antes del comienzo de los síntomas motores6. Los agregados de α-Syn en el

tejido colónico hasta ahora parecen ser los más predictivos de la EP preclínica, lo que apoya la teoría de

la transmisión de la patología α-Syn desde el sistema gastrointestinal hasta el cerebro11,20.

Como vemos, todos estos síntomas no motores están relacionados con la alteración de los sistemas de

neurotransmisión presente en la EP y con la presencia de la patología α-Syn y el daño en muchas

estructuras neuroanatómicas, como el locus coeruleus, el BNST o el NDR. Así, la alteración temprana de

la olfacción, la función del sueño y/o autonómica implica una disfunción neuronal consistente con la

hipótesis de la secuencia y el patrón de difusión de la patología α-Syn6,11,20.

Estas características tempranas se han propuesto como indicadores de la fase prodrómica premotora. Por

ello, el reconocimiento de que estas características no motoras podrían desarrollarse antes que los signos

motores, está favoreciendo su evaluación como posibles biomarcadores, aunque su detección es

posiblemente mucho más efectiva junto a parámetros de imagen y bioquímicos6.

Importancia del NDR y el BNST en los síntomas no motores de la EP Es importante definir la relevancia de ciertas estructuras cerebrales como sustrato anatómico de algunos

de los síntomas no motores que ocurren durante la progresión de la EP. Entre ellos, encontramos el núcleo

del lecho de la estría terminal (BNST) y el núcleo dorsal del rafe (NDR), relacionados, sobre todo, con los

síntomas neuropsiquiátricos (ansiedad y depresión) que aparecen en la EP.

Núcleo del lecho de la estría terminal (BNST)

El núcleo del lecho de la estría terminal es una pequeña estructura situada en el prosencéfalo basal y

considerada parte de la llamada “amígdala extendida”48. Está compuesta por múltiples subnúcleos y

poblaciones celulares neuroquímicamente diferentes49.

Esta estructura funciona como un nodo en el neurocircuito de la respuesta al estrés, integrando las

respuestas autonómicas y comportamentales al estrés y la ansiedad40,45. Tiene conexiones con múltiples

regiones límbicas (amígdala, ínsula anterior, hipocampo, hipotálamo y sustancia gris periacueductal) y

troncoencefálicas40. Contiene una alta densidad de fibras DA procedentes predominantemente del ATV y

la sustancia gris periacueductal y de forma menos extensa, del NDR, la SNpc y el área retrorubral50.

También recibe conexiones serotoninérgicas y noradrenérgicas. Envía importantes proyecciones al ATV,

la SNpc y a la amígdala basolateral, que intervienen en el ajuste motor y de la función ansiogénica40,50.

Este núcleo se ve afectado por la patología α-Syn en el cuarto estadío de Braak, en el que se afecta el

prosencéfalo basal11. Existen muchas evidencias preclínicas en ratones y primates no humanos que

demuestran su implicación en la ansiedad, lo que además se ha confirmado en humanos mediante

estudios de neuroimagen40,49,51.

20

Núcleo dorsal del Rafe (NDR)

El núcleo dorsal del Rafe (NDR) forma parte de la región rostral del núcleo del rafe, una pequeña

estructura situada en la línea media del tronco del encéfalo. Supone el origen del sistema serotoninérgico

central, ya que contiene la principal población de neuronas serotoninérgicas del cerebro52. Pero también

posee otros tipos de neuronas, que difieren en su morfología celular, propiedades electrofisiológicas y

expresión de neurotransmisores33,35. El NDR juega un importante papel en la regulación de muchas

funciones fisiológicas, como el ciclo vigilia/sueño, el estado de ánimo o la ingesta de alimentos53.

El NDR proporciona una extensa inervación a casi todo el neuroeje, enviando proyecciones a los ganglios

basales, a las áreas asociativas de la corteza frontal, al sistema límbico y al diencéfalo52. En particular, el

mesencéfalo (incluyendo la SN y el ATV) recibe la inervación serotoninérgica más densa del cerebro54. En

cuanto a las aferencias, recibe conexiones tanto del sistema nervioso periférico como central55. A

destacar, una proporción importante de fibras DA de la SN y el ATV proyectan al núcleo del rafe.

Durante la progresión de la EP, se produce la degeneración de las neuronas serotoninérgicas del NDR,

como han demostrado estudios post-mortem y de neuroimagen38 y, por tanto, el sistema serotoninérgico

se ve significativamente afectado, perdiéndose la inervación y los marcadores serotoninérgicos

(disponibilidad de 5-HT y de su transportador) en las áreas a las que proyecta este núcleo6,52,56.

La caracterización electrofisiológica de las neuronas DA mesencefálicas y las neuronas serotoninérgicas

del NDR ha revelado una estrecha interacción entre estos dos grupos celulares, existiendo múltiples

conexiones entre los sistemas dopaminérgico y serotoninérgico. Esto sugiere que la pérdida de neuronas

y fibras DA podría estar implicada en las alteraciones del sistema serotoninérgico durante el desarrollo de

la EP, ya que el núcleo del rafe está bajo el control dopaminérgico. Así, en la EP, el sistema serotoninérgico

debe adaptarse a la falta de dopamina propia de la enfermedad54,55.

A partir del estadio III de la EP, este núcleo se ve afectado por la patología de Lewy11. Diferentes estudios

han mostrado una correlación entre biomarcadores serotoninérgicos y la severidad de los síntomas de

depresión en pacientes de EP. Entre ellos, se encuentran los receptores de 5-HT en estructuras límbicas y

del rafe, los niveles plasmáticos de 5-HT, la pérdida de transportadores de 5-HT (SERT) presinápticos en

la corteza55, los niveles de metabolitos de la 5-HT (como la 5-HIAA) en el líquido cefalorraquídeo47. Todos

estos estudios apoyan el importante papel de la alteración de la neurotransmisión serotoninérgica

(controlada por el núcleo del rafe) en la contribución a la patofisiología de la depresión en la EP.

Tratamiento No existe ningún tratamiento eficaz para erradicar la EP, por lo que los tratamientos actuales se basan en

medidas generales como la fisioterapia o la logopedia, tratamientos farmacológicos sintomáticos,

tratamiento quirúrgico y ultrasonidos focalizados de alta frecuencia (HIFU).

El único tratamiento farmacológico existente es sintomático basado en intentar corregir el déficit

neuroquímico de dopamina existente en los pacientes de la EP, por lo que también se denomina terapia

de reemplazo. Actualmente, es el más utilizado. Este tratamiento mejora la función motora y su

progresión. Sin embargo, las características no motoras de la enfermedad que no están relacionadas con

la pérdida de células dopaminérgicas no se ven afectadas6.

21

Dentro del tratamiento farmacológico podemos encontrar: L-DOPA, precursor natural de la DA;

inhibidores de las enzimas que la metabolizan, que aumentan la disponibilidad de los fármacos en sangre,

haciendo más duradero el efecto; agonistas dopaminérgicos, que producen un beneficio mantenido;

antiglutamatérgicos y anticolinérgicos (aunque estos ya no se utilizan). Para algunos de ellos existen

bombas intragástricas o intraduodenales que permiten una infusión continua del fármaco.

Pero como casi todos los fármacos, estos pueden producir efectos adversos que se traducen en

complicaciones que suelen aparecer con el avance de la enfermedad. Entre ellos encontramos las

disquinesias (movimientos involuntarios exagerados), las fluctuaciones motoras (deterioros de fin de

dosis) y los trastornos del comportamiento (trastorno del control de impulsos), que suelen ser debidos al

tratamiento con agonistas dopaminérgicos.

Otro tipo de tratamiento es el de ultrasonidos localizados de alta frecuencia (HIFU por sus siglas en inglés),

un tratamiento no invasivo con el que se provoca una lesión irreversible y no modulable. Se utiliza como

alternativa para pacientes con temblor esencial o parkinsonismo refractario.

Por último, tenemos el tratamiento quirúrgico funcional para la estimulación cerebral profunda del núcleo

subtalámico mediante un electrodo que, una vez introducido, se puede regular según la progresión de la

enfermedad. Con este tratamiento se obtiene un 70% de reducción de los movimientos involuntarios y se

reduce la medicación en un 50%. También disminuyen los periodos off, lo que mejora mucho la calidad

de vida de los pacientes.

En cuanto a estrategias experimentales, actualmente se investigan varios tratamientos que tratan de

disminuir los efectos deletéreos histopatológicos y comportamentales presentes en la EP. Muchos de

ellos, tienen como diana la α-Syn.

Ya que la autofagia está alterada en la EP, una de las estrategias se basa en compuestos potenciadores de

la autofagia. Entre ellos encontramos la rapamicina o la trehalosa, que ha mostrado efectos beneficiosos

en el aclaramiento de la agregación de la α-Syn, la protección frente a la neurodegeneración nigroestriatal

y la prevención de los déficits comportamentales en un modelo de rata de EP basado en la administración

de un virus adenoasociado (AAV) para la expresión de la α-Syn mutada A53T57.

Otra de las estrategias está basada en la inmunoterapia, para reducir los niveles de oligómeros tóxicos de

α-Syn o la vacunación con α-Syn humana, que reduce la formación de agregados en animales

transgénicos58. Esta estrategia se ha llevado a ensayos clínicos en pacientes de EP y se encuentra en fases

preliminares59.

Otro de los focos de investigación se centra en agentes que reducen la expresión de la α-Syn silvestre,

como ARN interferentes (ARNi) u oligonucleótidos antisentido, que podrían prevenir la agregación de la

proteína, la neurodegeneración y la transferencia de la proteína a otras células58.

Un campo importante de investigación es el de las chaperonas, que promueven el replegamiento de

proteínas malplegadas y su transferencia a los sistemas de degradación. El clorhidrato de ambroxol (AMB),

una pequeña chaperona, ha demostrado aumentar la actividad β-glucocerebrosidasa (GCasa) in vitro en

cultivos celulares e in vivo en ratones y primates no humanos. Además, es capaz de cruzar la barrera

hematoencefálica y reducir los niveles de α-Syn. Además, su actividad chaperona parece ser importante

para el transporte lisosomal de la GCasa60–62. En ratas lesionadas con 6-OHDA, también ha demostrado

22

atenuar las alteraciones motoras, la depleción de DA y mejorar la disfunción mitocondrial, la patología α-

Syn (disminuye la agregación), la pérdida de neuronas DA y la vía intrínseca de la apoptosis60. Resultados

similares se han obtenido tras la administración de otras chaperonas farmacológicas, que además han

conseguido mejorar la respuesta inflamatoria microglial en la SN en un modelo murino de sinucleinopatía.

Por tanto, las chaperonas farmacológicas para la GCasa pueden ser beneficiosas en sinucleinopatías

independientemente del estatus de la actividad GCasa, lo que ofrece un interesante potencial para las

formas esporádicas de la EP sin mutaciones en el gen GBA163.

Por último, otra estrategia con un gran potencial es el aumento de la actividad GCasa en el SNC mediante

terapia génica. La inyección intracerebral de AAV para la expresión del gen GBA1 (AAV-GBA1) en ratones

transgénicos para la α-Syn humana silvestre o mutada A53T incrementa la actividad GCasa y reduce los

niveles de la α-Syn soluble e insoluble en la SN y el estriado, lo que sugiere que el incremento de la

actividad glicosidasa puede modular el procesamiento de la α-Syn y la progresión de su patología. Esto

podría interrumpir el feedback patogénico de la α-Syn sobre la actividad GCasa y, por tanto, restaurar la

capacidad celular de degradar la α-Syn64,65.

En un modelo de rata de neurodegeneración selectiva dopaminérgica mesencefálica, la coinyección del

AAV-GBA1 con el AAV-α-Syn A53T en la SN previene la degeneración de las neuronas dopaminérgicas

nigroestriatales inducida por la α-Syn A53T. Estos efectos neuroprotectores están asociados a la expresión

proteica alterada de marcadores de autofagia64. En modelos de sinucleinopatía con mutaciones en el gen

GBA1 (enfermedad de Gaucher) la administración de AAV-GBA1 ha mostrado disminuir los niveles de

lípidos como la glucosilesfingosina, así como de proteínas como la α-Syn, ubiquitina, tau y agregados de

α-Syn resistentes a proteinasa K, además de corregir los déficits de memoria4.

Por tanto, el incremento de la actividad GCasa en el SNC mediante la administración de la enzima

recombinante, la transferencia de un vector que codifica para la enzima lisosomal o la administración de

pequeñas moléculas que la activan podría reducir la acumulación de proteínas malplegadas y, por tanto,

ralentizar la progresión de la enfermedad en pacientes de EP con o sin mutaciones en el gen GBA1, por lo

que representa una potencial estrategia terapéutica65.

Modelos animales de la EP Durante las últimas 3-4 décadas, se han utilizado diferentes modelos animales para el estudio de la EP,

generados mediante diferentes estrategias. Clásicamente, se dividen en dos grupos: (1) administración

intracerebral o sistémica de neurotoxinas y (2) modelos genéticos. Ya que existe una gran dificultad para

recapitular todas las características neuropatológicas y clínicas de la EP en un solo modelo, la mayoría de

los modelos no reproducen la EP en su totalidad; pero, estudiados conjuntamente, presentan las

características principales de la enfermedad66.

Modelos basados en neurotoxinas El uso de neurotoxinas está presente desde la generación de los primeros modelos animales de la EP. Las

principales neurotoxinas utilizadas son la 6-hidroxidopamina (6-OHDA), el MPTP, la rotenona (insecticida)

y el paraquat (herbicida). Tanto la 6-OHDA como el MPTP son específicos del sistema dopaminérgico, ya

que la 6-OHDA y un metabolito del MPTP (el MPP+) son captados por las neuronas dopaminérgicas

23

mediante el transportador de DA. En cambio, la rotenona y el paraquat no poseen esta especificidad, ya

que no tienen selectividad por el transportador de DA y penetran las neuronas dopaminérgicas mediante

difusión67.

Todas ellas producen disfunción mitocondrial mediante la inhibición del complejo I de la cadena de

transportadora de electrones mitocondrial. Esto lleva a la generación de estrés oxidativo debido a una

alta producción de ROS y una baja producción de ATP, lo que genera graves efectos deletéreos en la célula.

Estas toxinas revelan una gran susceptibilidad de las neuronas DA a la disfunción mitocondrial y la

producción de ROS, ya que a pesar de que algunas no son específicas del sistema dopaminérgico, inducen

una pérdida modesta pero específica de las neuronas positivas para la TH en la SNpc67.

La 6-OHDA provoca una neurodegeneración masiva y rápida y se usa para modelos de disquinesias. No

pasa la barrera hematoencefálica (BHE), por lo que debe ser inyectada intracerebralmente. Esto

incrementa la variabilidad y supone una desventaja. El MPTP tiene la capacidad de cruzar la BHE, por lo

que se administra de forma sistémica. Tras cruzar la BHE, es convertido en un metabolito tóxico activo, el

ion 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP+), mediante la enzima monoamino oxidasa B (MAO-B), localizada

principalmente en las neuronas serotoninérgicas y en los astrocitos. Este metabolito es captado por el

transportador de DA, por lo que produce una pérdida masiva de neuronas dopaminérgicas. Su

administración es muy peligrosa en humanos, ya que su toxicidad es muy alta67.

Los modelos de roedores tratados con 6-OHDA y los primates no humanos tratados con MPTP son

actualmente los modelos de elección para las terapias sintomáticas, ya que han sido bastante predictivos

y están muy bien caracterizados. Pero el paraquat y la rotenona también han demostrado generar

toxicidad en las neuronas dopaminérgicas y suponer un factor de riesgo ambiental para el desarrollo de

la enfermedad, aunque no están tan bien caracterizados67.

El paraquat produce la pérdida de neuronas dopaminérgicas de la SN. Su administración se realiza de

forma sistémica, ya que penetra en el cerebro mediante el transportador de aminoácidos neutros de la

BHE (o sistema de transporte L) y, además, es tóxico para el organismo completo67,68. La rotenona produce

una pérdida masiva de las neuronas dopaminérgicas. Su administración es sistémica y, al igual que el

paraquat, es tóxica para el organismo completo67. Otra de las toxinas utilizadas para generar modelos de

EP y estudiar la neuroinflamación es el lipopolisacárido (LPS), aunque este se utiliza de forma mucho

menos frecuente69.

Como podemos ver, todas estas neurotoxinas producen una pérdida masiva y rápida de las neuronas

dopaminérgicas. Pero, además, reproducen la sintomatología motora de la EP (al menos en parte), por lo

que son útiles para evaluar terapias sintomáticas. Sin embargo, como ya hemos comentado, todos los

modelos tienen alguna limitación. En este caso, la mayoría de estos modelos no reproducen la patología

de α-Syn. Sólo se han detectado agregados intracelulares positivos para α-Syn en animales tratados con

rotenona70. Además, la pérdida masiva y rápida de las neuronas dopaminérgicas y la ausencia de la

patología α-Syn hacen que estos modelos no reproduzcan el curso progresivo propio de la EP, por lo que

no permiten el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes a la fisiopatología de la enfermedad

ni evaluar estrategias terapéuticas destinadas a ralentizar o detener la progresión de la enfermedad.

24

Modelos genéticos Aunque la mayoría de los casos de EP son esporádicos, defectos genéticos específicos en casos familiares

poco frecuente han ofrecido un conocimiento único de la patogénesis de la EP. Los modelos genéticos

están basados en la eliminación o incorporación de genes asociados a la EP, bien porque generan una

herencia autosómica o porque constituyen factores de riesgo para la enfermedad. Algunos de ellos son

los ratones knock out (KO) para genes como Parkina (Park2), Pink1 (Park6) o Pitx3 (también llamados

aphakia) y los transgénicos para los genes SNCA (mutación A53T, A30P, E46K), Park2 (mutación Q311X,

truncado) o LRRK2 (mutación R1441G)66,67. Algunos de estos modelos generan una disfunción temprana

del sistema dopaminérgico nigroestriatal66.

Los ratones Aphakia (Pitx3-/-) poseen un número muy disminuido de neuronas dopaminérgicas en la SN

debido a la deficiencia del gen Pitx3, implicado en la supervivencia y el mantenimiento de las neuronas

dopaminérgicas del cerebro medio. Reproducen un estadio moderado de la EP con un gradiente de

denervación ventro-dorsal del estriado28,30 que reproduce los síntomas clínicos de las disquinesias y se ha

utilizado para estudiar los mecanismos moleculares de las mismas71,72. Además, la ausencia de este factor

también produce alteraciones oculares durante el desarrollo embrionario, por lo que estos ratones son

ciegos73,74.

El estudio de los ratones KO actuales para Parkina, Pink1 y DJ-1, al igual que el de los modelos transgénicos

para LRRK2, puede ser útil para entender las anomalías tempranas del sistema dopaminérgico

nigroestriatal que ocurren debido a estas mutaciones. Los KO también pueden ser muy útiles para

comprender los mecanismos moleculares que subyacen a la compensación66.

Como ya hemos mencionado, uno de los genes más importantes de la patología de la EP es el gen SNCA,

que codifica la proteína α-Syn, por lo que los modelos basados en esta proteína son de gran interés.

Dentro de este grupo encontramos: (1) modelos transgénicos, (2) modelos basados en la sobreexpresión

de α-Syn mediante partículas virales y (3) modelos basados en la administración de fibrillas preformadas

de α-Syn. Los modelos murinos transgénicos para la α-Syn con neurodegeneración suponen una

herramienta muy valiosa para estudiar la toxicidad general y los mecanismos específicos de la patología

α-Syn, así como para testar estrategias terapéuticas. Los estudios de neuroprotección en estos modelos

confirman que el mantenimiento o la conversión de la α-Syn a su estado monomérico y el potenciamiento

de su degradación son terapéuticos. Algunos de estos modelos también presentan anomalías

sensoriomotoras progresivas debidas a una disfunción dopaminérgica. Además, la mayoría también son

útiles para entender los mecanismos de degeneración en sistemas no dopaminérgicos66.

Muchos de estos modelos transgénicos para la α-Syn muestran síntomas no motores similares a los que

presentan los pacientes de la EP. Por ejemplo, ratones transgénicos que sobreexpresan la α‑Syn humana

silvestre muestran déficits olfatorios6, alteraciones cognitivas (incluyendo alteraciones en el aprendizaje

y la memoria) asociadas con la acumulación de la α-Syn en regiones corticales y subcorticales58,75,

alteraciones del sueño y de la motilidad intestinal y estreñimiento. Algunos de ellos muestran una

disminución del comportamiento ansiogénico en varios tests, pero este cambio de comportamiento

podría reflejar hiperactividad, ya que se relaciona con una mayor actividad locomotora. En cambio, en

ratas, la administración bilateral de α‑Syn en la sustancia negra mediante vectores virales sí induce un

comportamiento ansiogénico6. También modelos de sobreexpresión de la α-Syn mutada mostraron un

fenotipo ansiogénico, síntomas gastrointestinales, alteraciones en el sistema nervioso entérico o un

25

control autonómico aberrante del corazón6. Modelos que expresan la α-Syn truncada mostraron

alteraciones en la sensibilidad olfatoria, así como déficits cognitivos76. Por tanto, los modelos transgénicos

para la α-Syn son útiles no solo para el estudio de los déficits motores debidos a la neurodegeneración

dopaminérgica, sino también para el estudio de los síntomas no motores presentes en la EP.

Un modelo murino transgénico para la α-Syn existente es el basado en el uso de cromosomas bacterianos

artificiales para la expresión de la α-Syn WT a partir del locus completo del gen SNCA humano (SNCA-

OVX), a niveles relevantes para la enfermedad. Usando este modelo, localizaron déficits tempranos y

selectivos en la neurotransmisión dopaminérgica en la vía nigroestriatal. Este fenotipo de inicio temprano

es seguido, en animales de edad avanzada, por una patología de tasas de disparo disminuidas en las

neuronas dopaminérgicas de la SN, pérdida de estas neuronas y alteraciones motoras en ausencia de

agregación proteica en la SN. Por ello, proponen que los fenotipos asociados a la EP no están dirigidos por

la agregación proteica progresiva, sino que están asociados con déficits mucho más tempranos en la

neurotransmisión dopaminérgica. Esto tiene importantes implicaciones para el desarrollo de terapias y

permite avanzar en el conocimiento de las bases celulares de los cambios en la neurotransmisión

dopaminérgica o no dopaminérgica en regiones cerebrales que difieren en la susceptibilidad a la

enfermedad77.

Otro de los modelos, expresa una forma truncada de la α-Syn humana 1-120 (modelo transgénico

“Glong”) que genera una agregación progresiva de la α-Syn, lo que supone una gran ventaja frente a otros

modelos que no presentan la patología α-Syn o en los que esta no es progresiva. Además, este modelo

permite determinar los mecanismos moleculares que conducen a la degeneración, así como identificar

dianas terapéuticas y testar posibles terapias78.

Así, muchos de los modelos son útiles para comprender procesos tempranos que preceden a la

neurodegeneración y que podrían ser muy útiles para su uso como biomarcadores o dianas terapéuticas.

Además, la creación de estos modelos animales y algunos modelos celulares mediante mutaciones en

varios genes asociados a la EP genética permite un mayor conocimiento sobre los mecanismos

moleculares de la EP, lo que supone una ventaja en el conocimiento de la patogénesis de la EP66.

Modelo Glong

El modelo “Glong” (utilizado en este estudio), es un modelo murino transgénico que consiste en la

expresión de la α-Syn humana truncada (1-120) bajo el promotor de la TH de rata en un ratón con un

fondo genético sin α-Syn (ratones OlaHsd Snca-/-)79. El cassette de TH conduce a una alta expresión en las

células dopaminérgicas y otras células TH-positivas.

La α-Syn truncada en el extremo C-terminal ha sido detectada en cuerpos de Lewy procedentes de

humanos y en cerebros de ratones transgénicos que expresan la α-Syn humana mutante. En su aparición

podría estar implicado el proteasoma. Además, se ha demostrado que la α-Syn humana truncada (1-120)

in vitro forma filamentos de forma más rápida que cualquier proteína silvestre o mutante. Pero los

filamentos de α-Syn aislados de cerebros humanos están compuestos de la proteína completa, lo que

sugiere que el truncamiento podría ocurrir después de la agregación. Está demostrado que la región C-

terminal de la α-Syn actúa como un regulador negativo de la agregación. Por tanto, las modificaciones en

esta región (oxidación, nitración, fosforilación) podrían influir en la tendencia de la α-Syn a agregar in vivo,

de forma similar a como lo hace el truncamiento78.

26

Este modelo genera inclusiones patológicas en la SN y el bulbo olfatorio y presenta niveles reducidos de

dopamina en el estriado. A nivel de comportamiento, este ratón transgénico muestra una reducción

progresiva en la locomoción espontánea y una mayor respuesta a la anfetamina78.

La acumulación progresiva de α-Syn en el compartimento somatodendrítico de las neuronas

dopaminérgicas en estos ratones muestra características patológicas, como la acumulación de microglía

e inflamación. Además, se produce una disfunción del sistema dopaminérgico que conduce a una

reducción significativa de dopamina y ácido homovanílico (pero no de 5-HT) desde los 3 meses de edad

del ratón78.

Este modelo fue el primero en demostrar una relación directa entre la patología citoplasmática de α-Syn

granular y filamentosa en el sistema dopaminérgico y un déficit comportamental progresivo sin la

implicación de áreas motoras. Además, los datos del estudio de este modelo sugieren que los déficits

comportamentales preceden a la neurodegeneración y sitúan a los terminales nerviosos como posible

sustrato anatómico del primer daño que ocurre en las sinucleinopatías78.

A diferencia de los pacientes de la EP, este modelo no muestra evidencias significativas de muerte

neuronal. Por ello, la reducción en los niveles de dopamina se explica por una disfunción metabólica

debida a la acumulación temprana de α-Syn truncada en los terminales presinápticos del estriado, más

que por cambios en los cuerpos celulares de la SN. De hecho, existe una correlación temporal entre la

presencia de terminales dilatados en el estriado y la deficiencia de dopamina78.

Así, los ratones que expresan la α-Syn humana truncada en las neuronas dopaminérgicas reproducen

muchos de los cambios característicos de las enfermedades humanas con cuerpos de Lewy; pero también

presentan algunas limitaciones, como el bajo número de fibrillas, la ausencia de muerte neuronal

significativa y la falta de la α-Syn endógena completa78.

Glucocerebrosidasa y EP Existen evidencias clínicas y neuropatológicas que relacionan el gen GBA1 con la EP y otras

sinucleinopatías, situando sus mutaciones como el mayor factor de riesgo genético común para estas

enfermedades. Los pacientes con mutaciones en este gen cursan con una enfermedad de inicio más

temprano, con una progresión clínica más rápida y un mayor riesgo de desarrollar déficits cognitivos7.

El gen GBA1, situado en el cromosoma 1q21, codifica la enzima lisosomal β-glucocerebrosidasa o β-

glucosidasa (GCasa) encargada de hidrolizar los glucolípidos glucosilceramida (GlcCer) y

glucosilesfingosina (GlcSph) en glucosa y ceramida o glucosa y esfingosina, respectivamente80.

Esta proteína se expresa de forma ubicua en todos los órganos del cuerpo, incluyendo el cerebro. En el

cerebro de primates no humanos, esta proteína se expresa sobre todo en unos núcleos muy pequeños o

grupos celulares que se encuentran en localizaciones restringidas y proveen al cerebro con

neurotransmisores específicos: neuronas colinérgicas de núcleo basal de Meynert, células

dopaminérgicas de la SNpc, neuronas serotoninérgicas del núcleo del rafe y neuronas noradrenérgicas del

locus coeruleus81.

27

Las mutaciones en homocigosis en este gen causan la enfermedad de Gaucher, un desorden de

almacenamiento lisosomal autosómico recesivo. Se han descrito unas 495 mutaciones diferentes82, pero

las mutaciones N370S y L444P son las más comunes en la enfermedad de Gaucher y la EP7,83.

Una mutación en el gen GBA1 en heterocigosis conduce a una reducción del 30-40% en la actividad de la

proteína84 y provoca un riesgo de desarrollar la EP de un 5-7% a los 70 años y de un 9-12% a los 80 años82.

Hoy día, se estima que entre un 7 y un 12% de los pacientes con EP porta una mutación en el gen GBA1

(GBA1-PD), aunque la frecuencia depende de la población82. Además, muchos estudios han mostrado una

actividad GCasa reducida en la SN de cerebros de pacientes de EP81. Estos pacientes suelen desarrollar

síntomas cognitivos más severos y una mayor acumulación de α-Syn y suelen ser diagnosticados más

temprano. Pero los pacientes de la EP idiopática, que no poseen mutaciones en el gen GBA1, también

muestran una reducción significativa en los niveles de proteína y actividad de la GCasa, lo que sugiere que

los defectos en esta proteína son importantes para la patofisiología de la enfermedad82. Además, existe

una asociación entre la severidad del fenotipo de la EP y la carga de mutaciones en el gen GBA181. Además,

algunas mutaciones como la E326K, se han asociado exclusivamente con la EP y no con la enfermedad de

Gaucher84.

Sin embargo, a pesar de existir un mayor riesgo de generar parkinsonismo en los portadores de

mutaciones de este gen, solo una minoría de los portadores llegan a desarrollar la EP, lo que indica que

existen otros factores de riesgo que juegan un papel importante82.

El grupo de Rocha demostró que las mutaciones en el gen GBA1 promueven el mal procesamiento de la

α-Syn y los déficits de memoria, dos características de la EP y la demencia con cuerpos de Lewy; además

del incremento de la concentración cerebral de GluSph, que actúa como neurotoxina64. Además, se sabe

que la β-glucocerebrosidasa juega un papel en el desarrollo de déficits específicos motores y cognitivos85.

En concreto, tiene una gran importancia en la memoria hipocampal4.

Glucocerebrosidasa y α-sinucleína Hay una clara relación entre la GCasa y la α-Syn, aunque los mecanismos moleculares que la sustentan se

desconocen. En 1996 Neudorfer y colaboradores86 publicaron por primera vez la relación entre la

enfermedad de Gaucher y la EP, tras observar pacientes de enfermedad de Gaucher con síntomas típicos

de la EP. Cada vez existen más evidencias genéticas y clínicas que sugieren una relación entre la

enfermedad de Gaucher y las sinucleinopatías. El análisis de los modelos animales de la enfermedad de

Gaucher indica que las sinucleinopatías relacionadas con la enfermedad de Gaucher resultan de la

combinación de una pérdida de actividad de la enzima GCasa con una ganancia de función tóxica debida

a la expresión de la enzima mutante. Esta ganancia de función tóxica se basa en la disrupción de los

procesos de proteostasis implicados en el correcto plegamiento de las proteínas, lo que favorece la

acumulación y agregación de la α-Syn4.

Así, existen evidencias que demuestran que la reducción de la actividad de la GCasa promueve la

acumulación y agregación de la α-Syn in vitro e in vivo4,87 sin provocar cambios en el ARNm, lo que sugiere

que el aumento de los niveles de la proteína resulta de una degradación comprometida. También se

produce la acumulación de los sustratos GlcCer, GlcSph y otros derivados lipídicos relacionados, lo que

también favorece la patología α-Syn2,88, ya que se ha demostrado que el GlcCer controla la formación de

28

agregados o formas solubles tóxicas de α-Syn en cultivos de neuronas y en cerebros de ratón y humanos,

promoviendo la neurodegeneración87.

La administración sistémica de conduritol β epóxido (CBE), un inhibidor de la GCasa, induce la agregación

de la α-Syn en la SN de ratones silvestres alterando la degradación lisosomal. Además, genera

neuroinflamación, activación del complemento y cambios en las proteínas transportadoras y sinápticas,

de forma paralela a la neurodegeneración en las cortezas motora y somatosensorial84. Los resultados

indican que la actividad decreciente de la GCasa podría comprometer funciones neuronales específicas,

generando alteraciones tempranas y graves de la función neuronal observadas en pacientes de EP

portadores de mutaciones en el gen GBA185. De hecho, promueve la desregulación de genes implicados

en la transmisión sináptica y el tráfico vesicular (como BDNF o los genes que codifican las proteínas que

forman el complejo SNARE). Esto se exacerba más en ratones que sobreexpresan la α-Syn, incluyendo

genes implicados en las respuestas reguladas por calcio y de inflamación astroglial64.

En cambio, la sobreexpresión del gen GBA1 mediante terapia génica (AAV-GBA1) ha mostrado reducir la

patología α-Syn facilitando el aclaramiento de los agregados insolubles de α-Syn, además de proteger

contra la neurodegeneración, disminuir la concentración de GluSph y mejorar los déficits cognitivos

asociados a la EP4. Es decir, mejora las alteraciones histopatológicas, bioquímicas y de comportamiento.

Todos estos datos validan el gen GBA1 y las vías lisosomales como dianas terapéuticas para reducir los

niveles de agregación de la α-Syn en la EP y corregir los déficits no-estriatales64. Aumentando la actividad

GCasa podemos restaurar la homeostasis lipídica lisosomal, reestablecer la función de los lisosomas y

promover la degradación de la α-Syn, impidiendo así su acumulación patológica en animales sin

mutaciones en el gen GBA1. Además, se podrían prevenir los déficits dopaminérgicos dependientes de la

edad85.

Pero esta relación es bidireccional, ya que la sobreexpresión de la α-Syn también lleva a la disminución de

la actividad GCasa88. El aumento y la formación de agregados de α-Syn contribuye al ciclo patogénico,

inhibiendo la maduración del lisosoma y la actividad normal de la GCasa y bloqueando el tráfico lisosomal

de la GCasa sintetizada de novo desde el retículo endoplásmico a los compartimentos endocíticos tardíos2,

lo que provoca acumulación de GlcCer y formación de oligómeros de α-Syn87 (Fig. 6). Esto potencia los

29

efectos patológicos de la α-Syn, ya que interfiere con su función normal en el tráfico vesicular y la

plasticidad sináptica, produciendo en último término la muerte neuronal85.

De hecho, datos obtenidos de pacientes de EP muestran que los niveles de proteína GCasa y de su

actividad enzimática están reducidos en áreas cerebrales que presentan patología α-Syn85. Es decir, existe

un círculo vicioso entre la acumulación de α-Syn y la actividad reducida de la GCasa (Fig. 7), por lo que la

reducción de la actividad GCasa no solo contribuye al desarrollo de la patología en pacientes con

mutaciones en el gen GBA1, sino que también afecta al desarrollo de formas esporádicas de la EP y otras

sinucleinopatías que no están asociadas a mutaciones en GBA187.

Los efectos de las mutaciones en el gen GBA1 sobre la α-Syn también podrían ser independientes de la

vía lisosomal y estar más relacionados con la alteración de las propiedades lipídicas de las membranas89.

En lugar de existir una relación lineal entre la GCasa y la α-Syn, la pérdida de función de la GCasa también

podría dar lugar a una serie de cambios en el metabolismo lipídico, autofagia, función mitocondrial, estrés

del RE y citotoxicidad y que todos ellos juntos fueran los actores verdaderos que sostienen la agregación

de la α-Syn malplegada81,87.

En este trabajo, utilizando un modelo de sinucleinopatía progresiva (Glong), nos centramos en la patología

α-Syn en áreas cerebrales clásicamente asociadas a los defectos motores presentes en la EP, como la SN

y el ATV y en áreas como el núcleo dorsal del rafe y el núcleo del lecho de la estría terminal, asociadas a

síntomas no motores de la EP. Además, estudiamos la relación del avance de la patología α-Syn en este

modelo con la disminución en la actividad de la GCasa.

30

Hipótesis y objetivos

La correlación entre la formación de cuerpos de Lewy y la neurodegeneración sugiere que la agregación

de la α-Syn tiene un papel esencial en la patogénesis de la EP. Sin embargo, los mecanismos moleculares

exactos por los que la agregación de la α-Syn induce la degeneración neuronal no se conocen

completamente. Por ello, se han generado diferentes modelos genéticos basados en la expresión de la α-

Syn. Sin embargo, la mayoría no reproduce la agregación de la α-Syn de la enfermedad humana

(inclusiones patológicas en las células dopaminérgicas de áreas como la SN). El modelo de ratón Glong,

que expresa la α-Syn humana truncada bajo el promotor de la TH, tiene la ventaja de ser un modelo

progresivo y, por tanto, podría convertirse en una buena herramienta para estudiar los mecanismos

moleculares implicados en la degeneración de las neuronas dopaminérgicas, reproducir el curso clínico

de la enfermedad y evaluar estrategias terapéuticas destinadas a detener o decelerar la progresión de la

enfermedad.

Hipótesis:

En el modelo de ratón Glong, la α-Syn humana truncada (1-120) se acumula en las neuronas TH-positivas

alterando las propiedades morfológicas y funcionales de las neuronas dopaminérgicas y serotoninérgicas

y produciendo, en último término la degeneración de estas neuronas en regiones cerebrales que

constituyen el sustrato neuroanatómico de los síntomas motores y no motores de la EP.

Objetivo principal:

Determinar las alteraciones moleculares, celulares y funcionales del núcleo dorsal del rafe y su asociación

con la sintomatología no motora de la EP en el ratón Glong, modelos de la enfermedad de Parkinson.

- Objetivo 1: Contribución en el establecimiento del ratón Glong como modelo progresivo de la

enfermedad de Parkinson: Caracterización de la acumulación de α-sinucleína en la SN, el ATV y el

estriado y de las alteraciones celulares y funcionales asociadas.

- Objetivo 2: Determinar la acumulación de α-sinucleína en las neuronas dopaminérgicas del núcleo

dorsal del rafe y su impacto en las terminales del núcleo del lecho de la estría terminal.

- Objetivo 3: Determinar los cambios de la actividad de la enzima lisosomal GCasa1 producidos por la

α-sinucleína y por la edad.

31

Materiales y métodos

Animales Para las tinciones inmunohistoquímicas, los estudios estereológicos, los análisis de imágenes y el cálculo

del área de los somas neuronales, se utilizaron 24 ratones: 12 Glong (Snca 1-120) y 9 Ola Hsd (Snca-/-) de

3, 8 y 12-15 meses (a partir de aquí se nombrarán como 15 meses) y 3 wild type (Snca+/+) de 15 meses.

Para los ensayos de actividad de la glucocerebrosidasa y la extracción previa de proteínas, se utilizaron 6

ratones Glong (Snca 1-120) de 3 y 7 meses, 7 ratones Ola Hsd (Snca-/-) de 3 y 7 meses de edad y 5 ratones

WT de 3 y 10-12 meses (a partir de aquí se nombrarán como 10 meses).

Los ratones Glong conforman un modelo transgénico para la α-sinucleína (α-Syn). Estos ratones poseen

un fondo genético sin α-Syn (Ola Hsd Snca-/-79) y expresan la α-Syn humana truncada (1-120) bajo el

promotor de la tiroxina hidroxilasa de rata, lo que provoca la generación de inclusiones patológicas en la

sustancia negra y el bulbo olfatorio y una reducción en los niveles de DA del estriado78. Estos ratones

fueron cedidos por Maria Grazia Spillantini (Universidad de Cambridge).

Los ratones Ola Hsd poseen un fondo genético C57BL/6J con una deleción espontánea del gen Snca79 y se

han utilizado como control negativo de los ratones Glong, ya que poseen el mismo fondo genético (sin el

transgén).

Los animales utilizados para todos los procedimientos se mantuvieron en las instalaciones del Instituto

Cajal (CSIC), en condiciones óptimas de luz-oscuridad (12 h luz/12 h oscuridad) y a temperatura constante

(21±2°C), con libre acceso a agua y comida, agrupados en jaulas con 5-6 ratones cada una.

Todos los procedimientos experimentales se realizaron tras la aprobación del Comité ético de

Experimentación animal del Instituto Cajal, del Órgano habilitado (CSIC) y la Comunidad de Madrid, de

acuerdo con el Real Decreto 53/2013, del 1 de febrero, por el que se establecen las normas básicas

aplicables para la protección de los animales utilizados en experimentación y otros fines científicos,

incluyendo la docencia.

32

Inmunohistoquímica Los ratones fueron anestesiados mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (0.04

mg/kg) y se perfundieron intracardiacamente con suero salino 0.9% y paraformaldehído 4% disuelto en

tampón fosfato (PB, pH 7,4). A continuación, sus cerebros fueron extraídos y post-fijados en

paraformaldehído al 4% durante 24 horas. Finalmente, se cortaron en secciones coronales seriadas de 30

µm de grosor en un vibratomo (Leica Microsystems) y se almacenaron a 4ºC en PB con 0.02% de azida.

La inmunohistoquímica se realizó sobre los cortes en flotación (en inglés, free-floating), utilizando un

protocolo previamente descrito por Granado et al., 201190 y basado en el método de detección biotina-

estreptavidina. Brevemente, las secciones fueron tratadas brevemente con H2O2 al 3% en PBS (tampón

fosfato salino) para eliminar la actividad peroxidasa endógena. Después, las secciones se incubaron con

NGS (del inglés, normal goat serum) al 10% en PBS-0.2% Tritón X-100 (Tx) durante una hora para bloquear

las uniones inespecíficas. Los cortes se incubaron durante dos noches a 4ºC en agitación con los

anticuerpos primarios: anti-TH policlonal hecho en conejo 1:1000 (EMD Millipore Corp., EEUU), anti-α-

Syn hecho en ratón 1:100 (BD Transduction), TPH2 policlonal hecho en conejo 1:720 (Novus Biologicals,

EEUU) y VMAT2 1:10000 (cedido por el profesor Gary Miller). Todos los anticuerpos se prepararon en PBS-

0.2% Tx con 1% de NGS.

Posteriormente, los cortes se lavaron con PBS-0.2% Tx y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente con

los anticuerpos secundarios biotiniliados: anti-conejo hecho en cabra (1:500, Vector laboratories) y anti-

ratón hecho en cabra (1:500, Vector laboratories), respectivamente. Tras ello, los cortes se lavaron con

PBS-0.2%Tx y se incubaron con estreptavidina conjugada con la peroxidasa de rábano (1:5000, Sigma) con

1% de NGS durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación.

A continuación, se realizó el revelado con diaminobenzina (DAB, 10 mg/ml, Sigma) y 0.1% de H2O2 en PB

y la reacción se monitorizó utilizando un microscopio óptico (Leica). Tras ello, los cortes se lavaron con

PB, se montaron en portaobjetos gelatinizados y se dejaron secar toda la noche. Una vez secos, los cortes

se deshidrataron en una batería de alcoholes (agua destilada, etanol 70%, 80%, 90% y 100%) y se aclararon

con xileno. Finalmente, los portaobjetos se cubrieron con cubreobjetos, utilizando el medio de montaje

DPX (Merk Millipore).

También se realizaron técnicas de inmunofluorescencia sobre cortes en flotación. Para las tinciones de

inmunofluorescencia, las rodajas se incubaron con los anticuerpos primarios anti-TH policlonal hecho en

conejo 1:1000 (EMD Millipore Corp., EEUU), anti-α-Syn hecho en ratón 1:100 (BD Transduction) y TPH2

policlonal hecho en conejo 1:720 (Novus Biologicals, EEUU). Al igual que en las técnicas de

inmunohistoquímica, todos los anticuerpos se prepararon en PBS-0.2% Tx con 1% de NGS.

Posteriormente, se utilizaron los anticuerpos secundarios Alexa fluor 594 1:250 hecho en cabra contra

conejo y Alexa fluor 488 1:250 hecho en cabra contra ratón (Life Technologies) durante 2 horas a

temperatura ambiente. Las muestras fueron visualizadas y fotografiadas en un microscopio confocal Leica

SP-5 directo (Leica Microsystems). Las imágenes se tomaron utilizando un objetivo de bajo aumento (10x)

y otro de alto aumento (63x en aceite de inmersión).

33

Estereología de neuronas TH y TPH2-positivas En 1 de cada 4 secciones (30 µm) de los cerebros de los ratones de cada genotipo, teñidas con el

anticuerpo anti-TH policlonal, se realizó un estudio estereológico en la sustancia negra, el área tegmental

ventral (ATV) y el núcleo dorsal del rafe (DRN) y en las rodajas teñidas con el anticuerpo anti-TPH2

policlonal, el estudio se realizó en el DRN. Este método estereológico de contaje de células no se ve

afectado por el tamaño o el estado de las neuronas. Los contajes estereológicos se realizaron en 4-8 cortes

seriados (dependiendo de la estructura analizada) por animal separados entre sí por 120 µm.

Para ello, se utilizó un microscopio óptico modelo Eclipse i80 (Nikon Instrument Inc., Madrid, España)

acoplado al software Stereo Investigator – MBF Bioscience. En primer lugar, con un objetivo de bajo

aumento (4x), se estableció el área de interés (SN, ATV, NDR). A continuación, con un objetivo de

inmersión en aceite y alto aumento (100x), se cuantificó manualmente el número de neuronas TH-

positivas o TPH2-positivas. Finalmente, el software realizó una extrapolación del número de neuronas TH-

positivas o TPH2-positivas en la región cerebral de interés completa. Los resultados se expresaron como

número de células TH-positivas o TPH2-positivas.

Cuantificación de la expresión de TH y α-Syn mediante análisis de imágenes El grado de inervación dopaminérgica y de acumulación de la α-Syn en el estriado y el núcleo del lecho de

la estría terminal se determinó a partir de imágenes de las secciones coronales teñidas con los anticuerpos

anti-TH y anti-α-Syn respectivamente obtenidas con un objetivo de bajo aumento (4x) en un microscopio

óptico equipado con la videocámara Leica DFC 290 HD. Para el análisis de imagen se utilizó un sistema

que convierte la intensidad de color en una escala de grises y cuantifica el área teñida como una

proporción respecto a la superficie total dibujada (Granado et al., 2008). Los resultados se expresan como

porcentaje del área teñida. El umbral de intensidad se seleccionó en los animales control (wild type) y se

aplicó por igual a todos los animales.

Cuantificación del tamaño del soma de las neuronas TH+

Para calcular el tamaño del soma de las neuronas TH-positivas de la sustancia negra y el área tegmental

ventral de los ratones Glong (a 3, 8 y 12-15 meses) y sus controles se utilizó un microscopio modelo 80i

Elipse (Nikon Instrument Inc.) acoplado al software Neurolucida. En primer lugar, con un objetivo de bajo

aumento (10x) se estableció un campo de visión dentro de la estructura a analizar. A continuación, con

un objetivo de aceite de inmersión y alto aumento (100x), se dibujó el contorno del soma de 7 neuronas

por sección. Los pasos anteriores se repitieron en 3 secciones por animal. Finalmente, el software calculó

el área de cada una de ellas.

34

Extracción de proteínas y ensayo de actividad Los ratones Glong y Ola Hsd fueron sacrificados mediante dislocación cervical. A continuación, se les

extrajo el cerebro y se diseccionaron las regiones a analizar (estriado, sustancia negra y núcleo dorsal del

rafe), que fueron introducidas en buffer de lisis 1% en hielo. A continuación, el tejido de cada región

cerebral fue homogeneizado en buffer de lisis 1% (1% taurocolato de sodio + 1% tritón X-100 + buffer Mc

Ilvaine pH 5.2) seguido de una sonicación (con dos pulsos de dos segundos) y centrifugación a 14000 rpm

durante 15 min a 4ºC. Por último, se recogió el sobrenadante, se alicuotó y se almacenó a -80ºC.

La concentración de proteínas de cada muestra se midió en el tejido cerebral lisado usando el ensayo de

ácido bicinconínico (BCA; Pierce, Rockford, IL), con una incubación de 30 minutos a 37ºC, utilizando una

curva patrón de BSA y midiendo la absorbancia a 540 nm en un fluorímetro (FluorStar Optima GBM

Biotech). Los datos de absorbancia obtenidos se extrapolaron mediante una recta patrón de

concentraciones de proteína conocidas (mg/ml).

La actividad glucocerebrosidasa fue medida en el estriado, sustancia negra y núcleo dorsal del rafe en

ratones Glong y Ola Hsd, según el ensayo descrito en García-Sanz et al., 2017. Para el ensayo se utilizó el

sustrato artificial 4-metilumbeliferil β-D-glucopiranósido (4-MUG, Sigma, USA). Tras la incubación de las

muestras con el sustrato a 37ºC durante una hora, la reacción fue parada añadiendo 100 μL de solución

de stop (glicina 0.2M/hidróxido de sodio 0.2M, pH 10.7). Para el control negativo, utilizamos una solución

de conduritol-β-epóxido (CBE), inhibidor de la GCasa.

Las placas fueron introducidas en un fluorímetro (FluorStar Optima GBM Biotech) y el producto de la

reacción enzimática, 4-metilumbeliferona (4-MU), fue medido con excitación a 365 nm y emisión a 445

nm. Para cada muestra, las diferencias en los valores de fluorescencia entre aquellos con y sin CBE fueron

estimados proporcionales a la actividad GBA.

La actividad enzimática fue evaluada mediante una curva estándar de 4-metilumbeliferil (Sigma, USA) y

normalizada al contenido de proteína de cada muestra, determinada previamente mediante el ensayo de

BCA (pmol/mg/h).

Análisis estadístico Para el análisis estadístico de los datos obtenidos de los ratones Glong (a 3, 8 y 12-15 meses) y sus

controles, testamos, en primer lugar, la distribución de los datos mediante un test de normalidad

D'Agostino-Pearson. Los datos mostraron una distribución no normal y un tamaño muestral pequeño, por

lo que, a continuación, se realizó un test estadístico no paramétrico Kruskal-Wallis (equivalente a Anova

de 1 vía) con comparaciones múltiples seguido de un test post-hoc Dunn´s. Las diferencias se consideraron

estadísticamente significativas cuando se obtuvo un valor de p<0.05 y los datos se expresan como la media

± EEM (Error estándar de la media). El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism.

35

Resultados

Las neuronas dopaminérgicas de la SN y el ATV de los ratones Glong expresan la α-Syn El ratón transgénico Glong expresa la α-Syn humana truncada (aminoácidos 1-120) bajo el promotor de

la tiroxina hidroxilasa (TH) de rata, lo que provoca la acumulación de α-Syn y la generación de inclusiones

patológicas en diferentes regiones del cerebro de estos animales78.

Para corroborar que la α-Syn humana se expresa exclusivamente en las neuronas TH-positivas

(dopaminérgicas) de la sustancia negra (SN) y del área tegmental ventral (ATV) en los ratones Glong,

llevamos a cabo tinciones de inmunofluorescencia dobles para la TH y la α-Syn. Se utilizaron secciones

coronales de la SN y ATV de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 15 meses. Los ratones Ola Hsd se utilizaron

para demostrar que el anticuerpo es específico, ya que la tinción es casi nula en estos ratones. Como se

observa en la Fig. 9, la α-Syn colocaliza con la enzima TH en los cuerpos neuronales dopaminérgicos de la

SN y del ATV de los ratones Glong. Por el contrario, no detectamos la α-Syn en las neuronas

dopaminérgicas (TH-positivas) de la SN y el ATV de los ratones Ola Hsd (Fig. 9) y la tinción en los WT es

difusa, sin que se puedan observar cuerpos celulares bien definidos.

36

Figura 9. Las neuronas TH+ de la sustancia negra de los ratones Glong expresan la α-Syn humana truncada

(1-120). Tinción de inmunofluorescencia doble realizada contra TH (rojo) y α-Syn (verde) en la SN y el ATV de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 15 meses. Puntas de flecha: neuronas que co-expresan la TH y la α-Syn humana truncada. Barras de calibración: 200 μm (objetivo de bajo aumento (10x)) y 22 μm (objetivo de alto aumento (63x)).

37

A continuación, determinamos la expresión rostro-caudal de la α-Syn humana en la SN y el ATV de estos

ratones. Para ello, realizamos una tinción inmunohistoquímica visualizada con DAB contra la α-Syn en

cortes seriados de dichas estructuras de ratones wild type (WT), Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses (Fig.

10). Como se puede observar en la Fig. 10, la α-Syn humana truncada se expresa con un patrón típico de

la población dopaminérgica de la SN y del ATV en el ratón Glong frente al ratón control Ola Hsd, que no

expresa esta proteína. Sin embargo, cabe destacar que la tinción de α-Syn en los ratones WT muestra una

señal que podría indicar que el anticuerpo reconoce también la α-Syn murina, expresada en todas las

neuronas de este animal.

Los ratones Glong no muestran pérdida de las neuronas dopaminérgicas de la SN ni el ATV con la edad Existen evidencias que demuestran que la acumulación y agregación de la α-Syn altera la funcionalidad

de las células dopaminérgicas, lo que provoca alteraciones patológicas y, en último término, su muerte91.

Para comprobar cómo afecta la acumulación de la α-Syn humana truncada a las neuronas dopaminérgicas

de las áreas cerebrales motoras del ratón Glong, realizamos tinciones inmunohistoquímicas contra la TH

(enzima limitante de la síntesis de dopamina) en cortes seriados de la sustancia negra y el ATV de ratones

WT, Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses. Posteriormente, sobre estas secciones se realizó un estudio

estereológico con el que se determinó el número de neuronas dopaminérgicas tiroxina hidroxilasa

positivas (TH+) (Fig. 11).

Comprobamos que en el modelo Glong no se produce una pérdida neuronal dopaminérgica significativa

con el avance de la edad en la SN (Fig. 11; Glong 3 meses: 17603 + 1670; Glong 8 meses: 17433 + 2945;

Glong 15 meses: 16852 + 2009 neuronas TH+) ni en el ATV (Fig. 11; Glong 3m: 12721 + 802; 8m: 12288 +

Figura 10. Los ratones Glong acumulan la α-Syn humana truncada en la SN y el ATV. Inmunohistoquímica contra α-Syn en la sustancia negra y el área tegmental ventral de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses. Barra de calibración: 500 µm (objetivo de bajo aumento (5x)).

38

535; 15m: 12232 + 1002 neuronas TH+) y tampoco presentan un número menor de neuronas

dopaminérgicas que los ratones control en la SN (WT: 17617 + 683; Ola Hsd: 16203 + 1190 neuronas TH+)

ni el ATV (WT: 11554; Ola Hsd: 11416 + 708 neuronas TH+).

Las neuronas dopaminérgicas de la SN y el ATV de los ratones Glong muestran alteraciones funcionales y morfológicas asociadas a la edad Estudios previos del laboratorio han demostrado que las neuronas dopaminérgicas que proyectan al

estriado ven su funcionalidad alterada en los ratones Glong a medida que su edad avanza, ya que pierden

una proteína esencial para su correcto funcionamiento, el transportador vesicular de monoaminas

(VMAT2), como indica la disminución drástica de tinción en el estriado del ratón Glong en comparación

con los controles (Fig. 12). Este transportador se encuentra en la membrana de las vesículas sinápticas,

encargándose de introducir las aminas biógenas (en este caso la dopamina) presentes en el citoplasma

celular al interior de dichas vesículas para su almacenamiento y posterior liberación92,93, por lo que es

necesaria para que exista una adecuada comunicación entre estas neuronas. Además, se le ha atribuido

un papel neuroprotector en el sistema dopaminérgico93.

Figura 11. Los ratones Glong no muestran pérdida de las neuronas dopaminérgicas de la SN ni el ATV con la edad. (A) Inmunohistoquímica contra TH de la SN y ATV de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses. Barra de escala: 500 µm (objetivo de bajo aumento (5x)). (B) Cuantificación estereológica del número

de neuronas TH+ en la SN y el ATV. Los datos se muestran como media ± EEM. n=3-4 animales por grupo de

edad.

39

Para ver si también se producen alteraciones en los cuerpos neuronales, estudiamos el tamaño de los

somas, ya que en el estudio estereológico de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra y el ATV

de los ratones Glong no observamos pérdida neuronal. El tamaño de las neuronas dopaminérgicas de

estas áreas se analizó utilizando el software Neurolucida y se midió en ratones Glong de 3, 8 y 15 meses

y sus controles (WT y Ola Hsd) con el fin de comprobar si a edades avanzadas, estas neuronas son

morfológicamente normales o se encuentran atrofiadas (Fig. 13 y 14).

Observamos que, con el avance de la edad de los ratones Glong, se produce una disminución significativa

del área de los somas de las neuronas dopaminérgicas tanto de la SN (Fig. 13; Glong 3 meses: 156 + 5; 8

meses: 131 + 4,5; 15 meses: 93 + 4 µm2) como del ATV (Fig. 14; Glong 3m: 186 + 3; 8m: 186 + 3,6; 15m:

146 + 4 µm2). Además, el área de las neuronas dopaminérgicas de los ratones Glong es significativamente

Figura 12. El transportador vesicular de monoaminas (VMAT2) se encuentra disminuido en el modelo Glong. (A) Inmunohistoquímica contra VMAT2 en el estriado de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses. Barra de escala: 500 µm (objetivo de bajo aumento (4x)). (B) Representación gráfica del porcentaje de área teñida de VMAT2 en el estriado. Los valores se muestran como media + EEM. Se encontraron diferencias significativas entre los ratones Glong de todas las edades y los ratones WT (****p<0.0001) y Ola Hsd (####p<0.0001). n=3-4 animales por grupo de edad.

40

menor que la de los controles en la SN (Fig. 13; WT: 233 + 6,7; Ola Hsd: 225 + 4,5 µm2) y el ATV (Fig. 14;

WT: 217 + 7; Ola Hsd: 215 + 4,5 µm2).

Estos resultados muestran que las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra y el ATV se encuentran

atrofiadas en los ratones Glong, por lo que su funcionalidad podría encontrarse alterada.

Figura 13. Las neuronas dopaminérgicas de la SN de los ratones Glong se atrofian con el avance de la edad de estos animales. (A) Inmunohistoquímica contra la TH en la SN de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses. Barra de calibración: 20 µm (Objetivo de alto aumento y aceite de inmersión (100x)). (B)

Análisis del tamaño del soma de las neuronas TH+ de la SN. Los valores se muestran como media + EEM. Se

encontraron diferencias significativas en el área media de los somas neuronales dopaminérgicos de la SN de los ratones Glong de 15 meses frente a los Glong 8 meses (@@p<0.01) y los Glong de 3 meses ($$$$ p< 0.0001) y en el soma de los ratones Glong de todas las edades (3, 8 y 15 meses) respecto a los WT (**** p<0.0001) y los Ola Hsd (#### p<0.0001). n=3-4 animales por grupo de edad.

41

Los ratones Glong expresan la α-Syn truncada en las terminales dopaminérgicas del estriado Para visualizar la expresión de la α-Syn en las terminales dopaminérgicas del estriado de los ratones Glong,

realizamos una tinción de inmunofluorescencia doble para la TH y la α-Syn en el estriado de ratones WT,

Ola Hsd y Glong de 15 meses. Como se puede observar en la Fig. 15, la α-Syn colocaliza con la TH en las

terminales dopaminérgicas (TH-positivas) que inervan el estriado (Fig. 15) en los ratones Glong.

Figura 14. Las neuronas dopaminérgicas del ATV de los ratones Glong se atrofian con el avance de la edad de estos animales. (A) Inmunohistoquímica contra la TH en el ATV de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses. Barra de calibración: 20 µm (objetivo de alto aumento y aceite de inmersión (100x)). (B) Análisis

del tamaño de las neuronas TH+ del ATV. Los valores se muestran como media + EEM. Se encontraron

diferencias significativas en el área de los somas neuronales dopaminérgicos del ATV de los ratones Glong de 15 meses frente a los ratones Glong de 3 y 8 meses ($$$$ p<0.0001) y en el soma de los ratones Glong de todas las edades (3, 8 y 15 meses) respecto a los ratones WT (*p<0.05; **p<0.01; ****p<0.0001) y a los Ola Hsd (### p<0.001; #### p<0.0001). n=3-4 animales por grupo de edad.

42

Figura 15. Las terminales dopaminérgicas del estriado de los ratones Glong expresan la α-Syn humana truncada (1-120). Tinción de inmunofluorescencia doble realizada contra TH (rojo) y α-Syn (verde) en ratones WT, Ola Hsd y Glong de 15 meses. Puntas de flecha: neuronas que co-expresan la TH y la α-Syn humana truncada. Barras de calibración: 200 μm (objetivo de bajo aumento (10x)) y 22 μm (objetivo de alto aumento (63x)).

43

Los ratones Glong acumulan la α -Syn humana truncada en el estriado El modelo Glong, deficiente en la α-Syn murina, expresa la α-Syn humana truncada bajo el promotor de

la TH de rata. Para medir la expresión de la α-Syn humana truncada en el estriado de los ratones Glong,

realizamos una tinción inmunohistoquímica contra la α-Syn en cortes seriados del estriado de ratones WT,

Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses, sobre la que se realizó un análisis de imagen, midiendo el porcentaje

de área teñida (Fig. 16).

Comprobamos que los ratones Glong expresan diferencialmente la α-Syn frente a los ratones Ola Hsd (Ola

Hsd: 0,13 + 0,04%; Glong 3 meses: 88,51 + 0,71%; 8 meses: 89,91 + 0,39%; 15 meses: 90,15 + 0,44% del

área teñida). Además, los ratones Ola Hsd, deficientes en la proteína α-Syn (Snca-/-), no muestran

expresión de la α-Syn, ya que la señal obtenida es casi nula y podría indicar el fondo inespecífico de la

tinción (Fig. 16). Los ratones WT muestran la expresión de la α-Syn murina en todas sus neuronas.

Figura 16. Los ratones Glong acumulan la α-Syn humana truncada en el estriado. (A) Inmunohistoquímica contra α-Syn en el estriado de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses. Barra de calibración: 500 µm (objetivo de bajo aumento (4x)). (B) Representación gráfica del porcentaje de área teñida de α-Syn del estriado. Los valores se muestran como media + EEM. Los ratones Glong presentan un aumento significativo en la expresión de α-Syn en el estriado respecto a los ratones Ola Hsd (####p<0.0001). Además, en los ratones Ola Hsd, la expresión de la α-Syn es significativamente menor a la de los ratones WT (****p<0.0001). n=3-4 animales por grupo de edad.

44

La expresión de α-Syn truncada reduce la inervación dopaminérgica estriatal con la edad

Dado que las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra inervan el estriado, tras realizar el estudio

estereológico en la sustancia negra, evaluamos el grado de inervación dopaminérgica del estriado de

ratones Glong de 3, 8 y 15 meses y sus controles (WT y Ola Hsd). Para ello, realizamos una tinción

inmunohistoquímica contra la TH en cortes seriados del estriado, sobre los que, posteriormente, se llevó

a cabo un análisis de las fibras TH+ (Fig. 17), para comprobar si, aunque el número de neuronas no

disminuya en la SN y el ATV, la inervación del estriado se encuentra alterada o si también se mantiene en

su estado normal.

Figura 17. En los ratones Glong de edad avanzada se produce una pérdida en la inervación dopaminérgica del estriado. (A) Inmunohistoquímica contra la TH del estriado de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses. Barra de calibración: 500 µm (objetivo de bajo aumento (4x)). (B) Representación gráfica del porcentaje de área teñida de TH en el estriado. Los valores se muestran como media + EEM. Los ratones Glong de 15 meses presentan una reducción significativa de la inervación dopaminérgica respecto a los ratones Glong de 3 meses ($$$$ p<0.0001) y respecto a los ratones WT (**p<0.01) y Ola Hsd (#p<0.05). n=3-4 animales por grupo de edad.

45

Observamos que la inervación dopaminérgica del estriado se altera en los ratones Glong de edad

avanzada (Fig. 17; WT: 83,79 + 0,99%; Ola Hsd: 82,82 + 1,21%; Glong 3 meses: 87,22 + 0,88%; 8 meses:

84,93 + 0,75%; 15 meses: 76,16 + 1,13% del área teñida). Estos resultados muestran que, aunque los

cuerpos neuronales presentes en la sustancia negra no se pierden, las fibras que proyectan a otras áreas

como el estriado están alteradas y disminuyen con la edad del animal.

Los ratones Glong expresan la α-Syn humana truncada en el NDR Existen evidencias que demuestran que, durante la progresión de la EP, se produce la degeneración de

las neuronas del NDR38, que actúa como sustrato anatómico de algunos síntomas no motores de la

enfermedad, como la depresión47.

Para confirmar que la α-Syn humana truncada se expresa en las neuronas dopaminérgicas del NDR,

realizamos, en primer lugar, tinciones de inmunofluorescencia doble contra la TH y la α-Syn (Fig. 18) y

contra la triptófano hidroxilasa 2 (TPH2; enzima limitante en la síntesis de 5-HT) y la α-Syn (Fig. 19) en

cortes seriados del NDR de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 15 meses de edad. Como se puede observar

en la Fig. 18, la α-Syn colocaliza con la TH en las neuronas dopaminérgicas del NDR de los ratones Glong,

a diferencia de los ratones control (WT y Ola Hsd). Por el contrario, en la Fig. 19, observamos que la α-Syn

no colocaliza con la THP2 en los cuerpos neuronales serotoninérgicos del NDR de los ratones Glong ni de

los ratones control (WT y Ola Hsd). No obstante, la abundante α-Syn presente en esta estructura también

podría estar afectando a las células serotoninérgicas.

46

Figura 18. Las neuronas TH+ del NDR de los ratones Glong expresan la α-Syn humana truncada (1-120).

Tinción de inmunofluorescencia doble realizada contra TH (rojo) y α-Syn (verde) en ratones WT, Ola Hsd y Glong de 15 meses. Puntas de flecha: neuronas que co-expresan la TH y la α-Syn humana truncada. Barra de calibración: 200 μm (objetivo de bajo aumento (10x)) y 22 μm (objetivo de alto aumento (63x)).

47

Figura 19. Las neuronas TPH2+ del NDR de los ratones Glong no expresan la α-Syn humana truncada (1-

120). Tinción de inmunofluorescencia doble realizada contra TPH2 (rojo) y α-Syn (verde) en ratones WT, Ola Hsd y Glong de 15 meses. Barra de calibración: 200 μm (objetivo de bajo aumento (10x)) y 22 μm (objetivo de alto aumento (63x)).

48

Para determinar la expresión de la α-Syn en el NDR de los ratones Glong y sus controles (WT y Ola Hsd),

realizamos una tinción inmunohistoquímica contra la α-Syn en cortes seriados del NDR de ratones WT,

Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses. Como podemos observar en la Fig. 20, el modelo Glong expresa la α-

Syn humana truncada en el NDR.

La expresión de α-Syn humana truncada en el NDR no produce muerte neuronal dopaminérgica ni serotoninérgica Estudios previos del laboratorio han demostrado que el modelo Glong muestra cambios

comportamentales a partir de los 8 meses de edad, cuando estos animales presentan un aumento en los

comportamientos de ansiedad y depresión. Para comprobar si estos cambios corresponden con una

disminución de las neuronas dopaminérgicas y/o serotoninérgicas del núcleo dorsal del rafe (NDR),

realizamos tinciones inmunohistoquímicas contra la TH y la TPH2 respectivamente en cortes seriados del

NDR de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses. Posteriormente, sobre las secciones teñidas, se

efectuó un estudio estereológico de las neuronas TH+ y TPH2+ (Fig. 21 y 22).

Como se muestra en las figuras 21 y 22, no se observa una pérdida significativa de las neuronas

dopaminérgicas ni serotoninérgicas con la edad en los ratones Glong (Fig. 21; Glong 3 meses: 1662; 8

meses: 1596; 15 meses: 1573 neuronas TH+) (Fig. 22; Glong 3m: 5145 + 187; 8m: 5231 + 37; 15m: 5321 +

175 neuronas TPH2+). Sin embargo, encontramos una pequeña disminución del número de neuronas TH-

y TPH2-positivas respecto a los ratones controles (Fig. 21; WT: 2186 y Ola Hsd: 1877 neuronas TH+) (Fig.

22; WT 5752 + 962; Ola Hsd: 5823 + 417 neuronas TPH2+). Aunque las diferencias no fueron significativas,

evidencian la alteración del NDR del ratón Glong desde una edad temprana. Es posible que estas

diferencias adquieran significación estadística aumentando el tamaño muestral y se pueda consolidar este

resultado.

Figura 20. Los ratones Glong acumulan la α-Syn humana truncada en el NDR. Inmunohistoquímica contra α-Syn en el NDR de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses y esquema representativo. Barra de calibración: 500 µm (objetivo de bajo aumento (10x)).

49

Figura 21. Los ratones Glong no muestran pérdida de las neuronas dopaminérgicas del NDR con la edad. (A) Inmunohistoquímica contra TH del NDR de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses. Barra de escala: 500 µm (objetivo de bajo aumento (10x)). (B) Cuantificación estereológica del número de neuronas

TH+ en el NDR. Los valores se muestran como la media ± EEM. El modelo Glong no muestra una reducción

significativa de las neuronas dopaminérgicas del NDR con la edad. n=3-4 animales por grupo de edad.

Figura 22. Los ratones Glong no muestran pérdida de las neuronas serotoninérgicas del NDR con la edad. (A) Inmunohistoquímica contra TPH2 en el NDR de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses. Barra de escala: 500 µm (objetivo de bajo aumento (10x)). (B) Cuantificación estereológica del número de

neuronas TPH2+ en el NDR. Los valores se muestran como la media + EEM. En el modelo Glong no se observa

una disminución significativa de las neuronas serotoninérgicas del NDR con la edad. n=3-4 animales por grupo de edad.

50

La α -Syn se acumula en las fibras dopaminérgicas del BNST de los ratones Glong Para determinar la expresión de la α-Syn humana truncada en el núcleo del lecho de la estría terminal

(BNST) de los ratones Glong, realizamos una tinción inmunohistoquímica contra la α-Syn en cortes

seriados de dicha estructura de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses. Posteriormente, sobre

las secciones teñidas se realizó un análisis de imagen, midiendo el porcentaje de área teñida de α-Syn (Fig.

23).

Comprobamos que los ratones Glong de 8 y 15 meses presentan un aumento de la expresión de la α-Syn

humana truncada (Glong 3 meses: 87,79 + 2,07%; 8 meses: 88,57 + 1,45%; 15 meses: 88,96 + 1,3% de área

teñida) frente a los ratones Ola Hsd (Ola Hsd: 0,04 + 0,02% de área teñida), deficientes en esta proteína

(Fig. 23). Así, la expresión de α-Syn en el BNST de los ratones Ola Hsd es significativamente menor a la de

los ratones WT, que expresan la α-Syn murina en todas sus neuronas.

Figura 23. Los ratones Glong acumulan la α-Syn humana truncada en el BNST. (A) Inmunohistoquímica contra α-Syn en el BNST de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses. Barra de calibración: 500 µm (objetivo de bajo aumento (5x)). (B) Representación gráfica del porcentaje de área teñida de α-Syn en el BNST. Los valores se muestran como la media + EEM. Los ratones Glong de 8 y 15 meses presentan un aumento significativo en la expresión de α-Syn en el BNST respecto a los ratones Ola Hsd (#p<0.05 y ##p<0.01, respectivamente). Los ratones Ola Hsd presentan un aumento en la expresión de α-Syn en el BNST respecto a los ratones WT (****p<0.0001). n=3-4 animales por grupo de edad.

51

La sobre expresión de α-Syn truncada en las neuronas dopaminérgicas produce una pérdida progresiva de la inervación dopaminérgica al BNST Las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra, el área tegmental ventral y el núcleo dorsal del rafe

envían proyecciones al núcleo del lecho de la estría terminal. Por ello, tras realizar el estudio estereológico

en todas estas estructuras y determinar el aumento en la expresión de la α-Syn, evaluamos el grado de

inervación dopaminérgica del BNST para comprobar si esta se mantiene en los ratones Glong de edad

avanzada o si, al igual que sucede con el estriado, la inervación dopaminérgica de esta área se encuentra

alterada. Para ello, realizamos tinciones inmunohistoquímicas contra la TH en cortes seriados del BNST de

ratones WT, Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses. Posteriormente, sobre estas secciones se llevó a cabo un

análisis de imagen en el que medimos el porcentaje de área teñida de TH (Fig. 24).

Como se muestra en la Fig. 24, los ratones Glong de 8 y 15 meses presentan una pérdida significativa de

la inervación dopaminérgica del BNST con respecto a los ratones Glong de 3 meses (Glong 3 meses: 58,17

+ 3,24%; 8 meses: 39,2 + 1,75%; 15 meses: 35,5 + 3,15% de área teñida). Esta pérdida también es

Figura 24. En los ratones Glong se produce una pérdida de la inervación dopaminérgica del BNST con la edad. (A) Inmunohistoquímica contra la TH del BNST de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 3, 8 y 15 meses. Barra de calibración: 500 µm (objetivo de bajo aumento (5x)). (B) Representación gráfica del porcentaje de área teñida de TH en el BNST. Los valores se muestran como la media + EEM. Los ratones Glong de 8 y 15 meses presentan una reducción significativa en la inervación dopaminérgica respecto a los ratones Glong de 3 meses ($ p<0.05 y $$ p<0.01, respectivamente) y respecto a los ratones WT (*p<0.05 y **p<0.01, respectivamente). n=3-4 animales por grupo de edad.

52

significativa respecto a los ratones control WT (WT: 62,08 + 4,34%; Ola Hsd: 55,39 + 6,48% de área teñida).

De nuevo, los resultados muestran que, aunque los cuerpos neuronales presentes en la sustancia negra,

el ATV y el NDR no disminuyan con la edad, las fibras que estas envían a otras áreas sí disminuyen, lo que

puede afectar al comportamiento del animal.

La actividad GCasa tiende a disminuir con la edad en la sustancia negra y el núcleo dorsal del rafe de los ratones Glong Estudios previos han demostrado que la agregación de la α-Syn reduce los niveles de la enzima

glucocerebrosidasa (GCasa), así como su actividad lisosomal87,94,95

Por ello, quisimos determinar los niveles de actividad GCasa en el ratón Glong, modelo de la EP, que

presenta una acumulación de la α-Syn humana truncada, a diferentes edades (3 y 7 meses). Para ello,

realizamos ensayos de actividad enzimática GCasa con el sustrato artificial 4-metilumbeliferil β D-

glucopiranósido en la sustancia negra, el estriado y el núcleo dorsal del rafe de ratones Glong y sus

controles (WT y Ola Hsd).

En primer lugar, encontramos que los ratones Ola Hsd muestran una reducción de la actividad GCasa

frente a los ratones WT en todas las estructuras analizadas (SN, estriado y NDR; Fig. 25). Estos resultados

indican que la ausencia de la α-Syn murina endógena afecta a la actividad de la enzima GCasa. En segundo

lugar, encontramos que los ratones Glong presentan un aumento no significativo de la actividad GCasa

respecto a los ratones Ola Hsd de la edad correspondiente en la SN (SN Glong 3 meses: 34,25 + 4,94

nmol/h/mg; 7 meses: 26,92 + 2,53 nmol/h/mg) (SN Ola 3 meses: 22,75 + 1,83 nmol/h/mg; 7 meses: 25,95

+ 2,77 nmol/h/mg), el estriado (Str Glong 3m: 17,34 + 1,26 nmol/h/mg; 7m: 20,03 + 1,25 nmol/h/mg) (Str

Ola 3m: 14,34 + 0,90 nmol/h/mg; Ola 7m: 18,23 + 1,22 nmol/h/mg) y el NDR (NDR Glong 3m: 27 + 0,04

nmol/h/mg; Ola Hsd 3m: 22,32 + 2,10 nmol/h/mg). Por último, los ratones Glong presentan una actividad

GCasa menor a la de los ratones WT en todas las estructuras analizadas (Fig. 25).

Además, observamos que la actividad GCasa de los ratones WT y Ola Hsd aumenta ligeramente con la

edad en la SN (SN WT 3 meses: 82,46 + 8,85 nmol/h/mg; 10-12 meses: 95,46 + 10,17 nmol/h/mg) (SN Ola

3 meses: 22,75 + 1,83 nmol/h/mg; 7 meses: 25,95 + 2,77 nmol/h/mg), el estriado (Str WT 3m: 66,24 + 3,17

nmol/h/mg; 10-12m: 75,85 + 7,91 nmol/h/mg) (Str Ola 3m: 14,34 + 0,90 nmol/h/mg; Ola 7m: 18,23 + 1,22

nmol/h/mg) y el NDR (NDR WT 3m: 96,28 + 6,17 nmol/h/mg; 10-12m: 101,60 + 2,72 nmol/h/mg) (NDR

Ola 3m: 22,32 + 2,10 nmol/h/mg; 7 m: 22,93 + 0,46 nmol/h/mg). En cambio, el modelo Glong presenta

una reducción (no significativa) en los niveles de actividad GCasa de la SN y el NDR a los 7 meses respecto

a los 3 meses de edad. Esta reducción no ocurre en el estriado de los ratones Glong, donde la actividad

GCasa es ligeramente mayor en los ratones Glong de 7 meses frente a los de 3 meses (Str Glong 3m: 17,34

+ 1,26 nmol/h/mg; 7m: 20,03 + 1,25 nmol/h/mg).

53

Figura 25. Los ratones Ola Hsd y Glong muestran una reducción de la actividad Gcasa. Ensayo de actividad Gcasa en la SN, estriado y NDR de ratones WT, Ola Hsd y Glong de 3 y 7 meses de edad. Los valores se muestran como la media + EEM. Los ratones Ola Hsd de 3 meses presentan una reducción significativa de la actividad GCasa del estriado respecto a los ratones WT de 3 meses (**p<0.01) y los ratones Ola Hsd de 7 meses presentan una reducción significativa respecto a los ratones WT de 10 meses en la sustancia negra y el estriado (##p<0.01 y #p<0.05, respectivamente). n=2-4 animales por grupo de edad.

54

Discusión

El objetivo de este trabajo ha sido determinar el efecto de la acumulación de la α-Syn humana truncada

(1-120) en las poblaciones neuronales dopaminérgica y serotoninérgica de áreas cerebrales con funciones

motoras como la sustancia negra (SN), el área tegmental ventral (ATV) o el estriado y de áreas no motoras

como el núcleo dorsal del rafe (NDR) o el núcleo del lecho de la estría terminal (BNST), importantes en la

EP. También hemos estudiado el efecto de la acumulación de la α-Syn humana truncada en la actividad

lisosomal GCasa1, importante para la correcta degradación de la α-Syn.

Para todo ello, hemos utilizado ratones de diferentes edades (3, 8 y 15 meses) de un modelo de agregación

de α-Syn, el ratón transgénico Glong, que carece de la α-Syn murina y expresa la α-Syn humana truncada

(1-120, desprovista de su extremo C-terminal). Como controles, se han utilizado ratones wild type (WT) y

ratones Ola Hsd (Snca-/-). Los ratones Ola Hsd, deficientes en la proteína α-Syn, nos permiten comprobar

los efectos de la acumulación de la α-Syn humana truncada en los ratones Glong de forma aislada, ya que

poseen el mismo fondo genético que estos. De esta forma, comparando estos dos modelos, estamos

eliminando la interferencia del efecto que pudiera ocasionar la presencia de la α-Syn murina endógena,

que sí está presente en los ratones WT.

En el estudio hemos comprobado que los ratones Glong presentan acumulación de la α-Syn humana

truncada (1-120) desde los 3 meses de edad en las células dopaminérgicas (TH+). En relación a las áreas

motoras, la población de neuronas dopaminérgicas de la SN y el ATV se mantiene constante, sin embargo,

estas neuronas se van atrofiando progresivamente con la edad de los ratones, por lo que las neuronas

dopaminérgicas de estas áreas sufren alteraciones morfológicas y funcionales. Así, la inervación que el

estriado recibe de estas áreas está alterada en los ratones Glong de 15 meses de edad, disminuyendo la

cantidad de fibras TH+. En cuanto a las áreas no motoras, las poblaciones dopaminérgicas y

serotoninérgicas del núcleo dorsal del rafe (NDR) se mantienen con la edad de los ratones, aunque hay

una tendencia a la baja en comparación con los ratones control. De manera similar, la inervación

dopaminérgica del BNST disminuye con la edad en los ratones Glong.

Acumulación de la α-Syn humana truncada (1-120) en el modelo Glong El modelo Glong expresa la α-Syn humana truncada (1-120) bajo el promotor de la tiroxina hidroxilasa

(TH) de rata. En este estudio hemos confirmado que las neuronas dopaminérgicas (TH+) de la SN, del ATV

y del NDR (Fig. 10 y 20) y las fibras dopaminérgicas que proyectan al estriado y al BNST (Fig. 16 y 23)

expresan la α-Syn humana truncada, presentando una diferencia significativa frente a los ratones control

desde los 3 meses de edad.

Estos resultados son consistentes con el estudio realizado por Tofaris y colaboradores78, en el que

encuentran altos niveles de la α-Syn humana truncada (1-120) en regiones cerebrales que expresan altos

niveles de TH, como la vía nigroestriatal y el bulbo olfatorio, de los ratones Glong desde las 6 semanas de

edad en adelante. En este estudio, la inmunoreactividad frente a la α-Syn humana truncada (1-120)

55

aparece tanto en el soma de las células TH+, con una colocalización del 90% y extendiéndose hacia los

procesos dendríticos, como en las terminales nerviosas, en concordancia con nuestros resultados.

Los resultados obtenidos en nuestro estudio muestran una cantidad constante de α-Syn en todas las

edades analizadas de los ratones Glong, es decir, no muestran una acumulación progresiva de esta

proteína. No podemos confirmar que la proteína no se acumule en las células dopaminérgicas con el

avance de la edad de los animales, ya que puede deberse a una limitación de la técnica de estudio o al

anticuerpo utilizado. Serían necesarios estudios posteriores con técnicas de mayor sensibilidad que

confirmaran si los niveles de α-Syn en las áreas estudiadas son constantes o, por el contrario, aumentan

con la edad del animal debido a la acumulación de esta. También es posible que, aunque no aumente la

α-Syn de manera detectable con el anticuerpo utilizado, sí aumente la fracción insoluble.

Efecto de la agregación de la α-Syn humana truncada (1-120) en las neuronas dopaminérgicas de la SN y el ATV En este estudio no se han encontrado diferencias en el número de neuronas dopaminérgicas de la SN y el

ATV de los ratones Glong a diferentes edades estudiadas, ni respecto a los ratones control. Sin embargo,

las células dopaminérgicas de estas dos estructuras presentan una atrofia progresiva, que podría estar

acompañada de otros cambios patológicos que dificulten el correcto funcionamiento de estas células y

las hagan disfuncionales.

Estos resultados confirman y completan los resultados obtenidos por Tofaris y colaboradores78 en su

estudio del modelo Glong. Estos investigadores no encuentran neurodegeneración dopaminérgica en la

SN, pero detectan cambios patológicos en las células dopaminérgicas de los ratones de 12-14 meses que

incluyen encogimiento del soma neuronal (somas picnóticos asociados a inclusiones perinucleares o muy

localizadas en un punto del soma neuronal) y vacuolización de este.

Nuestros datos están en consonancia con el estudio de Lynch y colaboradores96 en el modelo MitoPark

de la EP. Este modelo, deficiente en el factor de transcripción mitocondrial en las neuronas

dopaminérgicas, presenta una reducción en el tamaño de los somas de las neuronas dopaminérgicas de

forma dependiente de la edad, además acompañado de una disminución en la arborización de sus

neuritas. En este modelo, al igual que ocurre en el modelo Glong, la degeneración progresiva en la

morfología somatodendrítica ocurre de forma previa a la muerte neuronal, de forma que, a edades

relativamente avanzadas, las neuronas dopaminérgicas que permanecen vivas tienen importantes daños

que comprometen su funcionalidad.

Estudios realizados en muestras post-mortem de pacientes de EP también han encontrado una reducción

del volumen de los somas de las neuronas pigmentadas de la SN en comparación a los grupos control97.

Todos estos datos indican que a pesar de no existir una pérdida neuronal dopaminérgica en estructuras

como la SN y el ATV, como consecuencia de la presencia de depósitos de α-Syn, estas células acumulan

daños patológicos a medida que la edad del animal avanza, lo que compromete su funcionalidad.

56

Efecto de la agregación de la α-Syn humana truncada (1-120) en la inervación dopaminérgica del estriado En nuestro estudio encontramos que el modelo Glong presenta una pérdida en la inervación

dopaminérgica del estriado a los 15 meses de edad.

El grupo de Tofaris y colaboradores78, en su estudio de los ratones Glong, encontró signos de daño

patológico en las terminales nerviosas dopaminérgicas del estriado de los animales Glong de edad

avanzada, como procesos distróficos con varicosidades focales y un diámetro mayor al de los animales

control. Además, estos ratones presentaban una reducción de los niveles estriatales de dopamina y su

metabolito ácido homovanílico del 30% a partir de los 3 meses de edad, en consonancia con los cambios

neuroquímicos de la EP, caracterizada por una deficiencia en la DA estriatal y en el ácido homovanílico.

Estas alteraciones de las terminales dopaminérgicas del estriado junto con la degeneración de estas fibras

asociada a la edad observada en nuestro estudio concuerdan con los daños patológicos encontrados

previamente en el laboratorio en las fibras nerviosas del estriado de los ratones Glong, que muestran una

pérdida del transportador vesicular de monoaminas (VMAT2), necesario para el almacenamiento y la

posterior liberación de la dopamina, desde los 3 meses de edad.

Tanto la reducción de los niveles de VMAT2 en las terminales dopaminérgicas del estriado como la muerte

y degeneración terminal encontradas en nuestro estudio, concuerdan con varios estudios que han

demostrado que la sobreexpresión de la α-Syn provoca defectos en la neurotransmisión en las neuronas

dopaminérgicas98. Además, varios modelos animales de la EP basados en la sobreexpresión de la α-Syn

humana, han demostrado que los cambios en la función sináptica preceden a la neurodegeneración en

estos animales98.

Estudios anteriores realizados con PET han mostrado una disminución significativa de VMAT2 en el

estriado de pacientes de EP99. Además, se ha demostrado que en ratones que expresan solo una pequeña

cantidad de este transportador, presentan una disfunción dopaminérgica nigroestriatal asociada a la edad

que finalmente resulta en neurodegeneración, que comienza en los terminales nerviosos y finaliza en los

cuerpos celulares93.

Así, la reducción de DA podría deberse tanto a los daños patológicos presentes en los cuerpos celulares

(atrofia, inclusiones patológicas de α-Syn, vacuolización) como a los daños observados en las terminales

nerviosas (varicosidades, procesos distróficos, falta del VMAT2, incluso muerte axonal) o a la conjunción

de todos ellos. Todos estos daños podrían estar causando otros daños neuropatológicos y metabólicos

adicionales y, finalmente, cambios en la actividad locomotora, como los que encuentran Tofaris y

colaboradores78 en el modelo (con la edad y respecto a los animales control).

En un modelo murino con solo el 5% de expresión de VMAT2, se han encontrado alteraciones no-

dopaminérgicas que preceden a la pérdida de neuronas dopaminérgicas, lo que sugiere que un amplio

rango de déficits podría estar relacionado con una disfunción progresiva de las neuronas dopaminérgicas

(previa a la muerte celular)100.

Como podemos observar en la Fig. 17, aunque la acumulación de la α-Syn se produce desde una edad

temprana, la pérdida de inervación dopaminérgica del estriado no es significativa hasta los 15 meses. Esto

indica que, en estos animales, el envejecimiento, junto con la α-Syn acumulada, supone la aparición de

daños degenerativos que alteran las terminales dopaminérgicas, provocando finalmente su muerte.

57

Todos estos datos indican una disfunción específica del sistema dopaminérgico, tanto a nivel celular como

de las fibras nerviosas, en consonancia con la expresión diferencial de α-Syn (1-120) en estas neuronas y

que concuerda con datos obtenidos de cerebros de pacientes de EP. Estos datos muestran que, aunque

la deficiencia de DA estriatal es del 80%, la pérdida de neuronas dopaminérgicas de la SN es solo del

50%101.

Efecto de la agregación de la α-Syn humana truncada (1-120) en las neuronas dopaminérgicas y serotoninérgicas del NDR El NDR de los ratones Glong no muestra una neurodegeneración significativa de la población

dopaminérgica ni serotoninérgica, a diferencia de lo que ocurre en los pacientes de EP38, pero sí una ligera

disminución frente a los ratones control. Estos resultados son consistentes con datos previos78, que no

encuentran una reducción significativa de los niveles de serotonina estriatales.

Diversos estudios han demostrado que el NDR es el sustrato anatómico de síntomas neuropsiquiátricos

como la depresión, la ansiedad o trastornos del sueño que aparecen en los pacientes de la EP. Estudios

previos del laboratorio han demostrado que el modelo Glong muestra cambios comportamentales a partir

de los 8 meses, edad a la que estos ratones presentan un aumento en los comportamientos de depresión.

Por ello, a pesar de no apreciar muerte neuronal, sería necesario realizar un estudio morfológico y

metabólico más exhaustivo de estas células, ya que la acumulación de la α-Syn en el NDR podría estar

provocando daños patológicos en los somas neuronales, como atrofia, falta de transportadores u otras

proteínas o a nivel de las terminales nerviosas como ocurre en otras áreas (varicosidades, procesos

distróficos, muerte) que estuvieran alterando su funcionalidad. Estudios de biomarcadores

serotoninérgicos en las áreas a las que proyectan estas neuronas (mesencéfalo, sistema límbico, ganglios

basales, corteza) podrían aportar información sobre la integridad de este sistema.

Además, la acumulación de α-Syn en las neuronas dopaminérgicas podría implicar alteraciones en la

función de las neuronas serotonérgicas, dada la capacidad de las primeras para modular la actividad de

las segundas54,55.

Efecto de la agregación de la α-Syn humana truncada (1-120) en la inervación dopaminérgica del BNST En este estudio encontramos una neurodegeneración significativa de las fibras dopaminérgicas del BNST

de los ratones Glong a partir de los 8 meses de edad.

De nuevo, esta degeneración de las fibras dopaminérgicas del BNST de los ratones Glong indica una

disfunción del sistema dopaminérgico debida a la expresión diferencial de α-Syn (1-120) en estas células.

El BNST recibe una alta densidad de fibras DA procedentes de estructuras como la SN, el ATV y el NDR y

de fibras serotoninérgicas, procedentes de este último42,49. Al igual que ocurre con las fibras

dopaminérgicas que inervan el estriado y que presentan una deficiencia en VMAT2 y daños patológicos,

las fibras dopaminérgicas y serotoninérgicas que proyectan al BNST podrían estar dañadas en este

modelo, lo que podría estar alterando la funcionalidad de esta área cerebral.

58

Esta estructura tiene un importante papel en las respuestas autonómicas y comportamentales al estrés y

la ansiedad40,45. Además, se encuentra en una posición importante para modular los circuitos

dopaminérgicos implicados en el inicio del movimiento40,50. Datos previos obtenidos en el laboratorio han

demostrado que los ratones Glong presentan un aumento significativo en los comportamientos de

ansiedad a partir de los 8 meses de edad. Estos datos concuerdan con la neurodegeneración

dopaminérgica que encontramos en el BNST a partir de los 8 meses de edad de los animales.

Efecto de la agregación de la α-Syn humana truncada (1-120) en la actividad GCasa de la SN, el Str y el NDR Dada la estrecha relación descrita entre la proteína α-Syn y la enzima lisosomal GCasa1, la última parte

de este trabajo se ha centrado en determinar (1) si la ausencia de la α-Syn murina endógena tiene algún

efecto sobre la actividad GCasa1 y (2) si la acumulación de la α-Syn humana truncada reduce la actividad

lisosomal de esta enzima. Nuestros resultados muestran que los ratones Ola Hsd y Glong presentan una

reducción de la actividad GCasa1 frente a los ratones WT en la SN, el estriado y el NDR y que los ratones

Glong muestran un ligero aumento no significativo de la actividad GCasa1 respecto a los ratones Ola

Hsd. Por otro lado, encontramos que los ratones WT y Ola Hsd presentan un ligero aumento de la

actividad GCasa1 con la edad y, sin embargo, los ratones Glong presentan una reducción no significativa

en los niveles de actividad GCasa1 de la SN y el NDR con la edad (Fig. 25).

La reducción de la actividad GCasa1 de los animales Ola Hsd frente a los WT nos indica que la ausencia de

la α-Syn murina endógena podría ser responsable de este efecto. Como describimos en profundidad más

adelante, se ha demostrado la existencia de una relación bidireccional entre la α-Syn y la GCasa187, a pesar

de que, actualmente, los mecanismos moleculares que sustentan esta relación no se conocen

completamente. Es debido a esta relación, en la que estas dos proteínas influyen una sobre otra, que la

falta de la α-Syn murina endógena en los ratones Ola Hsd podría provocar efectos en la actividad GCasa1

de estos animales, en este caso, una reducción.

Además, recientemente, se ha estudiado el papel de la α-Syn en la expresión génica y se ha comprobado

que esta proteína regula este proceso tanto a nivel transcripcional, como traduccional, incluso en la

epigenética del ADN de la célula102. Por tanto, la falta de la α-Syn murina endógena en los ratones Ola Hsd

podría tener consecuencias a nivel traduccional (cambios en los niveles de otras proteínas o enzimas como

la GCasa1), pero también transcripcional (ARNm) o incluso no afectar a los niveles de la GCasa1 pero sí a

su actividad. Con el objetivo de determinar el nivel de interacción entre estas dos proteínas (α-Syn y

GCasa1), en futuros estudios sería interesante medir la cantidad de proteína GCasa1 o de su mensajero

mediante técnicas como Western Blot o RT-PCR, respectivamente, para saber si los cambios observados

en estos ratones se deben a una variación en los niveles de ARNm, de proteína o si, exclusivamente, se

trata de un efecto sobre la actividad de la enzima.

En cuanto al aumento de la actividad de la GCasa1 observado en los ratones WT y Ola Hsd a medida que

aumenta la edad, pensamos que puede deberse a factores asociados al envejecimiento, que conllevan

una acumulación de proteínas u orgánulos (desgaste energético, mitocondrias dañadas) y otros

compuestos tóxicos o aberrantes (generados por el estrés oxidativo) que las células deben degradar. Esto

puede hacer que los sistemas de degradación, y por consiguiente la actividad lisosomal GCasa1, estén más

59

activos como mecanismo de protección ante las alteraciones celulares derivadas del envejecimiento y de

forma independiente a la acumulación de la α-Syn.

No obstante, estos resultados se oponen a lo observado en algunos estudios previos. Rocha y

colaboradores103 demostraron que la actividad GCasa1 de sujetos controles sanos se reduce

gradualmente con la edad, evidenciando así que la reducción de la actividad GCasa1 puede ser un factor

de riesgo crítico relacionado con la edad para desarrollar la EP. Además, un estudio reciente ha

demostrado la reducción dependiente de la edad de la actividad GCasa1 y la acumulación de

glucoesfingolípidos en el cerebro de ratones envejecidos104. Dado que la edad máxima de los ratones Ola

Hsd utilizados en los ensayos de actividad ha sido de 7 meses, sería conveniente medir la actividad GCasa1

en ratones de mayor edad.

Así mismo, encontramos que la actividad GCasa1 está ligeramente incrementada en la SN y el NDR de los

ratones Glong respecto a los ratones Ola Hsd. Una posible explicación a este ligero aumento puede ser la

activación de los sistemas de degradación (entre ellos la autofagia lisosomal) y, por consiguiente, de la

actividad lisosomal GCasa1, como un mecanismo un mecanismo de respuesta de la célula ante la

presencia y acumulación de la α-Syn humana truncada en los ratones Glong.

Pensamos que este mecanismo de defensa como respuesta a la acumulación de la α-Syn podría comenzar

en estadios iniciales de la patología, cuando la acumulación de la α-Syn empieza a hacerse evidente (a

partir de los 3 meses) y que conforme avanza la edad del ratón y se acumula la α-Syn, los mecanismos de

homeostasis celular se ven alterados, lo que concuerda con la ligera reducción de la actividad GCasa1

observada en la SN y NDR de los ratones Glong de 7 meses frente a los de 3 meses. Para confirmar esta

hipótesis se requieren estudios adicionales que determinen la actividad GCasa1 en ratones Glong de

edades más avanzadas (12-18 meses), de forma que podamos comprobar si la actividad GCasa1 continúa

disminuyendo con el avance de la edad del animal, ya que los factores asociados al envejecimiento pueden

potenciar el efecto de la acumulación de la α-Syn en las células dopaminérgicas de estos ratones.

Estos resultados están en consonancia con estudios previos realizados en modelos celulares y animales.

Gegg y colaboradores94 observaron en una línea celular estable que la sobreexpresión de la α-Syn WT

provoca la disminución de la actividad GCasa en un 70%, sobre todo en regiones con acumulación de α-

Syn, además de tener un gran efecto sobre los niveles de proteína. También en el grupo de

Papadopoulos89 observaron que la sobreexpresión de la α-Syn WT mediante el uso de partículas virales

en neuronas corticales murinas primarias reduce la actividad GCasa de forma significativa.

Esta disminución de la actividad GCasa1 también se ha observado en ratones transgénicos que

sobreexpresan la α-Syn humana, como en el estudio llevado a cabo por el grupo de Ikuno y

colaboradores88, en el que, además, la actividad GCasa se veía más afectada en las regiones cerebrales

donde la α-Syn tenía una mayor expresión. Estos resultados son consistentes con resultados previos en

lisados corticales de ratones transgénicos para la α-Syn A53T humana. En estos estudios se observaron

niveles significativamente bajos de actividad GCasa lisosomal en los ratones transgénicos respecto a los

WT, lo que concuerda con los resultados obtenidos por el grupo de Sardi65 en el mismo tipo de ratones

transgénicos. Además, este último grupo demostró que este efecto es dependiente de los niveles de α-

Syn, ya que los ratones homocigotos para la α-Syn A53T mostraban una mayor reducción en la actividad

enzimática que los heterocigotos, que expresan niveles menores de α-Syn. Esta disminución aparecía

60

selectivamente asociada a la GCasa, ya que las actividades de otras enzimas lisosomales no se veían

afectadas.

De igual forma, nuestros resultados también son consistentes con resultados previos obtenidos en

muestras humanas. Varios estudios realizados en grandes cohortes han encontrado una reducción

significativa de la actividad GCasa en cerebros de pacientes de EP esporádica73,94,105. Así, mismo, esta

inhibición también se ha demostrado en extractos de neuronas procedentes de pacientes de EP106. Por

último, el grupo de Murphy y colaboradores95 observó una disminución de la actividad GCasa de forma

selectiva en regiones cerebrales que presentaban altos niveles de α-Syn en pacientes tanto en etapas

tempranas como tardías de la EP.

Como podemos observar, en numerosos estudios llevados a cabo en modelos celulares, animales o en

muestras humanas, se observa una relación directa entre los niveles de α-Syn y la actividad GCasa.

Además, en muchos de ellos, la disminución en la actividad GCasa es mayor cuanto mayores son los

niveles de α-Syn. Nuestros resultados muestran una acumulación no progresiva en regiones como el

estriado o el BNST, siendo los niveles de α-Syn similares a los 3, 8 y 15 meses de edad. Sin embargo, sería

necesario determinar su acumulación a diferentes edades en regiones como la SN y el NDR. Un estudio

reciente ha demostrado que los niveles de α-Syn per sé no influyen ni en la expresión ni en la actividad de

la enzima GCasa1, pero la presencia de agregados patológicos de α-Syn reduce la actividad GCasa1. Así,

proponen que la reducción de la actividad GCasa1 aumenta la vulnerabilidad de las neuronas a la patología

preexistente de la α-Syn107. Es por ello que, en nuestro modelo, sería interesante determinar la presencia

de inclusiones patológicas de α-Syn analizando su solubilidad a distintas edades (3, 8, 15 o 18 meses).

Además, dado que los niveles de α-Syn encontrados en los ratones Glong no cambian con la edad y que

los cambios observados en la actividad GCasa1 entre los ratones Glong de 3 y 7 meses no son

significativos, de acuerdo con la hipótesis planteada en el estudio de Henderson y colaboradores, también

sería necesario medir la actividad GCasa1 en los ratones Glong a edades tempranas (antes de los 3 meses),

cuando el nivel de la patología de la α-Syn es bajo.

No obstante, debemos ser cautos a la hora de interpretar estos resultados, ya que la GCasa es una enzima

ubicua y, por tanto, su expresión no está restringida exclusivamente a las neuronas dopaminérgicas que

expresan la α-Syn 1-120, sino que también se expresa en otros tipos celulares. Debido a que la técnica de

disección utilizada en este trabajo no nos permite discernir entre poblaciones celulares, la actividad

GCasa1 se ha medido en todos los tipos celulares presentes en cada estructura analizada, lo que puede

dificultar la interpretación de los resultados. Para comprobar el efecto de la acumulación de la α-Syn

humana truncada, sería necesario aislar las células TH-positivas y medir la actividad GCasa exclusivamente

en esta población neuronal. Además, cabe la posibilidad de que otras regiones cerebrales próximas a

nuestra región de interés también estén siendo incluidas en los ensayos de actividad y esto pueda

enmascarar nuestros resultados. Otro aspecto a tener en cuenta es el pequeño tamaño muestral utilizado

en estos ensayos de actividad, que explica la alta variabilidad de los resultados. Por ello, sería conveniente

repetir estos ensayos con un número mayor de ratones para dar solidez a los resultados.

Como han descrito numerosos estudios, a la vez que la acumulación de la α-Syn lleva a la disminución de

la actividad GCasa1 lisosomal, esta contribuye al aumento de la propagación y la estabilización de la α-

Syn oligomérica87, ya que la interacción fisiológica de la GCasa con la α-Syn promueve su degradación

lisosomal e impide una acumulación excesiva82. La interacción entre la α-Syn y la GCasa se encuentra muy

61

conservada, ya que se ha demostrado a lo largo de la escala evolutiva en diferentes modelos animales

desde los invertebrados como Drosophila melanogaster o el pez medaka hasta los vertebrados como los

ratones o los macacos82. Así, incluso en modelos animales invertebrados como C. Elegans, los individuos

con una actividad GCasa disminuida muestran niveles más altos de α-Syn que sus respectivos controles

silvestres, de forma similar a lo observado en modelos celulares humanos y en modelos murinos87.

Además, estudios de resonancia magnética nuclear muestran que la GCasa interacciona con una alta

proximidad con el extremo C-terminal de la α-Syn en el ambiente ácido del lisosoma (pH 5.5)82. Ya que el

modelo Glong utilizado en nuestros experimentos expresa la α-Syn humana truncada, deficiente en el

extremo C-terminal de la proteína78, esto podría impedir la correcta interacción de la GCasa con la α-Syn

para su degradación en el lisosoma celular, lo que podría estar favoreciendo su acumulación. Además, ya

que la relación entre estas dos proteínas es bidireccional, la interacción entre ellas podría ser necesaria

para el correcto funcionamiento de la GCasa, por lo que la pérdida de esta interacción en los ratones

Glong podría tener efectos en la actividad de la enzima.

En este mismo aspecto, el grupo de Yap y colaboradores108 demostró que la α-Syn con una conformación

de α-hélice, unida a membrana, es un potente inhibidor de la GCasa, ya que la separa de la membrana y

altera su sitio catalítico, impidiendo la accesibilidad del sustrato. Estos datos sugieren que la acumulación

intralisosomal de α-Syn inhibe la actividad GCasa mediante la formación de un complejo unido a

membrana de GCasa y α-Syn.

Otro de los mecanismos propuestos por los que la α-Syn interfiere sobre la actividad enzimática GCasa1

es la alteración del tráfico retículo endoplásmico-aparato de Golgi mediante la asociación aberrante de la

α-Syn con la maquinaria de fusión, haciendo que la forma inmadura de la GCasa1 presente en el retículo

endoplásmico se acumule106,109, lo que refuerza el ciclo de retroalimentación bidireccional entre las dos

proteínas82,87 al impedir la maduración de la GCasa1 y su correcto funcionamiento en los lisosomas. Para

poder profundizar en los mecanismos moleculares que sustentan la relación entre α-Syn y GCasa1, sería

muy interesante poder confirmar que la acumulación de α-Syn encontrada en el modelo Glong a partir de

los 3 meses, afecta a la localización celular de la enzima GCasa1, reteniéndola en el RE, e impidiendo que

llegue a su destino final, el lisosoma. Nuestros resultados están en consonancia con los resultados del

estudio de Mazzulli y colaboradores106 en el que demostraron que la disminución de la agregación de la

α-Syn restablecía el tráfico y la actividad GCasa, lo que indica que la inhibición resulta específicamente de

la agregación de la α-Syn.

A diferencia de la SN y del NDR, en el estriado de nuestro modelo no detectamos una tendencia a la baja

en la actividad GCasa1 a los 7 meses respecto a los 3 meses de edad. Es posible que las neuronas de la SN,

una región más vulnerable a la patología, presenten los efectos deletéreos de forma más temprana a otras

estructuras como el estriado, en el que las terminales sean más resistentes a los daños y estos aparezcan

a una edad más tardía. Por ello, sería necesario medir la actividad GCasa1 en todas estas estructuras en

animales más envejecidos (12-18 meses), en los que quizá la actividad GCasa1 del estriado se encuentre

más afectada por los efectos de la acumulación de la α-Syn humana truncada sumada a factores asociados

a la edad. En el grupo de Tayebi y colaboradores110 comparan ratones heterocigotos para GBA1 que

sobreexpresan el gen SNCA mutado A53T con ratones que no sobreexpresan este gen y no encuentran

diferencias en la actividad GCasa1 en el prosencéfalo ni el mesencéfalo. Esto difiere con los resultados

obtenidos en la SN y el NDR de los ratones Glong, pero estaría en consonancia con lo observado en el

62

estriado. Factores como los niveles de α-Syn en cada estructura o su agregación, podrían estar influyendo

en los cambios en los niveles de actividad GCasa1 de cada región cerebral.

Como se ha comentado anteriormente, el grupo de Henderson y colaboradores107 no encontró diferencias

en la actividad GCasa1 al comparar células que sobreexpresaban la α-Syn con células que carecían de

expresión de esta proteína, ni al comparar líneas de ratón con diferentes niveles de expresión de α-Syn

tanto WT como mutada (A53T) y tampoco al añadir monómeros de α-Syn a neuronas primarias

hipocampales. En cambio, sí encontraron diferencias en la actividad GCasa1 al tratar las neuronas con

fibrillas de α-Syn (forma patológica de la α-Syn). De acuerdo con esto, es posible que la acumulación de

α-Syn no sea suficiente para provocar cambios en la actividad GCasa1 en las terminales del estriado (no

observamos disminución de la actividad GCasa1 con la edad de los animales) como en la SN y el NDR (la

reducción de la actividad GCasa1 con la edad no es significativa; Fig. 25). Para poder comprobarlo, en

futuros estudios sería necesario determinar la solubilidad de la α-Syn en ratones Glong de distintas

edades.

Pero no solo la acumulación de la α-Syn y las mutaciones del gen GBA1 disminuyen la actividad GCasa183,

sino que existen otros factores que pueden afectar a la actividad de esta hidrolasa lisosomal. Ya que la

GCasa1 es transportada al lisosoma mediante la interacción con LIMP2, que facilita el tráfico de esta

proteína hasta el lumen lisosomal, las mutaciones en el gen SCARB2 (que codifica el transportador LIMP2)

también pueden contribuir a la disminución de la actividad GCasa1. De esta forma, la alteración del

transporte de la GCasa1 al lisosoma puede contribuir a reducir su actividad, incluso en ausencia de

mutaciones en GBA182. Todos estos resultados indican que la disminución de la actividad GCasa1 no solo

contribuye al desarrollo de la patología en pacientes con mutaciones en GBA1, sino que también afecta

al desarrollo de formas esporádicas más comunes de EP y sinucleinopatías en las que no existen

mutaciones en el gen GBA1.

Algunos estudios sugieren que, desde un punto de vista terapéutico, las estrategias centradas en

aumentar la expresión, estabilidad o liberación de la GCasa1 en los lisosomas disminuyen el contenido de

α-Syn y pueden ser útiles para una evaluación profunda a nivel de organismo2. De hecho, varios estudios

han demostrado que la sobreexpresión del gen GBA1 mediante la inyección de partículas virales

adenoasociadas (AAV) facilita el aclaramiento de los agregados insolubles de α-Syn4,64. Pero la expresión

mediante AAV de la GCasa en modelos animales no solo disminuye los niveles de α-Syn resistente a

proteinasa K, sino que también disminuye los niveles de sustratos como el GlcCer y la GluSph, mejora las

anomalías comportamentales, genera protección frente a la neurodegeneración y la pérdida de

marcadores dopaminérgicos estriatales y disminuye la neuroinflamación82,85. Esto indica que el aumento

de la actividad GCasa1 puede influir en la homeostasis de la α-Syn y reducir la acumulación de esta

proteína en animales sin mutaciones en el gen GBA1, ralentizando la progresión de las sinucleinopatías85.

Así, aunque la terapia génica no rescata completamente el fenotipo parkinsoniano de los ratones, mejora

claramente los síntomas que presenta el modelo82. Por ello, aumentar la actividad GCasa1 o reducir la

expresión de la α-Syn podrían ser estrategias potenciales para tratar la EP, independientemente de si

existen o no mutaciones en el gen GBA188.

63

Ventajas y limitaciones del modelo Glong La agregación de la a-Syn es considerada uno de los eventos más importantes en la patogénesis de la EP.

Por ello, muchos modelos animales de la EP se han generado en base a la acumulación de esta proteína

mediante diferentes mecanismos. Muchos de ellos expresan la a-Syn humana WT o mutante bajo

diferentes promotores. Sin embargo, la mayoría, que expresan la α-Syn bajo el promotor Thy1 o el

promotor de la proteína priónica, no generan acumulación de la α-Syn en las neuronas DA de la SN. Los

modelos que utilizan el promotor de la TH tampoco resultan en la formación de inclusiones patológicas78.

Así, este es el primer modelo transgénico murino con agregados de α-Syn mixtos (filamentosos y

granulares) en las neuronas dopaminérgicas. Esto demuestra que la expresión de la proteína α-Syn

humana truncada en un fondo genético sin α-Syn es capaz de inducir la formación de inclusiones in vivo78.

Otra de las ventajas de este modelo es su progresividad. Como hemos observado en este estudio, la

neurodegeneración de las fibras dopaminérgicas en áreas como el estriado o el BNST no ocurre desde el

nacimiento del animal, sino que las terminales van acumulando daños patológicos que las hacen

degenerar progresivamente. De la misma manera, este modelo presenta cambios comportamentales que

aparecen a lo largo de la vida del animal, como el aumento en los comportamientos ansiogénicos y

depresivos, que aparecen a partir de los 8 meses. En este modelo, al igual que ocurre en la EP humana,

los síntomas no motores se presentan con anterioridad a los síntomas motores y, en este caso, a la muerte

neuronal.

El modelo Glong expresa la α-Syn humana truncada, carente de los 20 aminoácidos del dominio C-terminal

(α-Syn 1-120). Esta forma de la proteína ha sido detectada en cuerpos de Lewy de muestras humanas y

en el cerebro de ratones transgénicos que expresan la α-Syn humana mutada y se ha demostrado que la

α-Syn humana truncada agrega de forma más rápida que cualquier proteína WT o mutante in vitro. Por

ello, se cree que el truncamiento del dominio C-terminal de la α-Syn juega un papel en la patogénesis de

las enfermedades por cuerpos de Lewy y en la degeneración de las neuronas dopaminérgicas. Sin

embargo, el mecanismo por el que la α-Syn truncada es generada en las células en condiciones

patológicas, está por dilucidar; pero se cree que el proteasoma podría estar implicado en este proceso.

Los filamentos de α-Syn aislados de cerebros humanos están compuestos de la proteína completa, lo que

sugiere que el truncamiento de la proteína podría ocurrir después de la agregación78. Nuestros resultados,

en consonancia con los resultados obtenidos por Tofaris y colaboradores78, demuestran que la región C-

terminal de la α-Syn actúa como un importante regulador negativo de la agregación in vivo, lo que podría

ayudar a comprender los mecanismos que subyacen a la patogénesis de la EP.

Como hemos podido comprobar, el modelo Glong, expresando la α-Syn humana truncada (1-120) en las

neuronas dopaminérgicas, recapitula muchos cambios característicos de las α-sinucleinopatías humanas.

Sin embargo, la mayor limitación de este modelo es el bajo número de fibrillas, la baja tasa de

neurodegeneración y la ausencia de la α-Syn murina endógena (completa), ya que esto podría provocar

un efecto per sé. Sin embargo, la eliminación de la proteína murina es necesaria para poder evaluar el

efecto de la acumulación de la α-Syn humana truncada sin la interferencia de la proteína murina

endógena78.

En contraposición a nuestro modelo, existen otros, como el estudiado por Thiruchelvam y

colaboradores111, que sí presentan pérdida de neuronas dopaminérgicas en la SN. Este modelo se basa en

la expresión de una forma doblemente mutada de la α-Syn bajo el promotor de la TH, pero no está claro

64

el mecanismo por el que la doble mutación incrementa la toxicidad de la α-Syn. Muchos factores, como

el fondo genético, la corta esperanza de vida, la ausencia de infecciones, la comida controlada y las

condiciones de vida, junto con mecanismos compensatorios que pueden aparecer durante el desarrollo,

pueden afectar a la muerte celular100.

En conclusión, el presente trabajo caracteriza un modelo murino transgénico basado en la agregación de

la α-Syn. La expresión de la α-Syn humana 1-120 bajo el control del promotor de la TH permite la

agregación de la proteína en diferentes regiones cerebrales, incluyendo la SN, el ATV, el NDR, el estriado

y el BNST, como demuestran los estudios histológicos. Esta agregación provoca la pérdida progresiva de

las terminales dopaminérgicas de áreas como el estriado y el BNST, además de la reducción de la actividad

de enzimas lisosomales importantes en la degradación de la α-Syn, como la β-glucocerebrosidasa en la SN

y el NDR de los ratones Glong. Nuestros resultados sugieren que el modelo Glong es un modelo apropiado

para el estudio progresivo de las alteraciones moleculares y funcionales causadas por la acumulación de

la α-Syn humana truncada (1-120) y su relación con la aparición y agravamiento de los síntomas motores

y no motores de la EP y los circuitos neuronales implicados.

65

Conclusiones

Del estudio realizado hemos obtenido las siguientes conclusiones:

En el modelo Glong:

1. La α-Syn humana truncada se acumula en la SN, el ATV, el estriado, el NDR y el BNST desde los 3

meses de edad.

2. No se produce neurodegeneración dopaminérgica asociada a la edad en la SN, el ATV, ni el NDR (y

tampoco serotoninérgica).

3. Las células de la SN y el ATV se atrofian progresivamente desde los 3 meses en adelante.

4. Las fibras dopaminérgicas del estriado degeneran a partir de los 15 meses y las del BNST a partir de

los 8 meses.

5. La actividad glucocerebrosidasa disminuye frente a los ratones wild-type .

6. La actividad glucocerebrosidasa disminuye en la SN y el NDR con la edad de forma no significativa.

En el modelo Ola Hsd:

7. La actividad glucocerebrosidasa disminuye respecto a los ratones wild-type.

66

Referencias

1. Sociedad Española de Neurología. https://www.sen.es/.

2. Blanz J, Saftig P. Parkinson’s disease: acid-glucocerebrosidase activity and alpha-synuclein clearance. J Neurochem. 2016;139:198–215.

3. McCann H, Stevens CH, Cartwright H, Halliday GM. α-Synucleinopathy phenotypes. Park Relat Disord [Internet]. 2014;20(SUPPL.1):S62–7. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S1353-8020(13)70017-8

4. Sardi SP, Clarke J, Kinnecom C, Tamsett TJ, Li L, Stanek LM, et al. CNS expression of glucocerebrosidase corrects α-synuclein pathology and memory in a mouse model of Gaucher-related synucleinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(29):12101–6.

5. Giguère N, Nanni SB, Trudeau LE. On cell loss and selective vulnerability of neuronal populations in Parkinson’s disease. Front Neurol. 2018;9(JUN).

6. Schapira AHV, Chaudhuri KR, Jenner P. Non-motor features of Parkinson disease. Nat Rev Neurosci [Internet]. 2017;18(7):435–50. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nrn.2017.62

7. Schapira AHV. Glucocerebrosidase and Parkinson disease: Recent advances. 2017;66(April):37–42.

8. Selvaraj S, Piramanayagam S. Impact of gene mutation in the development of Parkinson’s disease. Genes Dis [Internet]. 2019;6(2):120–8. Available from: https://doi.org/10.1016/j.gendis.2019.01.004

9. Pang SYY, Ho PWL, Liu HF, Leung CT, Li L, Chang EES, et al. The interplay of aging, genetics and environmental factors in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Transl Neurodegener. 2019;8(1):1–11.

10. Hoehn MM, Yahr MD. Parkinsonism : onset , progression , and mortality. 1967;17(May).

11. Braak H, Del Tredici K, Rüb U, De Vos RAI, Jansen Steur ENH, Braak E. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson’s disease. Neurobiol Aging. 2003;24(2):197–211.

12. Brás IC, Xylaki M, Outeiro TF. Mechanisms of alpha-synuclein toxicity: An update and outlook. Prog Brain Res. 2020;252:91–129.

13. Perez RG. Editorial: The Protein Alpha-Synuclein: Its Normal Role (in Neurons) and Its Role in Disease. Front Neurosci. 2020;14(February):1–3.

14. Garcia-Reitboeck P, Anichtchik O, Dalley JW, Ninkina N, Tofaris GK, Buchman VL, et al. Endogenous alpha-synuclein influences the number of dopaminergic neurons in mouse substantia nigra. Exp Neurol. 2013;248:541–5.

15. Nuber S, Rajsombath M, Minakaki G et al. Abrogating Native α-Synuclein Tetramers in Mice Causes a L-DOPA-Responsive Motor Syndrome Closely Resembling Parkinson’s Disease. Neuron. 2018;47(3):75–90.

16. Ghosh D, Mehra S, Sahay S, Singh PK, Maji SK. Α-Synuclein Aggregation and Its Modulation. Int J Biol Macromol [Internet]. 2017;100:37–54. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2016.10.021

17. Pissadaki EK, Bolam JP. The energy cost of action potential propagation in dopamine neurons: Clues to susceptibility in Parkinson’s disease. Front Comput Neurosci. 2013;7(FEB):1–17.

67

18. Villar-Piqué A, Lopes da Fonseca T, Outeiro TF. Structure, function and toxicity of alpha-synuclein:

the Bermuda triangle in synucleinopathies. J Neurochem. 2016;139:240–55.

19. Rocha EM, De Miranda B, Sanders LH. Alpha-synuclein: Pathology, mitochondrial dysfunction and neuroinflammation in Parkinson’s disease. Neurobiol Dis. 2018;109:249–57.

20. Kim S, Kwon SH, Kam TI, Panicker N, Karuppagounder SS, Lee S, et al. Transneuronal Propagation of Pathologic α-Synuclein from the Gut to the Brain Models Parkinson’s Disease. Neuron [Internet]. 2019;103(4):627-641.e7. Available from: https://doi.org/10.1016/j.neuron.2019.05.035

21. Uemura N, Uemura MT, Luk KC, Lee VMY, Trojanowski JQ. Cell-to-Cell Transmission of Tau and α-Synuclein. Trends Mol Med [Internet]. 2020;1–17. Available from: https://doi.org/10.1016/j.molmed.2020.03.012

22. Killinger BA, Kordower JH. Spreading of alpha-synuclein – relevant or epiphenomenon? J

Neurochem. 2019;150(5):605–11.

23. Gómez-Benito M, Granado N, García-Sanz P, Michel A, Dumoulin M, Moratalla R. Modeling

Parkinson’s Disease With the Alpha-Synuclein Protein. Front Pharmacol. 2020;11(April):1–15.

24. Kordower JH, Chu Y, Hauser RA, Freeman TB, Olanow CW. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson’s disease. Nat Med. 2008;14(5):504–6.

25. Gerfen CR. Indirect-pathway neurons lose their spines in Parkinson disease. Nat Neurosci. 2006;9(2):157–8.

26. Suárez LM, Solís O, Caramés JM, Taravini IR, Solís JM, Murer MG, et al. L-DOPA treatment selectively restores spine density in dopamine receptor d2-expressing projection neurons in dyskinetic mice. Biol Psychiatry [Internet]. 2014;75(9):711–22. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.biopsych.2013.05.006

27. Suarez LM, Solis O, Aguado C, Lujan R, Moratalla R. L-DOPA Oppositely Regulates Synaptic Strength and Spine Morphology in D1 and D2 Striatal Projection Neurons in Dyskinesia. Cereb Cortex.

2016;26(11):4253–64.

28. Suarez LM, Alberquilla S, García-Montes JR, Moratalla R. Differential synaptic remodeling by dopamine in direct and indirect striatal projection neurons in pitx3-/- mice, a genetic model of parkinson’s disease. J Neurosci. 2018;38(15):3619–30.

29. Suarez LM, Solis O, Sanz-Magro A, Alberquilla S, Moratalla R. Dopamine D1 Receptors Regulate Spines in Striatal Direct-Pathway and Indirect-Pathway Neurons. Mov Disord. 2020;1–13.

30. Alberquilla S, Gonzalez-Granillo A, Martín ED, Moratalla R. Dopamine regulates spine density in striatal projection neurons in a concentration-dependent manner. Neurobiol Dis [Internet].

2020;134(October 2019):104666. Available from: https://doi.org/10.1016/j.nbd.2019.104666

31. Yttri EA, Dudman JT. A Proposed Circuit Computation in Basal Ganglia: History-Dependent Gain. Mov Disord. 2018;33(5):704–16.

32. Widomska Justyna. The place of dopamine in the cortico-basal ganglia circuit. Physiol Behav. 2017;176(5):139–48.

33. Huang KW, Ochandarena NE, Philson AC, Hyun M, Birnbaum JE, Cicconet M, et al. Molecular and anatomical organization of the dorsal raphe nucleus. Elife. 2019;8:1–34.

34. Posada-Gracia M. Alteración neuronal del núcleo dorsal del rafe en un modelo genético de la enfermedad de Parkinson. 2019.

35. Grinberg LT, Rueb U, Alho AT di L, Heinsen H. Brainstem pathology and non-motor symptoms in PD. J Neurol Sci [Internet]. 2010;289(1–2):81–8. Available from:

68

http://dx.doi.org/10.1016/j.jns.2009.08.021

36. Gallagher DA, Schrag A. Psychosis, apathy, depression and anxiety in Parkinson’s disease. Neurobiol Dis [Internet]. 2012;46(3):581–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.nbd.2011.12.041

37. Brown RG, Landau S, Hindle J V., Playfer J, Samuel M, Wilson KC, et al. Depression and anxiety related subtypes in Parkinson’s disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2011;82(7):803–9.

38. Remy P, Doder M, Lees A, Turjanski N, Brooks D. Depression in Parkinson’s disease: Loss of dopamine and noradrenaline innervation in the limbic system. Brain. 2005;128(6):1314–22.

39. Prediger RDS, Matheus FC, Schwarzbold ML, Lima MMS, Vital MABF. Anxiety in Parkinson’s disease: A critical review of experimental and clinical studies. Neuropharmacology [Internet]. 2012;62(1):115–24. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.neuropharm.2011.08.039

40. Avery SN, Clauss JA, Blackford JU. The Human BNST: Functional Role in Anxiety and Addiction. Neuropsychopharmacology [Internet]. 2016;41(1):126–41. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/npp.2015.185

41. Knight LK, Depue BE. New frontiers in anxiety research: The translational potential of the bed

nucleus of the stria terminalis. Front Psychiatry. 2019;10(JULY):1–7.

42. Lowry CA, Hale MW, Evans AK, Heerkens J, Staub DR, Gasser PJ, et al. Serotonergic systems, anxiety, and affective disorder: Focus on the dorsomedial part of the dorsal raphe nucleus. Ann N Y Acad Sci. 2008;1148:86–94.

43. Halliday GM, Li YW, Blumbergs PC, Joh TH, Cotton RGH, Howe PRC, et al. Neuropathology of immunohistochemically identified brainstem neurons in Parkinson’s disease. Ann Neurol.

1990;27(4):373–85.

44. Even C, Weintraub D. Is depression in Parkinson’s Disease (PD) a specific entity? J Affect Disord

[Internet]. 2012;139(2):103–12. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.jad.2011.07.002

45. Feliu-Soler A, Martínez-Zalacaín I, Pérez-Aranda A, Borràs X, Andrés-Rodríguez L, Sanabria-Mazo JP, et al. The Bed Nucleus of the Stria Terminalis as a Brain Correlate of Psychological Inflexibility in Fibromyalgia. J Clin Med. 2020;9(2):374.

46. Kostić VS, Agosta F, Petrović I, Galantucci S, Špica V, Ječmenica-Lukic M, et al. Regional patterns of brain tissue loss associated with depression in Parkinson disease. Neurology. 2010;75(10):857–63.

47. Politis M, Wu K, Loane C, Turkheimer FE, Molloy S, Brooks DJ, et al. Depressive symptoms in PD correlate with higher 5-HTT binding in raphe and limbic structures. Neurology. 2010;75(21):1920–7.

48. Clauss J. Extending the neurocircuitry of behavioural inhibition: A role for the bed nucleus of the stria terminalis in risk for anxiety disorders. Gen Psychiatry. 2019;32(6).

49. Ch’ng S, Fu J, Brown RM, McDougall SJ, Lawrence AJ. The intersection of stress and reward: BNST modulation of aversive and appetitive states. Prog Neuro-Psychopharmacology Biol Psychiatry [Internet]. 2018;87(August 2017):108–25. Available from: https://doi.org/10.1016/j.pnpbp.2018.01.005

50. Bastide MF, Glangetas C, Doudnikoff E, Li Q, Bourdenx M, Fernagut PO, et al. Involvement of the bed nucleus of the stria terminalis in L-Dopa induced dyskinesia. Sci Rep. 2017;7(1):5–11.

51. Luyten L. The Bed Nucleus of the Stria Terminalis: Translational Deep Brain Stimulation to Reduce Anxiety. Neuroscientist. 2020;26(3):278–84.

52. Pasquini J, Ceravolo R, Brooks DJ, Bonuccelli U, Pavese N. Progressive loss of raphe nuclei serotonin transporter in early Parkinson’s disease: A longitudinal 123 I-FP-CIT SPECT study. Park Relat Disord

69

[Internet]. 2019;(December 2018):0–1. Available from:

https://doi.org/10.1016/j.parkreldis.2019.03.025

53. Wang S, Zhao Y, Gao J, Guo Y, Wang X, Huo J, et al. In Vivo Effect of a 5-HT7 Receptor Agonist on 5-HT Neurons and GABA Interneurons in the Dorsal Raphe Nuclei of Sham and PD Rats. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 2017;32(2):73–81.

54. Prinz A, Selesnew LM, Liss B, Roeper J, Carlsson T. Increased excitability in serotonin neurons in the dorsal raphe nucleus in the 6-OHDA mouse model of Parkinson’s disease. Exp Neurol [Internet]. 2013;248:236–45. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.expneurol.2013.06.015

55. Vegas-Suarez S, Paredes-Rodriguez E, Aristieta A, Lafuente J V., Miguelez C, Ugedo L. Dysfunction of serotonergic neurons in Parkinson’s disease and dyskinesia [Internet]. 1st ed. Vol. 146, International Review of Neurobiology. Elsevier Inc.; 2019. 259–279 p. Available from:

http://dx.doi.org/10.1016/bs.irn.2019.06.013

56. Qamhawi Z, Towey D, Shah B, Pagano G, Seibyl J, Marek K, et al. Clinical correlates of raphe serotonergic dysfunction in early Parkinson’s disease. Brain. 2015;138(10):2964–73.

57. He Q, Koprich JB, Wang Y, Yu W bo, Xiao B guo, Brotchie JM, et al. Treatment with Trehalose Prevents Behavioral and Neurochemical Deficits Produced in an AAV α-Synuclein Rat Model of

Parkinson’s Disease. Mol Neurobiol. 2016;53(4):2258–68.

58. Schapira AHV, Olanow CW, Greenamyre JT, Bezard E. Slowing of neurodegeneration in Parkinson’s disease and Huntington’s disease: Future therapeutic perspectives. Lancet [Internet]. 2014;384(9942):545–55. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(14)61010-2

59. NCT01568099 I. Clinical trials [Internet]. p. ClinicalTrials.gov. Available from: ClinicalTrials.gov

60. Mishra A, Chandravanshi LP, Trigun SK, Krishnamurthy S. Ambroxol modulates 6-Hydroxydopamine-induced temporal reduction in Glucocerebrosidase (GCase) enzymatic activity and Parkinson’s disease symptoms. Biochem Pharmacol [Internet]. 2018;155(May):479–93. Available from: https://doi.org/10.1016/j.bcp.2018.07.028

61. Migdalska-Richards A, Daly L, Bezard E, Schapira AHV. Ambroxol effects in glucocerebrosidase and α-synuclein transgenic mice. Ann Neurol. 2016;80(5):766–75.

62. Migdalska-Richards A, Ko WKD, Li Q, Bezard E, Schapira AHV. Oral ambroxol increases brain glucocerebrosidase activity in a nonhuman primate. Synapse. 2017;71(7):17–9.

63. Richter F, Fleming SM, Watson M, Lemesre V, Pellegrino L, Ranes B, et al. A GCase Chaperone Improves Motor Function in a Mouse Model of Synucleinopathy. Neurotherapeutics.

2014;11(4):840–56.

64. Rocha EM, Smith GA, Park E, Cao H, Brown E, Hayes MA, et al. Glucocerebrosidase gene therapy prevents α-synucleinopathy of midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis [Internet]. 2015;82:495–503. Available from: https://doi.org/10.1016/j.nbd.2015.09.009

65. Sardi SP, Clarke J, Viel C, Chan M, Tamsett TJ, Treleaven CM, et al. Augmenting CNS glucocerebrosidase activity as a therapeutic strategy for parkinsonism and other Gaucher-related synucleinopathies. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(9):3537–42.

66. Ted M. Dawson1 HSK and VLD. Dawson et al, 2011-Modèles animaux génétiques. 2011;66(5):646–61.

67. Terzioglu M, Galter D. Parkinson’s disease: Genetic versus toxin-induced rodent models. FEBS J. 2008;275(7):1384–91.

68. Shimizu K, Ohtaki K, Matsubara K, Aoyama K, Uezono T, Saito O, et al. Carrier-mediated processes in blood-brain barrier penetration and neural uptake of paraquat. Brain Res. 2001;906(1–2):135–

70

42.

69. Herrera AJ, Castaño A, Venero JL, Cano J, Machado A. The single intranigral injection of LPS as a new model for studying the selective effects of inflammatory reactions on dopaminergic system. Neurobiol Dis. 2000;7(4):429–47.

70. Betarbet R, Sherer TB, Mackenzie G, Garcia-osuna M, Panov A V, Greenamyre JT. Chronic systemic pesticide exposure produces pd symptoms Betarbet. Nat Neurosci. 2000;26:1301–6.

71. Solís O, Espadas I, Del-Bel EA, Moratalla R. Nitric oxide synthase inhibition decreases l-DOPA-induced dyskinesia and the expression of striatal molecular markers in Pitx3-/- aphakia mice. Neurobiol Dis [Internet]. 2015;73:49–59. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.nbd.2014.09.010

72. García-Montes JR, Solís O, Enríquez-Traba J, Ruiz-DeDiego I, Drucker-Colín R, Moratalla R. Genetic Knockdown of mGluR5 in Striatal D1R-Containing Neurons Attenuates l-DOPA-Induced Dyskinesia

in Aphakia Mice. Mol Neurobiol. 2019;56(6):4037–50.

73. Hwang DY, Ardayfio P, Kang UJ, Semina E V., Kim KS. Selective loss of dopaminergic neurons in the

substantia nigra of Pitx3-deficient aphakia mice. Mol Brain Res. 2003;114(2):123–31.

74. Yunmin Ding1, Jacqueline Restrepo1, Lisa Won1, Dong-Youn Hwang3, Kwang-Soo Kim3 and Un Jung Kang1 2. Chronic 3,4-Dihydroxyphenylalanine Treatment Induces Dyskinesia in Aphakia Mice, a Novel Genetic Model of Parkinson’s Disease. Neurobiol Dis [Internet]. 2007;23(1):1–7. Available

from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3624763/pdf/nihms412728.pdf

75. Lindgren HS, Dunnett SB. Cognitive dysfunction and depression in Parkinson’s disease: What can

be learned from rodent models? Eur J Neurosci. 2012;35(12):1894–907.

76. Hall K, Yang S, Sauchanka O, Spillantini MG, Anichtchik O. Behavioural deficits in transgenic mice expressing human truncated (1-120 amino acid) alpha-synuclein. Exp Neurol [Internet]. 2015;264:8–13. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.expneurol.2014.11.003

77. Janezic S, Threlfell S, Dodson PD, Dowie MJ, Taylor TN, Potgieter D, et al. Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(42).

78. Tofaris GK, Reitböck PG, Humby T, Lambourne SL, O’Connell M, Ghetti B, et al. Pathological changes in dopaminergic nerve cells of the substantia nigra and olfactory bulb in mice transgenic for truncated human α-synuclein(1- 120): Implications for lewy body disorders. J Neurosci. 2006;26(15):3942–50.

79. Specht CG, Schoepfer R. Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice. BMC Neurosci. 2001;2.

80. OMIM GBA1 [Internet]. Available from: https://www.omim.org/entry/606463

81. Dopeso-Reyes IG, Sucunza D, Rico AJ, Pignataro D, Marín-Ramos D, Roda E, et al. Glucocerebrosidase expression patterns in the non-human primate brain. Brain Struct Funct. 2018;223(1):343–55.

82. Do J, McKinney C, Sharma P, Sidransky E. Glucocerebrosidase and its relevance to Parkinson

disease. Mol Neurodegener. 2019;14(1):1–16.

83. García-Sanz P, Orgaz L, Bueno-Gil G, Espadas I, Rodríguez-Traver E, Kulisevsky J, et al. N370S-GBA1 mutation causes lysosomal cholesterol accumulation in Parkinson’s disease. Mov Disord. 2017;32(10):1409–22.

84. Rocha EM, Smith GA, Park E, Cao H, Graham AR, Brown E, et al. Sustained Systemic Glucocerebrosidase Inhibition Induces Brain α-Synuclein Aggregation, Microglia and Complement

71

C1q Activation in Mice. Antioxidants Redox Signal. 2015;23(6):550–64.

85. Rockenstein E, Clarke J, Viel C, Panarello N, Treleaven CM, Kim C, et al. Glucocerebrosidase modulates cognitive and motor activities in murine models of Parkinson’s disease. Hum Mol Genet. 2016;25(13):2645–60.

86. Neudorfer O, Giladi N, Elstein D, Abrahamov A, Turezkite T, Achai E, et al. Occurrence of Parkinson’s syndrome in type I Gaucher disease. QJM - Mon J Assoc Physicians. 1996;89(9):691–

4.

87. Mazzulli JR, Xu YH, Sun Y, Knight AL, McLean PJ, Caldwell GA, et al. Gaucher disease glucocerebrosidase and α-synuclein form a bidirectional pathogenic loop in synucleinopathies. Cell [Internet]. 2011;146(1):37–52. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2011.06.001

88. Ikuno M, Yamakado H, Akiyama H, Parajuli LK, Taguchi K, Hara J, et al. GBA haploinsufficiency accelerates alpha-synuclein pathology with altered lipid metabolism in a prodromal model of

Parkinson’s disease. Hum Mol Genet. 2019;28(11):1894–904.

89. Papadopoulos VE, Nikolopoulou G, Antoniadou I, Karachaliou A, Arianoglou G, Emmanouilidou E, et al. Modulation of β-glucocerebrosidase increases α-synuclein secretion and exosome release in mouse models of Parkinson’s disease. Hum Mol Genet. 2018;27(10):1696–710.

90. Granado N, Ares-Santos S, Oliva I, O’Shea E, Martin ED, Colado MI, et al. Dopamine D2-receptor knockout mice are protected against dopaminergic neurotoxicity induced by methamphetamine or MDMA. Neurobiol Dis [Internet]. 2011;42(3):391–403. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.nbd.2011.01.033

91. Roberts HL, Brown DR. Seeking a mechanism for the toxicity of oligomeric α-synuclein. Biomolecules. 2015;5(2):282–305.

92. Caudle WM, Richardson JR, Wang MZ, Taylor TN, Guillot TS, McCormack AL, et al. Reduced vesicular storage of dopamine causes progressive nigrostriatal neurodegeneration. J Neurosci. 2007;27(30):8138–48.

93. Isingrini E, Guinaudie C, C Perret L, Rainer Q, Moquin L, Gratton A, et al. Genetic elimination of dopamine vesicular stocks in the nigrostriatal pathway replicates Parkinson’s disease motor symptoms without neuronal degeneration in adult mice. Sci Rep. 2017;7(1):1–11.

94. Gegg ME, Burke D, Heales SJR, Cooper JM, Hardy J, Wood NW, et al. Glucocerebrosidase deficiency in substantia nigra of parkinson disease brains. Ann Neurol. 2012;72(3):455–63.

95. Murphy KE, Gysbers AM, Abbott SK, Tayebi N, Kim WS, Sidransky E, et al. Reduced glucocerebrosidase is associated with increased α-synuclein in sporadic Parkinson’s disease. Brain. 2014;137(3):834–48.

96. William B. Lynch, BA1, Christopher W. Tschumi, BA1, 2, Amanda L. Sharpe, PhD1, 3 SY, Branch, MS2, Cang Chen, MD, PhD4, Guo Ge, MD4, Senlin Li, MD, PhD4 and MJ, Beckstead, PhD1 2. Progressively Disrupted Somatodendritic Morphology in Dopamine Neurons in a Mouse Parkinson’s Model. Mov Disord. 2018;176(5):139–48.

97. Rudow G. Morphometry of the human substantia nigra in ageing and Parkinson’s disease. Acta Neuropathol. 2008;115(4):461–70.

98. Chung HK, Ho H-A, Pérez-Acuña D, Lee S-J. Modeling α-Synuclein Propagation with Preformed Fibril Injections. J Mov Disord. 2020;13(1):77–9.

99. Okamura N, Villemagne VL, Drago J, Pejoska S, Dhamija RK, Mulligan RS, et al. In vivo measurement of vesicular monoamine transporter type 2 density in Parkinson disease with 18F-AV-133. J Nucl

Med. 2010;51(2):223–8.

72

100. Chesselet MF, Richter F. Modelling of Parkinson’s disease in mice. Lancet Neurol [Internet].

2011;10(12):1108–18. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S1474-4422(11)70227-7

101. Putamen C, Hornvkiewicz O. Biochemical aspects of Parkinson ’ s disease. 1998;7–10.

102. Surguchev AA, Surguchov A. Synucleins and gene expression: Ramblers in a crowd or cops

regulating traffic? Front Mol Neurosci. 2017;10(July):1–11.

103. Rocha EM, Smith GA, Park E, Cao H, Brown E, Hallett P, et al. Progressive decline of

glucocerebrosidase in aging and Parkinson’s disease. Ann Clin Transl Neurol. 2015;2(4):433–8.

104. Penelope J. Halletta, 1, Mylene Huebeckerb, 1, Oeystein R. Brekka EBM, Emily M. Rochaa, David A. Priestmanb, Frances M. Plattb, 1, and Ole Isacsona,* 1. Glycosphingolipid levels and glucocerebrosidase activity are altered in normal aging of the mouse brain. Neurobiol Aging. 2018;176(1):189–200.

105. Chiasserini D, Paciotti S, Eusebi P, Persichetti E, Tasegian A, Kurzawa-Akanbi M, et al. Selective loss of glucocerebrosidase activity in sporadic Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies. Mol Neurodegener. 2015;10(1):4–9.

106. Mazzulli JR, Zunke F, Isacson O, Studer L, Krainc D. α-Synuclein-induced lysosomal dysfunction occurs through disruptions in protein trafficking in human midbrain synucleinopathy models. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(7):1931–6.

107. Henderson MX, Sedor S, McGeary I, Cornblath EJ, Peng C, Riddle DM, et al. Glucocerebrosidase Activity Modulates Neuronal Susceptibility to Pathological α-Synuclein Insult. Neuron [Internet]. 2020;105(5):822-836.e7. Available from: https://doi.org/10.1016/j.neuron.2019.12.004

108. Thai Leong Yapa, Arash Velayatib, Ellen Sidranskyb,* and JCL. Membrane-bound α-synuclein interacts with glucocerebrosidase and inhibits enzyme activity. Mol Genet Metab. 2013;18(9):1199–216.

109. Cooper AA, Gitler AD, Cashikar A, Haynes CM, Hill KJ, Bhullar B, et al. α-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science (80- ). 2006;313(5785):324–8.

110. Tayebi N, Parisiadou L, Berhe B, Gonzalez AN, Serra- J, Tamargo RJ, et al. Glucocerebrosidase haploinsufficiency in A53T α-synuclein mice impacts disease onset and course. 2018;122(4):198–208.

111. Marie-Francoise Chesselet, MD P. In vivo alpha-synuclein overexpression in rodents: a useful model of Parkinson’s disease? Exp Neurol [Internet]. 2008;23(1):1–7. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3624763/pdf/nihms412728.pdf