Activation et mode d’activation des lymphocytes T γ9δ2 · P.falciparum Protozoaires EBV Virus...

1

Activationet mode d’activation

des lymphocytes T γ9δ2 humains

2

Les deux types de lymphocytes T

γ δTCRα β

Lymphocyte Tαβ Lymphocyte Tγδ

Le répertoire T γδ humain potentiel

ChaînesNombre de segments géniquesfonctionnels α β γ δ

VDJC

472132

6-52

8341

46-

501

Les lymphocytes T γδ

3

Le répertoire T γδ majoritairement exprimé en périphérie

VγΙ Vδ1

Lymphocyte TγΙδ1

Vγ2Vγ3 Vγ4 Vγ5 Vγ8

Vγ9 Vδ2

Lymphocyte Tγ9δ2

Les lymphocytes T γδ

4Les lymphocytes T du sang circulant chez l’homme

1 à 5% T γδ

99 à 95% T αβ

20 % T Vδ1+

80 % T Vδ2+

Les lymphocytes T γ9δ2

CD4-

CD8-

CD28-

5

Tγ9δ2

M.tuberculosis E. Coli

Bactéries

P.falciparum

Protozoaires

EBV

Virus

Lymphomes B

Cellules tumorales

Les lymphocytes T γ9δ2

La réactivité γ9δ2

6

Lymphocyte Tγ9δ2

γ9 δ2

Les antigènes reconnus

Alkyle O

O-

O

O

P O

O-

O

P R

M.tuberculosis

TUBag1

TUBag2

TUBag3

TUBag4

Les PhosphoantigènesLa réactivité γ9δ2

La réactivité γ9δ2 Les Phosphoantigènes 7

γ9 δ2


Glycérol-3-P

Isopentényl-PP

Farnésyl-PP

TUBag1

mM

Lymphocyte Tγ9δ2µM

nM

EC50

La réactivité γ9δ2 Les Alkylamines 8

γ9 δ2Alkyle NH2

Sec-butylamine

éthylamine

isopropylamine

Lymphocyte Tγ9δ2

EC50: 1 mM


9

γ9 δ2


Les aminobiphosphonates

ibandronate

pamidronate

Lymphocyte Tγ9δ2

La réactivité γ9δ2

EC50: 100 µM

H C

O-

O

O

P O

O-

O

P H

R

NH2

OH

10

Fonctions cellulaires des Tγ9δ2 activés

Lymphocyte Tγ9δ2

Fonctions des T γ9δ2

+ Ag

Cytokines Th1TNF-αIFN-γ

ChimiokinesMIP-1αMIP-1βRANTES

CytotoxicitéPerforine/granzymegranulysine

+ IL2

Différenciation

Mémoires indifférenciés

Mémoires effecteurs

11

Intégration des Tγ9δ2 dans la réponse immunitaire antimicrobienne

IFNγTNFα

IFNγ

NOROSCMHII

IL12

IL2IL15

LTh0

LTh1

IFNγMacrophage activé

MIP-1α

Macrophage

IL12TNF

LTγδ

Infection microbienneproduits microbiens

Cytotoxicité

Fonctions des T γ9δ2

Etude du mode d’activation des Tγ9δ2 par les PAg 12

Lymphocyte Tγ9δ2

+ PAg

+ IL2

Cytokines Th1TNF-αIFN-γ

ChimiokinesMIP-1αMIP-1βRANTES

CytotoxicitéPerforine/granzymegranulysine

différenciationMémoires indifférenciés

Mémoires effecteurs

?

Caractérisation de phosphoantigènesde forte bioactivité

Mode de reconnaissance des phosphoantigènes

Interactions cellulaires lors de la réponseaux phosphoantigènes

13

Les Phosphoantigènes naturels

M.tuberculosisTUBag1 : 3-formyl-1-butyl-PP

In Journal In Journal ofof BiologicalBiological ChemistryChemistry 199199

O

OOH

O-

O

PO

O-

O

PCH3

Forme réduite non bioactive

OH

OOH

O-

O

PO

O-

O

PCH3

Lymphocyte Tγ9δ2

microphysiométrie

90

95

100

105

110

115

120

125

130

135

140

-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

temps (min)

Vite

sse

d'ac

idifi

catio

n %

100 nM

100 nM réduit

Caractérisation de phosphoantigènes de forte bioactivité

Les Phosphoantigènes naturels 14

γ9 δ2O

OOH

O-

O

PO

O-

O

PCH3

TUBag1 : 3 formyl-1 butyl-PP

E.coli

OH

OOH

O-

O

PO

O-

O

PCH3

HMB-PP

Lymphocyte Tγ9δ2

TUBag2 : 3 formyl-1 pentyl-PP?

In Journal In Journal ofof BiologicalBiological ChemistryChemistry, 2002, 2002


15

Isopentényl-PP

Farnésyl-PP

Mévalonate

3 Acétyl-coA

Voie dumévalonate

Cholestérol, isoprénylations…

Diméthylallyl-PP

Cellules animaleslevures


Biosynthèse des isoprénoïdes

PhosphoantigènesDe forte bioactivité

Voie deRohmer

Pyruvate + glycéraldéhyde 3 P

1-deoxy-D-xylulose 5P

3fb-PP

HMB-PP

?

Bactériesparasites

Lymphocyte Tγ9δ2 16

Les Phosphoantigènes de synthèseγ9 δ2

EC50

phosphohalohydrines

In Journal In Journal ofof biologicalbiological chemistrychemistry 20012001


Les Phosphoantigènes de synthèse 17

In Journal In Journal ofof biologicalbiological chemistrychemistry 20012001

Bromohydrine : BrHPP


0 20 40 60% T γ9δ2 parmi les lymphocytes T totaux

1:12500

1:2500

1:100

milieu

Dilution d’extraitsmycobactériens

50

25

12,5BrHPP (nM)

milieu

Amplification

EC50

Microphysiométrie

80

90

100

110

120

130

140

-10 0 10 20 30 40 50 60

temps (min)

taux

d'a

cidi

ficat

ion

%

100 nM50 nM25 nM5 nMmedium

BrHPP perfusion

18

milieuBrHPP

Cellules perfusées avec du milieu

Début d’acidificationPerfusion avec du BrHPP 50 nM


Etude cinétique en microphysiométrie

milieu

10s

Le Mode de reconnaissance des PAg

γ9 δ2

Le ParadoxeTCR canonique Vγ9-JγP-Cγ1/Vδ2-Jδ1-CδVariabilité jonctionnelleMais motifs récurrents

Bactéries

Cellules tumoralesProtozoaires

Virus

Très nombreux et divers Ag reconnus

O

OOH

O-

O

PO

O-

O

PCH3

OH

OOH

O-

O

PO

O-

O

PCH3

Forme réduite non bioactive

Forte discrimination

Contact cellulairenécessaireTCR γ9δ2 impliqué Pas de présentation par le CMH

19

20

Phosphoantigenes de synthèse :

3CH

OO

OHOH

-R

OPOPO

R:

CH2 I

C

HO

CH2 Br

C

HO

CH2 Cl

C

HO

O

C

CH2

C

O

CH2 OH

C

HO

OH

C

Réactivité chimique. .

faible

An

E-1,E-2,Sn-2

Sn-2 ++

Sn-2 +

Sn-2 ++

Sn-2 +++

>106

50 000

5 000

20

100

10

1

EC50 , (nM) :

Les Mode de reconnaissance des Ag In FASEB, 2000In FASEB, 2000

OO

OHOH

-

3CH

ROPOPO

nt

nt

nt

>106

>106

>106

>106

EC50 , (nM) :

Chaîne raccourcie d’un carbone

nt : non testé

21Dégradation des Phosphoantigènes par les LT γ9δ2

Avec LT γ9δ2

10 15 20 25

HPAEC Rt (minutes)

50

10

20

30

µS

étalon X-PP

Pi

Sans cellules

Sans cellules 2 .106 T γδ

Analyse du surnageantPar HPAEC

Phosphoantigène : X-PP13 nmoles

1h 37°C

X-PP XP + Pi

XP

Mode de reconnaissance des Ag In FASEB, 2000In FASEB, 2000

Corrélation entre bioactivité et hydrolysabilité 22

3CH

OO

OHOH

-R

OPOPO

P-NH-P

P-O-P

P-CH2-PP-CF2-P

P-CHF-P

40 50 60

10 0

0 10 20 30 70 80 90 100

EC50 (M)

IC50 (M)

Hydrolyse du pyrophosphate(%)

10-9

10-6

10-3

10-6

10-9

10-3

bioa

ctiv

ité

In FASEB 2000In FASEB 2000Mode de reconnaissance des Ag

23

Sn2 « force »du signal

activation

hydrolyse du P

Spécificité pour le ligand

Ajustement topologique

Les étapes de la reconnaissance d’un phosphoantigène

Mode de reconnaissance des Ag In FASEB, 200In FASEB, 200

La phosphatase alcaline humaine tissu-non-spécifique 24

GPI anchor

active site

BrHPP

N

C

H1

H2

Mode de reconnaissance des Ag

D’après Wilson et D’après Wilson et alal

25

26

Lymphocyte Tγ9δ2

NKG2D

MICA

CD94/NKG2A

HLA-E

Cellule « cible »

Interactions cellulaires et PAg

27

positif

négatif

D’après D’après AllisonAllison et et alal

conservé

Conservéindispensable

28

Cellule saine

NKG2D CD94/NKG2A

HLA-E

Lymphocyte Tγ9δ2

TCR/CD3

-+

MICA

Cellule infectéestress

virus

Bactéries intracellulaires

Métabolites microbiensPhosphoantigènesAlkylamines

Métabolites de l’hôte


-+Lyse

29

TCR-CD3ζ

Time lapse (3 min)37°C

CD4

CPA (LB)+agoniste

D’après D’après ZalZal et et alalInteractions cellulaires et PAg

La synapse immunologique entre CPA et Tαβ

30

D’après Dustin et D’après Dustin et alal

La synapse immunologique entre CPA et Tαβ

31

Nature de la synapse des lymphocytesT γ9δ2

TCR Vγ 9CD45

THP

γδ γδ

THP

+BrHPP 100 nM

D

γδγδ

D

γδ

In Journal In Journal ofof ImmunologyImmunology, 200, 200Interactions cellulaires et PAg

32

Nature de la synapse des lymphocytesT γ9δ2

CD2 P -TYR69% 59%

Milieu

58% 43%

68% 83%

P -TYRCD2

THP

γδ

γδ

THP +BrHPP 100 nM

SoumisSoumisInteractions cellulaires et PAg

33

La synapse immunologique entre THP et Tγ9δ2

Caractéristiques de la synapse d’un lymphocyte T γ9δ2 avecTHP-1 plus phosphoantigène

Pas de polarisation caractéristique du TCR

Polarisation de CD2 et LFA-1

Exclusion de CD45

Cette synapse a lieu aussi sans phosphoantigèneMais de manière moins fréquente


34

Implication des récepteurs de l’immunité innée

P -TYRNKG2D

NKG2D P -TYR69% 59%

+BrHPP 100 nM

76% 75%

THP γδ Milieu

69% 59%

76% 75%

THP γδ

Soumis JISoumis JIInteractions cellulaires et PAg

35

Implication des récepteurs de l’immunité innée

55% 73%

28% 46%

P -TYR P -TYRCD94

+BrHPP 100 nM

CD94

THP

γδ

γδ

THP

Milieu


36

La libération de Cytokines nécessite la présenceDe phosphoantigènes

Milieu +BrHPP 100 nM

γδ

THP

THP

γδIFNγ

γδ

THP

THPγδ

THP TNFα


Le transfert synaptique37

PKH67

CMTMRTHP

γδ

Le système de marquage


Le transfert synaptique 38

Transfert de fragments de membrane de THP-1à la surface de lymphocytes T γ9δ2

dans différentes conditions de culture

cellules+BrHPP+PP2 cellules+BrHPP+CytDcellules seules cellules+BrHPP

Journal Journal ofof immunologyimmunology 20022002Interactions cellulaires et PAg


Transfert de fragments de membrane de Daudià la surface de lymphocytes T γ9δ2


cellules+BrHPP+CytDcellules seules cellules+BrHPP cellules+BrHPP+PP2



Transfert de molécules membranaires (IgM) de Daudià la surface de lymphocytes T γ9δ2


IgM IgM IgM

D

γδ

γδ

γδ

D

γδD

CytDmilieu PP2


41

Le transfert synaptique

CTL

cible ciblecible

Interactions cellulaires et PAg D’après D’après StinchcombeStinchcombe et et alal

42

ConclusionLes lymphocytes T γ9δ2 reconnaissent des Ag solubles,Les phosphoantigènes, de manière particulière.Les phosphoantigènes naturels sont extrêmement bioactifset leurs analogues de synthèse sont de bons candidats pour l’immuno-intervention

Une synapse immunologique proche des autres lymphocytess’établit face à une cible potentielle, elle implique le TCR mais aussi les NKR.

Un transfert synaptique de fragments de membrane et de protéines membranaires a lieu activement lors de l’interaction avec une cible en présence de phosphoantigènes

43

Perspectiveslors d’infections

?

Nature dela synapse

Caractéristiques du transfert synaptique

Perspectives 44

Rôle physiologique du transfert synaptique dans la réponse immunitaire

Caractéristiques de la synapse lors de l’interactionavec des cibles résistantes à la lyse

45

CPTP, Toulouse

Jean-Jacques FourniéRémy Poupot

Julie TabiascoAlain Vercellone

Benoît FavierMartine Guiraud Denis Hudrisier

Etienne Joly Salvatore Valitutti

INSERM U463, Nantes

Marc BonnevilleFranck Halary

Marie-Alix Peyrat

IFR 30 & 31, Toulouse

Georges CassarJean-Pierre Estève

Fatima L’FaqihiSabina MuellerFrédéric Pont

Innate Pharma, Marseille

Christian Belmant

NIAID, Rockville, USA Tim Allison

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