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1 Resumen En la aorta de rata, la presencia de receptores adrenérgicos α 2 (AR-α 2 ) funcionales fue investigada en preparaciones anulares precontraídas con agonistas adrenérgicos α 1 y con agonistas no adrenérgicos. Particularmente, fue evaluada la interacción hipotética de los agonistas de AR-α 2 con la vasoconstricción ocasionada por la activación de receptores adrenérgicos α 1 (AR-α 1 ). Se obtuvieron respuestas relajantes y contráctiles con los agonistas de AR-α 2 . En anillos aórticos con y sin endotelio contraídos con fenilefrina (1 × 10 -6 M), los derivados de la imidazolína, clonidina y UK 14304, indujeron relajaciones con similar orden de potencias (-log EC 50 ) y efectos relajantes máximos, respectivamente. El tratamiento con el inhibidor de la sintasa de óxido nítrico, éster metilo de la N G -nitro-L-arginina (L-NAME), no tuvo efecto sobre la respuestas relajantes de la clonidina y el UK 14304. En los anillos con endotelio contraídos con fenilefrina, las relajaciones de la clonidina y el UK14304 no fueron antagonizadas por el antagonista selectivo de AR-α 2 , rauwolscina (1 × 10 -6 M). La clonidina y el UK 14304 produjeron solamente contracciones en los anillos aórticos con endotelio intacto y endotelio denudado contraídos con prostaglandina F 2α (3 × 10 -7 M). Adicionalmente, la clonidina y el UK 14304 provocaron relajación de las arterias denudadas de endotelio precontraídas con metoxamina, pero no así con serotonina.

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Resumen

En la aorta de rata, la presencia de receptores adrenérgicos α2 (AR-α2)

funcionales fue investigada en preparaciones anulares precontraídas con

agonistas adrenérgicos α1 y con agonistas no adrenérgicos. Particularmente,

fue evaluada la interacción hipotética de los agonistas de AR-α2 con la

vasoconstricción ocasionada por la activación de receptores adrenérgicos α1

(AR-α1). Se obtuvieron respuestas relajantes y contráctiles con los agonistas

de AR-α2. En anillos aórticos con y sin endotelio contraídos con fenilefrina (1

× 10-6 M), los derivados de la imidazolína, clonidina y UK 14304, indujeron

relajaciones con similar orden de potencias (-log EC50) y efectos relajantes

máximos, respectivamente. El tratamiento con el inhibidor de la sintasa de

óxido nítrico, éster metilo de la NG-nitro-L-arginina (L-NAME), no tuvo efecto

sobre la respuestas relajantes de la clonidina y el UK 14304. En los anillos

con endotelio contraídos con fenilefrina, las relajaciones de la clonidina y el

UK14304 no fueron antagonizadas por el antagonista selectivo de AR-α2,

rauwolscina (≤ 1 × 10-6 M). La clonidina y el UK 14304 produjeron solamente

contracciones en los anillos aórticos con endotelio intacto y endotelio

denudado contraídos con prostaglandina F2α (3 × 10-7 M). Adicionalmente, la

clonidina y el UK 14304 provocaron relajación de las arterias denudadas de

endotelio precontraídas con metoxamina, pero no así con serotonina.

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Finalmente, las curvas concentración-contracción para la clonidina y el

UK14304 en anillos aórticos sin endotelio, fueron significativamente

desplazadas hacia la derecha por el antagonista selectivo de los AR-α1D,

BMY 7378, y por la rauwolscina. Los valores de pA2 y pKB para el BMY 7378

y la rauwolscina, respectivamente, en contra de las acciones independientes

del endotelio de la clonidina y el UK 14304 fueron característicos de una

interación con los AR-α1D. El otro agonista selectivo de los AR-α2 estudiado,

el BHT 933 (un derivado de la azepina), careció de efectos relajantes o

contráctiles significativos en la aorta de la rata. En conclusión, los resultados

no proporcionan evidencia de la presencia de AR-α2 funcionales en la aorta

de la rata. Respectivamente, los efectos relajantes y contráctiles de los

derivados de la imidazolina, clonidina y UK 14304, son debidos a una

interacción ajustable (en relación con el estado activo de los AR-α1

dependiente del agonista), inhibitoria y excitatoria, con los AR-α1.

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Introducción:

Los receptores adrenérgicos o adrenoceptores α2 (AR-α2), miembros de la

gran familia de receptores acoplados a proteínas G, tienen un papel

importante en la regulación de la actividad del sistema nervioso simpático

(SNS) [1]. La activación de los AR-α2 en la región medular del tallo cerebral

inhibe la actividad del SNS [2], y la activación de los AR-α2 presinápticos,

inhibe la liberación de noradrenalina de las terminaciones nerviosas

periféricas simpáticas [3, 4]; en consecuencia, los agonistas de AR-α2 son

actualmente utilizados como antihipertensivos. Por otra parte, los AR-α2 se

encuentran ampliamente distribuídos en el propio tejido vascular. Los AR-α2

endoteliales participan en las respuestas vasorelajantes de la adrenalina y la

noradrenalina [5, 6], y aquellos localizados en el músculo liso vascular han

sido caracterizados como receptores vasocontrictores activados

fisiológicamente por catecolaminas [1, 2]. De esta forma, los AR-α2

endoteliales vasorelajantes pueden representar un mecanismo de control

local involucrado en la modulación opositora de las respuestas

vasoconstrictoras de las aminas simpaticomiméticas. No obstante, hay

también evidencia de que la vasodilatación mediada por los AR-α2 puede ser

independiente del endotelio [7, 8].

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En la aorta de la rata, ha sido ampliamente mostrado que las respuestas

contráctiles a los agonistas de AR-α2 son deprimidas en la presencia del

endotelio, e inversamente, aumentadas por la inhibición farmacológica de la

síntesis de óxido nítrico (ON) [9-18]. En conjunto, estos datos sugieren que el

ON desempeña un papel en la depresión dependiente del endotelio de las

respuestas vasculares constrictoras de los agonistas de AR-α2. Así, se ha

propuesto que tanto la liberación basal como la inducida de ON, inhibe las

respuestas aórticas provocadas por agonistas contráctiles; particularmente,

algunos autores [10-12] han considerado una posible contribución directa de

los AR-α2 para estimular la producción de ON. De hecho, los agonistas

selectivos de AR-α2 relajan tejidos aórticos precontraídos, y una explicación

aceptada para este efecto es que la activación de los AR-α2 puede inducir

vasodilatación [14-18]. Específicamente, se ha postulado una relajación

dependiente de ON mediada por AR-α2 endoteliales [5, 6]. Sin embargo,

varios reportes [7, 8] han producido evidencia que genera duda sobre la

presencia funcional de AR-α2 vasorelajantes endoteliales en la aorta (y otras

arterias) de la rata. Algunos de los efectos relajantes de los agonistas de AR-

α2 pueden no ser mediados por los AR-α2. En el músculo liso de la rata, los

agonistas de los AR-α2 pueden interferir directamente con la vasoconstricción

inducida por activación de los AR-α1 [7, 8]; de otra forma, ha sido reportado

que éllos pueden producir relajación por medio de la activación de AR-α2 del

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sarcolema, acoplados a canales de K+ sensibles a ATP [19]. Además, la

expresión molecular de AR-α2 en el endotelio vascular es incierta, aún

cuando la presencia de AR-α2 fue demostrada en el músculo liso vascular de

la rata [20, 21].

Los presentes experimentos fueron diseñados para reevaluar la naturaleza

de la relajación mediada por agonistas selectivos de AR-α2 en la aórta de

rata con endotelio intacto y denudado. Dos derivados de la imidazolina, la

clonidina y el UK 14304, y un derivado de la azepina, el BHT 933, fueron

estudiados. En particular, se hizo énfasis en elucidar si los efectos relajantes

de los agonistas de AR-α2 pueden explicarse por su interacción con AR-α1

previamente activados. La participación del ON derivado del endotelio en las

acciones relajantes de los agonistas de AR-α2 fue también reconsiderada.

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Métodos.

Las ratas machos Wistar (250-300 g de peso corporal; 10-12 semanas de

edad) fueron alojadas bajo condiciones control (22±2 °C, 60% de humedad y

luz artificial de 06:00 a 18:00 h). Alimentación normal y agua fueron

administradas ad libitum. El protocolo experimental fue aprobado por el

Comité de Cuidado de Animales de nuestra institución.

Preparación de los tejidos y medidas de la tensión.

Las ratas fueron anestesiadas con éter etílico, decapitadas y desangradas.

Las aortas torácicas fueron extirpadas y limpiadas cuidadosamente para

evitar el daño del endotelio; después, los vasos se seccionaron en

segmentos anulares de aproximadamente 4 mm de longitud. En otras

preparaciones, el endotelio fue lesionado mediante la abrasión de la

superficie íntima de los anillos aórticos con la parte roma de unas pinzas. Los

anillos aórticos fueron colocados en cámaras de tejidos (10 ml) llenas con

solución salina fisiológica Krebs compuesta de (mM): NaCl 118, KCl 4.7,

KH2PO4 1.2, MgSO4 1.2, CaCl2 2.5, NaHCO3 25, dextrosa 11.7 y EDTA

0.026. La solución Krebs fue mantenida a 37ºC y burbujeada continuamente

con 95% O2 y 5% CO2 (el pH de la solución fue aproximadamente 7.4). Cada

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segmento tisular fue colocado con una tensión inicial de 2g por 60 min. Las

contracciones se midieron isométricamente (transductor MP 100) y los datos

fueron registrados en una computadora con el programa AcqKnowledge

(MP100WSW, Biopac Systems, Inc.; California, USA). Los tejidos fueron

estabilizados (período de estabilización) mediante la adición de fenilefrina 1 x

10-6 M al baño tisular; después de que se obtuvo el estado estable de la

contracción, el contenido del baño fue reemplazado con solución Krebs

varias veces. Al alcanzar los tejidos la tensión basal previa, el proceso se

repitió en dos ocasiones, antes de la ejecución de los protocolos

experimentales. Este proceso de estabilización reduce la variabilidad del

tejido en respuesta a la administración repetida del agonista.

La integridad del endotelio fue probada con acetilcolina.

Después de un periodo de lavado, cada anillo aórtico fue contraído con

fenilefrina (1 x 10-6 M) y, una vez que la meseta fue alcanzada, se añadió

acetilcolina (1 x 10-6 M) para confirmar la viabilidad del endotelio vascular.

Las preparaciones con un endotelio intacto produjeron una relajación mayor

que el 70 %, mientras que la denudación endotelial fue confirmada por la

carencia de relajación producida por la acetilcolina.

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Protocolos experimentales

Curvas concentración-respuesta relajante en tejidos contraídos con

agonistas adrenérgicos α1 y no adrenérgicos.

Después del período de estabilización, los anillos aórticos con endotelio

intacto y denudado fueron contraídos con concentraciones submáximas de

fenilefrina (1 x 10-6M) o PGF2α (3 x 10-7 M), y se permitió la obtención de la

meseta de las contracciones por un período de 10 min. Entonces, se

realizaron experimentos concentración-respuesta para varios agonistas

adrenergicos α2 y reconocidos agonistas relajantes dependientes de

endotelio. En anillos aórticos con endotelio intacto, las respuestas relajantes

de la clonidina, el UK-14304, el BHT 933, la acetilcolina (agonista

muscarínico), y el A23187 (ionóforo de calcio) fueron evaluadas

independientemente, mediante la adición acumulativa de concentraciones

crecientes de cada agonista al baño tisular y registrando la relajación

generada. Semejantemente, en anillos aórticos sin endotelio, las respuestas

relajantes a la clonidina, el UK-14304, y el BHT 933 fueron estudiadas.

En otras series de experimentos, los tejidos aórticos con endotelio fueron

inicialmente tratados con rauwolscina (antagonista de AR-α2), L-NAME

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(inhibidor de la sintasa de ON) o vehículo (control) por 15 min. Después, los

anillos fueron contraídos con fenilefrina (1 x 10-6 M), y la contracción se

estabilizó durante 10 min. Las respuestas a la clonidina, el UK-14304, y el

BHT 933 fueron evaluadas entonces de forma independiente, mediante la

adición de concentraciones crecientes de cada agonista a los baños tisulares

y registrando la relajación generada.

En otros dos grupos de experimentos, los anillos aórticos sin endotelio fueron

contraídos con metoxamina o serotonina, se permitió la estabilización de las

contracciones durante 10 minutes y, subsecuentemente, la clonidina y el UK

14304 fueron aplicados acumulativamente para obtener curvas

concentración respuesta. Los efectos de la clonidina y el UK 14304 fueron

evaluados a diferentes niveles de tono activo provocados por tres

concetraciones diferentes de metoxamina (1 x 10-7, 1 x 10-6, y 1 x 10-5 M) o

serotonina (1 x 10-7, 1 x 10-6, and 1 x 10-5 M).

Curvas acumulativas concentración respuesta a los agonistas

adrenérgicos α2.

En anillos aórticos denudados de endotelio, se construyeron curvas

concentración-respuesta reproducibles mediante la exposición del tejido a

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concentraciones crecientes de los agonistas de AR-α2, clonidina, UK 14304,

y BHT 933, hasta que se observó una respuesta máxima. Para la conidina y

el UK 14304, en cada caso, cuatro curvas concentración-respuesta fueron

obtenidas (aproximadamente 60 minutos aparte entre éllas) en presencia y

ausencia (control) de antagonistas selectivos. (El BHT 933 no produjo

contracciones significativas). El tiempo de incubación de la rauwolscina, el

BMY 7378 (antagonista de AR-α1D), or vehículo fue 15 min. Cada anillo sirvió

como su propio control. Una preparación que no recibió tratamiento fue

estudiada en paralelo con los tejidos experimentales, y fue utilizada para

determinar cualquier cambio de sensibilidad a los agonistas dependiente del

tiempo.

Presentación y Análisis de Datos.

Los resultados se presentan como la media ± SEM (error estándar de la

media) del número de anillos aórticos obtenidos con 4 a 8 animales

diferentes. Las contracciones se presentan como gramos (g) de fuerza

desarrollada; las relajaciones como reducciones del incremento máximo en

tensión (precontracción en gramos) obtenida con la adición del agonista. El

logaritmo negativo de las concentración molar de un agonista requerida para

producir 50 % de la respuesta máxima (-log EC50) fue calculado (mediante

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análisis de regresión no lineal) para cada curva concentración-respuesta

individual con un programa de computación (Graph Pad Softwere; San

Diego, California, USA). La razón de las concentraciones del agonista (CR)

en presencia y ausencia del antagonista, fue determinada al nivel del 50% de

la respuesta máxima (EC50), y los estimados de pA2 se obtuvieron de la

ecuación: pA2 = log (agonista CR-1) - log [antagonista] [22]. Cuando la CR

fue obtenida con una sóla concentración del antagonista [B], la constante de

disociación aparente para el antagonista fue determinada del logaritmo

negativo de la constante de disociación del antagonista (pKB), con la

ecuación pKB= log [CR-1] – log [B].

El análisis estadístico fue hecho por medio del análsis de variancia (ANOVA)

seguido de la prueba (post hoc) de Bonferroni. En todas las comparaciones

un valor de P igual o menor que 0.05 fue considerado estadísticamente

significante.

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Resultados

Los efectos relajantes de los agonistas adrenérgicos α2 en tejidos

aórticos precontraídos con el agonista de AR-α1, fenilefrina.

Los agonistas de los AR-α2, Clonidina y UK 14304, produjeron relajaciones

dependientes de la concentración en los anillos aórticos con endotelio intacto

y denudado contraídos con fenilefrina (Figura 1). Las curvas concentración

respuesta del UK 14304 y la clonidina en preparaciones denudadas de

endotelio fueron equivalentes, correspondientemente, a aquellas obtenidas

con preparaciones con endotelio intacto (Figura 1). Adicionalmente, en

anillos aórticos con endotelio contraídos con fenilefrina, las relajaciones

inducidas por la clonidina y el UK 14304 no fueron afectadas

significativamente por los tratamientos con L-NAME (1×10-6 - 1×10-4 M)

(Figura 2). De otra forma, el BHT 933 fue incapáz de producir relajación

significativa en los anillos aórticos precontraídos con fenilefrina (Figuras 1 y

2).

[Insertar Figuras 1 y 2]

En experimentos comparativos, la acetilcolina y el A23187 produjeron

relajaciones dependientes de la concentración en anillos aórticos con

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endotelio contraídos con fenilefrina (Tabla 1). La aplicación de L-NAME

(1×10-7, 1×10-6, y 1×10-4 M) redujo de forma significativa el porcentaje de

relajación máxima producida por la acetilcolina (Tabla 1); sin embargo, no

hubo diferencia significativa entre los tratamientos con 1×10-6 y 1×10-4 M

(Tabla 1). Semejantemente, el L-NAME redujo significativamente la

respuesta relajante ocasionada por el ionóforo de calcio, A23187; el efecto

de 1× 10-6 M L-NAME fue mayor que aquel de 1×10-7 M L-NAME, pero fue

similar al obtenido con la concetración mayor de L-NAME probada en este

estudio (1×10-4 M) (Tabla 1). La remoción del endotelio abolió completamente

la respuesta relajante producida ya sea por acetilcolina o por el A23187

(datos no mostrados). Las relajaciones obtenidas por la acetilcolina y el

ionóforo de calcio no fueron afectadas por el inhibidor de la ciclooxigenasa,

indometacina (1×10-5 M) (datos no mostrados).

[Insertar Tabla 1]

El antagonista de AR-α2, rauwolscina (1×10-8 y 1×10-7 M), causó

desviaciones hacia la izquierda de las curvas concentración respuesta de la

clonidina y el UK 14304 en tejidos aórticos con endotelio intacto contraídos

con fenilefrina (Figura 3); empero, una concentración mayor de rauwolscina

(1×10-6M) provocó la inhibición significante de las respuestas contráctiles de

la fenilefrina (precontracción) (Figura 3).

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[Insertar Figura 3]

Los efectos de los agonistas adrenérgicos α2 en tejidos aórticos

precontraídos con el agonista no-adrenérgico, PGF2α

En anillos aórticos con endotelio intacto y denudado contraídos con PGF2α, la

clonidina y el UK 14304 causaron contracciones adicionales (Figura 4a y 4b,

respectivamente). En las mismas condiciones experimentales, el BHT 933 no

produjo respuesta (Figura 4c). De otra forma, la acetilcolina produjo una

relajación dependiente de la concentración en los anillos aórticos con

endotelio contraídos con PGF2α (Figura 4d).

[Insertar Figura 4]

Los efectos de los agonistas adrenérgicos α2 en tejidos aórticos

precontraídos con otros agonistas adrenérgicos y no adrenérgicos.

Los efectos de la clonidina y el UK 14304 fueron investigados adicionalmente

en tejidos aórticos sin endotelio contraídos con el agonista selectivo

adrenérgico α1, metoxamina, o con el agonista de receptores 5-HT,

serotonina. Los efectos de ambos agonistas de los AR-α2, fueron probados a

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diferentes niveles de tono activo producidos por concentraciones crecientes

de metoxamina o serotonina (Figure 5). En anillos aórticos sin endotelio

contraídos con serotonina, la clonidina (Figura 5a) y el UK 14304 (Figura 5c)

causaron sólamente contracciones adicionales o no tuvieron efectos. De otra

manera, en anillos aórticos denudados de endotelio contraídos con

metoxamina, la clonidina (Figura 5b) y el UK 14304 (Figura 5d) produjeron

contracciones cuando el tono precontráctil fue bajo (metoxamina, 1 × 10-7 M),

y efectos relajantes cuando fue alto (metoxamina, 10-6 y 10-5 M). Así en

tejidos precontraídos con metoxamina, ambos agonistas tienen una conducta

aparente dualistica. Sin embargo, los efectos contráctiles máximos de la

clonidina y el UK 14304 fueron 0.82 ± 0.07 y 0.62 ± 0.06 g, respectivamente;

mientras que las respuestas relajantes máximas para la clonidina y el UK

14304 (en tejidos contraídos con 1 × 10-5 M de metoxamina) fueron 0.27 ±

0.08 y 0.18 ± 0.06 g, respectivamente (Figures 5b y 5d). Obviamente, la

magnitud de los efectos máximos (contráctil y relajante) para cada agonista,

es diferente. Esta discrepancia no concuerda con la conducta de los

agonistas parciales con base en la teoría de ocupación de receptores.

[Insertar Figura 5]

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Los efectos de los antagonistas selectivos de AR-α sobre las

contraciones inducidas por los agonistas de los AR-α2.

En anillos aórticos denudados de endotelio, la aplicación de la clonidina o el

UK 14304 produjo contracciones en función de la concentración (Figure 6).

El BHT 933 (1×10-9 - 1×10-4 M) no indujo una respuesta contráctil significativa

(datos no mostrados). El antagonista selectivo de los AR-α1D, BMY 7378,

desplazó las curvas de la clonidina hacia la derecha sin reducir la respuesta

máxima, de forma competitiva; produciendo un valor de pA2 de 8.57 ± 0.11

(pendiente 0.86 ± 0.08) (Figura 6a). El BMY 7378 también se comportó como

un antagonista competitivo de las contracciones de UK 14304, con valor de

pA2 de 8.65 ± 0.10 (pendiente 0.82 ± 0.10) (Figura 6b). (Las pendientes de

los trazos de Schild no fueron estadísticamente diferentes de los valores

teóricos de 1). Adicionalmente, la rauwolscina (1×10-6M) desvió las curvas

concentración respuesta para la clonidina (Figura 7) y el UK 14304 (Figura 7)

a la derecha sin reducir las respuestas máximas; produciendo valores de pKB

de 6.99 ± 0.11 y 7.23 ± 0.09, respectivamente. Sin embargo, las

concetraciones más bajas de Rauwolscina (1×10-8 y 1×10-7M) no tuvieron

efecto significativo sobre las contracciones producidas por la clonidina y el

UK 14304 en anillos aórticos denudados de endotelio (Figura 7).

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[Insertar Figure 6]

[Insertar Figure 7]

Discusión:

En este estudio se evaluó la participación del ON derivado del endotelio en

los efectos relajantes de tres agonistas de los AR-α2, dos derivados

imidazolínicos, la clonidina y el UK 14304, y un derivado azepínico, el BHT

933. Además, se estudió la potencial acción inhibitoria del tono contráctil que

los agonistas mencionados pudieran ejercer directamente en el músculo liso

vascular. En anillos aórticos torácicos con y sin endotelio de la rata,

contraídos con fenilefrina, la clonidina y el UK 14304 produjeron relajaciones

dependientes de la concentración; los valores de las respuestas relajantes

fueron equivalentes en anillos con y sin endotelio, respectivamente. El

tratamiento con el inhibidor de la SON, L-NAME, con concentraciones que

inhiben completamente las relajaciones dependientes de ON endotelial

producidas por el agonista muscarínico, acetilcolina, y el ionóforo de Ca2+,

A23187, no tuvo efecto sobre las respuestas relajantes de la clonidina y el

UK 14304. Interesantemente, el BHT 933 no produjo relajación en los anillos

aórticos contraídos con fenilefrina. Estos datos indican que las respuestas

relajantes de la clonidina y el UK 14304 fueron independientes de la

presencia de endotelio funcional y, particularmente, de la liberación de ON.

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Además, los AR-α2 no parecen estar participando en la relajación, ya que,

por un parte, el BHT 993 fue incapaz de producirla; y por otra, el antagonista

de AR-α2 , la rauwolscina, ocasionó desplazamientos hacia la izquierda de

las curvas concentración respuesta de la clonidina y el UK 14304, sugiriendo

un efecto aditivo con ambos agonistas y no una actividad antagonista, como

cabría esperar.

Adicionalmente, cuando la PGF2α fue utilizada como agente contráctil en

anillos aórticos con endotelio intacto y denudado, en lugar del agonista

selectivo de AR-α1 (fenilefrina), la clonidina y el UK 14304 (no así el BHT

933) produjeron respuestas contráctiles de forma dependiente de la

concentración – en ningún caso fueron observadas respuestas relajantes.

Sin embargo, en las mismas condiciones experimentales, la acetilcolina

relajó los tejidos aórticos con endotelio. Así, las respuestas relajantes de los

agonistas de AR-α2 imidazolínicos, fueron obtenidas cuando el tono activo

previo fue generado por la estimulación de AR-α1 con fenilefrina, pero no por

la activación de receptores FP con PGF2α. Estos resultados sugieren que en

nuestras condiciones experimentales, los agonistas de AR-α2 derivados de la

imidazolina inducen relajación porque actúan como inhibidores de las

respuestas contráctiles producidas por activación de AR-α1 en el músculo

liso aórtico, comportandose como antagonistas; lo cual concuerda con los

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19

datos reportados en los trabajos previos de varios grupos de investigadores

[7, 8, 23-25]. Igualmente, la clonidina y el UK 14304 produjeron relajación de

arterias carentes de endotelio precontraídas con metoxamina - pero no con

serotonina - como cabe esperar de substancias que interactúan directamente

con los AR-α1. El efecto antipódico producido por los agonistas de AR-α2 en

los anillos aórticos contraídos con agonistas adrenérgicos α1 (relajación), en

comparación con el obtenido en tejidos aórticos contraídos con agonistas no-

adrenérgicos (contracción), no puede ser explicado sencillamente por una

interacción con el sistema de transducción por medio del cual la estimulación

de los AR-α1 produce la respuesta contráctil, ya que hay evidencia

experimental de que los cuatro preconstrictores (fenilefrina, PGF2α.

metoxamina y serotonina) utilizados en este estudio, participan del mismo

camino de señalización en el músculo liso vascular (es decir, un modo

primario de transducción de la señal que involucra la activación de proteínas

Gq heterotriméricas enlazadas a la fosfolipasa Cβ, con la generación de dos

segundos mensajeros, diacilglicerol – un cofactor en la activación de proteína

cinasa C – y 1,4,5-inositol trisfosfato, el cual mobiliza Ca2+ del retículo

endoplásmico) [26-28]. De esta forma, la hipótesis de que la clonidina y el UK

14304 interactúan con los AR-α1 permanece como la más probable, debido a

que la intervención con cualquiera de los componentes de la vía de

señalización debería de forma análoga alterar todas las respuestas

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contráctiles. En consecuencia, nosotros investigamos adicionalmente si la

respuestas relajantes provocadas por ambos agonistas de AR-α2 reflejan una

interacción con los AR-α1 del músculo liso de la aorta; es decir, los AR-α1D

[29-31].

La clonidina y el UK 14304 permitieron el desarrollo de curvas concentración

respuesta en tejidos aórtico sin endotelio, con efectos máximos de 72 y 53

%, respectivamente, del efecto contráctil máximo obtenido con fenilefrina;

contrariamente, el BHT 933 no produjo una respuesta contráctil significativa.

Las curvas concentración respuesta para la clonidina y el UK 14304 fueron

desplazadas a la derecha por el antagonista de AR-α1D, BMY 7378, y el

antagonista de AR-α2, rauwolscina. Los valores de pA2 para el BMY 7378 en

contra de las acciones independientes del endotelio de la clonidina y el UK

14304 fueron característicos de un efecto sobre los AR-α1D [29-31]. En

contraste, los valores de pKB obtenidos con la rauwolscina en contra de la

clonidina y el UK 14304 fueron dos órdenes de magnitud mayores que los

valores de la constante de disociación (KD) reportados para este antagonista

en sus interacciones con los AR-α2 [32-36]. Así, las respuestas relajantes

obtenidas con ambos agonistas de AR-α2 en los tejidos contraídos con

fenilefrina, pueden ser atribuídas a sus efectos como agonistas parciales con

los AR-α1. No obstante, la conducta observada de la clonidina y el UK 14304

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21

en los experimentos de relajación no apoya adecuadamente esta hipótesis,

ya que la relajación obtenida con cada agonista en tejidos precontraídos por

activación de los AR-α1, fue mayor del 70 %. (Este hecho no puede ser

conciliado con la actividad intrínseca que debería ser observada una vez que

la clonidina o el UK 14304 hubiesen competitivamente desplazado al

agonista completo de los AR-α1). De esta forma, la clonidina y el UK 14304

produjeron respuestas contráctiles significativas por activación de los AR-α1D

en anillos torácicos aórticos denudados de endotelio; sin embargo, ambos

agonistas causaron relajación plena que requiere la activación previa,

específica, de los mismos receptores por agonistas de AR-α1. Hay, en

apariencia, una interacción sui generis de la clonidina y el UK 14304 con los

AR-α1D, la cual no puede ser explicada adecuadamente por la teoría de la

ocupación de receptores.

En el músculo liso de la aorta de rata, ha sido recientemente reportado que el

UK 14304 (1-30 nM) y la clonidina (0.1-3 nM) produjeron relajación en anillos

aortícos denudados de endotelio contraídos con BaCl2, la cual fue inhibida

con el antagonista de AR-α2, yohimbina; en cambio, el UK 14304 provocó

contracción con concentraciones mayores (≥100 nM), la cual fue inhibida por

prazosina [19]. Los autores [19] concluyeron que la bajas concentraciones de

los agonistas de AR-α2 (clonidina y UK 14304) inducen relajación activando

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los AR-α2 del músculo liso, mientras que las concentraciones altas pueden

activar también a los AR-α1. Contrariamente, nuestros resultados obtenidos

con tejidos aórticos precontraídos con serotonina o PGF2α, muestran

claramente que las concentraciones bajas de la clonidina y el UK 14304

(≤100 nM) no produjeron respuestas relajantes, ni en presencia ni en

ausencia de endotelio. Además, como fue mencionado, las respuestas

relajantes a la clonidina y el UK 14304 en tejidos aórticos con endotelio

intacto precontraídos con fenilefrina, fueron desviadas a la izquierda en

presencia de rauwolscina, lo cual indica un efecto aditivo – en lugar de

inhibitorio - de este antagonista con los dos agonistas de AR-α2. De esta

forma, los efectos relajantes observados con la clonidina y el UK 14304 están

relacionados con la substancia utilizada para la inducción del tono activo

requerido para su evaluación.

A la fecha, no hay evidencia convincente de la presencia molecular de AR-α2

en el endotelio de la aorta de rata. No obstante, ha sido reportado que la

media y la adventicia de la aorta de rata expresan al ácido ribonucléico

mensajero (ARNm) de los AR-α2D [20, 21]. Las respuestas contráctiles de los

agonistas de AR-α2 en anillos aórticos sin endotelio, han sido usualmente

atribuídas a una acción selectiva con los AR-α2 localizados en el sarcolema

[9-18]; sin embargo, hay controversia al respecto, originada por reportes en

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23

los que los AR-α2 funcionales no han podido detectarse en la aorta de rata

[7, 8]. A diferencia de los AR-α1, los AR-α2 funcionales del músculo liso

vascular no se encuentran ampliamente distribuídos en el sistema vascular

[37]. De hecho, la actividad constrictora de los AR-α2 no está presente en las

arterias grandes, está generalmente restringida a las arteria pequeñas, las

arteriolas, y la circulación venosa [37, 38]. En este trabajo, la clonidina y el

UK 14304 produjeron contracción no relacionada con la estimulación de los

AR-α2, en anillos aórticos denudados de endotelio; la contracción fue

relacionada distintivamente con la activación de los AR-α1D. El otro agonista

de AR-α2 evaluado, el BHT 933, no se comportó como un agonista contráctil

en los tejidos aórticos. Estos datos y aquellos obtenidos con los

experimentos de relajación, en concierto, indican que entre los agonistas de

AR-α2 evaluados, los derivados imidazolínicos son los únicos capaces de

interactuar con los AR-α1D.

Finalmente, es importante mencionar que la adición de L-NAME o la

destrucción del endotelio, no modificaron de forma significativa las

contracciones producidas por la fenilefrina o por laPGF2α, como podría

esperarse ya que la liberación basal de ON usualmente atenúa las respuestas

contráctiles en la aorta de rata [9-18]; sin embargo, las contracciones inducidas

por los agonistas después de la inmersión en 1 x 10-4 M de L-NAME mostraron

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24

una tendencia consistente a aumentar. De otra forma, el fallo para obtener un

incremento en la contracción inducida por agonistas despues de la remoción del

endotelio en la aorta de rata, ha sido reportada por varios grupos de

investigadores [12, 39, 40].

Conclusión:

Nuestros resultados muestran que el endotelio – y específicamente el ON –

no contribuye a la relajación mediada por los agonistas de los AR-α2 en la

aorta de rata. Aún cuando la clonidina y el UK 14304 producen relajación en

la aorta de rata contraída con agonistas de AR-α1, la relajación no es

relacionada con la activación de AR-α2. La clonidina y el UK 14304 relajan

arterias contraídas con agonistas de AR-α1 pero no aquellas contraídas con

agonistas no adrenérgicos, lo cual sugiere una interferencia selectiva con los

AR-α1; esta es adicionalmente apoyada por el hecho de que las respuestas

contráctiles a ambos agonistas de AR-α2 – en tejidos denudados de endotelio

– son debidas a una interacción con AR-α1D. El otro agonista de los AR-α2

estudiado, BHT 933, un derivado de la azepina, carece de efectos relajante y

contráctil en la aorta de rata. Por tanto, es posible que los agonistas

derivados imidazolínicos, clonidina and UK 14304, debido a su estructura – y

no por su eficacia como agonistas de AR-α2 – sean capaces de una

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interacción ajustable (en relación con el estado activo de los AR-α1

dependiente de la concentración del agonista), excitatoria e inhibitoria, con

los AR-α1.

Impacto.

La inhibición farmacológica del funcionamiento del sistema nervioso

simpático es de gran utilidad en el tratamiento de la hipertensión arterial. Los

agonistas adrenérgicos α2 son usados para el tratamiento de la hipertensión

arterial principalmente por su capacidad para disminuir la actividad del

sistema nervioso simpático. El entendimiento del papel de los agonistas de

AR-α2 derivados imidazolínicos en diversas funciones fisológicas y

fisiopatológias es fundamental porque la modulación farmacológica de la

actividad de los receptores mencionados tiene implicaciones terapéuticas.

Por tanto, estos resultados deben ser importantes para el sector salud y la

industria farmaceútica.

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26

Tabla 1. Efecto inhibitorio del L-NAME de las relajaciones inducidas por la

acetilcolina o el A23187 en anillos aórticos de rata con endotelio intacto

precontraídos con fenilefrina (1 × 10-6 M).

-------------------------------------------------------------------------------------------------------

L-NAME Acetilcolina A23187

[M] - log EC50 % Rmax - log EC50 % Rmax

0 7.08 ± 0.04 82 ± 3 7.77 ± 0.08 88 ± 8

1×10-7 6.24 ± 0.06* 54 ± 4* 7.30 ± 0.07* 62 ± 8

1×10-6 5.81 ± 0.06*# 21 ± 4*# N.D. 7 ± 9*#

1×10-4 5.59 ± 0.08* 9 ± 4* N.D. 9 ± 9*

-------------------------------------------------------------------------------------------------------

Los valores son la media ± SEM de 4-6 experimentos. *P<0.05 versus tejidos

controles. # P<0.05 L-NAME (1 × 10-6 M) versus L-NAME (1 × 10-7 M). Rmax =

% maxima relajation. N.D. = no determinado.

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-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0

0.4

0.8

1.2

1.6Endo +Endo -

Clonidina, Log [M]

Con

tracc

ión

(g)

-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0

0.4

0.8

1.2

1.6

E +E -

UK 14304, Log [M]

Con

tracc

ión

(g)

-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0

0.4

0.8

1.2

1.6

E+E-

BHT 933, Log [M]

Con

tracc

ión

(g)

Figura 1. Curvas concentración-respuesta de la clonidina, el UK 14304, y el BHT 933 en anillos de aórta torácica de rata con endotelio intacto (Endo +) y denudado (Endo -) precontraídos con fenilefrina (1 × 10-6 M). Los resultados son expresados como reducción del tono contráctil inducido por la fenilefrina. Los valores son la media ± SEM de seis

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experimentos. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas para cualquier concentración entre las respuestas de un agonista en (Endo -) y (Endo +).

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-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0

0.4

0.8

1.2

1.601× 10-6

1× 10-4

L-NAME [M]

Clonidina, Log [M]

Con

tracc

ión

(g)

-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0

0.4

0.8

1.2

1.6

UK 14304, Log [M]

Con

tracc

ión

(g)

-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0

0.4

0.8

1.2

1.6

BHT 933, Log [M]

Con

tracc

ión

(g)

Figura 2. Curvas concentración-respuesta de la clonidina, el UK 14304, y el BHT 933 en presencia y ausencia de L-NAME en la aórta torácica de la rata precontraída con fenilefrina (1 × 10-6 M). Los resultados son expresados como reducción del tono contráctil inducido por

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la fenilefrina. Los valores son la media ± SEM de 4-6 experimentos. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas para cualquier concentración entre las respuestas relajantes de un agonista en tejidos tratados con L-NAME y tejidos controles.

-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0

0.4

0.8

1.201× 10-8

1 × 10-7

Rauwolscine [M]

1× 10-6

** ** * * **

** *

*

*

**

*

Clonidina, Log [M]

Con

tracc

ión

(g)

-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0

0.4

0.8

1.2

* * * * * * **

*

**

UK 14304, Log [M]

Con

tracc

ión

(g)

Figura 3. Efectos de la rauwolscina sobre las relajaciones inducidas por la clonidina y el UK

14304 en la aórta torácica de la rata contraída con fenilefrina (1 × 10-6 M). Los resultados son

expresados como reducción del tono contráctil producido por la fenilefrina. Los valores son la

media ± SEM de 6 experimentos. * P < 0.05 versus control.

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-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0

0.4

0.8

1.2

1.6

Endo +PG F2α (3× 10-7 M)

(a)Endo -

Clonidina, Log [M]

Con

tracc

ión

(g)

-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0

0.4

0.8

1.2

1.6

UK 14304, Log [M]

Con

tracc

ión

(g)

-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0

0.4

0.8

1.2

1.6

B-HT 933, Log [M]

Con

tracc

ión

(g)

-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0

0.4

0.8

1.2

1.6

ACh, Log [M]

Con

tracc

ión

(g)

Figura 4. Los efectos de la clonidina (a), el UK 14304 (b), el BHT 933 (c), y la acetilcolina

(Ach; d) en la aórta torácica de la rata con endotelio intacto (Endo +) y denudado (Endo -)

precontraída con prostaglandina F2α (PGF2α; 3 × 10-7 M). Los resultados son expresados

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como cambios del tono contráctil provocado por la PGF2α. Los valores son la media ± SEM

de 4-6 observaciones.

Figura 5 (Izquierda) Curvas concentración-respuesta de la clonidina (a) y el UK 14304 (c) en

la aórta torácica de la rata sin endotelio precontraída con serotonina (5-HT). (Derecha)

Efectos relajantes producidos por la clonidina (b) y el UK 14304 (d) en la aórta torácica de la

rata sin endotelio precontraída con el agonista de adrenoceptores α1, metoxamina. Los

resultados son expresados como cambios en el tono inducido por el agonista contráctil,

respectivamente, serotonina o metoxamina. Los valores son la media ± SEM de 6-8

observaciones.

Figura 6 Antagonismo por el BMY 7378 de las curvas concentración-respuesta contráctil de

la clonidina (a) y el UK 14304 (b) en los anillos de aórta torácica de la rata. Los datos

representan las medias ± SEM de 8 experimentos, y son expresados en gramos (g) de

fuerza desarrollada. Los recuadros representan los trazos de Schild; se presentan las

medias ± SEM de 8 experimentos.

Figura 7 Antagonismo por la Rauwolscina de las curvas concentración–contracción de la

clonidina (a) y el UK 14304 (b) en anillos aórticos sin endotelio. Los datos representan las

medias ± SEM de 8 experimentos, y son expresados en gramos (g) de fuerza desarrollada.