A direct influence of phenylephrine on the release of ... · 3 Introducción: Los receptores...
Transcript of A direct influence of phenylephrine on the release of ... · 3 Introducción: Los receptores...
1
Resumen
En la aorta de rata, la presencia de receptores adrenérgicos α2 (AR-α2)
funcionales fue investigada en preparaciones anulares precontraídas con
agonistas adrenérgicos α1 y con agonistas no adrenérgicos. Particularmente,
fue evaluada la interacción hipotética de los agonistas de AR-α2 con la
vasoconstricción ocasionada por la activación de receptores adrenérgicos α1
(AR-α1). Se obtuvieron respuestas relajantes y contráctiles con los agonistas
de AR-α2. En anillos aórticos con y sin endotelio contraídos con fenilefrina (1
× 10-6 M), los derivados de la imidazolína, clonidina y UK 14304, indujeron
relajaciones con similar orden de potencias (-log EC50) y efectos relajantes
máximos, respectivamente. El tratamiento con el inhibidor de la sintasa de
óxido nítrico, éster metilo de la NG-nitro-L-arginina (L-NAME), no tuvo efecto
sobre la respuestas relajantes de la clonidina y el UK 14304. En los anillos
con endotelio contraídos con fenilefrina, las relajaciones de la clonidina y el
UK14304 no fueron antagonizadas por el antagonista selectivo de AR-α2,
rauwolscina (≤ 1 × 10-6 M). La clonidina y el UK 14304 produjeron solamente
contracciones en los anillos aórticos con endotelio intacto y endotelio
denudado contraídos con prostaglandina F2α (3 × 10-7 M). Adicionalmente, la
clonidina y el UK 14304 provocaron relajación de las arterias denudadas de
endotelio precontraídas con metoxamina, pero no así con serotonina.
2
Finalmente, las curvas concentración-contracción para la clonidina y el
UK14304 en anillos aórticos sin endotelio, fueron significativamente
desplazadas hacia la derecha por el antagonista selectivo de los AR-α1D,
BMY 7378, y por la rauwolscina. Los valores de pA2 y pKB para el BMY 7378
y la rauwolscina, respectivamente, en contra de las acciones independientes
del endotelio de la clonidina y el UK 14304 fueron característicos de una
interación con los AR-α1D. El otro agonista selectivo de los AR-α2 estudiado,
el BHT 933 (un derivado de la azepina), careció de efectos relajantes o
contráctiles significativos en la aorta de la rata. En conclusión, los resultados
no proporcionan evidencia de la presencia de AR-α2 funcionales en la aorta
de la rata. Respectivamente, los efectos relajantes y contráctiles de los
derivados de la imidazolina, clonidina y UK 14304, son debidos a una
interacción ajustable (en relación con el estado activo de los AR-α1
dependiente del agonista), inhibitoria y excitatoria, con los AR-α1.
3
Introducción:
Los receptores adrenérgicos o adrenoceptores α2 (AR-α2), miembros de la
gran familia de receptores acoplados a proteínas G, tienen un papel
importante en la regulación de la actividad del sistema nervioso simpático
(SNS) [1]. La activación de los AR-α2 en la región medular del tallo cerebral
inhibe la actividad del SNS [2], y la activación de los AR-α2 presinápticos,
inhibe la liberación de noradrenalina de las terminaciones nerviosas
periféricas simpáticas [3, 4]; en consecuencia, los agonistas de AR-α2 son
actualmente utilizados como antihipertensivos. Por otra parte, los AR-α2 se
encuentran ampliamente distribuídos en el propio tejido vascular. Los AR-α2
endoteliales participan en las respuestas vasorelajantes de la adrenalina y la
noradrenalina [5, 6], y aquellos localizados en el músculo liso vascular han
sido caracterizados como receptores vasocontrictores activados
fisiológicamente por catecolaminas [1, 2]. De esta forma, los AR-α2
endoteliales vasorelajantes pueden representar un mecanismo de control
local involucrado en la modulación opositora de las respuestas
vasoconstrictoras de las aminas simpaticomiméticas. No obstante, hay
también evidencia de que la vasodilatación mediada por los AR-α2 puede ser
independiente del endotelio [7, 8].
4
En la aorta de la rata, ha sido ampliamente mostrado que las respuestas
contráctiles a los agonistas de AR-α2 son deprimidas en la presencia del
endotelio, e inversamente, aumentadas por la inhibición farmacológica de la
síntesis de óxido nítrico (ON) [9-18]. En conjunto, estos datos sugieren que el
ON desempeña un papel en la depresión dependiente del endotelio de las
respuestas vasculares constrictoras de los agonistas de AR-α2. Así, se ha
propuesto que tanto la liberación basal como la inducida de ON, inhibe las
respuestas aórticas provocadas por agonistas contráctiles; particularmente,
algunos autores [10-12] han considerado una posible contribución directa de
los AR-α2 para estimular la producción de ON. De hecho, los agonistas
selectivos de AR-α2 relajan tejidos aórticos precontraídos, y una explicación
aceptada para este efecto es que la activación de los AR-α2 puede inducir
vasodilatación [14-18]. Específicamente, se ha postulado una relajación
dependiente de ON mediada por AR-α2 endoteliales [5, 6]. Sin embargo,
varios reportes [7, 8] han producido evidencia que genera duda sobre la
presencia funcional de AR-α2 vasorelajantes endoteliales en la aorta (y otras
arterias) de la rata. Algunos de los efectos relajantes de los agonistas de AR-
α2 pueden no ser mediados por los AR-α2. En el músculo liso de la rata, los
agonistas de los AR-α2 pueden interferir directamente con la vasoconstricción
inducida por activación de los AR-α1 [7, 8]; de otra forma, ha sido reportado
que éllos pueden producir relajación por medio de la activación de AR-α2 del
5
sarcolema, acoplados a canales de K+ sensibles a ATP [19]. Además, la
expresión molecular de AR-α2 en el endotelio vascular es incierta, aún
cuando la presencia de AR-α2 fue demostrada en el músculo liso vascular de
la rata [20, 21].
Los presentes experimentos fueron diseñados para reevaluar la naturaleza
de la relajación mediada por agonistas selectivos de AR-α2 en la aórta de
rata con endotelio intacto y denudado. Dos derivados de la imidazolina, la
clonidina y el UK 14304, y un derivado de la azepina, el BHT 933, fueron
estudiados. En particular, se hizo énfasis en elucidar si los efectos relajantes
de los agonistas de AR-α2 pueden explicarse por su interacción con AR-α1
previamente activados. La participación del ON derivado del endotelio en las
acciones relajantes de los agonistas de AR-α2 fue también reconsiderada.
6
Métodos.
Las ratas machos Wistar (250-300 g de peso corporal; 10-12 semanas de
edad) fueron alojadas bajo condiciones control (22±2 °C, 60% de humedad y
luz artificial de 06:00 a 18:00 h). Alimentación normal y agua fueron
administradas ad libitum. El protocolo experimental fue aprobado por el
Comité de Cuidado de Animales de nuestra institución.
Preparación de los tejidos y medidas de la tensión.
Las ratas fueron anestesiadas con éter etílico, decapitadas y desangradas.
Las aortas torácicas fueron extirpadas y limpiadas cuidadosamente para
evitar el daño del endotelio; después, los vasos se seccionaron en
segmentos anulares de aproximadamente 4 mm de longitud. En otras
preparaciones, el endotelio fue lesionado mediante la abrasión de la
superficie íntima de los anillos aórticos con la parte roma de unas pinzas. Los
anillos aórticos fueron colocados en cámaras de tejidos (10 ml) llenas con
solución salina fisiológica Krebs compuesta de (mM): NaCl 118, KCl 4.7,
KH2PO4 1.2, MgSO4 1.2, CaCl2 2.5, NaHCO3 25, dextrosa 11.7 y EDTA
0.026. La solución Krebs fue mantenida a 37ºC y burbujeada continuamente
con 95% O2 y 5% CO2 (el pH de la solución fue aproximadamente 7.4). Cada
7
segmento tisular fue colocado con una tensión inicial de 2g por 60 min. Las
contracciones se midieron isométricamente (transductor MP 100) y los datos
fueron registrados en una computadora con el programa AcqKnowledge
(MP100WSW, Biopac Systems, Inc.; California, USA). Los tejidos fueron
estabilizados (período de estabilización) mediante la adición de fenilefrina 1 x
10-6 M al baño tisular; después de que se obtuvo el estado estable de la
contracción, el contenido del baño fue reemplazado con solución Krebs
varias veces. Al alcanzar los tejidos la tensión basal previa, el proceso se
repitió en dos ocasiones, antes de la ejecución de los protocolos
experimentales. Este proceso de estabilización reduce la variabilidad del
tejido en respuesta a la administración repetida del agonista.
La integridad del endotelio fue probada con acetilcolina.
Después de un periodo de lavado, cada anillo aórtico fue contraído con
fenilefrina (1 x 10-6 M) y, una vez que la meseta fue alcanzada, se añadió
acetilcolina (1 x 10-6 M) para confirmar la viabilidad del endotelio vascular.
Las preparaciones con un endotelio intacto produjeron una relajación mayor
que el 70 %, mientras que la denudación endotelial fue confirmada por la
carencia de relajación producida por la acetilcolina.
8
Protocolos experimentales
Curvas concentración-respuesta relajante en tejidos contraídos con
agonistas adrenérgicos α1 y no adrenérgicos.
Después del período de estabilización, los anillos aórticos con endotelio
intacto y denudado fueron contraídos con concentraciones submáximas de
fenilefrina (1 x 10-6M) o PGF2α (3 x 10-7 M), y se permitió la obtención de la
meseta de las contracciones por un período de 10 min. Entonces, se
realizaron experimentos concentración-respuesta para varios agonistas
adrenergicos α2 y reconocidos agonistas relajantes dependientes de
endotelio. En anillos aórticos con endotelio intacto, las respuestas relajantes
de la clonidina, el UK-14304, el BHT 933, la acetilcolina (agonista
muscarínico), y el A23187 (ionóforo de calcio) fueron evaluadas
independientemente, mediante la adición acumulativa de concentraciones
crecientes de cada agonista al baño tisular y registrando la relajación
generada. Semejantemente, en anillos aórticos sin endotelio, las respuestas
relajantes a la clonidina, el UK-14304, y el BHT 933 fueron estudiadas.
En otras series de experimentos, los tejidos aórticos con endotelio fueron
inicialmente tratados con rauwolscina (antagonista de AR-α2), L-NAME
9
(inhibidor de la sintasa de ON) o vehículo (control) por 15 min. Después, los
anillos fueron contraídos con fenilefrina (1 x 10-6 M), y la contracción se
estabilizó durante 10 min. Las respuestas a la clonidina, el UK-14304, y el
BHT 933 fueron evaluadas entonces de forma independiente, mediante la
adición de concentraciones crecientes de cada agonista a los baños tisulares
y registrando la relajación generada.
En otros dos grupos de experimentos, los anillos aórticos sin endotelio fueron
contraídos con metoxamina o serotonina, se permitió la estabilización de las
contracciones durante 10 minutes y, subsecuentemente, la clonidina y el UK
14304 fueron aplicados acumulativamente para obtener curvas
concentración respuesta. Los efectos de la clonidina y el UK 14304 fueron
evaluados a diferentes niveles de tono activo provocados por tres
concetraciones diferentes de metoxamina (1 x 10-7, 1 x 10-6, y 1 x 10-5 M) o
serotonina (1 x 10-7, 1 x 10-6, and 1 x 10-5 M).
Curvas acumulativas concentración respuesta a los agonistas
adrenérgicos α2.
En anillos aórticos denudados de endotelio, se construyeron curvas
concentración-respuesta reproducibles mediante la exposición del tejido a
10
concentraciones crecientes de los agonistas de AR-α2, clonidina, UK 14304,
y BHT 933, hasta que se observó una respuesta máxima. Para la conidina y
el UK 14304, en cada caso, cuatro curvas concentración-respuesta fueron
obtenidas (aproximadamente 60 minutos aparte entre éllas) en presencia y
ausencia (control) de antagonistas selectivos. (El BHT 933 no produjo
contracciones significativas). El tiempo de incubación de la rauwolscina, el
BMY 7378 (antagonista de AR-α1D), or vehículo fue 15 min. Cada anillo sirvió
como su propio control. Una preparación que no recibió tratamiento fue
estudiada en paralelo con los tejidos experimentales, y fue utilizada para
determinar cualquier cambio de sensibilidad a los agonistas dependiente del
tiempo.
Presentación y Análisis de Datos.
Los resultados se presentan como la media ± SEM (error estándar de la
media) del número de anillos aórticos obtenidos con 4 a 8 animales
diferentes. Las contracciones se presentan como gramos (g) de fuerza
desarrollada; las relajaciones como reducciones del incremento máximo en
tensión (precontracción en gramos) obtenida con la adición del agonista. El
logaritmo negativo de las concentración molar de un agonista requerida para
producir 50 % de la respuesta máxima (-log EC50) fue calculado (mediante
11
análisis de regresión no lineal) para cada curva concentración-respuesta
individual con un programa de computación (Graph Pad Softwere; San
Diego, California, USA). La razón de las concentraciones del agonista (CR)
en presencia y ausencia del antagonista, fue determinada al nivel del 50% de
la respuesta máxima (EC50), y los estimados de pA2 se obtuvieron de la
ecuación: pA2 = log (agonista CR-1) - log [antagonista] [22]. Cuando la CR
fue obtenida con una sóla concentración del antagonista [B], la constante de
disociación aparente para el antagonista fue determinada del logaritmo
negativo de la constante de disociación del antagonista (pKB), con la
ecuación pKB= log [CR-1] – log [B].
El análisis estadístico fue hecho por medio del análsis de variancia (ANOVA)
seguido de la prueba (post hoc) de Bonferroni. En todas las comparaciones
un valor de P igual o menor que 0.05 fue considerado estadísticamente
significante.
12
Resultados
Los efectos relajantes de los agonistas adrenérgicos α2 en tejidos
aórticos precontraídos con el agonista de AR-α1, fenilefrina.
Los agonistas de los AR-α2, Clonidina y UK 14304, produjeron relajaciones
dependientes de la concentración en los anillos aórticos con endotelio intacto
y denudado contraídos con fenilefrina (Figura 1). Las curvas concentración
respuesta del UK 14304 y la clonidina en preparaciones denudadas de
endotelio fueron equivalentes, correspondientemente, a aquellas obtenidas
con preparaciones con endotelio intacto (Figura 1). Adicionalmente, en
anillos aórticos con endotelio contraídos con fenilefrina, las relajaciones
inducidas por la clonidina y el UK 14304 no fueron afectadas
significativamente por los tratamientos con L-NAME (1×10-6 - 1×10-4 M)
(Figura 2). De otra forma, el BHT 933 fue incapáz de producir relajación
significativa en los anillos aórticos precontraídos con fenilefrina (Figuras 1 y
2).
[Insertar Figuras 1 y 2]
En experimentos comparativos, la acetilcolina y el A23187 produjeron
relajaciones dependientes de la concentración en anillos aórticos con
13
endotelio contraídos con fenilefrina (Tabla 1). La aplicación de L-NAME
(1×10-7, 1×10-6, y 1×10-4 M) redujo de forma significativa el porcentaje de
relajación máxima producida por la acetilcolina (Tabla 1); sin embargo, no
hubo diferencia significativa entre los tratamientos con 1×10-6 y 1×10-4 M
(Tabla 1). Semejantemente, el L-NAME redujo significativamente la
respuesta relajante ocasionada por el ionóforo de calcio, A23187; el efecto
de 1× 10-6 M L-NAME fue mayor que aquel de 1×10-7 M L-NAME, pero fue
similar al obtenido con la concetración mayor de L-NAME probada en este
estudio (1×10-4 M) (Tabla 1). La remoción del endotelio abolió completamente
la respuesta relajante producida ya sea por acetilcolina o por el A23187
(datos no mostrados). Las relajaciones obtenidas por la acetilcolina y el
ionóforo de calcio no fueron afectadas por el inhibidor de la ciclooxigenasa,
indometacina (1×10-5 M) (datos no mostrados).
[Insertar Tabla 1]
El antagonista de AR-α2, rauwolscina (1×10-8 y 1×10-7 M), causó
desviaciones hacia la izquierda de las curvas concentración respuesta de la
clonidina y el UK 14304 en tejidos aórticos con endotelio intacto contraídos
con fenilefrina (Figura 3); empero, una concentración mayor de rauwolscina
(1×10-6M) provocó la inhibición significante de las respuestas contráctiles de
la fenilefrina (precontracción) (Figura 3).
14
[Insertar Figura 3]
Los efectos de los agonistas adrenérgicos α2 en tejidos aórticos
precontraídos con el agonista no-adrenérgico, PGF2α
En anillos aórticos con endotelio intacto y denudado contraídos con PGF2α, la
clonidina y el UK 14304 causaron contracciones adicionales (Figura 4a y 4b,
respectivamente). En las mismas condiciones experimentales, el BHT 933 no
produjo respuesta (Figura 4c). De otra forma, la acetilcolina produjo una
relajación dependiente de la concentración en los anillos aórticos con
endotelio contraídos con PGF2α (Figura 4d).
[Insertar Figura 4]
Los efectos de los agonistas adrenérgicos α2 en tejidos aórticos
precontraídos con otros agonistas adrenérgicos y no adrenérgicos.
Los efectos de la clonidina y el UK 14304 fueron investigados adicionalmente
en tejidos aórticos sin endotelio contraídos con el agonista selectivo
adrenérgico α1, metoxamina, o con el agonista de receptores 5-HT,
serotonina. Los efectos de ambos agonistas de los AR-α2, fueron probados a
15
diferentes niveles de tono activo producidos por concentraciones crecientes
de metoxamina o serotonina (Figure 5). En anillos aórticos sin endotelio
contraídos con serotonina, la clonidina (Figura 5a) y el UK 14304 (Figura 5c)
causaron sólamente contracciones adicionales o no tuvieron efectos. De otra
manera, en anillos aórticos denudados de endotelio contraídos con
metoxamina, la clonidina (Figura 5b) y el UK 14304 (Figura 5d) produjeron
contracciones cuando el tono precontráctil fue bajo (metoxamina, 1 × 10-7 M),
y efectos relajantes cuando fue alto (metoxamina, 10-6 y 10-5 M). Así en
tejidos precontraídos con metoxamina, ambos agonistas tienen una conducta
aparente dualistica. Sin embargo, los efectos contráctiles máximos de la
clonidina y el UK 14304 fueron 0.82 ± 0.07 y 0.62 ± 0.06 g, respectivamente;
mientras que las respuestas relajantes máximas para la clonidina y el UK
14304 (en tejidos contraídos con 1 × 10-5 M de metoxamina) fueron 0.27 ±
0.08 y 0.18 ± 0.06 g, respectivamente (Figures 5b y 5d). Obviamente, la
magnitud de los efectos máximos (contráctil y relajante) para cada agonista,
es diferente. Esta discrepancia no concuerda con la conducta de los
agonistas parciales con base en la teoría de ocupación de receptores.
[Insertar Figura 5]
16
Los efectos de los antagonistas selectivos de AR-α sobre las
contraciones inducidas por los agonistas de los AR-α2.
En anillos aórticos denudados de endotelio, la aplicación de la clonidina o el
UK 14304 produjo contracciones en función de la concentración (Figure 6).
El BHT 933 (1×10-9 - 1×10-4 M) no indujo una respuesta contráctil significativa
(datos no mostrados). El antagonista selectivo de los AR-α1D, BMY 7378,
desplazó las curvas de la clonidina hacia la derecha sin reducir la respuesta
máxima, de forma competitiva; produciendo un valor de pA2 de 8.57 ± 0.11
(pendiente 0.86 ± 0.08) (Figura 6a). El BMY 7378 también se comportó como
un antagonista competitivo de las contracciones de UK 14304, con valor de
pA2 de 8.65 ± 0.10 (pendiente 0.82 ± 0.10) (Figura 6b). (Las pendientes de
los trazos de Schild no fueron estadísticamente diferentes de los valores
teóricos de 1). Adicionalmente, la rauwolscina (1×10-6M) desvió las curvas
concentración respuesta para la clonidina (Figura 7) y el UK 14304 (Figura 7)
a la derecha sin reducir las respuestas máximas; produciendo valores de pKB
de 6.99 ± 0.11 y 7.23 ± 0.09, respectivamente. Sin embargo, las
concetraciones más bajas de Rauwolscina (1×10-8 y 1×10-7M) no tuvieron
efecto significativo sobre las contracciones producidas por la clonidina y el
UK 14304 en anillos aórticos denudados de endotelio (Figura 7).
17
[Insertar Figure 6]
[Insertar Figure 7]
Discusión:
En este estudio se evaluó la participación del ON derivado del endotelio en
los efectos relajantes de tres agonistas de los AR-α2, dos derivados
imidazolínicos, la clonidina y el UK 14304, y un derivado azepínico, el BHT
933. Además, se estudió la potencial acción inhibitoria del tono contráctil que
los agonistas mencionados pudieran ejercer directamente en el músculo liso
vascular. En anillos aórticos torácicos con y sin endotelio de la rata,
contraídos con fenilefrina, la clonidina y el UK 14304 produjeron relajaciones
dependientes de la concentración; los valores de las respuestas relajantes
fueron equivalentes en anillos con y sin endotelio, respectivamente. El
tratamiento con el inhibidor de la SON, L-NAME, con concentraciones que
inhiben completamente las relajaciones dependientes de ON endotelial
producidas por el agonista muscarínico, acetilcolina, y el ionóforo de Ca2+,
A23187, no tuvo efecto sobre las respuestas relajantes de la clonidina y el
UK 14304. Interesantemente, el BHT 933 no produjo relajación en los anillos
aórticos contraídos con fenilefrina. Estos datos indican que las respuestas
relajantes de la clonidina y el UK 14304 fueron independientes de la
presencia de endotelio funcional y, particularmente, de la liberación de ON.
18
Además, los AR-α2 no parecen estar participando en la relajación, ya que,
por un parte, el BHT 993 fue incapaz de producirla; y por otra, el antagonista
de AR-α2 , la rauwolscina, ocasionó desplazamientos hacia la izquierda de
las curvas concentración respuesta de la clonidina y el UK 14304, sugiriendo
un efecto aditivo con ambos agonistas y no una actividad antagonista, como
cabría esperar.
Adicionalmente, cuando la PGF2α fue utilizada como agente contráctil en
anillos aórticos con endotelio intacto y denudado, en lugar del agonista
selectivo de AR-α1 (fenilefrina), la clonidina y el UK 14304 (no así el BHT
933) produjeron respuestas contráctiles de forma dependiente de la
concentración – en ningún caso fueron observadas respuestas relajantes.
Sin embargo, en las mismas condiciones experimentales, la acetilcolina
relajó los tejidos aórticos con endotelio. Así, las respuestas relajantes de los
agonistas de AR-α2 imidazolínicos, fueron obtenidas cuando el tono activo
previo fue generado por la estimulación de AR-α1 con fenilefrina, pero no por
la activación de receptores FP con PGF2α. Estos resultados sugieren que en
nuestras condiciones experimentales, los agonistas de AR-α2 derivados de la
imidazolina inducen relajación porque actúan como inhibidores de las
respuestas contráctiles producidas por activación de AR-α1 en el músculo
liso aórtico, comportandose como antagonistas; lo cual concuerda con los
19
datos reportados en los trabajos previos de varios grupos de investigadores
[7, 8, 23-25]. Igualmente, la clonidina y el UK 14304 produjeron relajación de
arterias carentes de endotelio precontraídas con metoxamina - pero no con
serotonina - como cabe esperar de substancias que interactúan directamente
con los AR-α1. El efecto antipódico producido por los agonistas de AR-α2 en
los anillos aórticos contraídos con agonistas adrenérgicos α1 (relajación), en
comparación con el obtenido en tejidos aórticos contraídos con agonistas no-
adrenérgicos (contracción), no puede ser explicado sencillamente por una
interacción con el sistema de transducción por medio del cual la estimulación
de los AR-α1 produce la respuesta contráctil, ya que hay evidencia
experimental de que los cuatro preconstrictores (fenilefrina, PGF2α.
metoxamina y serotonina) utilizados en este estudio, participan del mismo
camino de señalización en el músculo liso vascular (es decir, un modo
primario de transducción de la señal que involucra la activación de proteínas
Gq heterotriméricas enlazadas a la fosfolipasa Cβ, con la generación de dos
segundos mensajeros, diacilglicerol – un cofactor en la activación de proteína
cinasa C – y 1,4,5-inositol trisfosfato, el cual mobiliza Ca2+ del retículo
endoplásmico) [26-28]. De esta forma, la hipótesis de que la clonidina y el UK
14304 interactúan con los AR-α1 permanece como la más probable, debido a
que la intervención con cualquiera de los componentes de la vía de
señalización debería de forma análoga alterar todas las respuestas
20
contráctiles. En consecuencia, nosotros investigamos adicionalmente si la
respuestas relajantes provocadas por ambos agonistas de AR-α2 reflejan una
interacción con los AR-α1 del músculo liso de la aorta; es decir, los AR-α1D
[29-31].
La clonidina y el UK 14304 permitieron el desarrollo de curvas concentración
respuesta en tejidos aórtico sin endotelio, con efectos máximos de 72 y 53
%, respectivamente, del efecto contráctil máximo obtenido con fenilefrina;
contrariamente, el BHT 933 no produjo una respuesta contráctil significativa.
Las curvas concentración respuesta para la clonidina y el UK 14304 fueron
desplazadas a la derecha por el antagonista de AR-α1D, BMY 7378, y el
antagonista de AR-α2, rauwolscina. Los valores de pA2 para el BMY 7378 en
contra de las acciones independientes del endotelio de la clonidina y el UK
14304 fueron característicos de un efecto sobre los AR-α1D [29-31]. En
contraste, los valores de pKB obtenidos con la rauwolscina en contra de la
clonidina y el UK 14304 fueron dos órdenes de magnitud mayores que los
valores de la constante de disociación (KD) reportados para este antagonista
en sus interacciones con los AR-α2 [32-36]. Así, las respuestas relajantes
obtenidas con ambos agonistas de AR-α2 en los tejidos contraídos con
fenilefrina, pueden ser atribuídas a sus efectos como agonistas parciales con
los AR-α1. No obstante, la conducta observada de la clonidina y el UK 14304
21
en los experimentos de relajación no apoya adecuadamente esta hipótesis,
ya que la relajación obtenida con cada agonista en tejidos precontraídos por
activación de los AR-α1, fue mayor del 70 %. (Este hecho no puede ser
conciliado con la actividad intrínseca que debería ser observada una vez que
la clonidina o el UK 14304 hubiesen competitivamente desplazado al
agonista completo de los AR-α1). De esta forma, la clonidina y el UK 14304
produjeron respuestas contráctiles significativas por activación de los AR-α1D
en anillos torácicos aórticos denudados de endotelio; sin embargo, ambos
agonistas causaron relajación plena que requiere la activación previa,
específica, de los mismos receptores por agonistas de AR-α1. Hay, en
apariencia, una interacción sui generis de la clonidina y el UK 14304 con los
AR-α1D, la cual no puede ser explicada adecuadamente por la teoría de la
ocupación de receptores.
En el músculo liso de la aorta de rata, ha sido recientemente reportado que el
UK 14304 (1-30 nM) y la clonidina (0.1-3 nM) produjeron relajación en anillos
aortícos denudados de endotelio contraídos con BaCl2, la cual fue inhibida
con el antagonista de AR-α2, yohimbina; en cambio, el UK 14304 provocó
contracción con concentraciones mayores (≥100 nM), la cual fue inhibida por
prazosina [19]. Los autores [19] concluyeron que la bajas concentraciones de
los agonistas de AR-α2 (clonidina y UK 14304) inducen relajación activando
22
los AR-α2 del músculo liso, mientras que las concentraciones altas pueden
activar también a los AR-α1. Contrariamente, nuestros resultados obtenidos
con tejidos aórticos precontraídos con serotonina o PGF2α, muestran
claramente que las concentraciones bajas de la clonidina y el UK 14304
(≤100 nM) no produjeron respuestas relajantes, ni en presencia ni en
ausencia de endotelio. Además, como fue mencionado, las respuestas
relajantes a la clonidina y el UK 14304 en tejidos aórticos con endotelio
intacto precontraídos con fenilefrina, fueron desviadas a la izquierda en
presencia de rauwolscina, lo cual indica un efecto aditivo – en lugar de
inhibitorio - de este antagonista con los dos agonistas de AR-α2. De esta
forma, los efectos relajantes observados con la clonidina y el UK 14304 están
relacionados con la substancia utilizada para la inducción del tono activo
requerido para su evaluación.
A la fecha, no hay evidencia convincente de la presencia molecular de AR-α2
en el endotelio de la aorta de rata. No obstante, ha sido reportado que la
media y la adventicia de la aorta de rata expresan al ácido ribonucléico
mensajero (ARNm) de los AR-α2D [20, 21]. Las respuestas contráctiles de los
agonistas de AR-α2 en anillos aórticos sin endotelio, han sido usualmente
atribuídas a una acción selectiva con los AR-α2 localizados en el sarcolema
[9-18]; sin embargo, hay controversia al respecto, originada por reportes en
23
los que los AR-α2 funcionales no han podido detectarse en la aorta de rata
[7, 8]. A diferencia de los AR-α1, los AR-α2 funcionales del músculo liso
vascular no se encuentran ampliamente distribuídos en el sistema vascular
[37]. De hecho, la actividad constrictora de los AR-α2 no está presente en las
arterias grandes, está generalmente restringida a las arteria pequeñas, las
arteriolas, y la circulación venosa [37, 38]. En este trabajo, la clonidina y el
UK 14304 produjeron contracción no relacionada con la estimulación de los
AR-α2, en anillos aórticos denudados de endotelio; la contracción fue
relacionada distintivamente con la activación de los AR-α1D. El otro agonista
de AR-α2 evaluado, el BHT 933, no se comportó como un agonista contráctil
en los tejidos aórticos. Estos datos y aquellos obtenidos con los
experimentos de relajación, en concierto, indican que entre los agonistas de
AR-α2 evaluados, los derivados imidazolínicos son los únicos capaces de
interactuar con los AR-α1D.
Finalmente, es importante mencionar que la adición de L-NAME o la
destrucción del endotelio, no modificaron de forma significativa las
contracciones producidas por la fenilefrina o por laPGF2α, como podría
esperarse ya que la liberación basal de ON usualmente atenúa las respuestas
contráctiles en la aorta de rata [9-18]; sin embargo, las contracciones inducidas
por los agonistas después de la inmersión en 1 x 10-4 M de L-NAME mostraron
24
una tendencia consistente a aumentar. De otra forma, el fallo para obtener un
incremento en la contracción inducida por agonistas despues de la remoción del
endotelio en la aorta de rata, ha sido reportada por varios grupos de
investigadores [12, 39, 40].
Conclusión:
Nuestros resultados muestran que el endotelio – y específicamente el ON –
no contribuye a la relajación mediada por los agonistas de los AR-α2 en la
aorta de rata. Aún cuando la clonidina y el UK 14304 producen relajación en
la aorta de rata contraída con agonistas de AR-α1, la relajación no es
relacionada con la activación de AR-α2. La clonidina y el UK 14304 relajan
arterias contraídas con agonistas de AR-α1 pero no aquellas contraídas con
agonistas no adrenérgicos, lo cual sugiere una interferencia selectiva con los
AR-α1; esta es adicionalmente apoyada por el hecho de que las respuestas
contráctiles a ambos agonistas de AR-α2 – en tejidos denudados de endotelio
– son debidas a una interacción con AR-α1D. El otro agonista de los AR-α2
estudiado, BHT 933, un derivado de la azepina, carece de efectos relajante y
contráctil en la aorta de rata. Por tanto, es posible que los agonistas
derivados imidazolínicos, clonidina and UK 14304, debido a su estructura – y
no por su eficacia como agonistas de AR-α2 – sean capaces de una
25
interacción ajustable (en relación con el estado activo de los AR-α1
dependiente de la concentración del agonista), excitatoria e inhibitoria, con
los AR-α1.
Impacto.
La inhibición farmacológica del funcionamiento del sistema nervioso
simpático es de gran utilidad en el tratamiento de la hipertensión arterial. Los
agonistas adrenérgicos α2 son usados para el tratamiento de la hipertensión
arterial principalmente por su capacidad para disminuir la actividad del
sistema nervioso simpático. El entendimiento del papel de los agonistas de
AR-α2 derivados imidazolínicos en diversas funciones fisológicas y
fisiopatológias es fundamental porque la modulación farmacológica de la
actividad de los receptores mencionados tiene implicaciones terapéuticas.
Por tanto, estos resultados deben ser importantes para el sector salud y la
industria farmaceútica.
26
Tabla 1. Efecto inhibitorio del L-NAME de las relajaciones inducidas por la
acetilcolina o el A23187 en anillos aórticos de rata con endotelio intacto
precontraídos con fenilefrina (1 × 10-6 M).
-------------------------------------------------------------------------------------------------------
L-NAME Acetilcolina A23187
[M] - log EC50 % Rmax - log EC50 % Rmax
0 7.08 ± 0.04 82 ± 3 7.77 ± 0.08 88 ± 8
1×10-7 6.24 ± 0.06* 54 ± 4* 7.30 ± 0.07* 62 ± 8
1×10-6 5.81 ± 0.06*# 21 ± 4*# N.D. 7 ± 9*#
1×10-4 5.59 ± 0.08* 9 ± 4* N.D. 9 ± 9*
-------------------------------------------------------------------------------------------------------
Los valores son la media ± SEM de 4-6 experimentos. *P<0.05 versus tejidos
controles. # P<0.05 L-NAME (1 × 10-6 M) versus L-NAME (1 × 10-7 M). Rmax =
% maxima relajation. N.D. = no determinado.
27
-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0
0.4
0.8
1.2
1.6Endo +Endo -
Clonidina, Log [M]
Con
tracc
ión
(g)
-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0
0.4
0.8
1.2
1.6
E +E -
UK 14304, Log [M]
Con
tracc
ión
(g)
-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0
0.4
0.8
1.2
1.6
E+E-
BHT 933, Log [M]
Con
tracc
ión
(g)
Figura 1. Curvas concentración-respuesta de la clonidina, el UK 14304, y el BHT 933 en anillos de aórta torácica de rata con endotelio intacto (Endo +) y denudado (Endo -) precontraídos con fenilefrina (1 × 10-6 M). Los resultados son expresados como reducción del tono contráctil inducido por la fenilefrina. Los valores son la media ± SEM de seis
28
experimentos. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas para cualquier concentración entre las respuestas de un agonista en (Endo -) y (Endo +).
29
-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0
0.4
0.8
1.2
1.601× 10-6
1× 10-4
L-NAME [M]
Clonidina, Log [M]
Con
tracc
ión
(g)
-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0
0.4
0.8
1.2
1.6
UK 14304, Log [M]
Con
tracc
ión
(g)
-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0
0.4
0.8
1.2
1.6
BHT 933, Log [M]
Con
tracc
ión
(g)
Figura 2. Curvas concentración-respuesta de la clonidina, el UK 14304, y el BHT 933 en presencia y ausencia de L-NAME en la aórta torácica de la rata precontraída con fenilefrina (1 × 10-6 M). Los resultados son expresados como reducción del tono contráctil inducido por
30
la fenilefrina. Los valores son la media ± SEM de 4-6 experimentos. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas para cualquier concentración entre las respuestas relajantes de un agonista en tejidos tratados con L-NAME y tejidos controles.
-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0
0.4
0.8
1.201× 10-8
1 × 10-7
Rauwolscine [M]
1× 10-6
** ** * * **
** *
*
*
**
*
Clonidina, Log [M]
Con
tracc
ión
(g)
-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0
0.4
0.8
1.2
* * * * * * **
*
**
UK 14304, Log [M]
Con
tracc
ión
(g)
Figura 3. Efectos de la rauwolscina sobre las relajaciones inducidas por la clonidina y el UK
14304 en la aórta torácica de la rata contraída con fenilefrina (1 × 10-6 M). Los resultados son
expresados como reducción del tono contráctil producido por la fenilefrina. Los valores son la
media ± SEM de 6 experimentos. * P < 0.05 versus control.
31
-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0
0.4
0.8
1.2
1.6
Endo +PG F2α (3× 10-7 M)
(a)Endo -
Clonidina, Log [M]
Con
tracc
ión
(g)
-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0
0.4
0.8
1.2
1.6
UK 14304, Log [M]
Con
tracc
ión
(g)
-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0
0.4
0.8
1.2
1.6
B-HT 933, Log [M]
Con
tracc
ión
(g)
-9.5 -8.5 -7.5 -6.5 -5.5 -4.5 -3.50.0
0.4
0.8
1.2
1.6
ACh, Log [M]
Con
tracc
ión
(g)
Figura 4. Los efectos de la clonidina (a), el UK 14304 (b), el BHT 933 (c), y la acetilcolina
(Ach; d) en la aórta torácica de la rata con endotelio intacto (Endo +) y denudado (Endo -)
precontraída con prostaglandina F2α (PGF2α; 3 × 10-7 M). Los resultados son expresados
32
como cambios del tono contráctil provocado por la PGF2α. Los valores son la media ± SEM
de 4-6 observaciones.
Figura 5 (Izquierda) Curvas concentración-respuesta de la clonidina (a) y el UK 14304 (c) en
la aórta torácica de la rata sin endotelio precontraída con serotonina (5-HT). (Derecha)
Efectos relajantes producidos por la clonidina (b) y el UK 14304 (d) en la aórta torácica de la
rata sin endotelio precontraída con el agonista de adrenoceptores α1, metoxamina. Los
resultados son expresados como cambios en el tono inducido por el agonista contráctil,
respectivamente, serotonina o metoxamina. Los valores son la media ± SEM de 6-8
observaciones.
Figura 6 Antagonismo por el BMY 7378 de las curvas concentración-respuesta contráctil de
la clonidina (a) y el UK 14304 (b) en los anillos de aórta torácica de la rata. Los datos
representan las medias ± SEM de 8 experimentos, y son expresados en gramos (g) de
fuerza desarrollada. Los recuadros representan los trazos de Schild; se presentan las
medias ± SEM de 8 experimentos.
Figura 7 Antagonismo por la Rauwolscina de las curvas concentración–contracción de la
clonidina (a) y el UK 14304 (b) en anillos aórticos sin endotelio. Los datos representan las
medias ± SEM de 8 experimentos, y son expresados en gramos (g) de fuerza desarrollada.