RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

O

48

3. RESULTADOS E DISCUSSO

De seguida, so apresentados os resultados obtidos nos ensaios

realizados com a enzima -galactosidase (E.C. 3.2.1.23) proveniente do

microrganismo Kluyveromyces lactis. Ser feita uma apreciao dos valores

obtidos assim como uma comparao desses mesmos valores com estudos

semelhantes anteriormente realizados.

3.1. Ensaios com a Enzima Sluvel Lactozym 2600L

A enzima utilizada nestes ensaios foi a Lactozym 2600L sob a forma de

soluo. A -galactosidase apresentou uma actividade de 2600 U por grama

de preparao enzimtica. Esta preparao enzimtica apresenta uma

densidade de 1,15 g/mL .

tambm conhecida sob as denominaes de -galactosidase, Hydrolact,

Lactase ou Maxilact.

Todos os ensaios realizados com esta enzima foram efectuados a pH 6,8

pois o pH reportado como o ptimo para esta enzima (43, 44, 45).

Os resultados a seguir apresentados pretendem avaliar o desempenho da

enzima a Lactozym 2600L na hidrlise do substrato padro, o o-nitrofenol--

-galactosideo (o-npg), nas vrias condies experimentais.

Como foi referido anteriormente, os produtos da hidrlise deste

substrato so a galactose e o-nitrofenol (o-np) que um composto de cor

amarela.

3.1.1. Estudo do Efeito da Variao da Concentrao de Enzima

Os resultados que seguidamente so apresentados pretendem demostrar de

que modo a variao de concentrao de enzima influencia a actividade

RES

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enzimtica. Nestes ensaios foi utilizada uma concentrao de substrato padro,

o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 C.

Atravs da anlise do grfico 4., possvel observar que a formao de o-np

depende da concentrao de enzima. A concentrao de enzima mais elevada,

2,3 mg/mL, origina uma concentrao de o-np tambm mais elevada e atinge

um pico mximo aos 45 min, decrescendo consideravelmente dos 60 aos 90

min.

Grfico 4. Efeito da variao da concentrao de enzima livre ao longo do tempo

O facto da concentrao inicial de enzima ser elevada de enzima faz com que

o substrato seja rapidamente convertido, por um lado, e levando ao

aparecimento de galactose, por outro, pois um produto da hidrlise

enzimtica do substrato. A galactose um inibidor competitivo da enzima

diminudo a sua actividade (27,43,46).

A concentrao inicial de enzima de 0,920 mg/mL foi a que demonstrou

melhores resultados. De facto formou-se o-np durante um maior perodo de

tempo, tendo sido registado o seu pico de concentrao aos 90 minutos de

ensaio.

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

1400,00

1600,00

1800,00

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Co

nce

ntr

ao

de

o-n

p (

uM

)

Tempo (min)

1,150 mg/mL

2,300 mg/mL

0,920 mg/mL

0,575 mg/mL

0,460 mg/mL

RES

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50

As concentraes de 0,575 e de 0,460 mg/mL apesar de terem registado

valores de actividade iniciais bastante aceitveis, a partir dos 60 minutos de

ensaios originaram um patamar na converso do o-npg (Grfico 4.).

A concentrao enzimtica de 1,150 mg/mL, sendo a segunda mais elevada

s demonstrou actividade significativa nos primeiros 30 minutos de reaco,

atingindo o o-np um valor de concentrao semelhante aos 90 minutos de

ensaio.

Na avaliao dos resultados no estudo do efeito da concentrao de enzima

livre foi escolhida uma abordagem alternativa que recorre equao clssica de

Henri-MichaelisMenten, empregue por alguns autores e que sugere que a

velocidade inicial de hidrlise, vo pode ser expressa como funo da

concentrao inicial de enzima ([Eo]), ou seja: vo = (Vemax x [Eo])/(Ke + [Eo]).

A relao entre a velocidade inicial aumenta com o aumento de concentrao

enzimtica no entanto esse aumento no linear, tendendo para estabilizar

aquando do emprego de solues enzimticas mais concentradas, devido

saturao da superfcie do substrato.

O modelo escolhido permite calcular o valor das duas constantes Vemax e Ke,

respectivamente 20,3 mM/min e 51 g/mL, e que correspondem velocidade

mxima quando a concentrao enzimtica tende para infinito e concentrao

de enzima correspondente a metade da saturao.

Grfico 5. Efeito da variao da concentrao de enzima livre na actividade enzimtica

0

5

10

15

20

25

0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500

Act

ivid

ade

en

zim

tic

a (0

-np

M

/min

)

Concentrao Enzima Livre (mg/mL)

Exp

Modelo

RES

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51

3.1.2. Estudo do Efeito da Variao da Concentrao de Substrato

Os resultados seguintes pretendem avaliar o efeito da concentrao de

substrato na actividade enzimtica e foram obtidos em ensaios temperatura

de 37 C e com uma concentrao de enzima livre de 0,920 mg/mL.

Os valores representados no grfico 5 sugerem um aumento da actividade

enzimtica com o aumento da concentrao inicial de substrato.

Grfico 6. Efeito da Variao da Concentrao de Substrato na enzima livre

No entanto, e a partir dos 60 minutos de ensaio, a reaco progride mais

lentamente pois a partir deste ponto que o substrato disponvel no meio

reaccional para hidrlise diminui consideravelmente, havendo j, neste ponto

da reaco de hidrlise com a enzima livre, muito produto formado. O produto

formado pela hidrlise do o-npg , como j foi referido, o-np e galactose. Alguns

trabalhos (45) referem que a galactose disponvel no meio funciona como

inibidor competitivo da enzima -galactosidase, fazendo com que deste modo a

reaco seja mais lenta e a enzima demonstre menor actividade enzimtica.

A teoria de inibio da actividade da -galactosidase pela galactose foi antes

confirmada em vrios estudos (22,46,49), principalmente na investigao da

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Co

nce

ntr

ao

de

o-n

p (

uM

)

Tempo (min)

2,5 mM

5 mM

7,5 mM

10 mM

12,5 mM

15 mM

RES

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produo de galacto-oligossacridos atravs da utilizao da actividade

transglicoltica desta enzima.

Grfico 7. Actividade enzimtica da enzima livre s diferentes concentraes de substrato

A influncia da concentrao de o-npg na actividade hidroltica da -

galactosidase nas condies referidas anteriormente foi avaliada com

determinao dos parmetros cinticos. Neste trabalho verificou-se que a

actividade da -galactosidase favorecida com o aumento da concentrao de

substrato de 0,25 at 12,5 mM (Grfico 6).

O modelo de Michaelis-Menten {vo = (Vmax x [S])/(KM + [S])}, ajustado por

regresso no linear, aos pontos experimentais obtidos nos ensaios de

bioconverso (Grfico 6) permitiu a estimativa dos parmetros cinticos:

velocidade mxima, Vmx, de 30,20 mM.min-1, constante de Michaelis-Menten

(constante de afinidade pelo substrato), KM, de 5,27 mM e uma constante

cataltica (kcat) de 32,83 M/min.mg. A constante cataltica corresponde ao

nmero mximo de molculas de substrato, que so convertidas em produto,

por unidade de tempo, por stio cataltico, quando a enzima se encontra

saturada com o substrato.

A eficincia cintica de uma enzima, relativamente a um substrato, avaliada

pela constante de especificidade (kcat/KM), que d uma medida da rapidez, com

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20

Act

ivid

ade

En

zim

tic

a

(

M o

-np

/min

)

Concentrao de Substrato Inicial (mM)

Exp

Model

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que a enzima actua sobre um substrato em baixas concentraes. Esta

constante foi de 0,00623 min-1.mg-1, valor ao qual a enzima atingiu o seu

mximo de eficincia.

Realizando uma anlise comparativa com estudos anteriores, nota-se que, a

com mesma enzima mas proveniente de Kluyveromices fragilis, sob condies

experimentais de pH e temperatura semelhantes, se obteve um KM de 1,7 mM

(43), inferior ao valor de KM de 5,27 aqui obtido. J noutro estudo, de 2012, o

valor de KM obtido nos ensaios com a enzima livre foi de 4,77 mM, tendo sido

neste estudo utilizada exactamente a enzima proveniente tambm de

Kluyveromyces lactis (30).

Um estudo publicado em 2011 (45), realizado com -galactosidase de

Aspergilus oryzae e sob condies experimentais favorveis a esta enzima,

demonstra que a actividade enzimtica favorecida com as concentraes

elevadas de substrato. Este estudo confirma os resultados aqui obtidos.

3.1.3. Estudo do Efeito da Variao da Temperatura

Os ensaios que culminaram na obteno destes resultados foram

realizados com uma concentrao de substrato de 15mM e com uma

concentrao de enzima livre de 0,920 mg/mL. Avaliando o efeito da variao

da temperatura na actividade enzimtica,