2013 Μάρτιος NEWSLETTER Τεύχος 8στον κόσμο στην επιστήμη της...

1

Αγαπητοί συνάδελφοι,

Γράφω αυτό το κείμενο σε ένα τραίνο ταξιδεύοντας για

Θεσσαλονίκη. Έξω από το τραίνο η χειμωνιάτικη με λίγη άνοιξη

φύση αυτής της πολύτιμης γωνιάς του πλανήτη, μέσα ζωηρές συζητήσεις, χαρούμενη

ατμόσφαιρα, σε πείσμα των καιρών, πριν από το τριήμερο της Αποκριάς.

Καθυστέρησε αλήθεια αυτό το δελτίο για πολλούς λόγους αλλά τώρα επιτέλους έφθασε η ώρα

να επικοινωνήσουμε. Και έχουμε να πούμε πολλά καλά και κακά να πούμε, όπως λέγαμε στη

Μπερλίνα τα παλιά τα χρόνια (δεν ξέρω αν οι νεότεροι ξέρουν η έπαιξαν ποτέ Μπερλίνα...)

Μπορούμε να μιλήσουμε για τα νεανικά μάτια που με ενδιαφέρον παρακολουθούν κάθε μήνα

τις παρουσιάσεις των συναδέλφων, που αφορούν τα εργαστήρια. Τι γίνεται μέσα σε ένα

εργαστήριο βιοχημικό, σε ενα ορμονολογικό, σε ενα ανοσολογικό. ρώτησαν τα παιδιά την

επιτροπή νέων. Μαθαίνουμε για μεθόδους, για εξετάσεις, για νοσήματα... Γίνονται αυτά στα

δικά μας εργαστήρια; Ας το κάνουμε, είπαμε. Ας παρουσιάσουμε την πραγματικότητα, την

καθημερινότητα. Και η προσπάθεια πέτυχε και συνεχίζεται και σε ησυχία, με προσοχή

ξετυλίγεται η ρουτίνα και ζωντανεύουν τα γραφεία μας και γεμίζουν οι καρεκλίτσες οι πλιαν. (κι

αυτές μπορεί να μην τις καταλαβαίνουν οι νεότεροι).

Ή να σας πω για τις ημερίδες ποιότητας, που οργανώνει σε διάφορες πόλεις της Ελλάδας το

υπουργείο για να καλέσει τα εργαστήρια σε διαπίστευση ή τουλάχιστον σε εσωτερικό και

εξωτερικό έλεγχο ποιότητας. Παρουσιάζονται οι απόψεις των εχόντων την εμπειρία ή των

φορέων διαπίστευσης, πιστοποίησης, εξωτερικού ελέγχου ποιότητας. Αρκετοί συνάδελφοι

συμμετέχουν ως εκπαιδευτές ή εκπαιδευόμενοι και η Εταιρεία μας παίζει σημαντικό ρόλο. Θα

ήθελα να υπογραμμίσω και από τη θέση αυτή ότι υπάρχουν συνάδελφοι πρόθυμοι και έμπειροι

να βοηθήσουν όσους ξεκινάνε τη διαδικασία. Ελπίζουμε να μπορέσουμε να οργανώσουμε

σχετικό κομμάτι στην ιστοσελίδα μας.

Κι έπειτα ετοιμάζουμε συνέδριο στο Βόλο αυτή τη φορά με τους ενθουσιώδεις συναδέλφους

του Βιοχημικού του Αχιλλοπούλειου νοσοκομείου Βόλου αλλά και της υπόλοιπης Θεσσαλίας.

Αντλεί κανείς θετική ενέργεια από την επαφή με τις άλλες πόλεις της Ελλάδας, αναπνέει πιο

φρέσκο αέρα. Θα βρείτε πληροφορίες σε αυτό το δελτίο και βάλτε στο νου σας... 11-12

Οκτώβρη στο Βόλο για μια νέα συνάντηση, μια διαφορετική άποψη των πραγμάτων. Μη

σκεφθείτε Και πού θα βρω χρήματα... Τρελλοί είναι αυτοί πάλι... Μας κουβαλάνε εποχή κρίσης

στο Βόλο... Δέστε σαν μια νέα πρόκληση! Δέστε το σαν εκδρομή, σαν ευκαιρία να γνωρίσετε τι

γίνεται σε μικρότερες πόλεις της Ελλάδας, με εξίσου ή και καλύτερα οργανωμένα εργαστήρια,

πώς αντιμετωπίζουν τα πράγματα σήμερα ή και στο παρελθόν. Δώστε λοιπόν την ευκαιρία

στους συναδέλφους μας της Θεσσαλίας να σας δείξουν, να σας φιλοξενήσουν, να γίνουν οι

οικοδεσπότες της κλινικής χημείας για λίγες μέρες. Ετοιμάστε τις εργασίες σας. Κάτι έχετε να

πείτε, κάτι έχετε παρατηρήσει, ανακοινώστε το.

Θα προηγηθεί σεμινάριο συνεχιζόμενης εκπαιδευσης για την παιδιατρική κλινική χημεία αρχές

καλοκαιριού, με πολύ ενδιαφέροντα θέματα, καινούργια και ειδικά, που ενδιαφέρουν όμως

όλους, όσους έχουν να κάνουν με παιδιατρικούς ασθενείς.

Αυτά ήταν τα καλά νέα. Ελπίζω να μη με παρεξηγείτε και να θεωρείτε ότι όλα τα βλέπω θετικά

και σαν κάτι παλαιο... σας παροτρύνω να συμμετέχετε σε όλα, και όλα θα λυθούν και όλα θα

λάμψουν, και θα βρούμε τη θέση μας σε αυτή τη χώρα, όπου και την ιδιότητά μας ως

επαγγελματιών υγείας ακούγεται ότι αμφισβητούν. Υπάρχουν και τα κακά, αλλά μάλλον τα

ξέρετε όλοι. Τα βλέπετε κάθε μέρα.

Στη χώρα αυτή, όπου ο Πλάτων δίδαξε την πλήρη διαύγεια «εν αυγή καθαρά», στη χώρα αυτή

επικρατεί η αμφιβολία για την αλήθεια. Ηλίου φαεινότερη είναι η θέση μας, και έτσι

αντιμετωπίζεται σε όλο τον κόσμο... Όμως...

Σε αυτό το δελτίο μπορείτε να διαβάσετε για αυτούς που έτυχαν της υψηλότερης διάκρισης

στον κόσμο στην επιστήμη της χημείας, που φέτος σχετίζεται με τη βιοχημεία, και πιο

συγκεκριμένα με τους υποδοχείς, που συνδέονται με πρωτεΐνες G. Μπορείτε να διαβάσετε και

για το NOBEL ιατρικής, που αφορά στα βλαστοκύτταρα και τον επαναπρογραμματισμό τους.

Σε αυτό το δελτίο μπορείτε να διαβάσετε και τις εργασίες αυτών που βραβεύθηκαν στο

συνέδριό μας. Μελετείστε με ενδιαφέρον τις εργασίες τους. Για να ανέβει το φρόνημά μας. Τις

παρουσίασαν αλλά και τις έγραψαν για μας. Όσο για τους άλλους, τους μεγάλους, που μας

κάνουν παρέα στα δελτία, αν δεν σας πείθω εγώ να αντιμετωπίσετε τους καιρούς με

συμμετοχή, με δουλειά, με μελέτη, μπορεί να τα καταφέρουν αυτοί...

Με φιλικούς χαιρετισμούς

Κατερίνα Ψαρρά

Επιστολή εκδότη

NEWSLETTER 2013 Μάρτιος Τεύχος 8

ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ-

ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Αλωπεκής 47, 10676 Αθήνα

τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

Σε αυτό το τεύχος:

ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ HPLC-

MS/MS ΓΙΑ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΦΑΙΝΥΛΟΚΕΤΟΝΟΥΡΙΑΣ

ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΜΕΛΩΝ ΤΗΣ ΥΠΕΡΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ

ΤΟΥ TNF-α ΣΕ ΜΥΕΣ ΜΕ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ CRH

ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΔΕΡΜΑΤΙΚΗΣ ΤΡΑΥΜΑΤΙΚΗΣ

ΜΕΛΕΤΕΣ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΠΟΥ ΣΥΝΔΕΟΝΤΑΙ ΜΕ

ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ G

ΩΡΙΜΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΠΟΡΟΥΝ ΝΑ

ΕΠΑΝΑΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΤΟΥΝ ΓΙΑ ΝΑ ΓΙΝΟΥΝ

ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΑ

ΓΙΑ ΝΑ ΘΥΜΗΘΗΤΕ...

ΤΟ ΠΑΡΑΠΟΝΟ, ΤΟΥ ΟΔ. ΕΛΥΤΗ

Ε Π Ι Τ Ρ Ο Π Η Σ Υ Ν Τ Α Ξ Η Σ

• Μ . Β ι κ ε ν τ ί ο υ

• Μ . Γ α ρ ο φ α λ ά κ η

• Α . Γ ρ η γ ο ρ ά τ ο υ

• Ε . Κ ώ ν σ τ α

• Κ . Κ ω ν σ τ α ν τ ι ν ά κ ο υ

• Β . Λ ό η

2




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΕΘΟ∆ΟΥ HPLC-MS/MS ΓΙΑ ∆ΙΑΓΝΩΣΗ ΦΑΙΝΥΛΟΚΕΤΟΝΟΥΡΙΑΣ

ΚΑΙ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑΣ ΑΦΥ∆ΡΟΓΟΝΑΣΗΣ ΜΕΣΑΙΑΣ ΑΛΥΣΙ∆ΑΣ ΑΚΥΛΟ-ΣΥΝΕΝΖΥΜΩΝ Α

Μ. Αγγελοπούλου1, Ζ. Τσιάλλα1, Ί. Χριστοφίδης1, Π. Πέτρου1,

Α. Σιαφάκα-Καπάδαη2, Ι. Κανάριος3, Μ. Σιδηροπούλου3, Σ. Κακαµπάκος1

1 Ινστιτούτο Πυρηνικών και Ραδιολογικών Επιστηµών, Ενέργειας, Τεχνολογίας και Ασφάλειας, Ε.ΚΕ.Φ.Ε. «∆ηµόκριτος», Αγία Παρασκευή

15310 2 Εργαστήριο Βιοχηµείας, Τµήµα Χηµείας, Πανεπιστήµιο Αθηνών, Πανεπιστηµιούπολη, Ιλίσσια, 15771 3 Μαιευτήριο ΛΗΤΩ, Τοµέας Νεογέννητων, Αθήνα, 11524

ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΕΣ ΠΑΘΗΣΕΙΣ Ο µεταβολισµός περιλαµβάνει το σύνολο των βιοχηµικών αντιδράσεων που λαµβάνουν χώρα σε έναν ζώντα οργανισµό. Τα ένζυµα

διαδραµατίζουν καθοριστικό ρόλο σε όλες τις µεταβολικές οδούς και για το λόγο αυτό, οποιαδήποτε αλλαγή στη λειτουργία τους λόγω

κάποιας µετάλλαξης στο αντίστοιχο γονίδιο, µπορεί να δηµιουργήσει σοβαρές επιπτώσεις στο µεταβολισµό και κατ’ επέκταση στην υγεία.

Μία γενετική ανωµαλία σε κάποιο ένζυµο ή πρωτεϊνικό µεταφορέα που εµπλέκεται στο µεταβολισµό των πρωτεϊνών, των υδατανθράκων, των

λιπιδίων καθώς και των παράπλευρων συστηµάτων που εµπλέκονται µε αυτόν, ορίζεται ως ενδογενές σφάλµα του µεταβολισµού [1]. Στην

πλειονότητά τους οι µεταβολικές παθήσεις είναι κληρονοµικές µε αυτοσωµικό υπολειπόµενο χαρακτήρα και καθεµία από αυτές παρουσιάζει

διαφορετικούς φαινότυπους ανάλογα µε την ηλικία έναρξης, την κλινική σοβαρότητα και τον τρόπο µεταβίβασης της πάθησης από γενιά σε

γενιά [2].

Η συχνότητα εµφάνισης των µεταβολικών παθήσεων ποικίλει ανάλογα µε την εθνοτική σύνθεση του πληθυσµού. Στην Ευρώπη, η συχνότητα

εµφάνισης µεταβολικών παθήσεων είναι κατά µέσο όρο 1 στις 5.000 γεννήσεις. Οι µεταβολικές παθήσεις εµφανίζονται συνήθως αµέσως µετά

τη γέννηση ή κατά τη διάρκεια τις βρεφικής περιόδου και εξελίσσονται ταχέως, ενώ σε ένα µικρό ποσοστό αυτών τα συµπτώµατα

εµφανίζονται στην παιδική ηλικία [3].

Ο µεταβολικός έλεγχος για την ανίχνευση και τη διάγνωση µίας ή περισσοτέρων διαταραχών είναι πολύ σηµαντικός, ώστε να είναι δυνατή η

θεραπευτική τους αντιµετώπιση. Αναµφισβήτητα, η καταλληλότερη στιγµή για τη διάγνωση κάποιας µεταβολικής πάθησης είναι οι πρώτες

µέρες µετά τη γέννηση [2,4]. Για το λόγο αυτό, κατά τη διάρκεια των τελευταίων 50 ετών εφαρµόζονται παγκοσµίως προγράµµατα νεογνικού

προληπτικού ελέγχου. Η εισαγωγή του νεογνικού ελέγχου έχει συντελέσει στην έγκαιρη διάγνωση και αντιµετώπιση κληρονοµικών και

µεταβολικών ασθενειών και έχει συµβάλλει σηµαντικά στη µείωση της θνησιµότητας καθώς και της νοσηρότητας των νεογνών [5]. Μερικές

από τις παθήσεις που περιλαµβάνονται στα ευρωπαϊκά προγράµµατα ελέγχου είναι η φαινυλοκετονουρία, ο συγγενής υποθυρεοειδισµός, η

συγγενής υπερπλασία επινεφριδίων, η οµοκυστεϊνουρία, η ασθένεια µε χαρακτηριστική οσµή σφενδάµου στα ούρα, η γαλακτοζαιµία, η

ανεπάρκεια αφυδρογονάσης των µεσαίας αλυσίδας ακυλο-CoA, η ανεπάρκεια της παλµιτοϋλο-µεταφοράσης της καρνιτίνης Ι και Ι κ.ά. Η

εισαγωγή της φασµατοµετρίας µαζών στην κλινική ανάλυση επέτρεψε να συµπεριληφθούν στο νεογνικό έλεγχο ασθένειες που σχετίζονται µε

το µεταβολισµό των λιπαρών οξέων και τις οργανικές οξυαιµίες, καθώς επίσης και να αυξήθεί αξιοσηµείωτα ο αριθµό των αµινο-οξυαιµιών

που δύνανται να διαγνωσθούν. Ο αριθµός των παθήσεων που συµπεριλαµβάνονται στο πρόγραµµα νεογνικού ελέγχου ποικίλει από χώρα σε

χώρα και εξαρτάται τόσο από την οικονοµική δυνατότητα κάθε χώρας για πρόληψη όσο και από τα κριτήρια που θέτουν οι πραγµατογνώµονες

των κρατών. Στην Ελλάδα, το εθνικό πρόγραµµα νεογνικού ελέγχου ξεκίνησε το 1974 και σήµερα πραγµατοποιείται από το Ινστιτούτο

Υγείας του Παιδιού. Αρχικά το πρόγραµµα περιελάµβανε τον έλεγχο φαινυλοκετονουρίας. Από το 1983, µε τη συνεισφορά του Εργαστηρίου

Ανοσοδιαγνωστικών Προϊόντων του Ι./Ρ.-Ρ.Π. του Ε.ΚΕ.Φ.Ε. «∆ηµόκριτος», που προσέφερε επισηµασµένη µε ραδιο-ιώδιο (125Ι)

θυρεοειδοτρόπο ορµόνη (TSH) και ανοσοκατακρηµνιστικό αντιδραστήριο για 100.000 µετρήσεις το χρόνο, εντάχθηκε στο πρόγραµµα ο

έλεγχος του συγγενούς υποθυρεοειδισµού. Σήµερα, ελέγχονται επιπλέον, η συγγενής υπερπλασία των επινεφριδίων και η γαλακτοζαιµία.

Ωστόσο στο πρόγραµµα δεν εντάσσονται παθήσεις που απαιτούν τη χρήση φασµατοµετρίας µαζών και για το λόγο αυτό, ο αριθµός των

ελεγχοµένων παθήσεων είναι µικρός σε σύγκριση µε τον αριθµό των παθήσεων που περιλαµβάνονται στα προγράµµατα νεογνικού ελέγχου

άλλων ευρωπαϊκών χωρών.

Στα πλαίσια αυτής της εργασίας, αναπτύχθηκε απλή και σύντοµη µέθοδος υγρής χρωµατογραφίας-φασµατοµετρίας µαζών (HPLC/MS-MS) σε

αποξηραµένές κηλίδες αίµατος µε στόχο τη διάγνωση της φαινυλοκετονουρίας και της ανεπάρκειας της αφυδρογονάσης των µεσαίας

αλυσίδας ακυλοσυνενζύµων Α.

ΦΑΙΝΥΛΟΚΕΤΟΝΟΥΡΙΑ Η φαινυλοκετονουρία (PKU), µία µορφή υπερφαινυλαλανιναιµίας (HPA) είναι αυτοσωµική υπολειπόµενη κληρονοµική διαταραχή του

µεταβολισµού των αµινοξέων, µε συχνότητα εµφάνισης 1 στις 10.000 κατά µέσο όρο, και οφείλεται σε ανεπάρκεια του ηπατικού ενζύµου

υδροξυλάση της φαινυλαλανίνης (PΑΗ). Το ένζυµο αυτό, υπό φυσιολογικές συνθήκες καταλύει την οξείδωση της φαινυλαλανίνης (Phe) σε

τυροσίνη (Tyr). Έτσι, απώλεια ή ανεπάρκεια αυτού του ενζύµου οδηγεί σε αυξηµένα επίπεδα της Phe στο αίµα και τα βιολογικά υγρά ενός

οργανισµού και σε ανικανότητα σύνθεσης Tyr [6] (Σχήµα 1). Η πιο συνηθισµένη αιτία για την έλλειψη της δραστικότητας της PAH είναι µία

γενετική ανωµαλία στο γονίδιο που είναι υπεύθυνο για το ένζυµο PAH [7]. Γενετικές αναλύσεις που πραγµατοποιήθηκαν µέσω τεχνικών

ανασυνδυασµού DNA έδειξαν πως η γενετική περιοχή για την PKU βρίσκεται στο χρωµόσωµα 12q23.2. Το γονίδιο του PAH περιέχει 13

εξόνια συνολικού µήκους 90.000 βάσεων DNA. Η κλασσική µορφή της ασθένειας δεν οφείλεται σε απώλεια ολόκληρου του γονιδίου αλλά σε

µεταλλάξεις στην αλληλουχία του που οδηγούν σε υποκαταστάσεις αµινοξέων ή σε πρόωρη διακοπή της µετάφρασης του γονιδίου. Οι

πλειοψηφία των ασθενών που πάσχουν από PKU έχουν µία ή περισσότερες µεταλλάξεις στο συγκεκριµένο γονίδιο [8]. Μία δευτερεύουσα

αιτία για την εµφάνιση της PKU είναι κάποια διαταραχή στην αναγέννηση ή τη βιοσύνθεση της τετραϋδροβιοπτερίνης (BH4) που αποτελεί

συµπαράγοντα της PAH. Κατά την οξείδωση της Phe σε Tyr η BH4 µετατρέπεται σε κινονοειδή διϋδροβιοπτερίνη (qBH2). Προκειµένου να

συνεχισθεί η δράση του PAH, η ΒΗ4 πρέπει να αναγεννηθεί µέσω της αναγωγάσης της διϋδροπτεριδίνης (Σχήµα 1). Η ανεπάρκεια του

συγκεκριµένου ενζύµου οδηγεί σε ανεπάρκεια της PAH.

3

Σχήµα 1: Οξείδωση της Phe σε Tyr µέσω της υδροξυλάσης της Phe και αναγέννηση του απαραίτητου για την αντίδραση συµπαράγοντα BH4

Υπό φυσιολογικές συνθήκες, όταν η πρόσληψη της Phe από την τροφή είναι ικανοποιητική, ο ανθρώπινος οργανισµός µπορεί εύκολα να

συνθέσει επαρκή ποσότητα Tyr. Το ένζυµο (PAH) καταλύει την οξείδωση της Phe στη θέση 4 του αρωµατικού της δακτυλίου µετατρέποντάς

την σε Tyr, χρησιµοποιώντας µοριακό οξυγόνο και BH4. Η Tyr µέσω διαδοχικών ενζυµικών αντιδράσεων καταβολίζεται σε φουµαρικό, το

οποίο εισέρχεται στον κύκλο του κιτρικού οξέος και µετατρέπεται σε CO2 και H2O καθώς και σε ακετοακετυλο-CoA (κετονοσώµατα). Η

οξείδωση της Phe είναι η κύρια πορεία για τη βιοσύνθεση της τυροσίνης, η οποία αποτελεί πρόδροµη ένωση της ντοπαµίνης και των

κατεχολαµινών, νορεπινεφρίνης και επινεφρίνης (Σχήµα 2) και εµµέσως της µελανίνης και της θυροξίνης.

Τεύχος 8

Σχήµα 2: Κύρια πορεία αποικοδόµησης της Phe. Μεταβολισµός της Tyr σε CO2 και H2O ή ακετοακετυλο-CoA. Μετατροπή της Tyr σε

ντοπαµίνη, νορεπινεφρίνη και επινεφρίνη

Η ανεπάρκεια του ενζύµου PAH οδηγεί σε ανεπάρκεια τόσο της σύνθεσης της Tyr όσο και της παραγωγής των κατεχολαµινών και των

ορµονών που εξαρτώνται από αυτήν, καθώς επίσης και σε αύξηση των επιπέδων της Phe στο αίµα, η οποία είναι τοξική για τον εγκέφαλο.

Όταν η κύρια πορεία παρεµποδιστεί ακολουθείται µία δευτερεύουσα πορεία, η τρανσαµίνωση της Phe (Σχήµα 3). Πιο συγκεκριµένα, όταν η

PAH δεν λειτουργεί τότε η Phe δεν µπορεί να µετατραπεί σε Tyr και τρανσαµινώνεται µε αποτέλεσµα την παραγωγή φαινυλοκετονών, όπως

φαινυλοπυροσταφυλικό, φαινυλοξικό, φαινυλογαλακτικό όπως επίσης και σε ο-υδροξυφαινυλοξικό. Αποτέλεσµα των παραπάνω είναι η

πρόκληση µη αντιστρεπτών βλαβών στο κεντρικό νευρικό σύστηµα.

4

Σχήµα 3: Τρανσαµίνωση της Phe

Στην περίπτωση που η PKU δεν διαγνωστεί ώστε να αντιµετωπιστεί εγκαίρως, οι πάσχοντες µπορεί να εµφανίσουν στους πρώτους 5-6 µήνες

της ζωής τους διανοητική καθυστέρηση, χαρακτηριστική οσµή των ούρων (µούχλα) λόγω της παρουσίας φαινυλοπυροσταφυλικού και άλλων

φαινυλοκετονών και εξανθήµατα που προσοµοιάζουν µε έκζεµα. Στη συνέχεια του βίου τους συµπτώµατα όπως η ανεπαρκής νοητική

ανάπτυξη συνδυαζόµενη µε µικροκεφαλία, η διανοητική και ψυχοκοινωνική καθυστέρηση, τα κινητικά προβλήµατα, η απώλεια µελανίνης

από τα µαλλιά ή το δέρµα και αυξηµένα αντανακλαστικά των µυών καθίστανται περισσότερο έκδηλα [9-11].

Η θεραπευτική αντιµετώπιση των νεογνών µε ανεπάρκεια του PAH περιλαµβάνει αυστηρό περιορισµό της κατανάλωσης πρωτεϊνών και

µείωση του επιπέδου πρόσληψης της Phe σε εκείνο που απαιτείται για την πρωτεϊνική σύνθεση. Λόγω της περιορισµένης πρόσληψης των

φυσικών πρωτεϊνών είναι απαραίτητη η χορήγηση στους ασθενείς ενός µίγµατος αµινοξέων που εµπεριέχει όλα τα απαραίτητα αµινοξέα και

την Tyr για την κάλυψη των απαιτήσεων του οργανισµού σε άζωτo [11,12].

ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΑΦΥ∆ΡΟΓΟΝΑΣΗΣ ΤΩΝ ΜΕΣΑΙΑΣ ΑΛΥΣΙ∆ΑΣ ΑΚΥΛΟ-ΣΥΝΕΝΖΥΜΩΝ A

Η ανεπάρκεια της αφυδρογονάσης των µεσαίας αλυσίδας ακυλο-CoA (MCADD), είναι µία αυτοσωµική υπολειπόµενη πάθηση µε συχνότητα

εµφάνισης 1 στις 10.000 - 15.000 και σχετίζεται µε το µεταβολισµό των λιπαρών οξέων. Η αφυδρογονάση των µεσαίας αλυσίδας ακυλο-CoA

(MCAD), το οποίο είναι το πρώτο ένζυµο της β-οξείδωσης, καταλύει την οξείδωση των µεσαίας αλυσίδας ακυλο-CoA (6-12 άτοµα άνθρακα)

σε trans-∆2- ενοϋλο-CoA µε ταυτόχρονη αναγωγή του FAD σε FADH2 (Σχήµα 4).

Σχήµα 4: Πρώτο στάδιο της β-οξείδωσης. Αφυδρογόνωση των ακυλο-παραγώγων στον C2 µε ταυτόχρονο σχηµατισµό διπλού δεσµού

Ανεπάρκεια ή αδράνεια της MCAD οδηγεί σε αύξηση των επιπέδων των µεσαίας αλυσίδας ακυλο-CoA και των παραγόµενων παραπροϊόντων

τους, ακυλοκαρνιτινών και ακυλογλυκινών στο αίµα και τα ούρα, αντίστοιχα [13].

Το γονίδιο ACADM το όποιο κωδικοποιεί την πρωτεΐνη MCAD βρίσκεται στο χρωµόσωµα 1p31. Περισσότερες από 30 µεταλλάξεις έχουν

ταυτοποιηθεί σε αυτό το γονίδιο, στην πλειοψηφία τους παρανοηµατικές. Η πιο συχνή µετάλλαξη είναι η A985G. Αποτέλεσµα αυτής της

σηµειακής µετάλλαξης είναι η υποκατάσταση της λυσίνης από γλουταµινικό οξύ στη θέση 329 της πρόδροµης πρωτεΐνης, η οποία αντιστοιχεί

στη θέση 304 της ώριµης πρωτεΐνης. ∆ύο αντίγραφα αυτής της συνήθους µετάλλαξης έχουν βρεθεί σε 80% των ατόµων που πάσχουν από

MCADD στην Ευρώπη [13, 14]. Η MCADD είναι η πλέον συνήθης κληρονοµική διαταραχή του µεταβολισµού των λιπαρών οξέων.

Υπο φυσιολογικές συνθήκες, τα µεσαίας αλυσίδας λιπαρά οξέα (εξανοϋλο-, οκτανοϋλο-, δεκανοϋλο- λιπαρά οξέα) απορροφώνται από τον

εντερικό αυλό άµεσα και µέσω της πυλαίας φλέβας εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίµατος και µεταφέρονται στο ήπαρ όπου οξειδώνονται

[15]. Τα µεσαίας και µικρής αλυσίδας λιπαρά οξέα δεν ενεργοποιούνται στο κυτοσόλιο (όπως συµβαίνει µε τα µακράς αλυσίδας λιπαρά οξέα)

αλλά στη µιτοχονδριακή µήτρα όπου µετατρέπονται σε ακυλο-CoA µέσω των αντίστοιχων ακυλο-CoA συνθετασών προκειµένου να

οξειδωθούν [16]. Για την είσοδο των µεσαίας αλυσίδας λιπαρών οξέων στη µιτοχονδριακή µήτρα δεν απαιτείται η σύνδεσή τους µε καρνιτίνη

αλλά πραγµατοποιείται µέσω παθητικής διάχυσης. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, τα µεσαίας αλυσίδας ακυλο-CoA οξειδώνονται προς ακετυλο-

CoA, το οποίο εισέρχεται στον κύκλο του Krebs και στην αναπνευστική αλυσίδα για παραγωγή ενέργειας (Σχήµα 5).

Στην περίπτωση ανεπάρκειας της MCAD, τα µεσαίας αλυσίδας λιπαρά οξέα που έχουν εισέλθει στη µιτοχονδριακή µήτρα και έχουν

ενεργοποιηθεί αλλά και αυτά που προέκυψαν από ατελή οξείδωση των µακράς αλυσίδας λιπαρών οξέων δεν µπορούν να οξειδωθούν λόγω της

ανεπάρκειας αυτού του ενζύµου, που είναι το πρώτο από τα 4 ένζυµα της β-οξείδωσης. Προκειµένου να απελευθερωθεί το συζευγµένο µε τα

λιπαρά οξέα CoA και να συµµετέχει σε άλλες απαραίτητες αντιδράσεις έτσι ώστε να παραχθεί ενέργεια, τα µεσαίας αλυσίδας ακυλο-CoA

συνδέονται µε την καρνιτίνη, συσσωρεύονται µε την µορφή εξανοϋλο-, οκτανοϋλο-, δεκανοϋλο καρνιτίνης (C6, C8 και C10, αντίστοιχα) και

εξέρχονται του κυττάρου. Για το λόγο αυτό, στην πάθηση αυτή παρατηρείται αύξηση των επιπέδων των µεσαίας αλυσίδας ακυλοκαρνιτινών

στο αίµα.




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

5

Σχήµα 5. Μεταβολισµός των µεσαίας αλυσίδας λιπαρών οξέων σε περίπτωση ανεπάρκειας MCAD.

Συνήθως, τα πρώτα συµπτώµατα της MCADD εµφανίζονται νωρίς κατά την παιδική ηλικία, ενώ σε µικρότερο ποσοστό γίνονται αντιληπτά

κατά την εφηβεία. Έχει αναφερθεί ότι οι πάσχοντες από MCADD µπορεί να είναι φυσιολογικοί χωρίς κανένα σύµπτωµα όσο τρέφονται συχνά

ενώ είναι πιθανό να νοσήσουν ξαφνικά µετά από περιόδους νηστείας ή µόλυνσης. Τα κυριότερα από τα συµπτώµατα που παρατηρούνται σε

ασθενείς µε MCADD είναι υποκετονική υπογλυκαιµία, ενώ άλλα χαρακτηριστικά συµπτώµατα είναι υπογλυκαιµικές και µεταβολικές κρίσεις,

τάση για έµµετο, εγκεφαλοπάθεια, λήθαργος, κώµα ή ακόµα και θάνατος [13].

Η σύγχρονη θεραπευτική αντιµετώπιση της MCADD περιλαµβάνει αποφυγή νηστείας, δίαιτα πλούσια σε υδατάνθρακες και περιορισµένη σε

λίπη. Επίσης, απαραίτητη προϋπόθεση είναι η κατανάλωση τακτικών γευµάτων κατά τη διάρκεια της ηµέρας ενώ πρέπει να αποφεύγεται η

νηστεία κατά τη διάρκεια της νύχτας. Παρόλα αυτά, πρέπει να διευκρινιστεί ότι οποιαδήποτε θεραπεία δεν προλαµβάνει 100% τις

νευρολογικές διαταραχές. Ο περιορισµός στην κατανάλωση λίπους είναι αναγκαίος και κυρίως όταν ταυτόχρονα υπάρχει κάποια µόλυνση.

Επίσης, σε καταστάσεις που τα επίπεδα της καρνιτίνης στο αίµα είναι χαµηλά, η χορήγηση σκευασµάτων L-καρνιτίνης είναι αρκετά ωφέλιµη

[17].

ΜΕΘΟ∆ΟΙ ΓΙΑ ΤΗ ∆ΙΑΓΝΩΣΗ PKU και MCADD

Αρχικά, η διάγνωση της PKU επραγµατοποιείτο µέσω του προσδιορισµού των επιπέδων του φαινυλοπυροσταφυλικού οξέος στα ούρα [18].

Ωστόσο, σύντοµα αντικαταστάθηκε από µία ηµι-ποσοτική µέθοδο προσδιορισµού φαινυλαλανίνης µέσω βακτηριακής αναστολής, η οποία

ήταν η πρώτη µέθοδος που εφαρµόστηκε ευρέως για το νεογνικό έλεγχο της PKU σε δείγµατα αίµατος που βρίσκονταν υπό µορφή

αποξηραµένης κηλίδας (Guthrie test) [19]. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκαν φθορισµοµετρικές όσο και ενζυµικές µέθοδοι, οι οποίες βασίζονταν

στον προσδιορισµό της φαινυλαλανίνης. Οι µέθοδοι αυτές, εµφάνιζαν σχετικά υψηλά ποσοστά ψευδώς θετικών αποτελεσµάτων [20-22] και

ήταν αρκετά χρονοβόρες. Επιπλέον, αναπτύχθηκαν χρωµατογραφικές µέθοδοι για την ταυτόχρονη ανίχνευση φαινυλαλανίνης και τυροσίνης

[23-25]. Ο προσδιορισµός των συγκεντρώσεων των δύο αυτών αµινοξέων καθώς και η χρήση του λόγου Phe προς Tyr ως επιπλέον δείκτη για

τη διάγνωση της PKU, περιόρισε σηµαντικά τα ψευδώς θετικά αποτελέσµατα που εµφανίζονταν όταν η διάγνωση βασιζόταν µόνο στον

προσδιορισµό των επιπέδων φαινυλαλανίνης. Οι περισσότερες από τις χρωµατογραφικές µεθόδους απαιτούν παραγωγοποίηση των αµινοξέων,

πριν ή µετά το διαχωρισµό τους στη στήλη, χρησιµοποιώντας διάφορα αντιδραστήρια ανάλογα µε το είδος της ανίχνευσης, µε αποτέλεσµα να

αθίσταται κοπιώδης η προετοιµασία του δείγµατος.

Τα τελευταία χρόνια, η εισαγωγή της φασµατοµετρίας µαζών συνέβαλε στην αύξηση της ευαισθησίας καθώς και στη µείωση του χρόνου

ανάλυσης συγκριτικά µε τις προϋπάρχουσες µεθόδους. Η πλειοψηφία των MS µεθόδων απαιτούν παραγωγοποίηση πριν την ανάλυση των

δειγµάτων [26-28]. Ωστόσο, τα προβλήµατα που µπορεί να παρουσιαστούν κατά την παραγωγοποίηση των δειγµάτων, οδήγησαν στην

ανάπτυξη µεθόδου MS για την ανάλυση αµινοξέων χωρίς τη χρήση αντιδραστηρίων παραγωγοποίησης [29]. Στην µέθοδο αυτή, ο

υπολογισµός των συγκεντρώσεων των αµινοξέων πραγµατοποιείται βάσει του σήµατος του πρώτου θυγατρικού ιόντος, ώστε να αποφευχθούν

ψευδώς θετικά αποτελέσµατα λόγω της πιθανής ύπαρξης ισοβαρών ουσιών ή ιόντων µε το ίδιο m/z στο δείγµα. Το σήµα στην περίπτωση αυτή

είναι εν γένει σηµαντικά χαµηλότερο ως προς το σήµα του προδρόµου ιόντος, µε αποτέλεσµα η µέθοδος να έχει µειωµένη ευαισθησία.

Τεύχος 8

6

Συλλογή δειγµάτων

Αποξηραµένες κηλίδες αίµατος ενηλίκων εθελοντών σε απορροφητικό χαρτί χορηγήθηκαν

ανώνυµα από το ιατρείο του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «∆ηµόκριτος» για προκαταρκτική αξιολόγηση της

µεθόδου. Αποξηραµένες κηλίδες αίµατος νεογνών σε απορροφητικό χαρτί χορηγήθηκαν από το

Μαιευτήριο Λητώ, µε τη σύµφωνη γραπτή γνώµη των γονέων και έγκριση από την επιστηµονική

επιτροπή του µαιευτηρίου. Η λήψη των δειγµάτων έγινε από την πτέρνα των νεογνών µέχρι και 72

ώρες µετά τη γέννησή τους. Οι κηλίδες ξηράνθηκαν επί 4 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου και στη

συνέχεια φυλάχθηκαν σε ξηραντήρα στους - 20 οC, έως την ανάλυση τους.

Παρασκευή προτύπων δειγµάτων και δειγµάτων ελέγχου

Με φυγοκέντρηση ολικού αίµατος από εθελοντή ενήλικα, παρελήφθησαν τα ερυθροκύτταρα, τα

οποία εν συνεχεία εκπλύθηκαν µε φυσιολογικό ορό.

Τα πρότυπα δείγµατα και τα δείγµατα ελέγχου παρασκευάστηκαν µε ανάµειξη ερυθροκυττάρων µε

κατάλληλες ποσότητες ανθρώπινου ορού που περιείχε γνωστές συγκεντρώσεις των προς µέτρηση

ουσίων, ώστε να αντιστοιχούν σε αίµα µε αιµατοκρίτη 50-55%. Κηλίδες αίµατος των προτύπων δειγµάτων εναποτέθηκαν σε ειδικό

απορροφητικό χαρτί, ξηράνθηκαν και φυλάχθηκαν όπως και τα δείγµατα.

∆ιαδικασία ανάλυσης

∆ισκία αποξηραµένων σταγόνων αίµατος σε χαρτί, διαµέτρου 6,4 mm τοποθετήθηκαν στα πλακίδια µικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων. Σε κάθε

φρεάτιο προστέθηκαν 400 µL µεθανόλης και τα δείγµατα ανακινήθηκαν σε οριζόντιο αναδευτήρα επί 20 min στις 250 rpm και στη συνέχεια

τοποθετήθηκαν επί 20 min σε συσκευή υπερήχων. Κατόπιν, από κάθε φρεάτιο ελήφθησαν 300 µL του υπερκειµένου και εξατµίσθηκαν υπό

συνεχή ροή N2. Ακολούθησε ανασύσταση του ξηρού υπολείµµατος µε 50 µL Η2Ο:ACN, v/v, 1:1 ανά φρεάτιο. Για την ανάλυση των

προτύπων δειγµάτων και των δειγµάτων νεογνών µε HPLC-MS/MS, ενέθηκαν 5 µL δείγµατος, η ροή των διαλυτών ήταν 0,2 mL/min, ενώ η

βαθµίδωση των διαλυτών που χρησιµοποιήθηκε περιγράφεται στο Κεφάλαιο «Αποτελέσµατα-Συζήτηση».

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Στo πλαίσιo της εργασίας βελτιστοποιήθηκαν όλες οι παράµετροι που αφορούν την ανίχνευση των ουσιών µε το φασµατογράφο µάζας ΜS/

MS ώστε να λαµβάνεται µέγιστο σήµα για κάθε µία από τις προς ανάλυση ουσίες.

Η µελέτη των παραµέτρων ανίχνευσης των προς µέτρηση ουσιών σε λειτουργία θετικού ιοντισµού ηλεκτροψεκασµού (ESI),

πραγµατοποιήθηκε µε απευθείας έγχυση προτύπων διαλυµάτων των ουσιών στο MS/MS. ∆οκιµάστηκαν διαφορετικές ενέργειες ιοντισµού και

θραυσµατοποίησης και προσδιορίστηκαν οι µεταβάσεις των ιόντων για την ανάλυση των ουσιών. Οι µεταβάσεις των ιόντων που βρέθηκαν

ταυτίζονταν µε τις αναφερόµενες στη βιβλιογραφία και παρουσιάζονται στον Πίνακα 1 µαζί µε τις βέλτιστες συνθήκες θραυσµατοποίησης και

ιοντισµού για την κάθε ουσία.

Πίνακας 1. Μεταβάσεις ιόντων φαινυλαλανίνης, τυροσίνης, ακετυλοκαρνιτίνης, ακυλοκαρνιτινών και παράµετροι ανίχνευσης για το MS/MS.




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

7

Για τον χρωµατογραφικό διαχωρισµό των ουσιών δοκιµάστηκαν διάφορα µίγµατα διαλυτών τόσο µε ισοκρατική όσο και µε βαθµιδωτή

έκλουση καθώς και διαφορετικές ταχύτητες ροής. Η σύσταση των διαλυτών της κινητής φάσης που χρησιµοποιήθηκε στο τελικό πρωτόκολλο

ήταν 0,4 mM επτα-φθορο-βουτυρικό οξύ (HFBA) σε Η2Ο (διαλύτης Α) και 0,1% HCOOH σε ACN (∆ιαλύτης Β). H ροή των διαλυτών ήταν

0,2 mL/min. Για το διαχωρισµό των ουσιών στη στήλη πραγµατοποιήθηκε βαθµιδωτή αλλαγή των διαλυτών από 100:0 Α:Β, έπειτα γραµµική

µεταβολή σε 40:60 Α:Β στα 2,50 λεπτά, γραµµική µεταβολή σε Α:Β Η2Ο÷ACN στα 3 λεπτά και επαναφορά στην αρχική σύσταση, 100:0

Α:Β, στα 4 λεπτά. Ακολούθησε εξισσορόπηση της στήλης για ένα λεπτό. Όπως φαίνεται στο Σχήµα 7, όπου παρουσιάζεται το

χρωµατογράφηµα προτύπου δείγµατος, µε τις συνθήκες που επιλέχθηκαν επιτυγχάνεται πλήρης διαχωρισµός των προς µέτρηση ουσιών.

Σχήµα 7: Χρωµατογράφηµα προτύπου δείγµατος

ΑΝΑΛΥΣΗ ∆ΕΙΓΜΑΤΩΝ

Για τον προσδιορισµό των ουσιών σε αποξηραµένες κηλίδες αίµατος απαιτείται έκλουση των ουσιών απο την κηλίδα µε κατάλληλο διαλύτη

σε συνδυασµό µε υπερήχους, µεταφορά του υπερκειµένου σε άλλο σωλήνα, ξήρανση και ανασύσταση σε µίγµα ACN-H2O ώστε να µην

επηρεαστεί η σύσταση της κινητής φάσης. η όλη διαδικασία θα πρέπει να έχει ως αποτέλεσµα τη µέγιστη δυνατή ανάκτηση των προς µέτρηση

ουσιών απο την κηλίδα. Η βέλτιστη διαδικασία περιελάµβανε εκχύλιση των δειγµάτων µε MeOH υπό ανάδευση 20 λεπτών ακολουθούµενη

από έκθεση των δειγµάτων σε υπερήχους επί 20 λεπτά, ξήρανση και ανασύστασή τους µε µίγµα ACN:Η2Ο 30:70 v/v. Υπό αυτές τις συνθήκες,

το ποσοστό ανάκτησης που προσδιορίστηκε για την κάθε ουσία µε χρήση κηλίδων αίµατος στις οποίες είχαν προστεθεί γνωστές

συγκεντρώσεις δευτεριωµένων ουσιών ήταν υψηλότερο απο 85 % για όλες τις ουσίες.

Οι µέθοδοι που βασίζονται στην απευθείας έγχυση του δείγµατος στο φασµατογράφο µάζας είναι κυρίως ηµι-ποσοτικές, ο δε προσδιορισµός

των προς µέτρηση ουσιών βασίζεται στο λόγο του σήµατος που παρέχεται απο την κάθε ουσία προς το σήµα της αντίστοιχης δευτεριωµένης

ουσίας που προστίθεται στο διάλυµα έγχυσης σε σταθερή συγκέντρωση. Στην παρούσα µελέτη, έχοντας ως στόχο την ανάπτυξη ποσοτικής

µεθόδου πέραν της προσθήκης δευτεριωµένων ουσιών, παρασκευάστηκε σειρά προτύπων δειγµάτων των ουσιών σε αποξηραµένες κηλίδες

αίµατος. Για την ανάλυση των ουσιών χρησιµοποιήθηκαν κηλίδες διαµέτρου 6.4 mm ενώ ο όγκος του δείγµατος έγχυσης ήταν 5 µL.

ΑΝΑΛΥΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Για την εκτίµηση της γραµµικότητας της αναπτυχθείσας µεθόδου παρασκευάστηκαν επτά πρότυπα δείγµατα αποξηραµένων κηλίδων αίµατος

που αντιστοιχούσαν σε µία ευρεία περιοχή συγκεντρώσεων ως προς τον κάθε αναλύτη. Τα πρότυπα αυτά δείγµατα αναλύθηκαν µε την

αναπτυχθείσα µέθοδο και υπολογίστηκε το εµβαδό της επιφάνειας της χρωµατογραφικής κορυφής που αντιστοιχούσε σε κάθε αναλύτη. Για

την κατασκευή της καµπύλης βαθµονόµησης αφαιρέθηκε η τιµή της µηδενικής συγκέντρωσης από τις τιµές των υπολοίπων προτύπων

δειγµάτων και οι καθαρές τιµές που ελήφθησαν για κάθε αναλύτη αντιστοιχήθηκαν µε τη συγκέντρωσή του στο πρότυπο δείγµα. Οι καµπύλες

βαθµονόµησης (Σχήµα 8) ήταν γραµµικές για συγκεντρώσεις από 24 έως 800 µmol/L για την Phe και την Tyr, από 3 έως 100 µmol/L για την

C2 και από 0,1 έως 10 µmol/L για τις C6, C8 και C10 µε συντελεστές συσχέτισης r2 ≥ 0.998. Η γραµµική περιοχή απόκρισης καλύπτει τόσο τη

φυσιολογική περιοχή συγκεντρώσεων όσο και τις συγκεντρώσεις που µπορεί να προσδιοριστούν σε δείγµατα ασθενών µε PKU ή MCADD.

Τεύχος 8

8

Τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης είναι αρκετά χαµηλότερα από τις συγκεντρώσεις των αναλυτών σε δείγµατα µη ασθενών και

εποµένως η ευαισθησία της µεθόδου κρίνεται επαρκής για την ανάλυση πραγµατικών δειγµάτων.

Για τον έλεγχο της ακρίβειας της αναπτυχθείσας µεθόδου, πραγµατοποιήθηκαν πειράµατα ανάκτησης για όλες τις προς µέτρηση ουσίες σε

δείγµατα αίµατος. Βρέθηκε ότι η εκατοστιαία ανάκτηση για την Phe κυµαινόταν από 96 έως 105%, για την Tyr από 97-105%, ενώ για τις C2,

C6, C8, και C10 από 93 έως 109%. Σε όλες τις περιπτώσεις, η ανάκτηση των εξωγενώς προστιθέµενων ουσιών ήταν στα όρια (85-115%) που

απαιτούνται για να χαρακτηριστεί µία µέθοδος ακριβής και αξιόπιστη.

Η ειδικότητα της µεθόδου αξιολογήθηκε συγκρίνοντας τους λόγους σήµατος προδρόµου ιόντος προς θυγατρικό ιόν που προσδιορίστηκαν για

τα πρότυπα διαλύµατα των προς µέτρηση ουσιών σε H2O, τα πρότυπα δείγµατα και τα δείγµατα νεογνών.

Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι δεν υπήρχε αξιοσηµείωτη διαφορά µεταξύ των 3 διαφορετικών µητρών δείγµατος, γεγονός που υποδεικνύει ότι

δεν υπάρχουν παρεµβολές στο σήµα από τα συστατικά της µήτρας του δείγµατος. Εποµένως, η µέθοδος έχει υψηλή ειδικότητα όσον αφορά

τον προσδιορισµό των συγκεκριµένων αναλυτών σε δείγµατα αποξηραµένων κηλίδων αίµατος νεογνών.

0 2 4 6 8 100

5

10

15

20

25

30

Εµ

βα

δόν κ

ορ

υφ

ής

Συγκέντρωση οκτανοϋλο-καρνιτίνης (µmol/L)




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

0 200 400 600 8000

100

200

300

400

500

600

700

Εµ

βα

δό

ν κ

ορ

υφ

ής

Συγκέντρωση Φαινυλαλανίνης (µmol/L)

0 200 400 600 8000

20

40

60

80

100

120

Εµ

βα

δό

ν κ

ορ

υφ

ής

Συγκέντρωση Τυροσίνης (µmol/L)

0 20 40 60 80 1000

50

100

150

200

250

Eµ

βα

δόν κ

ορ

υφ

ής

Συγκέντρωση Ακετυλο-καρνιτίνης (µmol/L)

0 2 4 6 8 100

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Εµ

βα

δόν κ

ορ

υφ

ής

Συγκέντρωση εξανοϋλο-καρνιτίνης (µmol/L)

0 2 4 6 8 100

5

10

15

20

25

30

35

Εµ

βα

δόν κ

ορ

υφ

ής

Συγκέντρωση δεκανοϋλο-καρνιτίνης (µmol/L)

Σχήµα 8: Ενδεικτικές καµπύλες βαθµονόµησης των προς µέτρηση ουσιών. Κάθε σηµείο είναι η µέση τιµή των δύο µετρήσεων

± SD

9

Το όριο ανίχνευσης, το όριο ποσοτικοποίησης καθώς και η ενδο- και δι- αναλυτική διακύµανση για όλες τις προς µέτρηση ουσίες

παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.

Πίνακας 2: Όρια ανίχνευσης, ποσοτικοποίησης, ενδο- και δι-αναλυτική διακύµανση των προς µέτρηση ουσιών

Για τον προσδιορισµό του ορίου κατωφλίου για την καθεµία από τις ουσίες το οποίο αντιστοιχεί στη συγκέντρωση που διαχωρίζει τους

πάσχοντες από τους µη πάσχοντες, αναλύθηκαν 450 δείγµατα νεογνών. Για το σκοπό αυτό, αναλύθηκαν µε την αναπτυχθείσα µέθοδο

αποξηραµένες κηλίδες αίµατος νεογνών σε απορροφητικό χαρτί που χορηγήθηκαν από το Μαιευτήριο Λητώ µε τη συγκατάθεση των γονέων

και µετά από έγκριση από την επιστηµονική επιτροπή του µαιευτηρίου. Από τις τιµές που ελήφθησαν για τα 450 δείγµατα, προσδιορίστηκαν η

ελάχιστη τιµή, η µέγιστη τιµή, η διάµεσος τιµή καθώς και η µέση τιµή και η τυπική απόκλιση των µετρήσεων που αντιστοιχούσαν στο σύνολο

των δειγµάτων. Το όριο κατωφλίου υπολογίστηκε ως η µέση τιµή 450 δειγµάτων συν 2 φορές την τυπική απόκλιση. Τα όρια που

προσδιορίστηκαν παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.

Πίνακας 3: Τιµές ορίων κατωφλίου για τις προς µέτρηση ουσίες

Τα όρια κατωφλίου που υπολογίστηκαν από την ανάλυση των 450 δειγµάτων ήταν εντός του εύρους των ορίων κατωφλίου που έχουν

αναφερθεί στη βιβλιογραφία για όλες τις ουσίες [111].

Η µέθοδος συγκρίθηκε επιπλέον µε µία εµπορικά διαθέσιµη συσκευασία (MassChrom® Amino Acids and Acylcarnitines from Dried Blood

kit,Chromsystems) για τον ηµιποσοτικό προσδιορισµό των ουσιών που αφορούν τόσο την PKU όσο και την MCADD, µέσω της ανάλυσης των

450 δειγµάτων. Ο προσδιορισµός των ουσιών µέσω της εµπορικής συσκευασίας βασίζεται στη χρήση εσωτερικών προτύπων, είναι

ηµιποσοστικός ενώ η διάκριση µεταξύ πασχόντων και φυσιολογικών επιτυγχάνεται βάσει της τιµής δείγµατος ελέγχου που περιλαµβάνεται

στη συσκευασία και του οποίου η συγκέντρωση για κάθε ουσία αντιστοιχεί στις τιµές κατωφλίου. Στο Σχήµα 9 παρουσιάζονται τα

ιστογράµµατα συχνοτήτων των τιµών που ελήφθησαν για 450 δείγµατα και µε τις δύο µεθόδους και όπως φαίνεται, οι τιµές που

προσδιορίστηκαν για όλους τους αναλύτες ήταν παρεµφερείς.

Τεύχος 8

10




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

Σχήµα 9: Ιστογράµµατα συγκεντρώσεων των Phe, Tyr, C2, C6, C8, και C10 που προέκυψαν από ανάλυση 450 δειγµάτων νεογνών. Οι

συµπαγείς ράβδοι αντιπροσωπεύουν τις συγκεντρώσεις των δειγµάτων που προσδιορίστηκαν µε την αναπτυχθείσα µέθοδο, ενώ οι γραµµές

αντιπροσωπεύουν τις συγκεντρώσεις των ίδιων δειγµάτων που προσδιορίστηκαν µε την εµπορική συσκευασία. Οι κάθετες γραµµές

υποδεικνύουν το όριο κατωφλίου.

Eπιπλέον, προκειµένου να αξιολογηθεί η αναπτυχθείσα µέθοδος και από έναν εξωτερικό φορέα, το εργαστήριο έγινε µέλος του Newborn

Screening Quality Assurance Program του Centers for Disease Control and Prevention (CDC) και τα δείγµατα που εστάλησαν αναλύθηκαν µε

την αναπτυχθείσα µέθοδο. Από τα αποτελέσµατα προέκυψε ότι οι τιµές που προσδιορίστηκαν ήταν εντός των αναµενοµένων ορίων σύµφωνα

µε τα στατιστικά στοιχεία που παρέχονται στην αναφορά αυτού του οργανισµού ενώ η ενδοαναλυτική και η διαναλυτική διακύµανση ήταν

µικρότερες του 10% για όλες τις ουσίες.

11

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε για πρώτη φορά µέθοδος HPLC-MS/MS, χωρίς παραγωγοποίηση, για τον ταυτόχρονο ποσοτικό

προσδιορισµό Phe, Tyr καθώς και C2, C6, C8 και C10 σε αποξηραµένες κηλίδες αίµατος νεογνών µε στόχο την ταυτόχρονη διάγνωση της PKU

και της MCADD.

Ο διαχωρισµός των αναλυτών µέσω HPLC, οδήγησε στην εξάλειψη παρεµβολών από τη βιολογική µήτρα. ∆ιαπιστώθηκε ότι υπήρχε υψηλή

ειδικότητα, υψηλή ευαισθησία ανίχνευσης (Phe= 3µmol/L, C8=0.01 µmol/L), ακρίβεια, και επαναληψιµότητα (ενδο-αναλυτική διακύµανση <

12.5 %, δι-αναλυτική διακύµανση < 15 %). Τα αποτελέσµατα που ελήφθησαν από την ανάλυση 450 δειγµάτων ήταν σε συµφωνία µε εκείνα

που ελήφθησαν κατά την ανάλυση των ίδιων δειγµάτων µε εµπορικά διαθέσιµη συσκευασία. Βρέθηκε επίσης ότι υπήρχε συµφωνία µεταξύ

των αποτελεσµάτων που ελήφθησαν µε την αναπτυχθείσα µέθοδο και τον εξωτερικό φορέα ελέγχου. Επιπλέον, ο χρόνος ανάλυσης για κάθε

δείγµα ήταν 5 λεπτά, επιτρέποντας την ανάλυση µεγάλου αριθµού δειγµάτων ανά ηµέρα καθιστώντας την αναπτυχθείσα µέθοδο κατάλληλη

για την εφαρµογή της στο νεογνικό έλεγχο ρουτίνας.

La Marca G., Malvagia S., Donati M. A., Morrone A., Pasquini E. and Zammarchi E., Rapid diagnosis of medium chain Acyl Co-A dehydro-

genase (MCAD) deficiency in a newborn by liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, vol.

17, pp. 2688-2692.

ΑΝΑΦΟΡΕΣ

H. Harris, Genetical theory and the “inborn errors of metabolism”, B.M.J. 1970, vol. 1, pp. 321-237.

Inherited metabolic disorders, http://www.medicinesformankind.eu/upload/pdf/E_inhmeta.pdf (19/2/2012)

J. M. Saudubray, F. Sedel, J. H. Walter, Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: An introduction, J. Inherit. Metab. Dis.,

2006, vol. 29, pp. 261–274.

T. S. Raghuveer, U. Garg, and W. D. Graf, Inborn Errors of Metabolism in Infancy and Early Childhood: An Update, A.F.P., 2006, vol. 73, pp.

1981-1990.

Carroll A. E. and Downs S. M., Comprehensive cost-utility analysis of newborn screening strategies, Pediatrics 2006, vol. 117, pp. s287-s295.

Williams R. A., Cyril D. S. Mamotte, Burnett J. R., Phenylketonuria: An Inborn Error of Phenylalanine Metabolism, Clin Biochem Rev, 2008,

vol. 29, pp. 31-41.

Levy H. L. Ιnvited Editorial: Molecular genetics of Phenylketonuria and its implications, Am. J. Hum. Genet. 1989, vol. 45, pp. 667-670.

Flatmark T., Stevens R. C., Structural Insight into the Aromatic Amino Acid Hydroxylases and Their Disease-Related Mutant Forms, Chem.

Rev., 1999, vol. 99, pp. 2137-2160.

Kaplan A. R., Phenylketonuria: A review, Biochemography and Social Biology, 1962, vol. 9, pp. 151-160.

www.omim.org/entry/261600?search=phenylketonuria&highlight=phenylketouria

de Baulny H. O., Abandie V., Feillet F. and de Parscau L., Management of phenylketonuria and hyperphenylalaninemia, J. Nutr. 2007, vol.

137, pp. 1561S-1563S.

Diet intervention guidelines for adults with untreated PKU http://www.pkunews.org/adults/guide.htm (19-1-2012)

Grosse S., Khoury M., Greene C., Crider K. and Politt R., The epidemiology of medium chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency: An update,

Genet. Med. 2006, vol. 8, pp. 205-212.

Dessein A. F., Fontaine M., Andresen B. S., Gregersen N., Brivet M., Rabier D., Napuri-Gouel S., Dobbelaere D., Mention-Mulliez K., Mar-

tin-Ponthieu A., Briand G., Millington D. S, Vianey-Saban C., Wanders R. J. A. and Vamecq J., A novel mutation of the ACADM gene

(c.145C>G) associated with the common c.985A>G mutation on the other ACADM allele causes mild MCAD deficiency: a case report, Or-

phanet Journal of Rare Diseases 2010, vol. 5, pp. 1-9.

Leonhardt M. and Langhans W., Fatty acid oxidation and control of food intake, Physiology & Behavior, 2004, vol. 83, pp. 645-651.

Schulz H., Encyclopedia of Biochemical Chemistry, Fatty acid oxidation, 2004 Elsevier Inc., vol. 2, p. 90.

Schulz H., Beta oxidation of fatty acids, B.B.A., 1991, vol. 1081, pp. 109-120.

Allen R. J. and Wilson J. L., Urinary phenylpyruvic acid in phenylketonuria, J.A.M.A. 1964, vol. 188, pp. 720-724.

Guthrie R. and Susi A., A simple phenylalanine method for detecting PKU in large populations of newborn infants, Pediatrics 1963, vol. 32,

pp. 338-343.

Schulze A., Mayatepek E. and Hoffmann G. F., Evaluation of 6-year application of the enzymatic colorimetric phenylalanine assay in the set-

ting of neonatal screening for phenylketonuria, Clin. Chim. Acta 2002, vol. 317, pp. 27-37.

Τεύχος 8

12

Gerasimova N. S., Steklova I. V. and Tuuminem T., Fluorometric method for phenylalanine microplate assay adopted for phenylketonu-

ria screening, Clin. Chem. 1989, vol. 35, pp. 2112-2115.

Chace D. H., Millington D. S., Terada N., Kahler S., Roe C. and Hofman L. F., Rapid diagnosis of phenylketonuria by quantitative analysis

for phenylalanine and tyrosine in neonatal blood spots by tandem mass spectrometry, Clin.Chem. 1993, vol. 39, pp. 66-71.

Roesel R. A., Blankenship P. R. and Hommes F. A., HPLC assay of phenylalanine and tyrosine in blood spots on filter paper, Clin. Chim. Acta

1986, vol. 156, pp. 91-96.

Dale Y., Mackey V., Mushi R., Nyanda A., Maleque M. and Ike J., Simultaneous measurement of phenylalanine and tyrosine in phenylketonu-

ric plasma and dried blood by high-performance liquid chromatography, J. Chromatogr. B, 2003, vol. 788, pp. 1-8.

Kand’ar R. and Zakova P., Determination of phenylalanine and tyrosine in plasma and dried blood samples using HPLC with fluorescence

detection, J. Chromatogr. B 2009, vol. 877, pp. 3926-3929.

Chase D., Sherwin J., Hillman S., Lorey F. and Cunningham G., Use of phenylalanine-to-tyrosine ratio determined by mass spectrometry to

improve newborn screening for phenylketonuria of early discharge specimens collected in the first 24 hours, Clin. Chem. 1998, vol. 44, pp.

2405-2409.

Loukas Y. L., Soumelas G. S., Dotsikas Y., Georgiou V., Molou E. l., Thodi Boutsini G. M., Biti S. and Papadopoulos K Expanded newborn

screening in Greece: 30 months of experience, J. Inherit. Metab. Dis. 2010, DOI 10.1007/s10545-010-9181-8.

Schulze A., Kohlmuelter D. and Mayatepek E., Sensitivity of electrospray-tandem mass spectrometry using the phenylalanine/ tyrosine-ratio

for differential diagnosis of hyperphenylalaninemia in neonates, Clin. Chim. Acta 1999, vol. 283, pp. 15-20.

Wang C., Zhang W., Song F., Liu Z. and Liu S., A simple method for the analysis by MS/MS of underivatized amino acids on dry blood spots

from newborn screening, Amino Acids 2011, DOI 10.1007/s00726-011-0910-6.

Zoppa M., Gallo L., Zacchello S. and Giordano G., Method for the quantification of underivatized amino acids on dry blood spots from new-

born screening by HPLC-ESI-MS/MS, J. Chromatogr. B 2006, vol. 831, pp. 267-273.

Waterval W. A. H., Scheijen J. L. J. M., Ortmans-Ploemen M. M. J. C., Habets-van der Poel C. D. and Bierau J., Quantitative UPLC-MS/MS

analysis of underivatized aa in body fluids is a reliable tool for the diagnosis and follow-up of patients with inborn errors of metabolism, Clin.

Chim. Acta 2009, vol. 407, pp. 36-42.

Huang Ζ. Η., Gage D. A., Bieber L. L. and Sweeley C. C., Analysis of acylcarnitines as their N-demethylated ester derivatives by gas chroma-

tography-chemical ionization mass spectrometry, Anal. Biochem., 1991, vol. 199, pp. 98-105.

Costa C. G., Struys E. A., Bootsma A., ten Brink H. J.,. Dorland L, Tavares de Almeida I., Duran M. and Jakobs C., Quantitative analysis of

plasma acylcarnitinesusing gas chromatography chemical ionization mass fragmentography, J. Lipid. Res., 1997, vol. 38, pp. 173-182.

Lowes S. and Rose M. E., Simple and unambiguous method for identifying urinary acylcarnitines usding gas chromatography-mass spectrome-

try, Analyst 1990, vol. 115, pp. 511-516.

Minkler P. E., Ingalls S. T., Kormos L. S., Weir D. E. and Hoppel C. L., Determination of carnitine, butyrobetaine, and betaine as 4’ –

bromophenacyl ester derivatives by hogh performance liquid chromatography, J. Chromatogr., 1984, vol. 336, pp. 271-283.

Minkler P. E. and Hoppel C. L., Determination of free carnitine and ‘total’ carnitine in human urine: derivatization with 4’-bromophenacyl

trifluoromethanesulfonate and high performance liquid chromatography, Clin. Chim. Acta 1992, vol. 212, pp. 55-64.

Vernez L., Thormann W. and Krahenbuhl S., Analysis of carnitine and acylcarnitines in urine by capillary electrophoresis, J. Chromatogr. A,

2000, vol.895, pp.309-316.

Millington D. S., Koda N., Norwood D. L. and Roe C. R., Tandem mass spectrometry: A new method for acylcarnitine profiling with potential

for neonatal screening for inborn errors of metabolism, J. Inherit Metab. Dis. 1990, vol. 13, pp. 321-4.

Rashed M. S., Ozand P. T., Harrison M. E. and Watkins P. J. F., Electrospray tandem mass spectrometry in the diagnosis of organic acidemias,

Rapid. Commun. Mass Spectrom., 1994, vol. 8, pp. 129-133.

Chase D. H., Mass spectrometry in the clinical laboratory, Chem. Rev., 2001, vol. 101, pp. 445-477.

La Marca G., Malvagia S., Donati M. A., Morrone A., Pasquini E. and Zammarchi E., Rapid diagnosis of medium chain Acyl Co-A dehydro-

genase (MCAD) deficiency in a newborn by liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, vol.

17, pp. 2688-2692.




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

13




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΜΕΛΩΝ ΤΗΣ ΥΠΕΡΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ ΤΟΥ T`F-α ΣΕ ΜΥΕΣ ΜΕ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ CRH

ΚΑΤΑ ΤΗ ∆ΙΑΡΚΕΙΑ ∆ΕΡΜΑΤΙΚΗΣ ΤΡΑΥΜΑΤΙΚΗΣ ΕΠΟΥΛΩΣΗΣ Κατερίνα Ρωµανού, Όλγα Ραούλη, Ευθυµία Καραγιάννη, Ανδρεάς Μαργιωρής, Μαρία Βενυχάκη

Εργ. Κλινικής Χηµείας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήµιο Κρήτης– Ηράκλειο, Κρήτη

Τα δερµατικά τραύµατα αποτελούν ένα µείζον ιατρικό πρόβληµα που απορροφά ένα σηµαντικό ποσό των δαπανών για την υγεία. Η

επούλωση των τραυµάτων είναι µία σύνθετη διαδικασία η οποία απαιτεί το συντονισµό και τη συνεργασία διαφόρων τύπων κυττάρων και

µορίων και είναι άρρηκτα συνδεδεµένη µε τη φλεγµονή. Η συµπεριφορά του κάθε κυτταρικού πληθυσµού και η συνεισφορά των παραγόντων,

συστηµατικά και τοπικά παραγόµενων, στις φάσεις της επούλωσης (φλεγµονή-πολλαπλασιασµός-ανάπλαση ιστού) δεν είναι πλήρως

διασαφηνισµένες. Μολονότι η πλήρης αναγέννηση του τραυµατισµένου ιστού συµβαίνει σπάνια σε ενήλικα θηλαστικά, η τραυµατική

επούλωση σε υγιείς οργανισµούς δεν είναι συνήθως προβληµατική και δεν οδηγεί σε σηµαντικές λειτουργικές και αισθητικές αλλοιώσεις.

Παρόλα αυτά πολλά άτοµα υποφέρουν από διαταραχές στην επούλωση όπως συµβαίνει στους ηλικιωµένους, σε άτοµα που βρίσκονται σε

αγωγή µε αντιφλεγµονώδη (και κυρίως γλυκοκορτικοειδή) καθώς επίσης και σε παχύσαρκους ασθενείς.

Ο παράγοντας νέκρωσης όγκων-α (TNF-α) ανήκει στην οµώνυµη υπερ-οικογένεια, η οποία αποτελείται από 29 υποδοχείς και 19 προσδέτες

και εµπλέκεται σε πληθώρα βιολογικών λειτουργιών, όπως στον έλεγχο της ενεργοποίησης και απόπτωσης κυττάρων του ανοσοποιητικού,

στην οµοιόσταση των ιστών κλπ. Η υπερέκφραση του TNF-α επίσης συνδέεται µε µεγάλο αριθµό νόσων, οι οποίες σχετίζονται µε επίµονη

φλεγµονή και ιστική καταστροφή. Τα επίπεδα του TNF-α είναι υψηλά σε µη επουλωµένα έλκη και σχετίζονται µε ανεπαρκή επούλωση σε

ζωικά µοντέλα που πάσχουν από διαβήτη τύπου 2. Χρόνια αύξηση του TNF-α, όπως παρατηρείται σε παχύσαρκους ασθενείς έχει δειχθεί ότι

οδηγεί σε ανεπαρκή δερµατική τραυµατική επούλωση και προκαλεί ελάττωση της παραγωγής του κολλαγόνου, ενώ συστηµατική χορήγηση

αντισωµάτων κατά της κυτοκίνης TNFα αποκαθιστά τη µειωµένη τραυµατική επούλωση σε διαβητικά ob/ob ποντίκια. Εκτός από τον TNF-α

άλλα µέλη της οικογένειας αυτής για τα οποία εκδηλώνεται ολοένα και µεγαλύτερο ενδιαφέρον είναι οι παράγοντες BAFF και TWEAK. Ο

BAFF αναγνωρίσθηκε αρχικά ως παράγοντας που εµπλέκεται στη δηµιουργία λεµφωµάτων και στην εµφάνιση παθήσεων του ανοσολογικού

συστήµατος, αλλά στη συνέχεια εντοπίσθηκε και σε µια σειρά άλλων ιστών µε ή χωρίς ανοσολογική δράση. Ο TWEAK περιγράφηκε αρχικά

ως επαγωγός της απόπτωσης, ωστόσο έκτοτε ανιχνεύθηκε πληθώρα δράσεων αυτού του µορίου. Εκφράζεται σηµαντικά σε κύτταρα

φλεγµονής και δρα µέσω του υποδοχέα του Fn14, ο οποίος εκφράζεται σε επιθηλιακά, µεσεγχυµατικά, ενδοθηλιακά κύτταρα και σε προγονικά

κύτταρα διαφόρων κυτταρικών τύπων. Η έκφρασή του υποδοχέα Fn14 είναι φυσιολογικά χαµηλή, αλλά µετά από τραυµατισµό ενισχύεται,

επαγόµενη από αυξητικούς παράγοντες. Μέσω του υποδοχέα Fn14, ο TWEAK εµπλέκεται στην αποκατάσταση τραυµατισµένων ιστών,

ελέγχοντας διαδικασίες όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση, την κυτταρική µετανάστευση, την αγγειογένεση και τη

φλεγµονή. Υπό φυσιολογικές συνθήκες µετά την ανάπλαση του ιστού, τα επίπεδα του υποδοχέα Fn14 και του παράγοντα TWEAK

επανέρχονται σε χαµηλές τιµές. Ωστόσο, αν διατηρηθεί αυξηµένη η έκφρασή τους, ο ιστός οδηγείται σε χρόνιες καταστάσεις φλεγµονής,

αυξηµένη αγγειογένεση, παθολογική αναδόµηση του ιστού και απορρύθµιση του κυτταρικού πολλαπλασιασµού, καταστάσεις που σχετίζονται

µε την ανάπτυξη υπερπλασιών.

Ενώ έχουν µελετηθεί εκτενώς η παραγωγή και οι δράσεις της κυτοκίνης TNF-α στο δέρµα και στην τραυµατική επούλωση, όπως αναφέρθηκε

και πρωτύτερα, ελάχιστα είναι γνωστά για το ρόλο των παραγόντων BAFF, APRIL και TWEAK σε αυτόν τον ιστό. Αποτελέσµατά µας,

βρισκόµενα υπό δηµοσίευση, καταδεικνύουν την έκφραση των APRIL, BAFF και TWEAK, καθώς και τριών εκ των υποδοχέων τους (BCMA,

TACI και Fn14) σε φυσιολογική επιδερµίδα.

Η υποθαλαµική εκλυτική ορµόνη της κορτικοτροπίνης (CRH) είναι ο κύριος διαµεσολαβητής στην απόκριση του οργανισµού στο στρες,

συµπεριλαµβανοµένης και της φλεγµονώδους διαδικασίας. Είναι επίσης γνωστό ότι η CRH και οι υποδοχείς της εκφράζονται σε πληθώρα

περιφερικών ιστών συµπεριλαµβανοµένου του ανθρώπινου και του δέρµατος των τρωκτικών. Η περιφερική CRH κατέχει ισχυρές

προφλεγµονώδεις δράσεις στο δέρµα και σε άλλους ιστούς. Σε προηγούµενες µελέτες µας χρησιµοποιώντας ποντίκια µε γενετική ανεπάρκεια

της CRH (Crh-/- µύες) έχουµε δείξει ότι τα ζώα αυτά εµφανίζουν ταυτόχρονη ανεπάρκεια γλυκοκορτικοειδών, καθώς και δυο µε τρεις φορές

υψηλότερα επίπεδα TNF-α µετά από επαγωγή φλεγµονής µε διαφορετικά µοντέλα. Επιπλέον, η οµάδα µας έχει πρόσφατα δείξει ότι τα

ποντίκια αυτά έχουν επιταχυνόµενη δερµατική τραυµατική επούλωση.

Βασιζόµενοι σε αυτές τις γνώσεις, ο σκοπός της µελέτης µας ήταν να ερευνήσουµε την έκφραση µελών της υπεροικογένειας του TNF σε Crh-/-

µύες κατά τη διαδικασία της τραυµατικής επούλωσης.

Τα αποτελέσµατα της παρούσας εργασίας δείχνουν ότι η έκφραση του mRNA του TNF-α είναι µεγαλύτερη στα ζώα µε φυσιολογική έκφραση

της CRH (και κατά συνέπεια και των γλυκοκορτικοειδών) την πρώτη ηµέρα µετά την επαγωγή του τραύµατος συγκριτικά µε τα ζώα στα οποία

απουσιάζει η ορµόνη. Σε αντίθεση µε τον TNF-α, η έκφραση του mRNA του TWEAK δε διαφέρει σηµαντικά µεταξύ των δύο µοντέλων ζώων

στις χρονικές στιγµές που µελετήθηκε. Εξωγενής χορήγηση γλυκοκορτικοειδών σε φυσιολογικά επίπεδα, στα ποντίκια µε έλλειψη CRH, έχει

ως αποτέλεσµα τη µείωση των επιπέδων του TNF-α (όπως αναµενόταν) την πρώτη ηµέρα µετά την επαγωγή του τραύµατος. Σε αντίθεση µε

τον TNF-α, η χορήγηση γλυκοκορτικοειδών αύξησε σηµαντικά τα επίπεδα του TWEAK στην περιοχή του τραύµατος την τρίτη µέρα κατά τη

διαδικασία της επούλωσης.

Σχετικά µε την έκφραση των παραγόντων αυτών σε φυσιολογικό δέρµα τα αποτελέσµατά µας έδειξαν ότι η έκφραση του TNF-α και του

TWEAK είναι χαµηλότερη στους µύες µε ανεπάρκεια σε CRH πριν τη χορήγηση γλυκοκορτικοειδών. Τέλος, τα επίπεδα του mRNA του FN14

δεν είχαν σηµαντική διαφορά ανάµεσα στους δυο διαφορετικούς τύπους ποντικιών πριν και µετά την επαγωγή τραύµατος.

Συνοψίζοντας, η γενετική ανεπάρκεια σε CRH και γλυκοκορτικοειδή συνοδεύεται µε διαφοροποιηµένη έκφραση του TNF-α και του TWEAK

κατά τη διάρκεια της δερµατικής τραυµατικής επούλωσης. Τα νέα µας πειράµατα αποσκοπούν να διασαφηνίσουν τον πιθανό ρόλο αυτών των

παραγόντων στην επιταχυνόµενη τραυµατική επούλωση των Crh-/- ποντικών µε τελικό σκοπό να χρησιµοποιηθούν οι παράγοντες αυτοί ως

δείκτες της οµαλής ή όχι επούλωσης των δερµατικών τραυµάτων.

14




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

Μελέτες υποδοχέων που συνδέονται µε πρωτεΐνες G

Με το βραβείο Bobel Χηµείας για το 2012 βραβεύτηκαν οι Brian K. Kobilka και Robert J. Lefkowitz, για τις µελέτες

τους στους υποδοχείς που συνδέονται µε πρωτεΐνες G.

Μετάφραση-Προσαρµογή:

Κωνσταντινάκου Νέλλη, Χηµικός, Msc Βιοχηµείας

«Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry 2012

STUDIES OF G-PROTEIN–COUPLED RECEPTORS»

Οι υποδοχείς που συνδέονται µε πρωτεΐνες G (G-protein-coupled receptors, GPCRs) σχηµατίζουν ένα αξιοθαύµαστο µοριακό σύστηµα που

επιτρέπει τη µετάδοση ποικιλίας σηµάτων διαµέσου της κυτταρικής µεµβράνης, µεταξύ των κυττάρων και µεταξύ σηµείων που απέχουν

αρκετά στο σώµα. Σήµερα, έχουµε κατανοήσει το µοριακό µηχανισµό µε τον οποίο λειτουργούν αυτοί οι υποδοχείς, κυρίως εξαιτίας των

µελετών που έχουν πραγµατοποιήσει οι Brian K. Kobilka και Robert J. Lefkowitz.

Εισαγωγή

Όλα τα ανθρώπινα κύτταρα περιβάλλονται από µια πλασµατική µεµβράνη, τη φωσφολιπιδική διπλοστοιβάδα. Αυτή η µεµβράνη επιτρέπει στα

κύτταρα να έχουν ένα συγκεκριµένο µίγµα βιοχηµικά ενεργών ειδών, αποτρέποντας την είσοδο ανεπιθύµητων συστατικών από τον

περιβάλλοντα χώρο. Για τη σωστή λειτουργία των κυττάρων πρέπει ο βιοχηµικός µηχανισµός εντός του κυττάρου να µπορεί να λαµβάνει

οδηγίες από τον εξωτερικό χώρο.

Μεταβολές στα επίπεδα των ορµονών εξωτερικά των κυττάρων προκαλούν επίκτητες αλλαγές στην ενζυµική δραστικότητα στο εσωτερικό.

Τα µόρια της οσµής επηρεάζουν τα κύτταρα στο οσφρητικό επιθήλιο, ενώ τα συστατικά της τροφής επηρεάζουν τη χηµική δραστηριότητα

στους γευστικούς κάλυκες, οι οποίοι µε τη σειρά τους προκαλούν ηλεκτρικά σήµατα που µεταφέρουν την πληροφορία στον εγκέφαλο.

Τα ανθρώπινα κύτταρα επικοινωνούν διαρκώς τόσο µεταξύ τους όσο και µε τον περιβάλλοντα χώρο, γεγονός που απαιτεί µοριακή

«οργανολογία» και ένα κατάλληλο µηχανισµό για τη σωστή µετάδοση της πληροφορίας διαµέσου της κυτταρικής µεµβράνης. Επιπλέον, η

µετάδοση σήµατος µέσα στο σώµα µπορεί και πρέπει να καλύψει µεγάλες αποστάσεις. Για να µπορεί ο εγκέφαλος να αντιδρά άµεσα

χρειάζεται ταχύτατα πληροφορίες από τις αισθήσεις µας, την όραση, την οσµή, τη γεύση κλπ. Όλα τα παραπάνω απαιτούν ένα µοριακό

µηχανισµό για τη µετάδοση της πληροφορίας πέρα από τη πλασµατική µεµβράνη.

Ο µοριακός σχεδιασµός αποτελείται από υποδοχείς που συνδέονται µε πρωτεΐνες G (G-protein-coupled receptors, GPCRs). Πρόκειται για

πρωτεΐνες που εντοπίζονται στη πλασµατική µεµβράνη. Η ονοµασία τους GPCR οφείλεται σε ένα συνηθισµένο τρόπο µετάδοσης σήµατος

µέσω υποδοχέων εντός των κυττάρων µε πρωτεΐνες συνδεδεµένες µε GTP. Επειδή η πολυπεπτιδική τους αλυσίδα διαπερνά επτά φορές την

πλασµατική µεµβράνη, οι GPCRs αποκαλούνται επίσης επτα-διαµεµβρανικοί υποδοχείς ή υποδοχείς µε επτά διαµεµβρανικές έλικες (seven-

transmembrane receptors, 7TM). Ενεργοποιούν εύρος φυσιολογικών σηµάτων από το εξωτερικό των κυττάρων. Το σήµα µπορεί να αφορά στη

µεταβολή της συγκέντρωσης πεπτιδίων, ορµονών, λιπιδίων, νευροδιαβιβαστών, ιόντων, κλπ., ή ακόµα εισροή φωτονίων στο µάτι. Οι GPCRs

µετατρέπουν αυτά τα σήµατα στο εσωτερικό των κυττάρων και προκαλούν µια σειρά αντιδράσεων που περιλαµβάνει άλλες πρωτεΐνες,

νουκλεοτίδια και µεταλλικά ιόντα, τα οποία τελικά παραδίδουν ένα µήνυµα και προκαλούν την κατάλληλη κυτταρική και φυσιολογική

αντίδραση.

15




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

ΣΧΗΜΑ 1: Σχηµατική αναπαράσταση ενός κυττάρου µε το εσωτερικό του (γαλάζιο χρώµα) και το εξωτερικό του (µπλε χρώµα) χώρο, µε τα

διάφορα χηµικά συστατικά του να διαχωρίζονται από µια φωσφολιπιδική διπλοστοιβάδα. Η διπλοστοιβάδα περιέχει πολλές πρωτεΐνες. Φαίνονται

δυο αντίγραφα GPCRs µε ειδικότητα σε ένα διάχυτο πρόσδεµα (κίτρινο χρώµα). Οι υποδοχείς που συνδέονται µε το πρόσδεµα επηρεάζονται από

τη συγκέντρωση του προσδέµατος. Ο υποδοχέας στα αριστερά δεν είναι συνδεδεµένος και έτσι είναι µη-ενεργοποιηµένος, ενώ ο υποδοχέας στα

δεξιά είναι συνδεδεµένος µε ένα πρόσδεµα, δεµένος µε µια πρωτεΐνη G και έτσι είναι ενεργοποιηµένος. Tο πρόσδεµα δεν διαπερνά την µεµβράνη.

Το σήµα µεταδίδεται από τις στερεοδοµικές αλλαγές που πραγµατοποιούνται στον πρωτεϊνικό υποδοχέα.

Πολλές φυσιολογικές αντιδράσεις στα θηλαστικά εξαρτώνται από τους υποδοχείς 7ΤΜ, οι οποίοι είναι και οι στόχοι πλήθους φαρµακευτικών

σκευασµάτων. Περίπου χίλια ανθρώπινα γονίδια κωδικοποιούν υποδοχείς 7ΤΜ και περιλαµβάνονται στην αίσθηση / ανίχνευση πλήθους

εξωτερικών διεγερτών. Σαν παραδείγµατα µπορούµε να αναφέρουµε αδρενεγικούς υποδοχείς, υποδοχείς ντοπαµίνης, υποδοχείς ισταµίνης, τον

ελαφρύ υποδοχέα ροδοψίνης καθώς και αρκετούς υποδοχείς γεύσης και οσµής.

Ερωτήσεις-Κλειδιά

Οι GPCRs ρυθµίζουν τη ροή πληροφοριών στο εσωτερικό των κυττάρων για τις συνθήκες του εξωτερικού. Πώς επιτυγχάνεται αυτό σε

µοριακό επίπεδο; Ποια είναι τα µόρια που κάνουν αυτή τη δουλειά και πώς αποστέλλουν τελικά το µήνυµα; Πώς γίνεται ο διαχωρισµός

µεταξύ των διαφόρων ειδών σηµάτων; Πώς ρυθµίζονται τα σήµατα; Αυτά ήταν τα κρίσιµα ερωτήµατα για δεκαετίες. Οι ερευνητές για να

βρουν τις απαντήσεις έπρεπε να ταυτοποιήσουν τα µοριακά συστατικά του µηχανισµού µεταγωγής σήµατος και να παρακολουθήσουν τη

δραστηριότητά τους σε βιοχηµικές, βιοφυσικές και δοµικές έρευνες.

Ανακάλυψη και ταυτοποίηση των GPCRs

Τα περισσότερα από όσα γνωρίζουµε σήµερα σχετικά µε τα ενδιαφέροντα µοριακά χαρακτηριστικά των υποδοχέων 7ΤΜ ανακαλύφθηκαν τα

τελευταία 40 χρόνια. Παρόλα αυτά, η ροδοψίνη ταυτοποιήθηκε ως φωτοευαίσθητη χρωστική στις αρχές της δεκαετίας του 1870, και το

οµοιοπολικό πρόσδεµα της το 1933. Η ιστορία των υποδοχέων ενεργοποιηµένων µε προσδέµατα ξεκίνησε έναν αιώνα πριν, όταν αναφέρθηκε

ότι τα αντιδραστικά κύτταρα έχουν ένα «συστατικό υποδοχής» στην επιφάνειά τους. Τα πρώτα πειράµατα µε δείγµατα ιστών έδειξαν τις

αντιδράσεις σε ενεργοποιητές (αγωνιστές) και αναστολείς (ανταγωνιστές). Τον επόµενο µισό αιώνα (περίπου 1920-1970) αναπτύχθηκε η

κλασσική θεωρία των υποδοχέων που βασίζεται στο νόµο της αντίδρασης µάζας και στα δοσο-εξαρτώµενα δεδοµένα.

Μερικά από τα συστατικά σηµατοδοσίας στο εσωτερικό των κυττάρων περιγράφηκαν σε µοριακή βάση προτού περιγραφούν οι υποδοχείς.

Τέτοια είναι o δεύτερος αγγελιοφόρος cAMP (cyclic AMP) και το ένζυµο της αδενυλικής κυκλάσης (Nobel Prize in Physiology or Medicine

1971 to Earl W. Sutherland, Jr.), η πρωτεϊνική κινάση εξαρτωµενη από το cAMP και τις ετεροτριµερικές G-πρωτεΐνες (Nobel Prize in

Physiology or Medicine 1994 to Martin Rodbell and Alfred G. Gillman).

16




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

Η φύση των υποδοχέων που ενεργοποιούνται µε προσδέµατα παρέµεινε αµφισβητήσιµη µέχρι και τη δεκαετία του 1970. Η ύπαρξη των

υποδοχέων ως µεµονωµένων µοριακών οντοτήτων ήταν υπό συζήτηση και υπήρχε ακόµα και η άποψη ότι ο υποδοχέας και το ένζυµο της

αδενυλικής κυκλάσης είναι η ίδια πρωτεΐνη.

Η χηµική σύνθεση των αγωνιστών προσδεµάτων ραδιενεργά επισηµασµένων έπαιξε καθοριστικό ρόλο στην απόδειξη της ύπαρξης των

υποδοχέων αλλά και στην ανίχνευσή τους και την οπτικοποίησή τους πάνω στην πλασµατική µεµβράνη. Ο πρώτος που είχε επιτυχή

αποτελέσµατα σε αυτή τη προσέγγιση ήταν ο Lefkowitz, ο οποίος επισήµανε µε ραδιενεργό ιώδιο την αδρενοκορτικοτροπική ορµόνη και

παρατήρησε τη σύνδεσή της σε αδρενική µεµβράνη κατά τη διάρκεια διεργασιών. Μετά επικεντρώθηκε στη µελέτη των υποδοχέων της

επινεφρίνης (γνωστής ως και αδρεναλίνης).

Η επινεφρίνη είναι µια σηµαντική ορµόνη και νευροδιαβιβαστής που επηρεάζει πολλές φυσικές διαδικασίες, π.χ. τη ρύθµιση του καρδιακού

ρυθµού και της πίεσης του αίµατος. Για να ανταποκρίνονται τα κύτταρα στην επινεφρίνη έχουν ειδικούς υποδοχείς στην πλασµατική

µεµβράνη (αδρενεργικούς υποδοχείς) που αλληλεπιδρούν µε αυτή την ορµόνη. Υπάρχουν τουλάχιστον εννιά διαφορετικοί αδρενεργικοί

υποδοχείς που οµαδοποιούνται ως α- και β-υποδοχείς. ∆ιαφορετικοί ιστοί και όργανα αντιδρούν µε διαφορετικούς τρόπους στην ανεβασµένη

συγκέντρωση της επινεφρίνης. Ένας σηµαντικός στόχος που επιτεύχθη ήταν η ανακάλυψη ειδικών ραδιενεργών προσδεµάτων έναντι των β-

υποδοχέων. Στον συγκεκριµένο χώρο έγινε εύρος µελετών, καθώς αναπτύχθηκε µεγάλος αριθµός ειδικών ραδιενεργών προσδεµάτων µε

περιορισµένη ειδικότητα έναντι υποδοχέων. Τα ραδιενεργά προσδέµατα χρησιµοποιήθηκαν για να προσδιορίσουν ποσοτικά και να

συγκρίνουν τη δράση διαφορετικών αδρενεργικών συστατικών πάνω στη δραστικότητα των β-αδρενεργικών υποδοχέων και της αδενυλικής

κυκλάσης. Η µελέτη της θερµοδυναµικής σύζευξης όταν συνδεόταν το πρόσδεµα και η πρωτεΐνη G έδωσαν πολλές πληροφορίες για το

µηχανισµό µεταγωγής σήµατος.

ΣΧΗΜΑ 2: Αριστερά: Μοντέλο τριµερούς συµπλέγµατος. Ένας θερµοδυναµικός κύκλος περιγράφει το σχηµατισµό ενός συµπλέγµατος του

προσδέµατος (κίτρινο χρώµα), υποδοχέα (µπλε χρώµα) και της πρωτεΐνης G (κόκκινο χρώµα). ∆εξιά: κρυσταλλική δοµή ενός ενεργού τριµερούς

συµπλόκου. [Ribbon model drawn from the coordinates from file 3sn6.pdb using the software Molmol].

Το µοντέλο του τριµερούς συµπλόκου

Το 1980, ένας γενικός µηχανισµός για την ενεργοποίηση του υποδοχέα, το λεγόµενο µοντέλο του τριµερούς συµπλόκου, προτάθηκε από τον

Lefkowitz και τους συνεργάτες του Andre De Lean και Jeffery Stadel. Το τριµερές σύµπλοκο του εξωκυτταρικού προσδέµατος (αγωνιστή),

της GPCR διαµεµβρανικής πρωτεΐνης και της ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης G χρησιµεύουν σαν µια ενεργοποιηµένη µονάδα σήµατος. Ο

αγωνιστής (ορµόνη, νευροδιαβιβαστής, µόριο οσµής, κλπ.) προσδένεται στο εξωκυτταρικό τµήµα του υποδοχέα, ενώ η πρωτεΐνη G

δεσµεύεται στο ενδοκυττάριο τµήµα (Εικόνα 2).

17




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

Η σηµατοδότηση του υποδοχέα βασίζεται σε έναν αλλοστερικό µηχανισµό, και η αλλοστερική σύζευξη είναι αµοιβαία, όπως προκύπτει από

τους νόµους της θερµοδυναµικής. Η πρόσδεση του αγωνιστή αυξάνει τη συγγένεια για τη πρωτεΐνη G στο εσωτερικό του κυττάρου, και η

πρόσδεση της G-πρωτεΐνης αυξάνει την συγγένεια του υποδοχέα για δέσµευση των αγωνιστών αντίστοιχα. Μετά από τρεις δεκαετίες

εξειδικευµένης έρευνας, καταλαβαίνουµε τον µηχανισµό για τη διαµεµβρανική σηµατοδότηση από GPCRs και τη ρύθµιση τους. Ως

επιστέγασµα, ο Kobilka και οι συνεργάτες του αποκάλυψαν την τρισδιάστατη δοµή ενός πλήρως λειτουργικού τριµερούς συµπλόκου σε

υψηλή ανάλυση: του β2-αδρενεργικού υποδοχέα (β2-adrenergic receptor, βAR) σε σύζευξη µε αγωνιστή και πρωτεΐνη G.

Αποµόνωση και καθαρισµός

Η αποµόνωση και ο καθαρισµός λειτουργικών µορφών GPCR σε κυστίδια (µοντέλο σφαιρικών µεµβρανών) για πρώτη φορά επιτεύχθηκε για

τη ροδοψίνη από τον Ruth Hubbard. Οι υποδοχείς ενεργοποιούνται από διαχεόµενα προσδέµατα που βρίσκονται γενικά σε πολύ χαµηλές

ποσότητες, π.χ. σε ιστούς όπως το ήπαρ, οι πνεύµονες και η καρδιά, και η αποµόνωση τους αποτελεί πρόκληση. Οι πρώτες αναφορές για

διαλυτοποιηµένους υποδοχείς ορµονών βαζοπρεσσίνης, θυρεοτροπίνης και των παραθυρεοειδικών αδένων ήρθαν το 1975. Η επιλογή του

απορρυπαντικού αποδείχτηκε να είναι το κλειδί για την διαλυτοποίηση ενός λειτουργικού βΑR από τους Marc Caron και Lefkowitz.

Χρησιµοποίησαν το ίδιο απορρυπαντικό, όπως είχε χρησιµοποιηθεί νωρίτερα στην αποµόνωση λειτουργικής ροδοψίνης, µια ενδιαφέρουσα

σύµπτωση αν λάβουµε υπόψη µας ότι τη συγκεκριµένη χρονική περίοδο η οµολογία στην αλληλουχία µεταξύ των δύο ήταν άγνωστη. Μέθοδοι

χρωµατογραφίας συνάφειας αναπτύχθηκαν για τον καθαρισµό των υποδοχέων, χρησιµοποιώντας ειδικά συζευγµένα προσδέµατα µε

χρωµατογραφία ρητίνης. Με µερικά επιπλέον βήµατα, οι β-αδρενεργικοί υποδοχείς καθαρίστηκαν µε ειδική ενεργότητα σχεδόν ίση της

θεωρητικής.

Μια οικογένεια δοµικά συγγενών υποδοχέων

Ο Lefkowitz και οι συνεργάτες του συνέβαλαν δοµικά όταν κατάφεραν να κλωνοποιήσουν και να αλληλουχήσουν το πρώτο υποδοχέα

επινεφρίνης, βΑR. Με βάση αυτό το έργο, κατέστη σαφές ότι οι GPCRs αποτελούν µία οικογένεια πρωτεϊνών µε στενή δοµική σχέση. Αν και

τα σήµατα που συλλέγονται από GPCRs διαφέρουν ευρέως - κυµαίνονται από φωτόνια και µόρια οσµής ως νευροδιαβιβαστές, ορµόνες και

πεπτίδια - η µετάδοση του σήµατος εντός του κυττάρου επιτυγχάνεται µε έναν τρόπο εξαιρετικά όµοιο µε το κοινό δοµικό πλαίσιο των επτά

διαµεµβρανικών ελίκων.

Πάνω από µια δεκαετία πέρασαν ο Lefkowitz και οι συνεργάτες του αφοσιωµένοι στο να βρουν τα κατάλληλα προσδέµατα, ώστε να

χρησιµοποιηθούν σε χρωµατογραφία συγγένειας. Έµαθαν πώς να καθαρίζουν και πως να χειρίζονται τους βΑR. Αποµόνωσαν επαρκείς

ποσότητες αυτής της χαµηλής σε συγκέντρωση µεµβρανικής πρωτεΐνης από πνεύµονα χάµστερ, για ανάλυση της αλληλουχίας των Ν-τελικών

αµινοξέων των επιµέρους πεπτιδίων. Με βάση αυτή την πληροφορία, κατασκεύασαν εκφυλισµένα ολιγονουκλεοτίδια και τα χρησιµοποίησαν

για την κλωνοποίηση του βΑR γονιδίου. Ο Kobilka, που τότε ήταν νεαρός µεταδιδακτορικός του Lefkowitz, έπαιξε καθοριστικό ρόλο, και

αναγνωρίζεται από τον Lefkowitz για την επιτυχία και την κατασκευή µιας γονιδιωµατικής βιβλιοθήκης DNA ανώτερη από τη cDNA

βιβλιοθήκη που ήταν προηγουµένως διαθέσιµη για το έργο της κλωνοποίησης.

Ευτυχώς, το γονίδιο δεν έχει εσώνια και ολόκληρη η ακολουθία θα µπορούσε να αποκωδικοποιηθεί. Αυτό ήταν ένα σηµαντικό επίτευγµα από

όπου προέκυψε µια εντυπωσιακή έκπληξη: η παρουσία των επτά διαµεµβρανικών ελικών, σε συνδυασµό µε την οµόλογη αλληλουχία µε αυτή

της ροδοψίνης µέσα σε αρκετά από τα διαµεµβρανικά τµήµατα. Οι ερευνητές έχουν καταλήξει στο συµπέρασµα ότι όλοι οι υποδοχείς

συνδεδεµένοι µε πρωτεΐνες G µοιράζονται αυτή την δοµική διάταξη. Αυτό επιβεβαιώθηκε και από τον Shosaku Numa, ο οποίος παρουσίασε

την αλληλουχία ενός τρίτου GPCR: του µουσκαρινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης. Ο Lefkowitz και οι συνεργάτες του, κλωνοποίησαν µια

σειρά συναφών αδρενεργικών υποδοχέων. Ο βΑR και η ροδοψίνη έγιναν τα ιδρυτικά µέλη µιας τεράστιας οικογένειας υποδοχέων και η βάση

για όλες τις µελλοντικές εργασίες στον τοµέα αυτό.

ΣΧΗΜΑ 3. Η πρόβλεψη των επτά ελίκων σε βAR δείχνεται παραπάνω στη ροδοψίνη. Οι οµόλογες αλληλουχίες αµινοξέων στις έλικες πέντε, έξι

και επτά είναι ευθυγραµµισµένες, και οι ίδιες και οι όµοιες περιοχές είναι χρωµατισµένες.

18




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

Μηχανισµός σηµατοδότησης

Μια σηµαντική πτυχή του µηχανισµού σηµατοδότησης είναι ότι το πρόσδεµα δεν διέρχεται διαµέσου της µεµβράνης. Αντ΄αυτού, το σήµα

µεταφέρεται στο εσωτερικό του κυττάρου µε διαµορφωτικές αλλαγές στον πρωτεϊνικό υποδοχέα, οι οποίες οφείλονται στο γεγονός της

σύνδεσης µε το πρόσδεµα. Μία αύξηση στην συγκέντρωση του αγωνιστή στο εξωτερικό του κυττάρου αυξάνει τους υποδοχείς που είναι

δεσµευµένοι σε ένα πρόσδεµα.

Ο πρωτεϊνικός υποδοχέας στη µεµβράνη είναι δυναµικός και µπορεί να λάβει διαφορετικές διαµορφώσεις. Οι δύο κυρίαρχες διαµορφώσεις

ονοµάζονται: ενεργή και ανενεργή. Ο κάθε υποδοχέας έχει υψηλή συγγένεια για λίγους αριθµητικά παρόµοιους αγωνιστές που δεσµεύονται σε

µία συγκεκριµένη θέση στο εξωκυττάριο τµήµα του. Η δέσµευση του αγωνιστή ευνοεί την ενεργή διαµόρφωση του υποδοχέα, και αυξάνει την

συγγένεια για την πρωτεΐνη G στο εσωτερικό του κυττάρου.

Ο καταρράκτης των αντιδράσεων στο εσωτερικό του κυττάρου αρχίζει µε την ανταλλαγή νουκλεοτιδίων και τη διάσπαση της πρωτεΐνης G σε

υποµονάδες (Gα, Gβ και Gγ). Η Gα συνδέεται και διεγείρει ένζυµα όπως την αδενυλική κυκλάση. Έπειτα παράγεται το κυκλικό νουκλεοτιδίο

cAMP, που διαχέεται εύκολα και λειτουργεί ως «δεύτερος αγγελιοφόρος». Άλλες πρωτεΐνες µπορεί να αλληλεπιδράσουν µε τις Gβ και Gγ να

διαµορφώσουν περαιτέρω το σήµα. Η ενεργοποιηµένη διαµόρφωση των GPCR διαρκεί αρκετά ώστε να επιτραπεί σε ένα δεσµευµένο µόριο

αγωνιστή, ή ένα προσροφηµένο φωτόνιο, να ενεργοποιήσει αρκετές G-πρωτεΐνες, ενισχύοντας έτσι το σήµα. Οι αντιδρώσες πρωτεΐνες G

επανέρχονται στην αρχική διαµόρφωση µετά την υδρόλυση του νουκλεοτίδιου και µπορούν να επανεισαχθούν στην κύκλο.

Οι πρώτες γνώσεις σχετικά µε τις δοµικές αλλαγές κατά τη διάρκεια της σηµατοδότησης προήλθαν από βιοχηµικές και βιοφυσικές µελέτες. Οι

Wayne Hubbell και Gobind Khorana διαπίστωσαν ότι οι κινήσεις της έλικας 6 είναι σηµαντικές στο µηχανισµό ενεργοποίησης,

χρησιµοποιώντας φασµατοσκοπία παραµαγνητικού συντονισµού ηλεκτρονίων (EPR) και µεταλλαγµένα spin-επισηµασµένα µόρια κυστεΐνης.

Περαιτέρω λεπτοµέρειες των διαρθρωτικών µεταβάσεων προέκυψαν από µελέτες που χρησιµοποίησαν φθορισµό, φασµατοσκοπία IR, NMR

και φασµατοµετρία µάζας. Τα αποτελέσµατα αυτών των µελετών παρέχουν περαιτέρω λεπτοµέρειες στις δοµικές µεταβάσεις των άκρων, στον

ελεύθερο υποδοχέα έναντι του τριαδικού συµπλόκου. Υπάρχουν διακριτές δοµικές µεταβολές γύρω από τον δεσµευµένο αγωνιστή και

εκτεταµένος επαναπροσανατολισµός των διαµεµβρανικών ελίκων.

Όπως και σε άλλες πρωτεΐνες που µεταδίδουν πληροφορίες εξ αποστάσεως, ένα ελικοειδές πλαίσιο ενισχύει µια µικρή διαµορφωτική αλλαγή

που συµβαίνει στο ένα άκρο της πρωτεΐνης σε µια πολύ µεγαλύτερη διαµορφωτική αλλαγή στο άλλο άκρο. Οι έλικες είναι ραβδοειδές δοµές,

και θα µπορούσε κανείς να φανταστεί ένα 7ΤΜ υποδοχέα σαν µια οµάδα ράβδων βυθισµένη στη µεµβράνη. Εάν ένα πρόσδεµα δεθεί στο ένα

άκρο, η οµάδα ανοίγει σαν ένα µπουκέτο τριαντάφυλλα στο άλλο άκρο. Μικρές µεταβολές στο δίκτυο των αλληλεπιδράσεων της πλευρικής

αλυσίδας γύρω από τη θέση δέσµευσης του αγωνιστή µεταδίδονται σε µεγαλύτερες δοµικές αλλαγές στην ενδοκυττάρια πλευρά. Αυτό ανοίγει

µια θέση σύνδεσης για την πρωτεΐνη G και αποτελεί ένα σήµα που µεταδίδεται από το εξωτερικό προς το εσωτερικό του κυττάρου.

ΣΧΗΜΑ 4 Η δοµική βάση του µηχανισµού

σηµατοδότησης των GPCR. Μη ενεργοποιηµένος

βAR (2bar.pdb) φαίνεται αριστερά, και

ενεργοποιηµένος βAR συνδεδεµένος µε πρόσδεµα

και πρωτεΐνη G (3sn6.pdb) δεξιά. Στην κορυφή, ο

υποδοχέας στην µεµβράνη απεικονίζεται µε µπλε

κορδέλα που ιχνηλατεί τον σκελετό. Η κάτω εικόνα

είναι από το εσωτερικό της κυτταρικής µεµβράνης,

µε τον υποδοχέα να φαίνεται µε τρισδιάστατο

µοντέλο µε τις υδρόφοβες πλευρικές αλυσίδες να

απεικονίζονται µε σκούρο µπλε

19




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

Μια υψηλής ανάλυσης δοµή ενός ενεργού τριµερούς συµπλόκου, βρέθηκε πρόσφατα από τον Kobilka και τους συνεργάτες του. Αυτή η δοµή

του βAR σε σύζευξη µε ετεροτριµερή G-πρωτεΐνη και αγωνιστή, µας παρέχει µια πιο λεπτοµερή µατιά στη δοµική µετάβαση που διέπει το

µηχανισµό ενεργοποίησης µέσω της σύγκρισης µε το µη ενεργοποιηµένο υποδοχέα. Οι µικρές διαρθρωτικές αλλαγές γύρω από το πρόσδεµα

διαδίδονται στο εσωτερικό µε πολύ εντονότερη διαρθρωτική µετάβαση από ό,τι αναµενόταν. Υπάρχει µια µεγάλη µετατόπιση της έλικας 6 και

ένα άνοιγµα µιας βαθιάς υδρόφοβης σχισµής στην ενδοκυττάρια πλευρά του υποδοχέα (Σχήµα 4). Η C-τελική έλικα του Gα εισχωρεί σε αυτή

τη σχισµή και αυτό οδηγεί σε µεγάλες δοµικές αλλαγές στην πρωτεΐνη G, η οποία µε τον τρόπο αυτό ενεργοποιείται. Οι δοµικές αλλαγές

προκύπτουν από την αναδιάταξη του δικτύου των αλληλεπιδράσεων στον υποδοχέα.

Οι εκλεπτυσµένες εξελίξεις στη µοριακή βιολογία των τελευταίων ετών µας έδωσε την ικανότητα να κατασκευαστεί ένα σχετικά σταθερό

τριαδικό σύµπλοκο. Η εγγενής αστάθεια του συµπλόκου του υποδοχέα και της πρωτεΐνης G παρουσίασε µια σηµαντική πρόκληση. Το

σύµπλοκο είναι βραχύβιο, επιτρέποντας πολλές αλλαγές στην ενεργοποίηση της πρωτεΐνης G για κάθε σύνδεση µε πρόσδεµα.

Ένα µακρόβιο τριαδικό σύµπλοκο κατάλληλο για κρυστάλλωση προέκυψε από τον συνδυασµό πέντε βιοχηµικών στρατηγικών: επεξεργασία

µε απυράση του συµπλόκου µε GDP-δεσµευµένη µε πρωτεϊνη G, σταθεροποίηση του συµπλόκου χρησιµοποιώντας ένα πρόσφατα

αναπτυγµένο απορρυπαντικό, επιλογή ενός αντισώµατος καµελίδης - ενός νανοσωµατίδιου που σταθεροποιεί τη Gβ-υποµονάδα σε µια καλά

καθορισµένη χωροδιάταξη -, οµοιοπολική σύζευξη αγωνιστή, και την κλωνοποίηση της Τ4-λυσοζύµης εντός του βρόχου µεταξύ της έλικας 5

και 6 ώστε να µειωθεί η κινητικότητα του. Μελέτες ανταλλαγής ισοτόπων του µη τροποποιηµένου συµπλόκου σε συνδυασµό µε

φασµατοµετρία µάζας, δείχνουν ότι η δοµή του υποδοχέα στο τριαδικό σύµπλοκο είναι ουσιαστικά η ίδια όπως σε ένα µη τροποποιηµένο

σύµπλοκο.

Νεότερες δοµές

Η πρώτη φορά που απεικονίστηκε ένας υποδοχέας 7ΤΜ ήταν η δοµή της ροδοψίνης που βρέθηκε από τους Gebhard Schertler και Richard

Henderson χρησιµοποιώντας µικροσκόπιο κρυο-ηλεκτρονίων, που δείχνει τις επτά α-έλικες στην µεµβράνη. Για να επιτευχθεί υψηλότερη

ανάλυση αλλά και τρισδιάστατες δοµές, ο Tetsuji Okada και οι συνεργάτες του ανέπτυξαν µια στρατηγική καθαρισµού που οδήγησε σε καλώς

περιθλασµένους κρυστάλλους. Οι Krzysztof Palczewski και Okada έλυσαν την τρισδιάστατη δοµή της µη ενεργοποιηµένης ροδοψίνης,

παρέχοντας µια πιο λεπτοµερή άποψη των ελίκων στη µεµβράνη και τους βρόχους.

Η πραγµατοποίηση κρυσταλλογραφικών µελετών ενεργοποιηµένων από πρόσδεµα GPCRs απουσία αγωνιστή αποτελούσε µια πρόκληση

λόγω της σηµαντικής κινητικότητας των υποδοχέων. Ο Kobilka απάντησε σε αυτή την πρόκληση µαζί µε τον Gebhard Schertler και τον

Raymond Stevens χρησιµοποιώντας αντισώµατα, κλωνοποίηση και προσθήκη χοληστερόλης. Σε αυτή τη δοµή, οι έλικες του υποδοχέα είναι

περισσότερο παράλληλες σε σχέση µε το τριαδικό σύµπλοκο, και το ενδοκυττάριο µέρος του υποδοχέα δεν παρουσιάζει καµία µεγάλη

υδρόφοβη επιφάνεια (Σχήµα 4). Η µη-ενεργοποιηµένη δοµή βAR διαφέρει από αυτή της ροδοψίνης στην περιοχή σύνδεσης µε το πρόσδεµα

και σε άλλες περιοχές που παρουσιάζουν ασθενέστερες αλληλεπιδράσεις µεταξύ των κυτταροπλασµατικών άκρων των ελίκων 3 και 6.

Ο Klaus Peter Hofmann παρουσίασε κρυσταλλικές δοµές της οψίνης και της οψίνης δεσµευµένης µε θραύσµα πεπτιδίου από την πρωτεΐνη G

τρανσδουσίνης. Αυτές οι δοµές της ροδοψίνης χωρίς προσδέµατα παρουσιάζουν ένα µερικώς ενεργοποιηµένο υποδοχέα, µε µετατοπισµένη

κλίση και περιστροφή της έλικας 6 και µε σύνδεση του πεπτιδίου G σε µια σχισµή στην ενδοκυττάρια πλευρά.

Ο Kobilka βρήκε την κρυσταλλική δοµή του βAR αγωνιστή συζευγµένου µε ένα νανοσωµατίδιο ως υποκατάστατο για τη G-πρωτεΐνη. Οι

διαρθρωτικές µεταβολές σε σχέση µε τον ανενεργό βAR είναι εντυπωσιακά όµοιες µε τις διαρθρωτικές αλλαγές της οψίνης σε σχέση µε τη

ροδοψίνη. Τα ευρήµατα αυτά εξάλειψαν τον τεχνητό διαχωρισµό ανάµεσα στους υποδοχείς που έχουν ενεργοποιηθεί από πρόσδεµα και

αυτούς που έχουν ενεργοποιηθεί από φως, και ολοκληρώθηκε η δίοδος είχε ανοίξει το 1986 για ένα κοινό διαρθρωτικό πλαίσιο στους GPCRs.

Αυτές οι λεπτοµέρειες που προέρχονται από ροδοψίνη έχουν εµβαθύνει την κατανόηση στους ενεργοποιούµενους από προσδέµατα υποδοχείς,

και αντιστρόφως.

20




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

Οι αναστολείς έχουν µεγάλη φαρµακολογική αξία, και ο Sir James W. Black µοιράστηκε το Βραβείο Νόµπελ Φυσιολογίας & Ιατρικής 1988

για την ανακάλυψη της προπρανολόλης και της σιµετιδίνης, οι οποίες αναστέλλουν τον βAR και τον υποδοχέα της ισταµίνης Η2, αντίστοιχα.

Η προπανολόλη και τα παράγωγά της είναι β-αποκλειστές (β-blockers), που χρησιµοποιούνται στη θεραπεία καταστάσεων που περιλαµβάνουν

καρδιακά προβλήµατα και αυξηµένη αρτηριακή πίεση. Άλλες φαρµακευτικές ενώσεις είναι αγωνιστές, που ενεργοποιούν, για παράδειγµα,

τους υποδοχείς της ντοπαµίνης και της σεροτονίνης και ανακουφίζουν από τη νόσο του Parkinson, την ηµικρανία και νευροψυχιατρικές

καταστάσεις, ή είναι ανάστροφοι αγωνιστές, οι οποίοι εµποδίζουν τη βασική δραστηριότητα, για παράδειγµα, του υποδοχέα GABA που

εµπλέκεται στη µνήµη και τη µάθηση.

Η δοµή του τριαδικού συµπλόκου και µια σειρά από άλλες δοµές παρέχουν µια βάση για την φαρµακολογική ανάπτυξη φαρµάκων µε υψηλή

επιλεκτικότητα, αποτελεσµατικότητα και λίγες παρενέργειες. Οι βιοχηµικές στρατηγικές που αναπτύχθηκαν από τον Kobilka για τους βAR

καθιστούν δυνατή την παραγωγή κρυστάλλων καθώς και άλλων υποδοχέων 7ΤΜ. Αυτές οι τεχνικές έχουν ήδη υιοθετηθεί από άλλες οµάδες

µε σκοπό την παραγωγή κρυστάλλων και να δώσουν υψηλής ανάλυσης δοµές για πλήθος σηµαντικών, από φαρµακευτική άποψη, υποδοχέων.

Αριστερά: Ο Robert J. Lefkowitz (Born: 1943, Bew York, BY, USA, Affiliation at the time of the award: Howard Hughes Medical Institute, Duke University

Medical Center, Durham, BC, USA)

∆εξιά: Ο Brian K. Kobilka (Born: 1955, Little Falls, MB, USA, Affiliation at the time of the award: Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA)

Το µοριακό σύστηµα και σηµατοδότηση ανεξάρτητη από G-πρωτεΐνες

Η GPCR σηµατοδότηση είναι ένα κοµψό µοριακό σύστηµα µε συστατικά που χρησιµοποιούνται ξανά και ξανά για πολλά είδη των σηµάτων.

Ο ίδιος υποδοχέας µπορεί επίσης να σηµατοδοτεί διαµέσου διαφορετικών ενδοκυττάριων οδών ανάλογα µε την ταυτότητα του δεσµευµένου

προσδέµατος. Αυτό οφείλεται στην σχετική ευελιξία του υποδοχέα στην µεµβράνη, η οποία επιτρέπει διαφορετικούς αγωνιστές ή

αντίστροφους αγωνιστές να σταθεροποιούν διαφορετικές ενεργές ή ανενεργές µορφές.

Ο Lefkowitz και οι συνεργάτες βρήκαν οδούς ανεξάρτητες από G-πρωτεΐνες, στις οποίες οι υποδοχείς 7ΤΜ σηµατοδοτούν στο εσωτερικό του

κυττάρου µέσω άλλων πρωτεϊνών, συµπεριλαµβανοµένων των αρρεστινών. Εποµένως, ο όρος «7TM» και όχι ο όρος «GPCR» είναι ο

προτιµώµενος για αυτήν την οικογένεια υποδοχέων. Το µονοπάτι σηµατοδότησης επιλέγεται µε βάση την ταυτότητα του προσδέµατος, και ο

ίδιος 7ΤΜ υποδοχέας µπορεί να εµπλέκεται τόσο στην σηµατοδότηση εξαρτωµένης από G-πρωτεΐνη, όσο και στην ανεξάρτητη από πρωτεΐνη

G . Στην τρέχουσα ορολογία, αυτό αναφέρεται ως «µεροληπτικά προσδέµατα». Η µικρή δοµική µεταβολή στην εξωκυττάρια πλευρά του

υποδοχέα είναι σηµαντική για την ικανότητα των µεροληπτικών προσδεµάτων, ώστε να επιλεχθεί ένα µονοπάτι ενεργοποίησης. Η απόκτηση

περισσότερων πληροφοριών σε αυτό το φαινόµενο και τη δοµική βάση της, θα βελτιώσει την φαρµακολογική εξειδίκευση και την

εκλεκτικότητα µονοπατιού των φαρµάκων που στοχεύουν τους υποδοχείς 7ΤΜ.

21 ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ-



τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

Η µοριακή σχεδίαση της σηµατοδότησης µέσω 7ΤΜ χρησιµοποιείται ακόµη πιο ευρέως από τη φύση. Οι εννέα αδρενεργικοί υποδοχείς

επιτρέπουν ένα µοναδικό φυσιολογικό σήµα της ενισχυµένης συγκέντρωσης επινεφρίνης στο αίµα για να προκαλέσουν διαφορετικές

επιδράσεις σε διάφορα όργανα. Όταν η επινεφρίνη συνδέεται µε τους υποδοχείς στην καρδιά και τους πνεύµονες γίνεται ενεργοποίηση, ενώ

όταν συνδέεται µε τους υποδοχείς στο έντερο γίνεται απενεργοποίηση της διαδικασίας της πέψης. Βιοχηµικές µελέτες των χιµαιρικών

αδρενεργικών υποδοχέων, κατασκευασµένων από µέρη ενός υποδοχέα ενεργοποίησης και µέρη από ένα υποδοχέα φθίνουσας ρύθµισης, έχουν

καθορίσει τα τµήµατα του υποδοχέα που είναι υπεύθυνα για τη δέσµευση προσδέµατος και την ενεργοποίηση της πρωτεΐνης G, αντιστοίχως.

Αυτό έχει εµβαθύνει το επίπεδο της κατανόησης µας στην ποικιλοµορφία του µηχανισµού σηµατοδότησης.

Οµοιοπολικός έναντι µη οµοιοπολικού συνδέτη

Η ροδοψίνη έχει κεντρικό ρόλο στην όραση. ∆ιαφέρει από πολλούς άλλους υποδοχείς 7ΤΜ στο ότι το πρόσδεµα του συνδέεται οµοιοπολικά.

Συνεπώς, η σηµατοδότηση καθίσταται ανεξάρτητη από τη συγκέντρωση του προσδέµατος, και αυτό επιτρέπει στη ροδοψίνη να ανταποκριθεί

σε έναν άλλο τύπο σήµατος: την εισροή του φωτός. Η προσρόφηση ενός φωτονίου µετατοπίζει τη χωροδιάταξη του αµφιβληστροειδούς από

το cis- στο trans-ισοµερές, η οποία προκαλεί µια διαµορφωτική µεταβολή στη ροδοψίνη. Η ενεργή διαµόρφωση ευνοείται από το trans-

ισοµερές, ενώ το cis-ισοµερές σταθεροποιεί την ανενεργή µορφή. Μέσα στο κύτταρο, οι λειτουργίες της ροδοψίνης µέσω µιας πρωτεΐνης G

(τρανσντουσίνης) φωσφοδιεστεράσης και κυκλικού GMP, µοιάζει µε τη σηµατοδότηση του βAR υποδοχέα µέσω πρωτεΐνης G, αδενυλικής

κυκλάσης και cAMP.

Ο κανονισµός των υποδοχέων 7ΤΜ

Πρέπει να υπάρχουν µηχανισµοί για την απενεργοποίηση και τη ρύθµιση του σήµατος από έναν ενεργό GPCR, ειδάλλως το σήµα γίνεται

µόνιµο. Ένα θεµελιώδες ερώτηµα είναι, ως εκ τούτου, ποιοι µοριακοί µηχανισµοί ρυθµίζουν και τερµατίζουν το σήµα;

Βιοχηµικές µελέτες που πραγµατοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του 1970 και του 1980 µας παρέχουν αρκετές απαντήσεις. Το

σήµα µπορεί να διακοπεί από τη διάσπαση του αγωνιστή, αλλά µπορεί επίσης να τερµατιστεί ή µειωθεί η ρύθµιση µέσω της βιοχηµικής

ρύθµισης του υποδοχέα. Η έκθεση σε πρόσδεµα µπορεί να οδηγήσει σε φθίνουσα ρύθµιση. Η φωσφορυλίωση του ενδοκυτταριού τµήµατος

καθιστά τον υποδοχέα λιγότερο ευαίσθητο στην συγκέντρωση του προσδέµατος ή στο φως. Με άλλα λόγια, ο υποδοχέας καθίσταται

απευαισθητοποιηµένος. Ειδικά ένζυµα διεξαγάγουν αυτή τη χηµική τροποποίηση, για παράδειγµα, οι β-αδρενεργικοί υποδοχείς κινασών και η

κινάση ροδοψίνης. Η φωσφορυλίωση αυξάνει τη συγγένεια του υποδοχέα για ρυθµιστικές πρωτεΐνες που ονοµάζονται αρρεστίνες, που

οδηγούν σε περαιτέρω φθίνουσα ρύθµιση. Ο Kobilka διαπίστωσε ότι η εσωτερικοποίηση µέσω ενδοκυττάρωσης και η ανακύκλωση των

υποδοχέων αποτελεί άλλο µηχανισµό για τη ρύθµιση της σηµατοδότησης του υποδοχέα.

Σε ορισµένες γενετικές ασθένειες, οι µεταλλάξεις προκαλούν βασική δραστικότητα υποδοχέα. Οι µελέτες αυτών των µεταλλάξεων από τον

Lefkowitz µας παρέχουν πληροφορίες για ποιες ενδοµοριακές αλληλεπιδράσεις διατηρούν το κανονικό υποδοχέα ανενεργό όταν απουσιάζει ο

δεσµευµένος αγωνιστής. Σε µία θέση αδρενεργικού υποδοχέα, ανακάλυψε ότι άλλα 19 αµινοξέα, εκτός από το φυσικό ένα, οδηγούν σε

αύξηση της δραστικότητας. Η δραστικότητα του υποδοχέα µπορεί επίσης να διαµορφώνεται από τη σύνδεση των υποδοχέων της µεµβράνης

για να σχηµατιστούν οµο-ή ετεροδιµερή ή υψηλότερες ακόµα διατάξεις.

Βιβλιογραφία

Takeda S, Kadowaki S, Haga T, Takaesu H, Mitaku S (2002) Identification of G protein-coupled receptor genes from the human genome sequence. FEBS Lett 520, 97-101.

Fredriksson R, Lagerström MC, Lundin L-G, Schiöth HB (2003) The G-Protein-Coupled Receptors in the Human Genome Form Five Main Families. Phylogenetic Analysis, Paralogon

Groups, and Fingerprints. Mol Pharmacol 63, 1256-1272.

Wald G (1933) Vitamin A in the retina. Bature 132, 316.

Langley JN (1901) Observation on the physiological action of extracts of the supra-renal bodies. J Physiol (London) 17, 231-256

Dale HH (1906) On some physiological actions of ergot. J Physiol (London) 34, 163-206.

Furchgott RF (1964) Receptor mechanisms. Annu Rev Pharmacol 4, 21-50.

Rall TW, Sutherland EW (1958) Formation of a cyclic adenine ribonucleotide by tissue particles. J Biol Chem 232, 1065-1076.

Walsh DA, Perkins JP, Krebs EG (1968) An adenosine 3’,5’-monophosphate-dependent protein kinase. J Biol Chem 243, 3763-3765.

Rodbell M, Birmbaumer L, Posh SL, Krans HM (1971) The glucagon-sensitive adenylyl-cyclase system in plasma membranes of rat liver. V. An obligatory role of guanyl-nucleotides

in glucagon action. J Biol Chem 246, 1877-1882.

Ross EM, Gilman AG (1977) Resolution of some components of adenylate cyclase necessary for catalytic activity. J Biol Chem 252, 6966-6969.

Gilman AG (1987) G proteins: transducers of receptor-generated signals. Annu Rev Biochem 56, 615-649. 11 (15)

Lefkowitz RJ, Roth J, Pricer W. Pastan I (1970) ACTH receptors in the adrenal: specific binding of ACTH-125I and its relation to adenylyl cyclase. Proc Batl Acad Sci USA 65, 745-

752.

22




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

Lefkowitz RJ, Roth J, Pastan I (1970) Radioreceptor assay for adrenocorticotropic hormone: new approach to assay of polypeptide hormones

in plasma. Science 170, 633-635.

Levitzki A, Atlas D, Steer ML (1974) The binding characteristics and number of beta-adrenergic receptors on the turkey erythrocyte. Proc Batl

Acad Sci USA 71, 2773-2776.

Lefkowitz RJ, Mukherjee C, Coverstone M, Caron M (1974) Stereospecific (3H)(minus)-alprenolol binding sites, beta-adrenergic receptors

and adenylate cyclase. Biochem Biophys Res Commun 60, 703-709.

Aurbach GD (1974) Beta-adrenergic receptor: strereospecific interaction of iodinated beta-blocking agent with high affinity site. Science 186,

1223-1224.

De Lean A, Stadel JM, Lefkowitz RL (1980) A ternary complex model explains the agonist-specific binding properties and the adenylate cy-

clase-coupled beta-adrenergic receptor. J Biol Chem 255, 7108-7117.

Limbird LE, Gill DM, Lefkowitz RL (1980) Agonist-promoted coupling of the beta-adrenergic receptorwith the guanine nucleotide regulatory

protein of the adenylate cyclase system. Proc Batl Acad Sci USA 77, 775-779.

Rasmussen SG, DeVree BT, Zou Y, Kruse AC, Chung KY, Kobilka TS, Thian FS, Chae PS, Pardon E, Calinski D, Mathiesen JM, Shah ST,

Lyons JA, Caffrey M, Gellman SH, Steyaert J, Skiniotis G, Weis WI, Sunahara RK, Kobilka BK (2011) Crystal structure of the hu-

man beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Bature 477, 549-555.

Koradi R, Billeter M, Wüthrich K (1996) MOLMOL; a program for display and analysis of macromolecular structures. J Mol Graph 14, 51-55,

29-32.

Hubbard R (1954) The molecular weight of rhodopsin and nature of the rhodopsin-digitonin complex. J Gen Physiol 37, 381-399.

Tate RL, Schwartz HI, Holmes JM, Kohn LD (1975) Thyrotropin receptors in thyroid plasma membranes. Characteristics of thyrotropin bind-

ing and solubilization of thyrotropin receptor activity by tryptic dihestion. J Biol Chem 250, 6509-6515.

Roy C, Rajerison R, Bockaert J, Jard S (1975) Solubilization of the [8-lysine]vasopressin receptor and adenylate cyclase from pig kidney

plasma membrane. J Biol Chem 250, 7885-7893.

Malbon CC, Zull JE (1975) Solubilization of parathyroid hormone receptor from bovine kidney cortex plasma membranes. Biochem Biophys

Res Commun 66, 179-187.

Caron MG, Lefkowitz RJ (1976) Beta-adrenergic receptors: solubilization of (-)(3H)alprenolol binding sites from frog erythrocyte membranes.

Biochem Biophys Res Commun 68, 315-322.

Caron MG, Lefkowitz RJ (1976) Solubilization and characterization of beta-adrenergic receptors binding sites from frog erythrocytes. J Biol

Chem 251, 2374-2384.

Vauquelin G, Geynert P, Hanoune J, Strosberg AD (1977) Isolation of adenylate cyclase-free, beta-adrenergic receptor from turkey erythrocyte

membranes by affinity chromatography. Proc Batl Acad Sci USA 74, 3710-3714. 12 (15)

Caron MG, Srinivasan Y, Pitha J, Kociolek K, Lefkowitz RJ (1979) Affinity chromatography of the beta-adrenergic receptor. J Biol Chem 254,

2923-2927.

Vauquelin G, Geynet P, Hanoune J, Strosberg AD (1979) Affinity chromatography of the beta-adrenergic receptor from turkey erythrocytes.

Eur J Biochem 98, 543-546.

Shorr RG, Lefkowitz RJ, Caron MG (1981) Purification of the beta-adrenergic receptor. Identification of the hormone bining subunit. J Biol

Chem 256, 5820-5826.

Shorr RG, Heald SL, Jeffs PW, Lavin TN, Strohsacker MW, Lefkowitz RJ, Caron MG (1982) The beta adrenergic receptor: rapid purification

and covalent labeling by photoaffinity crosslinking. Proc Batl Acad Sci USA 79, 2778-2782.

Benovic JL, Shorr RG, Caron MG, Lefkowitz RJ (1984) The mammalian beta 2-adrenergic receptor: purification and characterization. Bio-

chemistry 23, 4510-4518.

Dixon RA, Kobilka BK, Strader DJ, Benovic JL, Dohlman HG, Frielle T, Bolanowski MA, Bennet CD, Rands E, Diehl RE, Mumford RA,

Slater EE, Sigal IS, Caron MG, Lefkowitz RJ, Strader CD (1986) Cloning of the gene and cDNA for mammalian beta-adrenergic

receptor: primary structure and membrane topology. Bature 321, 75-79.

Kobilka KB, Frielle T, Dohlman HG, Bolanowski MA, Dixon RA, Keller P, Caron MG, Lefkowitz RJ (1987) Delineation of the intronless

nature of the genes for the human and hamster beta 2-adrenergic receptor and their putative promoter regions. J Biol Chem 262,

7321-7327.

Ovchinnikov YA (1982) Rhodopsin and bacteriorhodopsin: structure-function relationships. FEBS Lett 148, 179-191.

Hargrave PA, McDowell JH, Curtis DR, Wang JK, Juszczak E, Fong SL, Rao JK, Agros P (1983) The structure of bovine rhodopsin. Biophys

Struct Mech 9, 235-244.

Nathans J, Hogness DS (1983) Isolation, sequence analysis, and intron-exon arrangement of the gene encoding bovine rhodopsin. Cell 34, 807-

814.

23




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

Kubo T, Fukuda K, Mikami A, Maeda A, Takahashi H, Mishina M, Haga T, Haga K, Ichiyama A, Kangawa K, Kojima M, Matsuo H, Hirose

T, Numa S (1986) Cloning sequencing and expression of complementary DNA encoding the muscarinic acetylcholine receptor. Ba-

ture 323, 411-416.

Lefkowitz RJ (2004) Histrorical review; A brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol Sci

25, 413-422.

Lefkowitz RJ (2007) Seven-transmembrane receptors: something old, something new. Acta Physiol 190, 9-19.

Ross EM, Gilman AG (1980) Biochemical properties of hormone-sensitive adenylate cyclase. Annu Rev Biochem 49, 533-564.

Fung B Stryer L (1980) Photolyzed rhodopsin catalyses the exchange of GTP for bound GDP in retinal rod outer segments. Proc Batl Acad Sci

USA 77, 2500-2504.

Pedersen SE, Ross EM (1982) Functional reconstitution of beta-adrenergic receptors and the stimulatory GTP-binding protein of adelnylate

cyclase. Proc Batl Acad Sci USA 79, 7228-7232.

Farrens DL, Altenbach C, Ynag K, Hubbell WL, Khorana HG (1996) Requirement for rigid body motion of transmembrane helices for light

activation of rhodopsin. Science 274, 768-770. 13 (15)

Suryanarayana S, Von Zastrow M, Kobilka BK (1992) Identification of intermolecular interactions in adrenergic receptors. J Biol Chem 267,

21991-21994.

Gether U, Lin S, Kobilka BK (1995) Fluorescent labeling of purified beta 2-adrenergic receptor. Evidence for ligand-specific conformational

changes. J Biol Chem 270, 28268-28275.

Kobilka BK, Gether U (1998) Examination of ligand-induced conformational changes in the beta 2-adrenergic receptor by fluorescence spec-

troscopy. Adv Pharmacol 42, 470-473.

Yu H, Kono M, Oprian DD (1999) State-dependent disulfide cross-linking in rhodopsin. Biochemistry 38, 12028-12032.

Peleg G, Ghanouni P, Kobilka BK, Zare RN (2001) Single-molecule spectroscopy of the beta(2) adrenergic receptor: observation of conforma-

tional substates in membrane protein. Proc Batl Acad Sci USA 98, 8469-8474.

Ghanouni P, Steenhuis JJ, Farrens DL, Kobilka BK (2001) Agonist-induced conformational changes in the G-protein-coupling domain of the

beta 2 adrenergic receptor. Proc Batl Acad Sci USA 98 5997-6002.

Yan EC, Kazmi MA, Ganim Z, Hou JM, Pan D, Chang BS, Sakmar TP, Mathies RA (2003) Retinal counterion switch in the photoactivation of

the G-protein-coupled receptor rhodopsin. Proc Batl Acad Sci USA 100, 9262-9267.

Patel AB, Crocker E, Eilers M, Hirshfeld A, Sheves M, Smith SO (2004) Coupling of retinal isomerization to the activation of rhodopsin. Proc

Batl Acad Sci USA 101, 10048-10053.

Ye S, Zaitseva E, Caltabiano G, Schertler GF, Sakmar TP, Deupi X, Vogel R (2010) Tracking G-protein-coupled receptor activation using

genetically encoded infrared probes. Bature 464, 1386-1389.

Rasmussen SG, Choi H, Rosenbaum DM, Kobilka TS, Thian FS, Edwards PC, Burghammer M, Ratnala VRP, Sanishvili R, Fischetti RF,

Schertler GFX, Weis WI, Kobilka BK. (2007) Crystal structure of the human beta2 adrenergic G-protein coupled receptor. Bature

450, 383-387.

Chezerov V, Rosenbaum DM, Hanson MA, Rasmussen SG, Thian FS, Kobilka TS, Choi H, Kuhn P, Weis WI, Kobilka BK, Stevens RC

(2007) High-resolution crystal structure of an engineered human beta2 adrenergic G-protein coupled receptor. Science 318, 1258-

1265.

Rosenbaum DM, Chezerov V, Hanson MA, Rasmussen SG, Thian FS, Kobilka TS, Choi HJ , Yao XJ, Weis WI, Stevens RC, Kobilka BK,

Stevens RC (2007) GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2 adrenergic receptor function. Science 318,

1266-1273.

Chung KY, Rasmussen SG, Liu T, Li S, DeVree BT, Chae PS, Calinski D, Kobilka BK, Woods VL Jr, Sunahara RK (2011) Conformtional

changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Bature 477, 611–615.

Schertler GF, Villa C, Hendersson R (1993) Projection structure of rhodopsin. Bature 362, 770-772.

Unger V, Hargrave PA, Baldwin JM, Schertler GF (1997) Arrangement of rhodopsin transmembrane alpha-helices. Bature 389, 203-206.14

(15)

Okada T, Takeda K, Kouyama T (1998) Highly selective separation of rhodopsin from bovine rod outer segment membranes using combina-

tion of divalent cation and alkyl(thio)glucoside. Photochem Photobiol 67, 495-499.

Okada T, Le T, Fox BA, Behnke CA, Stenkamp RE, Palczewski K (2000) X-Ray diffraction analysis of three-dimensional crystals of bovine

rhodopsin obtained from mixed micelles. J Struct Biol 130, 73-80.

Palczewski K, Kumasaka T, Hori T, Behnke CA, Motoshima H, Fox BA, Le Trong I, Teller DC, Okada T, Stenkamp RE, Yamamoto M, Mi-

yano M (2000) Crystal structure of rhodopsin: A G-protein coupled receptor. Science 289, 739-745.

Okada T, Fujiyoshi Y, Silow M, Navarro J, Landau EM, Schichida Y (2002) Functional role of internal water molecules in rhodopsin revealed

by X-ray crystallography. Proc Batl Acad Sci USA 99, 5982-5987.

24




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

Luttrell LM, Ferguson SS, Daaka Y, Miller WE, Maudsley S, Della Rocca GJ, Lin F, Kawakatsu H, Owada K, Luttrell DK, Caron MG, Lefko-

witz RJ (1999) Beta-arrestin-dependent formation of beta2 adrenergic receptor –Src protein kinase complexes. Science 283, 655-661.

Wei H, Ahn S, Shenoy SK, Karnik SS, Hunyady L, Luttrell LM, Lefkowitz RJ (2003) Independent beta-arrestin 2 and G-protein mediated

pathways for angiotensin II activation of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. Proc Batl Acad Sci USA 100, 10782-10787.

Azzi M, Charest PG, Angers S, Rosseau G, Kohout T, Bouvier M, Pineyro G (2003) Beta-arrestin-mediated activation of MAPK by inverse

agonists reveals distinct active conformations for G protein-coupled receptors. Proc Batl Acad Sci USA 100, 11406-11411.

Rajagopal S, Rajagopal K, Lefkowitz RJ (2010) Teaching old receptors new tricks: biasing seven-transmembrane receptors. Bature Rev Drug

Discov 9, 373-386.

Kobilka, B.K., Kobilka TS, Daniel K, Regan JW, Caron MG, Lefkowitz RJ. (1988) Chimeric alpha 2-,beta 2-adrenergic receptors: delineation

of domains involved in effector coupling and ligand binding specificity. Science 240, 1310–1316.

Wheeler GL, Bitensky MW (1977) A light-activated GTPase in vertebrate photoreceptors: regulation of light-activated cyclic GMP phosphodi-

esterase. Proc Batl Acad Sci USA 74, 4238-4242.

Godchaux W, Zimmerman WF (1979) Membrane-dependent guanine nucleotide binding and GTPase activities of soluble protein from bovine

rod cell outer segments. J Biol Chem 254, 7874-7884.

Kühn H (1980) Light- and GTP-regulated interaction of GTPase and other proteins with bovine photoreceptor membranes. Bature 283, 587-

589.15 (15)

Fung B, Hurley JB, Stryer L (1981) Flow of information in the light-triggered cyclic nucleotide cascade of vision. Proc Batl Acad Sci USA 78,

152-156.

Abood ME, Hurley JB, Pappone MC, Bourne HR, Stryer L (1982) Functional homology between signal-coupling proteins. Cholera toxin inac-

tivates the GTPase activity of transducin. J Biol Chem 257, 10540-10543.

Mukherjee C, Caron MG, Lefkowitz RJ (1975) Catecholamine-induced subsensitivity of adelnylate cyclase associated with loss of beta-

adrenergic receptor binding sites. Proc Batl Acad Sci USA 72, 1945-1949.

Stadel JM, Nambi P, Shorr RG, Sawyer DF, Caron MG, Lefkowitz RJ (1983) Catecholamine-induced desensitiziation of turkey erythrocyte

adenylate cyclase is associated with phosphorylation of the beta-adrenergic receptor. Proc Batl Acad Sci USA 80, 3173-3177.

Kühn H, Dreuer WJ (1972) Light-dependent phosphorylation of rhodopsin by ATP. FEBS Lett 20, 1-6.

Benovic JL, Strasser RH, Caron MG, Lefkowitz RJ (1986) Beta-adrenergic receptor kinase; identification of a novel protein kinase that phos-

phorylates the agonist-occupied form of the receptor. Proc Batl Acad Sci USA 83, 2797-2801.

Weller M, Virmaux N, Mandel P (1975) Light-stimulated phosphorylation of rhodopsin in the retina: the presence of a protein kinase that is

specific for photobleached rhodopsin. Proc Batl Acad Sci USA 72, 381-385.

Wilden U, Hall SW, Kühn H (1986) Phosphodiesterase activation by photoexcited rhodopsin is quenched when rhodopsin is phosphorylated

and binds the intrinsic 48-kDa protein of rod outer segments. Proc Batl Acad Sci USA 83, 1174-1178.

Benovic JL, Kühn H, Weyand I, Codina J, Caron MG, Lefkowitz RJ (1987) Functional desensitization of the isolated beta-adrenergic receptor

by the beta-adrenergic receptor kinase: potential role of an analog of the retinal protein arrestin (48 kDa protein). Proc Batl Acad Sci

USA 84, 8879-8882.

von Zastrow M, Kobilka BK (1994) Antagonist-dependent and –independent steps in the mechanism of adrenergic receptor internalization. J

Biol Chem 269, 18448-18452.

Hein L, Ishii K, Coughlin SR, Kobilka BK (1994) Intracellular targeting and trafficking of thrombin receptors. A novel mechanism för resensi-

tization of G-protein coupled receptors. J Biol Chem 269, 27719-27726.

Cotecchia S, Exum S, Caron MG, Lefkowitz RJ (1990) Regions of the alpha 1-adrenergic receptor involved in coupling to phosphatidylinositol

hydrolysis and enhanced sensitivity of biological function. Proc Batl Acad Sci USA 87, 2896-2900.

Kjelsberg MA, Cotecchia S, Ostrowski J, Caron MG, Lefkowitz RJ (1992) Constitutive activation of the alpha 1B-adrenergic receptor by all

amino acid substitutions at a single site. Evidence for a region which constrains receptor activation. J Biol Chem 267, 1430–1433.

Conn PM, Rogers DC, Stewart JM, Niedel J, Sheffield T (1982) Conversion of a gonadotropin-releasing hormone antagonist to an agonist.

Bature 296, 653-655.

25




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

Νόµπελ Ιατρικής/ Φυσιολογίας 2012,

«Ώριµα κύτταρα µπορούν να επαναπρογραµµατιστούν για να γίνουν πολυδύναµα»

Βασιλική Λόη, Χηµικός, «Κοργιαλλένειο Μπενάκειο Ε.Ε.Σ.»

Το βραβείο Νόµπελ Ιατρικής / Φυσιολογίας 2012 απονεµήθηκε από κοινού στους Sir John Gurdon και Shinya Yamanaka για

την ανακάλυψη ότι «Ώριµα κύτταρα µπορούν να επαναπρογραµµατιστούν για να γίνουν πολυδύναµα».

Ο Sir John B.Curdon γεννήθηκε το 1933 στο Ηνωµένο Βασίλειο και ολοκλήρωσε τη διδακτορική του διατριβή στο

πανεπιστήµιο της Οξφόρδης το 1960 ενώ ήταν µεταδιδακτορικός ερευνητής στο Ινστιτούτο Τεχνολογίας της Καλιφόρνια.

Σήµερα είναι καθηγητής στο πανεπιστήµιο του Cambridge.

Στην οµιλία του κατά τη διάρκεια της απονοµής του βραβείου επισήµανε, ότι, αν και το βραβείο Νόµπελ έχει δοθεί πολλές

φορές από κοινού σε κάποιους ερευνητές, πρώτη φορά οι δύο ερευνητές δεν έχουν δουλέψει µαζί ή µε τα ίδια υλικά.

Επιπρόσθετα, είπε, είναι αξιοπερίεργο ότι τη χρονιά που έκανε την πρώτη του ανακάλυψη, το 1962, όταν απέδειξε ότι η

εξειδίκευση των κυττάρων είναι αναστρέψιµη, ήρθε στον κόσµο ο Dr. Shinya Yamanaka.

Ο Sir John Gurdon δούλευε µε αυγά ή έµβρυα βατράχων. ∆ουλεύοντας µε αγάπη και αυταπάρνηση στο αντικείµενο έρευνας

που επέλεξε, αγάπησε πρωτίστως τα πειραµατόζωά του και τόνισε ότι διαφέρουν από άλλα µικρά ζώα ενώ έχουν φιγουράρει σε

αρκετά έργα λογοτεχνίας. Ας µην ξεχνάµε – υπενθύµισε στο λόγο του - ότι οι « Βάτραχοι» του Αριστοφάνη κέρδισαν το πρώτο

βραβείο κωµωδίας το 405 π.χ..

Το 1962 σε ένα πείραµά του αντικατέστησε τον ανώριµο πυρήνα του κυττάρου σε ένα ωάριο ενός βατράχου µε τον πυρήνα από

ένα ώριµο εντερικό κύτταρο. Το τροποποιηµένο κύτταρο αυγών αναπτύχθηκε σε κανονικό γυρίνο. Έτσι διαπίστωσε ότι τα

κύτταρα διατηρούν το DNA που δεν χρησιµοποιούν και ότι η κυτταρική διαφοροποίηση δεν είναι «µονόδροµος».

Ο Dr Shinya Yamanaka, γεννήθηκε στην Osaka της Ιαπωνίας, απέκτησε το πτυχίο του το 1977 στο Πανεπιστήµιο του Κόµπε

και έλαβε το διδακτορικό του στο Πανεπιστήµιο της Osaka. Σήµερα είναι καθηγητής στο Πανεπιστήµιο του Κιότο και ανώτερος

ερευνητής στο Ινστιτούτο Gladstone.

Ο Yamanaka δουλεύοντας µε ποντίκια απέδειξε 40 χρόνια αργότερα ότι και τα διαφοροποιηµένα κύτταρα των θηλαστικών

είχαν αντίστοιχες ιδιότητες. Εισάγοντας 4 γονίδια σε διαφοροποιηµένα κύτταρα ποντικιού πέτυχε να τα µετατρέψει σε

πολυδύναµα βλαστοκύτταρα. Τα πολυδύναµα βλαστικά κύτταρα που προκύπτουν (κύτταρα IPS) θα µπορούσαν να µετατραπούν

µε την κατάλληλη µοριακή καθοδήγηση σε όλους τους κυτταρικούς τύπους του οργανισµού. Τα αποτελέσµατα αυτά

δηµοσιεύτηκαν το 2006.

Οι Gurdon και Yamanaka άλλαξαν κυριολεκτικά την έως τώρα γνώση της κυτταρικής διαφοροποίησης. Με τις ανακαλύψεις

τους ανοίγονται νέα πεδία έρευνας σε πολλές επιστήµες και ο επαναπρογραµµατισµός των ανθρώπινων κυττάρων δηµιουργεί

νέες ευκαιρίες για τη µελέτη ασθενειών και µεθόδων θεραπείας τους.

Όπως είπε και σε µια συνέντευξή του ο Dr Yamanaka είναι πάνω από όλα γιατρός και ο στόχος του είναι να φέρει την

τεχνολογία των βλαστοκυττάρων (IPS) σε κλινικές, ασθενείς, στο κρεβάτι του ασθενούς.

The Bobel Prize in Physiology or medicine 2012

Bobelprize.org

10 Dec 2012

26




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

ΓΙΑ ΝΑ ΘΥΜΗΘΗΤΕ...ΤΙ ΕΛΕΓΕ Ο ΔΑΣΚΑΛΟΣ !!!

Την περίοδο του Εθνικού διχασμού στην Κρήτη, ένας επιθεωρητής δημοτικής εκπαίδευσης ανέβαινε μ' ένα μουλάρι σ' ένα ορεινό και δύσβατο χωριό, για να επιθεωρήσει τον εκεί δάσκαλο.

Στο δρόμο που επήγαινε συναντά έναν αγωγιάτη και τον ρωτά: «Δε μου λες, πατριώτη, ο δάσκαλος τι είναι;

Βενιζελικός ή Bασιλικός;». «Βενιζελικός», απαντά ο αγωγιάτης. «Α, το γαϊδούρι» σχολίασε ο επιθεωρητής.

Ο αγωγιάτης όμως ήταν Βενιζελικός και φίλος του δασκάλου και έτρεξε να μεταφέρει στον δάσκαλο τη στιχομυθία.

«Το και το, δάσκαλε. Σε είπε γαϊδούρι».

Την επομένη μπαίνει ο επιθεωρητής στην τάξη και ρωτά το δάσκαλο ποιο είναι το μάθημα της ημέρας. «Τα σημεία

της στίξεως», απαντά ο δάσκαλος. «Ας δούμε, λοιπόν, τι ξέρουν τα παιδιά», λέει ο επιθεωρητής.

Ο δάσκαλος σήκωσε ένα μαθητή, τον Σήφη, στον πίνακα και του είπε να γράψει τη φράση:

«Ο επιθεωρητής είπε, (κόμμα), ο δάσκαλος είναι γαϊδούρι (τελεία).

Αφού, έκπληκτος ο μαθητής, το έγραψε, τον ρωτά ο δάσκαλος: «Ποιος είναι, παιδί μου, γαϊδούρι;». «Ο δάσκαλος», ψέλλισε ο μαθητής. «Και ποιος το είπε;». «Ο επιθεωρητής, κύριε». «Ωραία», είπε ο δάσκαλος. «Σβήσε

τώρα το κόμμα και βάλ' το αλλιώς»:

«Ο επιθεωρητής, (κόμμα), είπε ο δάσκαλος, (κόμμα), είναι γαϊδούρι».

Μόλις τελείωσε ο μαθητής, τον ρωτά ο δάσκαλος: «Ποιος είναι τώρα, παιδί μου, το γαϊδούρι;». «Ο επιθεωρητής»,

απαντά δειλά ο μαθητής. «Και ποιος το είπε;» «Ο δάσκαλος», απαντά ο μαθητής.

Οπότε στρέφεται ο δάσκαλος στην τάξη και λέει: «Είδατε παιδιά τι κάνουν τα κόμματα; Πότε βγάζουν γάιδαρο τον

επιθεωρητή και πότε το δάσκαλο».!

Είπε μονολογώντας ο παππούς, καθισμένος στην πολυθρόνα του μπροστά στη τηλεόραση που ανακοίνωνε και

νέες μειώσεις στις συντάξεις: Όταν ήμουν μαθητής, άκουγα κάθε τόσο τη δασκάλα μου να λέει: «Να προσέχετε τα

κόμματα! Ένα λάθος κόμμα, μπορεί να σας χαλάσει τελείως τη σύνταξη!» Έπρεπε να περάσουν εξήντα χρόνια για

να καταλάβω τι εννοούσε."

ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΕΣ ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ

• 16ο ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ ΣΥΝΕΧΙΖΟΜΕΝΗΣ ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗΣ

ΘΕΜΑ: «ΠΑΙΔΙΑΤΡΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ»

Συντονιστής: Δρ Ιωάννης Παπασωτηρίου, EurClinChem

ΣΑΒΒΑΤΟ 01.6.2013 Αμφιθέατρο Χωρεμείου Ερευνητικού Εργαστηρίου-

Α’ Παιδιατρική Κλινική ΕΚΠΑ

• ΕUROMEDLAB 2013, May 19-23

20th IFCC-EFLM European Congress of Clinical Chemistry & Laboratory Medi-

cine

• 11ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Χημείας

27




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

16ο ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ ΣΥΝΕΧΙΖΟΜΕΝΗΣ ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗΣ –

ΘΕΜΑ: «ΠΑΙΔΙΑΤΡΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ»

Συντονιστής: Δρ Ιωάννης Παπασωτηρίου, EurClinChem

ΣΑΒΒΑΤΟ 01.6.2013

Αμφιθέατρο Χωρεμείου Ερευνητικού Εργαστηρίου-

Α’ Παιδιατρική Κλινική ΕΚΠΑ Γ.Ν. Παίδων Αθηνών «Η Αγία Σοφία»

Πρόγραμμα

09.00-09.30: Εγγραφές

9:30 - 10:00: Γιατί τα Παιδιά δεν είναι «Μικροί Ενήλικες», Δρ Χριστίνα Κανακά-Gantenbein, Αναπληρώτρια

Καθηγήτρια Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας, Μεταβολισμού και Διαβήτη, ΕΚΠΑ

10:00 - 10:30: Εργαστηριακή Διάγνωση Νευροβλαστώματος και Φαιοχρωμοκυττώματος, Κα Χριστίνα

Λαζαροπούλου, Χημικος Βιοχημικού Τμήματος ΓΝΠ Αθηνών «Η Αγία Σοφία»,

10:30- 11:00: Μεταβολικό Σύνδρομο στα Παιδιά και Εφήβους, Δρ Νένη Περβανίδου, Λέκτορας Αναπτυξιακής

Παιδιατρικής ΕΚΠΑ 11:00- 11:30: Αλλεργία και Ασθμα,

Δρ Χρυσάνθη Σκευάκη, Ειδικευόμενη Βιοπαθολόγος Βιοχημικού Τμήματος ΓΝΠ Αθηνών «Η Αγία Σοφία», Executive

Committee Member European Academy of Allergy and Clinical Immunology

11:30- 12.00: Διάλειμμα

12.00- 12.30: Βιοδείκτες της Νεογνικής Λοίμωξης, Δρ Τάνια Σιαχανίδου Επίκουρη Καθηγήτρια Νεογνολογίας, ΕΚΠΑ

12:30 - 13:00: Διαταραχές Αιμοστασης στη Βρεφική και Παιδική Ηλικία Δρ Εφη Αδαμτζίκη, Βιολόγος Μονάδας

Αιμορραγικών Διαθέσεων, ΓΝΠ Αθηνών «Η Αγία Σοφία»

13:00 - 13:30: Μεταβολικά Νοσήματα- Παρουσιάση 3 Αντιπροσωπευτικών Περιστατικών, Δρ Λίλια Λυκοπούλου,

Δ/ντρια ΕΣΥ Α’ Παιδιατρικής Κλινικής ΕΚΠΑ

13:30 - 14:00: Τιμές Αναφοράς στα Παιδιά και τους Εφήβους και ο Ρόλος της ΕΕΚΧ-ΚΒ

14:00 - 14:30: Συζήτηση - Ερωτήσεις.

Απογευματινά μαθήματα Πρόγραμμα Μαθημάτων

ΑΠΡΙΛΙΟΣ: Δευτέρα 1-4-13, 6-8μμ Τμήμα Ανοσολογίας – Ιστοσυμβατότητας

Εργαστήριο Ιστοσυμβατότητας:

Θεόφιλος Αθανασιάδης, βιολόγος – Τζένη Κουνιάκη, βιολόγος Γ.Ν.Α. “Ο Ευαγγελισμός”

Εργαστήριο πρωτεϊνών: Κατερίνα Παπαγεωργίου, βιολόγος Γ.Ν.Α. “Ο Ευαγγελισμός”

Εργαστήριο αυτοαντισωμάτων: Σύλβια Σολακιδη , βιολόγος PhD Γ.Ν.Α. “Λαϊκό”

Εργαστήριο κυτταρομετρίας: Κατερίνα Ψαρρά, χημικός MSc PhD Γ.Ν.Α. “Ο Ευαγγελισμός”

28




τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392

ΟΔ. ΕΛΥΤΗΣ

Αναρωτιέμαι μερικές φορές:

Είμαι εγώ που σκέφτομαι καθημερινά ,πως η ζωή μου είναι μία; Όλοι οι υπόλοιποι το ξεχνούν; Ή πιστεύουν πως θα έχουν κι άλλες, πολλές ζωές, για να κερδίσουν τον χρόνο που

σπαταλούν;

Ν' αντικρίζεις τη ζωή με μούτρα. Να περιμένεις την Παρασκευή που θα φέρει το Σάββατο και την Κυριακή για να ζήσεις. Κι ύστερα να μη φτάνει ούτε κι αυτό, να χρειάζεται να περιμένεις τις διακοπές. Και μετά ούτε κι αυτές να είναι αρκετές.

Να περιμένεις μεγάλες στιγμές. Να μην τις επιδιώκεις, να τις περιμένεις.

Κι ύστερα να λες πως είσαι άτυχος και πως η ζωή ήταν άδικη μαζί σου.

Και να μη βλέπεις ,πως ακριβώς δίπλα σου συμβαίνουν αληθινές δυστυχίες που η ζωή κλήρωσε σε άλλους ανθρώπους. Σ' εκείνους που δεν το βάζουν κάτω και αγωνίζονται.

Και να μην μαθαίνεις από το μάθημά τους.

Και να μη νιώθεις καμία φορά ευλογημένος που μπορείς να χαίρεσαι τρία πράγματα στη ζωή σου, την καλή υγεία, δυο φίλους, μια αγάπη, μια δουλειά, μια δραστηριότητα που σε κάνει να αισθάνεσαι ότι δημιουργείς, ότι έχει λόγο η ύπαρξή

σου.

Να κλαίγεσαι που δεν έχεις πολλά.

Που κι αν τα είχες, θα ήθελες περισσότερα. Να πιστεύεις ότι τα ξέρεις όλα και να μην ακούς. Να μαζεύεις λύπες και απελπισίες, να ξυπνάς κάθε μέρα ακόμη πιο

βαρύς.

Λες και ο χρόνος σου είναι απεριόριστος.

Κάθε μέρα προσπαθώ να μπω στη θέση σου. Κάθε μέρα αποτυγχάνω. Γιατί αγαπάω εκείνους που αγαπούν τη ζωή. Και που η λύπη τους είναι η δύναμή τους.

Που κοιτάζουν με μάτια άδολα και αθώα, ακόμα κι αν πέρασε ο χρόνος αδυσώπητος από πάνω τους.

Που γνωρίζουν ότι δεν τα ξέρουν όλα, γιατί δεν μαθαίνονται όλα. Που στύβουν το λίγο και βγάζουν το πολύ.

Για τους εαυτούς τους και για όσους αγαπούν.

Και δεν κουράζονται να αναζητούν την ομορφιά στην κάθε μέρα, στα χαμόγελα των ανθρώπων, στα χάδια των ζώων,

σε μια ασπρόμαυρη φωτογραφία, σε μια πολύχρωμη μπουγάδα.

Όσο κι αν κανείς προσέχει

όσο κι αν το κυνηγά

πάντα, πάντα θα 'ναι αργά

δεύτερη ζωή δεν έχει.

(από Το Παράπονο, του Οδ. Ελύτη)

2013 Μάρτιος NEWSLETTER Τεύχος 8στον κόσμο στην επιστήμη της...

Documents

Transcript of 2013 Μάρτιος NEWSLETTER Τεύχος 8στον κόσμο στην επιστήμη της...