ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑΕργαστήριο Βιοχημείας

Καλλιέργειες μικροοργανισμών και χρήση μικροσκοπίουΔιδάσκοντες: Αναπλ. Καθ. A. E. Κούκκου, Καθ. M. E. Λέκκα, Αναπλ. Καθ. Ε. Πάνου, Καθ. Ε. Παπαμιχαήλ, Καθ. Α. Τσελέπης, Καθ. Δ. Τσουκάτος

Άδειες Χρήσης

• Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σεάδειες χρήσης Creative Commons. • Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άλλου τύπου άδειας χρήσης, η άδεια χρήσης αναφέρεται ρητώς.

11

ΑΣΚΗΣΗ 1

ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ

και

ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟΥ

1. Γενικό μέρος («Πρακτική Βιοχημεία» καθηγητού Β. Μ. Καπούλα,

Αθήνα 1977).

2. Το Πρωτόζωο Tetrahymena pyriformis.

3. Διακριτικό όριο οπτικού (κοινού) μικροσκοπίου – ορισμοί εννοιών.

4. Μικροσκοπία.

5. Καταδυτικός φακός.

6. Εμβολιασμός μικροβιακών κυττάρων.

7. Όργανα που χρησιμοποιούνται σε μικροβιακές καλλιέργειες.

8. Πειραματικό μέρος.

9. Βιβλιογραφία.

12

13

1. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

(«Πρακτική Βιοχημεία» καθηγητού Β. Μ. Καπούλα, Αθήνα 1977)

Ορολογία

Καλλιέργεια μικροοργανισμών σημαίνει ανάπτυξη πληθυσμών μικροοργανισμών σε

κατά το μάλλον καθορισμένες συνθήκες. Μια καλλιέργεια μπορεί να περιέχει ένα μόνο

οργανισμό οπότε λέγεται καθαρή ή αξενική, δυό οργανισμούς σε σχέση μεταξύ τους,

οπότε έχουμε μια διμελή καλλιέργεια, και περισσότερους μικροοργανισμούς δηλαδή μια

μικτή καλλιέργεια.

Καλλιέργειες μονοκυττάρων οργανισμών μπορούμε να έχουμε είτε από

προκαρυωτικούς οργανισμούς είτε από μονοκύτταρους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Η

διάκριση σε προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οφείλεται στον χαρακτηριστικό τύπο

κυττάρου. Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς ανήκουν τα μικρόβια (σχιζομύκητες) και

τα κυανοφύκη, ενώ όλοι οι άλλοι ανώτεροι μονοκύτταροι και πολυκύτταροι οργανισμοί

έχουν ευκαρυωτικό τύπο κυττάρων. Ένα προκαρυωτικό κύτταρο διακρίνεται από ένα

ευκαρυωτικό με τις εξής κύριες διαφορές: Δεν υπάρχει πυρηνική μεμβράνη, το δε DNA

βρίσκεται συγκεντρωμένο σ’ ένα μέρος του κυτταροπλάσματος με τη μορφή μιας και

μόνο αλυσίδας DNA δηλαδή ενός και μόνο μεγάλου χρωμοσώματος. Δεν υπάρχουν

μιτοχόνδρια ή χλωροπλάστες, έτσι τα κυτοχρωμικά ένζυμα βρίσκονται στην κυτταρική

μεμβράνη. Η κυτταρική μεμβράνη διαφέρει σε ορισμένα δομικά της στοιχεία από την

κυτταρική μεμβράνη των ευκαρυωτικών κυττάρων.

Όργανα

Για να καλλιεργήσουμε στο εργαστήριο μονοκύτταρους οργανισμούς είναι

απαραίτητα ορισμένα χαρακτηριστικά γυάλινα σκεύη και όργανα όπως:

1) Αντικειμενοφόρες πλάκες και καλυπτρίδες μικροσκοπίου.

2) Δοχεία χρώσεως μεταλλικά ή γυάλινα (όπου τοποθετούνται, πάνω σε ειδικά

στηρίγματα, οι αντικειμενοφόρες πλάκες για τη χρώση των μικροοργανισμών).

3) Δοκιμαστικοί σωλήνες βιδωτοί και απλοί (συνήθως με διαστάσεις 17x170 mm).

4) Ειδικοί σωλήνες Yvann-Hall (για καλλιέργεια αναεροβίων μικροοργανισμών).

5) Τρυβλία Petri.

6) Πιπέττες αριθμημένες και απλές, και πιπέττες Pasteur.

14

7) Σωληνίσκοι Durham 5-6x30 mm για συλλογή αερίων.(Τοποθετούνται μέσα σε

δοκιμαστικούς σωλήνες για τη συλλογή των αερίων, που προέρχονται από

ζυμώσεις).

8) Φιάλες κωνικές και σφαιρικές.

9) Βελονοκάτοχο με κρίκο και με ακίδα.

10) Οπτικό μικροσκόπιο.

11) Κλίβανος επωαστικός 28-30C, 36-37C και ένας κλίβανος 50-55C όταν

πρόκειται για έλεγχο τροφίμων από μόλυνση μικροοργανισμών.

12) Κλίβανος ξηρής αποστείρωσης (η θερμοκρασία του πρέπει να φτάνει τους 200C).

13) Κλίβανος υγρής αποστείρωσης (με θερμοκρασία 130C και υπό πίεση).

14) Λύχνοι Βunsen.

Αποστείρωση

Προϋπόθεση για την επιτυχία μιας καθαρής (αξενικής) καλλιέργειας είναι α) η

σωστή διεργασία απομόνωσης του μικροοργανισμού και β) η διατήρηση της

καλλιέργειας απρόσβλητης από άλλους μικροοργανισμούς.

Αμόλυντες καλλιέργειες επιτυγχάνονται α) με την εκ των προτέρων καλή

αποστείρωση του χώρου, όπου θα τοποθετηθούν οι καλλιέργειες, με λάμπα υπεριωδών

ακτίνων, β) με την καλή αποστείρωση των θρεπτικών μέσων και των γυαλικών ή

οργάνων, που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν.

Στον κλίβανο ξηρής αποστείρωσης αποστειρώνονται υλικά που δεν καταστρέφονται

στους 180 επί 40΄. Δηλαδή πιπέττες με βαμβάκι στο στόμιο μέσα σε ειδικό μεταλλικό

κουτί, τρυβλία Petri σκεπασμένα με κηρόχαρτο, κ.λ.π. Επειδή στον κλίβανο υγρής

αποστείρωσης υπό πίεση η θερμοκρασία φτάνει τους 115-120 και πρέπει να μείνει

σταθερή για 20΄, αποστειρώνονται όλα εκείνα τα υλικά που δεν καταστρέφονται στους

120. Τα θρεπτικά υλικά αποστειρώνονται μέσα σ’ αυτούς τους κλίβανους και μέσα σε

κωνικές φιάλες ή δοκιμαστικούς σωλήνες, πωματισμένους με βαμβάκι και γάζα. Συνήθως

καλύπτουμε τις φιάλες με κηρόχαρτο για να μην υγραίνεται το βαμβάκι από τη

συμπύκνωση των υδρατμών. Αν στο θρεπτικό υλικό υπάρχουν σάκχαρα, η θερμοκρασία

δεν πρέπει να είναι ανώτερη από 115 γιατί καραμελλοποιούνται γρήγορα. Επειδή οι

μικροοργανισμοί, όταν βρίσκονται σε δυσμενείς συνθήκες περιβάλλοντος π.χ. υψηλές ή

χαμηλές θερμοκρασίες, έχουν την ιδιότητα να δημιουργούν ανθεκτικές μορφές, τα

σπόρια, τα οποία όταν πάλι βρεθούν σε κατάλληλες συνθήκες βλαστάνουν δίνοντας πάλι

την κανονική βλαστική μορφή του μικροοργανισμού, γι’ αυτό το λόγο καλύτερη είναι μια

15

κλασματική αποστείρωση, δηλαδή τοποθέτηση των υλικών σε διάφορες θερμοκρασίες

επί τρεις συνεχείς μέρες. Με την πρώτη αποστείρωση θανατώνονται οι βλαστικές μορφές

των μικροβίων και παραμένουν τα σπόρια. Μέχρι την επόμενη μέρα τα σπόρια θα

βλαστήσουν πάλι και τότε επακολουθεί δεύτερη αποστείρωση, όπου καταστρέφονται οι

περισσότεροι μικροοργανισμοί και ούτω καθ’ εξής.

Επειδή από την αποστείρωση εξαρτάται η καλή ανάπτυξη μιας καλλιέργειας,

γίνονται δοκιμές ελέγχου της αποστείρωσης υγρής ή ξηράς θερμότητας. Οι τρόποι

ελέγχου είναι χημικοί ή βακτηριολογικοί. Για τις χημικές δοκιμές χρησιμοποιούνται

χρωστικές γνωστού σημείου τήξης, οι οποίες μάλιστα κατά την τήξη αλλάζουν χρώμα. Οι

χρωστικές χρησιμοποιούνται σε ποσότητα 0,01% συνήθως, εκτός από τη φουξίνη και το

κυανούν του μεθυλενίου (0,1%). Δείκτης για τη θερμοκρασία των 110C είναι το μίγμα:

Βενζοναφθόλη 100,0 g

Σαφρανίνη 0,01 g

Για τη θερμοκρασία 121C δείκτης είναι το μίγμα:

Βενζοϊκό οξύ 100,0g

Πράσινο λαμπρό 0,01 g

Για θερμοκρασίες μεγαλύτερες χρησιμοποιούνται χρωστικές με μεγαλύτερο σημείο

τήξης, π.χ. καμφουρά (σ. τ. 175C).

Οι βακτηριολογικοί έλεγχοι γίνονται με το χορτοβακτηρίδιο και τον μεσεντερικό

βάκιλλο. Μαζί με τα προς αποστείρωση υλικά τοποθετείται και δοκιμαστικός σωλήνας,

που περιέχει καλλιέργεια αυτών των βακτηριδίων. Αν μετά την αποστείρωση αποδειχθεί

πως επέζησαν οι μικροοργανισμοί σημαίνει πως η αποστείρωση είναι ατελής.

Στο εμπόριο υπάρχουν ειδικά θρεπτικά υλικά είτε σε ζωμό είτε σε άγαρ, με τα

όποια γίνονται δοκιμές για την ύπαρξη ή όχι ορισμένων μικροβίων ή μυκήτων σε κάποιο

υλικό, π.χ. ζωμός mycophil της BBL χρησιμοποιείται για να πιστοποιηθεί η ύπαρξη

μυκήτων κατά την παρασκευή της πενικιλίνης, προκα?νης και βιταμίνης Β12. Με το Fluid

Thioglycolate medium δοκιμάζεται η έλλειψη μικροοργανισμών σε τελικά προϊόντα

βιομηχανίας σε υγρή ή στερεή κατάσταση μέσα σε δοκιμαστικούς σωλήνες, φιάλες ή

άλλους υποδοχείς.

Για υλικά που δεν είναι δυνατό ν’ αποστειρωθούν σε μεγάλες θερμοκρασίες, όπως

ορός ή άλλα υγρά, γίνεται μια διήθηση με ειδικούς ηθμούς, που συγκρατούν τα μικρόβια

όπως ένα κόσκινο ή απορροφούν τα μικρόβια λόγω διαφοράς ηλεκτρικού φορτίου. Οι

ηθμοί αυτοί είναι από αμίαντο ή τριμμένο γυαλί και χαρακτηρίζονται από γράμματα N,

16

W, EK, L1, L2 μέχρι L10 ανάλογα με τη διάμετρο των πόρων.

Εκτός από την αποστείρωση των υλικών και σκευών, όταν πρόκειται για

ιστοκαλλιέργειες, απαραίτητη είναι και η αποστείρωση του χώρου με ιονίζουσα

ακτινοβολία, δηλ. ακτίνες γ ή καθοδικές ακτίνες.

Μερική αποστείρωση επιτυγχάνεται με την παστερίωση, που πρώτος εφάρμοσε ο

Pasteur στη μπύρα και το κρασί. Σήμερα χρησιμεύει μόνο για την απαλλαγή διαφόρων

ποτών και τροφίμων, ιδίως για το γάλα από μικροοργανισμούς που προκαλούν πιθανόν

ασθένειες. Η μέθοδος στηρίζεται στην επί 30΄ και στους 62C θέρμανση. Με την

κατεργασία αυτή εξασφαλίζεται και η διατήρηση της γεύσης των ουσιών που

παστεριώνονται.

Εμβολιασμός

Αφού αποστειρώσουμε τα σκεύη και τα υλικά που θα χρησιμοποιήσουμε,

μπορούμε ν’ αρχίσουμε τον εμβολιασμό (inoculum, inoculation), δηλαδή τη μεταφορά

μικροβίων ή άλλων μονοκυττάρων οργανισμών από ένα stock ή ένα προς εξέταση υλικό,

σε συνθήκες που επιτρέπουν γρήγορη ανάπτυξη. Οργανισμοί όπως βακτήρια μεγάλου

μεγέθους, πρωτόζωα, φύκη και ιοί, καλλιεργούνται και απομονώνονται μόνο μέσα σε

υγρό περιβάλλον. Αφαιρούμε το πώμα από τον δοκιμαστικό σωλήνα, που περιέχει το

stock του μικροοργανισμού, με το μικρό δάκτυλο του δεξιού χεριού, ενώ στο αριστερό

κρατάμε το σωλήνα, (βλ. σχήμα) θερμαίνουμε στο λύχνο το στόμιο του σωλήνα και με

προσοχή, πάντα κοντά στο λύχνο –τον ανάβουμε πάντα μερικά λεπτά πριν, για ν’

απομακρυνθούν μικροοργανισμοί από τον αέρα γύρω λόγω θερμότητας– μ’ ένα σιφώνιο

ή με βελονοκάτοχο (κρίκος) αφαιρούμε μια ορισμένη ποσότητα υλικού. Κατόπιν

ανοίγουμε τη φιάλη ή τον δοκιμαστικό σωλήνα όπου θα γίνει ο εμβολιασμός,

θερμαίνουμε πάλι το στόμιο στο λύχνο και χωρίς ν’ ακουμπήσουμε στα τοιχώματα, με

προσοχή, αφήνουμε το υλικό να πέσει μέσα στο θρεπτικό μέσο. Θερμαίνουμε πάλι το

στόμιο της φιάλης ή του δοκιμαστικού σωλήνα και πωματίζουμε.

Όταν πρόκειται για εμβολιασμό μικροβίων ή μυκήτων ο εμβολιασμός γίνεται είτε

σε άγαρ, είτε σε ζωμό ανάλογα με τις παρατηρήσεις ή τ’ αποτελέσματα που θέλουμε να

πάρουμε. Όταν θέλουμε από ένα σύνολο μυκήτων ή μικροβίων ν’ απομονώσουμε ένα

είδος τότε ο εμβολιασμός γίνεται πρώτα σε άγαρ με ειδικό τρόπο και αφού επωάσουμε

την καλλιέργεια απομονώνεται μια καθαρή αποικία του είδους που μας ενδιαφέρει και

καλλιεργείται πάλι σε ζωμό ή άγαρ. Ο τρόπος με τον οποίον γίνεται ο εμβολιασμός από

υγρό σε άγαρ ή από υγρό σε υγρό, φαίνεται στο σχήμα (κάτω). Όλες οι διεργασίες για

17

τον εμβολιασμό πρέπει να γίνονται κοντά στη φωτιά του λύχνου. Το άγαρ μετά την

αποστείρωση βρίσκεται σε υγρή μορφή επειδή είναι ζεστό. Πριν αρχίσει να

στερεοποιείται μεταγγίζεται σε ποσότητα 10-15 ml μέσα στα Petri αφού ανοίξουμε λίγο

με προσοχή το καπάκι του Petri. Στριφογυρίζουμε το Petri ελαφρά, ώστε να κατανεμηθεί

ομοιόμορφα το υλικό και αφήνουμε να στερεοποιηθεί πριν κάνουμε τον εμβολιασμό. Η

επιφάνεια του άγαρ πρέπει να είναι λεία και «σχετικά» υγρή.

Σχήμα 1: Αντιπροσωπευτικοί διαδοχικοί χειρισμοί ασηπτικής μεταφοράς (εμβολιασμού)

καλλιέργειας από δοκιμαστικό σωλήνα (Α-Ζ) σε δοκιμαστικό σωλήνα (πάλι Β-Ζ) ή σε φιάλη (Η-Λ) ή σε τρυβλίο με άγαρ (αριστερά). Κάτω δίνονται παραστατικά οι δυο πιο συνηθισμένοι τρόποι σταδιακής εξάπλωσης του εμβολίου στο άγαρ (με κρίκο ή βελονοκάτοχο).

18

Απομόνωση

Αν το υλικό από το οποίο θέλουμε να απομονώσουμε έναν μικροοργανισμό είναι

πολύ «πυκνό» σε οργανισμούς, για να επιτύχει η απομόνωση, πρέπει πριν από τον

εμβολιασμό να κάνουμε ορισμένες αραιώσεις του αρχικού δείγματος. Αν επί πλέον

θέλουμε να μετρήσουμε τις αποικίες μικροοργανισμών που θα αναπτυχθούν από το

αρχικό διάλυμα, τότε οι αραιώσεις αυτές πρέπει να είναι συγκεκριμένες ώστε να

ανάγουμε τα αποτελέσματα στον αρχικό όγκο. π.χ. το 1/10 του αρχικού διαλύματος

(δείγματος) αναμιγνύεται με 9/10 αρχικού όγκου σ’ ένα δεύτερο σωλήνα, από το δεύτερο

σωλήνα το 1/10 αναμιγνύεται με 9/10 αρχικού όγκου σ’ ένα τρίτο σωλήνα κλπ., ώστε

τελικά να επιτύχουμε μια κατάλληλη αραίωση (βλ. σχήμα). Αν πρόκειται να

απομονώσουμε αναερόβιο οργανισμό, για τον οποίο το Ο2 είναι τοξικό, τότε μικρή

ποσότητα από δείγμα αναμιγνύεται με άγαρ σε υγρή μορφή και το 1/10 από αυτό το άγαρ

με άγαρ στον κατάλληλο όγκο άλλου σωλήνα κλπ. Αυτό επαναλαμβάνεται 6-10 φορές. Η

επιφάνεια του άγαρ σε κάθε σωλήνα που θα επωασθεί, σκεπάζεται με παραφίνη για να

εμποδίζεται η είσοδος του αέρα.

Σε περίπτωση που η απομόνωση ενός οργανισμού δεν είναι δυνατή να γίνει από

στερεό θρεπτικό υλικό, όπως στην περίπτωση των πρωτοζώων, με μια τριχοειδή πιπέττα

συλλαμβάνεται ο μικροοργανισμός αφού αναγνωρισθεί κάτω από το μικροσκόπιο,

ξεπλένεται αρκετές φορές για να απομακρυνθούν τυχόν μικροοργανισμοί και

καλλιεργείται. Επίσης σ’ αυτές τις περιπτώσεις χρησιμοποιείται μικροχειριστής.

Επώαση

Για να αναπτυχθεί μια καλλιέργεια χρειάζεται ένα κατάλληλο χρόνο επώασης και

κατάλληλες συνθήκες περιβάλλοντος, θερμοκρασίας, pH, υγρασίας κλπ. Όσον αφορά την

θερμοκρασία, για κάθε μικροοργανισμό υπάρχει ένα σημείο άριστης θερμοκρασίας όπου

η ανάπτυξή του έχει την μεγαλύτερη ταχύτητα. Αν η θερμοκρασία φτάσει σ’ ένα

maximum ή ένα minimum, τότε η ανάπτυξη του μικροοργανισμού δεν είναι η καλύτερη

και σταματάει τελείως στο θερμικό σημείο θανάτου. Ανάλογα με το καλύτερο θερμικό

σημείο οι μικροοργανισμοί διακρίνονται σε:

(α) Ψυχρόφιλους <20C,

(β) Μεσόφιλους 20-45C,

(γ) Θερμόφιλους >45C.

Όταν εξασφαλισθούν οι κατάλληλες συνθήκες περιβάλλοντος, τότε τα κύτταρα

μιας καλλιέργειας διαιρούνται σε κανονικά διαστήματα –συνήθως κάθε 20΄– και

19

επομένως η αύξηση ενός πληθυσμού σε συνάρτηση με τον χρόνο είναι εκθετική.

Για να υπολογίσουμε μια καμπύλη ανάπτυξης σε συνάρτηση με το χρόνο είναι

προτιμότερο να υπολογίσουμε το λογάριθμο του αριθμού των κυττάρων, παρά τον

αριθμό αυτών για τους εξής λόγους:

α΄. Στην ημιλογαριθμική απεικόνιση, λόγω του μεγάλου αριθμού των κυττάρων

που μπορεί να περιλάβει ο άξονας των τεταγμένων, υπάρχει η δυνατότητα της σύγχρονης

απεικόνισης πληθυσμού με λίγα και πολλά μέλη.

β΄. Η συμπεριφορά του πληθυσμού στις πρώτες διαιρέσεις δεν είναι ευδιάκριτη

στην αριθμητική απεικόνιση.

γ΄. Η κλίση της ευθείας στην ημιλογαριθμική απεικόνιση βρίσκεται εύκολα και

αντιπροσωπεύει την ταχύτητα αύξησης του πληθυσμού.

δ΄. Στην ημιλογαριθμική απεικόνιση μπορούμε να διαπιστώσουμε αν ελαττώνεται ο

χρόνος διπλασιασμού και αυξάνεται η ταχύτητα ανάπτυξης, αν αυξάνει ο χρόνος

διπλασιασμού και ελαττώνεται η ταχύτητα ανάπτυξης ή αν τέλος ο χρόνος διπλασιασμού

και η ταχύτητα ανάπτυξης μένουν σταθερά:

Η ταχύτητα ανάπτυξης υπολογίζεται από την εξίσωση:

dN

N = kNdt Nt = NΟ·ekNt (1)

όπου ΝΟ, Νt = ο αριθμός των κυττάρων σε χρόνο μηδέν και σε χρόνο t και kN = ειδική

ταχύτητα ανάπτυξης (specific growth rate), που εκφράζεται σαν αριθμός

κυτταροδιαιρέσεων ανά μονάδα χρόνου (hr–1) και υπολογίζεται αν λογαριθμήσουμε την

εξίσωση (1)

kN = – nN nN

t

n

tt O

G

=

2 (2)

(Η δεύτερη ισότητα προκύπτει αν στη θέση του t χρησιμοποιηθεί ο χρόνος μιας

γενεάς, tG (generation time), οπότε Νt = 2NΟ.

Η ταχύτητα ανάπτυξης μπορεί επίσης να υπολογισθεί από την εξίσωση:

Γ: σταθερός χρόνος διπλασιασμού και της ταχύτητας αύξησης

20

Νt = NO · 2K·t K =

nN nN

t nt o. 2 και Κ =

k

n tN

G 2 =

1 (3)

Στις εξισώσεις αυτές δηλαδή, υπεισέρχεται μια άλλη σταθερά Κ, που θα μπορούσε

να ονομασθεί ειδική ταχύτητα διπλασιασμού (K=1/tG).

Η καμπύλη αύξησης των μικροοργανισμών δεν παραμένει εκθετική παρά μόνο για

ορισμένο αριθμό γενεών επειδή 1ον εξαντλείται το θρεπτικό υλικό, 2ον παράγονται

μεταβολίτες τοξικοί για τους μικροοργανισμούς. Η καμπύλη αύξησης επομένως παίρνει

μια άλλη μορφή που διακρίνεται σε 4 τμήματα ή φάσεις:

1. Επωαστική φάση (Lag Phase)

όπου η ταχύτητα ανάπτυξης είναι 0. Η

επωαστική φάση παρατηρείται όταν τα

κύτταρα που εμβολιάστηκαν δεν

βρίσκονται στην λογαριθμική τους

φάση, επομένως πρέπει να

προετοιμασθούν με έντονη

πρωτεϊνοσύνθεση για να αυξηθούν

σε μέγεθος και μετά να διαιρεθούν.

Επίσης η επωαστική φάση μεγαλώνει ή μικραίνει λόγω της αλλαγής

υποστρώματος από το μέσον λήψης στο μέσο εμβολιασμού, δηλ. προετοιμασία

καταλλήλων ενζύμων των κυττάρων για την πέψη του νέου θρεπτικού υλικού

2. Εκθετική ή λογαριθμική φάση (Exponential ή Log-Phase), όπου σχεδόν όλα τα

κύτταρα είναι ζωντανά και σταθερού μεγέθους και ο αριθμός των κυττάρων αυξάνεται

παράλληλα με την κυτταρική μάζα.

3. Φάση στασιμότητας (Stationary Phase).

Oφείλεται στην εξάντληση του θρεπτικού μέσου είτε στην παραγωγή τοξικών

μεταβολιτών και διαιρούνται μόνο τα κύτταρα με αυξημένη αντοχή στα τοξικά

παράγωγα.

4. Φάση θανάτου (Phase of Decline).

Σ’ αυτό το τμήμα η καμπύλη είναι εκθετική, με αντίθετη όμως κλίση από την

καμπύλη αύξησης ζωντανών κυττάρων.

Η μέτρηση της αύξησης μιας καλλιέργειας γίνεται με μέτρηση της μάζας ή του

αριθμού των κυττάρων σε καθορισμένο όγκο. Η σχέση μάζας και αριθμού κυττάρων

είναι πρακτικά γραμμική, εκτός από την περίπτωση των σύγχρονων καλλιεργειών όπου

οι κυτταροδιαιρέσεις γίνονται σε καθορισμένα χρονικά διαστήματα.

χρόνος

1

2

3

4

21

Καλλιέργειες συνεχούς ροής

Οι συνηθισμένες καλλιέργειες (batch cultures) είναι κλειστά συστήματα, στα οποία

το περιβάλλον και τα κύτταρα μεταβάλλονται συνεχώς, βρίσκονται δηλαδή μόνιμα σε

κάποια μεταβατική κατάσταση (transient ή non-steady state), χωρίς να μπορεί ν’

αποκατασταθεί μια σταθεροποιημένη κατάσταση ισοζυγίου (steady state).

Ωστόσο όμως μια σωστότερη αντιμετώπιση του θέματος θα ήταν να ξεκινήσουμε

από βασική διάκριση των καλλιεργειών σε κλειστά και ανοιχτά συστήματα, όπου τα

τελευταία αντιπροσωπεύονται από τις λεγόμενες καλλιέργειες συνεχούς ροής, δηλαδή

καλλιέργειες που τροφοδοτούνται συνεχώς με μια σταθερή παροχή καθαρού θρεπτικού

μέσου, με ταυτόχρονη «ισοζυγισμένη» (balanced) απομάκρυνση ίσης ποσότητας

καλλιέργειας. Παρ’ όλο ότι διάφορες τεχνικές καλλιεργειών συνεχούς ροής έχουν

αναπτυχθεί εδώ και περισσότερα από 20 χρόνια, ωστόσο αγνοούνται συστηματικά, κι

αυτό οφείλεται στο ότι συνήθως οι μικροοργανισμοί διαθέτουν μεταβολικά συστήματα

που προσαρμόζονται εύκολα στις φυσικοχημικές μεταβολές του περιβάλλοντος και έτσι,

επιζούν και διπλασιάζονται για μεγάλα χρονικά διαστήματα σε κλειστά συστήματα.

Παράλληλα όμως αυτό έχει σαν αποτέλεσμα ν’ αγνοούνται ως επί το πλείστον πολλές

από τις βασικές αρχές ανάπτυξης των μικροοργανισμών, η συστηματική παράλειψη των

οποίων καταλήγει –όχι σπάνια– σε πειράματα περιορισμένης αξίας, που πολλές φορές

δεν είναι δυνατόν να αξιολογηθούν (invalidated). Ας δούμε όμως πιο λεπτομερειακά τις

γενικές αρχές ανάπτυξης των μικροοργανισμών:

Ο όρος ισοζυγισμένη ανάπτυξη (balanced growth) σημαίνει πως όλες οι εκτατικές

ιδιότητες α (λ.χ. σύνολο νουκλεϊνικών οξέων ή πρωτεϊνών ή κυτταρικής μάζας κλπ.)

αυξάνονται με σταθερή ταχύτητα δηλαδή.

d

dt

= kα.α

d = kα.dt αt = αΟ.ekαt (4)

Συγκρίνοντας τις σχέσεις αυτές με την εξίσωση 1 (δια α=Ν) βλέπουμε ότι στις

(κλειστές) καλλιέργειες η ανάπτυξη είναι ισοζυγισμένη μόνο στη λογαριθμική (εκθετική)

φάση.

Στις καλλιέργειες συνεχούς ροής όμως, η ανάπτυξη είναι πάντα ισοζυγισμένη, ενώ

ταυτόχρονα η συνεχής αντικατάσταση ενός μέρους της καλλιέργειας με καθαρό θρεπτικό

μέσο δίνει σταθερό αριθμό κυττάρων και σταθερή σύσταση του περιβάλλοντος έτσι,

ώστε οι καλλιέργειες αυτές να υπακούουν στην κινητική της σταθεροποιημένης

κατάστασης ισοζυγίου (steady-state kinetics) και θεωρητικά τουλάχιστον, μπορούν να

22

διατηρηθούν επ’ άπειρο. Είναι δε φανερό πως ο (σταθερός) αριθμός των κυττάρων σε μια

καλλιέργεια συνεχούς ροής εξαρτάται απόλυτα από δύο παράγοντες, την ειδική ταχύτητα

αναπτύξεως kN και την ταχύτητα διαλύσεως D (σε hr) = F/V όπου V = ο όγκος της

καλλιέργειας (σε lit) και F = η ροή (σε lit/hr) δηλαδή ο όγκος της καλλιέργειας που

αντικαθίσταται με θρεπτικό μέσο στη μονάδα του χρόνου:

(Αύξηση Κυττάρων) = (Ανάπτυξη) – (Απομάκρυνση)

dN/dt = kN.N – D.N. (5)

O μέσος χρόνος παραμονής των κυττάρων στην καλλιέργεια (mean residence time)

είναι θ = 1/D.

Η ποσότητα αυτή συνδέεται με το χρόνο διπλασιασμού tD = θn2, οπότε η

πιθανότητα ενός κυττάρου να διπλασιαστεί μέσα στην καλλιέργεια είναι exp (–tD/θ) =

exp (–DtD). Aυτό σημαίνει ότι όσο μεγαλύτερος γίνεται ο tD (ή ο θ) τόσο μεγαλύτερη

είναι η πιθανότητα ενός κυττάρου ν’ απομακρυνθεί πριν απ’ το διπλασιασμό του.

Από την εξίσωση (5) είναι φανερό ότι ο αριθμός των κυττάρων παραμένει

σταθερός (dN/dt = o) δηλαδή η κατάσταση ισοζυγίου αποκαθίσταται μόνον όταν:

kN = D (6)

Είναι επίσης φανερό πως όταν k΄Ν > D τότε ο αριθμός των κυττάρων θα αυξάνει

εκθετικά, σύμφωνα με την εξίσωση

dN

dt = (k΄Ν – D) . N Nt = NO.e(k΄Ν – D) t (7)

Η αύξηση αυτή θα συνεχίζεται μέχρις ότου η αυξημένη πυκνότητα των κυττάρων,

σε συνδυασμό με την αυξημένη απέκκριση τοξικών προϊόντων του μεταβολισμού, τον

ελαττωμένο αερισμό κλπ. θα έχουν σαν αποτέλεσμα την ελάττωση της ειδικής ταχύτητας

ανάπτυξης σε μια τιμή kN < k΄Ν έτσι ώστε kN – D=0.

Όταν σκεφτούμε πως όταν αρχίζει η ανάπτυξη μιας καλλιέργειας συνεχούς ροής

(δηλαδή αμέσως μετά τον εμβολιασμό) ο αριθμός των κυττάρων είναι πολύ μικρότερος

απ’ ό,τι στην σταθεροποιημένη κατάσταση ισοζυγίου, η παραπάνω επεξεργασία δείχνει

ότι η καμπύλη αύξησης των κυττάρων μοιάζει μερικώς με εκείνη μιας κλειστής

καλλιέργειας, καταλήγει δηλαδή σε ένα οριζόντιο τμήμα ανάλογο με τη στάσιμη φάση

(που όμως εδώ είναι η κατάσταση ισοζυγίου) μετά από μια φάση εκθετικής

(λογαριθμικής) αύξησης. Αυτή όμως ακολουθεί μια σχέση όμοια με την εξίσωση (7)

όπου αντί για τη σταθερά k΄Ν , ισχύει σε κάθε χρονική στιγμή μια άλλη ke < kN. Η ke

αυτή εξαρτάται από την πιθανότητα του κάθε κυττάρου να διπλασιαστεί μέσα στην

καλλιέργεια.

23

Η εξίσωση (5) εκφράζει επίσης ότι η ταχύτητα ανάπτυξης και η συγκέντρωση των

κυττάρων στην κατάσταση ισοζυγίου μπορεί να μεταβληθεί και ρυθμιστεί με απόλυτη

ακρίβεια είτε τροποποιώντας την ταχύτητα διαλύσεως D, είτε ρυθμίζοντας την τιμή kN,

που είναι συνάρτηση του γονοτύπου και του περιβάλλοντος, εξαρτάται δηλαδή απ’ το

είδος του μικροοργανισμού, από τις συνθήκες ανάπτυξης και επηρεάζεται πολύ από τις

συγκεντρώσεις των θρεπτικών υλών στο μέσο καλλιέργειας.

Αν όλες οι θρεπτικές ύλες στο μέσο βρίσκονται σε επάρκεια εκτός από μια ουσία

οριακής ανάπτυξης (growthlimiting substrate) τότε, σύμφωνα με μια επεργασία του

Μοnod, σε χαμηλές συγκεντρώσεις S:

kN = kmax

S

S KS (8)

όπου η kmax αντιστοιχεί σε μεγάλες συγκεντρώσεις S και η KS είναι μια σταθερά

κορεσμού υποστρώματος (substrate saturation constant), που ισούται με τη συγκέντρωση

S1/2 που αντιστοιχεί σε kmax/2 (ανάλογα με τη σταθερά Michaelis).

Aντικαθιστώντας την τιμή αυτή του kN στην σχέση της ταχύτητας ανάπτυξης των

καλλιεργειών (εξίσωση 1) προκύπτει:

dN

dt = kmax · N S

S KS

.

ή dW

dt = tmax · W S

S KS

.

(9)

όπου W = η μάζα των κυττάρων.

Ο Monod όρισε σαν παράγοντα αποδόσεως Υ (yield factor) τη μάζα των κυττάρων

που παράγονται από την κατανάλωση 1gr υποστρώματος, δηλ. Υ = – dW/dS οπότε:

– dS

dt = kmax · W

Y

S

S KS

(10)

Παρ’ όλο όμως ότι το Υ θεωρήθηκε αρχικά σαν κάποια σταθερά, εν τούτοις

εξαρτάται απ’ την ταχύτητα ανάπτυξης και από την υπόλοιπη σύσταση του

περιβάλλοντος.

Μετρήσεις

Η καλύτερη μέθοδος προσδιορισμού κυτταρικής μάζας είναι η μέτρηση του ξηρού

βάρους των κυττάρων. Προϋποτίθεται πως η χημική σύσταση των κυττάρων παραμένει

σταθερή και υπολογίζουμε έμμεσα την κυτταρική μάζα, προσδιορίζοντας ένα συστατικό

του κυττάρου (π.χ. ολικό άνθρακα ή άζωτο ή ολικές πρωτε?νες) ή μετρώντας τη

δραστικότητα ενός ενζύμου ή την ταχύτητα μιας μεταβολικής λειτουργίας (π.χ. αναπνοής

ή ζυμώσεως).

24

Ένα μέτρο της κυτταρικής μάζας

δίνουν επίσης θολωσιμετρικές μετρήσεις

(ή μετρήσεις οπτικής πυκνότητας σε

λ=600 mμ). Η μεταβολή της πυκνότητας

σε συνάρτηση με την μάζα είναι συνήθως

σταθερή, όταν δεν μεταβάλλεται το

μέγεθος των κυττάρων, συνήθως όμως η

αντιστοιχία δεν είναι ευθύγραμμη, όπως

δείχνει το παραπλεύρως σχήμα.

Οι μέθοδοι μετρήσεως του αριθμού των κυττάρων σε ένα εναιώρημα διακρίνονται

στις ακόλουθες κατηγορίες:

1. Μέτρηση συνολικού αριθμού κυττάρων

(α) Με αιματοκυτόμετρο: Η μέθοδος βασίζεται στη μέτρηση –με μικροσκόπιο–

του αριθμού των κυττάρων, που απαντούν μέσα σ’ έναν ορισμένο όγκο υγρού (ανάμεσα

από την καλυπτρίδα και την αντικειμενοφόρο), μετά την ακινητοποίηση (θανάτωση) των

κυττάρων.

(β) Με μετρητή Coylter: Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στη μέτρηση της διαφοράς

ηλεκτρικής αγωγιμότητος μεταξύ υγρού και κυττάρων. Ο μετρητής Coylter παρουσιάζει

μεγαλύτερη ακρίβεια όταν τα κύτταρα είναι σχετικά μεγάλου μεγέθους (κύτταρα

πρωτοζώων, φυκών κλπ.).

2. Μέτρηση ζωντανών κυττάρων: Γνωστή ποσότητα εναιωρήματος κυττάρων

διαλύεται σε γνωστό όγκο θρεπτικού διαλύματος Agar και απλώνεται σε Petri (Σχ. 1). Ο

αριθμός των ζωντανών κυττάρων βρίσκεται από μετρήσεις του αριθμού αποικιών που

σχηματίζονται.

Θρεπτικά μέσα

Οι μεγάλες διαφορές που υπάρχουν μεταξύ των οργανισμών όσον αφορά τις

φυσιολογικές τους ιδιότητες και επομένως, τις διαιτητικές τους ανάγκες, κάνει αδύνατη

την παρασκευή ενός και μόνο θρεπτικού μέσου κατάλληλου για όλους τους οργανισμούς.

Γι’ αυτόν το λόγο υπάρχει μια πληθώρα θρεπτικών υλικών για διάφορες καλλιέργειες. Τα

θρεπτικά αυτά υλικά κατασκευάζονται σύμφωνα με τις γενικές και ειδικές ανάγκες των

μικροοργανισμών από πλευράς στοιχείων απαραίτητων για τις φυσιολογικές τους

O.D.

ξηρό βάρος

25

λειτουργίες. Επίσης η εκλογή ενός κατάλληλου θρεπτικού υλικού μπορεί να οδηγήσει

στην απομόνωση ενός και μόνο μικροοργανισμού ή μιας μόνο ομάδας μικροοργανισμών,

που αναπτύσσονται πολύ καλύτερα σ’ αυτό το θρεπτικό υλικό, ενώ δεν παρέχει τα

απαραίτητα συστατικά για μια άλλη ομάδα μικροοργανισμών.

Τα θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιούνται για την απομόνωση, ανάπτυξη,

αναγνώριση και διατήρηση των διαφόρων μικροοργανισμών διακρίνονται σε σύμπλοκα ή

εμπειρικά, και στα συνθετικά, που παρασκευάζονται από όχι εντελώς χημικώς καθαρά

συστατικά. Απαραίτητα στοιχεία όλων των θρεπτικών μέσων είναι:

(α) Το νερό (β) Πηγή αλάτων (ανοργάνων ή οργανικών) (γ) Πηγή αζώτου (π.χ.

πρωτε?νες, αμινοξέα, ανόργανα αζωτούχα άλατα κλπ.). (δ) Πηγή άνθρακος (π.χ.

σάκχαρα, πρωτε?νες, οργανικά οξέα, ανόργανα ανθρακούχα άλατα κλπ. Οι απαιτήσεις

για την καλλιέργεια μυκήτων και βακτηρίων διαφέρουν μεταξύ τους και γι’ αυτό,

θρεπτικά μέσα κατάλληλα για ανάπτυξη βακτηρίων λέγονται «βακτηριολογικά», ενώ για

μύκητες «μυκητολογικά».

Η ρύθμιση του pH των θρεπτικών υλικών γίνεται μετά την παρασκευή τους και

πριν από την τελική τους αποστείρωση, με τη χρήση κανονικών ή δεκατοκανονικών

διαλυμάτων οξέων και αλκαλίων. Ο προσδιορισμός του pH γίνεται με την παραβολή του

χρώματος του θρεπτικού υλικού (μετά από προσθήκη δείκτη) με το χρώμα ενός προτύπου

διαλύματος με γνωστό pH. Ακόμη με δείκτες χάρτινους ή καλύτερα με pH-μετρο.

Στο εμπόριο διατίθενται έτοιμα αφυδατωμένα θρεπτικά υλικά κατάλληλα για κάθε

είδος καλλιέργειας. Επίσης διατίθενται θρεπτικά μέσα με προσθήκη μιας γνωστής

χρωστικής (thymol blue, Phenol red κλπ.) για την ανάπτυξη και απομόνωση ορισμένων

μικροοργανισμών. Ανάλογα δηλαδή με την ιδιότητα του μικροοργανισμού να

χρησιμοποιεί σαν πηγή ενέργειας για το μεταβολισμό του κάποιο γνωστό στοιχείο αυτών

των θρεπτικών υλικών, δημιουργείται κάποια αντίδραση μεταξύ μεταβολιτών και

χρωστικής, με αποτέλεσμα την αλλαγή του χρώματος του θρεπτικού μέσου π.χ. στο

εμπόριο υπάρχει το Mannitol salt agar, που περιέχει Phenol Red. Το άγαρ αυτό είναι

κατάλληλο για τον προσδιορισμό και καταμέτρηση αποικιών σταφυλοκόκκων. Μετά την

επώαση, οι αποικίες των μη παθογόνων κόκκων είναι μικρές και διαγράφονται από

κόκκινες ή μωβ ζώνες γύρω από την αποικία.

Οι αποικίες των παθογόνων κόκκων που χρησιμοποιούν την μαννιτόλη,

περιτριγυρίζονται από ζώνες κίτρινου χρώματος.

Κατά την επεξεργασία ενός ετοίμου αφυδατωμένου θρεπτικού μέσου και την

παρασκευή του θρεπτικού υλικού πρέπει να προσέξουμε τα εξής:

26

(α) Η προβλεπομένη ποσότητα της σκόνης πρέπει να προστίθεται στο μισό νερό

του τελικού όγκου. Αφού αναμιχθεί καλά, προστίθεται το υπόλοιπο νερό, προσέχοντας να

ξεπλύνουμε τα τοιχώματα του δοχείου.

(β) Το νερό είναι προτιμότερο να είναι θερμοκρασίας 45-50C.

Έτοιμα θρεπτικά υλικά μπορούν να συντηρηθούν για μικρό χρονικό διάστημα στο

ψυγείο.

Συντήρηση των καλλιεργειών

Η συντήρηση μικροβιακών καλλιεργειών επιτυγχάνεται σε θερμοκρασία ψυγείου

με ανακαλλιέργειες κατά χρονικά διαστήματα. Υπάρχουν ειδικά θρεπτικά υλικά για την

συντήρηση των μικροβιακών καλλιεργειών π.χ. το Dorset.

Για μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα επιτυγχάνεται η συντήρηση με λυόφιλο

αποξήρανση. Ανάπτυξη αναεροβίων μικροοργανισμών μπορούμε να επιτύχουμε είτε με

αφαίρεση του Ο2 από τον χώρο της αναπτύξεως του αναεροβίου μικροοργανισμού ή με

άλλη μέθοδο, που επιτυγχάνει την αύξηση της αναγωγικής δυνάμεως του υλικού. Η

αφαίρεση του Ο2 επιτυγχάνεται μέσα σε ειδικά δοχεία, στον πυθμένα των οποίων υπάρχει

κάποια χημική ουσία, που δεσμεύει το Ο2 (όπως π.χ. πυρογαλλικό οξύ).

Επίσης η δέσμευση του Ο2 μπορεί να επιτευχθεί με συγκαλλιέργεια στο ίδιο Petri

αναεροβίου μικροοργανισμού και του αεροβίου χορτοβακτηριδίου στο κάλυμμα του

Petri. Το χορτοβακτηρίδιο καταναλώνει πολύ γρήγορα το οξυγόνο που υπάρχει μέσα στο

Petri και έτσι δημιουργείται αναερόβιο περιβάλλον.

Καλλιέργειες Ιών

Οι ιοί είναι υποχρεωτικά παράσιτα και όπως είναι επόμενο, η καλλιέργειά τους

σημαίνει ότι διατίθενται κατάλληλα κύτταρα ή ιστοί, που θα χρησιμεύσουν σαν ξενιστές.

Τέτοια παρασκευάσματα για ειδικές περιπτώσεις μπορεί να είναι διάφορες

ιστοκαλλιέργειες. Το συνηθέστερο όμως μέσο για καλλιέργεια, αναγνώριση, τιτλοδότηση

και διατήρηση πολλών ζωικών ιών, καθώς και για την παρασκευή εμβολίων, είναι τα

εμβρυοφόρα αυγά, που αποτελούν και άριστο και οικονομικό πειραματικό υλικό.

Εμβρυοφόρα αυγά που έχουν επωασθεί επί 10-15 μέρες, εξετάζονται στο ωοσκόπιο

και στο κέλυφός τους σημειώνονται η περιοχή και το κέντρο του αεροφόρου σάκου,

καθώς και η θέση ακριβώς απέναντι απ’ το κεφάλι του εμβρύου. Στις θέσεις αυτές, αφού

απολυμανθούν με διάλυμα ιωδίου, ανοίγονται μικρές οπές με τρυπάνι ελαφρά, έτσι ώστε

να τρυπήσει μόνο το κέλυφος, αφήνοντας ανέπαφη την εσωτερική μεμβράνη. Με μια

27

απολυμασμένη (σε αλκοόλη και σε φλόγα) σύριγγα ανοίγονται κατόπιν οι δύο οπές, με

μια δεύτερη σύριγγα εισάγονται στην αλλαντοϊκή κοιλότητα 0,2 ml εμβολίου

(προηγουμένης καλλιέργειας του ιού) και οι οπές σφραγίζονται με τήγμα παραφίνης.

Ακολουθεί επώαση των αυγών σε 37C επί 2 έως 5 ημέρες, (ανάλογα με το είδος του ιού)

και κατόπιν παραλαβή του αμνιοτικού υγρού.

Μικροβιολογικές και Ιστοχημικές χρώσεις

Απαραίτητο συμπλήρωμα των παραπάνω είναι οι διάφορες χρώσεις, που

χρησιμεύουν είτε για να καταστήσουν ορατά στο μικροσκόπιο ορισμένα κύτταρα ή

οργανίδια κυττάρων, είτε για την αναγνώρισή τους είτε, τέλος, για τον εντοπισμό και τον

ημιποσοτικό προσδιορισμό συγκεκριμένων χημικών συστατικών του πρωτοπλάσματος

στα διάφορα σημεία κυττάρων, κυτταρικών οργανιδίων ή ιστών. Στην τελευταία

περίπτωση, οι χρώσεις είναι κατ’ εξοχήν ιστοχημικές (ή κυτταροχημικές) και συνήθως

είναι πολυπλοκότερες από τις απλές μικροβιολογικές χρώσεις ολοκλήρων κυττάρων. Και

στις δύο περιπτώσεις, η χρώση οφείλεται είτε σε κάποια φυσική αλληλεπίδραση μιας

χρωστικής (όπως προσρόφηση, διάλυση, ώσμωση) με ορισμένα συστατικά των

κυττάρων, είτε σε κάποια χημική αντίδραση, πράγμα που είναι συνηθέστερο στις

ιστοχημικές χρώσεις.

Οι χρωστικές που χρησιμοποιούνται είναι άλλοτε φυσικές, φυτικής (αιματοξυλίνη,

αιματεΐνη, βραζιλεΐνη, ορκεΐνη, κρόκος) ή ζωικής (καρμίνιο) προελεύσεως και άλλοτε

είναι τεχνητές (συνθετικές), που συνήθως δείχνουν μεγαλύτερη εξειδίκευση. Η

εξειδίκευσή τους αυτή οφείλεται στις διαφορές της δομής και του μεγέθους του μορίου

του συνδυασμένες με τον όξινο, βασικό ή ουδέτερο χαρακτήρα και τις σταθερές ιονισμού

τους. Οι κυριότερες όξινες συνθετικές χρωστικές είναι το πικρικό οξύ, η ερυθροσίνη, η

όξινη φουξίνη, η ηωσίνη, το Orange G. Βασικές είναι το κρυσταλλικό ιώδες, ιώδες

γεντιανής και ιώδες μεθυλίου, το πράσινο μεθυλίου και πράσινο μαλαχίτου, το κυανούν

μεθυλίου και κυανούν τολουϊδίνης, η βασική φουξίνη (κόκκινη), και οι Ιndolin και Colin

Black (μαύρες). Ουδέτερες είναι το ουδέτερο ερυθρό, ιώδες μεθυλενίου και οι χρωστικές

Giemsa, Leishmann και May-Grünwald.

Πολλά από τα διαλύματα των χρωστικών αυτών (συνήθως 1-2% σε 10, 30, 50, 70 ή

95% αλκοόλη) περιέχουν σαν «πρόστυμμα» φαινόλη σε αναλογία 2% (φαινικούχα

διαλύματα) ή οξικό οξύ σε αναλογία 0,5-1,0%. Τα προστύμματα αυτά, καθώς και η

αλκοόλη, που αποτελεί μέρος του διαλυτικού, έχουν σαν αποτέλεσμα την ισχυροποίηση

(και ομοιογένεια) της χρώσης, γιατί με τον πολικό τους χαρακτήρα προκαλούν διάσπαση

28

δεσμών υδρογόνου και άλλων φυσικοχημικών αλληλεπιδράσεων, διευκολύνοντας έτσι τη

διείσδυση της χρωστικής στα κύτταρα και την ομοιόμορφη κατανομή της (προσρόφηση ή

διάλυση) στη στοιβάδα των χημικών συστατικών που χρωματίζουν.

Σαν γενική αρχή θα πρέπει να σημειωθεί ότι η αποτελεσματικότητα μιας χρωστικής

εξαρτάται από δύο παράγοντες: Από το συντελεστή κατανομής της ανάμεσα στο υλικό

που χρωματίζει και το διαλυτικό μέσο και από την ένταση του χρώματός της, δηλαδή την

ελάχιστη οριακή συγκέντρωσή της για να είναι σαφώς ορατή, ώστε η δοκιμασία να είναι

ευαίσθητη. Σχετικά με τον πρώτο παράγοντα, ιδανική περίπτωση είναι εκείνη στην οποία

η χρωστική διαλυτοποιείται (σε όση συγκέντρωση είναι απαραίτητη για τον χρωματισμό)

σ’ ένα διαλυτικό μέσο, που είναι κακός διαλύτης τόσο για τη χρωστική, όσο και για τα

χημικά συστατικά του κυττάρου που θα χρωματισθούν. Λόγου χάριν, ένα λιποδιαλυτό

χρώμα διαλυμένο σ’ έναν καλό διαλύτη (όπως το χλωροφόρμιο ή η ακετόνη) πολύ

δύσκολα θα χρωματίσει τα λιποειδή, εκτός του ότι υπάρχει κίνδυνος να διαλυθούν και τα

λιποειδή στον καλό και γι’ αυτά διαλύτη. Με άλλα λόγια, ισχύουν και εδώ οι ίδιες γενικές

αρχές, που εφαρμόζονται στα αντιδραστήρια εμφανίσεως της χαρτοχρωματογραφίας,

TLC και ηλεκτροφόρησης, ειδικότερα όταν χρησιμοποιείται η τεχνική της εμβάπτισης

(όχι ψεκασμού).

Τέλος σε συνδυασμό με αρκετά από τα διαλύματα χρωστικών που αναφέρθηκαν

χρησιμοποιούνται, πριν ή μετά τη χρώση, ορισμένα εξωτερικά προστύμματα, που είτε

προκαλούν οξειδωτικές ή άλλες μεταβολές, (όπως τα διαλύματα χρωμικού ή

υπερμαγγανικού, το Lugol κ.ά.) είτε είναι παράγοντες διαφοροποίησης του χρώματος

λόγω διαφορικού αποχρωματισμού ή μεταχρωματισμού έτσι, ώστε τα διάφορα στοιχεία

του παρασκευάσματος να παίρνουν διάφορες αποχρώσεις και οι λεπτομέρειες της υφής

να είναι πιο ευδιάκριτες. Τέτοιοι παράγοντες διαφορικού αποχρωματισμού είναι η

ακετόνη, η αιθανόλη ή η βουτανόλη και υδατικά διαλύματα (1:4) θειϊκού, νιτρικού ή

υδροχλωρικού οξέος. Ιδιαίτερα οι αλκοόλες είναι πολύ χρήσιμες για την εμφάνιση

μεταχρωματισμού, που σημαίνει ότι ορισμένα στοιχεία του παρασκευάσματος δεν

χρωματίζονται με το χρώμα της χρωστικής (ορθοχρωματικά), αλλά με κάποιο άλλο

χρώμα, κι αυτό οφείλεται στο ότι τα μόρια της χρωστικής είναι τόσο «συμπιεσμένα»

μεταξύ τους (κοντά το ένα στο άλλο) ώστε αλληλεπιδρώντας, να αλλάζει ο βαθμός

ιονισμού τους (κατά τον Michaelis, σχηματίζονται διμερή, τριμερή κ.λ.π. μικύλλια της

χρωστικής). Η άποψη αυτή αποδεικνύεται από τη συμπεριφορά βασικών χρωστικών,

όπως η toluidine blue, κατά τη χρώση οξίνων πολυμερών: Τα νουκλεϊνικά οξέα

αντιδρούν ορθοχρωματικά (μπλε), ενώ ορισμένοι θειϊκοί ή άλλοι όξινοι πολυσακχαρίτες

29

με τις όξινες ομάδες τους σε απόσταση όχι πάνω από 5 Α, αντιδρούν μεταχρωματικά

(κόκκινα, ροζ ή ερυθροϊώδη). Ελαττώνοντας δε το pH, δηλαδή περιορίζοντας το βαθμό

διαστάσεως των οξίνων ομάδων, ο μεταχρωματισμός κάποτε εξαφανίζεται, πράγμα που

επιτρέπει τη διαφοροποίηση των οξίνων ομάδων μεταξύ τους.

Εκτέλεση και τεχνικά προβλήματα: Το κύριο μέρος στην εκτέλεση μιας χρώσης

είναι σχεδόν αυτονόητο: Το παρασκεύασμα καλύπτεται με μερικές σταγόνες απ’ το

κατάλληλο διάλυμα χρωστικής ή άλλο αντιδραστήριο, μένει το προβλεπόμενο χρονικό

διάστημα για ν’ αντιδράσει (πολλές φορές με θέρμανση) και εκπλύνεται το

αντιδραστήριο με νερό (σταγονόμετρο). Ανάλογα με τη μέθοδο, η κατεργασία αυτή

μπορεί να επαναληφθεί με το ίδιο ή με ένα δεύτερο και ένα τρίτο αντιδραστήριο ή με τα

διαλύματα αποχρωματισμού και διαφοροποίησης του χρώματος που αναφέραμε. Η

εργασία συμπληρώνεται με το επιμελημένο στέγνωμα του χρωματισμένου

παρασκευάσματος, με τη βοήθεια διηθητικού χαρτιού και με ρεύμα αέρα ή ελαφρή

θέρμανση. (Σε πολλές περιπτώσεις, η περίσσεια του νερού απομακρύνεται πρώτα με μια

σειρά διαλυμάτων αλκοόλης αυξανομένης περιεκτικότητας, λ.χ. 20%, 50%, 70%, 90%).

Σχήμα 2: Απεικόνιση χειρισμών χρώσεων. Α = μονιμοποίηση (και ξήρανση) στη φλόγα, Β =

επικάλυψη με χρωστική ή άλλο πρόστυμμα, Γ = έκπλυση και Δ = τελικό στέγνωμα με διηθητικό

χαρτί.

Τέλος, το στεγνό παρασκεύασμα καλύπτεται με μια σταγόνα κεδρελαίου και

παρατηρείται στο μικροσκόπιο με καταδυτικό φακό. (Η διατήρηση των χρωματισμένων

παρασκευασμάτων γίνεται με εμβάπτιση σε ξυλόλη και ξήρανση στον αέρα).

Η επιτυχία όμως του πειράματος, στις περισσότερες περιπτώσεις, εξαρτάται απ’ τη

σωστή προετοιμασία του παρασκευάσματος, πριν απ’ την εκτέλεση της χρώσης αυτής

30

καθεαυτής. Το στάδιο αυτό συγκεντρώνει και τα σπουδαιότερα τεχνικά προβλήματα, που

ξεκινούν απ’ το ότι για να έχει κάποια έννοια η χρώση, πρέπει ν’ αποφευχθεί η αυτόλυση

και γενικότερα, οποιαδήποτε αλλαγή της σχετικής τοπογραφικής θέσης των συστατικών

των κυττάρων ή η αμοιβαία διάχυση και σχετική «ομοιογενοποίηση» του

πρωτοπλάσματος. Η προετοιμασία λοιπόν του παρασκευάσματος έχει σκοπό τη

μονιμοποίηση ή στερέωσή του (fixation), σε τέτοια όμως κατάσταση ώστε να μην

εμποδίζεται η διάχυση και διείσδυση των αντιδραστηρίων σε όλα τα σημεία του

κυττάρου, πράγμα που έχει ιδιαίτερη σημασία όταν εξετάζεται το εσωτερικό του

κυττάρου ή των οργανιδίων του και που δημιουργεί πρόσθετα προβλήματα, ιδιαίτερα σε

ιστοχημικές χρώσεις για τον εντοπισμό συγκεκριμένων συστατικών των κυττάρων και

κυρίως, ενζύμων. Ωστόσο, στις απλές μικροβιολογικές χρώσεις για την αναγνώριση, τη

μέτρηση και τη χονδρική μορφολογική μελέτη των κυττάρων, το πρόβλημα

απλουστεύεται σημαντικά και η όλη προετοιμασία γίνεται με μόνη τη χρήση της φλόγας

ενός λύχνου, σε τρία διαδοχικά στάδια: Επίστρωση, ξήρανση και μονιμοποίηση.

Επίστρωση: Μια σταγόνα υγρής καλλιέργειας (ή αίματος κ.λ.π.) φέρεται στο

κέντρο της αντικειμενοφόρας πλάκας με πιπέττα Pasteur ή με κρίκο και εξαπλώνεται σε

λεπτή στοιβάδα με κυκλικές κινήσεις του κρίκου έτσι, ώστε ο κρίκος να μην ξαναπεράσει

απ’ τις ήδη ξερές περιοχές της στοιβάδας, για τον κίνδυνο δημιουργίας ρωγμών. Αν

πρόκειται για στερεή καλλιέργεια, είτε προηγείται αραίωση και ομογενοποίησή της σε

υγρό μέσο, είτε μικρό μέρος της φέρεται με κρίκο σε προτοποθετημένη (στην πλάκα)

σταγόνα νερού και ακολουθεί ομογενοποίηση και εξάπλωση με τον κρίκο. Τέλος, η

επίστρωση του αίματος γίνεται συνήθως με μια δεύτερη αντικειμενοφόρο πλάκα, που

κρατιέται σε επαφή στο άκρο της σταγόνας (με γωνία περίπου 45) μέχρι να εξαπλωθεί

το υλικό στο εσωτερικό της γωνίας κατά μήκος και κατόπιν, μετακινείται ομαλά

συμπαρασύροντας και εξαπλώνοντας τη σταγόνα καθ’ όλο το πλάτος της πλάκας. Αν η

επίστρωση δεν είναι συνεχής –εμφανίζει κενά– αυτό είναι ένδειξη ότι η πλάκα δεν ήταν

απόλυτα καθαρή.

Ξήρανση: Πριν απ’ τη μονιμοποίηση, το παρασκεύασμα είναι απαραίτητο να

ξεραθεί (με ρεύμα αέρα, ή επανειλημμένη τοποθέτηση σε ηλεκτρικό μάτι για λίγο, ή

πέρασμα 3-4 φορές ψηλά από τη φλόγα) με προσοχή, ώστε να μην προκληθεί

καραμελλοποίηση ή άλλες αλλοιώσεις, που γίνονται μόνον σε διάλυμα.

31

Η Μονιμοποίηση του ξερού πλέον υλικού γίνεται κρατώντας 2-3 φορές την πλάκα

στο άκρο της φλόγας επί τόσο χρόνο, ώστε η πλάκα να είναι ανεκτή όταν ακουμπήσει

στο πάνω μέρος του χεριού.

Μια καλύτερη μέθοδος, που απαιτεί όμως πείρα, είναι η κάλυψη του ξερού

παρασκευάσματος με 2-3 σταγόνες απόλυτης αλκοόλης και αναστροφή της πλάκας, ώστε

να αναφλεγεί η αλκοόλη.

Για τις ιστοχημικές και κυτοχημικές χρώσεις, τις ειδικές για τη μελέτη της λεπτής

δομής του εσωτερικού των κυττάρων ή της κατανομής των νουκλεϊνικών οξέων,

πρωτεϊνών, πολυσακχαριτών, λιποειδών κ.λ.π. στα διάφορα στοιχεία του κυττάρου, η

παραπάνω τεχνική δεν λύνει πάντοτε ικανοποιητικά τα τεχνικά προβλήματα που

αναφέρθηκαν στην αρχή. Στις περιπτώσεις αυτές, η μονιμοποίηση γίνεται με την

επίδραση (5-15 min) κάποιου στερεωτικού (μονιμοποιητικού) διαλύματος (fixative), απ’

την οποία προηγείται η ηπιότερη και λιγότερη δυνατή αφυδάτωση, δηλαδή μόνον όση

χρειάζεται για να μην παρασυρθούν τα κύτταρα με τις διαδοχικές εκπλύσεις, όταν αυτό

δεν εξασφαλίζεται από τη χρήση του στερεωτικού αυτού καθεαυτού. Τα στερεωτικά αυτά

διαλύματα προκαλούν στα επί μέρους συστατικά των κυττάρων χημικές ή φυσικοχημικές

μετουσιωτικές μεταβολές τέτοιες, που αφ’ ενός μεν εμποδίζουν τη διάχυσή τους, άρα

μονιμοποιούν τη σχετική θέση τους, αφ’ ετέρου δε απελευθερώνουν τις

«προστατευμένες» (με λιποπρωτεϊνικούς κλπ. δεσμούς) δραστικές τους ομάδες,

εξασφαλίζοντας έτσι και τη δυνατότητα αντιδράσεώς τους, και τη διείσδυση των

αντιδραστηρίων σ’ όλα τα σημεία. Τα πιο συνηθισμένα κυτοχημικά στερεωτικά

διαλύματα είναι τα ακόλουθα:

Ουδέτερη φορμαλίνη (υδατικό διάλυμα 4% HCHO).

Αλατούχος φορμαλίνη (όπως η ουδέτερη + 0,85g NaCl)

Ασβεστιούχος φορμαλίνη (όπως η ουδέτερη +5g CaCl2.2H2O)

Πικρική φορμαλίνη (4% HCHO σε 60% αιθανόλη + 0,15 g πικρικού οξέος + 0,18g

(NaCl).

Πικρικοξική φορμαλίνη (όπως η πικρική +5% CH3COOH).

32

Γλουταραλδε?δη (2,5% σε 0,2Μ κακοδυλικό νάτριο, pH 7,2).

Οξικό-αιθανόλη (σε αναλογία όγκων 1:19 (5%) ή 1:3).

Τριχλωροξικό οξύ (5% σε νερό ή 1% σε 80% αιθανόλη).

33

2. TO ΠΡΩΤΟΖΩΟ ΤΕTRAHYMENA PYRIFORMIS

O μικροοργανισμός Tetrahymena pyriformis ανήκει στη συνομοταξία των

πρωτοζώων και στην ομοταξία των βλεφαριδωτών. Υπάρχει σ’ όλες σχεδόν τις χώρες στα

ύδατα των ποταμών και πηγών. Χρησιμοποιείται σαν «πειραματόζωο» στη Βιοχημεία

επειδή ο μεταβολισμός της και οι βιοχημικές της πορείες μοιάζουν με αυτές των

ανώτερων οργανισμών. Επίσης είναι εύκολο να καλλιεργηθεί σε αξενικές συνθήκες.

Υπάρχουν πολλά είδη Tetrahymena και αρκετά στελέχη

από κάθε είδος. Στο εργαστήριο χρησιμοποιούμε την

Tetrahymena pyriformis στέλεχος W. H Tetrahymena

pyriformis είναι μονοκύτταρος οργανισμός σχήματος αχλαδιού

(από εκεί και το pyriformis). Έχει μήκος περί τα 50 mm.

Περιβάλλεται εξωτερικά από μεσημβρινές σειρές

εξειδικευμένων βλεφαρίδων [1] (kinetics) και την κυματοειδή

μεμβράνη [2]. Το σωματίδιο από το οποίο ξεκινά κάθε βλεφαρίδα καλείται κινητόσωμα.

Τα κινητοσώματα συνδέονται μεταξύ τους με μικρές μεμβράνες που λέγονται

κυτοδέσματα. Στο επάνω και λεπτότερο μέρος υπάρχει το στόμα ή κυττόστομα [3]. Το

κυττόστομα αποτελείται από το στοματικό άνοιγμα την στοματική κοιλότητα και τέσσερις

μεμβράνες (από εκεί το Tetrahymena), μια μεγάλη και τρεις μικρότερες η κίνηση των

οποίων σπρώχνει την τροφή μέσα στη στοματική κοιλότητα. Στο άκρο του κυττοστόματος

υπάρχει χυμοτόπιο για την πέψη της τροφής. Έχει δύο πυρήνες, ένα μακροπυρήνα

πολυπλοειδή και ένα μικροπυρήνα διπλοειδή. Ο πρώτος μπορεί να προέλθει και από τον

μικροπυρήνα. Πολλαπλασιάζεται με δυαδική σχάση και με σεξουαλική αναπαραγωγή

στην οποία συμμετέχουν δύο διαφορετικά στελέχη του αυτού είδους (ανταλλαγή

γενετικού υλικού). Διατηρεί την οσμωτική της ισορροπία με το λεγόμενο συσταλτό

κενοτόπιο (contractile vacuole). Στο πλατύτερο άκρο του κυττάρου υπάρχει ο

κυττοπρωκτός [4] (cytoproct) για την αποβολή των άχρηστων συστατικών στο

περιβάλλον.

Λόγω της κινητικότητάς της αναπτύσσεται μόνο σε υγρό περιβάλλον. Στο

εργαστήριο διατηρείται σε καλλιέργεια που περιέχει μόνο πρωτεόζη-πεπτόνη, 2% (πηγή

αμινοξέων). Το θρεπτικό υλικό της καλλιέργειας εργασίας περιέχει στα 100 ml 2g

πρωτεόζη-πεπτόνη, 0,2g εκχύλισμα ζύμης (πηγή βιταμινών) και 0,5g D-γλυκόζης. Με

αυτό το θρεπτικό υλικό και σε θερμοκρασία ανάπτυξης 22 έως 23C έχει χρόνο

διπλασιασμού περί τις 10 έως 12 ώρες.

34

3. ΔΙΑΚΡΙΤΙΚΟ ΟΡΙΟ ΟΠΤΙΚΟΥ (ΚΟΙΝΟΥ) ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟΥ

Oρισμοί εννοιών:

Φ = γωνιακό άνοιγμα = μέγιστη τιμή της γωνίας των ακτίνων που εκκινούν από

φωτεινό σημείο και διέρχονται δια μέσου οπής (κόρης οφθαλμού ή μη) από φακό.

Α = αριθμητικό άνοιγμα φακού (αντικειμενικού φακού μικροσκοπίου). Α = η.ημ

(φ/2), η = δείκτης διάθλασης υλικού του φακού. Πρακτικά η μέγιστη τιμή του Α, για

«ξηρούς» φακούς (πριν από τον αντικειμενικό φακό υπάρχει αέρας) είναι 0,95, επειδή

ηαέρα ≈1 και ημ (φ/2) < 1. Αν πρόκειται για «καταδυτικό» φακό (πριν από τον

αντικειμενικό φακό υπάρχει υγρό μέσο με δείκτη διάθλασης > 1 – ως καταλληλότερο

έχει επιλεγεί το κεδρέλαιο με η = 1,515, όσο περίπου και για το καθαρό γυαλί n = 1,525)

τότε η μέγιστη τιμή του Α είναι ≈1,4.

θ = γωνία οράσεως = γωνία υπό την οποία βλέπουμε ένα αντικείμενο.

Μ = γωνιακή μεγένθυση = θ2 δια του οπτικού οργάνου /θ1 δια του γυμνού οφθαλμού. Μ

= θ2/θ1, M = L.Δ/f1f2, M = Δ.θ2.2Α/λ ή Μ = 280Α, όπου Δ = 25 cm είναι η «ελάχιστη

απόσταση ευκρινούς οράσεως», L η απόσταση μεταξύ των εστιών των δύο συστημάτων

φακών του μικροσκοπίου (αντικειμενικού, προσοφθάλμιου) και f1, f2 οι εστιακές

αποστάσεις αντίστοιχα.

Πρακτικά, οι κατασκευαστές μικροσκοπίων προχωρούν σε μεγενθύσεις Μ = 500Α

έως Μ = 1000Α, διότι έτσι ο οφθαλμός κοπιάζει λιγότερο.

δ = διακριτικό όριο (μικροσκ.), 1/δ = διακριτική ικανότης. δ = 0, 61λ/Α, ή δ = 0,

5λ/Α = λ/2Α (λόγω επικάλυψης κατά 30% των κηλίδων) ή δ = λ/2.1, 4 = λ/2,8 (Α = 1,4

για καταδυτικό φακό).

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΩΝ ΔΙΑΚΡΙΤΙΚΟΥ ΟΡΙΟΥ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟΥ

(για μικροσκόπια ορατού φωτός - κοινά μικροσκόπια - οπτικά μικροσκόπια)

Αριθμητικό άνοιγμα

Α 0,95 Α 1,4

0,40 0,21 0,14

0,50 0,26 0,18

0,75 0,39 0,27

όπου δ = λ/2Α.

μήκος κύματος λ(μm)

35

4. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ

α. Οπτικό (κοινό) μικροσκόπιο (Bright.field). Τα χαρακτηριστικά του περιγράφηκαν

ανωτέρω. Εκτός του κοινού μικροσκοπίου υπάρχουν και άλλοι τύποι που το καθένα

έχει και κάποιο ιδιαίτερο χαρακτηριστικό, όπως:

β. Μικροσκόπια υπεριώδους ακτινοβολίας (Ultra violet). Eπειδή το μήκος κύματος

είναι μικρότερο από 0,4 μm, επιτυγχάνουν μικρότερο διακριτικό όριο και άρα

μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα. Τα μικροσκόπια όμως αυτά δεν έχουν διαδοθεί

πολύ, διότι το όφελος δεν είναι μεγάλο σε σχέση με το κόστος.

γ. Αντίθεσης φάσης (phase-contrast). Eιδικά κατασκευασμένοι φακοί δημιουργούν

διαφορές φάσης (των ακτίνων του αντικειμένου) τις οποίες μετατρέπουν σε διαφορές

πλάτους κύματος και έτσι αυτές (οι διαφορές φάσης) γίνονται εμφανείς υπό μορφή

διαφορών έντασης του φωτός. Το πρακτικό τους αποτέλεσμα είναι ότι επιτρέπουν να

φαίνεται εντονότερα το περίγραμμα του κυττάρου (ή όποιου υποκυτταρικού

οργανιδίου - π.χ. πυρήνας), λόγω αλλαγής του δείκτη διάθλασης σε εκείνη την

περιοχή του κυττάρου.

δ. Σκοτεινού πεδίου (Dark-field). Βασίζονται σε φαινόμενα σκέδασης του φωτός που

παρατηρούνται στα όρια μεταξύ φάσεων διαφορετικών τιμών περίθλασης και έχουν

ως αποτέλεσμα να φαίνεται το περίγραμμα του κυττάρου έντονα φωτεινό.

ε. Παρεμβολής (Interference). Είναι παρόμοια με τα αντίθεσης φάσης. Δεν έχουν

ακόμη διευκρινισθεί όλες τους οι δυνατότητες.

στ. Φθορισμού (Fluorescence). Χρησιμοποιούνται φθορίζουσες ουσίες, για χρώση των

κυττάρων ή υποκυτταρικών οργανιδίων, οι οποίες μέσω του φαινομένου της

φωταύγειας δίνουν πληροφορίες για αυτά.

ζ. Ηλεκτρονικό (Electron). Χρησιμοποιούν μαγνητικούς φακούς, οι οποίοι είναι

απαλλαγμένοι από τις ατέλειες των οπτικών (απλών) φακών και έχουν τη

δυνατότητα να διακρίνουν λεπτομέρειες έως 0,2 nm σε αντίθεση με τα οπτικά που

φθάνουν έως 0,2 μm περίπου (διακριτικό όριο).

5. ΚΑΤΑΔΥΤΙΚΟΙ ΦΑΚΟΙ

Επιτυγχάνεται αύξηση του γωνιακού ανοίγματος, άρα και του αριθμητικού

ανοίγματος ή τελικά της μεγέθυνσης (επόμενο

σχήμα). Έχουν συνολική μεγέθυνση x1000 και

εάν για την παρατήρηση χρησιμοποιείται

καλυπτρίδα, τότε μεταξύ φακού και

καλυπτρίδας τοποθετείται σταγόνα

κεδρελαίου.

36

6. ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ (αφυλετικός πολλαπλασιασμός σε υγρή καλλιέργεια)

Αν είναι:

t ο χρόνος που επιθυμούμε να διαρκέσει η εκθετική ανάπτυξη υγρής καλλιέργειας

κυττάρων,

Ap η τιμή απορρόφησης δείγματος της εκθετικής φάσης ανάπτυξης αιωρήματος

κυττάρων, τα οποία χρησιμοποιούνται ως προκαλλιέργεια για εμβολίασμα,

Α0 η τιμή απορρόφησης της καλλιέργειας κατά τον εμβολιασμό (χρόνος t=0),

Ν0 ο αριθμός των κυττάρων ανά μονάδα όγκου της καλλιέργειας, απορρόφησης Α0,

Αt η τιμή απορρόφησης δείγματος της εκθετικής φάσης ανάπτυξης αιωρήματος

κυττάρων, μετά χρόνο t από την έναρξη του εμβολιασμού,

Νt ο αριθμός των κυττάρων ανά μονάδα όγκου της καλλιέργειας, απορρόφησης Αt,

Κ ο λόγος Αt/Αp, (1)

n ο αριθμός των κυτταρικών διαιρέσεων εντός του χρόνου t,

DT ο χρόνος του ενός διπλασιασμού για συγκεκριμένο στέλεχος και συνθήκες

ανάπτυξης,

V ο όγκος του χρησιμοποιούμενου υγρού θρεπτικού μέσου ανάπτυξης (μη

συμπεριλαμβανομένου του όγκου του εμβολιάσματος) και

X ο όγκος του χρησιμοποιούμενου εμβολιάσματος, και επειδή ισχύει Νt/N0 = 2n

(Schlegel, 1986), και δοθέντος ότι αυξανομένου του αριθμού (ή της μάζας) των

κυττάρων αυξάνεται αναλογικά και η απορρόφηση του αιωρήματός τους, θα

ισχύουν:

Αt/A0 = Nt/N0 = 2n (2) και

X.Ap = (V+X) A0 ή Χ(Αp–A0) = A0V ή

Χ=Α0V (Ap–A0)–1 = V [(Ap/A0)–1]–1, η οποία λόγω των σχέσεων (1) και (2) γίνεται:

X=V [(ApAt/A0At)–1]–1 = V [(At/A0K)–1]–1 = V [(2n/K)–1]–1 = V [(2n–K)/K]–1 = KV

[2n–K]–1 και επειδή είναι n=t/DT και 2n=10n.log2 = 100,30103.n = enn2 = e0,69315n, τελικά

θα ισχύει:

Χ=KV [2t/DT–K]–1 ή

Χ=KV [100,30103.t/DT–K]–1 ή

Χ=KV [e0,69315.t/DT–K]–1 ή

Χ=KV [exp(0,69315.t/DT)–K]–1 ή

Χ=KV [exp(n2.t/DT)–K]–1

37

7. OΡΓΑΝΑ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΣΕ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΕΣ

ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ

α. Επωαστικός θάλαμος (incubator). Χώρος σταθερής θερμοκρασίας που επιτρέπει την

ανάπτυξη (κυτταρική διαίρεση) μικροοργανισμών ή άλλων κυττάρων ή σε στερεή

καλλιέργεια, ή σε υγρή για μικροοργανισμούς που δεν απαιτούν ανακίνηση.

β. Επωαστικός θάλαμος με ανακινούμενη βάση (Shaker-incubator). Επιτρέπει ότι και ο

επωαστικός θάλαμος αλλά για βακτήρια που απαιτούν ανακίνηση. Είναι πολλών

τύπων, ή με ρεύμα θερμού αέρα ή με θερμαινόμενο νερό, ενώ η κίνηση της βάσης

μπορεί να είναι περιστροφική ή παλλινδρομική.

γ. Επωαστικός θάλαμος αδρανούς ατμόσφαιρας (CO2 incubator). Επιτρέπει την

ανάπτυξη αναερόβιων κυττάρων. Αέριο CO2 διοχετεύεται ώστε να δημιουργεί

αδρανή ατμόσφαιρα.

δ. Κλίβανος υγρής αποστείρωσης. Για την υγρή αποστείρωση χρησιμοποιείται το

αυτόκλειστο (autoclave) γνωστό και σαν χύτρα Papin

που φαίνεται στο σχήμα.

Α: Θερμαντική πλάκα.

Β: Νερό απιοντισμένο για την παραγωγή των υδρατμών.

C: Χώρος τοποθέτησης των προς αποστείρωση σκευών.

D: Θερμόμετρο.

Ε: Βαλβίδα εκτόνωσης.

F: Μανόμετρο.

ε. Φίλτρα αποστείρωσης διαλυμάτων. Μικρές συσκευές που περιέχουν αποστειρωμένα

φίλτρα μικρών πόρων (0,45μm) και επιτρέπουν την αποστείρωση με φιλτράρισμα

διαλυμάτων ευαίσθητων ουσιών στη θερμοκρασία (και άρα μη δυναμένων να

αποστειρωθούν σε κλίβανο υγρής αποστείρωσης). Το διάλυμα διέρχεται μέσω των

πόρων του φίλτρου όπου συγκρατούνται οι μικροοργανισμοί.

στ. Κλίβανος ξηρής αποστείρωσης. Αποστειρώνονται σιφώνια και άλλα αντικείμενα σε

θερμοκρασία 180C για 40 min.

ζ. Λυχνίες υπεριώδους ακτινοβολίας ή ακτίνων Χ. Είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν

για αποστείρωση ποικίλων αντικειμένων(π.χ. τρυβλίων petri) ή ακόμη και

ολόκληρων χώρων (π.χ. θάλαμοι καλλιεργειών).

η. Θάλαμος νηματικής ροής (Laminar flow). Συσκευή-θάλαμος όμοιος με απαγωγό που

επιτρέπει την πιο ασφαλή διαδικασία των εμβολιασμών κυτταροκαλλιεργειών

38

απαλλαγμένων μολύνσεων από μικροοργανισμούς ξένους προς το κύτταρο της

καλλιέργειας. Ρεύμα φιλτραρισμένου αέρα (απαλλαγμένου μικροοργανισμών)

διοχετεύεται από άνω προς τα κάτω και ακολούθως κατευθύνεται προς τα έξω, έτσι

ώστε να παρασύρει τους μικροοργανισμούς του περιβάλλοντος χώρου που είναι

πιθανό να μολύνουν την κυτταροκαλλιέργεια κατά τους διάφορους χειρισμούς που

εκτελούνται.

θ. Οπτικό μικροσκόπιο (Βλέπε: ΔΙΑΚΡΙΤΙΚΟ ΟΡΙΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟΥ ΚΑΙ

ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ).

8. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Α. Ιδιαιτερότητες της άσκησης

α. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στη χρήση του λύχνου Bunsen προς αποφυγή

ατυχημάτων. Π.χ. ανάφλεξη των μαλλιών της κεφαλής μας ή των ενδυμάτων

μας αν πλησιάσουμε πολύ κοντά, ή ανάφλεξη του οινοπνεύματος που

χρησιμοποιείται για απολύμανση του πάγκου εργασίας, ή άλλων εύφλεκτων

υλών.

β. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στη χρήση του κλιβάνου υγρής αποστείρωσης.

Π.χ. το καπάκι να κλείνει καλά και με ασφαλή τρόπο, έτσι ώστε να αποκλειστεί

η πιθανότητα να εκτιναχθεί, ενώ θα είναι ανεβασμένη η πίεση των ατμών.

Επίσης μετά το τέλος της αποστείρωσης το άνοιγμα πρέπει να γίνεται αφού

βεβαιωθούμε ότι η πίεση των ατμών έχει μηδενισθεί και να γίνεται με προσοχή

και με τα κατάλληλα γάντια, το δε πρόσωπό μας να μην πλησιάσει κοντά, προς

αποφυγή εγκαυμάτων από τους ατμούς ή από τις θερμές μεταλλικές επιφάνειες

του κλιβάνου.

γ. Προσοχή επίσης στη χρήση της φυγοκέντρου. Να μην ανοίγεται το καπάκι πριν

ολοκληρωθεί η περιστροφή της κεφαλής, διότι είναι ενδεχόμενο να εμπλακεί σ’

αυτή η εργαστηριακή μας μπλούζα ή τα χέρια μας.

δ. Χρησιμοποιημένα γυαλικά μιας χρήσεως π.χ. τριχοειδείς σωλήνες, ή πιπέτες

Pasteur, ή αντικειμενοφόρος, ή σπασμένα γυαλικά απορρίπτονται σε ειδικό

καλάθι, προς αποφυγή πιθανού ατυχήματος, τόσο του ασκούμενου φοιτητή, όσο

και των καθαριστριών που μαζεύουν τα σκουπίδια.

ε. Χρησιμοποιείται πάντοτε χλωρίνη (διάλυμα NaClO) για την καταστροφή των

κυττάρων εις τρόπον ώστε να μην διαφύγουν στο περιβάλλον.

ζ. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στη χρήση του μικροσκοπίου προς αποφυγή

39

καταστροφής κάποιου από τους μεγεθυντικούς φακούς ή άλλου εύθραυστου

εξαρτήματός του.

η. Ομοίως απαιτείται προσοχή στη χρήση των χρωστικών, προς αποφυγή χρώσης

των ενδυμάτων των φοιτητών, από τα οποία δεν είναι δυνατόν να αφαιρεθούν.

Β. Παρασκευή του θρεπτικού μέσου

Ζυγίζουμε 4 gr πρωτεόζης-πεπτόνης, 1 gr D+ - γλυκόζης και 0,4 gr εκχυλίσματος

ζύμης. Τα διαλύουμε με Η2Ο μέχρις όγκου 200 ml. Τοποθετούμε το διάλυμα σε 2

κατάλληλες φιάλες καλλιέργειας. Πωματίζουμε με υδροφόρο μπαμπάκι και γάζα.

Γ. Αποστείρωση

Κάνουμε υγρή αποστείρωση στους 121C για 10 min. Μετά την αποστείρωση

αφήνουμε τις φιάλες με τα θρεπτικά υλικά να ψυχθούν.

Δ. Εμβολιασμός

Με αποστειρωμένα στον κλίβανο (180C για 40 min) σιφώνια με φραγμένο το

στόμιο με υδροφόρο βαμβάκι μεταφέρω Χ ml από παλιά καλλιέργεια στο

καινούργιο θρεπτικό μέσο υπό αξενικές συνθήκες. (Βλέπε σχ. 1 Γενικού Μέρους

και εμβολιασμό μικροβιακών κυττάρων).

Ε. Μικροσκοπική παρατήρηση

Απ’ την παλιά καλλιέργεια (έχει προετοιμαστεί απ’ την προηγούμενη εργαστηριακή

ομάδα) παίρνω μία σταγόνα την τοποθετώ σε αντικειμενοφόρο πλάκα και σκεπάζω

με καλυπτρίδα. Εστιάζω στο μικροσκόπιο και παρατηρώ τα κύτταρα της

Tetrahymena Pyridormis. Καταγράφω ζωτικότητα και κινητικότητα.

ΣΤ. Μέτρηση αριθμού κυττάρων με αιματοκυττόμετρο (πλάκα Neubaner)

Παίρνεται 1 ml από το εναιώρημα των κυττάρων και τοποθετείται σε ποτήρι

ζέσεως των 50 ml. Προσθέτονται 2-3 σταγόνες διαλύματος φορμαλδε?δης 1% για

την ακινητοποίηση και τον θάνατο των κυττάρων και στη συνέχεια το εναιώρημα

αραιώνεται με την προσθήκη 4 έως 6 ml H2O. Aκολουθεί ανάδευση για την

ομοιογενή κατανομή των κυττάρων στο εναιώρημα και στη συνέχεια, με τριχοειδή

σωλήνα τοποθετείται από μια σταγόνα στις δύο πλευρές του αιματοκυτόμετρου

αφού πρώτα σκεπαστεί με την ειδική καλυπτρίδα. Η μέτρηση των κυττάρων γίνεται

40

και στα 9 μεγάλα τετράγωνα κάθε πλευράς της πλάκας σε μικροσκόπιο,

χρησιμοποιώντας φακό μεγέθυνσης x4 ή x10 (συνολική μεγέθυνση x40 ή x100).

Υπολογισμός του αριθμού των κυττάρων: Έστω Α το σύνολο των κυττάρων της

μίας πλευράς της πλάκας και Β της άλλης. Τότε ο αριθμός τους ανά ml

εναιωρήματος θα είναι:

A B/ /9 9

2

x λ x 104 κύτταρα/ml

Ο συντελεστής διόρθωσης 104, αφορά τον όγκο του υγρού που συγκρατείται σε

κάθε ένα από τα 9 μεγάλα τετράγωνα. Ο όγκος αυτός έχει υπολογιστεί σε 10–4 ml,

και 1/λ είναι η αραίωση του κυτταρικού αιωρήματος.

Σχ. Σχηματική παράσταση υποδιαιρέσεων πλάκας Neubauer.

Ζ. Παραλαβή κυττάρων με φυγοκέντρηση:

Η καλλιέργεια φυγοκεντρείται στις 3.000 rpm για 15 min στους 4C. Μετά την

απόχυση του υπερκειμένου θρεπτικού υλικού παίρνουμε μία σταγόνα πυκνού

κυτταρικού αιωρήματος από το δημιουργούμενο από τις 1-2 σταγόνες του

εναπομείναντος υγρού για τη διαδικασία της χρώσης των κυττάρων. Τα υπόλοιπα

κύτταρα ξεπλένονται με ρυθμιστικό διάλυμα ανόργανο ισότονο με το θρεπτικό και

1mm 0.25mm

3mm

41

ξαναφυγοκεντρούνται. Στο τελικό ίζημα των κυττάρων προσθέτουμε 5 ml

μεθανόλης και τα τοποθετούμε στην κατάψυξη για να χρησιμοποιηθούν στην Εργ.

Άσκηση των Λιποειδών.

Η. Χρώση των κυττάρων

α. Στρώνομε μια σταγόνα αιωρήματος κυττάρων πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα.

β. Αφού η στρώση στεγνώσει στον αέρα γίνεται στερέωση, ρίχνομε πάνω σταγόνες

χρωστικής May-Grünwald μέχρι να καλυφθεί τελείως η αντικειμενοφόρος, και

αφήνουμε την χρωστική να δράσει για 3 min.

γ. Μετά χωρίς να αποχύσουμε την χρωστική προσθέτουμε ίση ποσότητα νερού και

αφήνουμε να δράσει το μείγμα (χρωστική + νερό) για 1 min.

δ. Απορρίπτουμε το προηγούμενο μίγμα και προσθέτουμε πάνω στην

αντικειμενοφόρο υδατικό διάλυμα Giemsa (4 σταγόνες Giemsa σε 2 ml νερού)

μέχρι να καλυφθεί τελείως.

ε. Αφήνουμε το διάλυμα Giemsa να δράσει 10 min. Μετά ξεπλένουμε την

αντικειμενοφόρο με νερό. Αφήνουμε να στεγνώσει στον αέρα και παρατηρούμε με

το μικροσκόπιο.

10. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Αλεξόπουλος, Κ. (1966). Γενική φυσική-οπτική, Αθήνα.

Hill, D.L. (1972). The biochemistry and physiology of Tetrahymena. D. G. Buelow,

I. L. Cameron and G. M. Paolilla, eds. Academic Press, New York, London.

Καπούλας, Β. (1977). Μικροβιολογικές μέθοδοι. Εισαγωγή στην εργαστηριακή

Βιοχημεία. Κεφ. 3, σελ. 37-54, Β΄ έκδοση, Αθήνα.

Περυσινάκης, Α. (1992). Γενετικός έλεγχος επί του μεταβολισμού του

γλουταμινικού οξέος στο ζυμομύκητα Shizosaccharomycer pombe. Διδακτορική

διατριβή. Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων.

Streiblova, E. (1988). Cytological methods. Yeast, a practical approach series.

Chap. 2 pp. 9-49. Ed.: I Campbell and J. H. Duffus. Pub: IRL press Oxford,

Washington.

42

Τέλος Ενότητας

Χρηματοδότηση• Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα

πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα.• Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο

Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού.

• Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

Σημειώματα

Σημείωμα Ιστορικού Εκδόσεων Έργου

Το παρόν έργο αποτελεί την έκδοση 1.0. Έχουν προηγηθεί οι κάτωθι εκδόσεις:• Έκδοση 1.0 διαθέσιμη εδώ.http://ecourse.uoi.gr/course/view.php?id=1374.

Σημείωμα ΑναφοράςCopyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκοντες: Αναπλ. Καθ. A. E. Κούκκου, Καθ. M. E. Λέκκα, Αναπλ. Καθ. Ε. Πάνου, Καθ. Ε. Παπαμιχαήλ, Καθ. Α. Τσελέπης, Καθ. Δ. Τσουκάτος. «Εργαστήριο Βιοχημείας. Καλλιέργειες μικροοργανισμών και χρήση μικροσκοπίου». Έκδοση: 1.0. Ιωάννινα 2014. Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση: http://ecourse.uoi.gr/course/view.php?id=1374.

Σημείωμα Αδειοδότησης

• Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης CreativeCommons Αναφορά Δημιουργού -Παρόμοια Διανομή, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη.

• [1] https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/.